KR101248668B1 - 저온 상압 플라즈마 노출을 이용한 세포의 생장 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저온 상압 플라즈마 노출을 이용한 세포의 생장 조절 방법에 관한 것으로, 플라즈마 가스 유입량, 입력 전압, 세포배양배지의 양, 플라즈마 노출 시간, 발생원과의 거리, 또는 플라즈마 노출 횟수 등의 플라즈마 노출 조건을 조절하여 세포의 생장을 촉진 또는 억제할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

저온 상압 플라즈마 노출을 이용한 세포의 생장 조절 방법{Method for controlling cell proliferation by using a non-thermal atmospheric pressure plasma exposure}

본 발명은 세포에 조사할 수 있는 저온 상압 플라즈마 발생장치를 통해 세포 배양 시 플라즈마 처리하여 정상세포, 줄기세포, 암세포 등의 생장을 촉진 또는 억제하는 저온 상압 플라즈마 노출을 이용한 세포의 생장 조절 방법에 관한 것이다.

플라즈마는 기체의 이온화된 상태로서 특정 조건에서는 중성기체와 전자 및 이온이 열적 평형을 이루지 않은 상태로 안정하게 유지되는 비평형성을 갖는다. 이러한 성질을 갖는 비평형 플라즈마 (Non-equilibrium plasma)는 물체의 표면과 상호작용을 할 때 커다란 에너지 전달 없이 필요한 화학적 반응만 강하게 일으킬 수 있어 반응하는 물질을 손상시키지 않으면서 표면 처리가 가능한 장점이 있으며 물질 표면 가공, 마이크로일렉트로닉스 (microelectronics), 반도체 공정 등에 널리 사용되고 있다.

플라즈마는 넓은 영역에서 균일한 밀도로 만들기 위해 기존에는 압력을 낮춘 진공 챔버 내에서 발생시켰으나 근래에는 전극의 간격을 줄임으로써 상압 (atmospheric pressure) 정도의 비교적 높은 압력에서도 방전을 일으킬 수 있어 기존의 저압 방전과는 달리 진공 챔버 및 이에 따른 펌프 장치가 필요하지 않기 때문에 플라즈마 발생에 필요한 비용이 적으며 일상적인 기체압력 범위에서 사용할 수 있으므로 그 응용성이 매우 높고 유기물 가공 및 생체에도 응용 가능하다는 장점이 있다.

특히, 이러한 상압 플라즈마를 이용한 바이오-메디컬 (Bio-medical) 응용 분야에 대한 연구가 진행되기 시작하면서 비평형 상태의 플라즈마가 사람 세포 또는 조직에 미치는 영향에 대한 관심이 높아지고 있다. 그러나 플라즈마가 화상 등으로 생긴 피부손상 치유 나 암세포와 같은 악성 세포의 제거 및 사멸, 미용을 위한 피부개선, 뼈나 치아의 법랑질 (Enamel) 성분 회복 등에 영향을 미친다고 알려져 있지만 어떠한 메커니즘을 통해 손상된 세포의 회복, 암세포의 사멸을 유도하는지 연구된 바가 없다. 단지 최근 들어 바이오-메디컬 응용을 위한 상압 저온 마이크로 플라즈마 분사장치를 개발하거나 (한국 공개특허 제2009-0028661호), 대기압 플라즈마를 이용하여 미생물이 오염된 대상을 살균 하는 방법이 고안되었다 (한국 공개특허 제 2009-0021172호).

현재 사람에 직접 적용하지 않고 세포 수준에서 세포 생장을 조절할 수 있는 적정 에너지 수준의 마이크로 플라즈마 장치를 개발하고 이를 이용한 플라즈마와 사람세포간의 상호작용 기전을 이해할 수 있는 원천 기술 연구가 매우 필요한 상태이다.

한편, 최근 약 20년 이상 줄기세포는 사용에 있어서 윤리적 또는 정치적인 이슈로 인해 배아줄기세포 (embryonic stem cell)의 연구에 그 한계점이 나타나면서 대안으로 성체 줄기세포에 대한 연구가 활발하게 진행 중이다. 성체 줄기세포 (Adult Stem cell)는 주로 골수성 중간엽 줄기세포 (Bone marrow mesenchymal stem cell, MSCs)에 초점이 맞춰져 연구되어왔다. 지방조직 (Adipose tissue) 또한 골수와 마찬가지로 중배엽기원 기관 (Mesodermally-derived organ)으로서 미세소관 내피세포 (microvascular endothelial cells), 평활근 세포 (smooth muscle cells), 지방줄기세포 (adipose stem cells) 등을 함유하고 있는 기질을 포함하고 있으며 쉽게 분리가 가능하다 [Zuk et al., Tissue Eng 2001; 7: 211-228]. 이러한 세포들은 지방조직으로부터 효소학적인 분해 (enzymatic digestion)를 통해 분리할 수 있으며 중간엽 줄기세포 성장을 촉진시키는 특정 배양 환경에서 지방조직 유래 성체줄기세포 (Adipose Tissue-Derived Stem Cells, ADSCs)로서 성장할 수 있다. 지방조직 유래 성체줄기세포는 자기-재생능력 (self-renewal capacity), 장기생장능력 (long-term viability) 및 다계열성 분화가능성 (multilineage differentiation potential)을 포함하는 많은 특성을 지니고 있으며 [Zuk et al., MolBiol Cell 2002; 13: 4279-4295, De Ugarte et al., Cells Tissues Organs 2003; 174: 101-109] 특정 조건 (성장인자, 분화유도 화합물 등)에서 골아세포 (osteoblasts), 지방세포 (adipocytes), 근아세포 (myoblasts), 연골세포 (chondrocytes) 등으로 분화가 가능하다 [Hauner et al., J Clin Endocrinol Metabol 1987; 64: 832-835, Grigoradis et al., J Cell Biol 1988; 106: 2139-2151]. 이러한 관점으로 보아, 지방조직 유래 성체줄기세포를 이용한 연구는 중배엽성 결함의 복구 (mesodermal defect repair)나 관련 질환을 치료하는데 유용한 후보세포가 될 수 있다.

최근 성체줄기세포를 이용한 여러 가지 실험이 활발해지면서 성체줄기의 배양과 관련한 발명도 함께 진행되고 있는 추세이다. 성체 줄기세포의 배양 시, 배양 과정에서 줄기세포보다는 분화된 세포가 자연 발생되어 함께 배양되어 줄기세포의 증식을 방해하는 현상을 억제하기 위한 방법으로 특수한 배지 조성물을 사용하여 타 세포의 분화를 방지하거나 (유럽특허 제1424338호), 배양된 줄기세포를 컬럼 (Column) 방식을 이용하여 분리하여 원하지 않는 세포를 제거하고, 줄기세포만을 재 배양하는 기술을 개시하고 있다 (미국특허 제5674750호, 제5925567호). 국내에서는 줄기세포가 포함하는 수송체의 특성을 이용하여 줄기세포 배양 중 발생하는 수송체를 제거함으로써 줄기세포 배양의 연속성을 유지할 수 있는 방법을 발명하였다 (한국 공개특허 제2005-00723349호). 또한 중간엽 줄기세포를 동물에게 투여하여 동물에서 자가면역 질환, 알레르기 반응, 암 또는 염증질환을 치료, 상처 치유를 촉진시키거나 (한국 공개특허 제2008-7025380호), 미세전류 (micro-current) 또는 음이온 (negative ion)을 이용한 체세포 복제 수정란의 체외 배양방법과 배아줄기세포의 배양방법 (한국특허 제0715366호) 등이 진행되었다.

본 발명의 목적은 세포 배양 시 세포의 생장을 촉진 또는 억제할 수 있는 최적의 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 확립함으로써 세포의 생장을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 배양 시 세포의 저온 상압 플라즈마 노출 조건을 제어하는 단계를 포함하는 세포 생장 조절 방법을 제공한다.

본 발명은 정상세포, 줄기세포, 또는 암세포 등의 세포 생장을 촉진 또는 억제할 수 있는 저온 상압 플라즈마 노출 조건을 확립함으로써 세포 치료를 목적으로 하는 기기의 개발, 이의 안전 기준 마련, 허용 노출 범위 등에 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 저온 상압 플라즈마 발생장치를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 저온 상압 플라즈마 발생장치의 모식도와 회로를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 세포배양배지의 양에 따른 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 노출 시간에 따른 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 입력 전압 별 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 가스 유입량에 따른 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 노출세포와 플라즈마 발생원까지의 거리에 따른 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 8 및 9는 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 플라즈마 노출 횟수에 따른 세포 생장 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 저온 상압 플라즈마 처리 시 반복 노출에 따른 암세포 생장 억제 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 세포 배양 시 세포의 저온 상압 플라즈마 노출 조건을 제어하는 단계를 포함하는 세포 생장 조절 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 언급하는 "저온 상압 (대기압) 플라즈마"는 열적 변화 없이 대상 물체에 대한 화학적 반응성은 크면서 비교적 에너지가 안정하고 반응하는 물질의 표면에서만 작용하기 때문에 상호 작용하는 물질의 상태를 변화시키거나, 손상시키지 않는 장점을 가지고 있다.

상기 저온 상압 플라즈마를 발생하는 장치는 도 1 및 2에 개시되어 있으며, 교류전원을 이용한 DBD (Dielectric Barrier Discharge) 방식으로, 기저 전극은 테프론 재질의 관 내부에 위치하고, 관 내부 중심에 테프론으로 둘러싸인 또 다른 전극봉이 위치한다. 방전은 두 전극 사이의 공간에서 일어나며 두 원통 사이의 간격은 1 ~ 10 mm 이다. 원통형의 방전공간은 에어 (Air) 혹은 방전 구동가스가 지나가도록 설계되어 있다. 중심부에 위치한 전극봉에 교류 전원이 인가되는데, 주파수는 5 ~ 350 kHz 이고, 전압은 rms 값으로 1 ~ 20 kV 이다.

상기 저온 상압 플라즈마 발생장치는 다음의 적용가능 범위를 갖는 것을 특징으로 한다:

플라즈마 발생원으로부터의 거리 : 2-5 cm

Standard liter per minute (slm) : 0.2 slm 이상

Source : 헬륨 가스 (He gas)

주파수 (Frequency) : 20 kHz

입력 전압 (Input voltage) : 5-12 V

출력 전압 (Output voltage) : 6-20 kV

본 발명의 세포 생장 조절 방법은 상기 저온 플라즈마 발생장치를 이용하여 세포 배양 시 플라즈마 노출 조건을 제어하여 세포의 생장을 촉진 또는 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 플라즈마 노출 조건은 가스 유입량, 입력 전압, 세포배양배지의 양, 플라즈마 노출 시간, 발생원과의 거리, 또는 플라즈마 노출 횟수 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

상기 가스 유입량은 저온 상압 플라즈마 발생장치에 제공하는 가스의 유입량을 뜻하는 것으로, 바람직하게는 헬륨 가스의 유입량을 의미한다.

한 가지 구체예에 있어서, 정상세포, 줄기세포, 암세포 등의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 가스 유입량은 0.5 내지 5 slm일 수 있다.

상기 입력 전압은 저온 상압 플라즈마 발생장치에 가하는 전압을 의미한다.

한 가지 구체예에 있어서, 정상세포의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 입력 전압은 5 내지 6 V일 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 줄기세포의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 입력 전압은 5 내지 12 V일 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 암세포의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 입력 전압은 1 내지 12 V일 수 있다.

상기 세포배양배지의 양은 배양세포에 제공되는 배지의 함량을 뜻하는 것으로, 정상세포, 성체줄기세포, 또는 암세포 중 어느 하나의 배양에 사용되는 배지일 수 있다. 예컨대, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), RMPI, 또는 케라티노사이트 SFM (sphere-forming medium) 등일 수 있다.

보다 구체적으로, 섬유아세포 (IMR90) 등의 정상세포와, 인간 자궁경부암세포 (HeLa), 간암세포 (HepG2), 골육종암세포 (U2OS) 등의 암세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제를 포함하는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.

폐섬유아세포 (WB8-VA13), 대장암세포 (HCT116), 유방암세포 (MDA-MB-231 등은 10% 우태아혈청과 1% 항생제를 포함하는 RPMI 배지에서 배양할 수 있다.

성체줄기세포는 분화배지인 케라티노사이트 SFM 배지를 사용할 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 세포 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 상기 세포배양배지의 양은 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL일 수 있다.

상기 발생원과의 거리는 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 노출되는 배양세포까지의 거리를 뜻한다. 바람직하게는, 발생원과의 거리는 4 cm 일 수 있다.

상기 플라즈마 노출 시간은 배양 세포에 플라즈마를 1회 처리 시 노출 시간을 의미하고, 플라즈마 노출 횟수는 플라즈마의 반복노출 횟수를 뜻한다.

한 가지 구체예에 있어서, 세포의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 플라즈마 노출 시간은 1회 처리 시 60초 내지 120초일 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 세포의 생장 조절에 영향을 줄 수 있는 플라즈마 반복노출 횟수는 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회일 수 있다.

본 발명의 세포 생장 조절 방법은 저온 상압 플라즈마 노출 조건을 제어하여 정상세포 또는 줄기세포의 생장을 촉진하거나, 암세포의 생장을 억제할 수 있다. 보다 바람직하게는, 인체의 정상세포, 성체줄기세포, 또는 암세포의 생장을 조절할 수 있다.

한 가지 구체예에 따르면, 헬륨 가스 유입량 0.5 내지 5 slm (standard liter per minute), 입력 전압 5 내지 6 V, 발생원으로부터의 거리 4 cm로 셋팅하고, 정상세포 배양배지의 양을 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL로 조정하여 1회 60초 내지 120초, 반복 노출인 경우 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회 플라즈마 처리하여 정상세포의 생장을 촉진할 수 있다.

또한, 한 가지 구체예에 따르면, 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 헬륨 가스 유입량 0.5 내지 5 slm, 입력 전압 5 내지 12 V, 발생원으로부터의 거리 4 cm로 셋팅하고, 줄기세포 배양배지의 양을 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL로 조정하여 1회 20초 내지 120초, 반복 노출인 경우 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회 플라즈마 처리하여 줄기세포의 생장을 촉진할 수 있다.

한 가지 구체예에 따르면, 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 헬륨 가스 유입량 0.5 내지 5 slm, 입력 전압 1 내지 12 V, 발생원으로부터의 거리 4 cm로 셋팅하고, 암세포 배양배지의 양을 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL로 조정하여 1회 60초 내지 120호, 반복 노출인 경우 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회 플라즈마 처리하여 암세포의 생장을 억제할 수 있다.

상술한 바와 같이, 세포 배양 시 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 조절함으로써 다양한 세포의 생장을 촉진 또는 억제하는데 사용할 수 있고, 이를 이용하여 선택적으로 세포의 생장을 조절 가능한 세포 치료를 목적으로 하는 기기의 개발, 개발 기기의 안전 기준 마련, 허용 노출범위 등을 위한 응용에 사용 가능할 것이다.

또한, 저온 상압 플라즈마의 노출에 따른 다양한 세포의 생장과 관련한 메커니즘 규명 연구에 기반을 제공할 것이다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<제조예 1> 대기압 플라즈마 발생장치 (Atmospheric Pressure Plasma device)

헬륨 (He) 가스를 사용하는 대기압 (상압)에서 플라즈마를 발생시킬 수 있는 장치는 도 1 및 2에 도시하였다. 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

상기 대기압 플라즈마 발생장치는 교류전원을 이용한 Dielectric Barrier Discharge (DBD) 방식이다. 접지전극 (Ground electrode)은 테프론 (Teflon) 재질의 관 내부에 위치하고, 관 내부 중심에 테프론으로 둘러싸인 또 다른 전극봉이 위치한다. 방전은 두 전극 사이의 공간에서 일어나며 두 원통 사이의 간격은 1 ~ 10 mm 이다. 원통형의 방전공간은 에어 (Air) 혹은 방전 구동가스가 지나가도록 설계되었다. 중심부에 위치한 전극봉에 교류 전원이 인가되는데, 주파수는 5 ~ 350 kHz 이고 전압은 rms 값으로 1 ~ 20 kV 이다.

<제조예 2> 지방조직 유래 성체줄기세포분리 및 여러 종류의 인체 세포 배양

사람의 지방조직을 50 mL-튜브에 PBS 와 동량으로 나누어 담고 위 아래로 흔들어서 조직 사이에 있는 적혈구를 떼어내었다.

3,000 rpm 에서 3분 동안 원심 분리하여 조직을 침전시켜 위에 남은 조직만 다시 50 mL-튜브에 나누어 담고 PBS 세척을 2회 더 반복하였다. 조직 세척이 끝난 후 PBS 에 녹인 0.0075% 콜라게나아제 XI 를 50 mL-튜브에 지방조직과 동량으로 넣고 37℃ 진탕배양기 (shaking incubator)에서 10분마다 흔들어주면서 한 시간 동안 조직을 효소분해 하였다.

한 시간 후 원심 분리하여 분해된 지방조직은 버리고 남은 세포만 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지를 넣고 콜라게나아제를 불활성화(inactivation) 시킨 뒤 PBS 세척 후 우태아혈청 (10% (v/v) fetal bovine serum, FBS) 및 항생제 (1%, 10 mL/L 항생제)가 포함된 배지 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다.

24 시간 배양 후, 붙지 않은 세포나 적혈구는 PBS 로 씻어주고 줄기세포로의 분화가 가능한 특성화된 배지 (Keratinocyte SFM)를 넣은 후 5% CO₂, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다.

인간 자궁경부암세포 (HeLa), 간암세포 (HepG2), 골육종암세포 (U2OS), 섬유아세포 (IMR90)는 DMEM (10% FBS, 1% 항생제 포함) 배지에서 배양하고, 폐섬유아세포 (WI38-VA13), 대장암세포 (HCT116), 유방암세포 (MDA-MB-231)은 RPMI (10% FBS, 1% 항생제 포함)에서 배양하였다.

<실시예 1> 인체세포에 저온 상압 플라즈마 처리

2×10⁴ 개의 각 세포를 35 mm-디쉬에 씨딩(seeding)한 후 24 시간 배양하였다. 24시간 후 세포 배양액을 새것으로 교체해주고 플라즈마 노출 조건 (입력 전압, 세포배양액 양, 가스 유입량, 노출 시간, 발생원으로부터의 거리)에 따라 플라즈마를 노출한 후 12 시간 동안 배양하여 MTT 분석으로 세포 생장 정도를 측정하였다.

반복적인 플라즈마 발생에 의한 세포생장 효과를 확인하기 위해서는 5 slm 의 He 가스, 1 mL의 세포배양액, 입력전압 5 V, 플라즈마 발생원으로부터 4 cm 떨어진 곳에서 1 분 또는 2 분의 플라즈마를 1시간 간격으로 노출 시킨 후 9 시간 까지 배양하여 0, 1, 3, 6, 9 시간 마다 MTT 분석 또는 증가한 세포수의 측정을 통해 세포증식에 영향을 미치는 플라즈마의 효과를 확인하였다.

또한, 같은 조건에서 24 시간 마다 2분의 플라즈마를 노출시킨 후 72 시간 까지 매 24 시간마다 세포 증식 정도를 측정하였다.

상기 MTT 분석은 미토콘드리아 탈수소효소의 활성을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 라는 노란색을 띄는 화학물질을 이용하여 분광광도계를 통해 측정하는 방법이다.

약 1×10⁴ cells/mL 의 세포를 35 mm-디쉬에 깔고 24 시간 배양 후 각각 다른 세기 및 노출시간으로 저온 상압 플라즈마를 노출시킨 후 5 mg/mL 농도의 MTT 용액을 첨가한 뒤 2-4시간 배양 후 생성되는 포마잔 생성물을 녹여 96-웰에 옮긴 후 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)에서 흡광도를 측정하였다.

<실험예 1> 세포배양배지의 양(media volume)에 따른 세포 생장 효과

발생하는 상압 플라즈마가 세포에 직접 작용하여 효과를 나타내기 위해서는 세포배양액을 통과하거나 세포배양배지에 특정 자극을 주어야만 가능하다. 이러한 상압 플라즈마와 세포배양배지 간의 효과를 확인하기 위해 세포배양배지의 양을 다르게 한 후 상압 플라즈마에 세포를 노출시켜 그 생장을 MTT 분석으로 확인하였다.

보다 구체적으로, 1×10⁴ cells/mL 의 세포를 35 mm-디쉬에 24 시간 배양 후, 세포 내 배양액을 완전히 제거하고, 0.5 mL 단위로 0-2 mL까지 새 배양액으로 교체해 주었다. 5slm 의 플라즈마를 디쉬로부터 4 cm 떨어진 곳에서 발생시켜 1 분간 세포에 노출시킨 후 12 시간 배양 후 MTT 분석을 수행하였다. 상압 플라즈마에 노출시키지 않은 0 mL의 배양액이 들어있는 세포를 대조군으로 하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 0.5 mL과 1 mL의 배양액에서 인간 자궁경부암세포 (HeLa), 섬유아세포 (IMR90) 및 지방조직 유래 성체줄기세포 (ASC)의 생장이 특이적으로 나타났으며, 특히 1 mL에서는 정상세포와 줄기세포의 성장이 암세포에 비해 약 10-30% 정도 촉진된 것을 확인할 수 있다. 세가지 세포의 생장 변화량이 가장 큰 1 mL의 배양배지를 모든 실험에 적용하였다.

<실험예 2> 플라즈마 노출시간에 따른 세포 생장 효과

상압 플라즈마가 세포에 노출된 시간에 따른 생장효과를 확인하기 위해 0-180 초까지 플라즈마를 자궁경부암세포 (HeLa), 섬유아세포 (IMR90), 지방조직유래 성체줄기세포 (ASC) 에 0-180 초 동안 노출시키고 12 시간 배양 후, MTT 분석으로 세포 생장 효과를 측정하였다.

플라즈마 노출 조건: 5 slm, 5 V, 발생원으로부터의 거리 4 cm, 세포 배양액 1 mL

도 4에 나타난 바와 같이, 60 초 이후에 섬유아세포 (IMR90)와 지방조직 유래 성체줄기세포 (ASC)의 생장이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 60 초 이상, 특히 120 초의 노출조건에서 세 종류의 세포 생장이 가장 차이가 많이 나는 것으로 보여지며, 이러한 노출 조건을 모든 실험에 적용하였다.

<실험예 3> 입력 전압 별 세포 생장 효과

플라즈마 발생시 조절 가능한 전압 (입력 전압)의 변화에 암세포, 정상세포, 줄기세포가 어떤 영향을 받는지 확인하기 위해 5-12 V의 전압변화에 따른 세포생장 효과를 확인하였다. 각 세포를 입력 전압이 다른 플라즈마에 1분간 노출시키고 12시간 후 MTT 분석으로 세포 생장 변화를 확인하였다.

플라즈마 노출 조건: 5 slm, 발생원으로부터 거리 4 cm, 세포 배양액 1 ml, 노출시간 60 sec.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 장치로부터 플라즈마를 발생시키는데 필요한 전압은 5 V 이상에서 조절 가능하다. 5 V에서부터 12 V까지 전압을 증가하였을 때 발생하는 플라즈마에 따른 세포 생장 효과는 5 내지 6 V 사이에서 사람 간암세포 (HepG2)에 비해 정상세포 (WI38-VA13)와 줄기세포 (ASC)의 생장이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 가스 유입량(gas flow)에 따른 세포 생장 효과

본 발명에서 상압 플라즈마가 발생 가능하게 하는 헬륨가스의 유입량은 0.2 slm 이상이다. 0.2 - 5 slm의 가스 유입량에 따라 세포생장에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 가스 유입량을 증가시키면서 플라즈마를 발생시켜 MTT 분석을 통해 세포생장을 확인하였다. 헬륨가스의 분당 유입량 (Slm; standard liter per minute) 에 따른 세포 생장 효과를 확인하였다.

플라즈마 노출 조건: 노출시간 1 분, 5 V, 발생원과의 거리 4 cm, 세포배양액 1 mL.

도 6에 나타난 바와 같이, 0.5 slm 이상에서 줄기세포의 생장이 증가하기 시작하였으며 특히 3 및 5 slm 에서 세 종류의 세포의 생장이 다르게 확인되었다. 5 slm 을 기준으로 하여 다음 플라즈마 노출 실험에 적용하였다.

<실험예 5> 세포와 플라즈마 발생원으로부터의 거리에 따른 세포 생장 효과

플라즈마가 발생하는 위치로부터 세포까지의 거리에 따라 세포생장에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 플라즈마 발생원으로부터 2, 3, 4, 5 cm 떨어진 위치에 세포를 위치시키고 1분간 플라즈마를 노출시켰다. 12 시간 배양 후 MTT 분석을 통해 세포생장을 확인하였다.

플라즈마 노출 조건: 노출시간 1 분, 5 slm, 5 V, 세포배양액 1 mL.

도 7에 나타난 바와 같이, 실험결과, 2 cm 떨어진 곳에서 노출시킨 조건을 세포생장률 100% 로 하였을 때 3 cm, 4 cm 의 위치에서 암세포 (HeLa)에 비해 정상세포 (IMR90)와 줄기세포 (ASC)의 생장이 증가한 것으로 보인다. 5 cm 에서는 세 종류의 세포 생장 정도가 크게 차이를 보이지 않았다.

<실험예 6> 플라즈마 노출 횟수에 따른 세포 생장 효과

반복적인 플라즈마 노출이 세포생장에 미치는 효과를 확인하기 위해 노출 빈도를 높여 1시간마다 2분 동안 노출한 후 0, 1, 3, 6, 9 시간 후 MTT 분석을 통해 세포 생장을 확인하였다 (도 8). 또한 24 시간을 주기로 플라즈마를 2 분 동안 노출한 후의 세포의 생장을 세포 수를 통해 확인하였다 (도 9).

플라즈마 노출 조건: 5 slm, 5 V, 발생원으로부터 거리 4 cm, 세포 배양액 1 mL, 노출시간 2 min/1h, 2 min/24 h)

1시간마다 플라즈마를 2분 동안 각 세포에 처리하였을 경우 (도 8)와 24 시간을 주기로 2분 동안 반복적으로 암세포 (HeLa), 정상세포 (IMR90), 줄기세포 (ASC) 에 노출 시킨 후 (도 9)의 결과를 비교해 보면, 두 결과 모두 암세포의 증식은 억제되고 정상세포와 줄기세포의 증식은 촉진된 것을 확인할 수 있다. 특히 1시간마다 플라즈마를 처리하였을 경우 암세포의 증식 억제 효과가 비교적 빠르게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 7> 플라즈마 노출 횟수에 따른 암세포 생장 억제 효과

HeLa 세포에서 보인 세포 생장 억제 효과를 확인하기 위해 다른 종류의 암세포 4가지를 사용하였다. 1시간마다 2분 동안 플라즈마를 반복적으로 노출시킨 후 (도 8과 노출조건 동일) MTT 분석을 통하여 세포생장을 측정하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 인간 대장암세포주 (HCT116), 간암세포주 (HepG2), 유방암세포주 (MDA-MB-231), 골육종암세포주 (U2OS) 를 사용하여 1시간 단위로 플라즈마를 노출하였을 때 나타나는 세포생장 변화를 9시간 동안 배양하여 확인한 결과, 모든 암세포에서 플라즈마에 노출하였을 때 3시간 이후로 대조군에 비해 약 15% 이상 세포생장 억제 효과를 보였다.

Claims (8)

1. 정상세포 또는 줄기세포 배양 시 교류 전원을 이용한 DBD (Dielectric Barrier Discharge) 방식의 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 제어하는 단계를 포함하는 세포 생장 촉진 방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   저온 상압 플라즈마 노출 조건은 가스 유입량, 외부에서 플라즈마 발생장치의 전원부로 공급되는 직류 전압인 입력 전압, 세포배양배지의 양, 플라즈마 노출 시간, 플라즈마 발생원으로부터 피검 세포 시료까지의 거리, 또는 플라즈마 노출 횟수 중 적어도 하나를 포함하는 세포 생장 촉진 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   세포배양배지는 정상세포 또는 줄기세포 배양에 사용되는 배지인 세포 생장 촉진 방법.
   
5. 삭제
6. 제1항 또는 제3항에 있어서,
   정상세포의 생장을 촉진하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 0.5 내지 5 slm (standard liter per minute)의 헬륨 가스 유입량 , 5 내지 6 V의 입력 전압 , 플라즈마 발생원으로부터 피검 세포 시료까지의 거리를 4 cm로 셋팅하고, 정상세포 배양배지의 양을 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL로 조정하여 1회 60초 내지 120초, 반복 노출인 경우 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회 플라즈마 처리하는 것인 세포 생장 촉진 방법.
   
7. 제1항 또는 제3항에 있어서,
   줄기세포의 생장을 촉진하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 0.5 내지 5 slm의 헬륨 가스 유입량, 5 내지 12 V의 입력 전압, 플라즈마 발생원으로부터 피검 세포 시료까지의 거리를 4 cm로 셋팅하고, 줄기세포 배양배지의 양을 1×10⁴ 세포수 당 0.5 내지 1 mL로 조정하여 1회 60초 내지 120초, 반복 노출인 경우 1시간 마다 1분 내지 2분 간 2회 내지 10회, 또는 24시간 마다 2분 간 2회 내지 5회 플라즈마 처리하는 것인 세포 생장 촉진 방법.
8. 삭제

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