WO2020218730A1 - 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포주기 조절용 조성물 - Google Patents

플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포주기 조절용 조성물 Download PDF

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WO2020218730A1
WO2020218730A1 PCT/KR2020/002914 KR2020002914W WO2020218730A1 WO 2020218730 A1 WO2020218730 A1 WO 2020218730A1 KR 2020002914 W KR2020002914 W KR 2020002914W WO 2020218730 A1 WO2020218730 A1 WO 2020218730A1
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plasma
cells
cell
cell cycle
culture medium
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PCT/KR2020/002914
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Inventor
이진우
김경숙
정민형
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경희대학교 산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N5/0626—Melanocytes
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling a cell cycle including a plasma active culture medium and a method for controlling the cell cycle using a plasma active culture medium.
  • Cell division is an essential process performed to compensate for the growth and natural loss of living organisms, and plays a very important role in maintaining living organisms. Therefore, cell division is carried out through a very sophisticated and complex process, and such cell division abnormalities cause diseases such as cancer.
  • Eukaryotic cells when a signal for cell growth is received from the outside, it proliferates according to the cell cycle through a signaling system. Eukaryotic cells proliferate by periodically going through the process of S phase and somatic cell division (M phase), and G1 and G2 phases exist between S and M phases, respectively. In other words, it divides by rotating the cycle of the G1-S-G2-M groups in sequence. After cell division is completed, it returns to the G1 phase, and the G1 phase is the most active period of intracellular metabolism. Most cells spend a lot of time in the G1 phase, and if there is no external signal, the cell cycle stops progressing and exists as the G0 phase (rest phase), which stops at the G1 phase.
  • M phase somatic cell division
  • the cell cycle is a fundamental process in the proliferation and growth of individual cells.
  • Cell cycle progression is regulated by both internal and external factors.
  • CDKs cyclin dependent protein kinases
  • each phase of the cell cycle is regulated by cyclin dependent protein kinases (CDKs) such as CDK-1, CDK-2, and CDK-4.
  • CDKs cyclin dependent protein kinases
  • ROS has a decisive effect on the cell cycle, and specifically, it is involved in the cell cycle through phosphorylation and ubiquitination of CDK. Additionally, ROS inhibits the NF-kB pathway and is involved in the alteration of cyclins D, A, and p21.
  • PAM plasma active culture medium
  • Another object of the present invention is to provide a method for controlling the cell cycle by using a plasma active culture medium.
  • the present invention provides a composition for controlling a cell cycle and/or a composition for cell culture comprising the PAM, including a plasma-activated culture medium (PAM) prepared by irradiating plasma to a cell culture medium. do.
  • PAM plasma-activated culture medium
  • the present invention also provides a method for controlling the cell cycle and/or a method for culturing cells, comprising the step of culturing cells and treating the cultured cells with a composition for cell cycle control including a plasma active culture medium do.
  • the composition for controlling the cell cycle and/or the composition for cell culture provided in the present invention includes a plasma active culture solution (PAM) prepared by irradiating plasma to the cell culture solution.
  • PAM plasma active culture solution
  • cell cycle regulation means cell cycle arrest, and preferably, it means reversible cell cycle arrest.
  • method of regulating the cell cycle may mean a method of stopping the cell cycle.
  • plasma refers to an ionized gas that satisfies Debye shielding. It is regarded as one of the three basic states of matter, gas, liquid, and solid, and is expressed as the fourth state.
  • a neutral gas is converted to a plasma by an external voltage, and electrons and cations may be generated by excitation and ionization of the neutral gas, and radicals excited by molecular gas may exist.
  • the plasma of the present invention may be generated under normal pressure.
  • it may be a normal temperature and normal pressure plasma (NTAPP), but is not limited thereto.
  • Room temperature atmospheric pressure plasma of the present invention may be used in the same meaning as room temperature atmospheric pressure plasma.
  • the plasma generating apparatus of the present invention can use a known plasma generating apparatus without limitation, as long as it can generate the plasma active culture solution according to the object of the present invention. In particular, it is used in which arc and static electricity are inhibited to generate plasma for biological purposes. It is characterized.
  • the plasma generating apparatus of the present invention comprises: an apparatus main body; A needle or rod-type power electrode in which a flat ground electrode provided on one side of the device body is disposed to face the flat ground electrode in the body; And a high voltage power supply device for supplying power to the power electrode.
  • plasma generation was performed at room temperature and atmospheric pressure using 3.0W microwave power and argon (Ar) gas, and the plasma generating apparatus and the medium were separated by 0.35cm.
  • room temperature is a temperature range that does not correspond to a high-temperature plasma, and the temperature conditions considered as room temperature plasma in the art can be applied without limitation, for example, 60°C or less, 40°C Hereinafter, it means 0 to 60°C, 5 to 45°C, 20 to 40°C, 20 to 30°C, or RT (room temperature).
  • the carrier gas may be used without limitation as long as it is suitable for the purpose of producing a plasma and plasma active liquid that achieves the object of the present invention, but preferably at least one selected from at least one combination selected from the group consisting of helium and argon, and more
  • argon may be used as a carrier gas, and plasma may be generated by supplying a high voltage current to the gas.
  • plasma activated water which is a liquid activated using plasma, exhibits similar characteristics to gaseous plasma, and is used in agriculture and medical fields.
  • Plasma activated water is produced by generating plasma on the surface of the medium or in water in a liquid medium.
  • the plasma-activated culture medium of the present invention may be used in the same sense as a plasma-conditioned medium (PCM).
  • PCM plasma-conditioned medium
  • Such a plasma treatment medium has the same or improved or similar anticancer effect through the same mechanism as the irradiated plasma, and has the advantage of being easy to move and apply compared to plasma.
  • the medium irradiated with plasma can be used without limitation any known medium used for cell culture, and the medium is suitable for culturing the corresponding cells according to the type of cells selected for culture. It is preferable to select and use an appropriate medium.
  • the culture medium of the cells may be a culture medium of animal or plant cells, preferably a culture medium of mammalian cells.
  • M254 medium may be used as a basal medium.
  • the M254 medium may not contain calcium, and 20 amino acids, vitamins, inorganic salts, Adenine.HCl, D-Glucose (Dextrose), DL-alpha-lipoic Acid, Ethanolamine, HEPES, O-Phosphorylethanolamine , Putrescine 2HCl, Sodium Pyruvate, and Thymidine.
  • the 20 amino acids are glycine, alanine, alanyl glutamine, arginine hydrochloride, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, histidine hydrochloride, isoleucine, leucine, lysine hydrochloride, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.
  • the vitamins include choline chloride, pantothenic acid, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyridoxal hydrochloride, vitamin B12, and d-Biotin.
  • the inorganic salt is NaVO 3 , ((NH 4 ) 6 (Mo 7 O 24 -4H2 O ), CuSo 4 -5H 2 O, FesO 4 -7H 2 O, MgCl 2 -6H 2 O, MnSO 4 -H 2 O , NiCl 2 -6H 2 O, KCl, NaCH 3 COO-3H 2 O, NaHCO 3 , NaCl, Na 2 SiO 3 -9H 2 O, Ha 2 HPO4-7H 2 O, Na 2 SeO 3 , SnCl 2 -2H 2 O, and ZnSO 4 -7H 2 O.
  • the plasma-irradiated culture medium may additionally contain an additive required for culturing cells, and may include, for example, human melanocyte growth supplement (HMGS). have.
  • HMGS human melanocyte growth supplement
  • the plasma may be generated using microwave power, and the microwave power may be appropriately selected and used by a person skilled in the art according to the purpose and method of the experiment.
  • 1.0W to 5.0W, 2.0W to 4.0 It may be W or 2.5W to 3.5W, preferably 3.0W.
  • the plasma may be irradiated in a state in which the culture medium to be irradiated with plasma and the plasma gas (plume) are in contact or at a distance from a predetermined distance.
  • the separation distance is 0.1 to 15cm, 0.1 to 10cm, 0.1 to 5cm, 0.1 to 3cm, 0.1 to 1cm, 0.1 to 0.5cm, 0.3 to 15cm, 0.3 to 10cm, 0.3 to It may be 5cm, 0.3 to 3cm, 0.3 to 1cm, or 0.3 to 0.5cm, preferably 0.3 to 0.4cm, more preferably 0.35cm.
  • the electrode When the electrode is irradiated in contact with the culture solution, the electrode may be positioned on the surface of the culture solution or in the culture solution.
  • the time for irradiating the plasma to the culture medium is 4 minutes to 30 minutes, 4 minutes to 25 minutes, 4 minutes to 20 minutes, 5 minutes to 30 minutes, 5 minutes to 25 minutes, 5 minutes to 20 minutes, or 8 minutes to 20 minutes. It can be minutes.
  • a plasma-activated culture solution was prepared by applying plasma at room temperature and pressure to M254 medium.
  • Plasma-activated culture solution was prepared by irradiating plasma for 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes, or 20 minutes with the electrode 0.35 cm away from the surface of the 10ml M254 medium contained in a Petri dish.
  • the conditions of the room temperature and atmospheric pressure plasma were performed at room temperature and atmospheric pressure using 3.0W microwave power and argon (Ar) gas, and the plasma generating apparatus and the medium were separated by 0.35 cm.
  • the spectrum emitted from the injected argon gas atom was 690 to 990 nm and the peaks due to N2 and O were measured between 337.2 and 690 to 900 nm, respectively.
  • the OH band was observed in the range of 307 to 309 nm.
  • the plasma-activated culture medium provided by the present invention has the advantage of being able to stop the cell cycle without causing cell death or cell damage.
  • the stoppage of the cell cycle is a reversible reaction, and when cells are cultured in a normal culture medium not irradiated with plasma, the stoppage of the cell cycle may be recovered. Therefore, the plasma-activated culture medium may be used, for example, for cell cycle control and/or cell culture.
  • the composition for cell cycle control and/or cell culture composition comprising the plasma active culture medium provided by the present invention can control the cell cycle of eukaryotic cells, preferably animal cells, more preferably human-derived cells.
  • the cells are, for example, melanocytes, cervical cancer cells, skin cancer cells, oral cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, egg cells, sperm cells, fertilized eggs, hair cells, nail root cells , Skin cells, sweat gland (apocrine sweat gland) cells, neurons, and may be one or more cells selected from the group consisting of immune cells, and the immune cells are, for example, lymphocytes, macrophages, plasma cells, eosinophils, or It may be an NK cell.
  • the method of regulating the cell cycle according to the present invention can temporarily stop the cell cycle without damaging normal cells.
  • the composition for cell cycle control and/or the composition for cell culture comprising the plasma active culture medium provided by the present invention can arrest the cell cycle through the control of G0/G1 and G2/M checkpoints. .
  • the number of harvested cells decreased as the plasma exposure time increased, but compared to the initial inoculation amount of cells. Since the number of cells did not decrease (FIG. 2), it was confirmed that the plasma-activated culture medium had the effect of somewhat inhibiting cell proliferation, but no cell death or cell damage occurred.
  • the G0/G1 phase decreased, the G2/M phase increased, and the cell cycle was stopped, but it was found that this is a temporary phenomenon.
  • PAM-treated cells did not show significant cell death by the control group, so only cell cycle arrest was observed without cell death or damage.
  • the cell cycle recovered as time passed. Specifically, DNA synthesis was inhibited in the group where the total incubation time was 72 hours after 48 hours incubation in the plasma-activated culture medium, but the treatment of the plasma-activated medium was terminated in the group cultured for 96 hours. After that, DNA synthesis gradually increased. In addition, compared to the control group, the cell cycle of the G0/G1 phase decreased, and it was found that the recovery of the cell cycle is achieved through a decrease in cell cycle arrest and an increase in somatic cell division. Was confirmed.
  • the plasma active culture medium may increase intracellular active oxygen (ROS).
  • active oxygen in a cell refers to a chemically reactive molecule including an oxygen atom, and has a property of inducing oxidative stress in cells.
  • the active oxygen is, for example, peroxide (H 2 O 2 ), superoxide anion radical (O 2 ), hydroxyl radical (OH), and singlet oxygen (singlet oxygen). , 1 O 2 ), but is not limited thereto.
  • the concentration of active oxygen in the cell is 1.1 to 3 times, 1.5 to 3 times, 1.7 times to 3 times, 1.1 times to 2.7 times, 1.5 times to 2.7 times, 1.7 times to 2.7 times, 1.1 times to 2.5 times, 1.5 times to 2.5 times, 1.7 times to 2.5 times, 1.1 times to 2.3 times, 1.5 times To 2.3 times or 1.7 to 2.3 times.
  • the amount of active oxygen in the cells was compared with the positive control H2O2 treatment group and the negative control a-MSH or arbutin treatment group by measuring active oxygen in cells by flow cytometry by treating the plasma active culture medium.
  • H 2 O 2 showed a similar increase in intracellular free radicals as when treated with 100 uM. Specifically, it showed an increase in intracellular active oxygen at a level of 1.8 to 2.1 times compared to the control group not treated with the plasma active culture medium, and this increase is interpreted as a level that inhibits cell proliferation without inducing cell death.
  • the composition for cell culture provided by the present invention may include a plasma-activated culture solution, and the plasma-activated culture solution is 50 parts by weight or more, 60 parts by weight or more, 70 parts by weight or more, 80 parts by weight or more, 90 parts by weight or more , Or may be included in 100 parts by weight.
  • the composition for cell culture may be characterized in that it regulates the cell cycle, and in one example, the cell cycle control may be a stop of the cell cycle.
  • the method of stopping the cell cycle provided by the present invention includes the steps of (1) culturing the cells and (2) treating the cultured cells with a composition for cell cycle control including a plasma active culture medium.
  • the method of stopping the cell cycle provided by the present invention includes the step of (1) culturing cells.
  • the cell refers to a eukaryotic cell, preferably an animal cell, more preferably a cell isolated from a mammal including a human.
  • the cells are, for example, melanocytes, cervical cancer cells, skin cancer cells, oral cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, lung cancer cells, egg cells, sperm cells, fertilized eggs, hair cells, nail root cells, It may be a skin cell, a sweat gland cell (apocrine sweet gland), a nerve cell, an immune cell, and preferably a melanocyte.
  • the immune cells may be, for example, lymphocytes, macrophages, plasma cells, eosinophils, or NK cells.
  • the step of culturing the cells may be performed using a general culture medium not irradiated with plasma, and the culture medium may be appropriately selected and used by a person skilled in the art according to common technical knowledge, which is considered suitable for cell culture. It may be to further include an additive required for.
  • 1% (v/v) of HGMS was added to M254 medium that was not irradiated with plasma and used for cell culture, and melanocytes were used as cells to be cultured.
  • the method for stopping the cell cycle provided by the present invention includes the step of (2) treating the cultured cells with a cell cycle control composition comprising a plasma active culture medium.
  • the step of treating the cultured cells with the cell cycle control composition may be performed by culturing the cells by replacing the culture medium of the cultured cells with a plasma active culture medium.
  • the method for preparing a composition for controlling the cell cycle including the plasma-activated culture medium is as described above.
  • the plasma-activated culture medium is preferably used immediately after preparation, and specifically within 1 week, within 5 days, within 3 days, within 2 days, within 24 hours, within 12 hours, within 8 hours, within 4 hours after preparation, It may be used within 2 hours after manufacture, within 1 hour after manufacture, within 30 minutes after manufacture, within 15 minutes after manufacture, within 10 minutes after manufacture, or within 5 minutes after manufacture, but is not limited thereto.
  • the time required for use after the preparation refers to the time required to replace the cell culture solution after plasma irradiation to the plasma active culture solution is completed.
  • 1% (v/v) of human melanocyte growth supplement (HMGS, Gibco Cascade biologics, USA), 100 U/ml penicillin and 50 ug/ml streptomycin were added to M254 in human skin melanocytes. After culturing in the medium, the culture medium was replaced with the M254 medium irradiated with plasma for 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes or 20 minutes, respectively, and cultivation was performed thereafter.
  • human melanocyte growth supplement HMGS, Gibco Cascade biologics, USA
  • the cell cycle stopped by the method of stopping the cell cycle provided by the present invention has a temporary effect, and the cell cycle can be reversibly restored.
  • the cell cycle arrest may be restored by culturing the cells in a cell culture solution not treated with plasma.
  • the melanocytes are cultured in a plasma-activated culture solution for 48 hours, and then cultured for 24 hours (in total culture for 72 hours) or 48 hours (in total culture for 96 hours) in a normal culture solution not irradiated with plasma.
  • a plasma-activated culture solution for 48 hours, and then cultured for 24 hours (in total culture for 72 hours) or 48 hours (in total culture for 96 hours) in a normal culture solution not irradiated with plasma.
  • the method for culturing cells includes culturing the cells in a culture medium containing a plasma active culture medium.
  • the plasma-activated culture medium in the culture medium may be included in an amount of 50 parts by weight or more, 60 parts by weight or more, 70 parts by weight or more, 80 parts by weight or more, 90 parts by weight or more, or 100 parts by weight, but is not limited thereto.
  • the method of culturing the cells may be characterized in that the cell cycle can be controlled, and in one example, the regulation of the cell cycle may mean stopping the cell cycle.
  • the method of stopping the cell cycle and/or the method of culturing cells provided by the present invention can be used for storage of cells and prevention or treatment of cell cycle related diseases such as cancer.
  • it may be used for the following purposes, but it will be apparent to those skilled in the art that it is not limited thereto.
  • Application example 2 It is used to inhibit cancer progression by stopping the cell cycle of cancer cells.
  • Use case 3 It is used for preservation of reproductive cells or fertilized eggs to solve the cell damage problem caused by the existing cryopreservation method.
  • Application Example 4 It is used to prolong the duration of cosmetic procedures such as hair or nails by causing the hair or nail cell cycle to stop.
  • Application Example 5 It is used to prevent recurrence of ingrown toenails by inhibiting the cell cycle after treatment by surgical resection of ingrown toenails.
  • Use Case 7 Relieve symptoms by inhibiting the production of apocrine sweat gland cells in patients with hyperhidrosis.
  • Application Example 8 It is used to relieve the phantom pain of the limb amputation caused by the growth of nerve cells by stopping the cell cycle of nerve cells.
  • Use case 9 Inhibits cell division of fertilized eggs and is used for contraception
  • Application example 10 It is used for suppressing autoimmunity and hypersensitivity reaction by stopping the cell cycle of immune cells.
  • Application Example 11 Used for maintaining the freshness of foods that can be damaged by cell division such as fruits and vegetables.
  • the cell cycle can be reversibly stopped.
  • the plasma-activated culture medium provided by the present invention does not cause cell death and has an effect of temporarily stopping the cell cycle without damaging the cells.
  • the method of stopping the cell cycle using the plasma-activated culture medium provided by the present invention is a reversible method, and does not cause damage or death of cells, and thus has excellent safety.
  • 1 is a photograph of melanocytes cultured for 24 hours or 48 hours by adding a plasma-activated culture medium irradiated with plasma for 20 minutes under a microscope.
  • 2A is a graph showing the results of measuring the number of viable cells after culturing for 24 hours by adding each plasma active culture solution.
  • 2B is a graph showing the results of measuring the number of viable cells after 48 hours of culture by adding each plasma active culture solution.
  • 3A is a schematic diagram of a normal temperature and normal pressure plasma generator.
  • 3B is a graph showing an optical emission spectrum in the range of 200 to 100 nm during discharge of the plasma jet at room temperature and pressure according to Example 1.
  • FIG. 3B is a graph showing an optical emission spectrum in the range of 200 to 100 nm during discharge of the plasma jet at room temperature and pressure according to Example 1.
  • 4A to 4D are graphs showing the cell distribution for each cell cycle according to the treatment time of the plasma active culture medium.
  • each bar is displayed in the order of 0min, 4min, 8min, 16min, and 20min.
  • 4A is a sub-G1
  • FIG. 4B is a G0/G1 group
  • FIG. 4C is an S group
  • FIG. 4D is a distribution graph of a G2/M group.
  • 5A to 5D are graphs showing whether or not the cell cycle is recovered by culturing cells in the plasma-activated culture medium after treatment or non-treatment of the plasma-activated culture medium in Example 6.
  • 5A is a graph showing the distribution by cell cycle of the group cultured for a total of 72 hours
  • FIG. 5B is a graph showing the distribution by cell cycle of the group cultured for a total of 96 hours.
  • the upper part shows the graph of the control group without using the plasma-activated culture medium, and the lower part shows the result of the group treated with the plasma-activated culture medium irradiated with plasma for 8 minutes.
  • 5C is a graph comparing the distribution of G0/G1 and G2/M phases by total culture time with a control group.
  • 5D is a graph showing the results of measuring the number of viable cells in the control group and the plasma-activated culture solution-treated group according to the culture time.
  • ROS active oxygen
  • 7A to 7C are graphs of flow cytometry results for analyzing the amount of ROS in cells according to the treatment of the plasma active culture medium.
  • 7A is a graph showing the results of gating a population of actual healthy cells for flow cytometry.
  • 7B is a graph showing the ratio of fluorescence signals of M1 and M2 of a control group not treated with a plasma-activated culture medium (top) and a diagram showing corresponding values (bottom).
  • 7C is a graph showing the ratio of M2 groups between the plasma-activated culture medium-treated group and the control group.
  • a plasma-activated culture solution was prepared and used in the experiment by directly irradiating plasma to the liquid medium for cell culture. .
  • M254 medium (GIBCO Cascade Biologics, Portland, OR, USA) was used as the melanocyte culture medium, and a plasma activation medium was prepared by applying normal temperature and atmospheric pressure plasma to the M254 medium.
  • the room temperature and atmospheric pressure plasma conditions according to the present invention were performed at room temperature and atmospheric pressure using 3.0W microwave power and argon (Ar) gas, and the plasma generating apparatus and the medium were separated by 0.35 cm.
  • the plasma irradiation temperature was not to exceed 40°C.
  • 10 mL of cell-free medium was placed in a Petri dish, and plasma was irradiated for 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes, or 20 minutes, respectively, to prepare a final plasma active culture solution.
  • Microwave accuracy was adjusted to ⁇ 2.0%
  • gas pressure was 0 to 3 Bar
  • gas flow was adjusted to 0 to 5 SLM.
  • Fig. 3A shows a schematic diagram of the normal temperature and normal pressure plasma generator
  • Fig. 3C shows the distance between the plasma generator electrode and the medium.
  • 3B shows an optical emission spectrum during discharge of the plasma jet at room temperature and pressure of the present invention in the range of 200 to 1000 nm.
  • the spectra emitted from the injected argon gas atom were 690 to 990 nm and the peaks due to N 2 and O were measured between 337.2 and 690 to 900 nm, respectively.
  • the OH band was observed in the range of 307 to 309 nm.
  • the experiment was carried out by replacing the culture medium with a plasma-activated medium, and plasma-activated medium (PAM) was used for culturing melanocytes immediately after plasma irradiation.
  • PAM plasma-activated medium
  • the melanocytes of normal human skin used in the present invention were purchased from ATTC (Manassas, VA, USA) and used.
  • the melanocytes used in the present invention were M254 Medium (GIBCO Cascade Biologics, USA) in a medium to which 1% of human melanocyte growth supplement (HMGS, Gibco Cascade biologics, USA), 100U/ml penicillin and 50ug/ml streptomycin were added. Cultured.
  • ⁇ -MSH ⁇ -melanocyte stimulating hormone
  • Arbutin Arbutin
  • each cell was washed with PBS, and M254 containing 20 uM 2, 7-dichlorofluorescin diacetate (2, 7-dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • the medium was treated with HMGS at 37°C for 30 minutes and used for flow cytometry.
  • FIG. 1 The results of microscopic observation of cells cultured for 24 hours or 48 hours in a plasma-activated medium irradiated with plasma for 20 minutes are shown in FIG. 1, respectively.
  • the plasma-activated culture medium of the present invention does not cause the death or damage of melanocytes, unlike when the amount of reactive oxygen species is increased by irradiating plasma to cancer cells.
  • Apoptosis or cell damage was confirmed by measuring the number of cells. Specifically, after attaching 1 ⁇ 10 6 cells to a 100 mm culture dish for 24 hours, the culture solution was removed, and melanocytes were cultured using PAM treated for 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes, and 20 minutes, respectively. Subsequently, after 24 and 48 hours, the cells were removed by treatment with trypsin-EDTA solution (JBI, Seoul, Korea), and the enzyme was inhibited with 5% FBS. Then, it was washed twice with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) and the number of cells was measured using an automatic cytometer ADAM-MC cell counter (NanoEnTeK, Seoul, Korea).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the live cells in the case of using plasma activated water with plasma exposure times of 0, 4, 8, 12, 16, or 20 minutes, respectively. The number was measured. The results are shown in FIG. 2. As a result of measuring the number of cells, the number of harvested cells gradually decreased as the plasma exposure time increased, but there was no decrease in the number of cells compared to the amount of inoculated cells, indicating that there was no cell death or cell damage. That is, the plasma-activated culture medium of the present invention has the effect of somewhat inhibiting cell proliferation, but does not cause cell death or cell damage.
  • melanocytes were aliquoted into a 6cm cell culture dish at 5 ⁇ 10 5 cells/dish, cultured for 24 hours, and then attached to the dish. Attached melanocytes were treated with a-MSH (1uM), arbutin (1uM), and H 2 O 2 (100uM Ehsms 200 uM) and used as a control.
  • a plasma-activated culture solution was used according to the plasma irradiation time, and specifically, the plasma irradiation time of the plasma-activated culture solution was non-plasma treatment (0 minutes), 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes, and 20 minutes, respectively.
  • Plasma-activated culture solution or a-MSH, arbutin, H 2 O 2 was treated and cultured for 3 hours, and then intracellular ROS measurement was performed.
  • the ROS is peroxide (H 2 O 2 ), superoxide anion radical (O 2 ), hydroxyl radical (OH), and singlet oxygen ( 1 O 2 ) Includes.
  • FIG. 7 shows a flow cytometric analysis result graph for analyzing the amount of ROS in cells according to the treatment of the plasma active culture medium.
  • FIG. 7A is a graph showing the results of gating a population of actual healthy cells for flow cytometry, and the results of flow cytometry are indicated by the fluorescence ratio of the M2 phase in FIGS. 7B to 12C, and M1 to the left of the baseline is under stress conditions. It means cells that are not present, and M2 to the right of the baseline represents the percentage of cells with increased ROS production.
  • FIG. 7C it was confirmed that the ratio corresponding to M2 increased in the experimental group treated with the plasma-activated culture solution, and thus the production of ROS increased relatively much compared to the control group of FIG. 7B.
  • ROS active oxygen
  • the increase in ROS in melanocytes is 1.8 to 2.1 times higher than that of the control group not treated with the plasma-activated culture medium, and the increase is small. This low level of increase in ROS cannot induce apoptosis, but is predicted to inhibit cell proliferation.
  • Example 3 In order to confirm the mechanism of action of the inhibitory effect of cell proliferation identified in Example 3, flow cytometric analysis was performed to investigate the effect of the plasma-activated culture medium on the cell cycle distribution. Melanocytes were cultured for 24 hours or 48 hours using plasma-activated culture medium irradiated with plasma for various plasma exposure times (0 minutes, 4 minutes, 8 minutes, 12 minutes, 16 minutes and 20 minutes) between 0 and 20 minutes. .
  • the cells were washed twice with PBS buffer, treated with 10 ug/mL of RNaseA enzyme, and stained with 50 ug/mL of propidium iodide (Sigma-Aldrich). The cell cycle was then analyzed using FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson) and CellQuest 6.0 software.
  • FIG. 4 shows a graph of cell distribution for each cell cycle step according to the treatment time of the plasma active culture medium.
  • 4A is a graph of a sub-G1 group
  • FIG. 4B is a G0/G1 group
  • FIG. 4C is an S group
  • FIG. 4D is a graph of a G2/M group.
  • the number of cells in the sub-G1 phase increased statistically significantly according to the plasma irradiation time (FIG. 4A).
  • the distribution of the ratio of G0/G1 groups also increased with the plasma irradiation time (Fig. 4b).
  • This increase in the distribution of melanocytes in the G0/G1 phase is accompanied by a decrease in the distribution of cells corresponding to the G2/M phase (FIG. 4D).
  • the S group was reduced by plasma treatment (Fig. 4c). The above results suggest that the proliferation of melanocytes was inhibited by an increase in the growth phase of cells, inhibition of DNA synthesis and somatic cell division.
  • melanocytes were cultured in a plasma-activated culture medium irradiated with plasma for 8 minutes and monitored for an extended period.
  • cells were cultured for 48 hours in a plasma-activated culture medium irradiated with plasma for 8 minutes, and cells not treated with a plasma-activated culture medium were used as a control. Thereafter, the culture solution was replaced with a new culture solution not irradiated with plasma, and the cells were cultured for 24 or 48 hours.
  • Cell cycle analysis was performed in substantially the same manner as in Example 5-1.
  • FIG. 5 a graph is shown as a result of confirming whether or not the cell cycle is recovered by culturing cells in the plasma-activated culture medium after treatment or non-treatment of the plasma-activated culture medium.
  • Figures 5a to 10b show the cell cycle analysis results of each group according to the culture time. Each group refers to a group cultured for a total of 72 hours (48 hours in PAM and then 24 hours in plasma untreated medium, Fig. 5A) or a total of 96 hours (48 hours in PAM and 48 hours in plasma untreated medium, Fig. 5B). .
  • FIG. 5C shows a graph comparing the distribution of G0/G1 and G2/M phases by total culture time with the control group.
  • the cell cycle distribution of the control cells varied from group to group.
  • the G0/G1 phase was found to be 13% higher in the group cultured for 96 hours compared to the group cultured for 72 hours.
  • the distribution of the 96-hour culture group was 53% lower than that of the 72-hour culture group. The cause of the difference is still unclear, but it is predicted that this difference is partially affected by the physiological state of the cell at the time the experiment is performed.
  • the present inventors considered the difference between the control group and the experimental group at the same time. Compared with the control group, the cell cycle distribution in the G0/G1 phase decreased by 20% and 17% in the 72-hour and 96-hour culture groups, respectively. The above results clearly show that cell cycle recovery is achieved through reduced cell cycle arrest and increased somatic division.
  • the cells were found to return to their original state through recovery of cell cycle progression within 48 hours after treatment with the plasma-activated culture medium. However, it takes a long time to fully recover to a normal state, and many cells stayed in the arrest state. Therefore, even after 96 hours, the cell proliferation rate treated with the plasma-activated culture solution was 1.0 x 10 4 cells/h, which was lower than that of the control group, 3.0 x 10 4 cells/h (FIG. 5D).
  • ROS reactive oxygen
  • the plasma-activated culture medium induced cell cycle arrest through the regulation of the G0/G1 and G2/M phases, but did not cause significant cell death. Furthermore, cell cycle arrest is a transient phenomenon lasting for 48 hours or shorter, and the cell cycle slowly recovered.
  • the half-life of the active oxygen produced by the normal temperature and atmospheric pressure plasma in the culture medium is several hours to several days depending on the temperature, but the ROS level decreases with time. Therefore, the increase in intracellular ROS level in melanocytes also decreases with time, and is predicted to affect the recovery of cell cycle progression.
  • the above can be summarized as follows. Treatment of the plasma-activated culture medium (PAM) at an appropriate concentration may cause cell proliferation and cell cycle arrest, but the cell proliferation and cell cycle arrest may be recovered after a certain period of time.
  • PAM plasma-activated culture medium
  • the above results suggest that the cell cycle can be turned on and off without intracellular toxicity, that is, switching is possible using normal temperature and atmospheric pressure plasma.

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Abstract

본 발명은 세포 배양액에 플라즈마를 조사하여 제작된 플라즈마 활성 배양액(PAM)을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물, 상기 조성물을 이용한 세포 주기를 조절하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포의 사멸 또는 손상 없이도 가역적으로 세포 주기를 조절할 수 있는 특성을 가진다.

Description

플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포주기 조절용 조성물
본 발명은 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기의 조절용 조성물 및 플라즈마 활성 배양액을 이용하여 세포 주기를 조절하는 방법에 관한 것이다.
세포 분열은 생명체의 성장과 자연적인 손실을 보충하기 위해 수행되는 필수적인 과정으로, 생명체 유지에 있어 매우 중요한 역할을 수행한다. 따라서 세포 분열은 매우 정교하고 복잡한 과정을 통해 수행되며, 이와 같은 세포 분열의 이상은 암과 같은 질병의 원인이 된다.
진핵세포의 경우, 외부에서 세포 성장에 대한 신호를 받으면 신호전달체계를 통하여 세포 주기에 따라 증식한다. 진핵세포는 S기와 체세포분열(M기)의 과정을 주기적으로 거치면서 증식하며, S기와 M기 사이에는 G1기와 G2기가 각각 존재한다. 즉, G1-S-G2-M기의 주기를 차례로 돌면서 분열한다. 세포분열이 완료된 후에는 G1기로 돌아가며, 상기 G1기는 세포 내 대사가 가장 활발한 시기이다. 대부분의 세포는 많은 시간을 G1기의 상태로 지내며, 외부 신호가 없으면 세포 주기의 진행이 중단되어 G1기에서 멈춘 G0기(휴지기)로 존재한다.
세포 주기는 개별 세포의 증식 및 성장에 있어 기초적인 프로세스에 해당한다. 세포 주기의 진행은 내적 및 외적 요소 모두의 조절을 받는다. 내부적으로, 세포 주기의 각 단계는 CDK-1, CDK-2, CDK-4와 같은 사이클린 의존적 단백질 키나아제(CDKs) 에 의해 조절된다. 추가적으로 영양소, 성장 인자 및 호르몬을 포함하는 몇몇 외부적 요소가 세포 주기에 관여하며, 이러한 요소는 세포 내 신호전달경로(intracellular signal transduction neetworks)를 통해 작용한다. ROS는 세포 주기에 결정적인 영향을 미치며, 구체적으로 CDK의 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 통해 세포 주기에 관여한다. 추가로, ROS는 NF-kB 경로를 저해하며, 사이클린 D, A, 및 p21의 변경에 관여한다.
이러한 세포 주기의 조절에 장애가 발생하는 경우, 세포 성장이 조절되지 않아 암과 같은 질병의 원인이 된다. 따라서, 세포 주기를 조절하는 기술의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 플라즈마 활성 배양액(PAM)을 포함하는, 세포 주기 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 플라즈마 활성 배양액을 이용하여, 세포주기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 배양액에 플라즈마를 조사하여 제조된 플라즈마 활성 배양액(PAM)을 포함하는 세포 주기의 조절용 조성물 및/또는 상기 PAM을 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포를 배양하는 단계 및 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물을 상기 배양된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 주기를 조절하는 방법 및/또는 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 제공하는 세포 주기 조절용 조성물 및/또는 세포 배양용 조성물은, 세포 배양액에 플라즈마를 조사하여 제조된 플라즈마 활성 배양액(PAM)을 포함한다.
본 발명의 플라즈마 배양액을 사용함으로써, 배양 중인 세포에 플라즈마를 직접 조사하는 경우 모든 세포에 고르게 플라즈마 활성 효과를 얻을 수 없는 단점을 보완할 수 있다.
본 발명에 있어서 "세포 주기 조절"은 세포 주기의 정지(cell cycle arrest)를 의미하며, 바람직하게는 가역적인 세포 주기의 정지를 의미한다. 일 예에서, 상기 “세포 주기를 조절하는 방법”은 세포 주기를 정지하는 방법을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 "플라즈마"는 디바이 차폐(Debye shielding)를 만족하는 이온화된 기체를 말한다. 이는 물질의 기본적인 세 가지 상태인 기체, 액체, 고체와 더불어 또 하나의 상태로 여겨지며 제4상태로 표현된다. 본 발명의 플라즈마는 외부 전압에 의해 중성기체가 플라즈마로 중성기체의 여기, 이온화에 의하여 전자 및 양이온이 발생할 수 있고, 분자가스가 여기된 라디칼이 존재할 수 있다.
본 발명의 플라즈마는 상압 상태에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 상온상압 플라즈마(NTAPP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상온상압 플라즈마는 상온 대기압 플라즈마와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명의 플라즈마 생성장치는 본 발명의 목적에 따른 플라즈마 활성 배양액을 생성할 수 있다면, 공지된 플라즈마 생성 장치를 제한없이 사용할 수 있으나, 특히 생물학적 목적의 플라즈마를 생성시키기 위하여 아크 및 정전기를 저해시킨 것을 특징으로 한다. 예컨대 본 발명의 플라즈마 생성장치는 장치 본체; 장치 본체 내의 일측에 구비되는 평판형 접지 전극이 본체 내에서 평판형 접지 전극과 대향하게 배치되는 니들 또는 로드형 파워 전극; 및 파워전극으로 전력을 공급하기 위한 고전압 전원 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 플라즈마 생성은 3.0W microwave power와 아르곤(Ar) 가스를 이용하여 상온 대기압에서 시행하였고, 플라즈마 생성 장치와 배지는 0.35cm 이격되어 있었다.
본 발명의 '상온상압 플라즈마'에 있어서, 상온이란, 고온 플라즈마에 해당하지 않는 온도 범위로서 당업계에서 상온 플라즈마로 여겨지는 온도 조건을 제한 없이 적용 가능하며, 예를 들어, 60℃ 이하, 40℃ 이하, 0 내지 60℃, 5 내지 45℃, 20 내지 40℃, 20 내지 30℃ 또는 RT(room temperature)를 의미한다.
상기 캐리어 가스는 본 발명의 목적을 달성하는 플라즈마 및 플라즈마 활성액의 제조 목적에 적합한 것이라면, 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 헬륨 및 아르곤으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 조합으로부터 선택된 1종 이상, 더욱 바람직하게는 아르곤을 캐리어 가스로 할 수 있으며, 이와 같은 가스에 고전압의 전류가 공급됨으로써 플라즈마가 생성될 수 있다.
한편, 플라즈마를 이용하여 활성화시킨 액체인 플라즈마 활성수(plasma activated water)는 기체 상태의 플라즈마와 유사한 특징을 보이며, 농업 및 의료 분야에 사용되고 있다. 플라즈마 활성수는 액체 상태인 매개체에 플라즈마를 매개체 표면 또는 수중에서 발생시켜 제작한다.
본 발명의 플라즈마 활성 배양액은, 플라즈마 처리된 배지(plasma-conditioned medium; PCM)와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 이와 같은 플라즈마 처리 배지는 조사된 플라즈마와 동일한 기전을 통해 동등한 또는 개선된 또는 유사한 항암 효과를 가지며, 플라즈마와 비교하여 이동 및 적용이 용이한 장점이 있다.
본 발명의 플라즈마 활성 배양액 제조를 위하여 플라즈마가 조사되는 배지는 세포 배양을 위해 사용되는 임의의 공지의 배지를 제한없이 사용할 수 있으며, 상기 배지는 배양을 위해 선택된 세포의 종류에 따라 해당 세포의 배양에 적절한 배지를 선별하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포의 배양액은 동물 또는 식물 세포의 배양액, 바람직하게는 포유 동물 세포의 배양액일 수 있다.
구체적으로, 피부의 상피조직, 예를 들어, 멜라닌 세포(Melanocyte) 또는 각질형성세포(Keratinocyte)에 적합한 배지의 경우는 M254 배지를 기본배지 (basal media)로 사용할 수 있다. 상기 M254 배지는 칼슘을 포함하지 않을 수 있으며, 아미노산 20종, 비타민, 무기염(inorganic salts), Adenine.HCl, D-Glucose(Dextrose), DL-alpha-lipoic Acid, Ethanolamine, HEPES, O-Phosphorylethanolamine, Putrescine 2HCl, Sodium Pyruvate, 및 Thymidine을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 20종은 글리신, 알라닌, 알라닐 글루타민, 아르기닌 염산염, 아스파라긴, 아스파틱산, 시스테인, 글루탐산, 히스티딘 염산염, 이소류신, 류신, 라이신 염산염, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 상기 비타민은 염화콜린, 판토테닉산, 엽산, 미오-이노시톨, 나이아신아마이드, 피리독살 염산염, 비타민 B12, 및 d-비오틴(d-Biotin)을 포함한다. 상기 무기염은 NaVO3, ((NH4)6(Mo7O24-4H2O), CuSo4-5H2O, FesO4-7H2O, MgCl2-6H2O, MnSO4-H2O, NiCl2-6H2O, KCl, NaCH3COO-3H2O, NaHCO3, NaCl, Na2SiO3-9H2O, Ha2HPO4-7H2O, Na2SeO3, SnCl2-2H2O, 및 ZnSO4-7H2O를 포함할 수 있다.
본 발명의 플라즈마 활성 배양액 제조를 위하여 플라즈마가 조사되는 배양액은 세포의 배양에 필요한 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 멜라닌세포성장인자(human melanocyte growth supplement, HMGS)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 플라즈마는 마이크로파 전력(microwave power)을 이용하여 생성될 수 있으며, 상기 마이크로파 전력은 실험의 목적 및 방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 1.0W 내지 5.0W, 2.0W 내지 4.0W 또는 2.5W 내지 3.5W일 수 있으며, 바람직하게는 3.0W일 수 있다.
상기 플라즈마는 플라즈마가 조사될 배양액과 플라즈마 기체 (plume)가 접촉한 상태 또는 일정한 거리를 두고 떨어진 위치에서 조사될 수 있다. 플라즈마 전극이 배지와 이격되어 플라즈마가 조사되는 경우, 이격 거리는 0.1 내지 15cm, 0.1 내지 10cm, 0.1 내지 5cm, 0.1 내지 3cm, 0.1 내지 1cm, 0.1 내지 0.5cm, 0.3 내지 15cm, 0.3 내지 10cm, 0.3 내지 5cm, 0.3 내지 3cm, 0.3 내지 1cm, 또는 0.3 내지 0.5cm 일 수 있으며, 바람직하게는 0.3 내지 0.4cm, 더욱 바람직하게는 0.35cm일 수 있다. 상기 전극이 배양액과 접촉한 상태에서 조사되는 경우, 배양액의 표면 또는 배양액 내에 전극이 위치할 수 있다.
상기 플라즈마를 배양액에 조사하는 시간은 4분 내지 30분, 4분 내지 25분, 4분 내지 20분, 5분 내지 30분, 5분 내지 25분, 5분 내지 20분, 또는 8분 내지 20분일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, M254 배지에 상온 및 상압 플라즈마를 가해 플라즈마 활성 배양액을 제조하였다. 페트리 접시에 담긴 10ml M254배지 표면으로부터 전극이 0.35cm 이격된 상태에서 4분, 8분, 12분, 16분, 또는 20분간 플라즈마를 조사하여 플라즈마 활성 배양액을 제작하였다. 상기 상온상압 플라즈마의 조건은 3.0W 마이크로파 전력(microwave power)과 아르곤(Ar) 가스를 이용하여 상온 대기압에서 시행하였고, 플라즈마 생성 장치와 배지는 0.35cm 이격되어 있었다. 세포가 없는 배지 10mL를 페트리 접시에 담고, 플라즈마를 각각 4분, 8분, 12분, 16분, 또는 20분간 조사하여 최종 플라즈마 활성 배양액을 제조하였다. 마이크로파 정확도는 ±2.0%, 가스 압력은 0 내지 3Bar 및 가스 흐름은 0 내지 5 SLM으로 조절되었다.
주입되는 아르곤 가스 원자로부터 방출되는 스펙트럼은 690 내지 990nm이고 N2 및 O에 의한 피크는 337.2 및 690 내지 900nm 사이로 각각 측정되었다. OH band는 307 내지 309nm 범위에서 관찰되었다.
본 발명이 제공하는 플라즈마 활성 배양액은, 세포의 사멸 또는 세포 손상을 야기하지 않으면서 세포 주기를 정지시킬 수 있는 장점을 가진다. 상기 세포 주기의 정지는 가역적인 반응으로서, 플라즈마를 조사하지 않은 일반 배양액에서 세포를 배양하는 경우, 세포 주기의 정지가 회복되는 것일 수 있다. 따라서 상기 플라즈마 활성 배양액은 예를 들어, 세포의 주기 조절 및/또는 세포의 배양 용도로 활용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물 및/또는 세포 배양용 조성물은 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 유래의 세포의 세포주기를 조절할 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 멜라닌세포(melanocyte), 자궁경부암세포, 피부암세포, 구강암세포, 위암세포, 대장암세포, 폐암세포, 난자세포, 정자세포, 수정란, 두발세포, 조근(nail root) 세포, 피부세포, 땀샘 (apocrine sweat gland) 세포, 신경세포, 및 면역세포로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포일 수 있으며, 상기 면역세포는 예를 들어, 림프구, 대식세포, 형질세포, 호산구, 또는 NK 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 플라즈마 활성 배양액을 세포 배양액으로 사용한 결과, 멜라닌 세포의 손상 또는 사멸은 관찰되지 않았다 (실시예 3). 보다 구체적으로, 현미경으로 멜라닌 세포를 살핀 결과, 멜라닌 세포 특유의 수지상 돌기가 확인되는 등 외관상 세포의 손상이 나타나지 않았다 (도 1). 따라서 본 발명에 의한 세포 주기를 조절하는 방법은, 정상 세포를 손상시키지 않으면서 세포주기를 일시적으로 정지시킬 수 있다. 본 발명이 제공하는 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물 및/또는 세포 배양용 조성물은, G0/G1 및 G2/M 검문 지점(checkpoint)의 조절을 통해 세포 주기를 정지(arrest)시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 플라즈마 활성 배양액을 세포 배양액으로 사용한 후 생존 세포(live cell)의 수를 측정한 결과, 플라즈마 노출 시간이 길어짐에 따라 수확된 수가 감소하였으나, 세포의 초기 접종량에 비해서는 세포 수가 감소하지 않아(도 2), 플라즈마 활성 배양액이 세포 증식을 다소 억제하는 효과는 있으나, 세포 사멸 또는 세포 손상이 일어나지 않음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, PAM에서 멜라닌 세포를 배양한 결과, G0/G1기가 감소하였으며, G2/M기의 증가가 나타나, 세포 주기가 정지되었으나, 일시적인 현상임을 알 수 있었다. 또한 PAM 처리된 세포는 대조군에 의해 의미 있는 세포 사멸이 나타나지 않아, 세포의 사멸 또는 손상 없이 세포 주기의 정지만이 나타났다.
본 발명의 일 실시예에서, PAM으로 처리한 멜라닌 세포를 다시 플라즈마를 조사하지 않은 일반 M254 배지에서 배양한 결과, 시간이 경과함에 따라 세포 주기가 회복되었다. 구체적으로, 플라즈마 활성 배양액에서 48시간 배양 후 일반 배양액으로 옮겨 총 배양 시간이 72시간인 그룹에서는 DNA의 합성이 저해되었으나, 96시간 배양한 그룹에서는 DNA 합성이 증가하여, 플라즈마 활성 배지의 처리가 종료된 이후 서서히 DNA 합성이 증가하는 결과를 나타내었다. 또한 대조군 그룹과 비교하여 G0/G1기의 세포 주기가 감소하여, 세포 주기의 회복이 세포 주기의 정지 감소 및 체세포분열의 증가를 통해 이루어짐을 밝혀, 플라즈마 활성 배양액에 의한 세포 주기 정지가 가역적인 반응임을 확인하였다.
상기 플라즈마 활성 배양액은, 세포 내 활성 산소(ROS)를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명에서 세포 내 활성 산소는, 산소 원자를 포함한, 화학적으로 반응성 있는 분자를 의미하며, 세포의 산화적 스트레스를 유발하는 특성을 가진다. 상기 활성 산소는, 예를 들어 퍼옥사이드(peroxide, H2O2), 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 및 일중항산소(singlet oxygen, 1O2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 플라즈마 활성 배양액에서 세포를 배양하는 경우, 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 대조군 세포에 비해 플라즈마 활성 배양액을 처리한 경우 세포 내 활성 산소의 농도가 1.1배 내지 3배, 1.5배 내지 3배, 1.7배 내지 3배, 1.1배 내지 2.7배, 1.5배 내지 2.7배, 1.7배 내지 2.7배, 1.1배 내지 2.5배, 1.5배 내지 2.5배, 1.7배 내지 2.5배, 1.1배 내지 2.3배, 1.5배 내지 2.3배 또는 1.7배 내지 2.3배 증가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 플라즈마 활성 배양액을 처리하여 유세포 분석법으로 세포 내 활성 산소를 측정하여 양성 대조군인 H2O2 처리군, 음성 대조군인 a-MSH 또는 arbutin 처리군과 세포 내 활성 산소의 양을 비교한 결과, H2O2를 100 uM 처리하였을 때와 유사한 세포 내 활성산소 증가 양상을 보였다. 구체적으로, 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 대조군에 비해 1.8배 내지 2.1배 수준의 세포 내 활성 산소 증가를 나타내었으며, 이러한 증가폭은 세포 사멸을 유도하지 않으면서 세포 증식을 저해하는 수준으로 해석된다.
본 발명이 제공하는 세포 배양용 조성물은, 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 플라즈마 활성 배양액이 50 중량부 이상, 60 중량부 이상, 70 중량부 이상, 80 중량부 이상, 90 중량부 이상, 또는 100중량부로 포함될 수 있다. 상기 세포 배양용 조성물은 세포 주기를 조절하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 일 예에서 상기 세포주기 조절은 세포 주기의 정지일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 세포 주기를 정지시키는 방법은, (1) 세포를 배양하는 단계 및 (2) 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물을 상기 배양된 세포에 처리하는 단계를 포함한다.
이하 각 단계를 상술한다.
본 발명이 제공하는 세포 주기를 정지시키는 방법은 (1) 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물로부터 분리된 세포를 의미한다. 상기 세포는 예를 들어, 멜라닌 세포, 자궁경부암세포, 피부암세포, 구강암세포, 위암세포, 대장암세포, 폐암세포, 난자세포, 정자세포, 수정란, 두발(hair) 세포, 조근(nail root) 세포, 피부세포, 땀샘 세포(apocrine sweet gland), 신경세포, 면역세포일 수 있으며, 바람직하게는 멜라닌 세포일 수 있다. 상기 면역세포는 예를 들어 림프구, 대식세포, 형질세포, 호산구, 또는 NK세포일 수 있다.
상기 세포를 배양하는 단계는, 플라즈마를 조사하지 않은 일반적인 배양액을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 배양액은 세포 배양에 적절하다고 생각되는 배양액을 당업자가 기술 상식에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 세포 배양에 필요한 첨가물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 플라즈마를 조사하지 않은 M254 배지에 HGMS를 1% (v/v) 첨가하여 세포 배양에 이용하였으며, 배양 대상 세포로는 멜라닌 세포(melanocyte)를 이용하였다.
본 발명이 제공하는 세포 주기를 정지시키는 방법은 (2) 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물을 상기 배양된 세포에 처리하는 단계를 포함한다.
상기 세포 주기 조절용 조성물을 배양된 세포에 처리하는 단계는, 배양된 세포의 배양액을 플라즈마 활성 배양액으로 교체하여 세포를 배양하는 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물의 제조 방법은 상술한 바와 같다.
상기 플라즈마 활성 배양액은 제조 후 즉시 사용되는 것이 바람직하며, 구체적으로 제조 후 1주일 이내, 5일 이내, 3일 이내, 2일 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 8시간 이내, 4시간 이내, 제조 후 2시간 이내, 제조 후 1시간 이내, 제조 후 30분 이내, 제조 후 15분 이내, 제조 후 10분 이내, 또는 제조 후 5분 이내에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제조 후 사용에 소요되는 시간은 플라즈마 활성 배양액에 플라즈마 조사가 완료된 이후 세포 배양액의 교체까지 소요되는 시간을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 인간 피부의 멜라닌 세포를 1%(v/v)의 human melanocyte growth supplement(HMGS, Gibco Cascade biologics, USA), 100U/ml 페니실린 및 50ug/ml 스트렙토마이신을 첨가한 M254 배지에서 배양한 후, 플라즈마를 각각 4분, 8분, 12분, 16분 또는 20분 조사한 M254 배지로 배양액을 교체하여 이후 배양을 수행하였다.
본 발명이 제공하는 세포 주기를 정지시키는 방법에 의해 정지된 세포 주기는, 일시적인 효과를 가지며, 가역적으로 세포 주기가 회복될 수 있다. 상기 세포 주기의 정지의 회복은, 예를 들어, 플라즈마를 처리하지 않은 세포 배양액에서 세포를 배양함으로써 세포 주기의 정지가 회복될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 멜라닌 세포를 플라즈마 활성 배양액에서 48시간 배양한 후, 플라즈마를 조사하지 않은 일반 배양액에서 24시간(전체 72시간 배양) 또는 48시간(전체 96시간 배양) 배양하여 세포 주기의 분포를 관찰한 결과, 전체 72시간 배양한 그룹에서는 DNA 합성이 여전히 저해되어 있었으나, 96시간 배양한 그룹에서는 DNA의 합성이 증가하여, 세포 주기 진행을 위한 DNA 합성 기능이 회복되었음이 확인되었다.
본 발명이 제공하는 세포의 배양 방법은, 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 배양액에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배양액 내 플라즈마 활성 배양액은 50 중량부 이상, 60 중량부 이상, 70 중량부 이상, 80 중량부 이상, 90 중량부 이상, 또는 100 중량부로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포의 배양 방법은 세포 주기를 조절할수 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 일 예에서, 상기 세포 주기의 조절은 세포 주기의 정지를 의미할 수 있다.
본 발명이 제공하는 세포 주기를 정지시키는 방법 및/또는 세포의 배양 방법은, 세포의 보관, 암 등 세포주기 관련 질환의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있다. 예를 들어, 하기와 같은 용도로 활용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님은 당업자에게 자명할 것이다.
활용례 1. 멜라닌 세포에 저장된 멜라닌 소모시까지 세포주기를 정지하여 피부 미백 용도로 활용
활용례 2. 암세포의 세포 주기를 정지시켜 암 진행 억제 용도로 활용.
활용례 3. 생식세포 또는 수정란의 보존 용도로 활용하여 기존의 동결보존 방법에 따른 세포 손상 문제를 해결.
활용례 4. 모근 또는 조근 세포 주기의 정지를 유발하여 두발 또는 손톱 등 미용 시술의 지속 기간 연장에 이용.
활용례 5. 내성 발톱 환자의 수술적 절제 방법으로 치료 후 세포 주기를 억제하여, 발톱이 자람에 따른 내성 발톱의 재발을 방지하는 용도로 활용.
활용례 6. 상처 부위가 일정 수준 회복된 후 세포 주기를 억제하여 해당 부위의 섬유 조직의 과증식을 억제함으로써 켈로이드 생성 방지 용도로 활용.
활용례 7. 다한증 환자의 아포크린 땀샘 세포의 생성을 억제하여 증상 완화.
활용례 8. 신경세포의 세포 주기를 정지시켜, 신경세포의 성장으로 인해 발생하던 사지 절단 부위의 환지통(phantom pain) 완화 용도로 활용.
활용례 9. 수정란의 세포 분열을 억제시켜 피임 용도로 활용.
활용례 10. 면역세포의 세포 주기를 정지시켜 자가면역 및 과민반응 억제 용도로 활용.
활용례 11. 과일이나 채소 등 세포분열로 인해 상할 수 있는 음식의 신선도 유지 용도로 활용.
본 발명에서 제공하는 플라즈마 활성 배양액을 세포에 처리함으로써, 세포 주기를 가역적으로 정지시킬 수 있다. 본 발명이 제공하는 플라즈마 활성 배양액은 세포의 사멸을 유발하지 않으며, 세포를 손상시키지 않으면서 세포 주기를 일시적으로 정지시키는 효과가 있다.
본 발명이 제공하는 플라즈마 활성 배양액을 이용하여 세포 주기를 정지시키는 방법은, 가역적인 방법으로서, 세포의 손상 또는 사멸을 유발하지 않아 안전성이 우수하다.
도 1은 플라즈마를 20분 조사한 플라즈마 활성 배양액을 첨가하여 24시간 또는 48시간 배양한 멜라닌 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2a는 각 플라즈마 활성 배양액을 첨가하여 24시간 배양한 후의 생존 세포 수 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 각 플라즈마 활성 배양액을 첨가하여 48시간 배양한 후의 생존 세포 수 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 상온상압 플라즈마 발생기의 모식도이다.
도 3b는 실시예 1에 따른 상온상압 플라즈마 제트의 방전 중 200 내지 100nm 범위의 광학적 방출 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 4d는 플라즈마 활성 배양액의 처리 시간에 따른 각 세포주기 단계별 세포 분포를 나타낸 그래프이다. 각 그래프에서 각 막대는 0min, 4min, 8min, 16min, 및 20min 순서로 표시되었다. 도 4a는 sub-G1, 도 4b는 G0/G1기, 도 4c는 S기, 도 4d는 G2/M기의 분포 그래프이다.
도 5a 내지 5d는 실시예 6에서 플라즈마 활성 배양액의 처리 또는 미처리 후 플라즈마 미처리 배양액에서 세포를 배양하여 세포주기의 회복 여부를 확인한 그래프이다. 도 5a는 총 72시간 배양한 그룹의 세포 주기별 분포를, 도 5b는 총 96시간 배양한 그룹의 세포 주기별 분포를 나타낸 그래프이다. 각각 상단은 플라즈마 활성 배양액을 사용하지 않은 대조군의 그래프를, 하단은 플라즈마를 8분 조사한 플라즈마 활성 배양액을 처리한 그룹의 결과를 나타내었다. 도 5c는 총 배양시간별 G0/G1 및 G2/M기의 분포를 대조군과 비교한 그래프이다. 도 5d는 배양 시간에 따라 대조군과 플라즈마 활성 배양액 처리군의 생존 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 플라즈마 활성 배양액의 처리 후 세포 내 활성산소(ROS)의 양을 플라즈마 활성 배양액 미처리 대조군(Control)을 기준으로 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 7c는 플라즈마 활성 배양액의 처리에 따른 세포 내 ROS 양 분석을 위한 유세포분석 결과 그래프이다. 도 7a는 유세포분석을 위해 실제 건강한 세포의 집단을 게이팅(gating)한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7b는 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 대조군의 M1과 M2의 형광신호 비율을 나타낸 그래프(상단) 및 해당 수치(하단)를 나타낸 그림이다. 도 7c는 플라즈마 활성 배양액 처리군과 대조군의 M2기 비율을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 자세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 플라즈마 활성 배양액(plasma activated media, PAM)의 제조
배양 중인 세포에 플라즈마를 직접 조사하는 경우 모든 세포에 고르게 플라즈마 활성 효과를 얻을 수 없는 점 등 단점을 보완하기 위해, 세포 배양용 액체 배지에 직접 플라즈마를 조사하여 플라즈마 활성 배양액을 제조하여 실험에 이용하였다.
멜라닌 세포 배양액으로는 M254 배지(GIBCO Cascade Biologics, Portland, OR, USA)가 사용되었으며, 상기 M254 배지에 상온상압 플라즈마를 가해 플라즈마 활성 배지를 제작하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 상온상압 플라즈마 조건은 3.0W 마이크로파 전력(microwave power)과 아르곤(Ar) 가스를 이용하여 상온 대기압에서 시행하였고, 플라즈마 생성 장치와 배지는 0.35cm 이격되어 있었다. 플라즈마 조사 온도는 40℃를 넘지 않도록 하였다. 세포가 없는 배지 10mL를 페트리 접시에 담고, 플라즈마를 각각 4분, 8분, 12분, 16분, 또는 20분간 조사하여 최종 플라즈마 활성 배양액을 제조하였다. 마이크로파 정확도는 ±2.0%, 가스 압력은 0 내지 3Bar 및 가스 흐름은 0 내지 5 SLM으로 조절되었다. 도 3a에 상온상압 플라즈마 발생기의 모식도를, 도 3c에 플라즈마 발생기 전극과 배지 사이의 간격을 나타내었다.
도 3b에 본 발명의 상온상압 플라즈마 제트의 방전 중 광학적 방출 스펙트럼을 200 내지 1000nm 범위에서 나타내었다. 주입되는 아르곤 가스 원자로부터 방출되는 스펙트럼은 690 내지 990nm이고 N2 및 O에 의한 피크는 337.2 및 690 내지 900nm 사이로 각각 측정되었다. OH band는 307 내지 309nm 범위에서 관찰되었다.
멜라닌 세포를 먼저 배양한 후, 플라즈마 활성 배양액으로 배양액을 교체하여 실험을 진행하였으며, 플라즈마 활성화 배지(Plasma-activated medium, PAM)는 플라즈마 조사 후 즉시 멜라닌 세포 배양에 이용되었다.
실시예 2. 멜라닌 세포의 배양
본 발명에 이용된 정상 인간 피부의 멜라닌 세포는 ATTC(Manassas, VA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 본 발명에서 사용된 멜라닌 세포는 M254 Medium(GIBCO Cascade Biologics, USA)에 1%의 human melanocyte growth supplement(HMGS, Gibco Cascade biologics, USA), 100U/ml 페니실린 및 50ug/ml 스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 배양하였다.
배양된 세포가 60mm 세포배양 접시에 1 Х 106 cells/dish가 되도록 분주하여 24시간 adaptation 시킨 후, 4분, 8분, 12분, 16분, 또는 20분간 플라즈마를 조사한 플라즈마 활성 배양액 10mL에서 24시간 또는 48시간 배양하였다. 양성 대조군(Positive control)으로는 플라즈마 활성 배양액 대신 멜라닌 생성 증가 효과가 있다고 알려진 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)를 10mL의 배지에 최종 농도 1uM이 되게 처리하였고, 음성 대조군(negative control)으로는 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려져 있는 알부틴(albutin)을 1mM이 되도록 첨가하였다.
배양 후 trypsin-EDTA solution (JBI, Seoul, Korea) 처리 및 5%(v/v) FBS를 함유한 PBS 로 세척 후 세포를 수확하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
실시예 3. 세포 사멸 또는 손상 발생 여부의 확인
3-1. 세포 배양
60mm 세포배양 접시에 멜라닌 세포를 5 Х 105cells/dish가 되도록 분주하고 24시간 배양 후, 플라즈마 활성 배양액(플라즈마 조사 시간 각각 4분, 8분, 12분, 16분 또는 20분) 또는 1uM a-MSH, 1mM 알부틴을 첨가하고, ROS를 형성하는 것으로 알려져 있는 과산화수소(H2O2)를 최종 농도가 100uM 또는 200uM이 되도록 처리한 후, 3시간 더 배양하였다. 이후 각 세포를 PBS로 세척하고, 20 uM 2, 7-디클로로플루오레신 디아세테이트(2, 7-dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 M254 배지에 HMGS와 같이 37℃ 온도에서 30분간 처리하여 유세포 분석에 이용하였다.
3-2. 현미경 관찰
플라즈마를 20분 조사한 플라즈마 활성 배지에서 24시간 또는 48시간 배양한 세포를 현미경으로 관찰한 결과를 도 1에 각각 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 배양 시간이 증가함에 따라 멜라닌 세포의 수가 증가했으며, 멜라닌 세포 특유의 수지상 돌기가 확인되어 외관상 손상된 세포가 거의 관찰되지 않음을 확인할 수 있다. 따라서 암세포에 플라즈마를 조사하여 활성산소가 증가하였을 때와는 달리, 본 발명의 플라즈마 활성 배양액은 멜라닌 세포의 사멸 또는 손상을 초래하지 않음을 알 수 있다.
3-3. 세포수 측정(Cell count)
세포수 측정을 통해 세포사멸이나 세포손상을 확인하였다. 구체적으로, 100mm 배양접시에 1x106의 세포를 24시간 부착시킨 후 배양액을 제거하고 4분, 8분, 12분, 16분, 및 20분으로 각각 처리된 PAM 을 사용하여 멜라닌 세포를 배양하였다. 이어서 24시간과 48시간 후에 trypsin-EDTA solution (JBI, Seoul, Korea)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 5% FBS로 효소의 작용을 억제시켰다. 이어서 인산완충버퍼액 (Phosphate Buffered Saline, PBS, pH 7.4)으로 2회 세척하고 세포수를 자동 세포계측기 ADAM-MC cell counter (NanoEnTeK, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다
멜라닌 세포가 사멸 또는 손상에 이르게 되는 지 확인하기 위해 플라즈마 노출 시간이 각각 0분, 4분, 8분, 12분, 16분, 또는 20분인 플라즈마 활성수를 사용한 경우의 생존 세포(live cell)의 수를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 세포 수 측정 결과, 플라즈마 노출 시간이 길어짐에 따라 점차 수확된 세포 수가 감소하는 양상이 나타났으나, 세포 접종량에 비해 세포수의 감소가 나타나지 않아, 세포 사멸 또는 세포 손상이 없음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 플라즈마 활성 배양액은 세포 증식을 다소 억제하는 효과는 있으나, 세포 사멸 또는 세포 손상은 발생하지 않는다.
실시예 4. 세포 내 활성산소(ROS) 수준 변화
4-1. 활성산소 생산량 측정 방법
플라즈마 활성 배양액에 의한 M2의 변화를 분석하기 위해, 멜라닌 세포 내 ROS의 양을 분석하였다. 멜라닌 세포에서 플라즈마 활성 배양액에 의한 세포 내 ROS의 증가는 2', 7'-디클로로플루오로세인 아세테이트(DCFH-DA)를 이용하여, 유세포분석법(flow cytometry)으로 측정되었다.
구체적으로, 양성 대조군으로서 H2O2에 노출된 후 ROS 수준의 증가를 검증하였으며, 음성 대조군인 a-MSH 및 arbutin에 의한 효과 역시 조사하였다. H2O2는 그 자체로 ROS로서, 양성 대조군으로 이용되었다. 추가로 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 그룹을 대조군(Control)으로 이용하였다.
먼저 멜라닌 세포를 6cm 세포 배양 접시에 5x 105 cells/dish로 분주한 후, 24시간동안 배양하여 접시에 부착시켰다. 부착된 멜라닌 세포를 a-MSH(1uM), arbutin(1uM), 및 H2O2 (100uM Ehsms 200 uM)로 처리하여 대조군으로 이용하였다. 실험군으로는 플라즈마 활성 배양액을 플라즈마 조사 시간에 따라 사용하였으며, 구체적으로 플라즈마 활성 배양액의 플라즈마 조사 시간은 각각 플라즈마 미처리 (0분), 4분, 8분, 12분, 16분, 및 20분이었다.
플라즈마 활성 배양액 또는 a-MSH, arbutin, H2O2를 처리하여 3시간 배양 후 세포 내 ROS 측정을 수행하였다. 상기 ROS는 퍼옥사이드(peroxide, H2O2), 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 및 일중항산소(singlet oxygen, 1O2)를 포함한다.
각 세포들은 PBS로 세척하고 20uM DCFH-DA(Sigma-Aldrich)가 희석된, HMGS를 포함하는 M254 배지에서 30분간 37℃에서 배양되었다. 상기 배양 직후 유세포 분석법을 이용하여 세포내 ROS 수준을 측정하였다.
4-2. 플라즈마 활성 배양액 처리에 따른 멜라닌 세포 내 ROS 변화
도 7에 플라즈마 활성 배양액의 처리에 따른 세포 내 ROS 양 분석을 위한 유세포분석 결과그래프를 나타내었다. 먼저 세포 조각(cell debris)이나 과하게 분화되는 등 분석에 차질을 주는 세포를 제외하기 위한 게이팅 결과를 도 7a에 나타내었다. 도 7a는 유세포분석을 위해 실제 건강한 세포의 집단을 게이팅(gating)한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7b 내지 12c에 유세포분석 결과를 M2기의 형광 비율로 표시하였으며, 기준선 왼쪽으로 M1은 스트레스 조건에 있지 않은 세포를 의미하며, 기준선 오른쪽의 M2는 ROS의 생산이 증가한 세포의 비율을 나타낸다. 도 7c에서 확인 가능한 바와 같이, 플라즈마 활성 배양액을 처리한 실험군에서 M2에 해당하는 비율이 증가하여, ROS의 생산이 도 7b의 대조군에 비해 상대적으로 많이 증가하였음이 확인되었다.
멜라닌 세포를 H2O2 100 및 200uM로 처리한 결과, 세포내 활성 산소(ROS) 수준이 각각 급격히 증가하여 H2O2 비처리 세포군에 비해 각각 1.8배 및 2.2배 증가하였다. a-MSH는 ROS 생산에 영향을 주지 않았다. 도 6에 나타낸 바와 같이, ROS 수준은 플라즈마 활성 배양액에서 배양된 모든 세포에서 증가하였다. ROS의 증가는 플라즈마 조사 시간에 비례하지는 않았으며, 플라즈마 활성 배양액에 의한 ROS의 증가는 H2O2 100 uM 처리에 의한 증가와 유사하였다(도 6).
본 발명에서의 플라즈마 활성 배양액 처리는 멜라닌 세포에서 ROS 증가가 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 대조군 대비 1.8배 내지 2.1배 수준으로, 증가폭이 적다. 이러한 낮은 수준의 ROS 증가는 세포 사멸을 유도할 수는 없으나, 세포증식을 저해하는 수준으로 예측된다.
실시예 5. PAM의 세포주기 정지 효과
5-1. 실험 방법
상기 실시예 3에서 확인된 세포 증식의 억제 효과의 작용기전을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometric analysis)을 수행하여 플라즈마 활성 배양액이 세포 주기 분포에 미치는 영향을 조사하였다. 0 내지 20분 사이의 다양한 플라즈마 노출 시간(0분, 4분, 8분, 12분, 16분 및 20분) 동안 플라즈마가 조사된 플라즈마 활성 배양액을 이용하여 멜라닌 세포를 24시간 또는 48시간 배양하였다.
대조군으로는 플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 세포를 사용하였으며, 이를 기준으로 세포사멸 및 죽은 세포의 기준을 설정하였다.
세포 배양 이후 PBS 버퍼를 이용하여 두 번 세척하고, 10ug/mL의 RNaseA 효소 처리 후, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, Sigma-Aldrich) 50ug/mL로 염색하였다. 이후 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson) 및 CellQuest 6.0 소프트웨어를 이용하여 세포 주기를 분석하였다.
5-2. PAM과 세포주기의 정지 (Cell cycle arrest)
도 4에 플라즈마 활성 배양액의 처리 시간에 따른 각 세포주기 단계별 세포 분포 그래프를 표시하였다. 도 4a는 sub-G1기, 도 4b는 G0/G1기, 도 4c는 S기, 도 4d는 G2/M기의 그래프이다.
구체적으로, 플라즈마 활성 배양액에서 멜라닌 세포를 24시간 배양 후, sub-G1 기의 세포 수가 플라즈마 조사 시간에 따라 통계적으로 유의미하게 증가하였다 (도 4a). G0/G1기의 비율 분포 또한 플라즈마 조사 시간에 따라 증가하였다 (도 4b). 이러한 G0/G1기의 멜라닌 세포 분포 증가는 G2/M기에 해당하는 세포 분포의 감소를 수반한다 (도 4d). S기는 플라즈마 처리에 의해 감소하였다 (도 4c). 상기 결과는 세포의 생장기(growth phase)의 증가, DNA 합성 및 체세포 분열의 저해에 의해 멜라닌 세포의 증식이 저해되었음을 암시한다.
멜라닌 세포를 플라즈마 활성 배양액에서 48시간 배양한 경우, sub-G1 기가 증가하였으나, 통계적으로 유의미한 증가율을 보이지는 않았다 (도 4a). 플라즈마 활성 배양액은 G0/G1 기를 감소시켰으며, G2/M기를 증가시켰다 (도 4b 및 4d). 상기 결과는 세포 주기가 정지(arrest)되나, 이러한 정지가 오래 지속되지는 않음을 의미한다. 세포 주기 정지가 감소하기 시작함에 따라 DNA 합성 및 체세포분열이 증가했다. S 기 또한 현저하지는 않지만 증가하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 플라즈마 활성 배양액이 멜라닌 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유발할 수 있음을 암시한다. 그러나 세포사멸은 유의미한 수준으로 나타나지 않았으며, 오래 지속되지 않고 일시적인 현상에 불과했다. 이러한 결과는 실시예 3의 세포 증식 및 손상 결과와 일치한다.
실시예 6. 세포주기의 스위칭 여부
6-1. 세포주기 스위칭 확인을 위한 세포주기 모니터링
플라즈마 활성 배양액의 세포 주기의 전환(switching)을 확인하기 위해, 멜라닌 세포를 플라즈마를 8분간 조사한 플라즈마 활성 배양액에서 배양하여 extended period 동안 모니터링을 수행하였다.
구체적으로, 세포를 플라즈마를 8분 조사한 플라즈마 활성 배양액에서 48시간 배양하였으며, 대조군으로는 플라즈마 활성 배양액으로 처리하지 않은 세포를 이용하였다. 이후 배양액을 플라즈마를 조사하지 않은 새로운 배양액으로 교체하여 세포를 24시간 또는 48시간 배양하였다. 세포 주기의 분석은 상기 실시예 5-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.
6-2. 세포 주기 정지의 회복
도 5에 플라즈마 활성 배양액의 처리 또는 미처리 후 플라즈마 미처리 배양액에서 세포를 배양하여 세포 주기의 회복 여부를 확인한 결과 그래프를 표시하였다. 도 5a 내지 10b에 배양 시간에 따른 각 그룹의 세포 주기 분석 결과를 나타내었다. 각 그룹은 전체 72시간 배양(PAM에서 48시간 이후 플라즈마 미처리 배지에서 24시간, 도 5a) 또는 전체 96시간(PAM에서 48시간 배양 후 플라즈마 미처리 배지에서 48시간, 도 5b) 배양한 그룹을 의미한다.
플라즈마 활성 배양액을 처리하지 않은 대조군과 비교할 때 sub-G1 기에서의 세포 사멸이 근소하게 증가하였으나, 이러한 변화는 두 그룹 모두 유의미한 증가로 판단되지 않았다.
S 기의 변화와 관련하여, 72시간 배양 그룹에서는 DNA의 합성이 저해되었으나, 96시간 배양한 그룹에서는 DNA 합성이 증가하였다 (도 5a 및 b). 따라서, DNA 합성은, 플라즈마 활성 배지 처리 이후 특정 시점에서 점차 증가한 것으로 해석된다.
도 5c에 총 배양 시간별 G0/G1 및 G2/M기의 분포를 대조군과 비교한 그래프를 표시하였다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포의 세포주기 분포는 그룹마다 다양하게 나타났다. G0/G1 기는 96시간 배양된 그룹에서의 분포가 72시간 배양된 그룹에 비해 13% 더 높게 나타났다. G2/M 기의 경우, 96시간 배양 그룹의 분포가 72시간 배양 그룹에 비해 53% 낮게 나타났다. 상기 차이가 발생하는 원인은 아직 불분명하나, 이러한 차이가 부분적으로 실험이 수행되는 시점의 세포의 생리학적 상태의 영향을 받는 것으로 예측된다. 일반적으로, 0.3 내지 2%의 세포가 sub-G1 기, 70 내지 74%의 세포가 G0/G1기, 15-20%가 S기, 및 7 내지 14%의 세포가 G2/M기에 해당하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 대조군과 실험군의 차이를 동시에 고려하였다. 대조군 그룹과 비교하여, G0/G1 기의 세포주기 분포는 72시간 및 96시간 배양 그룹에서 각각 20% 및 17% 감소하였다. 상기 결과는 세포 주기 회복이 세포 주기의 정지(arrest) 감소 및 체세포분열의 증가를 통해 이루어진다는 사실을 분명히 나타낸다.
도 4 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 세포들은 플라즈마 활성 배양액 처리 후 48시간 이내에 세포주기 진행의 회복을 통해 본래의 상태로 돌아가는 것으로 나타났다. 그러나 정상 상태로 완전히 회복하기까지에는 긴 시간이 필요하며, 많은 세포가 정지(arrest) 상태에 머물러 있었다. 따라서, 96시간이 지난 후에도 플라즈마 활성 배양액을 처리한 세포 증식률이 1.0 x 104 cells/h로, 대조군의 세포 증식률인 3.0 x 104cells/h보다 낮은 수치를 나타내었다 (도 5d).
본 발명에서 관찰된 세포 주기 정지는 플라즈마 활성 배양액에 의해 증가된 활성 산소(ROS)와 관련있는 것으로 추측된다. 세포 주기에 대한 활성 산소의 영향은 플라즈마 조사 시간과 비례하였으며, 일시적인 성장 정지부터 세포 사멸(apoptosis) 또는 세포 괴사(necrosis)와 같은 영구적인 세포 사멸까지 다양한 범위로 나타났다. 기존 연구와 비교하면, ROS는 마우스 섬유아세포의 G1, S, 및 G2기에서 일시적인 다중 시기의 세포 주기 정지를 야기한 바 있으나, M 기에는 영향을 주지 않았다. 또 다른 연구에서, ROS의 축적은 G2/M기의 정지 및 그에 따른 세포 사멸(apoptosis)을 유도한다는 사실이 보고된 바 있다.
본 발명에서, 플라즈마 활성 배양액은 G0/G1 및 G2/M 기의 조절을 통해 세포 주기의 정지를 유도하였으나, 유의미한 세포 사멸이 야기되지는 않았다. 나아가, 세포 주기 정지는 48시간 또는 그보다 짧은 시간 동안 지속되는 일시적인 현상으로서, 세포 주기가 천천히 회복되었다.
상온상압 플라즈마에 의해 생성된 활성산소의 배양액 내 반감기는 온도에 따라 수 시간 내지 수일이지만, ROS 수준은 시간에 따라 감소한다. 따라서, 멜라닌 세포에서 세포 내 ROS 수준의 증가 또한 시간에 따라 감소하며, 세포 주기 진행의 회복에 영향을 줄 것으로 예측된다. 상기 내용은 다음과 같이 요약될 수 있다. 적절한 농도의 플라즈마 활성 배양액(PAM) 처리는 세포 증식 및 세포 주기의 정지를 유발할 수 있으나, 상기 세포 증식 및 세포 주기의 정지는 특정 시간이 경과하면 회복될 수 있다. 상기 결과는 상온상압 플라즈마를 이용하여 세포 내 독성 없이 세포 주기를 켜고 끌 수 있음, 즉 스위칭이 가능함을 시사한다.

Claims (15)

  1. 세포 배양액에 플라즈마를 조사하여 제조된 플라즈마 활성 배양액(plasma activated media, PAM)을 포함하는, 세포 주기 조절용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마는 상온상압 플라즈마이며, 상기 상압은 대기압인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마는 4분 내지 30분 동안 조사되는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마 활성 배양액은, 플라즈마 활성 배양액을 포함하지 않는 배양액에 비해 세포 내 활성 산소를 1.1배 내지 3배 증가시키는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마 활성 배양액은 세포 사멸의 유도 없이 세포 주기를 정지시키는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마 활성 배양액은, G0/G1 또는 G2/M 검문 지점의 조절을 통해 세포 주기를 정지시키는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 멜라닌 세포(melanocyte), 암세포, 생식세포, 수정란, 모근세포, 조근세포, 신경세포, 및 면역 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포인 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양액은 포유동물 세포의 배양액인 것인, 조성물.
  9. 세포를 배양하는 단계; 및
    세포 배양액에 플라즈마를 조사하여 제조된 플라즈마 활성 배양액(plasma activated media, PAM)을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물을 상기 배양된 세포에 처리하는 단계를 포함하는,
    세포 주기를 가역적으로 정지시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 플라즈마는 상온상압 플라즈마이고, 상기 상압은 대기압인 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 플라즈마는 4분 내지 30분 동안 조사되는 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 세포는 멜라닌 세포(melanocyte), 암세포, 생식세포, 수정란, 모근세포, 조근세포, 신경세포, 및 면역 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포인, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 플라즈마 활성 배양액은 세포 내 활성 산소를 증가시키는 것인, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 세포주기 정지는 플라즈마를 조사하지 않은 세포 배양액에서 세포를 배양하여 회복되는 것인, 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 세포 배양액은 포유동물 세포의 배양액인 것인, 방법.
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