HU209154B - Process for producing chimeric antibody specific to human tumour antigene - Google Patents

Process for producing chimeric antibody specific to human tumour antigene Download PDF

Info

Publication number
HU209154B
HU209154B HU876038A HU603887A HU209154B HU 209154 B HU209154 B HU 209154B HU 876038 A HU876038 A HU 876038A HU 603887 A HU603887 A HU 603887A HU 209154 B HU209154 B HU 209154B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
chimeric
human
antibody
cells
gene
Prior art date
Application number
HU876038A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52153A (en
Inventor
Alvin Y Liu
Randy R Robinson
Karl Erik Hellstrom
Ingegerd Hellstrom
Original Assignee
Int Genetic Eng
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Int Genetic Eng, Oncogen filed Critical Int Genetic Eng
Publication of HUT52153A publication Critical patent/HUT52153A/hu
Publication of HU209154B publication Critical patent/HU209154B/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Details Of Garments (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya humán tumor antigén fajlagosságú antitestek előállítására rekombináns DNS módszerek, továbbá eljárás az ezeket kódoló genetikai szekvenciák, előállítására.
A sejt-sejt fúzió alkalmazása monoklonális antitestek előállításához [Kohler és Milstein: Natúré (London) 256, 495 (1975)] forradalmat okozott a biológiában, hatásában azonosat azzal, amelyet a rekombináns DNS klónozás feltalálása idézett elő. A hibridómákból termelt monoklonális antitesteket már széles körben alkalmazzák a klinikai és alapkutatási tanulmányokban. A humán B sejt hibridómák által termelt monoklonális antitestek alkalmazásai nagy ígéretet jelentenek a rák, vírusos és mikrobiális fertőzések, csökkentett antitest-termeléssel járó B-sejt immunhiányok és az immunrendszer más betegségei és rendellenességei kezelésében.
Sajnos sok akadály áll fenn a humán monoklonális antitestek képzésének a tekintetében. Ez különösen igaz, amikor olyan monoklonális antitesteket kívánunk kifejleszteni, amelyeket rák diagnózisához és kezeléséhez alkalmas humán tumor antigének meghatározásához kívánunk alkalmazni. Ezeknek a tumor antigéneknek a többségét nem ismeri fel idegen antigénként a humán immunrendszer, ennek megfelelően ezek az antigének nem immunogének emberekben. Ezzel ellentétben azok a humán tumor antigének, amelyek immunogének egerekben, alkalmazhatók egér monoklonális antitestek termelésére, amely antitestek fajlagosan felismerik a humán antigént és amelyeket lehet alkalmazni terápiás célokra emberben. „Idegen” antitestek, pl. egér antitestek, ismételt injektálása emberbe káros túlérzékenységi reakciókhoz, valamint a keringő antitestek fokozott kiürüléséhez vezethetnek úgy, hogy az antitestek nem érik el célpontjukat.
A másik gond, amellyel az immunológus szembe találkozik, az, hogy a sejttenyészetben kapott humán monoklonális antitestek többsége IgM típusú. Amikor azonban IgG típusú humán monoklonális antitesteket kívánunk kapni, olyan technikákat kell alkalmaznunk, mint pl. sejtosztályozás, hogy azt a néhány sejtet, amely IgG vagy más típusú antitesteket termel, azonosítsuk, és az IgM típusú antitesteket termelő, többséget jelentő sejtekből kiválasszuk. Igény van tehát hatékony eljárásra, amellyel bármilyen, előre meghatározott vagy kívánt antigén fajlagosságú adott antitest típusát megváltoztathatjuk.
A találmány szerinti megoldás lehetőséget biztosít arra, hogy hibridóma- és genetikai manipulációs technikák kombinációjával kiméra humán/nem-humán antitestek előállításához gyors és hatékony módszert, és ezekből származó termékeket nyújtson.
A találmány szerinti eljárással előállított kiméra antitestek az egér-egér hibridómákból származó monoklonális antitestek és a humán monoklonális antitestek előnyös jellemzőinek kombinálását jelentik. A kiméra monoklonális antitestek, az egér monoklonális antitestekhez hasonlóan felismerik a humán célantigént és kötődnek ahhoz, viszont az egér monoklonális antitestektől eltérően a kiméra antitestek faj-fajlagos tulajdonságai következtében káros túlérzékenység reakciók nem alakulnak ki, és emberben in vivő alkalmazva nem ürülnek ki gyorsan. Ezen kívül a találmány szerinti módszereket alkalmazva bármilyen antitest izotípust át lehet adni egy adott antigén kombináló helyen.
A kiméra antitestek termelése problémájával kapcsolatban több szerző publikált közleményeket.
Morrison S. L. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984. november)] meghatározott antigén kötő fajlagosságú egér-humán antitest molekula termelését ismertetik, az eljárás abban áll, hogy egy ismert antigén kötő fajlagosságú egér antitest-termelő mielóma sejtvonal variábilis régió génjeit humán immunglobulin konstans régió génekkel kapcsolják rekombináns DNS technikákat alkalmazva. Ezzel a módszerrel olyan kiméra géneket alkotnak, ahol az S107 mielóma sejtvonalból való nehézlánc variábilis régió exonja jól kapcsolódott a humán IgGl vagy IgG2 nehézlánc konstans régió exonjaival, és az ugyanabból a mielómából való könnyűlánc variábilis régió exonja jól kapcsolódott a humán kappa könnyűlánc exonjával. Ezeket a géneket egér mielóma sejtvonalakba vitték át. Ilyen módon kiméra egér-humán antifoszfokolin antitesteket termelő transzformált sejteket alakítottak ki.
Morrison S. L. és munkatársai (173494 számú európai szabadalmi közzétételi irat, közzétéve 1986. március 5-én) kiméra „receptor”-okat (pl. antitesteket) ismertetnek, amelyek az egyik fajból származó variálibis régiókat és a másik fajból származó konstans régiókat tartalmaznak. Megemlítik, hogy cDNS klónozást alkalmaznak a gének megalkotásához, de nem mutatják be a cDNS klónozás vagy beindítás részleteit (lásd az 5., 7. és 8. oldalakat).
Boulianne G. L. és munkatársai [Natúré 312, 643 (1984. december 13.)] szintén olyan antitesteket állítanak elő, amelyek egér variálibis régiókhoz kapcsolt humán konstans régiókból állnak. Olyan immunglobulin géneket alkottak, amelyekben a trinitro-fenil (TNP) hapténra fajlagos egér variábilis régiókat kódoló DNS szegmensek humán mű és kappa konstans régiókat kódoló szegmensekkel vannak kapcsolva. Ezek a kiméria gének funkcionális TNP kötő kiméra IgM-ként fejeződnek ki.
Boulianne és munkatársai, valamint Morrison és munkatársai munkájával kapcsolatban kommentárok találhatók az alábbi irodalmi helyeken:
Munro: Natúré 312, 597 (1984. december 13.); Dickson: Genetic Engineering News 5 (3) (1985. március); Marx; Science 229,455 (1985. augusztus).
Neuberger M. S. és munkatársai [Natúré 314, 268 (1985. március 25.)] olyan kiméra nehézlánc immunglobulin gént alkottak, amelyben egy, a 4-hidroxi-3nitrofenacetil (NP) hapténre fajlagos egér variábilis régiót kódoló DNS szegmens egy olyan szegmenssel van egyesítve, amely a humán epszilon régiót kódolja. Ezt a kiméra gént J558L sejtvonalba fertőzték át, és így olyan antitestet állított elő, amely az NP hapténhoz kötődött és humán IgE tulajdonságokat mutatott.
Neuberger M. S. és munkatársai ismertették olyan
HU 209 154 Β sejtvonalak előállítását is, amelyek olyan haptén-fajlagos antitesteket választanak ki, amelyekben az Fc rész vagy valamely aktív enzim résszel [Williams G. és Neuberger M. S.: Gene 43, 319 (1986)], vagy egy c-myc antigén determinánsokat mutató polipeptiddel van helyettesítve [Natúré 312, 604 (1984)].
Neuberger és munkatársai [WO 861/01533 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés (közzétéve 1986. március 13-án)] kiméra antitestek előállítását is (lásd az 5. oldalt) ismertetik, és a számos technika alkalmazása között a „típus megváltoztatás koncepcióját” (6. oldal) is felvetik.
Taniguchi M. [171 496 számú európai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1985. február 19-én)] olyan kiméra antitestek termelését ismerteti, amelyek kísérleti állatokból származó, tumor fajlagosságú variálibis régiókat és emberekből származó konstans régiókat tartalmaznak. A megfelelő könnyű- és nehézlánc gének genom formában termelődnek, és emlős sejtekben fejeződnek ki.
Takeda S. és munkatársai [Natúré 314, 452 (1985. április 4.)] lehetséges eljárást írnak le olyan kiméra immunglobulin gének előállítására, amelyek intron szekvenciája el van távolítva egy retvovírus vektor alkalmazásával. Egy nem várt összeillesztő donor helykialakulása azonban a V. terület vezető szekvencia kiiktatását okozza. így ezzel a megközelítéssel nem lehet teljes kiméra antitest molekulákat kialakítani.
Cabilly S. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3273-3277 (1984. június)] olyan plazmidokat írnak le, amelyek az anti-karcinoembrionális antigén (CEA) antitest nehézláncainak és/vagy könnyűláncainak szintézisét irányítják E. coliban. Egy másik plazmidot alkottak a nehézlánc (Fd’) fragmentum csonkított formájának a kifejezésére E. coliban. Funkcionális CEA-kötő aktivitást kapnak a nehézlánc egy részének könnyűlánccal in vitro helyreállításával, E. coli kivonatokban.
Cabilly S. és munkatársai [125023 számú európai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1984. november 14-én)] kiméra immunglobulin géneket és ezek vélt termékeit, valamint más módosított formákat ismertetnek. A 21., 28. és 33. oldalakon ez a közlemény tárgyalja a cDNS klónozását és beindítását.
Boss M. A. [120694 számú európai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1984. október 3-án)] 4-nitrofenil fajlagosságú, nem kiméra immunglobulin láncok kifejeződését mutatja be E. coliban. Itt számos kiméra antitestet írnak le, de részletek nélkül (lásd a 9. oldalt).
Wood C. R. és munkatársai [Natúré 314, 446 (1985. április)] olyan plazmidokat írnak le, amelyek egér antiNP antitest fehérjék szintézisét irányítják élesztőkben. Úgy tűnik, hogy a mű antitest fehérje nehézláncok glikozilezve vannak az élesztősejtekben. Amikor mind a nehéz-, mind a könnyűláncot ugyanabban a sejtben szintetizálják, néhány fehérje funkcionális antitest molekulákká áll össze, amint ezt az élesztő sejtekből készített oldható fehérjében anti-NP kötő aktivitással kimutatják.
Alexander A. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3260-3264 (1982)] egy abnormálisán rövid olyan lg gamma nehézláncot (OMM gamma3 HCD szérum fehérje) kódoló cDNS szekvencia előállítását írják le, amely egy 19 aminosav hosszúságú vezetőt tartalmaz, amelyet a V terület első 15 gyöke követ. Egy erőteljes belső kiiktatás eltávolítja a V terület maradékát és a teljes CH1 tartományt. Ez egy belsőleg kiiktatott molekulát kódoló cDNS.
Dolby T. W. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 6027-6031 (1980)] egy cDNS szekvencia és az ezt tartalmazó rekombináns plazmid előállítását írja le, ahol a szekvencia a mű és kappa humán immunglobulinokat kódolja. A rekombináns DNS molekulák egyike a CH3 konstans régió tartomány egy részéhez és a teljes 3’ nem-kódoló szekvenciához tartozó kodonokat tartalmazza.
Seno M. és munkatársai [Nucleic Acids Research
11, 719-726 (1983)] egy cDNS szekvencia és az ezt tartalmazó rekombináns plazmidok előállítását írja le, amely szekvencia a humán IgE nehézlánc (epszilon lánc) variálibis régiójának egy részét és teljes konstans területét kódolja.
Kurokawa T. és munkatársai [Nucleic Acid Research 11, 3077-3085 (1983)] három kifejező plazmid megalkotását mutatja be cDNS-t alkalmazva, amely plazmidok a humán IgE nenézlánc konstans régióját kódolják.
Liu F. T. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5369-5373 (1984. szeptember)] cDNS szekvenciák és az ezeket tartalmazó rekombináns plazmidok előállítását írják le; ezek a szekvenciák a humán IgE nehézlánc CH2 tartományának mintegy kétharmadát és a Ch3 és CH4 tartományának egészét kódolják.
Tsujimoto Y. és munkatársai [Nucleic Acids Rés.
12, 8407-8414 (1984. november)] humán V lambda cDNS szekvenciának egy lg lambda-termelő humán Burkitt limfóma sejtvonalból való előállítását írják le, ahol a cDNS szintézishez primerként egy klónozott konstans régió gén előnyeit használják ki.
Murphy J. [WO 83/03 971 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés (közzétéve 1983. november 24-én)] egy toxint és egy sejtspecifikus ligandumot (amely lehet antitest) tartalmazó fragmentumokból készített hibrid fehérjéket ismertet.
Tan és munkatársai [J. Immunoi. 135, 8564 (1984. november)] kiméra humán-egér immunglobulin genomiális gén kifejeződését érik el egér mielóma sejtekbe való átfertőzés után.
Jones Ρ. T. és munkatársai [Natúré 321, 552 (1986. május)] olyan genom-konstrukciót alkotnak meg és fejeznek ki, ahol egér monoklonális antitestből való variábilis régiók CDR tartományaival helyettesítik a humán antitestben levő megfelelő tartományokat.
Sun L. K. és munkatársai [Hybridóma 5, 1. supplementum, S17 (1986)] lehetséges tumor fajlagossággal rendelkező kiméra humán/egér antitestet írnak le. A kiméra nehéz- és könnyűlánc gének genom-konstrukciók és emlős sejtekben fejeződnek ki.
Sahagan és munkatársai [J. Immunoi. 137, 10663
HU 209 154 Β
1074 (1986. augusztus)] humán tumorral társult antigénre való fajlagossággal rendelkező kiméra antitestet írnak le, amelyekhez a gének genomiális szekvenciákból vannak összeállítva.
A szakterületen nemrégiben jelentek meg összefoglaló közlemények is. Morrison S. L.: Science 229, 1202-1207 (1985. szeptember 20.); Oi V. T. és munkatársai, BioTechniques 4,214 (1986).
Különösen idevág Oi és munkatársai összefoglalója, amely azt állítja, hogy a cDNS konstrukcióból származó kiméra antitestek termelése élesztőben és/vagy baktériumokban nem szükségszerűen előnyös.
Ide vonatkozik még a kommentár is a Biotechnology 4, (1986) irodalmi hely 835. oldaláról.
A találmány tárgya eljárás kívánt variábilis régió fajlagossággal és konstans régió tulajdonságokkal rendelkező genetikai manipulációval kialakított kiméra antitest előállítására génklónozás és a könnyű- és nehézláncok kifejeződése útján. A klónozott immunglobulin génterméket genetikailag manipulált sejtekben való kifejeződéssel állítjuk elő.
Az oligonukleotid szintézis, rekombináns DNS klónozás és fajlagos immunglobulin láncok előállítása különböző prokarióta és eukarióta sejtekben eszközt nyújt humán tumor antigén fajlagosságú kiméra humán/egér monoklonális antitestek nagy léptékű előállítására. A találmány szerinti eljárással immunglobulin láncokat kódoló cDNS szekvenciákat állítunk elő, amely láncok egy konstans humán régiót és egy variábilis, nem-humán régiót tartalmaznak. Az immunglobulin láncok lehetnek könnyű- vagy nehézláncok.
A találmány szerinti eljárással továbbá immunglobulin láncokat kódoló gén-szekvenciákat állítunk elő, amely gén-szekvenciák kívánt fajlagosságú variábilis régiónak megfelelő cDNS-t tartalmaznak. Ezeket kombinálni lehet humán eredetű genomiális konstans területekkel.
A találmány szerinti eljárással a fentiek szerinti szekvenciákat állítjuk elő, amelyek rekombináns DNS molekulákban, megfelelő hordozókban, pl. plazmid vektorokban vannak jelen, amelyek képesek kifejeződni kívánt prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezetekben.
A találmány értelmében továbbá olyan gazdaszervezeteket állítunk elő, amelyek tenyésztés révén képesek kiméra antitesteket előállítani.
A találmány szerinti eljárással egyedi kiméra immunglobulin egyedi láncokat, valamint teljesen összeállított molekulákat is előállítunk, amelyek humán konstans régiókat és humán tumor antigén fajlagosságú, variábilis régiókat tartalmaznak, ahol minden variábilis régió azonos kötési fajlagossággal bír.
A találmány szerinti eljárással előállított további immunglobulin láncok és/vagy molekulák lehetnek:
a) teljes funkcionális immunglobulin molekula, amely az alábbiakat tartalmazza:
(i) két egyforma kiméra nehézlánc, amely humán tumor antigén fajlagosságú variábilis régióból és humán konstans régióból áll, és (íi) két egyforma teljes (vagyis nem-kiméra) humán könnyűlánc;
b) teljes funkcionális immunglobulin molekula, amely az alábbiakat tartalmazza:
(i) két egyforma kiméra nehézlánc, amely a jelzett variálibis régióból és humán konstans régióból áll, (ii) két egyforma teljes (vagyis nem-kiméra) nemhumán könnyűlánc;
c) monovalens antitest, azaz komplett, funkcionális immunglobulin molekula, amely az alábbiakat tartalmazza:
(i) két egyforma kiméra nehézlánc, amely a fentebb jelzett variábilis régióból és egy humán konstans régióból áll, és (ii) két különböző könnyűlánc, amelyek csak egyikének van azonos fajlagossága a nehézláncok variábilis régióját illetően; a létrejövő antitest molekula ennek csak az egyik végéhez kötődik és ezért nem képes kétértékű (divalens) kötésre.
A kiméra láncok vagy nem-kiméra láncok fentebb említett kombinációit kódoló genetikai szekvenciák, különösen cDNS szekvenciák előállítása szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
A találmány szerinti eljárással továbbá olyan genetikai szekvenciákat, elsősorban cDNS szekvenciákat állítunk elő, amelyek egy antitest molekula nehézés/vagy könnyűláncának kívánt fajlagosságú variábilis régióját kódolják, operatívan összekapcsolva olyan polipeptideket kódoló szekvenciával, amelyek eltérőek egy immunglobulin lánctól (pl. enzim). Ezeket a szekvenciákat a találmány szerinti eljárással állíthatjuk össze, és kifejezhetjük, hogy kevert funkciójú molekulákat termeljenek.
cDNS szekvenciák alkalmazása különösen előnyös a genomiális szekvenciákhoz viszonyítva (amelyek intronokat tartalmaznak), amennyiben a cDNS szekvenciákat ki lehet fejezni baktériumokban és más olyan gazdaszervezetekben is, amelyekből hiányoznak a megfelelő RNS összeillesztő rendszerek.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábra a mű- és gamma-immunglobulin nehézlánc-gének DNS átrendeződéseit és kifejeződését mutatja be. Ez a humán nehézlánc-gén komplex vázlatos bemutatása, nem léptékszerűen bemutatva. A nehézlánc variábilis V régió képződés a VH, D és JH génszegmensek megfelelő összekapcsolása révén történik. Ez alakítja ki az aktív mű-gént. Egy másfajta DNS átrendeződés, amelyet „típus megváltoztatás”-nak nevezünk, áthelyezi az egyesített VH, D és JH területeket a mű konstans C terület szomszédságából egy másik nehézlánc C terület szomszédságába (itt a gamma típusra való megváltoztatást ábrázoljuk).
A 2. ábra a humán és egér J régiók ismert nukleotid szekvenciáját mutatja be. A J régiókhoz tartozó megegyező szekvenciákat a tényleges szekvenciák alatt mutatjuk be. Az egér kappa J régió megegyező szekvencia alatti oligonukleotid szekvencia egy Univerzális Immunglobulin Gén (UIG) oligonukleotid. Meg kell jegyeznünk, hogy csak néhány J régió van viszonylag megőrzött szekvenciákkal, elsősorban a konstans régiók közelében, az egyes immunglobulin gén fókuszokban.
HU 209 154 Β
A 3. ábra az egér J régiók nukleotid szekvenciáit mutatja be. Alul ábrázoltuk az UIG-H és UIG-K oligonukleotid primereket. Meg kell jegyeznünk, hogy mindegyikük tartalmaz egy restrikciós enzimhelyet. Ezek primerként alkalmazhatók az mRNS variábilis régiójával komplementer cDNS szintéziséhez, valamint klónozott cDNS in vitro mutagenizálásához.
4. ábra Humán konstans tartomány modul
A pGMHó humán C gamma 1 kiónt a GM2146 sejtvonalból izoláltuk. Ennek a Jh-Ch1 csatlakozásánál található szekvenciát mutatjuk be. Két restrikciós enzimhely alkalmas egyesítési pontként CH1 gén különböző VH génekkel történő rekombinálásában. A BstEII hely a JH régióban van, és ezt egy egér-humán kiméra nehézlánc immunglobulin korábbi konstrukciójában alkalmaztuk. Az Apai hely a 16. nukleotid gyök a humán gamma 1 CH1 kódoló tartományában; ezt alkalmazzuk a találmányban leírt konstrukcióban.
A pGML60 humán CK klón két cDNS klón egyesített terméke, az egyiket GM1500-ból (pK2-3), a másikat GM2146-ból (pGMLl) izoláltuk. A bemutatott JhCK csatlakozási szekvencia a pK2-3-ból származik. A JK HindlII oligonukleotidot alkalmazó in vitro mutagenezist úgy hajtjuk végre, hogy beépítünk egy 14 nukleotid hosszúságú HindlII helyet a J-C csatlakozástól 5’ irányban. Ez az emberi GTG kodont CTT kodonná változtatja.
Az 5. ábra a pH3-6a L6 VH cDNS klón V régiója nukleotid szekvenciáját mutatja be. A szekvenciát a didezoxi-terminációs eljárással határozzuk meg, gén fragmentumok M13 szubklónjait alkalmazva (a későbbiekben ismertetjük). A körök azokat az aminosav-gyököket jelzik, amelyeket peptid szekvenciával igazoltunk. A CDR3 régióban a DSP2-vel homológ szekvenciát aláhúztuk.
A 6. ábra a pL3-12a L6 VK cDNS klón V régiója nukleotid szekvenciáját mutatja be. A helyre irányuló mutagenezishez alkalmazott oligonukleotid prímért alul, a JK5 szegmensben mutatjuk be. A körök azokat az aminosav gyököket jelölik, amelyeket peptid szekvenciával izoláltunk.
A 7. ábra a kiméra L6-VH + humán C gamma 1 kifejező plazmid megalkotását mutatja be. Az (a) panel az M13mpl9-Cl-delta4 (Cl-delta4) és M13mpl9-Cldelta21 (Cl-delta21) BAL-31 kiiktatásos kiónok szekvenciáit mutatja be. A pH3-6a cDNS klón 5’ végét nyíllal jeleztük. Az M13 szekvenciákat aláhúztuk. Az ebben a kísérletben alkalmazott oligonukleotid primer a H3-6a (5’-GACTGCACCAACTGG-3’), amely FR 1-ben az érett N terminális közelében kezdődik. A (b) panel 1 pg CI-delta4 és Cl-delta21 helyre irányuló mutageneziséhez szolgáló stratégiát mutatja be, amelyeket 20-20 ng MJH2-ApaI 31-mer oligonukleotidhoz forrasztottuk. A komplementer szálat DNS polimeráz Klenow-fragmentum segítségével szobahőmérsékleten 30 perc, majd 15 °C hőmérsékleten 72 óra alatt szintetizáltuk. Az átfertőzött fág tarfoltokat nitrocellulózra adszorbeáltuk, NaOH-val rögzített, és 32P-veI jelzett MHJ2-ApaI oligonukleotidhoz hibridizáltuk 65 °C hőmérsékleten 18 óra hosszat 4xTBS [0,6 mól/1 NaCl,
0,04 mól/1 trisz-HCl (pH 7,4), 0,004 mól/1 EDTA] + 10% dextránszulfátban. A szűrők végső mosását 65 °C hőmérsékleten 4xSSPE + 0,1% SDS-ben 15 percig végeztük [Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]. A pozitív tarfoltokat úgy mutattuk ki, hogy egy éjszakán át exponáltuk Kodak XAR filmen, majd ezeket közvetlenül átvittük növesztéshez, illetve RF DNS restrikciós enzimes elemzéséhez. Az MJH2-ApaI oligonukleotid az egér CHl-hez való hibás illesztéseit megjelöltük; ezek kódolási változásokat eredményeznek, amelyeket az oligonukleotidok alatt jeleztünk. A (c) panel az egyes mutagenizált L6-VH moduloknak a pING200l2 kiméra kifejező plazmid állandó VH-jával történő helyettesítésének stratégiáját mutatja be, amelynek során a pING2111-et és pIN2112-t kialakítjuk.
A 8. ábra a kiméra pING2119 L6 kifejező plazmid megalkotását mutatja be. A pING2100-ból való SalI-> BamHI fragmentum azonos a pING2012 E-ből való Sáli—>BamHI „A” fragmentummal.
A 9. ábra a VK gén módosítását mutatja be és ennek alkalmazását könnyűlánc, valamint nehéz- és könnyűlánc kifejező plazmidok megalkotásában:
(a) Az oligo d[GC] szegmensének kiiktatása L6 VK-tól 5’ irányban. Az oligonukleotid 22-mer hosszú, és 1 Sáli helyet tartalmaz. A három hibás illesztést mutatjuk be. A VK gént mutagenezis után Sall-Hind III fragmentumként egyesítjük a humán C K modullal. Az így keletkezett kifejező plazmid a pING2119.
(b) pING2114, nehéz- és könnyűlánc kifejező plazmid. A pING2114 kifejező plazmid tartalmazza az L6 nehézlánc kiméra gént a pING2111-ből és a kiméra könnyűláncot a pING2119-ből (vastag vonal).
A 10. ábra az L6 kiméra antitest kifejező plazmidok megalkotásában végzett szekvencia-változtatások öszszefoglalását mutatja be. Az 5’ nem transzlatált régióban aláhúzott gyökök a klónozott egér kappa- és nehézlánc-génekből származnak. A V/C határon bekarikázott gyökök a restrikciós enzim helyek bevezetése érdekében végzett mutagenezises műveletek eredményei. A fölöttük kis körökkel jelzett gyökök az L6 nehézlánc kimérában szintén mutagenezis eredményei. Ezek néma változások.
Az alábbiakban leírjuk a találmány előnyös kiviteli módjait.
Bevezetés
Az antitestek általában két könnyű- és két nehézlánc molekulából állnak. A könnyű- és nehézláncok szerkezeti és funkcionális homológiájú tartományokra oszthatók. Mind a könnyű (VL), mind a nehéz- (VH) lánc variábilis régiói felismerést és fajlagosságot határoznak meg. A könnyű- (CL) és nehéz- (CH) lánc konstans régióinak a tartományai fontos biológiai tulajdonságokat adnak át, pl. antitest lánc kapcsolódást, kiválasztódást, placentán keresztüli mobilitást, komplement kötést és hasonlókat.
A B sejtekben az események komplex sorozata vezet az immunglobulin-gén kifejeződéséhez. Az antigén fajlagosságot és kötést átadó V régió gén-szekvenciák
HU 209 154 Β különböző csíravonal gén-szegmensekben helyezkednek el, ezeket VH-nak, D-nek és JH-nak; vagy VL-nek és JL-nek nevezzük. Ezek a gén-szegmensek DNS átrendeződésekkel vannak kapcsolva, így a komplett V területeket alkotják, amelyek a könnyű-, illetve nehézláncokban fejeződnek ki (1. ábra). Az átrendezett, kapcsolt (VL-JL és Vh-D-Jh) V szegmensek ezután a teljes variábilis régiót, illetve a könnyű- és nehézláncok antigén-kötő tartományait kódolják.
Meghatározások
A leírásban és igénypontokban az alábbi kifejezéseket és fogalmakat alkalmazzuk.
(1) Kifejező vektor; az mRNS szintéziséhez szükséges, bármilyen génszekvenciából származó szabályozó jeleket tartalmazó plazmid DNS a vektorba beiktatva.
(2) Modul vektor; konstans vagy variábilis régió génmodult tartalmazó plazmid DNS.
(3) Kifejező plazmid: olyan kifejező vektor, amely egy beiktatott gént, pl. egy kiméra immunglobulin gént tartalmaz.
(4) Gén klónozás: egy gén szintézise, beiktatása DNS vektorokba, azonosítása hibridizálással, szekvenciaelemzése stb.
(5) Átfertőzés (transzfekció): DNS átvitele emlős sejtekbe.
Genetikai eljárások és termékek A találmány tárgya eljárás egy humán tumor antigén fajlagosságú humán/egér kiméra antitest klónozására és előállítására. Antigénként a Cancer Rés. 46, 3917-3923 (1986) és Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7059-7063 (1986) irodalmi helyeken leírt monoklonális antitestekkel kötődő antigént alkalmazunk. Az ezt a monoklonális antitestet kiválasztó hibridómát az American Type Culture Collection-nál (ATCC, Rockville, Maryland) deponáltuk 1984. december 6-án ATCC NB 8677 letéti számon.
Az előállítási eljárás öt elemből tevődik össze:
(1) Hírvivő (messenger) RNS (mRNS) izolálása a monoklonális antitestet termelő egér B sejt hibridóma vonalból, klónozás és cDNS termelés ebből;
(2) Univerzális Immunglobulin Gén (UIG) oligonukleotidok előállítása, amelyek a könnyű- és nehézlánc mRNS-ben levő variábilis régió génszegmensek klónozásához primerekként és/vagy vizsgáló mintaként alkalmazhatók, és cDNS előállítása ezekből;
(3) Konstans régió génszegmens modulok előállítása cDNS előállításával és klónozásával, vagy genomiális gén előállítással és klónozással;
(4) Komplett nehéz- és könnyűlánc kódoló szekvenciák előállítása a fenti (2) rész szerinti klónozott fajlagos immunglobulin variábilis régió génszegmensek és a klónozott humán konstans régió génszegmens modulok összekapcsolásával;
(5) Könnyű- és nehézláncok kifejezése és termelése kiválasztott gazdaszervezetekben, beleértve a prokarióta és eukarióta sejteket, vagy külön-külön végzett fermentációkban, majd az antitest molekulák in vitro összeállítása, vagy mindkét lánc azonos sejtben történő termelés.
Az immunglobulin könnyű- és nehézlánc-gének és a kódolt hírvivő RNS-ek közös vonása az úgynevezett J régió [azaz kapcsoló (joining) terület, lásd az 1. ábrát]. A könnyű- és nehézlánc J régiók különböző szekvenciákkal bírnak, de nagymértékű (több mint 80%) szekvencia homológia áll fenn, különösen a konstans régiók közelében, a nehéz JH régiókban, illetve a kappa könnyűlánc J régiókban. Ezt a homológiát használjuk ki a találmány szerinti eljárásban, és a könnyű- és nehézlánc J régiók megegyező szekvenciáit alkalmazzuk oligonukleotidok (amelyeket itt UIG-nek nevezünk) tervezéséhez, amelyeket primerekként vagy vizsgáló mintákként használunk immunglobulin könynyű- és nehézlánc mRNS-ek vagy gének klónozásához (3. ábra). Egy adott UIG, szekvenciájától függően, képes lehet hibridizálni az összes immunglobulin mRNShez vagy génhez, amely egy egyedi, fajlagos J szekvenciát tartalmaz. Egy adott UIG vizsgáló minta másik hasznosítása lehet a hibridizálás egy fajlagos konstans régió, pl. UIG-MJK könnyűlánc vagy nehézlánc mRNS-éhez, amely kimutat minden egér JK-t tartalmazó szekvenciát (2. ábra). Az UIG tervezésekor egy olyan szekvenciát is beiktathatunk, amely egy restrikciós enzimhelynek az immunglobulin gén cDNS másolatába történő bevezetésére szolgál (lásd a 3. ábrát). A találmány szerinti eljárásban kémiai gén-szintézist is végezhetünk az UIG vizsgáló minták kialakítására, amelyeket az immunglobulin mRNS klónozására és az immunglobulin mRNS V területek módosítására alkalmazunk. Másrészt oligonukleotidokat a célból is szintetizálhatunk, hogy egyedileg felismerjük a J régiók kevésbé megőrzött 5’-régióját, azaz mint diagnosztikus segédanyagot alkalmazhatjuk az immunglobulin mRNS-ben jelen levő adott J régió azonosítására.
A komplett V+C régió cDNS kiónjainak a hibridóma sejt könnyű- és nehézlánc mRNS-ekbŐl történő kialakítására többlépéses munkamenetet alkalmazunk. Először az oligo dT-vel beindított cDNS komplementer szálát szintetizáljuk, és ezt a kettős szálú cDNS-t megfelelő cDNS klónozó vektorokba, pl. pBR322-be [Gubler és Hoffman: Gene 25, 263 (1983)] klónozzuk. A kiónokat UIG oligonukleotid vizsgáló mintával végzett hibridizálással vizsgáljuk át. Az ezzel az átvizsgálás! eljárással azonosított pozitív nehéz- és könnyűlánc kiónokat térképezzük és szekvenciaelemzésnek vetjük alá, hogy kiválasszuk azokat, amelyek V régiót és vezető kódoló szekvenciát tartalmaznak. Kívánt restrikciós enzim hasítási helyek bevezetésére in vitro mutagenezist, beleértve pl. az UIG oligonukleotidok alkalmazását, alkalmazunk.
Eljárhatunk úgy is, hogy szintetikus UIG oligonukleotidokat alkalmazunk primerként a cDNS szintéziséhez.
Másodszor, cDNS konstans terület modul vektorokat készítünk humán sejtekből. Szükség esetén ezeket a cDNS kiónokat helyre irányuló mutagenezissel módosítjuk, hogy egy restrikciós helyet alakítsunk ki a humán szekvenciában levő analóg helynél vagy egy má6
HU 209 154 Β sík kívánt helynél a konstans régió határának közelében.
Eljárhatunk úgy is, hogy genomiális C régió kiónokat hasznosítunk forrásként C régió modul vektorokhoz.
Harmadszor, a fentiek szerint kialakított, klónozott V régió szegmenseket kimetsszük és könnyű- vagy nehézlánc C régió modul vektorokba ligáljuk. így pl. klónozhatjuk a komplett humán kappa könnyűlánc C régiót és a komplett humán gamma, C régiót. Ezen kívül módosíthatjuk a humán gamma, területet úgy, hogy egy terminációs kodont vezetünk be, és ezáltal olyan génszekvenciát kapunk, amely egy Fab molekula nehézlánc részét kódolja.
A működőképesen összekapcsolt V és C szekvenciákat tartalmazó kódoló szekvenciákat ezután megfelelő kifejező hordozókba visszük át megfelelő, prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezetekben való kifejeződéshez. A „működőképesen összekapcsolva” kifejezés azt jelenti, hogy a kódoló szekvenciák közös keretben vannak egyesítve, amelyek a triplett leolvasó keretben változások vagy megszakítások nélkül folyamatosan transzlatálható génszekvenciát képeznek.
A cDNS genetikai szekvenciáknak a találmány szerinti eljárásban való alkalmazásának különös előnye az a tény, hogy ezek folyamatosan kódolják mind a nehéz, mind a könnyű immunglobulin láncokat. A „folyamatosan” kifejezés azt jelenti, hogy ezek a szekvenciák nem tartalmaznak intronokat (azaz nem genomiális szekvenciák, hanem mivel az mRNS-ből erednek reverz átírással, az egymás melletti exonok szekvenciái). A találmány szerinti eljárással előállított cDNS szekvenciáknak ez a jellemzője lehetővé teszi, hogy ezek kifejezhetők legyenek prokarióta gazdaszervezetekben, pl. baktériumokban, vagy alacsonyabb rendű eukarióta gazdaszervezetekben, pl. élesztőkben. A cDNS klónozási eljárás alkalmazásának másik előnye, hogy a variábilis régió gén-modulok könnyen és egyszerűen nyerhetők.
A „konstans” és „variábilis” kifejezéseket funkcionálisan alkalmazzuk az immunglobulin lánc azon régióinak a jelölésére, mind a könnyűlánc, mind a nehézlánc esetén, amelyek a természetes, nem kiméra antitestekben levő variábilis és konstans régiók által mutatott tulajdonságokat és vonásokat kódolják. Megjegyezzük, hogy nem szükséges, hogy a variábilis vagy konstans régiókat kódoló teljes terület jelen legyen, amennyiben egy funkcionálisan működő régió jelen van.
A kifejező hordozók lehetnek plazmidok vagy más vektorok. Ezek közül előnyösek azok a hordozók, amelyek funkcionálisan komplett humán konstans nehézvagy könnyűlánc szekvenciát hordoznak, ahol ezek a szekvenciák megfelelő restrikciós helyekkel bírnak. Ezek a restrikciós helyek úgy vannak megtervezve, hogy bármilyen, megfelelő kohezív végekkel bíró, variábilis nehéz- és könnyűlánc szekvencia könnyen beleiktatható legyen. A humán konstans nehéz- vagy könnyűlánc szekvenciát tartalmazó hordozók tehát a találmány szerinti eljárással előállított fontos termékek.
Ezeket a hordozókat bármilyen kívánt komplett nehézvagy könnyűlánc kifejezéséhez alkalmazhatjuk bármilyen alkalmas gazdaszervezetben.
Az egyik előnyös gazdaszervezet az élesztő. Élesztő alkalmazása immunglobulin könnyű- és nehézláncok előállításához jelentős előnyöket biztosít. Az élesztők elvégeznek bizonyos transzláció utáni peptid-módosításokat, beleértve a glikozilezést. Egy sor rekombináns DNS stratégia létezik jelenleg, amelyek erős promotor szekvenciákat és nagy kópiaszámú plazmidokat használnak; ezeket a kívánt fehérjék kiemelkedő termelésére lehet alkalmazni élesztőkben. Az élesztők klónozott emlős géntermékekben felismernek vezető szekvenciákat, és vezető szekvenciákat hordozó peptideket (vagyis prepeptideket) választanak ki (Hitzman és munkatársai: llth International Conference on Yeast; Genetics and Molecular Biology, Montpelier, Franciaország, 1982. szeptember 13-17.).
Élesztő gén kifejező rendszereket rutinszerűen lehet értékelni a nehéz- és könnyűlánc termelés szintje, fehérje-stabilitás és -kiválasztás alapján. Bármely olyan élesztő gén kifejező rendszer-sorozatot alkalmazhatunk amely az aktívan kifejezett gének promoter és terminátor elemeit tartalmazza, ahol az aktívan kifejezett gének olyan glikolitikus enzimeket kódolnak, amelyek nagy mennyiségben termelődnek, amikor az élesztőket glükózban gazdag tápközegben növesztjük. Az ismert glikolitikus gének is nagyon hatékony transzkripciós kontroll szignálokat biztosítanak. így pl. az izo-l-citokróm C (CYC-1) gén promotor és terminátor szignáljait is alkalmazhatjuk.
A klónozott immunglobulin cDNS-ek élesztőben való kifejezéséhez optimális kifejező vektorokat a következőképpen értékelhetjük ki:
(1) A V és C régiókat összekötő klónozott immunglobulin DNS-t különböző transzkripciós promotorokhoz és terminátor DNS fragmentumokhoz rögzítjük.
(2) A kiméria géneket élesztő plazmidokba visszük [lásd pl.: Broach J. R.: Methods in Enzymology; 101. kötet, 307. oldal (szerkesztők: Wu R. és munkatársai (1983)].
(3) További genetikai egységeket, pl. élesztő vezető peptidet foglalhatunk be az immunglobulin DNS konstrukciókba, hogy antitest kiválasztódást érjünk el.
(4) A szekvencia egy részletét, leggyakrabban a génszekvencia 6-20 kodonját módosíthatjuk, hogy előnyös élesztő kodon felhasználást képviseljen.
(5) A kiméra géneket olyan plazmidokba visszük át, amelyeket élesztő kromoszómákba való integráláshoz alkalmazunk.
A könnyű- és nehézlánc gének élesztőben történő szimultán kifejezését a következőképpen végezhetjük. (1) A könnyű- és nehézlánc géneket egyenként egy élesztő promotor és egy terminátor szekvenciához rögzítjük és ugyanabba a plazmidba visszük be. Ezt a plazmidot vagy élesztőben való, vagy autonóm replikációhoz, vagy az élesztő kromoszómába bizonyos helyeknél való integráláshoz tervezhetjük.
HU 209 154 Β (2) A könnyű- és nehézlánc géneket egyenként egy élesztő promotor és terminátor szekvenciához rögzítjük különböző plazmidokban, amely plazmidok különböző szelektív markereket tartalmaznak. így pl. a könnyűlánc gént olyan nehézlánc plazmidba vihetjük be, amely szelektív markerként a trp 1 gént tartalmazza, míg a nehézlánc gént olyan plazmidba vihetjük be, amely szelektív markerként ura3-at tartalmaz. A plazmidokat vagy élesztőben való autonóm replikációhoz, vagy az élesztő kromoszómájába bizonyos helyeknél való integrációhoz tervezhetjük. Egy olyan élesztő törzset, amely mindkét szelektív markerre nézve hiányos, vagy szimultán vagy egymás után transzformálunk a könnyűlánc gént tartalmazó plazmiddal és a nehézlánc gént tartalmazó plazmiddal.
(3) A könnyű- és nehézlánc géneket egyenként egy élesztő promotor és terminátor szekvenciához rögzítjük különböző plazmidokban, amelyek eltérő szelektív markereket tartalmaznak, amint ezt a fenti (2) részben leírtuk. Egy „a” párosodási típusú élesztő törzset, amely a könnyű- és nehézlánc kifejező plazmidokban található szelektív markerekben hiányos (a fenti példában ezek trpl és ura3) a könnyűlánc gént tartalmazó plazmiddal transzformálunk, a szelekciót a két szelektív marker egyikével végezve (a fenti példában ez trpl). Egy „alfa” párosodási típusú élesztő törzset, amely ugyanazokban a szelektív markerekben hiányos, mint az „a” törzs (azaz a fenti példa szerint trpl-ben és ura3-ban), transzformálunk egy plazmiddal, amely a nehézláncot tartalmazza, a szelekciót a másik szelektív markerrel végezve (a fenti példában tehát ura3-mal). A könnyűlánc plazmidot tartalmazó „a” törzs (fenotípus: Trp+ Ura* a fenti példában) (párosítjuk és diploidokat szelektálunk, amelyek protorofok mindkét fenti szelektív markéira (Trp+ Ura+ a fenti példában).
A bakteriális gazdaszervezetek közül, amelyeket transzformációs gazdaszervezetként alkalmazhatunk, az E. coli K12 294 törzs (ATCC 31446) különösen előnyös. Más előnyösen alkalmazható mikrobiológiai törzs, például az E. coli X1776 (ATCC 31537) törzs. A fentebb említett törzseken kívül alkalmazhatjuk az E. coli W3110 (ATCC 27 325) törzset és más Enterobacteriumokat is, pl. Salmonella typhimuriumot vagy Serratia marcescenst, és különböző Pseudomonas fajokat.
Ezekkel a gazdaszervezetekkel kapcsolatban általában olyan plazmid vektorokat alkalmazunk, amelyek a gazdasejttel összeférő fajból származó replikon - és szabályozó-szekvenciákat tartalmaznak. A vektor rendesen egy replikációs helyet hordoz, valamint olyan specifikus géneket, amelyek képesek fenotípusos szelekciót biztosítani a transzformált törzsekben. így pl. az E. coli könnyen transzformálódik pBR322-t alkalmazva; ez a plazmid egy E. coli fajból származik [Bolivár és munkatársai: Gene 2,95 (1977)]. ApBR322 ampicilin- és tetraciklin-rezisztencia géneket tartalmaz, és így könnyű eszközt nyújt transzformált sejtek azonosításához. A pBR322 plazmid és más mikrobiális eredetű plazmidoknak tartalmazniok kell promotorokat is, vagy módosítva kell legyenek, hogy promotorokat tartalmazzanak; amelyeket a mikroorganizmus saját fehérjéje kifejezéséhez alkalmazhat. A rekombináns DNS konstrukciókban a legáltalánosabban használt promotorok a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktáz (béta-galaktozidáz) promotor rendszerek [Chang és munkatársai: Natúré 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai: Science 198, 1056 (1977)] és a triptofán promotor rendszerek [Goeddel és munkatársai Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980); 0036776 számú európai szabadalmi közzétételi irat]. Bár ezek a leggyakrabban alkalmazott promotorok, más mikrobiológiai eredetű promotorokat is fedeztek fel és alkalmaztak.
így pl. bármilyen nehéz vagy könnyű kiméra immunglobulin lánchoz való genetikai konstrukciót a lambda bakteriofág (PL) bal oldali promotorának szabályozása alá lehet helyezni. Ez a promotor a legerősebb ismert promotorok egyike, amely szabályozható. A szabályozást a lambda represszorral végezzük, és a szomszédos restrikciós helyek ismertek.
Az immunglobulin lánc szekvencia kifejeződését más szabályozó szekvenciák szabályozása alá is helyezhetjük, amelyek az organizmusra nem transzformáit státusában „homológok” lehetnek. így pl. a laktóz-függő E. coli kromoszomális DNS egy laktóz vagy lac operont tartalmaz, amely laktóz emésztést közvetít a béta-galaktozidáz enzim kialakulása következtében. A lac szabályozó elemeket a lambda pLAC5 bakteriofágból kaphatjuk meg, amely E. colira fertőző. A lac promotor-operátor rendszert IPTG-vel indukubálhatjuk.
További promotor/operátor rendszereket vagy ezek részeit is alkalmazhatjuk. így pl. arabinózt, kolicin El-t, galaktózt, alkalikus foszfatázt, triptofánt, xilózt, tac-ot és hasonlókat alkalmazhatunk.
További előnyös gazdaszervezetek az emlős sejtek, amelyek szövettenyészetekben in vitro, vagy állatokban in vivő nőnek. Az emlős sejtek a transzláció utáni, immunglobulin fehérje molekulákká történő módosításokat biztosítanak, ilyenek a vezető peptid eltávolítása, az összekapcsolt nehéz- és könnyűlánc korrekt összehajtódása, megfelelő glikozilezés a korrekt helyeken, és a funkcionális antitest fehérje kiválasztása.
Antitest fehérjék termelésére gazdaszervezetként alkalmas emlős sejtek, a limfoid eredetű sejtek, pl. az Sp2/0-Agl4 hibridóma (ATCC CRL 1581), vagy a P3X63Ag8 mielóma (ATCC TIB 9), és ennek származékai. Ilyenek még a fíbroblaszt eredetű sejtek is, pl. a Verő (ATCC CRL 81) vagy a CHO-K1 (ATCC CRL 61) sejtek.
Klónozott nehézlánc és könnyűlánc gének emlős sejtekben való kifejezésére számos lehetséges vektorrendszer áll rendelkezésre. A vektorok egyik csoportja a kívánt génszekvenciákat a gazdasejt genomjába integrálja.
Azokat a sejteket, amelyekben stabilan integrált DNS található, úgy választhatjuk ki, hogy egyidejűleg gyógyszerrezisztencia géneket is vezetünk be; ilyenek pl. az E. coli gpt [Mulligan R. C. és Béig P.: Proc. Natl. Acad. Sci.
HU 209 154 Β
USA 78, 2072 (1981)] vagy Tn5 neo [Southern P. J. és Berg P.: J. Mól, Appl. Génét. 1,327 (1982)]. A szelektálható marker gént vagy a kifejezendő DNS génszekvenciákhoz kapcsoljuk, vagy együttes átfertőzéssel (ko-transzfekcióval) vezetjük be ugyanabba a sejtbe [Wigler M. és munkatársai: Cell 16,77 (1979)]. A vektorok egy másik csoportja olyan DNS elemeket hasznosít, amely autonóm replikálódási képességet ad át egy extrakromoszomális plazmidnak. Ezek a vektorok állati vírusokból származhatnak, pl. szarvasmarha papillóma vírusból [Sarver N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7147 (1982)], polióma vírusból [Deans R. J. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1292 (1984)], vagy az SV40 vírusból [Lusky M. és Botchan M.: Natúré 293,79 (1981)].
Mivel az immunglobulin cDNS csak olyan szekvenciákból áll, amelyek egy antitest fehérjét kódoló érett mRNS-t képviselnek, további, a gén átírását szabályozó és az RNS-t feldolgozó génkifejező elemek is szükségesek az immunglobulin mRNS szintéziséhez. Ilyenek az összeillesztő szignálok, transzkripciós promotorok, beleértve az indukálható promotorokat, fokozókat és terminációs szignálokat. Az ilyen elemeket tartalmazó cDNS kifejező vektorokat ismertetnek, például Okayama H. és Berg P.: Mól. Cell. Bioi. 3, 280 (1983); Cepko C. L. és munkatársai: Cell 37, 1053 (1984); és Kaufman R. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52,689(1989).
A gazdasejtként alkalmazott emlős sejteknek további előnye, hogy olyan kiméra immunglobulin géneket képesek kifejezni, amelyek genomiális szekvenciákból származnak. így az emlős sejtek olyan kiméra immunglobulin géneket fejezhetnek ki, amelyek variábilis régió cDNS modulból és egy olyan konstans régióból állnak, amely részben vagy teljesen a genomiális szekvenciákból tevődik össze. Számos humán konstans terület genomiális kiónt írtak le [Ellison J. W. és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 10, 4071 (1982); vagy Max E. és munkatársai: Cell 29, 691 (1982)]. Az ilyen genomiális szekvenciák alkalmazása előnyös lehet immunglobulin fokozóknak, összeillesztő szignáloknak és transzkripciós terminációs szignáloknak a konstans terület génszegmenssel együtt történő szimultán bevezetésére.
A teljes H2L2 antitesteket különböző módszerekkel állíthatjuk elő.
Először, külön kifejezhetjük a könnyű- és nehézláncokat, majd ezeket a tisztított könnyű- és nehézláncokat in vitro összeállíthatjuk komplett H2L2 IgG antitestekké. A komplett H2L2 IgG molekulák sejtekben való kialakításához alkalmazott összeállítási utakat kiterjedten tanulmányozták [lásd pl. Scharff M.: Harvey Lectures 69, 125 (1974)]. Az IgG antitestek redukált, izolált könnyű- és nehézláncokból való képződéséhez szolgáló in vitro reakcióparamétereket Beychok S. határozta meg [Cells of Immunglobulin Synthesis, Academic Press, New York, 69. oldal (1979)].
Másodszor eljárhatunk úgy is, hogy a könnyű- és nehézláncokat azonos sejtekben együtt fejezzük ki, így a nehéz- és könnyűláncok intracelluláris asszociációját és komplett H2L2 IgG antitestekké való összekapcsolását érjük el. Az együttes kifejezés történhet azonos vagy különböző plazmidok segítségével ugyanabban a gazdaszervezetben.
Polipeptid termékek
A találmány szerinti eljárással „kiméra” könnyű és nehéz immunglobulin láncokat állítunk elő. Egy kiméra lánc egy konstans régiót, amely lényegében hasonló ahhoz, amely egy természetes humán immunglobulinban jelen van, és egy variábilis régiót tartalmaz, amely a találmány szerinti kívánt antigén fajlagossággal, vagyis a nevezett humán tumor antigénre való fajlagossággal bír.
A találmány szerinti eljárással olyan immunglobulin molekulákat állítunk elő, amelyek könnyű- és nehézláncokat tartalmaznak úgy összekapcsolva, hogy az egyesített molekula minden kívánt kötési és felismerési tulajdonságot mutasson. Immunglobulin molekulák különböző típusait állítjuk elő: monovalens (egyértékű) molekulákat, kétértékű molekulákat kiméra nehézláncokkal és nem kiméra könnyűláncokkal, vagy a találmány szerinti kötő tartományokat tartalmazó molekulákat, amelyek a kívánt funkciókat hordozó maradékokhoz kötődnek.
Azonos vagy különböző variábilis régió kötő fajlagosságú kiméra nehézláncokat és nem kiméra (vagyis teljesen humán vagy teljesen nem humán) könnyűláncokat tartalmazó antitesteket állíthatunk elő a szükséges polipeptid láncok megfelelő egyesítésével. Ezeket a láncokat egyedenként készítjük el a találmány szerinti moduláris összeállítási eljárással.
Alkalmazások
A találmány szerinti eljárással előállított humán konstans régiót tartalmazó antitesteket passzív immunizáláshoz alkalmazhatjuk elsősorban embereknél, anélkül, hogy negatív immunreakciók, pl. szérumbetegség vagy anafilaxiás sokk lépne fel. Az antitesteket természetesen alkalmazhatjuk a technika állása szerinti immundiagnosztikus vizsgálatokhoz és készletekhez is kimutathatóan jelzett formában (pl. enzimek 125I, I4C, fluoreszcens jelzések stb.), immobilizált formában (polimer csöveken, gyöngyökön stb.), jelzett formában in vivő megjelenítésekhez, ahol a jelzés lehet radioaktív sugárzást kibocsátó vagy NMR kontraszt ágens, pl. szén-13 nukleusz, vagy röntgensugár kontraszt ágens, pl. nehézfém nukleusz. Az antitesteket megfelelő jelzéssel alkalmazhatjuk az antigén in vitro lokalizálásához is.
Az antitesteket alkalmazhatjuk terápiás célokra önmagában, komplement által közvetített lizátumban, vagy toxinokhoz vagy terápiás maradékokhoz, pl. ricinhez stb. kötve.
Kevert antitest-enzim molekulákat alkalmazhatunk immundiagnosztikus eljárásokhoz, pl. ELISA-hoz. Kevert antitest-peptid effektor konjugátumokat alkalmazhatunk az effektor gyök nagy hatékonysággal és fajlagossággal történő célzott szolgáltatásához.
Pontosabban a találmány szerinti eljárással elő9
HU 209 154 Β állított kiméra antitestek minden olyan esetben alkalmazhatók, ahol a rágcsáló L6 monoklonális antitestet fel lehet használni, azzal a nyilvánvaló előnnyel, hogy a kiméra antitestek összeférhetők az emberi testtel.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban néhány részletes példával mutatjuk be, a korlátozás szándéka nélkül.
Kísérleti rész
Anyagok és eljárások
Szövettenyésztő sejtvonalak
A GM2146 és GM1500 humán sejtvonalakat a Humán Mutant Cell Repository-tól (Camden, New Yersey) szerezzük be és RPMI 1640+10% borjúembrió szérum (M. A. Bioproducts) tápközegben tenyésztjük. Az Sp2/0 sejtvonalakat az American Type Culture Collection-tól szerezzük be és a Dulbecco által módosított Eagle-tápközegen (DMEM) tenyésztjük, amely tartalmaz még 4,5 g/1 glükózt (M. A. Bioproducts) és 10% borjúembrió-szérumot (Hyclone, Sterilé Systems, Logan, Utah). A tápközegeket penicillin/streptomicinnel egészítjük ki. (Irvine Scientific, Irvine, Kalifornia).
Rekombináns plazmid és bakteriofág DNS-ek
A pBR322, pLl és pUC12 plazmidokat a Pharmacia P-L Biochemicals-tól (Milwaukee, Wisconsin) vásároljuk. A pSV2neo és pSV2-gpt plazmidokat a BRL-től (Gaithersburg, Maryland) szerezzük be, ezek rendelkezésre állnak az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland) is. ApHu-gamma-1 a humán IgGl kromoszomális gén 8,3 kb-s HindlII-BamHI fragmentumának szubklónja. A humán IgGl kromoszomális gén izolálására szolgáló eljárást írnak le Ellison J. W. és munkatársai [Nucl. Acids. Rés. 10,4071 (1982)]. Az M8alfaR xl2 azt a 0,7 kb-s Xbal-EcoRI fragmentumot tartalmazza, amely az M603 kromoszomális gén J-C intron területéből származó egér nehézlánc fokozót tartalmazza [Davis M. és munkatársai. Natúré 283, 733 (1979)] M13mpl0-be beiktatva. A DNS manipulációkat, így a sűrűség-gradiens centrifugálást, restrikciós endonukleázos emésztést, a DNS fragmentumok tisztítását agaróz gélelektroforézissel, ligálást és E. coli transzformálását, Maniatis T. és munkatársai írják le [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)], de alkalmazhatunk más eljárásokat is. A restrikciós endonukleázokat és a többi DNS/RNS módosító enzimeket a Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana), BRL, New England Biolabs (Beverly, Massachussetts) és Pharmacia P-L cégektől szerezzük be.
Oligonukleotidok előállítása
Az oligonukleotidokat vagy a triészter eljárással szintetizáljuk [Ito és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 10, Π55 (1982)], vagy az ELESEN-től (Los Angeles, Kalifornia) vásároljuk. A tritilezett, védőcsoportoktól megszabadított oligonukleotidokat Sephadex-G250-en, majd fordított fázisú HPLC-vel 0-25% acetonitril gradienssel 10 mmól/1 trimetil-amin-ecetsavban (pH 7,2) C18 μ Bondapak oszlopon (Waters Associates) tisztítjuk. A detritilezést 80%-os ecetsavban 30 percig, majd három bepárlással végezzük. Az oligonukleotidokat [gamma-32P]ATPvel és T4 polinukleotid kinázzal kezeljük.
RNS előállítás és elemzés
Teljes celluláris RNS-t készítünk szövettenyészet sejtekből Auffray C. és Rougeon F. eljárásával [Eur. J. Biochem. 107, 303 (1980)] vagy Chirgwin J. M. és munkatársai eljárásával [Biochemistry 18, 5294 (1979)]. A poli(A)+ RNS előállítását, a metil-merkuri-agaróz gél elektroforézist, és a „Northern” átvitelt nitrocellulózra úgy végezzük, amint ezt Maniatis T. és munkatársai fentebb idézett munkájukban leírták. A teljes celluláris RNS-t vagy poli(A)+ RNS-t közvetlenül kötjük nitrocellulózhoz, az RNS-t először formaldehiddel kezelve [White B. A. és Bancroft F. C.: Bioi. Chem. 257,8569 (1982)]. A szűrőhöz kötött RNS hibridizálását nick-transzlatált DNS fragmentumokkal végezzük olyan körülményeket alkalmazva, amelyet Margulies D. H. és munkatársai írtak le [Natúré 295,168 (1982)], vagy 32P-jelzett oligonukleotidokkal végezzük 4xSSC-t, 10X Denhardt oldatot és 100 pg/ml lazac sperma DNS-t alkalmazva 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, amelyet 4xSSC-vel végzett mosás követ 37 °C hőmérsékleten.
cDNS előállítása és klónozás
Oligo-dT-vel beindított cDNS könyvtárakat állítunk elő GM1500 és GM2146 sejtekből származó poli (A)+ RNS-ből Land H. és munkatársai eljárása szerint [Nucl. Acids Rés. 9,2251 (1981)]. A cDNS könyvtárakat hibridizálással vizsgáljuk át (Maniatis T. és munkatársai, fentebb idézett munka) 32P jelzett oligonukleotidokkal, de Lángé és munkatársai munkamenetét alkalmazva [Cell 34, 891 (1983)], vagy nick-transzlatált DNS fragmentumokkal.
Oligonukleotid primer kiterjesztés és klónozás
Poli(A)+ RNS-t (20 pg) összekeverünk 1,2 g primerrel 40 pl 64 mmól/1 KCl-ben. 90 ’C hőmérsékleten végzett 5 perces denaturálás, majd jégen végzett lehűtés után 3 egység emberi méhlepény ribonukleáz inhibitort [Humán Placental Ribonuclease Inhibitor; BRL] adunk hozzá 3 pl 1 mól/l-es triszxHCl-ben (pH 8,3). Az oligonukleotidot az RNS-hez forrasztjuk 42 ’C hőmérsékleten 15 percen át, majd 12 pl keveréket adunk hozzá, amely 0,05 mól/1 DTT-t, 0,05 mól/1 MgCl2-t, és 1-1 mmól/1 dATP-t, dTTP-t, dCTP-t és dGTP-t tartalmaz. 2 pl alfa-32P dATP (400 Ci/mmól, New England Nuclear) adunk hozzá, majd ezt követően 3 pl AMV reverz transzkriptázt (19 egység/pl, Life Sciences).
’C hőmérsékleten 105 percen át végzett inkubálás után 2 pl 0,5 mól/1 EDTA-t, majd 50 pl 10 mmól/1 triszt és 1 mmól/1 EDTA-t (pH 7,6) tartalmazó oldatot adunk hozzá. A be nem épült nukleotidokat Sephadex G-50 oszlopkromatográfiával eltávolítjuk, és az RNSDNS hibridet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A második szál szintézisét, a homopolimer farokképzést dGTP-vel, vagy dCTP-vel, és a beiktatást a homopolimer farokkal ellátott vektorokba úgy végezzük, amint ezt Gubler és Hoffman fentebb idézett munkájukban leírják.
HU 209 154 Β
Helyre irányuló mutagenezls
Egyszálú M13 szubklón DNS-t (1 gg) egyesítünk 20 ng oligonukleotid primerrel 12,5 μΐ Hing pufferban [7 mmól/1 triszxHCl (pH 7,6), 7 mmól/1 MgCl2, 50 mmól/1 NaCl]. 95 °C hőmérsékletre melegítés után leforrasztott csőben, a prímért a templáthoz forrasztjuk lassan lehűtve 70 °C-ról 37 °C-ra 90 perc alatt. 2 μΐ dNTP-t (1-1 mmól/1 mindegyikből), 1 μΐ 32P-dATP-t (10 pCi), 1 μΐ DTT-t (0,1 mól/1) és 0,4 μΐ Klenow DNS polimeráz I-et (2 egység, Boehringer Mannheim) adunk hozzá és lánc-kiterjesztést végzünk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át. Ehhez 1 μΐ (10 ng) M13 reverz prímért adunk (New England Biolabs), és a melegítés/forrasztási és lánckiterjesztési lépéseket megismételjük. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/1 EDTA (pH 8), majd 80 μΐ 10 mmól/1 triszxHCl (pH 7,6), 1 mmól EDTA oldat hozzáadásával állítjuk le. A termékeket fenollal extraháljuk és Sephadex G-50 oszlopkromatográfiával tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk a restrikciós enzimes emésztés és a megfelelő vektorhoz való ligálás előtt.
Mielóma szövettenyészet sejtjeinek álfertőzése
Potter H. és munkatársai elektroporációs módszerét alkalmazzuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984)]. Átfertőzés után a sejteket hagyjuk helyreállni komplett DMEM-ben 48-72 órán át, majd átoltjuk 10000-50000 sejt/üreg mennyiségben 96 üreges tenyésztő lemezekre szelektív tápközegek jelenlétében. A G418 (GIBCO) szelekciót 0,8 mg/ml koncentrációnál, a miko fenolsav (Calbiochem) szelekciót 6 g/ml +0,25 mg/ml xantin koncentrációnál, és a HAT (Sigma) szelekciót standard koncentrációnál végezzük.
Vizsgálatok immunlobulin szintézisre és kiválasztásra
A kiválasztott immunglobulint közvetlenül szövettenyészet sejt felülúszókból mérjük. Citoplazma fehérjekivonatokat készítünk úgy, hogy 106 sejtet Vortex-berendezésen kezelünk 160 μΐ oldatban, amely 1% NP40-et, 0,15 mól/1 NaCl-t, 10 mmól/1 triszt, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz (pH 7,6), és a lizátumot 15 percig 0 °C hőmérsékleten tartjuk, ezt centrifugálás követi 10000 g-nél, hogy eltávolítsuk az oldhatatlan törmeléket.
Kettős antitest szendvics ELISA-t [Voller A. és munkatársai: a „Manual of Clinical Immunology”, c. szakkönyvben, 2. kiadás (szerkesztők: Rose N. és Friedman H.) 359-371 oldal (1980) használunk a fajlagos immunglobulinok kimutatására, ehhez affinitással tisztított antiszérumokat alkalmazunk. A humán IgG kimutatására a lemezhez kötött antiszérum kecske antihumán IgG (KPL, Gaithersburg, Maryland) 1/1000 hígításban, míg a peroxidázhoz kötött antiszérum kecske anti-humán IgG (KPL vagy Tago, Burlingame) 1/4000 hígításban. A humán kappa immunglobulin kimutatásához a lemezhez kötött antiszérum kecske anti-humán kappa (Tago) 1/500 hígításban, míg a peroxidázhoz kötött antiszérum kecske anti-humán kappa (Cappel) 1/1000 hígításban.
1. példa
Kiméra egér-humán immunglobulin rák antigén fajlagossággal (1) L6 antitest
Az L6 monoklonális antitestet (Mab) olyan egérből nyerjük, amelyet előzőleg humán tüdőkarcinómából származó sejtekkel immunizáltunk, miután a lépsejteket NS-1 egér mielóma sejtekkel hibridizáltuk. Az antitest egy korábban nem azonosított szénhidrát antigénhez kötődik, amely nagy mennyiségben fejeződik ki a legtöbb humán karcinómából származó sejt felületén, ide értve a tüdő karcinómákat (adenokarcinóma, pikkelyes karcinóma), mell karcinómákat, végbél karcinómákat és petefészek karcinómákat, míg az antigén csak nyomnyi szinten van jelen felnőtt gazdaszervezetekből származó normális sejtekben. Az L6 Mab Ig2a típusú, és antitest-függő celluláris citotoxicitást (ADCC) közvetíthet humán perifériás vér leukociták, mint effektor sejt források jelenlétében úgy, hogy lizálja az L6 pozitív tumor sejteket, továbbá lizálhatja az L6 pozitív tumor sejteket humán szérum mint komplement-forrás jelenlétében; a lizis úgy mutatható ki, mint 5lCr kibocsátás jelzett sejtekből egy 4 órás inkubációs periódus során. Az L6 MAb lokalizálódhat meztelen egerekre xeno-transzplantált L6 pozitív tumorokon, és gátolhatja az ilyen tumorok kinövését. Az L6 MAb-t az alábbi irodalmi helyek írják le: Cancer Rés. 46, 39173923 (1986) (MAb fajlagosságra) és Proc. Natl. Acad. Sci. 83,7059-7063 (1986) (MAb működésre).
(2) J szekvenciák azonosítása az L6 immunglobulin mRNS-ében
Fagyasztott M6 sejteket jégen 10 percig, majd szobahőmérsékleten felengedtetünk. A szuszpenziót 15 ml PBS-sel hígítjuk és a sejteket lecentrifugáljuk. Ezeket újra szuszpendáljuk PBS-sel végzett mosás után 16 ml 3 mól/1 LiCl-t és 6 mól/1 karbamidot tartalmazó oldatban, és összezúzzuk Polytron nyíróberendezéssel. Az mRNS előállítását és a poli(A+) frakció kiválasztását úgy hajtjuk végre, amint ezt Auffray C. és Rougeon F. leírták [Eur. J. Biochem. 107, 303 (1980)].
Az L6-ból származó poli(A+) RNS-t egyenként hibridizáljuk jelzett JH1, JH2, JH3 és JH4 oligonukleotidokkal olyan körülmények között, ahogyan ezt Nobrega és munkatársai leírják [Anal,. Biochem 131, 141 (1983)]. A terméket ezután elektroforézisnek vetjük alá 1,7%-os agaróz-TBE gélen. A gélt 10%-os TCA-ban fixáljuk, szárazra itatjuk és autoradiográfíához exponáljuk. Az eredmény az mutatja, hogy az L6 VH tartalmaz JH2 szekvenciákat.
A VK mRNS elemzéséhez White és Bancroft pontfolt („dotblot”) eljárását [J. Bioi. Chem. 257, 8569 (1982)] alkalmazzuk. Poli(A+) RNS-t immobilizálunk nitrocellulóz szűrőkön és jelzett vizsgáló minta-oligonukleotidokhoz hibridizáljuk 40 °C hőmérsékleten 4xSSC-ben. Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az L6 tartalmaz JK5 szekvenciákat. Gyenge hibridizálást figyelünk meg JK2-höz.
(3) V régió cDNS klánok
L6 poli(A+) RNS-en levő, oligo (dT)-vel beindított könyvtárat vizsgálunk át kappa kiónokra egér CK régió
HU 209 154 Β vizsgáló mintával. Az L6 könyvtárból számos kiónt izolálunk. Egy második átvizsgálás 5’ JK5 fajlagos vizsgáló mintával azonosítja az Ló (JK5) könnyűlánc kiónokat. Az L6 nehézlánc kiónjait a JH2 oligonukleotiddal végzett átvizsgálással izoláljuk.
A pH3-6a és pL-12a cDNS kiónokból származó nehéz- és könnyűlánc géneket vagy gén-fragmentumokat M13 bakteriofág vektorokba iktatjuk nukleotid szekvencia elemzés céljából. Ezen kiónok változó területe komplett nukleotid szekvenciáit (5. és 6. ábrák) didezoxi-lánc-terminációs eljárással határozzuk meg. Ezek a szekvenciák olyan V régió aminosav-összetételt sejtetnek, amely jól egyezik a megfigyelt összetételekkel, és olyan peptid szekvenciákat sejtetnek, amelyeket a V régiók részeinek közvetlen aminosav szekvencia elemzésével már igazoltak.
A cDNS kiónok nukleotid szekvenciái azt mutatják, hogy ezek immunglobulin V régió kiónok, mivel ezek V tartományra jellemző aminosavgyököket tartalmaznak [Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest; US Dept. of HSS (1983)].
Az L6 VH a II. alcsoporthoz tartozik. A cDNS egy 24 aminosavgyökös N-terminális szekvenciát valószínűsít, amely az ismert VH-val azonos [45-165 CRI; Margolies és munkatársai: Mól. Immunoi. 18, 1065 (1981)]. Az L6 VH a JH2 szekvenciával rendelkezik. Az L6 VL a VK-KpnI csoportba tartozik [Nishi és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6399 (1985)] és JK5-öt alkalmaz. A klónozott L6 VL olyan aminosavszekvenciát valószínűsít, amelyet az L6 könnyű láncból a 18-40 és 80-96 gyököknek megfelelő peptidek aminosavszekvencia elemzése bizonyít.
(4) In vitro mutagenezis restrikciós helyek bevezetésére a J területbe egy humán C-modullal való összekapcsoláshoz, valamint a V modulokhoz 5’irányban levő oligo (dC) szekvenciák eltávolítására.
Mind az L6 VK, mind az L6 VH kiónt, amelyek oligo (dT)-vel végzett beindítással alakulnak ki, módosítani kell. Az L6 VK-nál a 6. ábrán bemutatott JKHindIII J-terület mutagenezis prímért alkalmazzuk. Egy cDNS kiónból származó CK modult mutagenizálunk, hogy tartalmazza a HindlII szekvenciát (lásd a 4. ábrát). A mutegenezis reakciót ezeknek a géneknek az M13 szubklónjain végezzük. A mutáns kiónok gyakorisága a kapott tarfoltok 0,5-1% közti tartományában van.
Már korábban is megfigyeltük, hogy a VH kiméra génben az AUG kodontól fölfelé levő oligo (dC) szekvencia hatással van a megfelelő összeillesztésre egy adott génkonstrukcióban. Úgy becsüljük, hogy az RNS átiratoknak akár 70%-a is hibás illesztésben megy keresztül, ahol a vezető szekvenciában egy rejtett 3’ öszszeillesztés akceptort alkalmazunk. Ennek megfelelően a beindító AUG-tól fölfelé az oligo (dC) szekvenciát az összes kiónban eltávolítjuk.
Az egyik megközelítésben egy Sáli restrikciós helyet tartalmazó oligonukleotidot alkalmazunk az L6 VK klón mutagenizálására. Az ehhez az oligonukleotiddal irányított mutagenezishez alkalmazott primer egy 22mer, amely Sáli helyet vezet be az oligo (dC) és a beindító Met kodon közé (9. ábra).
Egy másik megközelítésben a BAL-31 nukleázt alkalmazzuk, hogy leszedjük az oligo (dC)-t a pH3-6a L6 VH kiónban. A kiiktatás méretét a kapott mutánsok közül kettőben nukleotid szekvenciaelemzéssel meghatározzuk, ezt a 7. ábrában mutatjuk be. Mindkét említett mutánsban (delta 4 és delta 21) a kódoló területtől 5’ irányban a teljes oligo (dC) el van távolítva.
Ezeket a kiónokat ezután oligonukleotiddal irányított mutagenezissel módosítjuk az MJH2-ApaI printerrel (7. ábra). Ez a 31 bázisos primer Apai helyet vezet be az egér CH génben annál a helynél, amely analóg a humán C gamma génhez tartozó megfelelő kodonokat vezet be. A kiméra nehézlánc gén, amely a mutagenizált egér VH gén modul és a humán CH modul egyesítésével készült, így olyan kiméra fehérjét kódol, amely nem tartalmaz humán aminosavakat a teljes VH régióban.
A humán C gamma 1 gén modul GM2146 sejtekből (Humán Genetic Mutánt Cell Repository, Newark, New Yersey) származó cDNS. Ezt a C gamma 1 gén modult előzőleg egyesítjük egy egér VH modullal, így alakítjuk ki a pING2012E plazmidot.
(5) L6 kiméra kifejező plazmidok
Az L6 kiméra nehézlánc kifejező plazmidok a pING2012E VH modulnak a delta 21 és delta 4 mutánsok VH muduljaival történő kicseréléséből származnak, így alakulnak ki a pING2111 és pING2112 plazmidok (7. ábra). Ezek a plazmidok irányítják a kiméra L6 nehézláncok szintézisét, amikor emlős sejtekbe fertőzzük át.
Az L6 könnyűlánc kiméra génhez az egér VK modul Sall-HindlII fragmentumát egyesítjük a humán CK modullal annak a munkamenetnek a segítségével, amelyet a 8. ábrában körvonalazunk, így kapjuk meg a pING2119et. A neo szekvencia helyettesítése a pSV2 gpt-ből származó E. coli gpt génnel a pING2120-at eredményezi, amely L6 kiméra könnyűláncot fejez ki és mikofenolsav rezisztenciát ad át, amikor emlős sejtekbe fertőzzük át.
Nehéz-, és a könnyűlánc kiméra gének jelenléte ugyanabban a plazmidban lehetővé teszi a könnyű- és nehézlánc gének 1:1 génarányú bevezetését az átfertőzött sejtekbe, ez pedig a kiegyensúlyozott génadagoláshoz vezet. Ez javíthatja a kifejeződést és csökkentheti az átfertőzött sejteknek az optimális kiméra antitest kifejeződéshez szükséges manipulációit. Ebből a célból a pING2111 és pING21l9 kiméra nehéz- és könnyűlánc génekből származó DNS fragmentumokat egyesítjük a pING2114 plazmidban (9. ábra). Ez a kifejező plazmid egy szelektálható neoR markert és az egyes kiméra génekhez külön-külön transzkripciós egységeket tartalmaz, amelyek mindegyike magában foglal egy egér nehézlánc fokozót.
Az L6 kiméra gének módosításait és V-C kapcsolási területeit a 10. ábrában foglaljuk össze.
(6) Egér limfoid sejtek stabil álfertőzése kiméra antites tek előállításához
Elektroporációt [Potter és munkatársai, fentebb idézett munka; Taneguzzo és munkatársai: Mól. Cell Bioi. 6, 703 (1986)] alkalmazunk az L6 kiméra kifejező plazmid DNS bevezetésére egér Sp2/0 sejtekbe. Az
HU 209 154 Β elektroporációs technika átfertőzési gyakorisága Sp2/0 sejtek esetén l-10xl0“5.
A két gént kifejező pING2114 kifejező plazmidot AatlI restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel linearizáljuk, és átfertőzzük Sp2/0 sejtekbe, így mintegy 50 G418 rezisztens kiónt kapunk, amelyeket humán könnyű- és nehézlánc szintézisre nézve átvizsgálunk.
A D7 és 3E3 termelő esetén a kiméra antitest-lánc szintézisének szintjét az 1. táblázatban mutatjuk be. Kiméra L6 antitestet készítünk a D7 átfertőzött sejtek tenyésztésével 24 órán át 2xl06 sejt/ml koncentrációban 5 1 DMEM-ben, amely HEPES pufferral, penicillinnel és sterptomicinnel van kiegészítve. A felülúszót Amicon YM30 membránon koncentráljuk 10 mmól/1 nátrium-foszfát pufferban (pH 8,0). A készítményt DEAE cellulóz oszlopra visszük, amely az immunglobulint kötött és nem kötött frakciókra választja szét. A DEAE-n nem kötött, DEAE-n kötött és DEAE előtti készítményekből származó mintákat (1,6 1 tápközegből) külön-külön tisztítjuk affinitás kromatográfiával „Α’’-fehérje-Sepharose oszlopon, és 0,1 mól/l-es nátrium-citrát oldattal eluáljuk. Az eluált antitestet semlegesítjük, és Amicon Centricon szűréssel koncentráljuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban. A három készítménynél a kitermelés 12 pg (DEAE-n nem kötött), 6 pg (DEAE-n kötött) és 9 pg (DEAE oszlop előtt). Az antitest láncok Western elemzése azt jelzi, hogy ezek H2L2 tetramerré vannak kombinálódva a natív immunglobulinokhoz hasonlóan.
(7) Szövettenyészetekben előállított kiméra L6 antitest tisztítása
a) Sp2/0xpING2114xD7 sejteket lxlO6 sejt/ml koncentrációig növesztünk tenyésztő tápközegben [DMEM (Gibco #320-1965)], amely 10% borjúembrió-szérummal (Hyclone #A~ 1111-D), 10 mmól/1 HEPES-sel, lx Glutamin-Penicillin-Sterptomicin-nel van kiegészítve.
b) A sejteket 400xg-val centrifugáljuk, és újra szuszpendáljuk szérummentes tenyésztő tápközegben 2xl06 sejt/ml koncentrációban 18-24 órán át.
c) A tápközeget 4000 fordulat/percnél centrifugáljuk J5-4,2 rotorban (3000xg) 15 percig.
d) 1,6 liter felülúszót átszűrünk 0,45 mikronos szűrőn, és YM30 (Amicon Corp.) szűrőn 25 ml-re koncentráljuk.
e) A koncentrált felülúszó vezetőképességét 5,7-5,6 mS/cm-re (CDM 80 radiométeren mérve) és a pH-t 8,0-ra állítjuk be.
f) A felülúszót 2000 g-nél centrifugáljuk 5 percen át, majd 40 ml-es DEAE oszlopra visszük, amelyet előzőleg 10 mmól/1 nátrium-foszfáttal (pH 8,0) egyensúlyoztunk ki.
g) Az átáramló frakciókat összegyűjtjük, és 1 ml-es „Α’’-fehérje Sepharose (Sigma) oszlopra visszük, amely előzőleg 10 mmól/1 nátrium-foszfáttal (pH 8,0) volt kiegyensúlyozva.
h) Az oszlopot először 6 ml 10 mmól/l-es nátriumfoszfát pufferral (pH 8,0), majd 8 ml 0,1 mól/l-es nátrium-citráttal (pH 3,5), majd 6 ml 0,1 mól/l-es citromsavval (pH 2,2) mossuk. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk olyan csövekbe, amelyek 5 pl 2 mól/l-es trisz bázist (Sigma) tartalmaznak.
i) Az IgG fő tömege a pH 3,5-ös eluátumban van, ezt összegyűjtjük és Centricon 30-on (Amicon Corp.) mintegy 0,06 ml-re koncentráljuk.
j) A puffért a Centricon 30-ban PBS-re cseréljük [10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,4), 0,15 mól/1 NaCl] PBS-sel végzett ismételt hígítással és újra koncentrálással.
k) Az IgG oldatot 0,10 ml-re állítjuk be és szarvasmarha szérum albumint (V frakció, U. S. Biochemicals) adunk hozzá 1,0%-ban stabilizálószerként.
(8) Kiméra L6 antitest termelése aszcitesz folyadékból és tisztítása
a) Az aszcitesz folyadékot először 2000xg-nél centrifugáljuk 10 percig.
b) A felülúszó vezetőképességét 5,7-5,6 mS/cm-re és pH-ját 8,0-ra állítjuk be.
c) A felülúszót ezután 40 ml DEAE-cellulóz oszlopra visszük, amelyet előzőleg 10 mmól/1 Na2HPO4gyel (pH 8,0) egyensúlyoztunk ki.
d) A DEAE oszlopon átmenő folyadékot összegyűjtjük és pH-ját 7,4-re állítjuk be, és 1,0 ml kecske anti-humán IgG (H + L) Sepharose oszlopra visszük.
e) Az oszlopot először 6 ml 10 mmól/l-es nátriumfoszfátot, 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldattal mossuk, majd 8 ml 0,5 mól/1 NH4OH-t és 3 mól/1 nátrium-tiocianátot tartalmazó oldattal mossuk.
f) A nátrium-tiocianátos eluátumot összegyűjtjük és dializáljuk 2L PBS-sel szemben egy éjszakán át.
Az antitestet tovább koncentrálhatjuk a korábban leírt munkamenet j. és k. lépéseivel.
/. táblázat
Sp2/0 transzfektánsok által kiválasztot L6 kiméra láncok szintjei3
Tenyésztési körűiményék Sp2/0xD7 Sp2/Ox3E3
FBS Kappa6 Gammac Kap- pab Gam- ma1·'
1.20 ml, 2d, beoltva 2xl05/ml-rel + 17 77 100 700
2.200 ml, 2d, beoltva 2xl05/ml-rel + 0,9 6 80 215
3.200 ml, ld, beoltva 2xl06/ml-rel - 1,9 3,8 57 221
4. Balb/c aszcitesz - 5160 19 170 ND ND
a - Sp2/0 sejtek, elektroporációval átfertőzve pING2114 (pL6HL)lel b” gg/l, humán kappára fajlagos ELISA-val mérve - humán Bence-Jones fehérje standard c - pg/l, humán gammára fajlagos ELISA-val mérve - humán IgG standard
ND - nem határoztuk meg
FBS - borjúembrió-szérum
HU 209 154 Β (9) Kiméra L6 antitesten végzett tanulmányok
Először a mintákat kötési vizsgálattal vizsgáljuk, amelyben egy L6 antigén pozitív és egy L6 antigén negatív sejtvonalat inkubálunk standard L6 egér monoklonális antitesttel, a sejttenyészet felülúszóból származó kiméra L6 antitesttel, és aszcitesz-folyadékból (amint fentebb leírtuk) származó kiméra L6 antitesttel, majd második reagensként humán (vagy a standardnál egér) immunglobulin elleni fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC)-konjugált kecske antitesttel.
Mivel a kötési vizsgálat a kiméra L6 erős reaktivitását mutatja L6 antigén pozitív sejtvonalon, és a reaktivitás teljes hiányát mutatja negatív sejtvonalon, a következő lépés az, hogy megvizsgáljuk a kiméra L6 olyan irányú képességét, hogy gátolja az egér L6 kötését antigén pozitív sejtekhez; az ilyen gátlási vizsgálatokat rutinszerűen alkalmazzák, hogy megállapítsák két antitest antigén-felismerésének azonosságát. Ezeket az adatokat később tárgyaljuk („A kötés gátlása”). Ezeknek a tanulmányoknak a részeként elvégezzük az antitest aviditásának durva becslését. Végül az antitest
Végül az antitest funkció két szempontját tanulmányozzuk: az ADCC közvetítésére valóképességet humán perifériás vér leukociták jelenlétében, és az L6 pozitív tumorsejtek elpusztítására valóképességet humán szérum mint komplement forrás jelenlétében (lásd később: „Működési vizsgálatok”).
Kötési vizsgálatok. Célsejtekként humán végbélkarcinóma 3347 sejtvonalból származó sejteket használunk, amelyekről előzőleg kimutattuk, hogy mintegy 5xlO5 molekula L6 antigént fejeznek ki a sejt felületén. Negatív kontrollként HSB2 T sejtvonalból származó sejteket alkalmazunk, mivel ezek korábbi vizsgálatok szerint nem fejeznek ki kimutatható mennyiségű L6 antigént. A célsejteket először 30 percig 4 °C hőmérsékleten vagy kiméra L6-tal, vagy egér L6 standarddal, amelyet előzőleg egér aszciteszből tisztítottunk, inkubáljuk. Ezután egy második, FITC-cel jelzett reagenssel inkubáljuk, amely a kiméra antitest esetén kecske anti-humán immunglobulin, amelyet a TAGOtól (Burlingame, Kalifornia) szerzünk be, és 1:50 hígításban alkalmazunk. Az egér standard esetén reagensként kecske anti-egér immunglobulint használunk, amelyet szintén a TAGO-nál szerzünk be és 1:50 hígításban alkalmazunk. Az antitest kötését a sejtek felületén Coulter Model EPIC-C sejtosztályozó berendezést alkalmazva határozzuk meg.
Amint a 2. táblázatban és a 2A) táblázatban bemutatjuk, mind a kiméra, mind a standard egér L6 szignifikánsan és mintegy azonos mértékben kötődik az L6 pozitív 3347 vonalhoz. Az L6 negatív HSB2 vonalhoz a háttér-értéket meghaladó mértékben nem kötődnek.
Azt a tényt figyelembe véve, hogy a három különböző, a 2. táblázatban bemutatott kiméra L6 minta hasonlóképpen viselkedik a kötési vizsgálatokban, ezeket az alább bemutatott gátlási vizsgálatokhoz egyesítjük. Ugyanolyan gátlási vizsgálatokat végzünk az aszcitesz folyadékból származó L6-nál is, ezt a 2A) táblázatban mutatjuk be.
A kötés gátlása. Következő lépésben azt vizsgáljuk, hogy a kiméra L6 antitest vagy a standard egér L6 növekvő adagjai milyen mértékben gátolhatják a FITC-cel jelzett egér L6 kötését az antigén pozitív 3347 végbélkarcinóma sejtek felületéhez.
Mind a kiméra, mind a standard egér L6 gátolja a közvetlenül jelzett L6 antitest kötését, és a kötési görbék párhuzamosak. A kiméra antitest valamivel kevésbé hatékony, mint a standard, ha tekintetbe vesszük, hogy 3,4 pg/ml összegyűjtött kiméra L6 MAb szükséges a kötés 50%-os gátlásához, míg a standard egér L6 MAb-ból ugyanakkor csak 2,0 pg/ml szükséges; és 5,5 pg/ml kiméra L6 (aszcitesz folyadékból származó) szükséges a kötés 50%-os gátlásához, míg a standard egér L6 MAb-ból ehhez csak 2,7 pg/ml szükséges.
Ezeknek a tanulmányoknak a részeként durva becslést végzünk az antitest aviditásával kapcsolatban. A standard egér L6 aviditását mintegy 4xl08-nak határoztuk meg. Az adatok azt jelzik, hogy nincs szignifikáns különbség az aviditásban a kiméra és egér L6 között.
Működési vizsgálatok. Összehasonlítjuk a kiméra L6 és standard egér L6 azon képességét, hogy milyen mértékben lizálják az L6 antigén pozitív sejteket humán perifériás vér leukociták mint effektor sejtek (közvetítve az ADCC-t, vagyis az antitest-függő celluláris citotoxicitást), illetve humán szérum mint komplement-forrás jelenlétében (közvetítve a CDC-t, vagyis a komplement-függő citolízist).
Amint a 3. táblázatban és a 3A)-3D) táblázatokban bemutatjuk, a kiméra L6 hatékonyabb az ADCC előidézésében, mint a párhuzamosan vizsgált egér L6 minta, amint ezt 4 órás 51Cr kibocsátási vizsgálat igazolja.
A 4. és 4A)-4B) táblázat a komplement által közvetített célsejt lízisre vonatkozó vizsgálatok adatait mutatja be. Ebben az esetben nagy citolitikus aktivitás figyelhető meg mind az egér, mind a kiméra L6 antitesteknél.
Következtetések
A fentebb bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított kiméra L6 monoklonális antitestek egy sor fontos, nem várt minőségi jellemzővel bírnak. Először is a kiméra L6 antitest mintegy azonos mértékben kötődik az L6 antigén pozitív tumorsejtekhez, mint az egér L6 standard, és mintegy azonos aviditással. Ez fontos az alábbi okokból: az L6 antitest (a) egy felületi szénhidrát antigént és (b) egy mintegy 20000 daltonos fehérje antigént határoz meg, amelyek mindegyike jellemző a nem kissejtes tüdőkarcinómára (NSCLC) és bizonyos más humán karcinómákra. Jelentős, hogy az L6 antitest nem kötődik kimutathatóan normális sejtekhez, pl. fibroblasztokhoz, hámsejtekhez, vagy a főbb szervekben levő felhámsejtekhez, így a kiméra L6 monoklonális antitest olyan antigént határoz meg, amely karcinóma sejtekre fajlagos, normális sejtekre pedig nem.
HU 209 154 Β
A találmány szerinti eljárással előállított kiméra monoklonális antitestek azon képességükön túl, hogy fajlagosan kötődnek rosszindulatú sejtekhez és lokalizálnak tumorokat, jelentős biológiai befolyást gyakorolnak célponthoz való kötődésre, így ezek a kiméra antitestek kiválóan alkalmazhatók a tumor immunterápiában. Az itt bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy a kiméra L6 képes tumorsejtek megkötésére és a kötéskor elpusztítja a tumorsejteket, akár az ADCC, akár a CDC révén. Ez a tumorölő aktivitás már 0,01 μg/ml (10 ng/ml) kiméra L6 antitest koncentrációnál is kimutatható.
Bár monoklonális antitestek alkalmazása esetén a tumor terápia kísérleti távlatai nagyon vonzóak, beszámoltak arról, hogy tumorok részlegesen visszatértek, és eddig a monoklonális antitest terápiával csak korlátozott sikereket értek el. [Houghton: Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1242-1246 (1985. február)]. Úgy tűnik, hogy az egér monoklonális antitestek (egyike azoknak, amelyeket eddig kipróbáltak) gyógyászati hatékonysága a legtöbb gyakorlati célra túl kicsi. A kiméra L6 kiemelkedő biológiai aktivitása, amely a karcinóma antigén elleni fajlagossággal együtt jelenik meg, lehetővé teszi, hogy a kiméra L6 antitestet tumorok in vivő kezelésében terápiás szerként alkalmazzuk. Sőt a „humán” tulajdonságok miatt, amely a kiméra L6 monoklonális antitestet ellenállóbbá teszi az in vivő kiürüléssel szemben, a kiméra L6 monoklonális antitestek előnyösen alkalmazhatók nem csupán a nem-módosított kiméra antitestekkel végzett terápiához, hanem különböző, gyógyszerekkel, toxinokkal, immunmodulátorokkal, izotópokkal stb., alkotott immunkonjugátumok kialakítására, valamint diagnosztikus célokra, pl. megfelelően jelzett kiméra L6 antitesteket alkalmazva tumorok in vivő megjelenítésére. Az ilyen immunkonjugációs módszerek szakember számára ismeretesek, és a találmány szerinti eljárással előállított kiméra L6 antitest molekulák módosítására alkalmazhatók.
Két, kiméra L6 antitestet kiválasztó törzset deponáltunk az amerikai egyesült államokbeli bejelentés dátuma előtt az ATCC-nél (Rockville, Maryland), ezek alkalmasak a találmány bemutatására. A két törzs: az átfertőzött C255 hibridóma (amely a fenti 3E3 sejteknek felel meg), ATCC HB 9240, és az átfertőzött C256 hibridóma (amely a fenti D7 sejteknek felel meg), ATCC HB 9241.
(10) L6 láncok kifejezése élesztőben
Kiméra L6 antitest nehéz- és könnyűláncokat kódoló genetikai szekvenciákat készítünk, és bevezetjük vektorokba. Élesztősejteket transzformálunk ezekkel, és az L6 antitesthez tartozó nehéz és könynyű antitest láncok kifejeződését külön-külön kimutatjuk.
A deponált sejtvonalakat alkalmazó kiviteli módot kizárólag csak a találmány szerinti eljárás bemutatása céljából adjuk meg, a korlátozás szándéka nélkül. A találmány szerinti eljárásban bármely olyan sejtvonal alkalmazható, amely ezekkel funkcionálisan ekvivalens, továbbá az eljárás módosítása is lehetséges.
2. táblázat
Kiméra L6 antitest és egér L6 monoklonális antitest kötési vizsgálatok L6 antigén pozitív és L6 antigén negatív sejvonalakhoz
Antitest Sorozat Kötési hányados* H3347 sejtekhez (L6 +)
GAM GAH
Standard L6 56,6 4,2
a 1,3 110,3
Kiméra L6 b 1,3 110,3
c 1,3 110,3
Kötési hányados* HSB-
2 sejtekhez
(L6-)
GAM GAH
Standard L6 1,1 1,1
a 1,0 1,0
Kiméra L6 b 1,0 1,1
c 1,0 1,1
* Az összes vizsgálatot 10 pg/ml antitest koncentrációnál végezzük. A kötési hányados azt a számot mutatja, hogy a vizsgált minta hányszor fényesebb, mint a csak GAM-mal (FITC-vel konjugált kecske-anti egér) vagy GAH-val (FITC-cel konjugált kecske-antihumán) kezelt kontroll minta. Az 1 érték azt jelenti, hogy a vizsgált minta éppen olyan fényes, mint a kontroll, a 2 érték azt jelenti, hogy a vizsgált minta kétszer olyan fényes, mint a kontroll stb.
2A) táblázat
Kiméra L6 antitest és egér L6 monoklonális antitest kötési vizsgálatok L6 antigén pozitív és L6 antigén negatív sejtvonalai
Antitest Antitest koncentrá- ció (pg/ml) Kötési hányados H3347 sejtekhez* (L6+)
GAM GAH
Standard L6 30 10 3 38 49 40 4 4 3
Kiméra L6 (aszcites) 30 10 3 2 2 1 108 108 42
Kiméra L6 (sejttenyészet) 30 10 3 1 1 1 105 86 44
Kötési hányados* HSB-2 sejtekhez (L6-)
GAM GAH
Standard L6 10 1 1
Kiméra L6 (aszcites) 10 1 1
Kiméra L6 (sejttenyészet) 10 1 1
* A kötési hányados azt a számot mutatja, hogy a vizsgált minta hányszor fényesebb, mint a csak GAM-mal (FITC-vel konjugált kecske anti-egér) kezelt kontroll minta. Az 1 érték azt jelenti, hogy a vizsgált minta éppen olyan fényes, mint a kontroll; a 2 érték azt jelenti, hogy a vizsgált minta kétszer olyan fényes, mint a kontroll stb......................
HU 209 154 Β
3. táblázat
Kiméra L6 és standard (egér) L6 antitestek ADCC-je 3347 végbél karcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis*
10 100 64
Kiméra L6 5 100 70
10 0 2
10 100 24
Standard L6 5 100 17
10 0 2
Semmi 0 100 1
* A célsejteket előzőleg 5lCr-rel jelezzük, majd 4 órán át MAb és humán perifériás vér leukociták (PBL) kombinációjának tesszük ki, ezt követően mérjük az 3lCr kibocsátást. Az 5lCr kibocsátás (a nem kezelt sejtekből spontán kibocsátott értékekkel végzett korrekció után) a százalékos citolízis mértékét mutatja.
3A) táblázat
Kiméra L6 és standard (egér) L6 antitestek ADCC-je 3347 végbél karcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis
20 100 80
10 100 74
Kiméra L6 (aszcites) 5 100 71
2,5 100 71
20 0 0
10 100 84
Kiméra L6 (sejtte- 5 100 74
nyészet) 2,5 100 67
10 0 3
20 100 32
Standard L6 10 100 26
20 0 0
* A célsejteket előzőleg 5lCr-rel jelezzük, majd 4 órán át MAb és humán perifériás vér leukociták (PBL) kombinációjának tesszük ki. Ezt követően mérjük az 3lCr kibocsátást. Az 3lCr kibocsátás (a nem kezelt sejtekből spontán kibocsátott értékekkel végzett korrekció után) a százalékos citolízis mértékét mutatja.
3B) táblázat
Kiméra L6 és standard (egér) L6 antitestek ADCC-je 3347 végbél karcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis
5 100 84
2,5 100 78
1,25 100 85
Kiméra L6 (aszcites) 0,63 0,31 100 100 81 80
0,16 100 71
0,08 100 65
5 0 0
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis
Standard L6 5 5 100 0 32 0
Semmi 0 100 19
* A célsejteket előzőleg 5lCr-rel jelezzük, majd 4 órán át MAb és humán perifériás vér leukociták (PBL) kombinációjának tesszük ki. Ezt követően mérjük az 3lCr kibocsátást. Az 3lCr kibocsátás (a nem kezelt sejtekből spontán kibocsátott értékekkel végzett korrekció után) a százalékos citolízis mértékét mutatja.
3C) táblázat
Kiméra L6 és standard (egér) L6 antitestek ADCC-je H2669 tüdőkarcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis*
Kiméra L6 (aszcites) 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 100 100 100 100 100 0 35 31 27 15 13 15
Standard L6 10 1 100 100 9 15
Semmi 0 100 9
Kiméra L6 (aszcites) 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 10 10 10 10 10 10 19 15 11 13 22 11
Standard L6 10 1 10 10 7 6
Semmi 0 10 8
Kiméra L6 (aszcites) 10 0 4
Standard L6 10 0 9
* A célsejteket előzőleg 3lCr-rel jelezzük, majd 4 órán át MAb és humán perifériás vér leukociták (PBL) kombinációjának tesszük ki. Ezt követően mérjük az 3lCr kibocsátást. Az 3lCr kibocsátás (a nem kezelt sejtekből spontán kibocsátott értékekkel végzett korrekció után) a százalékos citolízis mértékét mutatja.
3D) táblázat
Kiméra L6 és standard (egér) L6 antitestek ADCC-je 3347 végbélkarcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis
10 100 62
1 100 66
0,1 100 69
Kiméra L6 (aszcites) 0,01 100 26
0,001 100 8
0,0001 0 3
10 0 0
HU 209 154 Β
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) PBL célsejtenként % citolízis
Standard L6 10 1 100 100 0 19 24 0
Semmi 0 100 8
* A célsejteket előzőleg 5lCr-rel jelezzük, majd 4 órán át MAb és humán perifériás vér leukociták (PBL) kombinációjának tesszük ki. Ezt követően mérjük az 5lCr kibocsátást. Az slCr kibocsátás (a nem kezelt sejtekből spontán kibocsátott értékekkel végzett korrekció után) a százalékos citolízis mértékét mutatja.
4. táblázat
Kiméra és standard (egér) L6 antitestek komplement-függő citotoxikus hatása a 3347 vonalból származó végbélkarcinóma sejtekre, 4 órás 51Cr kibocsátási vizsgálattal mérve. Egészséges egyéntől vett humán szérumot alkalmazunk komplement-forrásként
Antitest Humán komplement % citolízis
L6 standard, lOpg/ml igen 90
Kiméra L6,10 pg/ml igen 89
L6 standard, 10 pg/ml nem 0
Kiméra L6, 10 pg/ml nem 1
4A) táblázat
Kiméra és standard (egér) L6 antitestek komplementfüggő citotoxikus hatása a 3347 végbél karcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) Humán komplement % citolízis*
20 + 29
10 + 23
Kiméra L6 (asztites) 5 2,5 + + 18 8
20 Inaktivált 0
10 0 0
20 + 29
Kiméra L6 (sejttenyészet) 5 2,5 20 + + + 26 18 4
10 0 4
20 + 55
Standard L6 10 + 37
20 Inaktivált 0
20 0 1
Semmi 0 + 0
* A komplement által közvetített citolízist 4 órás 5lCr kibocsátási vizsgálattal mérjük. Komplementforrásként egészséges egyéntől vett humán szérumot alkalmazunk.
4B) táblázat
Kiméra és standard (egér) L6 antitestek komplement-függő citotoxikus hatása a 3347 végbél karcinóma sejtvonalra
Antitest Antitest koncentráció (pg/ml) Humán komplement % citolízis*
10 + 209
5 + 155
2,5 + 166
Kiméra L6 1,25 + 114
(aszcites) 0,6 + 63
0,3 + 17
10 0 0
10 + 96
5 + 83
2,5 + 48
Standard L6 1,25 + 18
0,6 + 7
0,3 + 4
10 0 2
Semmi 0 + 0
* A komplement által közvetített citolízist 4 órás 31Cr kibocsátási vizsgálattal mérjük. Komplementforrásként egészséges egyéntől vett humán szérumot alkalmazunk.

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás L6 tumor antigénre fajlagos olyan kiméra antitest előállítására, amely humán konstans régiót és rágcsáló eredetű variábilis régiót tartalmaz, és amelynek az antigén kötőhelye kompetitív módon gátolja az ATCC HB8677 hibridóma által termelt monoklonális L6 antitest kötését, és amely kiméra antitest az ATCC HB8677 hibridóma által termelt monoklonális L6 antitest által közvetítettnél erősebb biológiai effektor funkciót közvetít emberben, azzal jellemezve, hogy pING2114 plazmidot tartalmazó emlős gazdasejtet, ahol a plazmid az L6 tumor antigénre fajlagos kiméra antitestet kódoló nukleotid-szekvenciát egy, a génkifejeződést szabályozó, második nukleotid-szekvencia szabályozása alatt tartalmazza, az L6 tumor antigénre fajlagos kiméra antitest kifejezését biztosító körülmények között tenyésztünk, majd a kiméra antitestet a tenyészetből kinyerjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként ATCC HB9240 vagy ATCC HB9241 számon letétbe helyezett SP 2/0 rágcsáló hibridómát alkalmazunk.
HU876038A 1986-10-27 1987-10-27 Process for producing chimeric antibody specific to human tumour antigene HU209154B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92324486A 1986-10-27 1986-10-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52153A HUT52153A (en) 1990-06-28
HU209154B true HU209154B (en) 1994-03-28

Family

ID=25448370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU876038A HU209154B (en) 1986-10-27 1987-10-27 Process for producing chimeric antibody specific to human tumour antigene

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5354847A (hu)
EP (1) EP0266663B1 (hu)
JP (1) JPH02501886A (hu)
AT (1) ATE117370T1 (hu)
AU (2) AU626254B2 (hu)
DE (1) DE3751004T2 (hu)
ES (1) ES2069527T3 (hu)
FI (1) FI891984A (hu)
GR (1) GR3015810T3 (hu)
HU (1) HU209154B (hu)
IE (1) IE62304B1 (hu)
IL (1) IL84285A (hu)
NZ (1) NZ222309A (hu)
OA (1) OA09115A (hu)
PT (1) PT85995B (hu)
WO (1) WO1988003145A1 (hu)
ZA (1) ZA878044B (hu)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
CA1341235C (en) * 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8720833D0 (en) * 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US6710169B2 (en) 1987-10-02 2004-03-23 Genentech, Inc. Adheson variants
US5336603A (en) * 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
ATE190355T1 (de) * 1988-09-06 2000-03-15 Xoma Corp Genexpressions-elemente und herstellung von chimären maus-mensch-antikörpern
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3900534A1 (de) * 1989-01-10 1990-07-12 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostischer nachweis unter verwendung von chimaeren antikoerpern
ES2082850T3 (es) * 1989-02-24 1996-04-01 Univ California Inmunoglobulinas preparadas geneticamente.
DE3909799A1 (de) * 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
US5580774A (en) * 1989-07-31 1996-12-03 Eli Lilly And Company Chimeric antibodies directed against a human glycoprotein antigen
US20050196400A1 (en) * 1991-05-06 2005-09-08 Xoma Technology Ltd. Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5635177A (en) 1992-01-22 1997-06-03 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
US5543499A (en) * 1993-10-29 1996-08-06 Wake Forest University DNA sequence encoding a polypeptide with anti-tumor properties
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5817768A (en) * 1995-06-07 1998-10-06 The New York Blood Center, Inc. Monospecific antibodies against a subunit of fibrinogen
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
PT966533E (pt) 1997-02-07 2010-01-26 Univ Ramot Factor neurotrófico iii dependente da actividade (adnf iii)
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
CA2462113C (en) 2001-10-01 2013-01-29 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
US7306919B1 (en) 2001-10-31 2007-12-11 Thornthwaite Jerry T Antigen-antibody cancer recognition system
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
AU2003240005B2 (en) * 2002-06-14 2010-08-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Recombination of nucleic acid library members
EP2436774A3 (en) 2002-08-01 2012-06-13 The Regents of The University of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US20040156846A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Triton Biosystems, Inc. Therapy via targeted delivery of nanoscale particles using L6 antibodies
AU2003901511A0 (en) * 2003-03-28 2003-04-17 Bionomics Limited Nucleic acid molecules associated with angiogenesis II
US20110064730A1 (en) * 2003-03-28 2011-03-17 Thomas John Gonda Method of modulating angiogenesis
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20070160994A1 (en) * 2003-12-15 2007-07-12 Institut Pasteur Repertoire determination of a lymphocyte b population
ATE421998T1 (de) * 2003-12-15 2009-02-15 Pasteur Institut Ermittlung des repertoires von b-lymphozyten populationen
EP1776384B1 (en) 2004-08-04 2013-06-05 Mentrik Biotech, LLC Variant fc regions
HUE033196T2 (hu) 2005-01-27 2017-11-28 Children's Hospital & Res Center At Oakland GNA1870-alapú vezikulum vakcinák Neisseria meningitidis által okozott betegségek elleni szélesspektrumú védekezéshez
CA2594297A1 (en) 2005-01-27 2006-07-27 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
DK1866339T3 (da) 2005-03-25 2013-09-02 Gitr Inc GTR-bindende molekyler og anvendelser heraf
ATE485057T1 (de) * 2005-05-26 2010-11-15 Seattle Genetics Inc Humanisierte antikörper gegen cd40 und verfahren zu ihrer anwendung
US8901281B2 (en) 2005-06-17 2014-12-02 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 binding molecules and uses therefor
EP2041180B8 (en) 2006-06-19 2014-03-05 Liquidating Trust Ilt3 binding molecules and uses therefor
US20080213170A1 (en) * 2007-01-23 2008-09-04 Young David S F Cancerous Disease Modifying Antibodies
US8003761B2 (en) * 2007-01-23 2011-08-23 Hoffmann-La Roche Inc. Cancerous disease modifying antibodies
CN101801413A (zh) 2007-07-12 2010-08-11 托勒克斯股份有限公司 采用gitr结合分子的联合疗法
CA2699394C (en) 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
US8293101B2 (en) 2009-03-13 2012-10-23 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
WO2012006635A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
JP5978212B2 (ja) 2010-08-24 2016-08-24 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｉｖコアタンパク質に特異的な抗体及びその使用
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013106577A2 (en) 2012-01-10 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
EP2931293B1 (en) 2012-12-12 2019-02-20 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating erythropoiesis
WO2015053523A1 (ko) * 2013-10-07 2015-04-16 한화케미칼 주식회사 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
PT3383920T (pt) 2015-11-30 2024-04-15 Univ California Entrega de carga útil específica para tumores e ativação imune utilizando um anticorpo humano que tem como alvo um antigénio altamente específico da superfície das células tumorais
US10995126B2 (en) 2016-05-04 2021-05-04 National Health Research Institutes Immunogenic peptide containing a b cell epitope of tumor associated antigen L6
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
US12049511B2 (en) 2016-11-10 2024-07-30 Fortis Therapeutics, Inc. Engineered CD46-specific effector cells and uses thereof in the treatment of cancer
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
EP3655031A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neisseria meningitidis immunogenic compositions
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2019099374A2 (en) 2017-11-14 2019-05-23 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for making and using bispecific antibodies
CN116419747A (zh) 2020-08-07 2023-07-11 福蒂斯治疗公司 靶向cd46的免疫偶联物及其使用方法
US12030888B2 (en) 2021-02-24 2024-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4468464A (en) * 1974-11-04 1984-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biologically functional molecular chimeras
US4486538A (en) * 1978-07-07 1984-12-04 Samuel Bogoch Detection of malignant tumor cells
US4650756A (en) * 1981-08-31 1987-03-17 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to cell surface antigens of human renal cancer
US4476538A (en) * 1982-02-01 1984-10-09 Analog Devices, Inc. Trigonometric function generator
AU573529B2 (en) * 1982-05-12 1988-06-16 President And Fellows Of Harvard College Hybrid proteins
US4708862A (en) * 1983-02-22 1987-11-24 Xoma Corporation Radioimmuno detection of human cancers using anti-tumor monoclonal antibody
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4550756A (en) * 1984-01-16 1985-11-05 The Goodyear Tire & Rubber Company Pneumatic tire tread
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) * 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) * 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4906562A (en) * 1984-12-21 1990-03-06 Oncogen Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas
US4770993A (en) * 1985-10-31 1988-09-13 Beatrice Companies, Inc. Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to thaumatin
AU606320B2 (en) * 1985-11-01 1991-02-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5091178A (en) * 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
PT85995A (en) 1987-11-01
OA09115A (en) 1991-10-31
IL84285A0 (en) 1988-03-31
AU2810592A (en) 1993-01-28
IE872880L (en) 1988-04-27
PT85995B (pt) 1990-08-31
ATE117370T1 (de) 1995-02-15
IE62304B1 (en) 1995-01-25
EP0266663A1 (en) 1988-05-11
FI891984A0 (fi) 1989-04-26
EP0266663B1 (en) 1995-01-18
DE3751004T2 (de) 1995-05-24
US5354847A (en) 1994-10-11
ZA878044B (en) 1988-04-25
AU626254B2 (en) 1992-07-30
WO1988003145A1 (en) 1988-05-05
AU8326187A (en) 1988-05-25
HUT52153A (en) 1990-06-28
ES2069527T3 (es) 1995-05-16
FI891984A (fi) 1989-04-26
GR3015810T3 (en) 1995-07-31
IL84285A (en) 1993-03-15
DE3751004D1 (de) 1995-03-02
JPH02501886A (ja) 1990-06-28
AU656633B2 (en) 1995-02-09
NZ222309A (en) 1990-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU209154B (en) Process for producing chimeric antibody specific to human tumour antigene
US5500362A (en) Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US6893625B1 (en) Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
EP0247091B1 (en) Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0550400B1 (en) Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0457875A1 (en) Chimeric mouse-human a10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen
EP0404003A2 (en) Chimeric mouse-human KM10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen
AU606653C (en) Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
EP0536566A1 (en) Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee