CN111789954A - 延缓衰老的方法和药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了免疫检查点调节剂在延缓个体衰老中的应用、在制备预防或改善个体与衰老有关的病理学或非病理学病症或者延缓个体衰老的药物中的应用，以及在制备预防和/或治疗年龄相关性疾病的药物中的应用。

Description

延缓衰老的方法和药物

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及免疫检查点调节剂在延缓个体衰老、延长个体寿命或者制备预防和/或治疗年龄相关性疾病的药物中的应用。

背景技术

人类的长寿（超过80岁）在现代尤其是发达国家变得越来越容易实现。根据联合国对世界人口的展望，在全球范围内，从2015年到2050年年龄超过60岁的人数预计将从9.01亿增加21亿，而年龄超过80岁的人数预计将1.25亿增加到4.34亿。伴随人口老龄化，各种增龄相关的慢性疾病的发病率大幅增加，因此研究衰老、防治增龄相关的老年慢性病，对提高老年人生活质量、增加人类健康寿命具有重要意义。

衰老是一个漫长而高度复杂的自然现象，是机体在生命周期中随年龄增长而发生的全身组织、器官功能退减和稳态下降的过程，包括大多数生理指标的下降。其是涉及多个基因通过复杂途径作用的过程，其还没有完全从分子和细胞的角度被理解。它是造成许多慢性病的主因，包括心血管疾病（动脉粥样硬化）、癌症、骨质疏松症，黄斑变性，肺功能不全，肺气肿、肾衰竭，2型糖尿病和神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森病）等。尽管衰老细胞被认为很大程度上有利于机体的发育、再生和平衡，但衰老细胞被发现聚集在与年龄相关的病理部位，可破坏正常组织结构，推动与年龄相关的疾病。

近年来，肿瘤免疫疗法取得了巨大的成功，其中免疫检查点调节剂通过激活自身免疫系统攻击肿瘤细胞的能力，已经彻底改变了癌症治疗，以抗PD-1、PD-L1和CTLA-4为代表的一大批药物已经被广泛应用于临床，对多种类型的肿瘤都有显著疗效，并在一些晚期肿瘤的治疗领域实现重大突破。尽管这些药物仍有许多改进余地，在体内会引起免疫相关不良反应（irAEs），涉及皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌和其他器官系统，但临床数据表明免疫治疗带来的irAEs通常发生率并不高，且大部分为1~2级，临床上对症处理即可，故免疫治疗的安全性是可控的。

然而，本申请发明人将安全性可控的免疫检查点调节剂与衰老或年龄相关性疾病建立关联，并经实验证实后，提供了一种免疫检查点调节剂的新用途。

发明内容

本申请发明人创造性的发现免疫检查点调节剂与衰老或年龄相关性疾病的关系，具体的，向个体施加免疫检查点调节剂后，可以调节个体的免疫反应，并延缓个体的衰老、延长个体的寿命，而且对于预防和/或治疗年龄相关性疾病也有积极性的作用。

本发明的第一方面，提供了免疫检查点调节剂在延缓个体衰老中的应用。

所述的延缓个体衰老包含治疗目的和非治疗目的。

本发明的第二方面，提供了免疫检查点调节剂在预防或改善个体与衰老有关的病理学或非病理学病症中的应用。

所述的与衰老有关的病理学或非病理学病症包含治疗目的和非治疗目的。

本发明的第三方面，提供了免疫检查点调节剂在制备延缓个体衰老，或者，在预防或改善个体与衰老有关的病理学或非病理学病症的药物中的应用。

本发明的第四方面，提供了免疫检查点调节剂在制备治疗和/或预防衰老相关疾病和健康状况的药物中的用途。

本发明的第五方面，提供了免疫检查点调节剂在制备预防和/或治疗年龄相关性疾病的药物中的应用。

免疫检查点是免疫系统中的一种分子，它要么发出信号（共刺激分子），要么关闭信号，帮助控制免疫反应。通过免疫检查点调节剂调节免疫系统，可以区分体内正常细胞和异常细胞，这使得免疫系统能够攻击异常细胞，同时保持正常细胞的完整性。

优选的，所述的免疫检查点调节剂可以为刺激检查点分子或抑制检查点分子（免疫检查点抑制剂）。

在本发明的一个具体实施方式中，优选免疫检查点抑制剂，即能够通过中断免疫抑制信号通路或促进免疫刺激信号通路来增强免疫应答的药剂。

进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂特异性结合至CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、SIRPA、TIGIT或CD47。

其中，CD27（又称肿瘤坏死因子受体超家族成员7；NCBI基因ID:939）是B细胞的记忆标记物。CD27的活性受其配体CD70在淋巴细胞和树突状细胞上的瞬时有效性控制。CD27共刺激可抑制Th17效应细胞功能。

CD28（也称为Tp44；NCBI基因ID:940）在几乎所有人类CD4+T细胞和大约一半的CD8T细胞上组成性表达。其两个配体CD80和CD86结合在树突状细胞上表达，可促进T细胞的增殖。

CD40（又称肿瘤坏死因子受体超家族成员5；NCBI基因ID:958）在多种免疫系统细胞上表达，包括抗原提呈细胞，具有CD40L，又称CD154作为其配体，CD40L短暂表达于活化的CD4+T细胞表面。CD40信号被认为是“许可”树突状细胞成熟，从而触发T细胞活化和分化。

CD122（又称白介素-2受体β亚基；IL2RB）（NCBI基因ID:3560）可增加CD8+效应T细胞的增殖，并且参与T细胞介导的免疫应答。

4-1BB（也称为TNF受体超家族成员9；CD137）（NCBI基因ID:3604）与配体CD137L结合，可诱导T细胞增殖。CD137介导的信号转导也被认为可以保护T细胞，尤其是CD8+T细胞，使其免于活化诱导的细胞死亡。

OX40（又称TNF受体超家族成员4；CD134）（NCBI基因ID:7293）可促进效应T细胞和记忆T细胞的扩张，但也因其抑制T调节细胞的分化和活性以及调节细胞因子的产生而闻名。OX40的配体是OX40L（CD252）。许多抗OX40单克隆抗体已被证明对晚期癌症有临床应用价值。

GITR（也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18；CD357）（NCBI基因ID:8784）可促进T细胞增殖，包括Treg扩增。GITR的配体主要在抗原提呈细胞上表达。GITR抗体已被证明通过丧失Treg谱系稳定性来促进抗肿瘤应答。

ICOS（也称为诱导性T细胞共刺激因子CD278）（NCBI基因ID:29851）在活化的T细胞上表达。其配体为ICOSL，主要在B细胞和树突状细胞上表达。ICOS在效应T细胞功能中起重要作用。

A2AR（又称腺苷A2A受体）（NCBI基因ID:135）被认为是肿瘤治疗中的一个重要检查点，因为免疫微环境中的能够激活A2a受体的腺苷是负免疫反馈环，并且肿瘤微环境中的腺苷浓度相对较高。

B7-H3（也称为CD276）（NCBI基因ID:80381）被认为是共抑制分子。它参与调节T细胞介导的免疫反应。研究表明，虽然该基因的转录本在正常组织和实体瘤中普遍表达，但该蛋白仅在肿瘤组织中优先表达。

B7-H4（也称为含有T细胞激活抑制剂1的V-set结构域；VTCN1）（NCBI基因ID:79679）由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达。高水平的B7-H4与肿瘤进展相关。

BTLA（也称为B和T淋巴细胞衰减器；CD272）（NCBI基因ID:151888）以HVEM（疱疹病毒进入介质）为配体。在人CD8+T细胞从初始细胞向效应细胞表型分化过程中，BTLA的表面表达逐渐下调，而肿瘤特异性CD8+T细胞表达高水平的BTLA。

CTLA-4（也称为细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；CD152）（NCBI基因ID:1493）是免疫球蛋白超家族的成员，编码一种向T细胞传递抑制信号的蛋白质。它是抗癌药Yervoy的靶标。CTLA-4在Treg细胞上的表达可以控制T细胞的增殖。

IDO（又称吲哚胺2,3-双加氧酶1）（NCBI基因ID:15930）是一种具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。IDO可以抑制T细胞和NK细胞，产生并激活Tregs和髓源性抑制细胞，促进肿瘤血管生成。

LAG3（也称为淋巴细胞活化基因-3；CD223）（NCBI基因ID:3902）通过对Tregs的作用以及对CD8+T细胞的直接作用来抑制免疫反应。一些抗LAG3抗体正在进行临床试验，例如BMS-986016（施贵宝百时美）。

PD-1（也称为程序性细胞死亡1；PDCD1）（NCBI基因ID:5133）有两个配体PD-L1和PD-L2。它是一个免疫检查点，通过促进淋巴结抗原特异性T细胞凋亡（程序性细胞死亡）和同时减少调节性T细胞（抗炎、抑制性T细胞）凋亡的双重机制来预防自身免疫。这个检查点是抗癌药Keytruda的靶点。

PD-L1（也称为程序性细胞死亡1配体1；CD274）（NCBI基因ID:29126）在许多不同癌症的肿瘤细胞上表达。PD-L1的表达是肿瘤细胞逃避免疫攻击的主要机制之一。

PD-L2（也称为程序性细胞死亡1配体2；CD273）（NCBI基因ID:80380）通过与PDCD1的相互作用，通过阻断细胞周期进程和细胞因子的产生来抑制T细胞增殖。

TIM-3（也称为T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3；HAVCR2；甲型肝炎病毒细胞受体2；CD366）（NCBI基因ID:84868）在活化的人CD4+T细胞上表达并调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3作为Th1/Tc1功能的负调节因子，在与配体galectin-9相互作用时触发细胞死亡。

VISTA（也称为T细胞激活的V域Ig抑制因子；V-Set免疫调节受体；VSIR）（NCBI基因ID:64115）主要表达在造血细胞上，因此VISTA在肿瘤内白细胞上的一致表达可能使VISTA阻断在广泛的实体瘤中有效。

SIGLEC7（也称为唾液酸结合免疫球蛋白类型凝集素7；CD328）（NCBI基因ID:27036）和SIGLEC9（也称为唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素9；CD329）（NCBI基因ID:27180）是在各种免疫细胞表面发现的蛋白质，包括自然杀伤细胞和巨噬细胞（SIGLEC7）和中性粒细胞，巨噬细胞、树突状细胞和活化的T细胞（SIGLEC9）。SIGLEC7和SIGLEC9可以通过与覆盖细胞表面的聚糖上的末端唾液酸结合来抑制这些细胞的免疫功能。

TIGIT（也称为具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体；VSTM3）（NCBI基因ID:201633）是一种抑制性受体，在自然杀伤（NK）细胞、CD8+T细胞和免疫抑制调节性T细胞（Treg）上表达。

CD47（NCBI基因ID:961）是一种参与β3整合素介导的白细胞信号转导的膜蛋白。目前已知它与血栓反应蛋白-1、信号调节蛋白α（SIRPα；Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶底物1；CD172a）（NCBI基因ID:140885）相互作用，调节各种细胞功能，包括细胞迁移、轴突延伸、细胞因子产生和T细胞活化。最近的研究证实了CD47-SIRPα轴对吞噬功能的抑制作用。

优选的，所述的免疫检查点调节剂为抗体或抗原结合片段。其特异性结合至免疫检查点或其配体。

优选的，所述的抗体可以为人抗体、人源化抗体或非人抗体。

优选的，所述的抗体可以为单克隆抗体或双特异性抗体。

更进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂为特异性结合至CTLA-4、OX40、BTLA、PD-1、CD40、SIRPA或CD47的抗体或抗原结合片段。

再进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂可以是抗CTLA-4抗体（例如，Ipilimumab）、抗PD-1抗体（例如，Nivolumab、Pembrolizumab、Cemiplimab）或抗PD-L1抗体（例如，Avelumab、Atozolizumab、Durvalumab）。

再进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂可以是抗LAG3抗体（例如Relatlimab）、抗CD27抗体（例如Varlilumab）或抗CD137抗体（例如，Utomilumab）。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫检查点调节剂可以是抗OX40抗体（例如PCT/CN2017/112832中描述的）、抗PD1抗体（例如PCT/CN2018/077016中描述的）、抗CD40抗体（例如PCT/CN2018/096494和PCT/CN2019/091564中描述的）、抗PDL1抗体（PCT/CN2019/075654中描述的）、抗CTLA4抗体（例如PCT/CN2017/102816中描述的）或者抗-4-1BB抗体（PCT/CN2018/105162中描述的）。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫检查点调节剂为CTLA-4抗体或其抗原结合片段，所述的CTLA-4抗体为单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体或多特异性抗体。所述的CTLA-4抗体选自人抗体、非人抗体或者人源化抗体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的CTLA-4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6所示。

优选的，所述的CTLA-4抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：9所示，所述的CTLA-4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。

优选的，所述的药物包含CTLA-4抗体和缀合物，所述缀合物为细胞毒素。

优选的，所述的药物还包括药用载体。

进一步优选的，所述的药用载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、着色剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂或崩解剂等等。

优选的，所述的年龄相关性疾病选自癌症、骨质疏松症、骨关节炎、心血管疾病（例如动脉粥样硬化、心血管衰竭、中风或心脏病发作等等）、肥胖、2型糖尿病、黄斑变性、肺功能不全、白内障、肺气肿、肾衰竭、神经退行性疾病（例如阿尔茨海默氏症或帕金森病等）、认知障碍、视觉障碍、听力丧失、脂溢性角化病、皮肤皱纹、脱发或白发。

优选的，所述的年龄相关性疾病是由衰老引发的。

优选的，所述的衰老选自认知障碍、视觉障碍、听力丧失、皮肤皱纹、脱发、白发。

优选的，所述的个体选自人或非人动物。

进一步优选的，所述的人为至少45岁、至少50岁、至少60岁或至少70岁的成年人。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人为至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100岁。

进一步优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物为啮齿动物。在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物选自基因人源化的非人动物或野生型非人动物。

进一步优选的，所述的基因人源化的非人动物选自基因CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、SIRPA、TIGIT或CD47中的一种或两种以上人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的基因人源化的非人动物选自基因CTLA-4、OX40、BTLA、PD-1、CD40、SIRPA或CD47中的一种或两种以上人源化的非人动物。

本发明的第六方面，提供了一种延缓个体衰老、延长个体寿命、降低个体死亡风险、改善个体器官功能、清除个体衰老细胞或者预防和/或治疗年龄相关疾病的组合物，其包含免疫检查点调节剂。

优选的，所述的组合物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、注射剂、吸入剂、含片、栓剂、乳剂、微乳剂、亚微乳剂、纳米颗粒、凝胶剂、粉剂、悬乳液、乳膏剂、胶冻剂或喷雾剂等。

即包含抗体或抗原结合片段中至少一种（例如，一种、两种、三种或四种）的组合物。制备的组合物与其预期给药途径（例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内）相容。所述组合物可包括无菌稀释剂（例如，无菌水或生理盐水）、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗菌剂或抗真菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，以及抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂（例如乙二胺四乙酸）、缓冲剂（如乙酸酯、柠檬酸盐或磷酸盐）和等渗剂（例如，葡萄糖）、多元醇（例如甘露醇或山梨醇）或盐（例如氯化钠）或其任何组合。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体（参见，例如，美国专利No. 4,522,811）。所述组合物的制剂可以配制并封装在安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。如有需要（例如，在可注射制剂中），可通过使用涂层（例如卵磷脂或表面活性剂）来保持适当的流动性。抗体或其抗原结合片段之吸收可藉由包含延迟可以延迟吸收的药剂（例如单硬脂酸铝及明胶）来延长。或者，可通过植入物和微胶囊递送系统来实现有控制的释放，所述系统可包括可生物降解的、生物相容的聚合物（例如，乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚羟基甲酸酯和聚乳酸）。

含有本文所述抗体或抗原结合片段中的一个或多个的组合物可配制成以剂量单位形式（即，含有预定量的活性化合物，以便于给药和剂量均匀的物理离散单元）经肠外（例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内）给药。

成分的毒性和治疗效果可通过细胞培养或实验动物（如猴子）的标准药物程序来确定。例如，可以确定LD50（对50%的人群致命的剂量）和ED50（对50%的人群有治疗效果的剂量）：治疗指数是LD50:ED50的比率。首选具有高治疗指数的药物。如果药剂表现出不良副作用，应注意尽量减少潜在损害（即减少不必要的副作用）。毒性和治疗效果可通过其他标准药物程序来确定。

从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制任何特定药剂的适当剂量，以用于受试者（例如人类）。一个或多个（例如，一个、两个、三个或四个）抗体或其抗原结合片段的治疗有效量将是治疗受试者（例如，治疗与年龄相关的疾病）、受试者（例如，人类受试者）或被确定有发展疾病风险的受试者（例如，40岁、50岁或60岁以上的受试者）的疾病的量，降低受试者（例如人类）一种或多种疾病症状的严重程度、频率和/或持续时间。本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和剂量可由卫生保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法，以及通过观察受试者（例如，人类）中的一个或多个疾病症状来确定。某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量和时间（例如，疾病或疾病的严重程度、以前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及是否存在其他疾病）。

示范性剂量包括每千克受试者重量（例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg）。虽然这些剂量涵盖广泛的范围，但本领域的普通技术人员将理解，治疗剂，包括其抗体和抗原结合片段，其效力是不同的，其有效量可以通过本领域已知的方法来确定。通常，开始时给予相对较低的剂量，主治保健专业人员或兽医专业人员（在治疗应用的情况下）或研究人员（当仍在开发阶段工作时）可以随后逐步增加剂量，直到获得适当的反应。此外，任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、排泄率，抗体或抗体片段在体内的半衰期。

本发明的第七方面，提供了一种延缓个体衰老、延长个体寿命、降低个体死亡风险、改善个体器官功能或清除个体衰老细胞的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

优选的，所述的免疫检查点调节剂特异性结合至CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、SIRPA、TIGIT或CD47。进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂为CTLA-4抗体。

优选的，所述的清除包括但不限于杀死或诱导凋亡。

优选的，通过治疗、预防或降低年龄相关疾病或年龄相关症状发展的风险来降低死亡风险。

其中，年龄相关症状是感染易感性增加、中暑或体温过低的风险增加、对骨折或关节变化（例如从轻微僵硬到严重关节炎）的易感性增加、运动迟缓和受限、总能量减少、便秘、尿失禁，认知障碍（如思维迟缓、记忆和/或思维障碍）、反射和协调能力下降、平衡困难、视力下降、周边视力下降、视力受损、听力损失、皮肤皱纹和下垂、头发变白或变灰、脱发，体重减轻的部分原因是肌肉组织的丧失、虚弱、生育能力下降或更年期。

优选的，所述的器官可以是心血管系统（如肺、心脏、血管）、消化系统（如唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠和肛门）、内分泌系统（例如下丘脑、垂体、松果体或松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺）、排泄系统（如肾脏、输尿管、膀胱、尿道）、淋巴系统（如扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏）、表皮系统（例如皮肤、头发、指甲）、肌肉系统、骨骼系统（例如骨骼、软骨、韧带、肌腱）、神经系统（例如大脑、脊髓）、呼吸系统（例如咽，喉、气管、支气管、肺和膈肌）、生殖系统（如性器官，如卵巢、输卵管、子宫、外阴、阴道、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎）、肌肉系统和骨骼系统（如骨骼、软骨、韧带、肌腱）。

进一步优选的，所述的器官选自大脑、眼睛、皮肤、心脏、肾脏、肺、生殖器官或肝脏中的一种或两种以上的组合。

施加免疫检查点调节剂后，衰老细胞可以被识别，从而增加免疫应答提高清除衰老和功能失调细胞的速度，从而减缓衰老进程，降低出现衰老相关症状的风险。

本发明的第八方面，提供了一种防止或减少受试者细胞或组织衰老发生的方法，述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

优选的，所述的免疫检查点调节剂特异性结合至CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、SIRPA、TIGIT或CD47。进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂为CTLA-4抗体。

本发明的第九方面，提供了一种治疗或降低发生年龄相关疾病的风险的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

优选的，所述的免疫检查点调节剂特异性结合至CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、SIRPA、TIGIT或CD47。进一步优选的，所述的免疫检查点调节剂为CTLA-4抗体。

优选的，所述的治疗可减少细胞中与年龄相关的生物标记物（例如，端粒相关的DNA损伤、p16INK4a肿瘤抑制蛋白、苏丹红-B（SBB））或抑制组织中的细胞形态改变。在一些实施例中，所述治疗可减少皱纹、改善头发质量和覆盖范围以及认知功能。在一些实施例中，对象是非人动物。在一些实施例中，认知功能可以通过平衡木行走、趋地性、视觉定位、爬梯、线缆测试、热板测试或行走轨迹分析来测量。

本发明的第十方面，提供了一种年龄相关性疾病的治疗方法，所述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

本发明的第十一方面，提供了一种减缓受试者衰老过程的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

本发明的第十二方面，提供了一种减缓受试者中年龄相关症状进展的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的免疫检查点调节剂或组合物。

优选的，年龄相关症状选自脱发、白发或灰发。

优选的，年龄相关症状选自视觉障碍或听力损失。

优选的，年龄相关症状是脂溢性角化病或皮肤皱纹。

优选的，年龄相关症状是认知障碍。

优选的，年龄相关症状选自器官功能下降、肌肉力量下降、肌肉质量减少或细胞生理学改变。

优选的，所述的方法或者治疗可以抑制年龄的进展。在一些实施例中，所述治疗可导致杀死衰老细胞中或诱导其凋亡，改善器官的功能，或防止或减少器官中细胞衰老的发生。

本发明表明，针对免疫检查点的抗体可以减缓衰老过程并提高存活率。衰老会影响免疫器官功能（如胸腺），并降低适应性免疫系统和先天免疫系统的功能。因此，一个年老的受试者更容易感染传染病、癌症和其他许多疾病。在细胞水平上，衰老可以引起功能失调细胞的功能和特征变化。随着受试者年龄的增长，免疫系统无法有效地识别和清除这些细胞（例如，通过呈现与衰老过程相关的抗原或肽）。这些衰老细胞随后开始在体内积累（衰老细胞的年龄相关积累）。调节免疫反应可以去除这些功能失调的细胞，从而在细胞、组织、器官或身体层面延缓衰老进程。优选的，施加免疫检查点调节剂可以提高受试者的免疫应答，增强的免疫应答可以提高清除衰老和功能失调细胞的速度，从而减缓衰老进程，降低患上与年龄有关的疾病的风险，提高生存率以及寿命。

抗体（也称为免疫球蛋白）由两类多肽链组成，轻链和重链。本发明所述的抗体可以是完整的四个免疫球蛋白链抗体，包括两个重链和两个轻链。抗体的重链可以是包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD的任何同型或包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等的亚型。轻链可以是kappa轻链或lambda轻链。抗体可以包括两个相同的轻链拷贝和两个相同的重链拷贝。每个重链包含一个可变结构域（或可变区域，VH）和多个恒定结构域（或恒定区域），在其恒定结构域内通过二硫键相互结合，形成抗体的“干”。每个轻链包含一个可变结构域（或可变区域，VL）和一个恒定结构域（或恒定区域），每个轻链通过二硫键结合与一个重链结合。每个轻链的可变区域与它所绑定的重链的可变区域对齐。轻链和重链的可变区域包含三个夹在更保守的框架区域（FR）之间的高变区。

这些高变区被称为互补决定区（CDRs），形成了构成抗体主要抗原结合面的环。这四个框架区域主要采用β-片式构象，CDRs形成环连接，在某些情况下形成beta-sheet结构的一部分。每个链中的CDRs被框架区域紧密地固定在一起，并且与来自另一个链的CDRs一起促进抗原结合区域的形成。

在一些实施例中，抗体是完整的免疫球蛋白分子（例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA）。IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）是高度保守的，与它们的恒定区域不同，特别是与它们的铰链和上CH2结构域不同。IgG亚类的序列和差异是本领域的公知常识，并在Vidarsson等人的“IgG亚类和同系物型：从结构到效应器功能”中进行了描述，《Frontiers in immunology》5（2014）；Irani等人的“人类IgG亚类的分子特性及其对设计抗感染性疾病的治疗性单克隆抗体的意义”《Molecular immunology》67.2（2015）：171-182；Shakib，Farouk等人的“人类IgG亚类：结构、功能和调控的分子分析”，Elsevier，2016年；通过对以上文献的引用将其全部并入本文中。

本发明所述的抗体也可以是来自任何物种（例如人类、啮齿动物、小鼠、骆驼类）的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多专一抗体和嵌合抗体，所述嵌合抗体包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合域。术语“抗原结合域”或“抗原结合片段”是保留完整抗体的特定结合活性的抗体的一部分，即抗体的任何部分能够与完整抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如Fab，Fab'，F（ab'）2和这些片段的变体。因此，在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以是（例如）单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、糖尿病体抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。抗原结合域的非限制性实例包括，例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。在一些实施例中，单链抗体具有一个重链可变域和一个轻链可变域。

只要抗体片段保持所需的全长抗体的亲和力和特异性，就适合在所提供的方法中使用。一个Fv片段是包含了完整抗原识别和结合位点的抗体片段。这个区域由一个重链和一个轻链可变结构域紧密结合的二聚体组成，在自然界中可以共价，例如在单链抗体中那样。正是在这种结构中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面定义一个抗原结合位点。总的来说，六个CDR或其子集赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是一个单一的可变结构域（或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半）也可以识别和结合抗原，尽管亲和力通常低于整个结合位点。

单链抗体（scFv）或抗体片段包括抗体的VH和VL结构域（或区域），其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，单链抗体多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽连接体，使得单链抗体能够形成用于抗原结合的所需结构。

Fab片段包含轻链的可变域和常量域，以及重链的可变域和第一恒定域（CH1）。F（ab’）2抗体片段包括一对Fab片段，它们通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。本领域中还已知抗体片段的其它化学偶联。

双抗是一种带有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含一个VH，连接到同一个多肽链中的VL（VH和VL）。通过使用一个由于太短而不能在同一条链上的两个结构域之间配对的连接器，这些结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。

线性抗体包括一对串联的Fd片段（VH-CH1-VH-CH1），它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。

本发明的抗体和抗体片段可在Fc区域内修饰以提供所需的效应器功能或血清半衰期。

在一些实施例中，本文所述的抗体或抗原结合片段可阻断免疫检查点分子的结合。在一些实施例中，通过与检查点分子结合，抗体可抑制信号通路并上调或下调免疫反应。

在一些实施例中，如本文所述的抗体或抗原结合片段可将免疫应答、活性或T细胞（例如，CD8+和/或CD4+细胞）的数量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些实施例中，如本文所述，其抗体或抗原结合片段可将T细胞（例如，Treg细胞）的活性或数量降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

在一些实施例中，抗体（或其抗原结合片段）以高结合亲和力特异性结合至免疫检查点分子。亲和力可以从动力学速率常数的商（KD=koff/kon）推导出来。测量抗体对抗原亲和力的一般技术包括，例如，ELISA、RIA和表面等离子共振（SPR）。在一些实施例中，KD小于1x 10-6 M、小于1 x 10-7 M、小于1 x 10-8 M、小于1 x 10-9 M或小于1 x 10-10 M。在一些实施例中，KD小于50 nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3nM、2 nM或1 nM。在一些实施例中，KD大于1x10-7m、大于1x10-8m、大于1x10-9m、大于1x10-10m、大于1x10-11m或大于1x10-12m。

本发明所述的“抗体”是指包含至少一个（例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个）互补决定区（CDR）（例如，免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任何一个，或免疫球蛋白重链的三个CDR中的任何一个）的任何抗原结合分子，并且能够与抗原表位特异结合。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施例中，一个抗体可包含人抗体的一个Fc区域。

本发明所述的“人抗体”是指由存在于人体内的内源性核酸（例如，重排的人类免疫球蛋白重链或轻链位点）编码的抗体。在一些实施例中，从人体或在人类细胞培养物（例如，人类杂交瘤细胞）中产生人抗体。在一些实施例中，在非人类细胞（例如，小鼠或仓鼠细胞系）中产生人抗体。在一些实施例中，在细菌或酵母细胞中产生人抗体。在一些实施例中，在含有未排列或重新排列的人类免疫球蛋白位点（例如，重链或轻链人类免疫球蛋白位点）的转基因非人动物（例如，牛）中产生人抗体。

本发明所述的“人源化抗体”是指包含了从非人（例如，小鼠）衍生的最小序列的免疫球蛋白以及人类免疫球蛋白序列的非人抗体。在非限制性实例中，人源化抗体是人抗体（受体抗体）的高变区域（例如，CDR）残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人抗体（例如供体抗体，例如，小鼠、大鼠或兔抗体）的高变区域（例如，CDR）残基所取代。在一些实施例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类（例如，小鼠、）的免疫球蛋白残基取代。在一些实施例中，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰可以进一步改善抗体的性能。在一些实施例中，人源化抗体基本上包含至少一个且通常两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的高变环（CDR）对应于非人类（例如，小鼠）免疫球蛋白的高变环（CDR），并且所有或基本上所有的框架区域都是人类免疫球蛋白的。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体可使用本领域已知的分子生物学方法产生。本领域已知产生人源化抗体之方法之非限制性实例。

本发明所述的“免疫检查点”是指免疫系统的调节器，能增强免疫应答，从而提高衰老和功能障碍细胞的清除率。这些免疫检查点可以是刺激性检查点分子（激动剂）或抑制性检查点分子（拮抗剂，）。它们对自我耐受很重要，它可以防止免疫系统不加选择地攻击细胞。

本发明所述的“免疫检查点调节剂”是指免疫检查点的调节器。免疫检查点调节器通过靶向免疫检查点来提高或降低免疫应答。

本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“预防”是指通过施用本发明所述的免疫检查点调节剂或组合物来抑制症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“治疗”是指在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。在本发明的一个具体实施方式中，包括但不限于逆转、改善、减缓或停止至少一种年龄相关症状或年龄相关疾病的进展。

本发明所述的“衰老”是与变老有关的过程，指个体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象，是许多病理、生理和心理过程的综合作用的必然结果。其包括但不限于细胞变化，体型和外形变化，心血管系统功能衰退，呼吸器官老化，消化系统的变化，肌肉骨骼运动系统变化，神经系统变化，运动反应迟缓，以及增加疾病、虚弱或残疾的易感性和发生频率。

当这个词特别指人和许多动物时，衰老也可以指有机体中停止分裂的单个细胞（细胞衰老）。对人类来说，衰老代表着随时间变化的积累，包括生理和心理上的变化。老龄化是大多数人类疾病已知的最大风险因素之一：在全球每天约15万人死亡中，约三分之二死于与年龄有关的原因。衰老与动态的生物、生理、环境、心理、行为和社会过程的变化有关。一些与年龄有关的变化是良性的，比如头发变白。另一些则导致感官功能和日常生活活动的下降，增加疾病、虚弱或残疾的易感性和发生频率。事实上，年龄增长是人类许多慢性疾病的主要危险因素。但是，事实上，衰老本身只是一种过程或自然现象而不是某种特定疾病。

衰老的特点是逐渐丧失生理完整性，导致功能受损，增加死亡的可能性。这种恶化是人类主要疾病包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病的首要风险因子。大多数人或相当一部分人一生中都会经历一些典型的衰老症状和与年龄相关的疾病。

衰老也是大多数人类疾病已知的最大风险因素之一。如本文所用，与年龄相关的疾病是指与衰老过程相关的疾病。一些常见的与年龄相关的疾病包括癌症、心血管疾病（如心血管衰竭、中风和心脏病发作）、骨质疏松症、肥胖、2型糖尿病、骨关节炎、白内障、动脉粥样硬化、黄斑变性、肺功能不全、肺气肿、肾功能衰竭和一些神经退行性疾病。痴呆症成为与年龄相关的更常见的神经退行性疾病。痴呆症的范围从轻度认知障碍到阿尔茨海默病、脑血管病、帕金森病和卢-盖瑞氏病等神经退行性疾病。此外，衰老与死亡风险直接相关。

癌症和其他与年龄有关的退行性疾病一样，发病率的增加几乎是在生命周期的中间点开始呈指数级增长。因此，癌症也是一种常见的与年龄相关的疾病。如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。这种细胞的例子包括具有异常状态或以快速增殖细胞生长为特征的条件的细胞。该术语包括癌症生长，例如肿瘤；癌性过程、转移组织和恶性转化的细胞、组织或器官，不考虑组织病理类型或侵袭性阶段。还包括各种器官系统的恶性肿瘤，如呼吸系统、心血管系统、肾脏系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝脏系统、胃肠道系统和内分泌系统的恶性肿瘤；以及腺癌，包括大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤等恶性肿瘤，非小细胞肺癌和小肠癌。

在细胞水平上，细胞经历一个自然的生命周期，包括生长、成熟和死亡。这种自然生命周期受到许多因素的调节，而周期的中断涉及许多疾病状态。当细胞经历老化过程时，细胞达到复制极限，停止进一步分裂。细胞通过减缓分裂和进入细胞衰老来接近这个极限。与退化细胞和组织的功能丧失不同，恶性（癌变）细胞必须获得新的（尽管是异常的）功能，使其发展成为致命的肿瘤。这些癌细胞不会像正常细胞在生命周期结束时那样死亡。

细胞衰老是指细胞增殖（生长）基本上不可逆的停止。它发生在细胞经历潜在的致癌压力时。衰老生长停滞的持续性强化了衰老响应至少在一定程度是抑制了癌症发展的观点。衰老被认为是不可逆的，因为没有已知的生理刺激可以刺激衰老细胞重新进入细胞周期。然而，分子生物学操作，例如，某些肿瘤抑制基因的连续失活，可以导致衰老细胞增殖。可能存在尚未被认识的生理环境，在这种情况下，衰老生长停滞是可逆的。不管怎样，延缓衰老是严格的。它由至少两个主要的肿瘤抑制途径p53/p21和p16INK4a/pRB通路建立和维持，现在被认为是恶性肿瘤发生的一个强大屏障。因此，衰老通常被认为是抑制癌症发展的一种反应。细胞程序性死亡可以在衰老细胞中自然发生，这是细胞内信号级联的结果。细胞程序性死亡最常见的形式是细胞凋亡，它在控制种群数量和阻止可能导致肿瘤的大量细胞生长方面起着重要作用。当正确的内部信号被激活时，细胞最终被触发自杀。自噬是另一种细胞程序性死亡，其中细胞自身的内部机制被溶酶体降解。这一过程的发生可能是由于机体自我保护的原因，或者是为了使机体能够保存分配给身体其他部位的资源。与程序性细胞死亡不同，坏死是由创伤、感染或毒素等外部因素引起的细胞和活组织的过早死亡。

衰老细胞或被认为有衰老特征的细胞包括例如丧失分裂能力的细胞、与凋亡有关的细胞和失去自我修复能力的细胞，以及被认为有衰老细胞生物标记物的细胞等。细胞衰老是通过测量衰老相关的ß-半乳糖苷酶（SA-ß-gal）来检测的，这种水解酶只在衰老细胞中催化ß-半乳糖苷酶水解成单糖。另一个目前常用于鉴别培养物和组织中衰老细胞的标记物是p16INK4a肿瘤抑制蛋白。p16INK4a在大多数正常细胞和组织中表达较低或无法检测到，但在衰老诱导的细胞中很容易检测到。其他标记物包括DNA损伤位点、DDR信号、53BP1、磷酸化CHK2、衰老相关异染色质位点（SAHF）、肿瘤抑制蛋白DEC1（在食管癌中删除）和DcR2（诱饵受体2）的表达上调，显著下调的核层蛋白层粘连蛋白B1（LMNB1）的表达。在细胞水平上衰老生物标志还包括基因组不稳定性、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养素敏感解除、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞衰竭和细胞间通讯改变。此外，衰老细胞在染色质组织和基因表达方面也有广泛的变化。这些变化包括大量促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶的分泌，这一特征被称为衰老相关的分泌表型（SASP）（见e.g.，López-Otín等）《衰老的特征》，《细胞153.6》（2013）：1194-1217；Campisi，“衰老、细胞衰老和癌症”，《生理学年鉴》第75期（2013年）：685-705页。

本发明所述的延缓个体衰老包括但不限于延长个体寿命、恢复或增强皮肤弹性或活动增多等等。

本发明所述的与衰老有关的病理学或非病理学病症包括个体反应性下降、皮毛光泽度下降、皮毛颜色灰白、皮毛粗糙、脱毛、眼部损害、眼部分泌物多、角膜混浊、白内障、脊柱后凸、生殖器形态改变、生殖器分泌物多、牙齿形态变化等。优选的，包括但不限于毛发花白、白内障、背部头部等明显脱毛、胡须脱落、活动减少或灵活程度降低等等。

本发明所述的“受试者”、“患者”和“个体”在说明书中可互换地使用，并描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物、人类或非人类。兽医和非兽医应用均被考虑。人类患者可以是成人或青少年（例如18岁以下的人）。除了人类，病人还包括但不限于老鼠、老鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括，例如，非人灵长类动物（例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等）、啮齿动物（例如，老鼠、老鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子）、兔形目动物、猪（例如猪、小型猪）、马、犬、猫、牛和其他家养、农场和动物园动物。在一些实施例中，受试者是男性。在一些实施例中，受试者是女性。在一些实施例中，受试者至少高于相关人群的平均年龄。

在一些实施例中，基于一组或一群受试者来计算百分比分布。在一些实施例中，受试者年龄大于群体中所有受试者至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一些实施例中，受试者年轻于群体中所有受试者至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。

在一些实施例中，受试者是人类。在一些实施例中，人类受试者可为至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100岁。在一些实施例中，人类受试者可小于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100岁。

在一些实施例中，本文所述的方法可使受试者的寿命至少增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%。在一些实施例中，本文描述的方法将受试者的死亡风险、发生年龄相关症状（例如脱发、视力受损）或年龄相关疾病（例如癌症、神经退行性疾病或心血管疾病）的风险降低至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%，17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%。

在一些实施例中，本文描述的方法可将受试者中的细胞衰老生物标记物（例如，SA-ß-gal）降低至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%。

本发明所述的“有效量”足以产生有益或期望结果的量或剂量，包括例如，阻止、减缓、阻滞或抑制疾病或症状的进展。有效量会因受试者的年龄和体重、症状严重程度和给药途径等因素而变化，因此可以根据个体情况确定给药量。

有效量可以在一次或多次给药中使用。举例而言，抗体或抗原结合片段之有效量是指足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减缓及/或延迟受试者之疾病或症状（例如，年龄相关症状）之进展或足以改善、停止、稳定、逆转，在体外或体内延缓细胞衰老过程的用量。如本领域所理解，抗体或抗原结合片段的有效量是可变的，除其他外，其变化取决于患者病史以及诸如所使用抗体的类型（和/或剂量）等其它因素。

用于施用抗体、编码多核苷酸的抗体和/或本文所公开的组合物的有效量和时间表可根据经验确定，并且作出此类判断属于本领域的常识。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将取决于，例如，将接受抗体、编码多核苷酸的抗体和/或本文公开的组合物的哺乳动物，给药途径，特定类型的抗体，本文所公开的编码多核苷酸的抗体，抗原结合片段及/或组合物及其它施用于哺乳动物的药物。选择适当的抗体或抗原结合片段剂量的指南可在抗体和抗原结合片段的治疗用途文献中找到，例如，“单克隆抗体手册”，Ferrone等人编辑，Noges出版，Park Ridge，N.J.，1985，ch.22和pp.303-357；Smith等人的“人类诊断和治疗中的抗体”，Haber等人编辑，瑞文出版社，纽约，1977年，第365-389页。

抗体有效量的典型每日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施例中，剂量可小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3 mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施例中，剂量可大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施例中，剂量约为10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。

本发明所述的“施加”包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、动脉内注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、腹腔内注射、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。

在本文所述的任何方法中，所述至少一种抗体、其抗原结合片段或药物组合物（例如，本文所述的任何抗体、抗原结合片段或药物组合物）及任选地，至少一种额外的治疗剂可至少每周给受试者一次（例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一天一次、一天两次或一天三次）。在一些实施例中，至少两种不同抗体及/或抗原结合片段被投给相同组合物（例如，液体组合物）。在一些实施例中，至少一种抗体或抗原结合片段及至少一种额外治疗剂被投给两种不同的组合物（例如含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和含有至少一种额外治疗剂的固体口服组合物）。在一些实施例中，至少一种附加治疗剂作为药丸、片剂或胶囊施用。在一些实施例中，以两种不同的组合物投与至少一种抗体或抗原结合片段及至少一种额外治疗剂（例如，含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物及含有至少一种额外治疗剂的固体口服组合物）。在一些实施例中，至少一种附加治疗剂作为药丸、片剂或胶囊施用。在一些实施例中，在缓释口服制剂中施用至少一种附加治疗剂。

在一些实施例中，可在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物（例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物）之前或之后将一种或多种额外治疗剂施与受试者。在一些实施例中，一种或多种附加治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物（例如，抗体、抗原结合抗体片段中的任何一种，或本文所述之药物组合物）投与受试者以使得在受试者中一个或多个额外治疗剂与至少一个抗体或抗原结合片段（例如，本文所述之任何抗体或抗原结合片段）在生物活性期内存在重叠。在一些实施例中，附加治疗剂是如本文所述的另一检查点调节剂。

在一些实施例中，可将至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物（例如，本文所述之抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任何一种）投与受试者（例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的期间内）。熟练的医学专业人员可以使用本文描述的用于诊断或跟踪治疗效果的任何方法（例如，观察年龄相关疾病的至少一种症状）来确定治疗期的长度。如本文所述，熟练的医学专业人员还可以基于对治疗有效性的评估（例如，使用本文所述和本领域已知的任何方法）改变给予受试者的抗体或抗原结合抗体片段（和/或一种或多种附加治疗剂）的特性和数量（例如，增加或减少），并且还可以调整（例如，增加或减少）针对受试者的至少一个抗体或抗原结合抗体片段（和/或一个或多个附加治疗剂）的剂量或频率。

本发明所述的“癌症”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为头颈部复发或转移性鳞状细胞癌(SCCHN)。

针对本发明所述免疫检查点的抗体被描述，例如，在Pardoll，“癌症免疫治疗中免疫检查点的封锁”，Nature Reviews Cancer 12.4 (2012): 252; Storz.,“免疫检查点抑制剂的知识产权问题”，MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016；US7605238；US5811097；US6682736；US757595048；US8008449；US895249；US8952136；US8217149；US2014341917；US878779108；US7943743；US838383796；US20180044429；US 8334429；US8334102；US 6312693；US 90288830；US 6974863；US 8674863；US 8614295；US20140348841；US 9957323323；US 9371395；US 9574000；US 9574000；US 20120064096；US2019015309097；US20170070022273；US2011027171358 358；US 6312693；US20110271713535358；US20190185564；US20170051061；US20170198042；通过引用将其全部并入本文中。此外，这些免疫检查点分子的序列、功能和变异可以通过NCBI基因ID轻易地在NCBI网站上找到，所有信息都以引用的方式完整地包含在本文中。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：B-hPD-1小鼠（83周龄）照片，出生日期2017/8/21，拍摄日期2019/4/18，该小鼠呈现明显的眼部毛发脱落，且胡须均已脱落。

图2：B-hPD-1小鼠（83周龄）照片，颈部和背部毛发花白，毛发稀疏，眼周毛发脱落。

图3：不同周龄B-hCTLA-4小鼠注射抗人CTLA-4抗体（给药组）或生理盐水（对照组）后体重曲线图。

图4：不同周龄B-hCTLA-4小鼠注射抗人CTLA-4抗体（给药组）或生理盐水（对照组）后小鼠存活率曲线图。

图5：不同周龄SIRPA/CD47小鼠注射抗人CD47抗体（给药组）或生理盐水（对照组）后体重曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：免疫检查点基因人源化小鼠的自然衰老模型

使用模式动物进行生物学研究是常规手段。在衰老研究中，采用自然衰老模型在生理衰老过程中最符合人类衰老的特点。目前用于自然衰老模型的动物实验以常用的大鼠或小鼠为主。百奥赛图已经利用基因编辑技术将小鼠体内的多个免疫检查点基因用人源序列进行替换，由于人类基因片段的原位替换，小鼠体内可表达或部分表达人源蛋白，这些模式动物已经广泛的用于抗人抗体的筛选和药效评价。本实施例利用这些基因人源化模式动物建立了自然衰老模型，经过长期的观察实验，发现这些免疫检查点基因人源化小鼠的衰老状态建立的自然衰老模型与野生型小鼠相似，未发现明显差别。

野生型衰老小鼠模型（C57BL/6）：

和人类一样，老鼠在它们的一生中经历了年轻、中年、老年和非常老的时期。老鼠的中年期从10个月大开始，到14-15个月左右结束。这一时期相当于人类38-47岁。

老鼠的老年从18到24个月不等。它相当于人类56-69岁。这一时期的特点是几乎所有的小鼠品系的生物标志物都出现衰老变化。对于C57BL/6小鼠，这一时期的上限约为24个月大。尸检和病理评估变得非常有用。许多与衰老相关的组织学病变在24个月后变得相当清晰。

在这段时间之后，许多老鼠会患上菌株特异性疾病，这些疾病会影响生物标记物并产生不一致的结果。超过24个月大的老鼠被认为是“非常老的”，存活率明显下降。

免疫检查点基因人源化小鼠衰老模型：

选择7-8周龄健康的免疫检查点基因人源化小鼠（自然合笼得到）入组，每次入组雌性和/或雄性至少15只，每两个月入组一次，所有小鼠均在SPF级别下按照常规方法饲养，提供标准饮食（饲料为Co60辐照实验鼠生长繁殖饲料，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，货号为1010060；饮用水经高压灭菌），笼具每周清洁一次，室温保持在20-26℃和相对湿度为40-70%，12/12小时光照/黑暗循环，笼中提供絮窝纸。随着年龄增长，动物自然死亡或达到安乐死标准。

实验以小鼠入组为准，每周巡查所有小鼠一次，每月对动物的老化度进行观察评估并称重一次，其中老化度评估主要从外在形体及行为学改变，观察并记录小鼠的反应性、皮毛光泽、皮毛颜色、皮毛粗糙程度、脱毛程度、眼部损害、眼部分泌物、角膜混浊、白内障、脊柱后凸、生殖器形态、生殖器分泌物、牙齿形态等多项指标，再根据程度不同给予客观的记录。

目前已开展了CTLA-4、OX40、BTLA、PD-1、CD40、SIRPA/CD47等涉及7个基因的6种人源化小鼠的实验，每种小鼠选择7至9个批次小鼠入组实验，这6种小鼠中，最早入组开始实验的CTLA-4，最早入组的小鼠已经达到24月龄；最晚开始实验的是CD40，最早的小鼠已有16个月。整体来说，这些小鼠约在14-15月龄时普遍出现典型的衰老症状，包括毛发花白、白内障、背部头部等明显脱毛、胡须脱落、活动减少、灵活程度降低，个别小鼠有自发肿瘤等（见图1-2）。不同基因人源化小鼠在同月龄时体重和生存率相似（B-hOX40小鼠，n=59，其中♀30/♂29，小鼠月龄15个月时存活♀29/♂26，平均体重♀33.8g，♂47.1g，整体存活率94.7%；B-hCTLA-4小鼠，n=57，其中♀30/♂27，小鼠月龄15个月时存活♀29/♂25，平均体重♀36.0g，♂47.4g，整体存活率93.2%），同一基因人源化小鼠的整个生命周期也呈现体重先持续增加，然后维持稳定至极老后下降的趋势，例如B-hCTLA-4小鼠在几个典型年龄阶段的体重和存活率情况如表1所示。上述特征与野生型小鼠一致。

表1

实施例2：利用自然衰老模型检测免疫检查点抗体的效果

将自然衰老的免疫检查点基因人源化小鼠随机分为给药组或对照组，其中给药组注射抗人免疫检查点抗体，对照组注射等量生理盐水，初步研究结果表明免疫检查点抗体有助于延缓小鼠的衰老表现。

以B-hCTLA-4小鼠为例，该小鼠首批入组雄鼠36只，在81-85周龄时存活30只（对应约19月龄），全部表现明显的早期衰老症状，将这些小鼠随机分为对照组和给药组（n=15），其中给药组腹腔注射3mg/kg的抗人CTLA-4抗体1次（该抗体由祐和医药提供，见PCT/CN2017/102816，克隆号为4G12。4G12的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQID NO: 1-6（Kabat编号）或SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3-6（Chothia编号）中。除非在本公开内容中特别指出，否则在本公开内容中默认使用Kabat编号。其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示），对照组注射等量生理盐水，给药频率为每周1次，共给药26次。每周观察小鼠状态、记录存活情况并称量小鼠的体重。对实验结果进行评估分析，结果显示对照组和给药组的小鼠体重差异不大（图3），表明免疫相关不良反应（irAEs）是可耐受和可控的。对小鼠的存活数量及存活率进行分析（图4），可见给药组小鼠的存活情况明显优于对照组，且曾出现过连续9周无小鼠死亡。此外，与对照组相比，给药组小鼠皮肤弹性较好（在给药时由操作人员评估），且对其行为进行观察评估表明给药组小鼠的运动和精神状态均优于对照组。以上研究结果表明抗人CTLA-4抗体有助于延缓机体衰老。

此外，还可以通过其他方法来评估抗人抗体延缓机体衰老的效果，例如检测小鼠的生理和生化指标，包括观察与衰老相关的指标的变化，如，检测端粒相关DNA损伤；观察细胞形态；检测与衰老相关的标记物水平，如p16INK4a肿瘤抑制蛋白；通过组织化学染色标记衰老细胞（如苏丹黑B，SBB）；从而评估机体的衰老程度。除了目视检查评估(例如观察皮毛、尾巴、身体组成评分)外，还可以进行行为学研究，包括梁行走，趋地性，视觉定位，爬梯，电线测试，热板测试和步行轨迹分析等，进一步筛选、评估有助于适度提高免疫力、延缓衰老的免疫检查点调节剂。

实施例3利用自然衰老模型检测免疫检查点抗体的效果

取SIRPA/CD47双基因纯合子，6周龄时入组33只（8-9周），在74-75周龄时全部存活且全部表现明显的早期衰老症状，将这些小鼠随机分为对照组和给药组，其中给药组（n=17）腹腔注射150ug的抗人CD47抗体1次（该抗体由祐和医药提供，见PCT-CN2020-110544），对照组（n=16）注射等量生理盐水，给药频率为每周1次，从75周起共给药10次，具体给药方案见下表2。每周观察小鼠状态、记录存活情况并称量小鼠的体重，体重和存活总结于表3中。对实验结果进行评估分析，发现对照组与治疗组的小鼠体重具有明显差异（p=0.001）（图5），对小鼠的存活数量进行分析，对照组小鼠在整个实验周期内均存活，但给药组死亡4只小鼠，可见对照组小鼠的存活情况优于给药组。以上研究结果表明该抗人CD47抗体可能具有一定毒性，在治疗衰老方面作用不明显。

表2给药方案

表3各组小鼠存活情况及体重情况

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120> 延缓衰老的方法和药物

<130> 1

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Thr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Arg Gly Gly Gly Tyr

1 5

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (10)

1.免疫检查点调节剂在延缓个体衰老、预防或改善个体与衰老有关的病理学或非病理学病症中的应用。

2.免疫检查点调节剂在制备延缓个体衰老，或者，在预防或改善个体与衰老有关的病理学或非病理学病症的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的免疫检查点调节剂特异性结合至CD137、CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9或TIGIT。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的免疫检查点调节剂为CTLA-4抗体或其抗原结合片段，所述的CTLA-4抗体为单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体或多特异性抗体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的CTLA-4抗体选自人抗体、非人抗体或者人源化抗体。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的CTLA-4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物包含CTLA-4抗体和缀合物，所述缀合物为细胞毒素。

9.根据权利要求2或8所述的应用，其特征在于，所述的药物还包括药用载体。

10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的个体选自人或非人动物，所述的非人动物为啮齿动物，所述的非人动物选自基因人源化的非人动物或野生型非人动物。

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