KR20150130115A

KR20150130115A - 상온 대기압 플라즈마를 이용한 치은 섬유아세포의 세포활성도 촉진 방법

Info

Publication number: KR20150130115A
Application number: KR1020140057279A
Authority: KR
Inventors: 김경남; 권재성; 최은하; 김용희
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2015-11-23

Abstract

본 발명은 상온 대기압 플라즈마 젯을 이용하여 세포의 활성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

상온 대기압 플라즈마를 이용한 치은 섬유아세포의 세포활성도 촉진 방법{METHOD FOR INCREASING CELLULAR ACTIVITY OF GINGIVAL FIBROBLAST BY USING NON-THERMAL ATMOSPHERIC PRESSURE PLASMA}

본 발명은 상온 대기압 플라즈마를 이용한 치은 섬유아세포의 세포활성도 촉진 방법에 관한 것이다.

치주염은 치주 조직의 염증 질환이다. 이 질환의 치료는 질환 원인을 제거시키는 단계를 포함하며, 치주 재생으로 알려진 치주 상처의 치료라는 어려운 과정이 뒤따른다. 치주 재생은 치은 세포의 매트릭스의 부착, 증식, 분화 및 합성과 같은 세포 활성이 가장 중요한데 그 이유는 치은 세포가 치주 조직에서 가장 풍부한 세포이기 때문이다.

에나멜 기질 단백질, 치주 인대 세포(periodontal ligament cells) 및 성장 인자들의 사용과 같은 방법에 의하여 치은 섬유아세포(gingival fibroblasts)의 세포 활성 증진을 통하여 치주 조직(periodontal tissue)의 재생 시도에 대한 다수의 연구가 이미 진행되고 있다. 최근에, 레이저를 이용한 치료법이 관심을 받고 있는데, 치은 섬유아세포의 증진 및 유전자 발현의 증가를 일으키는 저출력 레이저의 이용이 특히 각광을 받고 있다. 그러나, 레이저 치료법은 레이저에 의하여 발생되는 내인성 열 및 위험한 플럼(plum)으로 인해 주변 조직의 비선택적 침습을 야기할 수 있다는 단점이 있다.

플라즈마(plasma)는 일반적으로 고도의 활동성 이온(highly reactive ion), 전자 및 라디칼이 풍부한 일부 이온화된 가스에 관한 것이다. 이 기술은 다양한 산업적 응용을 위하여 널리 사용되고 있으나, 상온 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)가 최근에 개발되었으며, 이는 최종제품에 열로 인한 상해를 주지 않아서, 바이오 물질에 적용이 가능하다. 특히, 직접적으로 세포 또는 살아있는 조직에 적용할 수 있다.

본 발명의 목적은 치은 섬유아세포의 세포 활성을 증진시키는 방법을 목적으로 하며, 이를 위하여 상온 대기압 플라즈마 젯을 이용하는 것을 특징으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 예의 상온 대기압 플라즈마 젯(NTAPPJ)을 이용하여 세포의 활성에 대한 연구를 수행하여, NTAPPJ을 세포에 적용함으로써 세포 활성을 증진시킬 수 있다는 발견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 치은 섬유아세포 배양 시 세포를 상온 대기압 플라즈마에 노출하는 단계를 포함하는 세포 활성 촉진 방법을 제공할 수 있다.

상기 상온 대기압 플라즈마 노출 조건은 세포배지로부터 약 5 내지 20 mm의 거리를 두고 조사하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 약 10 mm의 거리를 둘 수 있다.

상기 상온 대기압 플라즈마 노출 조건은 전압은 2.4 내지 5 W이고, 조사시간은 1분 내지 4분이며, 유입 기체는 공기이고 유속은 0.5 lpm 내지 1.5 lpm으로 바람직하게는 1 lpm인 것을 특징으로 한다.

상기 상온 대기압 플라즈마를 조사하는 단계는 세포를 배지에 먼저 넣고 세포가 들어 있는 배지에 조사할 수 있다.

또는 상기 상온 대기압 플라즈마를 조사하는 단계는 배지에 먼저 조사를 한 후 조사된 배지에 세포를 넣을 수 있다.

상기 상온 대기압 플라즈마는 치은 섬유아세포에서 TFG-β 및 VEGF의 유전자 발현을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

상기 유전자 발현의 촉진은 일산화질소(nitric oxide)에 의하여 유발되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명에 사용되는 상온 대기압 플라즈마 제공 장치를 제공할 수 있다. 상기 장치는 펜슬형 전극을 사용하며, 교류(AC) 고압전원발생장치와 연결되어 있는 구조이다. 상기에서, 플라즈마 젯이 분출되는 출구의 펜슬형 전극 반대편에 기체가 유입되는 유입구가 존재한다. 또한, 상기 장치는 석영 튜브 내에 내부 전극이 형성되어 있으며, 플라즈마 젯의 분출구 주변은 다공성 알루미나로 이루어져 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상온 대기압 플라즈마를 세포에 조사함으로써 세포의 활동을 촉진시키는 효과를 제공한다. 특히, 특정 조건으로 상온 대기압 플라즈마를 조사하는 경우 열로 인한 상해 없이 세포 활동의 촉진이 가능하다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 이용 가능한 상온 대기압 플라즈마 젯의 모식도를 보여주는 다이어그램이다.
도 2는 상온 대기압 플라즈마 젯을 세포에 조사하는 방법을 보여주는 모식도로서, (a)는 직접 조사 방법(direct treatment method)이고, (b)는 배지 조사 방법(media treatment method)이다.
도 3은 상온 대기압 플라즈마 젯의 노출 여부에 따른 사람 유래 치은 섬유아세포에 대한 세포 부착(a) 및 세포 증식(b)을 보여주는 그래프이다.
도 4는 배양 3시간 후의 사람 유래 치은 섬유아세포의 모양을 보여주는 이미지이다. (a)는 비처리된 대조군 세포이고, (b) 내지 (g)는 2종의 시험군 세포로서, 2종의 다른 방법에 의하여 상온 대기압 플라즈마 젯에 노출되었다. 직접 처리 방법에 의하여 1분(b), 2분(c), 4분(d) 노출한 것이고, 배지 처리 방법에 의하여 1분(e), 2분(f), 4분(g) 노출한 것이다.
도 5는 상온 대기압 플라즈마 젯 노출 여부에 따라 5일째에 사람 유래 치은 섬유아 세포의 (a) TGF-β, (b) VEGF, (c) COL-I, (f) iNOS의 상대적 유전자 발현을 보여주는 그래프이다. 직접 처리 방법에 의하여 1분(1D), 2분(2D) 또는 4분(4D) 이고, 배지 처리 방법에 의하여 1분(1M), 2분(2M), 4분(4M)을 나타낸다. 또한, (d)는 TGF-β, (e)는 VEGF에 대하여, 화학 스캐빈저(scavenger)를 이용한 결과 또한 그래프에서 보여주는 것으로, c-PTIO를 배지에 첨가한 후 직접 처리 방법에 의하여 1분(1C), 2분(2C) 또는 4분(4C), 트로록스(trolox)를 배지에 첨가한 후 직접 처리 방법에 의하여 1분(1T), 2분(2T) 또는 4분(4T), 나트륨 피루베이트(sodium pyruvate)를 배지에 첨가한 후 직접 처리 방법에 의하여 1분(1S), 2분(2S) 또는 4분(4S)을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 플라즈마를 이용하여 치은 섬유아세포의 증식 방법에 2.4W~5W의 전압이 인가되는 경우 전압(Kv)과 전류(mA)를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 상온 대기압 플라즈마 젯 장치를 이용하여 세포의 활동을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

“플라즈마”는 물질 중에서 가장 낮은 에너지 상태를 가지고 있는 고체에 열을 가하여 온도가 올라가면 액체가 되고 다시 열에너지가 가해지면 기체로 전이를 일으킨다. 계속해서 기체가 더 큰 에너지를 받으면 상태전이와는 다른 이온화된 입자들이 만들어 지게 되며 이때 양이온과 음이온의 총 전하수는 거의 같아진다. 이러한 상태가 전기적으로 중성을 띄는 플라즈마 상태라고 한다.

도 1은 본 발명에 따른 상온 대기압 플라즈마를 발생시키는 장치를 개시하고 있다.

본 발명에 따른 플라즈마 발생 장치는 펜슬형 전극을 사용하며, 교류(AC) 고압전원발생장치와 연결되어 있는 구조이다. 플라즈마 젯이 분출되는 출구의 펜슬형 전극 반대편에 기체가 유입되는 유입구가 존재한다. 또한, 석영 튜브 내에 내부 전극이 형성되어 있으며, 플라즈마 젯의 분출구 주변은 다공성 알루미나로 이루어져 있다.

본 발명에서는 NTAPPJ의 가스는 1 L/min 속도의 압축 공기를 사용하였고 약 1.1 kV 를 인가하여 상온 대기압 플라즈마를 생성하였다. 치은 섬유아세포를 12-wells plate에서 넣고, 1 분, 2 분, 4 분간 NTTAPPJ에 노출시켰다.

본 발명에 따른 상온 대기압 플라즈마 젯을 이용한 세포 활동의 촉진 조건은 전압은 2.4 내지 5W이고, 조사시간은 1분 내지 4분이며, 유입 기체는 공기이고 유속은 노즐의 지름크기가 2 mm 일 때 레이놀즈 숫자가 1500 내지 2000을 만족하는 1 lpm인 것을 특징으로 한다. 노즐의 지름크기에 따라 유속은 상황에 따라 조정된다.

플라즈마 조사는 '직접 처리 방법(direct treatment method)'과 '배지 처리 방법(media treatment method)'으로 나뉜다. 직접 처리 방법은 상온 대기압 플라즈마 젯을 세포가 담긴 배지에 직접 분사하는 것을 의미하고, 배지 처리 방법은 배지에 미리 플라즈마를 조사한 후에 조사된 배지에 세포를 혼합하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 세포 활동 촉진 방법은 직접 처리 방법 및 배지 처리 방법이 모두 적용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 사용된 치은 섬유아세포는 상업적으로 시판되는 것으로서(HGF-1, American Type Culture Collection, USA), 3 내지 6회 계대 배양한 것이다. 세포는 Dulbecco? Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco, USA)에서 10 % 태아 소 혈청(FBS, Gibco, USA) 및 1 % 항생제(penicillin/streptomycin, Gibco, USA)를 넣고 배양하였다.

모든 세포 실험은 2가지 방법으로 수행되었다. 첫번째 그룹은 세포를 표준 12-well 배양 플레이트(SPL, Korea)에 1 ml의 배양 배지를 함유하여 배양하였다. 세포를 함유한 배양 배지는 즉시 NTAPPJ에 노출시켰다. 두번째 그룹은 세포가 없는 표준 12-well 배양 플레이트(SPL, Korea)에 1 ml의 배양 배지를 넣고 NTAPPJ 로 전처리한 후, 세포를 추가하였다. 첫번째 그룹을 '직접 처리' 그룹이라고 하고, 두번째 그룹을 '배지 처리' 그룹이라고 한다.

본 발명에 따른 세포 활동 촉진 방법은 상온 대기압 플라즈마 젯을 이용하여 플라즈마를 조사함으로써 세포 내 세포성장인자를 자극하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법은 세포 성장 인자인 TGF-β 및 VEGF의 유전자 발현을 촉진한다는 데 그 특징이 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

세포 부착 및 세포 증식

부착된 세포에 대한 NTPPJ의 효과는 수용성 테트라졸리윰 분석(WST, Daeil-lab, Korea)에 의하여 측정되었다. 미리 계수된 1 x 10⁵ 세포는 NTAPPJ 노출의 이전 (Direct Treatment group) 또는 이후 (Media Treatment group) 그룹으로 분류되었고, 부착된 세포의 상대적 수를 세고, WST 분석을 이용하여 12시간 배양하였다. 비부착된 세포는 세척하여 떼어내었다. 흡광도는 리더기(Epoch, BioTek, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정되었다. 그 결과는 대조군에 대하여 상대적 백분율로 표시되었다.

세포의 증식에 대한 NTAPPJ 의 영향은 DNA 합성 동안에 BrdU 결합을 이용하여 평가하였다. 미리 계수된 1 x 10⁵ 세포를 NTAPPJ 노출의 이전 (for Direct Treatment group) 또는 이후(for Media Treatment group)에 위치시키고, 배양 3일째에 100 μl의 100 mM BrdU 용액(Roche Applied Science, Germany)을 각 배양 세포에 첨가하였다. BrdU 를 갖는 세포는 8 시간 동안 항온처리하고, 90분 동안 퍼옥시다아제와 접합된 항-BrdU와 반응시키고 색깔 현상을 위하여 테트라메틸벤지딘과 반응시켰다. 흡광도는 리더기(Epoch, BioTek, USA)를 이용하여 370 nm에서 측정하였다.

NTAPPJ 노출 후 세포 부착 및 사람 유래 치은 섬유아세포의 세포 흡착 및 증식이 도 2에 나타나 있다. 이 결과들에서는 '직접 처리(Direct treatment)'및 '배지 처리(Media treatment)' 방법 모두에 대하여 NTAPPJ 노출 시 세포 부착의 수에 있어서 유의적 변화는 통계적으로 확인할 수 없었다(도 2a). 또한, 세포 증식의 관점에서, '직접 처리(Direct treatment)' 및 ' 배지 처리(Media treatment)' 방법 모두에 대하여 NTAPPJ 노출된 세포와 대조군 간의 통계적으로 유의적 차이는 없었다(도 2b).

세포 모양

세포 모양에 대한 NTAPPJ의 영향은 형광 염색과 공촛점 레이저 현미경에 의하여 측정되었다. 미리 계수된 1 x 10⁴ 세포는 NTAPPJ 노출 이전 (Direct Treatment group) 또는 이후 (Media Treatment group)에 놓이고, 세포들을 DAPI (파란색으로 핵 염색, Invitrogen, USA) 및 로다민 팔로이딘 (붉은색으로 액틴 필라멘트 염색, Invitrogen, USA) 으로 염색하고 3시간 동안 배양하였다. 염색된 세포들은 공촛점 레이저 현미경(LSM700, Carl-Zeiss, USA)으로 영상화하였다.

NTAPPJ 노출 후 세포 모양은 도3에 나타난 사진과 같다. 상기 사진에서는 '직접 처리' 및 '배지 처리' 방법 모두에서 1분 및 2분간 노출된 세포의 필로포디아 프로젝션 증거의 잘 신장된 세포를 보여준다(도 3(b), 3(c), 3(e) and 3(f)). 이들 사진과 비교하면, 상기 언급된 군들과의 차이가 명확하지는 않지만, NTAPPJ에 노출되지 않은 대조군 세포들은 좀 둥그런 편이다 (도 3(a)). 그러나, '직접 처리' 및 '배지 처리' 방법에 의하여 NTAPPJ에 4분간 노출된 세포들은 더 작고 신장되어 있지 않은 것은 명확하였다(도 3(d) 및 3(g)).

mRNA 의 정량 분석

mRNAs의 발현에 미치는 NTAPPJ의 영향은 RT-PCR 분석에 의하여 측정되었다. 미리 계수된 1 x 10⁴ 세포를 NTAPPJ 노출의 이전 (직접 처리 그룹) 또는 이후 (배지 처리 그룹)에 놓고 5일간 세포 배양 후 각 실험군 및 대조군의 세포로부터 총 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 추출하였다. 상보적 DNA (cDNA)를 High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 획득하고, SYBR green mix reagent (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 각 유전자-특이적 프라이머의 서열은 collagen type I (COL-I), transforming growth factor (TGF-β), vascular endothelial growth factor (VEGF), inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 GAPDH에 대한 기존 연구를 참조로 하였다[Hakki, S.S. and S.B. Bozkurt, Effects of different setting of diode laser on the mRNA expression of growth factors and type I collagen of human gingival fibroblasts . Lasers in Medical Science, 2012. 27(2): p. 325-331. 및 Lin, S.J., et al., Nitric oxide inhibits androgen receptor-mediated collagen production in human gingival fibroblasts . Journal of Periodontal Research, 2012. 47(6): p. 701-710].

실시간 PCR 싸이클은 95 ℃에서 4분간, 60 ℃에서 1분간 그리고 70 ℃에서 1분간 40 싸이클을 수행하였다.

또한, 100 μM 카르복시-PTIO (Sigma Aldrich, USA), 10mM 나트륨 피루베이트 (Sigma Aldrich, USA) 및 10 μM 트롤록스(Sigma Aldrich, USA) 각각을 화학적 스카벤저로 및 '직접 처리' 그룹에 추가하여 산화질소, 과산화수소 및 활성산소의 역할을 확인하였다. NTAPPJ에 노출하고 실시간 PCR을 통하여 동일한 방식으로 상기 샘플에서 동일한 시간으로 측정하였다.

통계적 분석

세포 부착, 증식 및 mRNA의 정량은 테스트/대조군 당 6개 샘플에서 수행되었고, 실시간 PCR 실험을 2번 반복하였다. 모든 결과에 대한 통계적 분석은 SPSS PASW 18.0 program (SPSS Inc., USA)을 이용한 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Tukey method를 통하여 분석되었고, 통계적 유의성은 p < 0.05에서 선언되었다.

유전자 발현에 대한 mRNA의 정량 분석은 RT-PCR을 사용하여 수행되었고, 그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다. '직접 처리' 및 '간접 처리' 방법의 테스트 샘플 모두에서 TGF-β의 상대적 발현이 대조군보다 상당히 높게 나타났다(p<0.05) (도 4a). 또한, 상대적 발현은 NTAPPJ의 노출 1분에서 최고였으며, 노출 4분에서 최하였다. 이러한 경향은 NTAPPJ를 노출시킨 다른 유전자 발현에서도 유사하였다(도 4(b)). COL-I 발현의 결과를 보면, '직접 처리' 방법에 의해 NTAPPJ를 2분 조사한 세포에서 상대적 발현이 상당히 증가되었음을 알 수 있다(도 4(c) 2D).

유전자 발현에 미치는 상이한 화학 물질의 역할은 스카벤저의 추가를 통해서 분석하였다. 이 결과, c-PTIO의 추가는 TGF-β에 대한 상대적 유전자 발현의 상당한 감소를 나타내었다(도 4(a)의 1D, 2D 및 4D와 비교되는 도 4(d)의 1C, 2C 및 4C). 이것은 또한 c-PTIO가 첨가된 VEGF의 유전자 발현에 대한 경우와 같다(도 4(e)). 그러나, 트롤록스의 첨가는 TGF-β 및 VEGF 발현에 대하여 어떠한 효과를 시각적으로 확인할 수 없었고, 나트륨 피루베이트의 첨가는 c-PTIO과 트롤록스의 사이의 어느 정도로 영향을 끼쳤다.

최종적으로, iNOS의 상대적 발현에 대한 결과는 테스트 군에서 iNOS 유전자 발현에 어떠한 통계적 유의적 증가를 나타내지 않았으며, '직접 처리' 방법에 의한 NTAPPJ의 4분 조사에 의한 세포의 평균 상대적 발현양은 다른 것들보다 더 높아 보였다.

이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의하여 설명되었으나, 본 발명은 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

Claims

세포 배양시 세포를 상온 대기압 플라즈마에 노출하는 단계를 포함하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 치은 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마를 노출하는 단계는 세포배지로부터 5 내지 20 mm의 거리를 두고 조사하는 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상온 대기압 플라즈마를 노출하는 단계는 조건은 전압은 2.4 내지 5 W이고, 조사시간은 1분 내지 4분이며, 유입 기체는 공기이고 유속은 0.5 내지 1.5 lpm인 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마는 세포 배지에 먼저 조사한 후 조사된 배지에 세포를 넣는 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마는 세포를 배지에 넣은 후 세포가 있는 배지에 조사하는 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상온 대기압 플라즈마는 세포 내 TFG-β 및 VEGF의 유전자 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자 발현의 촉진은 일산화질소(nitric oxide)에 의하여 일어나는 것을 특징으로 하는 세포 활동 촉진 방법.
제1항에 있어서, 상기 상온 대기압 플라즈마는 펜슬형 전극을 가지고, 교류(AC) 고압전원발생장치와 연결되어 있는 구조를 갖는 장치로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 세포 촉진 방법.
제9항에 있어서, 상기 장치는 플라즈마 젯이 분출되는 출구의 펜슬형 전극 반대편에 기체가 유입되는 유입구를 갖고, 석영 튜브 내에 내부 전극이 형성되어 있으며, 플라즈마 젯의 분출구 주변은 다공성 알루미나로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 세포 촉진 방법.