PT85995B - Processo para a preparacao de um anticorpo quimerico com especificidade para antigenio de tumor humano - Google Patents

Description

Campo do invento

Este invento está relacionado com má todos de DNA recombinante para a preparação de um anticorpo com especificidade para antigénio de tumor humano, sequências genéticas que o codificam assim como métodos de obtenção de tais sequências.

Trabalhos anteriores

A aplicação da fusão de células para a produção de anticorpos monoclonais por Kohler e Milstein (Nature (London), 256: 495, 1975) produziu uma revolução em biologia igual ao impacto do invento da clonagem de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais produzidos a partir de hibridomas são já largamente usados em estudos básicos científicos e clínicos. As aplicações dos anticorpos monoclonais produzidos por hibridomas de células B humanas oferecem grandes hipóteses de tratamento de cancro, infecções virais e microbianas, imunodeficiências de células B com produção de anticorpos diminuída e outras doenças e perturbações do sistema imune.

Infelizmente, existem uma série de obstáculos em relação ao desenvolvimento de anticorpos mono clonais humanos. Isto é especialmente verdade quando se tenta desenvolver anticorpos monoclonais que definam antigénios de tumor humano para o diagnóstico e tratamento do cancro. Muitos destes antigênios de tumor não são reconhecidos como antigênios estranhos pelo sistema imune humano, portanto estes antigênios podem não ser imunogénicos no hoAo contrário, os antigénios de tumor humano que são imunogénicos em murganhos podem ser usados para a produção de anticorpos monoclonais de murganho que reconhecem especificamente o antigênio humano e que podem ser usados terapeuticamente em humanos. Noentanto, injecções repetidas de anticorpos estranhos, como seja um anticorpo de murganho, em humanos, pode conduzir a reacções de hipersensibilidade graves assim como a uma taxa aumentada de desaparecimento das moléculas de anticorpo circulante de tal forma que os anticorpos não atingem o seu local alvo.

Um outro problema enfrentado pelos imunologistas é que a maior parte dos anticorpos monoclonais humanos obtidos em cultura celular são do tipo IgM. No entanto, quando se pretende obter monoclonais humanos do tipo IgG, tem sido necessário usar técnicas tais como classifica ção de células, para identificar e isolar as poucas células que produzem anticorpos do tipo IgG ou de outro tipo de entre a maioria produtora de anticorpos do tipo IgM. Existe, portanto, a necessidade de um método eficaz para alteração das classes de anticorpos, para qualquer anticorpo determinado com uma especificidade antigénica predeterminada ou pretendida.

O presente invento liga as tecnologi_ as dos hibridomas e da engenharia genética para proporcionar um método rápido e eficaz, assim como produtos dele derivados, para a produção de um anticorpo quimérico humano/ /não humano.

Os anticorpos quiméricos do presente invento possuem uma combinação das caracteristicas vantajosas dos anticorpos monoclonais derivados de hibridomas de ratinho-ratinho e dos anticorpos monoclonais humanos.

-4Os anticorpos monoclonais quiméricos, tal como os anticorpos monoclonais de ratinho, podem reconhe cer e ligar um antigênio alvo humano, ao contrário dos ant_i corpos monoclonais de ratinho, as propriedades específicas da espécie dos anticorpos quiméricos evitarão a indução de reacções de hipersensibilidade prejudiciais e darão origem a uma resistência ao desaparecimento de circulação quando usados em humano in vivo. Ainda usando os métodos divulgados no presente invento qualquer isotipo de anticorpo pretendido pode ser conferido quando de um local particular de combinação com antigênio.

Relato sobre a divulgação de informações

Vários autores publicaram abordagens ao problema da produção de anticorpos guiméricos.

Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 81: 6851-6855 (Noveihbro 1984), descreve a produção de uma molécula de anticorpo ratinho-humana de especificidade de ligação a antigênio definida, produziJ da pela ligação de genes da região variável de uma linha ce lular de mieloma produtora de anticorpos de ratinho, com especificidade de ligação a antigénios conhecida, dos genes da região constante da imunoglobulina humana usando técnicas de DNA recombinante. Construiram-se genes quiméricos, em que o exão da região variável da cadeia pesada da linha

Nota: O presente Relato sobre a divulgação de informações está sujeita às condições de 37 C.F.R. l,97(b). Ainda, os Requerentes possuem o direito de demonstrar que o seu inven to foi feito antes de qualquer uma das publicações referidas.

celular de mieloma S107 bem ligados aos exões da região constante da cadeia pesada de IgGl ou IgG2 humana e o exão da região variável da cadeia leve do mesmo mieloma ao exão da cadeia leve Kapa humana. Estes genes foram transfectados para linhas celulares de mieloma de ratinho. As células transformadas produtoras de anticorpos quiméricos ratinho-humanos antifosfocolina foram assim desenvolvidos.

Morrison, S.L. et al., Pedido de Patente Europeia N9 173494 (publicado em 5 de Março, 1986) descrevem receptores quiméricos (erg. anticorpos) tendo regiões variáveis derivadas de uma espécie e regiões constantes derivadas de uma outra. E referida a utilização da clonagem de cDNA para construir os genes, se bem que não sejam mostrados detalhes da clonagem e iniciação de cDNA (ver pp 5, 7 e 8).

Boulianne, G. L. et al., Nature, 312: 643 (13 de Dezembro, 1984), tam bém produziu anticorpos consistindo em regiões variáveis de ratinho ligadas a regiões constantes humanas. Construiram-se genes de imunoglobulina em que os segmentos de DNA codificadores das regiões variáveis de ratinho específicas para o hapteno trinitrofenilo (TNP) foram ligadas a segmentos codificadores das regiões constantes humanas mu e kappa. Estes genes quiméricos foram expressos como IgM quimérica funcional de ligação ao TNP.

Para comentários acerca do trabalho de Boulianne et al., e Morrison et al., ver Munro, Nature, 312: 597 (13 de Dezembro, 1984), Dickson, Genetic Engineering News, 5_, NQ 3 (Março, 1985), ou Marx, Science, 229: 455 (Agosto de 1985).

-6Neuberger, M.S. et al., Nature, 314: 268 (25 de Março de 1985), também construíram um gene quimérico de cadeia pesada de imunoglobulina em que um segmento de DNA codificador de uma região variável de ratinho específica para o hapteno l-hidroxi-3-nitrofenacetilo (NP) foi ligada a um segmento codificador da região epsilon huma na. Quando este gene quimérico foi transfectado para a lin ha celular J558L, produziu-se um anticorpo que se ligou ao hapteno NP e que tinha propriedades de IgE humana.

Neuberger, M.S. et al.,'também publicaram trabalho mostrando a preparação de linhas celulares que secretam anticorpos específicos de hapteno em que a por ção Fc foi substituída por uma porção de enzima activa (Williams, G. e Neuberger, M.S. Gene 43: 319, 1986) ou com um polipeptídeo apresentando determinantes antigénicos c-myc (Nature, 312: 604, 1984).

Neuberger, M. et al., Publicação PCT WO 86/01533, (publicado em 13 de Março, 1986) também descr£ vem a produção de anticorpos quiméricos (ver p.5) e sugerem, entre as técnicas, o uso do conceito de mudança de classe (ver pág. 6).

Taniguchi, M., no Pedido de Patente Europeia N2 171 496 (publicado em 19 de Fevereiro, 1985) descreve a produção de anticorpos quiméricos tendo regiões variáveis com especificidade para tumores derivados de animais experimentais e regiões constantes derivadas de humano. Os genes das cadeias pesada e leve correspondentes são produzidos na forma genónica e expressos em células de mamífero.

Takeda, S et al., Nature, 314: (4 de Abril, 1985) descreveram um método potencial para a constru ção de genes quiméricos de imunoglobulina que têm removidas as sequências de intrão através do uso de um vector retrovírus. No entanto, um local dador de splicing inesperado provocou a delecção da sequência condutora da região V. Deste modo, esta abordagem não deu moléculas completas de anticorpos quiméricos.

Cabilly, S et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 81: 3273-3277 (Junho de 1984), descreve plasmídeos que dirigem a síntese em E. coli de cadeias pesadas e/ou ca deias leves de anticorpos anti antigénios carcinoembrionários (CEA). Construiu-se um outro plasmídeo para a expressão de uma forma truncada do fragmento da cadeia pesada (Fd') em E.coli. Obteve-se actividade funcional de ligação a CEA por reconstituição in vitro, em extractos de E_. coli, de uma porção da cadeia pesada com cadeia leve.

Cabilly S. et al., Pedido de Patente Europeia 125023 (publicado a 14 de Novembro de 1984) descre ve genes de imunoglobulinas quiméricas e seus presumíveis produtos assim como outras formas modificadas. Nas páginas 21, 28 e 33 é discutida a clonagem e iniciação de cDNA.

Boss, M.A., Pedido de Patente Europeia 120694 (publicado a 3 de Outubro de 1984) descreve a expressão em E. coli de cadeias de imunoglobulina não quim£ ricas com especificidade para 4-nitrofenilo. Existe uma larga descrição de anticorpos quiméricos mas sem detalhes (ver pág. 9).

Wood, C. R. et al., Nature, 314: 446 (Abril de 1985) descreve plasmídeos que dirigem a síntese de proteínas de anticorpos de ratinho anti-NP em levedura. As proteínas da cadeia pesada num dos anticorpos parecem ser glicosiladas nas células de levedura. Quando se sintetizaram as cadeias leve e pesada na mesma célula, alguma proteína originou moléculas de anti-corpos funcionais, conforme detectado pela actividade de ligação anti-NP em proteína solúvel preparada a partir de células de levedura.

Alexander, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 3260-3264 (1982), descreve a preparação de uma sequência de cDNA codificadora de uma cadeia pesada de Ig gama humana anormalmente pequena (proteína do soro HCD OMM gama ) contendo uma sequência condutora de 19 aminoácidos seguido dos primeiros 15 resíduos da região V. Uma extensa delecção interna remove o restante da cadeia V e todo o domínio C_ul. Isto é cDNA codificador de uma molécuia com delecção interna.

Dolby, T, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 77: 6027-6031 (1980), descreve a preparação de uma sequência de cDNA e plasmídeos recombinantes contendo a mesma codificando os polipeptídeos mu e kappa da imunoglobu lina humana. Uma das moléculas de DNA recombinante continha codões para parte do domínio da região constante CH^ e toda a sequência 3' não codificadora.

Seno, M. et al., Nucleic Acids Resear ch, 11,: 719-726 (1983), descreve a preparação de uma sequên cia de cDNA e de plasmídeos recombinantes contendo a mesma codificando parte da região variável e toda a região constante da cadeia pesada da IgE humana (cadeia epsilon).

KuroKawa, T. et al., ibid, 11,: 3077-3085 (1983), mostram a construção, usando cDNA, de três plasmídeos de expressão codificadores da porção constante da cadeia pesada da IgE humana.

Liu, F. T. et al.,.. Proc. Natl. Acad, Sei, USA, 81,: 5369-5373 (Setembro de 1984), descreve a pr£ paração de uma sequência de cDNA e plasmídeos recombinantes contendo a mesma codificando cerca de dois terços da CH₂ e todos os domínios C„3 e C„4 da cadeia pesada da IgE humana, ri ri

Tsujimoto, Y et al., Nucleic Acids

Res., 12: 8407-8414 (Novembro de 1984), descreve a preparação de uma sequência de cDNA de lambda V humana a partir de uma linha celular de linfoma de Burkitt humana produtora de Ig lambda, tirando partido de um gene clonado da região constante como iniciador para a síntese de cDNA.

Murphy, J. , Publicação PCT WO 83/03971 (publicada em 24 de Novembro de 1983) descreve proteínas hí bridas feitas a partir de fragmentos compreendendo uma tox£ na e um ligando específico para células (que sugerido como sendo possivelmente um anticorpo).

Tan, et al., J. Immunol. 135 : 8564 (Novembro de 1985), obteve a expressão de um gene genómico de imunoglobulina quimérica humana-ratinho após transfecção para células de mieloma de ratinho.

Jones, Ρ. T., et al., Nature 321: 552 (Maio de 1986) construiu e expressou uma construção genómica em que os domínios CDR das regiões variáveis de um anticorpo monoclonal de ratinho foram usados para substituir os correspondentes domínios num anticorpo humano.

• «

Sun, L.K. , et al., Hybridoma 5 suppl.1 S17 (1986) descreve um anticorpo quimérico humano/ratinho com potencial especificidade para tumores. Os genes quimé ricos das cadeias pesada e leve são construções genómicas e expressas em células de mamífero.

Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066 -1074 (Agosto de 1986) descreve um anticorpo quimérico com especificidade para um antigênio associado a tumores humanos, os genes do qual são montados a partir de sequências genéticas.

Para uma revisão recente do campo ver também Morrison, S.L., Science 229: 1202-1207 (20 de Setembro de 1985) e Oi, V. T. et al., BioTechniques 4: 214 (1986).

A publicação de Oi et al., é relevan te uma vez que defende a produção de anticorpos quiméricos a partir de construções de cDNA em levedura e/ou bactéria não é necessariamente vantajosa.

Ver também Comentário na página 835 em Biotechnology £ (1986).

Sumário do Invento

O invento proporciona um anticorpo quimérico obtido por engenharia genética com as caracterís ticas pretendidas de especificidade da região variável e da região constante, através da clonagem de genes e expressão das cadeias leve e pesada. Os produtos dos genes clonados

I das imunoglobulinas podem ser produzidos através da expre£ são em células manipuladas por engenharia genética.

A aplicação da síntese de oligodeso xinucleotídeos, clonagem de DNA recombinante e produção de cadeias específicas de imunoglobulina em várias células procarióticas e eucariotas proporciona um meio para a produção em larga escala de um anticorpo monoclonal quimérico humano/ratinho com especificidade para um antigénio de tumor humano.

invento proporciona sequências de cDNA codificadoras de cadeias de imunoglobulina compreenden do uma região constante human e uma região variável não hu mana. As cadeias de imunoglobulina podem ser leves ou pesadas .

invento proporciona sequências ge. néticas codificadorasde cadeias de imunoglobulina compreendendo uma região variável de cDNA da especificidade pretendida. Estas podem ser combinadas com regiões constantes genómicas de origem humana.

invento proporciona sequências co mo as descritas, presentes em moléculas de DNA recombinante em veículos tais como vectores plasmídeos, capazes de expressão em hospedeiros procarióticos ou eucarióticos pre tendidos.

invento proporciona hospedeiros capazes de produzirem por cultura, os anticorpos quiméricos e métodos de utilização destes hospedeiros.

invento também proporciona cadeias individuais de imunoglobulinas quiméricas individuais, assim como moléculas montadas completas tendo regiões constantes humanas e regiões variáveis com uma especificidade para antigénios de tumores humanos, em que ambas as regiões variáveis têm a mesma especificidade de ligação.

Entre as várias cadeias de imunoglobulina e/ou moléculas proporcionadas pelo invento estão:

(a) uma molécula de imunoglobulina completa e funcio nal compreendendo:

(i) duas cadeias pesadas guiméricas idênticas compreendendo uma região variável com uma es. pecificidade para antigênios de tumores huma nos e região constante humana, e (ii) duas cadeias leves todas humanas (i.e. não quiméricas) idênticas.

(b) uma molécula de imunoglobulina, completa e funcio nal, compreendendo:

(i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas compreendendo uma região variável como indica do e uma região constante humana e (ii) duas cadeias leves não humanas (i.e. não qui. méricas) idênticas.

(c) um anticorpo monovalente, i.e., uma molécula de imunoglobulina completa e funcional compreendendo:

(i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas compreendendo uma região variável como indicado e uma região constante humana e (ii) duas cadeias leves diferentes, apenas uma das quais tem a mesma especificidade da região variável das cadeias pesadas. A molécula de anticorpo resultante liga-se apenas a um extremo e é portanto incapaz de ligação bivalente.

Também são aqui proporcionadas sequên cias genéticas, especialmente sequências de cDNA, codificadoras das combinações referidas de cadeias quiméricas ou de cadeias não quiméricas.

invento também proporciona uma sequência genética, especialmente uma sequência de cDNA, cod£ ficadora da região variável de especificidade pretendida de uma cadeia leve e/ou pesada de uma molécula de anticorpo, operacionalmente ligada a uma sequência codificadora de um polipeptídeo diferente da cadeia de imunoglobulina (e.g. uma enzima). Estas sequências podem ser montadas pelos métodos do invento e expressas para dar moléculas com funções mistas.

uso de sequências de cDNA é particularmente vantajoso relativamente às sequências genómicas (as quais contêm intrões) devido às saquências de cDNA poderem ser expressas em bactérias ou outros hospedeiros que não possuam sistemas splicing de RNA adequados.

Breve descrição das Figuras

A FIGURA 1 mostra os rearranjos de DNA e a expressão dos genes das cadeias pesadas mu e gama de imunoglobulina. Esta é uma representação esquemática do complexo de genes da cadeia pesada humana, não mostrada à escala. A formação da região variável V da cadeia pesada ocorre através da união adequada dos segmentos de genes , D e J„. Isto origina um gene mu activo. Um tipo diferente de rearranjo de DNA designado mudança de classe transfere a região de V_u, D e J„ ligadas da vizinhança da região cons π ti — tante C de cadeia pesada (mudança para gama está aqui esque matizado).

A FIGURA 2 mostra as sequências de nucleotídeos conhecidos das regiões J humana e de ratinho. As sequências consensus para as regiões J estão apresentadas por debaixo das sequências reais. A sequência oilgonucleotídica debaixo da sequência consensus da região J de kapa de ratinho é um oligonucleotídeo Universal dos Genes das Imunoglobulinas (UIG). Note-se que existem apenas algumas regiões J com sequências relativamente conservadas, especialmente perto das regiões constantes, em cada locus do gene da imunoglobulina.

A FIGURA 3 mostra as sequências de nu cleotídeos das regiões J de ratinho. Estão apresentados por baixo os oligonucleotídeos iniciadores UIG-H e UIG-K. Note-se que cada um contem um local de enzima de restrição. Eles podem ser usados como iniciadores para a síntese de cDNA complementar da região variável do mRNA e podem também ser usados para mutagenizar, in vitro, cDNA clonado.

FIGURA 4 Módulo do domínio constante humano.

clone de gama 1 C humana, pGMH6, foi isolado a partir da linha celular GM2146. E apresentada a sequência na sua junção J^-C^l. Dois locais para enzi^ mas de restrição são úteis como pontos de ligação na recom binação do gene C^l com diferentes genes V^. 0 local Bst

E II está na região e foi usado numa construção anterior de uma imunoglobulina de cadeia pesada quimérica ratinho-humana. 0 local Apal está 16 resíduos para dentro de nucleotídeos do dominio codificador de C_H1 da cadeia 1 gama humana; e é usado na construção descrita neste pedido.

clone de C^. humana, pGML60, é uma composição de dois clones de cDNA, um isolado a partir de GM1500 (pk2-3), o outro a partir de GM2146 (pGMLl). A sequência da junção 8-0 apresentada deriva de pK2-3. MutaI\ IX.

génese in vitro usando o oligonucleotídeo, J_KHindIII, foi efectuada para introduzir um local Hind III com 14 resíduos de nucleotídeos a 5 resíduos da junção J-C. Isto altera um codão GTG humano para um codão CTT.

A FIGURA 5 mostra a sequência de nucleotídeos da região V do clone de cDNA de L^V^, pH3-6a. A sequência foi determinada pelo método de terminação didesoxi usando subclones em M13 de fragmentos do gene (apresen tado abaixo). Os círculos abertos significam resíduos de aminoácidos confirmados pela sequência de pepetídeos. Está sublinhada uma sequência homóloga de Dg_{p 2} ^na região CDR3.

A FIGURA 6 mostra a sequência de nucleotídeos da região V do clone de cDNA de L6 V pL3-12a. 0 oligonucleotídeo iniciador usado para a mutagénese dirigida está apresentado abaixo do segmento J_K5. Os círculos

abzertos significam residuos de aminoácidos confirmados pela sequenciação de peptideos.

A Figura 7 mostra a construção dos plasmideos de expressão de L6-V^ quimérica mais gama 1 C humana. O painel (a) mostra as sequências dos clones de delecção com BAL-31 M13mpl9-Cl-delta 4 (Cl-delta 4) e M13mp cDNA, pH3-6a, está indicado com uma seta. As sequências de M13 estão sublinhadas. O oligonucleotideo iniciador usado para esta experiência é H3-6a (5¹-GACTGCACCAACTGG-3¹), que inicia em FR1 perto do extremo N maduro. O painel (b) mostra a estratégia para mutagenese dirigida de 1 ug de clones Cl-delta e Cl-delta 21, cada um emparelhado com 20 ng do oligonucleotideo de 31-meros MJH2-ApaI. A síntese de cadeia complementar com o fragmento Klenow da DNA polimera se decorreu à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois a 15°C durante 72 horas. As placas fágicas tranformadas foram absorvidas a nitrocelulose, fixadas com NaOH e 32 hidridadas com o oligonucleotideo MJH2-ApaI marcado com p a 65°C, 18 horas, em TBS 4x(0,6M NaCl, 0,04 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,004 M EDTA) mais 10% sulfato de dextrano. A lavagem final dos filtros foi a 65°C, SSPE 4x 0,1% de SDS durante 15 minutos (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,1982).

As placas positivas foram detectadas por exposição durante a noite a filme Kodak XAR e foram directamente replicadas para crescimento a análise com enzimas de restrição do DNA FR. Os emparelhamentos imperfeitos do oligonucleotideo MJH2-ApaI com C^l de ratinho estão apontados resultando nas alterações de codificação apresentadas por debaixo dos oligonucleotídeos.

painel (c) mostra a estratégia da substituição de V„ residente com cada um dos módulos L6-VH Π mutagenizados no plasmídeo de expressão quimérica pING2012 para originar pING2111 e pING2112.

A FIGURA 8 mostra a construção do plasmídeo de expressão de L6 quimérica, pING2119. 0 fragmento Sall e BamHI do pING2100 é idêntico ao fragmento A Sall a BamHI do pING2012E.

A FIGURA 9 mostra a modificação do gene V e o seu uso na construção de plasmídeos de expressão

K. da cadeia leve e das cadeias leve mais pesada.

(a) Delecção do segmento oligo d/^-GC/ 5 ¹ de V_K de L6.

oilgonucleótídeo é um 22-mero e contem um sítio Sall. Estão apresentados os 3 locais de de semparelhamento. 0 gene V^, após mutagénese, é ligado como fragmento SalI-HindIII ao módulo C K humano. O plasmídeo de expressão assim formado é pING2119.

(b) pING2114, um plasmídeo de expressão das ca deias leve e pesada. 0 plasmídeo de expressão pING2111 con tem o gene quimérico da cadeia pesada L6 de pING2111 e a cadeia leve quimérica de pING2119 (linha grossa).

A FIGURA 10 mostra um resumo da sequência de alterações feitas na construção dos plasmídeos de expressão do anticorpo quimérico L6. Os resíduos sublinhados na região 5' não traduzida são derivados dos genes clonados das cadeias kapa e pesada de ratinho. Os resíduos

I

colocados dentro de círculos na fronteira V/C resultam de operações de mutagénese para colocar locais de restrição nesta região. São alterações silenciosas.

Descrição das realizações preferidas

Introdução

De um modo geral os anticorpos são compostos por duas moléculas de cadeia leve e duas de cadeia pesada. As cadeias leves e pesadas estão divididas em domínios de homologia estrutural e funcional. Os domínios variáveis de ambas as cadeia leve (V^) e pesada (V_H) determinam o conhecimento e especificidade. Os domínios da região constante das cadeias leve (C ) e pesada (C ) conferem L π propriedades biológicas importantes como sejam associação das cadeias de anticorpos, secreção, mobilidade transplacen tária, ligação do complemento e outras.

Uma série complexa de acontecimentos conduz à expressão dos genes das imunoglobulinas nas células B. As sequências genéticas da região V que conferem especificidade e ligação ao antigênio estão situadas em seg mentos de genes de linhas celulares separadas designados V_H, D e J_H; ou V_L e J_L> Estes segmentos de genes são ligados por rearranjos de DNA para formar as regiões V completas expressas nas cadeias pesada e leve respectivamente (Fi_ gura 1). 0 rearranjo, segmentos V(V_L~J_L e V^-D-J^) ligados codificam então as regiões variáveis completas ou domínios de ligação do antigênio das cadeias leve e pesada, respecti_ vamente.

ι

Definições

Ao longo da especificação e reivindi_ cações são usados determinados termos e frases. As definições que se seguem são fornecidas com fins de clareza e consistência.

1. Vector de expressão - um DNA de plasmldeo conten do os sinais reguladores necessários para a síntese de mRNA derivado de gualquer sequência genética, inserida no vector.

2. Vector módulo - um DNA de plasmídeo contendo um módulo de genes da região constante ou variável.

3. Plasmídeo de expressão - um vector de expressão que contem um gene inserido, como seja um gene de imunoglobulina quimérica.

4. Clonagem de genes - síntese de um gene, inserção em vectores de DNA, identificação por hibridação, análise de sequências e similares.

5. Transfecção- a transferência de DNA para células de mamífero.

Processos e produtos genéticos invento proporciona uma nova abordagem para a clonagem e produção de um anticorpo quimérico humano-ratinho com especificidade para antigénio de tumor humano. 0 antigénio é o ligado pelo anticorpo monoclonal

I

descrito em Câncer Res. 46: 3917-3923 (1986) e em Proc. Nat. Sei.USA 83: 7059-7063 (1986). O hibridoma secretor deste anticorpo monoclonal foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland em 6 de Dezembro de 1984, com ο N° de acesso NB 8677.

O método de produção combina cinco elementos:

(1) Isolamento de RNA mensageiro (mRNA) a partir da linha de hibridoma de células B de ratinho produtora do anticorpo monoclonal, clonagem e produção de cDNA a partir dele;

(2) Preparação de oligonucleotídeos do Gene Universal de Imunoglobulina (UIG), úteis como iniciadores e/ou sondas para a clonagem dos segmentos genéticos da região variável no mRNA das cadeias leve e pesada da linha celular de hibridoma e produção de cDNA a partir dele;

(3) Preparação de módulos de segmentos genéticos da região constante por preparação e clonagem de cDNA ou preparação e clonagem dos genes genómicos;

(4) Construção das sequências codificadoras completas das cadeia leve e pesada por ligação dos segmentos clonados de genes da região variável de imunoglobulina específica da parte (2) acima aos mó dulos de segmentos de genes clonados da região constante humana;

I

(5) Expressão e produção das cadeias leve e pesada em hospedeiros seleccionados, incluindo células procarióticas e eucarióticas, quer em fermentações separadas seguido de montagem das moléculas de anticorpo in vitro, quer através da produção de ambas as cadeias na mesma célula.

Uma característica comum a todos os genes das cadeias leve e pesada das imunoglobulinas e dos RNAs mensageiros codificados é a chamada região J (i.e. região de ligação, ver Figura 1). As regiões J das cadeias pesada e leve têm sequências diferentes, mas existe um elevado grau de homologia de sequências (superior a 80%) especialmente perto da região constante, dentro das regiões J_H da cadeia pesada ou nas regiões J da cadeia leve kapa. Esta homologia é explorada neste invento e as sequências consensus das regiões J das cadeias leve e pesada foram usadas para projectar oligonucleotídeos (aqui designados como UIGs) para usar como iniciadores ou sondas para clonagem dos mRNAs ou genes das cadeias leve e pesada das imunoglobulinas (Figura 3). Dependendo da sequência de um UIG particular, este pode ser capaz de hibridar com todos os mRNAS ou genes de imunoglobulina contendo uma única sequência J espe cífica. Uma outra utilidade de uma sonda UIG particular pode ser a hibridação com mRNAs das cadeias leves ou pesadas de uma região constante específica, como seja UIG-MJK que detecta todas as sequências de ratinho contendo J_TZ(Figu ra 2) . A sequência de UIG pode também incluir uma sequência para introduzir um sítio para enzimas de restrição na cópia de cDNA de um gene de imunoglobulina (ver Figura 3).

O invento pode, por exemplo, utilizar síntese quimica de genes para gerar as sondas UIG para a clonagem e modificação das regiões V no mRNA de imunoglobu-22-

lina. Por outro lado, pode-se sintetizar oligonucleotídeos para reconhecerem individualmente, a região 5' menos conse£ vada dasregiões J como ajuda de diagnóstico na identificação da região J particular presente no mRNA de imunoglobuli. na.

Por outro lado, pode-se sintetizar oligonucleotídeos para reconhecerem individualmente a região 5' menos conservada da região J como auxílio de diagnóstico na identificação da região J particular presente no mRNA de ig.

Utilizou-se um processo de vários pas_ sos para a obtenção de clones de cDNA da região completa V + C a partir dos mRNAs das cadeias leve e pesada das células de hibridoma. Primeiro, sintetiza-se a cadeia comple mentar de cDNA iniciada com oligo dT e este cDNA de cadeia dupla é clonado em vectores de clonagem de cDNA adequados como seja o pBR322 (Gubler e Hoffman, Gene, 25: 263 (1983)). Os clones são testados por hibridação com sondas de oligonucleotídeos UIG. Os clones positivos para cadeias leves e pesadas identificados por este processo de rastreir são mapeados e sequenciados para seleccionar aqueles que possuem as sequências codificadoras da região V e da sequência condutora. A mutagénese in vitro incluindo, por exemplo, o uso de oligonucleotídeos UIG, é então usada para a obtenção dos sítios de clivagem por enzimas de restrição pretendidos.

Um método alternativo é usar oligonu cleotídeos UIG sintéticos como iniciadores para a síntese de cDNA.

Segundo, preparam-se vectores de módulo de cDNA da região constante a partir de células humanas. Estes clones de cDNA são modificados, quando necessário, por mutagénese dirigida para colocar um sítio de restrição na posição análoga da sequência humana ou noutra posição pretendida perto de uma fronteira da região constante. Um método alternativo utiliza clones genómicos da região C como fonte de vectores módulo para a região C.

Terceiro, os segmentosclonados da re gião C obtidos como descrito atrás são retirados e ligados aos vectores módulo da região C das cadeias leve e pesada. Por exemplo, pode-se clonar a região C completa da cadeia leve kapa humana e a região C completa gama 1 humana. Ainda, pode-se modificar a região gama^ humana para introduzir um codão de terminação e portanto obter uma sequência genética que codifique a porção da cadeia pesada de uma molécula F , .

ab

As sequências codificadoras tendo Li gadas operacionalmente regiões V e C são então transferidas para veículos de expressão adequados para a expressão em hospedeiros adequados, procarióticos ou eucarióticos. Liga do operacionalmente significa ligação na mesma grelha de leitura das sequências codificadoras para originar uma sequência genética continuamente traduzível sem alterações ou interrupções da grelha de leitura dos tripletos.

Uma vantagem particular de usar sequências genéticas de cDNA no presente invento é o facto de elas codificarem continuamente cadeias de imunoglobulina, pesadas ou leves. Por continuamente pretende-se significar que as sequências não contêm intrões (i.e. não são se-24-

quências genómicas mas, uma vez derivadas de mRNA por trans crição reversa, são sequências de exões contíguos). Esta característica das sequências de cDNA proporcionadas pelo invento permite que sejam expressas em hospedeiros procari<5 ticos, tais como bactérias, ou hospedeiros eucarióticos inferiores, tais como leveduras.

Uma outra vantagem de usar o método de clonagem de cDNA é a facilidade e simplicidade de obtenção dos módulos de genes da região variável.

Os termos constante e variável são usados funcionalmente para indicar as regiões da cadeia de imunoglobulina, cadeia pesada ou leve, que codificam pro priedade e características inerentes às regiões variável e constante nos anticorpos naturais não quiméricos. Como se fez notar, não é necessário estarem presentes as regiões co dificadoras completas das regiões variável ou constante, desde que esteja presente e disponível uma região funcional.

Os veículos de expressão incluem pias mídeos ou outros vectores. Entre estes são preferidos os veículos portadores de uma sequência constante de uma cadeia pesada ou leve, humana e funcionalmente completa tendo sítios de restrição adequados colocados por engenharia genéti_ ca demodo a que qualquer sequência variável de cadeia pesada ou leve com extremos coesivos adequados possa ser facilmente inserido nela. Os veículos contendo sequências constantes das cadeias pesadas ou leves humanas são assim uma importante execução prática do invento. Estes veículos podem ser usados como intermediários para a expressão de qualquer cadeia completa pesada ou leve pretendida em qualquer hospedeiro adequado.

Um hospedeiro preferido é a levedura.

A levedura proporciona vantagens substanciais para a produção das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina. As leveduras fazem modificações dos peptídeos pós-tradução incluindo glicosilação. Existe agora uma série de estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e plasmídeos de elevado número de cópias os quais podem ser usados para uma produção franca das proteínas pretendidas em levedura. A levedura reconhece sequências condutoras em produtos clonados de genes de mamíferos e secreta peptídeos portadores de sequências condutoras (i.e. prepeptídeos) (Hitzman, et al., llth International Conference on Yeast, Genetics and Molecular Biology, Montpelier, França, 13-17 Setembro, 1982).

Os sistemas de expressão genética em levedura podem ser de rotina avaliados quanto ao nível de produção de cadeias pesadas e leves, estabilidade das proteínas e secreção. Pode ser usado qualquer um de uma série de sistemas de expressão genética em levedura incluindo ele mentos promotores e de terminação derivados de genes activa_ mente expressos codificadores de enzimas glicolíticas produzidas em largas quantidades quando as leveduras crescem em meios ricos em glucose. Genes glicolíticos conhecidos podem também oferecersinais de controle de transcrição muito eficazes. Por exemplo, podem ser usados o promotor e s_i nais de terminação do gene do iso-l-citocrómio C (CYC-1).

A abordagem que se segue pode ser con cretizada para avaliação dos plasmídeos de expressão óptimos para a expressão dos cDNAs clonados de imunoglobulina em levedura.

(1) 0 DNA clonado de imunoglobulina ligando as regiões V e C é ligado a diferentes promotores de transcrição e fragmentos de DNA terminadores;

(2) Os genes quiméricos são colocados em plasmídeos de levedura (ver, por exemplo, Broach, J.R. em Methods in Enzymology - Vol. 101: 307 ed. Wu,

R. et al., 1983));

(3) Unidades genéticas adicionais tais como um peptjí deo condutor de levedura podem ser incluídas em construções de DNA de imunoglobulina para se con seguir secreção de anticorpos.

(4) Uma porção da seguência, frequentemente os primeiros 6 a 20 codões da sequência do gene podem ser modificados para representarem a série de co dões preferida de levedura.

(5) Os genes quiméricos são colocados em plasmídeos usados para a integração nos cromossomas de leve dura.

As abordagens que se seguem podem ser executadas para expressão simultânea dos genes das cadeias leve e pesada em levedura.

(1) Os genes das cadeias leve e pesada são individual, mente ligados a um promotor de levedura e a uma sequência terminadora e colocados no mesmo plasmídeo. Este plasmídeo pode ser projectado para replicação autónoma em levedura ou integração em sítios específicos do cromossoma de levedura.

(2) Os genes das cadeias leve e pesada são ligados individualmente a um promotor de levedura e a uma sequência terminadora em plasmídeos separados contendo diferentes marcas selectivas. Por exemplo, o gene da cadeia leve pode ser colocado num plasmídeo contendo o gene trpl como marca se lectiva, enquanto que o gene da cadeia pesada pode ser colocado num plasmídeo contendo ura3 co mo marca selectiva. Os plasmídeos podem ser pro jectados para replicação autónoma em levedura ou integração em sítios específicos nos cromossomas de levedura. Uma estirpe de levedura defectiva para ambas as marcas selectivas é transformada simultaneamente ou sequencialmente com o plasmídeo contendo o gene da cadeia leve e com o plasmideo contendo o gene da cadeia pesada.

(3) Os genes das cadeias leve e pesada são ligados individualmente a um promotor e sequência terminadora de levedura em plasmídeos separados cada um contendo diferentes marcas selectivas como descrito em (2) atrás. Uma estirpe de levedura tipo de conjugação a defectiva nas marcas selectivas encontradas nos plasmídeos de expressão das cadeias leve e pesada (trpl e ura3 no exemplo acima) é transformada com o plasmídeo contendo o gene da cadeia leve por selecção para uma das duas marcas selectivas (trpl no exemplo acima). Uma estirpe de levedura tipo de conjugação alfa defectiva nas mesmas marcas selectivas da estirpe a (i.e. trpl e ura3 como exemplos) é transformada com um plasmídeo contendo o gene da cadeia pesada por selecção para a marca selectiva alternativa (i.e. ura3 no exemplo acima). A estirpe a contendo o plasmídeo da cadeia leve (fenótipo : Trp+ Ura^- no exemplo acima) e a esti£ pe contendo o plasmídeo da cadeia pesada (fenóti^ po : Trp+ Ura^- no exemplo acima) são conjugadas e os diplóides seleccionados por serem prototróficos para ambas as marcas selectivas referidas (Trp+ Ura^- no exemplo acima).

Entre os hospedeiros bacterianos que podem ser utilizados como hospedeiros de transformação é particularmente útil E. coli K12 estirpe 24 (ATCC 31446). Outros estirpes microbianos que podem ser usados incluem E. coli X 1776 (ATCC 31537). Podem ser usadas as estirpes referidas, assim como E. coli W3110 (ATCC 27325) e outras enterobactérias tais como Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens, e várias espécies de Pseudomas.

Em geral, os vectores plasmídeos con tendo replicões e sequências de controle que derivam de espécies compatíveis com uma célula hospedeira são usados con juntamente com estes hospedeiros. 0 vector normalmente po£ sui um sítio de replicação, assim como genes específicos que são capazes de proporcionar selecção fenótipica em célu las transformadas. Por exemplo, E. coli é facilmente tran£ formada usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli (Bolivar, et al., Gene, 2z 95(1977)). pBR322 contem genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e oferece assim meios fáceis para a identificação de células transformadas. 0 plasmídeo pBR322 ou outros plasmídeos microbianos devem também conter, ou serem modificados para conterem, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para a expressão das suas próprias proteínas.

Os promotores mais vulgarmente usados na construção de DNA recombinante incluem os sistemas promotores da beta-lactamase (penicilinase) e lactose (beta-galactosidade) (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); e sistemas pro motores do triptofano (Goeddel et al., Nucleic Acids Research , 8 : 4057 (1980); Publicação EPO N° 0036776). Se bem que estes sejam os mais regularmente usados, outros promotores microbianos foram descobertos e utilizados.

Por exemplo, uma construção genética para qualquer cadeia pesada ou leve de imunoglobulina quim£ rica pode ser colocada sob o controle do promotor esquerdo do bacteriófago lambda (P^). Este promotor é um dos promo tores mais fortes conhecidos que podem ser controlados. O controle é exercido pelo repressor lambda e conhecem-se sí_ tios de restrição adjacentes.

A expressão da sequência de cadeia de imunoglobulina pode também ser colocada sob o controle de outras sequências reguladoras que devem ser homólogas para o organismo no seu estado não transformado. Por exem pio, DNA cromossónico de E. coli dependente de lactose com preende um operão lactose ou lac que medeia a digestão da lactose produzindo a enzima beta-galactosidase. Os elemen tos de controle lac podem ser obtidos a partir do bacterió fago lambda pLAC5, o qual é infeccioso para E.coli. O sistema promotor-operador lac pode ser induzido por IPTG.

Podem igualmente ser enpregues outros sistemas promotor/operador ou porções deles. Por exemplo podem ser usados arabinose, glicina EI, galactose, fosfata se alcalina, triptofano, xilose tac e similares.

Outros hospedeiros preferidos são células de mamifero crescidas in vitro em cultura de tecidos ou in vivo em animais. As células de mamifero proporcionam modificações pós-tradução das moléculas proteicas imunoglobulina incluindo remoção do peptideo condutor, enrolamento correcto e montagem das cadeias pesadas e leves, glicoxilação correcta nos sittios sertos e secreção de anticorpos funcionais.

As células de mamíferos que podem ser úteis como hospedeiros para a produção de anticorpos incluem células de origem linfóide tais como o hibridona Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581) ou o mieloma P3x63Ag8(ATCC TIB9) e seus derivados. Podem ser ainda células de origem fibroblástica, tais como VERO (ATCC CRL 81) ou CHO-xl (ATCC CRL 61).

Pode-se dispor de vários sistemas vecto res possíveis para a expressão de genes domados da cadeia leve ou da cadeia pesada em células de mamifero. Uma classe de vactores basei-se na integração de sequências genéticas no genoma de célula hospedeira. As células que possuem DNA estávelmente integrado podem ser seleccionadas por introdução simultânea de genes de resistência a drogas tais como gtp de E.coli.(Mulligan, R.L. e Berg.P., Proc Natl. Acad. Sei.,USA, 78; 2072 (1981)) ou Tr5 neo (Southerm, P.J. e Berg.

P.J.Mol.Appl.Genet., 1 : 327 (1982)). O gene da massa selec cionável pode ser ligado às sequências de DNA do gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por contransfecção (Wigles, M et.al., Call, 16: 77(1979)). Uma segunda classe de vectores utiliza elementos de DNA que conferem capacidades de replicação autónoma a um plasmideo extracoromóssonico.

I

Destes vectores podem ser derivados de virus animais, como sejam virus do papilona bovino (Sarver, N.et al. , Proc. Natl Acad. Sei, USA, 79 : 7147 (1982), virus do polioma (deans, R.J. et al., Proc.Natl.

I Acad.Sei.USA, 81 1292 (1984) ou virus JV40 (Lusky, M. e

Botcham, M. Nature, 293 : 79 (1981)).

Uma vez que um cDNA de imunoglobulina é constituído apenas por sequências representando o mRNA maduro codificador de uma proteína anticorpo, são necessários elementos adicionais de expressão genética reguladores de transcrição do gene e do processamento do RNA para a sintese do mRNA de imunoglobulina. Estes elementos podem incluir sinais de splicing promotores da transcrição incluindo promotores induziveis, potenciadores e sinais de terminação. Vectores de expressão de cDNA que incorporam tais elemntos são por exemplo os descritos por Okayama H e Berg, para P., Mol. Cell Biol.3 : 280 (1983); Cepko, C.L. et al. Cell, 37 : 1053 (1984); e Kaufmam, R.J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 82: 689 (1985).

| Uma vantagem adicional das células de mamíferos como hospedeiros é a sua capacidade para expressarem genes de imunoglobulina quiméricas os quais são para isso obtidos a partir de sequências genoméicas. Assim as células de mamífero podem expressar genes de imunoglobulinas quiméricas que são constituídos por um módulo de cDNA da região variável mais uma região constante que é com posta no todo ou em parte por sequências genomeicas.

Foram descritos vários clones genómicos da região constante humana (Ellison, J.W. et al., Nucleic. Acids.Res, 10 : 4071 (1982) ou Max. E. et al., Call, 29 : 691 (1982). O uso de tais sequências genómicas pode ser conveniente para a introdução de potenciadores, sinais de splicing e sinais de terminação da transcrição de imunoglobulina juntamente com o segmento do gene da região constante.

Podem ser seguidas diferentes abordagens para se obter anticorpos completos.

Primeiro pode-se expressar separadamente as cadeias leve e pesada seguido de montagem in vitro das cadeias leves e pesadas purificadas para dar anticorpos Ig As vias de montagem usadas para a geração de moléculas completadas Ig G ^{em calulas f}°i extensivamente estudqdaz (ver por exemplo, Scharff, M., Harvey Lectures, 69: 125 (1974)). Os parâmetros da reacção in vittro para a formação de anticorpos IgG a partir das cadeias reduzidas e pesadas foram definidos por Beycho, S., Cells of Immunoglobulia Synthesis Academic Press, New York, página | 69, 1979.

Segundo é possível expressar simultaneamente cadeias leves e pesadas na mesma célula para se conseguir associação e ligação intracelulares das cadeias pesadas a cadeias leves em anticorpos IGG ^comPl^etos·

A expressão simultânea pode ocorrer usando o mesmo plasmideo ou plasmídeos diferentes no mesmo hospedeiro.

Produtos Polipeptidicos invento proporciona cadeias de imunoglobulina quiméricas pesadas ou leves. Uma cadseia quimérica uma região constante substancialmente semelhante à pre_ sente numa imunoglobulina natural humana e uma região vari£ vel tendo a especificidade antigénica pretendida do invento, i.e. contra o antigênio de tumor humano especificado.

invento também proporciona moléculas de imunoglobulina tendo cadeias pesadas e leves associadas de modo a que a o molécula apresente quaiquer propriedades de ligação e reconhecimento pretendidos. São proporcionados vários tipos de imunoglobulinas: monovalentes bivalentes moléculas com cadeias pesadas quiméricas e cadeias leves não quiméricas ou moléculas os dominios de ligação variáveis do invento ligados a porções postadoras das funções pretendidas.

Os anticorpos tendo cadeias pesadas qui, méricas da mesma ou diferente especificidade de ligação da região variável e cadeia leves não quiméricas (i.e., todas humanas ou todas não humanas) podem ser preparadas pela associação adequadas da cadeia polipeptidicas necessárias estas cadeias são preparadas indicidualmente pelos métodos de montagem modular do invento.

Utilizações

Os anticorpos do invento tendo região constante humana podem ser utilizados para imunização passiva, especialmente em humanos sem reacção imune negativas tais como perturbações do soro ou choque anafilático.

Os anticorpos podem certamente, ser também utilizados em ensaios e kits de imunodiagnóstico 125 na forma marcada de modo a detectar-se (e.g. enzimas, I, marcas fluorescentes, etc) ou na forma imobilizada (em | tubos poliméricos, esferas, etc), na forma marcada para ima_ gem in vivo, em que a marca pode ser um emissor radioactivo ou um agente contrastante para NMR como sejam núcleos de carbono-13 ou um agente contrastante para raios X, como seja um núcleo de metal pesado. Os anticorpos podem também | ser usados para localização in vitro do antigênio por marca ção adequada.

Os anticorpos podem ser usados com fins terapêuticos, por si sós, na lise mediada pelo complemento ou acoplados a toxinas ou partes terapêuticas, tais como ri_ cino, etc.

Moléculas mistas de anticorpo-enzima podem ser usadas para métodos de imunodiagnóstico, tais como ELISA. Conjugados mistos de anticorpo-peptídeo efector podem ser usados para libertação dirigida da parte efectora | com um grau de eficácia e especificidade elevadas.

Especif icamente, os anticorpos quiméri^ cos deste invento podem ser usados para qualquer caso em que o anticorpo monoclonal L6 do murganho possa ser usado, com a vantagem óbvia de os quiméricos serem compatíveis com o | corpo humano.

Tendo descrito de um modo geral o invento, o mesmo será melhor compreendido por referência a certos exemplos específicos que aqui são incluídos apenas com fins ilustrativos e não se pretendem como limitantes a menos que seja especificado.

Parte Experimental

Materiais e Métodos

Linhas celulares para cultura de tecidos

As linhas de células humanas GM2146 e GM1500 foram obtidas do Human Mutant Cell Repository (Camden, New Jersey) e cultivadas em RPMI1640 mais 10% de soro fetal bovino (M.A. Bioproducts). As linhas celulares Sp2/0 foram obtidas da American Type Culture Collection e crescidas em Meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DMEM) mais 4,5g/l de glucose (M.A. Bioproducts) mais 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Sterile Systems, Logan, Utah). Os meios foram suplementados com penicilina/estreptomicina (Irvine Scientific, Irvine, Califórnia).

Plasmídeos recombinantes e DNAs de bacteriófagos

Os plasmídeos pBR322, pLl e pUC12 foram adquiridos à Pharmacia P-L Biochemicals (Milwaukee, Wis_ consin). Os plasmídeos pSV2-neo e pSV2-ght foram adquiridos à BRL (Gaithersburg, Maryland), e estão disponíveis na American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). pHu-gamma-1 é um subclone do fragmento HindiII-BamHI de 8,3Kb do gene cromossónico da IgGl humana. Um método de is£ lamento do gene cromossónico da IgGl humana está descrito por Ellison, J.W. et al., Nucl. Acids Res., 10: 4071 (1982). M8alfaRX12 contem o fragmento Xbal-EcoRI de 0,7Kb contendo o potenciador da cadeia pesada de ratinho da região do intrão J-C do gene cromossónico M 603 (Davis, M. et al., Natu re, 283:733 , 1979) inserido em M13mpl0. As manipulações de DNA envolvendo purificação de DNA de plasmídeo por centrifugação de equilíbrio em gradientes de densidade, diges-36-

tão com endonucleares de restrição, purificação dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose, ligação e transformação de E.coli foram como descrito por Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982) ou outros processos. As endonucleares de restrição e outras enzimas de modificação de DNA/RNA' foram adquiridas à Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana), BRL, New England Biolals (Beverly, Massachusetts) e Pharmacia P-L.

Preparação de oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos foram sintetizados pelo método triéster de Ito et al., (Nucl. Acids Res., 10: 1755 (1982))ou foram adquiridos à ELESEN, Los Angeles, Califórnia. Os oligonucleotídeos tritilados e desbloqueados foram purificados em Sephadex-G50, seguido de HPLC em fase reversa com um gradiente de 0-25% de acetonitrilo em ácido trietilaminoacético lOmM, pH 7,2, numa coluna C18 uBondapak (Waters Associates). A destritilação decorreu em ácido acético a 80% durante 30 minutos, seguido de evaporação três vezes. Os oligonucleotídeos foram marcados com i 32

I /gama- P 7 ATP mais polinucleotídeo cinase de T4.

Preparação e análise de RNA

Preparou-se RNA celular total a partir de células em cultura de tecidos pelo método de -Auffrey, C. e Rougeon, F. (Eur. J. Biochem., 107: 303 (1980) ou Chirgwin, J. M. et al., (Biochemistry, 18: 5294 (1979)). A preparação de RNA poli(A)⁺ , electroforese em gel de metil-mercúrio agarose e transferência Northern para nitrocelulose foram realizadas como descrito por Maniatis, T. et al., supra.

RNA celular total ou RNA poli (A)⁺ foi directamente ligado a nitrocelulose tratando primeiro o RNA com formaldeído (White, B.A. e Bancroft, F.C., J.Biol. Chem., 257: 8569 (1982)). A hibridação de RNA ligado a filtros com fragmentos de DNA marcado pornick-translation usando as condições descritas por Margulies, D.H. et al., (Nature), 295: 168 (1982) ou com oligonucleotídeos marcados com P usando SSC4x, Denhardfs lOx, 100 jug/ml do DNA de esperma de salmão a 37°C durante a noite, seguido de lavagem em SSC4x a 37°C.

Preparação e clonagem de cDNA

Prepararam-se bibliotecas de cDNA iniciado com oligo-dT a partir de RNA poli(A)+ de células GM1500 e GM2146 pelos métodos de Land, H. et al.,(Nucl. Acids Res,, 9 : 2251 (1981) e Gubler, V. e Hoffman, B. J., Gene, 25 : 263 (1983), respectivamente. As bibliotecas de cDNA foram testadas por hibridação (Maniatis, T., supra) com oligonucleotídeos marcados com P usando o processo de Lang et al., (Cell, 34: 891 (1983) ou com fragmentos de DNA marcados por nick-translation.

Extensão a partir do oligonucleotídeo iniciador e clonagem

Misturou-se RNA poli(A)⁺ (20 jug) com 1,2 jig de iniciador em 40 jul de KC1 64mM. Após desnaturação a 90°C durante 5 min. seguido de arrefecimento em gelo, adicionou-se 3 unidades do Inibidor de Ribonucleases de Placenta Humana (BRL) em 3 jul de 1M Tris-HCl, pH 8,3. O oligonucleotídeo foi emparelhado com o RNA a 42°C durante

-3815 minutos, depois adicionou-se 12 pl de 0,05MDTT, 0,05M MgC12 e dATP, DTPP, dCTP e dGTP, ImM de cada. Adicionou-se 2 /11 de alfa-32p-dATP (400 Ci/mmol, New England Nuclear), segiu-se 3 /11 de transcriptase reversa de AMV (19 unidades/ /pl, Life Sciences).

Após incubação a 42°C durante 105 min. adicionou-se 2 pl de 0,5M EDTA e 50 pl de lOmMTris, lmMEDTA pH 7,6. Os nucleotídeos não incorporados foram removidos por cromatografia em coluna de Sephadex G-50 e o híbrido RNA-DNA foi extraído com fenol, depois com clorofórmio e precipitado com etanol. A síntese da segunda cadeia, colocação de caudas homopoliméricas usando dGTP ou dCTP e inserção em vectores com caudas homopoliméricas foi efectuado como descrito por Gubler e Hoffman, supra.

Mutagénese dirigida

O subclone de DNA em M13 de cadeia simples (1 /ig) foi combinado com 20 ng de iniciador oligonucleotídeo em 12,5 /11 de tampão Hin (7mM Tris-HCl, pH 7,6, 7mM MgC^, 50mM NaCl). Após arrefecimento até 95°C num tubo selado, o iniciador foi emparelhado com o molde através de arrefecimento lento de 70°C para 37°C durante 90 minu32 tos. Adicionou-se 2 pl de dNTPs (ImM cada), 1 /11 de P-dATP (10 /íCi), l/il de DTT (0,lM) e 0,4 pl de DNA Poli Klenow (2 u, Boehringer Mannhein) e as cadeias prolongadas durante 30 minutos a 37°C. A isto adicionou-se 1 /11 (lOng) do iniciador reverso de M13 (New England) Biolabs) e repetiu-se os passos de aquecimento/emparelhamento e extensão das cadeias.

Parou-se a reacção com 2 /11 de EDTA

0,05M, pH 8, mais 80 jul de lOmMTris-HCl, pH 7,6, lmM EDTA. Os produtos foram extraídos com fenol e purificados por cro matografia em colunas de Sephadex G-50 e precipitados com etanol antes da digestão com enzimas de restrição e ligação ao vector adequado.

Transfecção de células de mieloma em cultura de tecidos

Usou-se o método de electroporação de Potter, H. et al., (Proc. Natl. Acad. Sei.,USA, 81: 7161 (1984)). Após transfecção, deixou-se as células recuperarem em DMEM completo durante 48-72 horas, depois semearam-se entre 10 000 e 50 000 células por poço em placas de cultura de 96 poços na presença demeio selectivo. A selecção em G418 (GIBCO) foi a 0,8 mg/ml, o ácido nicofenólico (Calbiochem) estava a 6 jug/ml mais 0,25 mg/ml de xantina e o HAT (Sigma) estava na concentração padrão.

Ensaios para a síntese e secreção de imunoglobulina

A imunoglobulina secretada foi medi, da directamente a partir dos sobrenadantes das células em cultura de tecidos. O extracto de proteína citoplasmática foi preparando por agitação com vortex de 10θ células em 160 jul de 1% NP40, 0,15M NaCl, lOmMTris, lmMEDTA, pH 7,6 e deixando o lisado a 0°C, 15 minutos, seguido de centrifugação a 10000 x g para remover os detritos insolúveis.

Para detectar imunoglobulinas espeoí ficas usou-se o método da dupla sanduíche de anticorpos, ELISA (Voller, A. et al.,, em Manual of Chimical Immunology,

Ed., Eds. Rose, N. e Friedman, H. pp. 359-371, 1980) usando anti-soro purificado por afinidade. Para a detecção de IgG humana, o anti-soro ligado à placa é IgG de cabra anti-humano (KPL, Gaithersburg, Maryland) a uma diluição de 1/1000, enquanto que o anti-soro ligado a peroxidase é IgG de cabra anti-humano (KPL ou Tago, Burlingame) a uma diluição de 1/4000. Para a detecção de imunoglobulina kapa humana, o anti-soro ligado à placa é de cabra anti-kapa humana (Tago) a uma diluição de 1/500, enquanto que o anti-soro ligado a peroxidase é de cabra anti-kapa humana (Cappel) a uma diluição de 1/1000.

EXEMPLO 1

Uma Imunoglobulina Quimérica Ratinho-Humana com Especificidade para Antigênio de Cancro (1) Anticorpo L6

O anticorpo monoclonal (Mab) L6 foi obtido de um ratinho que tinha sido imunizado com células de um carcinoma do pulmão humano, após o que as células do baço foram hibridadas com células de mieloma de ratinho NS-1. O anticorpo liga-se a um antigênio com açúcar previamente não identificado que é expresso em grandes quantidades na superfície das células da maior parte dos carcinomas do pulmão (adeno, escamoso), carcinomas da mama, carcinomas do cólon e carcinomas do ovário, enquanto que o antigênio só está presente em níveis reduzidos nas células normais do

hospedeiro adulto. Mab L6 é uma IgG2a e pode mediar citoto xicidade celular dependente de anticorpos, ADCC, na presença de leucócitos humanos do sangue periférico como fonte de cé lulas efectoras, de modo a lisar as células de tumor positivas para L6 e pode lisar as células de tumor positivas pa ra L6 na presença de soro humano como fonte de complemento; a lise é detectada pela libertação de Cr de células marca das durante um período de incubação de 4 horas. 0 Mab L6 pode localizar tumores positivos para L6 xenotransplantados em ratinhos labro e pode inibir o crescimento de tais tumores .

Mab L6 está descrito em Câncer Res. 46: 3917-3923, 1986 (sobre especificidade do Mab) e em Proc. Natl. Acad. Sei., 83: 7059-7063 1986 (sobre função do i Mab). O Mab está descrito nos pedidos copendentes S.N. 776 i

321 entregue em 18 de Outubro, 1985 e S.N. 684.759 entregue em 21 de Dezembro, 1984. O conteúdo de cada um deles está aqui totalmente incluido como referência.

(2) Identificação de sequências J no mRNA da imunoglobulina de L6.

As células congeladas foram descong£ ladas em gelo durante 10 minutos e depois à temperatura ambiente. A suspensão foi diluida com 15 ml de PBS e as células foram centrifugadas. Ressuspenderam-se, após lavagens em PBS, em 16 ml de 3M LiCl, 6M ureia e rebentaram-se num sistema de polytron. A preparação de mRNA e a selecção da fracção de poli(A)⁺ foi efectuado de acordo com Auffray, C. e Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107: 303, 1980.

RNA poli(A)⁺ de L6 foi hibridado individualmente com oligonucleotídeos marcados 1^3 e J^4 nas condições descritas por Nobrega et al., Anal. Biochem. 131, 1983). Os produtos foram então sujeitos a electroforese num gel de 1,7% agarose-TBE. 0 gel foi fixado em 10% TCA, seco e exposto para autorradiografia. O resultado mostrou que L6 contem sequências 1^2.

Para a análise do mRNA de V_K usou-se o método de transferência de pontos (dot-blot) de White e Bancroft J. Biol. Chem. 257: 8569, (1982). RNA poli(A)⁺ foi imobilizado em filtros de nitrocelulose e hibridado com sondas de oligonucleotídeos marcados a 40° em SSC4x. Estas experiências mostraram que L6 contem sequências ^J _K5. Obser vou-se uma hibridação com J_R2 muito fraca.

(3) Clones de cDNA da região V

Uma biblioteca iniciada com oligo(dT) em RNA poli(A)⁺ de L6 foi testada relativamente à presença de clones kapa com uma sonda da região C_rz de ratinho. A partir da biblioteca de L6 isolaram-se vários clones. Um segundo despiste com uma sonda específica de 5' identificou os clones de cadeia leve (J„5) de L6. Os clones

IX. das cadeias pesadas de L6 foram isolados por despiste com o oligonucleotídeo J_H2.

Os genes das cadeias pesadas e leve ou os fragmentos de genes dos clones de cDNA, pH3-6a e pL3-12a foram inseridos no vector bacteriofágico M13 para análise da sequência de nucleotídeos. As sequências de nucleotídeos completas da região variável destes clones foram

-43determinadas (FIGURAS 5 e 6) pelo método de terminação didesoxi de cadeias. Estas sequências determinam composições de aminoácidos da região V que estão de acordo com as composições observadas e determinam sequências pepetídicas que foram verificadas por sequenciação directa de aminoácidos I de porções das regiões V.

As sequências de nucleotídeos dos clones de cDNA mostram que são clones da regiãó V de imuno globulina uma vez que contêm resíduos de aminoácidos de diagnóstico dos domínios V (Kabat et al., Sequences of Pro teins of Immunological Interest; U.S. Dept of HHS, 1983).

A de L6 pertence ao subgrupo II. 0 cDNA prevê uma sequência N-terminal de 24 resíduos de ami. noácidos idênticos aos de uma conhecida (45-165 CRI; Margolies et al., Mol. Immunol. 18: 1065, 1981). A de L6 contem a sequência J^2. A de L6 é da família V^-Kpnl (Nishi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 6399, 1985) e usa <1^.5. A de L6 clonada prevê uma sequência de aminoácidos que foi confirmada por sequenciação de aminoácidos dos pep tídeos da cadeia leve de L6 correspondendo aos resíduos 18I -40 e 80-96.

(4) Mutagénese in vitro para arranjar sítios para enzimas de restrição na região J para ligação a um módulo C humano e para remover sequências oligo(dC) 5' dos módulos V.

Ambos os clones originados por inicia ção com oligo(dT) L6 V e L6 necessitam de ser modifica dos. Para a L6 V.., utilizou-se o iniciador de mutagénese da região J J_rz HindIII, como se mostra na FIGURA 6. Um mó i\ ——— — —

dulo C_r. humano derivado de um clone de cDNA foi mutagenizado para conter a sequência HindIII (ver FIGURA 4). A reacção de mutagénese foi efectuada em subclones em M13 destes genes. A frequência de clones mutantes variou entre 0,5 e 1% das placas obtidas.

Foi previamente observado que a sequência oligo(dC) a montante do codão AUG num gene quimérico de interfere com o splicing correcto numa construção genética particular. Calculou-se que talvez tanto como 70% dos RNAs transcritos têm splicing errado, em que foi usado um aceitador 3' de splicing escondido presente na sequência condutora. Assim, a sequência de oligo (dC) a montante do codão AUG foi removida em todos os clones.

Numa abordagem, usou-se um oligonucleotídeo que contem um sítio de restrição Sall para mutagenizar o clone L6 V^. 0 iniciador usado para esta mutagénese dirigida com oligonucleotídeos é um mero-22 que introduz um sítio Sall entre o oligo(dC) e o codão iniciador met (FIGURA 9).

Numa abordagem diferente, a nuclease Bal-31 foi usada para retirar o oligo(dC) no clone L_CV_U

Ό Π pH3-6a. A dimensão da delecção em dois dos mutantes obtidos foi determinado por sequenciação de nucleotídeos e está apresentado na FIGURA 7. Em ambos os mutantes, (delta 4 e delta 21) todas as sequências oligo(dC) 5' relativamente à região codificadora foram eliminadas.

Estes clones foram então modificados por mutagénese dirigida com oligonucleotídeos usando o iniciador MJH2-ApaI (FIGURA 7). Este iniciador de 31 bases introduz um sítio Apal no gene de ratinho numa posição

análoga à de um sítio Apal existente no módulo de genes de cDNA C gamai humano. 0 iniciador introduz os codões adequados ao gen de C gamai humana. 0 gene da cadeia pesada quimérica feito por ligação do módulo de genes de de ra tinho mutagenizados ao módulo de humano origina assim uma proteína quimérica quenão contem aminoácidos humanos em toda a região V^.

módulo de genes de C gamai humana é um cDNA derivado de células GM2146 (Human GEnetic Mutant Cell Repository, Newark, New Jersey). Este módulo de genes de C gamai foi previamente combinado com um módulo de genes de ratinho para formar o plasmídeo de expressão qui_ mérico pING2012E.

(5) Plasmídeos de expressão de L6 quimérico

Os plasmídeos de expressão da cadeia pesada quimérica de L6 derivaram da substituição di módulo de pING2012E pelos módulos V_H dos mutantes delta 21 e delta 4 para dar os plasmídeos de expressão pING2111 e pING 2112 (FIGURA 7). Estes plasmídeos dirigem a síntese da ca_ deia pesada quimérica de L6 quando transfectados para célu las de mamíferos.

Para o gene quimérico da cadeia leve de L6, o fragmento SalI-HindIII do módulo V_K de ratinho foi ligado ao módulo c^ humano pelo processo descrito na FIGURA 8, formando pING2119. A substituição da sequência neo com o gene gpt de E. coli.derivado de pSV2-gpt resultou em pING 2120, o qual expressou a cadeia leve quimérica de L6 e con fere resistência ao ácido micofenólico quando transfectado para células de mamífero.

A inclusão de genes quiméricos das cadeias pesadas e leves no mesmo plasmídeo permite a intr<3 dução em células transfectadas de uma proporção de genes 1:1 de genes das cadeias pesada e leve conduzindo a uma dç> sagem equilibrada de genes. Isto deverá melhorar a expres_ são e diminuir as manipulações de células transfectadas originando uma expressão potimizada de anticorpos quiméricos . Com esta finalidade os fragmentos de DNA derivados dos genes das cadeias quiméricas pesada e leve de pING2111 e pING2119 forma combinados no plasmídeo de expressão pING 2114(FIGURA 9). Este plasmídeo de expressão contem uma marca neo seleccionável e unidades de transição separadas para cada gene quimérico, cada uma incluindo um potenciador da cadeia pesada de ratinho.

As modificações das regiões de liga, ção V-C dos genes quiméricos de L6 estão resumidas na FIGU RA 10.

(6) Transfecção estável de células linfóides de ratinho para a produção de anticorpo quimérico.

Z electroporação foi usada (Potter et al., supra; Toneguzzo et al., Mol. Cell. Biol. 6_: 703 1986) para a introdução do DNA do plasmídeo de expressão quimérica de L6 em células Sp2/0 de ratinho. A técnica de electroporação deu uma frequência de transfecção de 1-10 x x 10 para as células Sp2/0.

plasmídeo de expressão de dois genes, pING2114 foi linearizado por digestão com Aatll endonuclease restrição e transfectado para células Sp2/0, dando aproximadamente cinquenta clones resistentes G418 que foram testados quanto à síntese das cadeias leve e pesada humanas.

Os níveis de síntese de cadeias de anticorpo quiméricas dos dois produtores, D7 e 3E3 estão apresentados na Tabela 1. 0 anticorpo L6 quimérico foi pr£ parado cultivando as células transfectadas D7 durante 24 g horas a 2 x 10 células/ml em 5 1 de DMEM suplementado com tampão HEPES, penicilina e estreptomicina. O sobrenadante foi concentrado numa membrana Amicon YM30 em tampão fosfato de sódio lOmM, pH 8,0. A preparação foi aplicada numa coluna de DEAE-celulose, que se separou a imunoglobulina nas fracções não ligada e ligada. Amostras de preparações não ligadas a DEAE, ligadas a DEAE, e pré-DEAE (a partir de 1,61 de meio) foram separadamente purificadas por cromatografia de afinidade numa coluna de Proteína A-Sefarose, eluindo com citrato de sódio O,1M ph 3,5. O anticorpo eluido foi neutralizado e concentrado por filtração em Amicon em tampão fosfato salino. As produções para as três preparações foram de 12 pg (não ligada a DEAE), 6 pg (ligada a DEAE), e 9 pg (pré-coluna de DEAE). A análise Western das cadeias de anticorpo indicou que elas estavam combinadas num tetrâmero semelhante às imunoglobulinas nativas.

(7) Purificação do anticorpo L6 quimérico secretado em cultura de tecidos.

a. Células Sp2/0.pING2114.D7 foram crescidas em meio de cultura /DMEMCGilco #320-1965), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (Hyclone *A -1111-D) , com lOmM HEPES, Glutamina-Pen-Strep lx (Irvine Scientific *9316) para 1 x 10θ células/ml.

b. As células foram então centrifugadas a 400x g

xg e ressuspensas em meio de cultura sem soro a 2 x 10 células/ml durante 18-24 hr.

c. O meio foi centrifugado a 4000 RPM num rotor JS-4,2 (3000 xg) durante 15 minutos.

d. 1,6 litros do sobrenadante foi então filtra do através de um filtro de 0,45 microns e depois concentrado através de um filtro YM30 (Anicon Corp.) para 25 ml.

e. A condutância do sobrenadante concentrado foi ajustada a 5,7-5,6 mS/cm radiómetro CDM 80 e o pH foi ajustado a 8,0.

f. 0 sobrenadante foi centrifugado a 2000xg, 5 minutos e depois aplicado numa coluna de 40 ml com DEAE, a qual foi pré-equilibrada com fosfato de sódio lOmM, pH 8,0.

g. A fracção do volume de exclusão foi colhida e aplicada numa coluna de 1 ml de proteína A-Sefarose (Sigma) pré-equilibrada com fosfato de sódio lOmM, pH 8,0.

h. Lavou-se a coluna primeiro com 6 ml de tam_ pão fosfato de sódio lOmM, pH 8,0, seguido de 8 ml de citr£ to de sódio 0,lM pH 3,5, depois por 6 ml de ácido cítrico 0,1 M (pH 2,2). Colheram-se fracções de 0,5 ml em tubos contendo 50 μ1 de base Tris 2M (Sigma).

I

i. 0 grosso da IgG estava na eluição de pH 3,5 e foi reunida e concentrada através de Centricon 30 (Amicon Corp.) até aproximadamente 0,06 ml.

j. 0 tampão foi midado para pBS (10 mM fosfato de sódio pH 7,4, 0,15M NaCl) em Centricon 30 por diluição repetida com PBS e reconcentração.

k. A solução do IgG foi então ajustada a 0,10 ml e adicionada albumina do soro bovina (Fracção V, U.S. Biochemicals) para 1,0% como reagente estabilizador.

(⁸) Produção e purificação do anticorpo L6 quimérico a partir de fluido ascitico.

a. As ascites foram primeiro centrifugadas a 2000 χ g durante 10 min.

b. A condutância do sobrenadante foi ajustada a 5,7-5,6 mS/cm e o pH ajustado a 8,0.

c. Colocou-se então o sobrenadante numa coluna de 40 ml de DEADE-celulose pré-equi1ibrada com 10mM NaPO^H pH 8,0.

d. 0 volume de exclusão da coluna de DEAE foi colhido e o seu pH foi ajustado a 7,4 e depois aplicado numa coluna de 1,0 ml de IgG de cabra anti-humana (H + L)-sefarose.

e. Lavou-se a coluna primeiro com 6 ml de 10 mM fosfato de sódio, 0,5M cloreto de sódio, seguido de 8 ml de 0,5 NH^OH e 3mM tiocianato de sódio.

f. O eluato de tiocianato de sódio foi reunido e dialisado contra 2L PBS durante a noite.

o anticorpo pode ainda ser concentra do pelos passos J, e K. do processo anterior.

TABELA 1

Níveis de cadeias quiméricas de L6 secretadas a partir de Sp2/0 transfectadas

Condições de Cultura	Sp2/0.D7	Sp2/0.3E3
FBS	Kappa^ GammaC	b Kappa	GammaC
1.	20 ml, 2d,	+	17	77	100	700
	seed 2xl0^/ml
2.	200 ml, 2d,	+	0,9	6	80	215
	seed 2,5xl0^/ml
3.	200 ml, ld,	-	1,9	3,8	97	221
	seed 2xl0®/ml
4.	Balb/c ascites	—	5,160	19,170	ND	ND

Células Sp2/0 transfectadas por electroporação com pING2114 (pL6HL)

- jug/1 medido por ELISA específica para padrão kapa-humana-proteína Bence-Jones humana.

c ✓

- jug/1 medido por ELISA específica para padrão gama humana-IgG humana

ND- Não determinado

FBS: Soro Fetal Bovino.

(9) Estudos efectuados no anticorpo L6 quimérico

Primeiro, as amostras foram testadas com um ensaio deligação, no qual células de uma linha celu lar positiva para o antigénio L6 e de uma linha celular negativa para o antigénio L6 foram incubadas com o anticor po monoclonal padrão de ratinho contra L6 , anticorpo contra L6 quimérico derivado de sobrenadantes de culturas delulares e anticorpo contra L6 quimérico derivado de ascites (como previamente descrito) seguido de um segundo reagente, anticorpos de cabra contra imunoglobulina humana (ou de ra. tinho, para o padrão) conjugados com fluoresceina-isotiocianato.

Uma vez que o ensaio de ligação mos trou grande reactividade do L6 quimérico na linha celular positiva para o antigénio L6 e total ausência de reactividade na linha celular negativa o passo seguinte foi testar a capacidade do L6 quimérico para inibir a ligação de L6 de ratinho às células positivas para o antigénio; tais en saios de inibição são usados de rotina para estabelecer a identidade de dois anticorpos que reconhecem o antigénio. Estes resultados são discutidos abaixo (Inibição da Ligação). Como parte destes estudos fez-se um cálculo aproxi. mado da avidez dos anticorpos.

Finalmente, estudaram-se dois aspec tos da função dos anticorpos, a capacidade para mediar ADCC na presença de leucócitos humanos do sangue periférico e a capacidade para matar células de tumor positivas para L6 na presença de soro humano como fonte de complemento (ver Ensaios funcionais abaixo).

Ensaios de ligação. Usou-se como al_ vo células de umalinha humana de carcinoma do cólon, 3347, que previamente se tinha verificado expressar aproximada5 z mente 5 xlO moléculas do antigénio L6 na superfície celu| lar. Usou-se como testemunha negativa células da linha de células T HSB2 uma vez que elas, de acordo com testes ante riores, não expressam quantidades detectáveis do antigénio L6. As células alvo foram primeiro incubadas durante 30 min. a 4°C com o L6 quimérico ou com o padrão L6 de ratinho | que foi purificado a partir de ascites de ratinho. Isto foi seguido de incubação com um segundo reagente marcado com FITC, o qual para o anticorpo quimérico foi imunoglobu lina de cabra anti-imunoglobulina humana, obtida da TAGO (Burlingame, CA) e usado numa diluição de 1:50. Para o pa_ drão de ratinho usou-se imunoglobulina de cabra-anti-imunoglobulina de ratinho também adquirida à TAGO e usada numa diluição de 1:50. A ligação do anticorpo à superfície celular foi determinada usando um classificador de células Coulter Model EPIC-C.

Como se mostra na Tabela 2 e na Tabe. la 2A, tanto o L6 quimérico como o padrão de ratinho ligaram-se significantemente e aproximadamente no mesmo grau à linha 3347 positiva para L6. Não se ligaram acima do fundo à linha HSB2 negativa para L6.

Face ao facto de as três amostras ) diferentes de L6 quimérico apresentadas na Tabela 2 compor^ tarem-se de modo semelhante nos ensaios de ligação, elas foram reunidas para os estudos de inibição apresentados abaixo. Os mesmos estudos de inibição foram efectuados pa ra L6 quimérico derivado de fluido ascítico apresentado na Tabela 2A.

Inibição da ligação. Como passo seguinte estudou-se o grau em que doses graduais do anticorpo L6 quimérico ou o L6 padrão de ratinho podia inibir a ligação de um L6 de ratinho marcado com FITC à superfície de cé lulas de carcinoma do cólon 3347 positivas para o antigénio.

Tanto o L6 quimérico como L6 padrão de ratinho inibiram a ligação do anticorpo L6 directamente marcado, sendo as curvas de ligação paralelas. 0 anticorpo quimérico foi ligeiramente menos eficaz do que o padrão, conforme indicado pelos resultados que mostram que 3,4 jug/ /ml do Mab L6 quimérico (conjunto de fracções), em vez de 2,0 ^ig/ml do Mab L6 padrão de ratinho, foi necessário para 50% de inibição da ligação e que 5,5 jug/ml de L6 quimérico (derivado de ascites), em vez de 2,7 jng/ml do' Mab L6 padrão de ratinho, foi necessário para 50% de inibição da ligação.

Como parte destes estudos fez-se uma estimativa por alto da avidez do anticorpo. A avidez do L6 padrão de ratinho tinha sido previamente determinada co8 mo sendo de aproximadamente 4x10 . Os resultados indicaram que não houve diferenças significativas na avidez entre o L6 quimérico e de ratinho.

Ensaios funcionais. Fez-se uma compa ração entre a capacidade do L6 quimérico e do L6 padrão de ratinho para lisar células positivas para o antigénio L6 na presença de leucócitos humanos do sangue periférico como fonte de células efectoras (mediadoras da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos, ADCC) ou soro humano como fonte de complemento (mediadora de Citotoxicidade Dependente de Complemento, CDC).

Como se mostra na Tabela 3 e Tabelas 3A-3D, o L6 foi superior à amostra de L6 ratinho simultânea, mente testada na produção de ADCC, conforme medido por um 51 teste de libertação de Cr de 4hr.

As Tabelas 4 e 4A-4B apresentam os resultados de estudos de lise de células alvo mediada pelo complemento. Neste caso, observou-se uma elevada actividade citolítica com os anticorpos L6 de ratinho e quimérico.

Conclusões.

Os resultados apresentados atrás demonstram uma série de qualidades importantes e inesperadas do anticorpo monoclonal L6 quimérico do invento. Em primei_ ro lugar, o anticorpo L6 quimérico liga-se a células de tumor positivas para L6 com aproximadamente o mesmo grau do padrão h6 de ratinho e com aproximadamente a mesma avidez. Isto é significativo pelas seguintes razões: o anticorpo L6 define (a) um antigénio tipo açúcar de superfície e (b) um antigénio proteico de cerca de 20 000 daltons, cada um deles é característico do carcinoma do plumão de células não pequenas (NSCLC) e de outros carcinomas humanos. Significativamente, o anticorpo L6 não se liga de um modo detectável a células normais como sejam fibroblastos, células endoteliais, ou células epiteliais nos orgãos principais. Assim, o anticorpo monoclonal L6 quimérico define um antigé: nio que é especifico para as células do carcinoma e não para células normais.

I

Além das capacidades dos anticorpos monoclonais L6 quiméricos do presente invento para se ligarem especificamente a células malignas e localizarem tumores , o L6 quimérico exerce profundos efeitos biológicos quando da ligação ao seu alvo, o que torna o anticorpo quimérico um candidato importante à imunoterapia de tumores. Os resultados aqui apresentados demonstram que o L6 quimérico é capaz de se ligar a células de tumor e quando da ligação mata as células tumorais, quer por ADCC quer por CDC. Tal actividade de matar tumores foi demonstrada usando cocentrações do anticorpo L6 quimérico tão baixas como 0,01 ug/ml (10 ng/ml).

Ainda que a exploração da terapia de tumores usando anticorpos monodorsais seja atraente,tendo sido relatados algumas regressões parciais de tumores, até à data tal terapia com anticorpos monoclonais tem encontrado limitado sucesso (Houghton, Fevereiro de 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. 82:1242-1246).

A eficácia terapêutica dos anticorpos moços e monoclonais de ratinho (que são os que até agora foram o que foram tratados) parece ser demasiado baixo para o maior parte dos fins práticos. A descoberta da profunda actividade biológica do L6 quimérico acoplada à sua especificidade para um antigénio de carcinoma torna o anti. corpo L6 quimérico um agente terapêutico de elite para o tratamento de tumores in vivo.

Ainda devido às propriedades humanas que farão os anticorpos monoclonais L6 quiméricos mais resistentes à clemence in vivo, os anticorpos monoclonais L6 quiméricos serão com vantagem usados não ape nas na terapia com anticorpos quiméricos não modificados,

mas também no desenvolvimento de vários imunoconjugados com drogas, toxinas, imnunomoduladores, isótopos, etc., assim como com fins diagnósticos tais como a imagem in vivo de tumores usando anticorpos quiméricos L6 adequadamente marcados. Tais técnicas de imnuconjugação são conhecidas dos familizarizados com a matéria e podem ser usados para modificar as moléculas de anticorpo L6 quiméricas do presente invento.

Duas linhas celulares ilustrativas secretoras do anticorpo L6 quimérico foram depositadas, antes de data de pedido U.S. na ATCC, RocKolle Maryland. Estas são hibridoma transferctado c259 (corresponde às células 3E3 supra) ATCC HB 4240 e hibridoma transfectado C256 (células D7 supra) ATCC HB 9241.

(10) Expressão em levedura das cadeias L6

Prepararam-se sequências genéticas codificadoras das cadeias pesadas e leve do anticorpo L6 quimérico e introduzido em vectores. Transformaram-se células de levedura com eles e detectou-se a expressão das cadeias de anticorpo pesada e leve separadamente para o anticorpo L6.

O presente invento não deve ser limitado no seu âmbito pelas linhas celulares depositadas uma vez que o trabalho depositado pretende ser simples e ilu£ tração de um aspecto do invento e todas as linhas celulares que sejam funcionalmente equivalentes estzao dentro do âmbito do invento. De facto podem ser feitas várias modificações do invento, além das apresentadas, a partir da descrição precedente e desenhos juntos. Tais modificações pretemdem-se dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Tabela 2

Ensaios de ligação do anticorpo L6 quimérico e do anticorpo monoclonal L6 de ratinho numa linha celular positiva para o antigênio L6 e numa negativa para o antigênio L6

Anticorpo	Lote	Taxa de células	ligação para * H3347 (L6+)
GAM	GÃH
L6 padrão		56,6	4,2
L6 quimérico	a	1,3	110,3
	b	1,3	110,3
	c	1,3	110,3
		Taxa de	rv * ligaçao para
		células	HSB-2 (L6-)
		GAM	GAH
L6 Padrão		1,1	1,1
L6 Quimérico	a	1,0	1,0
	b	1,0	1,1
	c	1,0	1,1

* Todos os ensaios foram conduzidos usando uma concentração de anticorpo de 10 Mg/ml. A taxa de ligação é o número de vezes que a amostra a testar é mais brilhante do que a amostra testemunha tratada com GAM • t

(cabra-anti-ratinho conjugado com FITC) ou GAH (cabra anti-humano conjugado com FITC) sozinho. Uma taxa de 1 significa que a amostra a testar é tão brilhante como a testemunha; uma taxa de 2 significa que a amostra a testar é duas vezes mais brilhante que a testemunha etc.

Tabela 2A

Ensaios de ligação do anticorpo L6 quimérico e do anticorpo monoclonal de ratinho numa linha celular positiva para o antigénio L6 e numa negativa para o antigénio L6

Anticorpo

L6 Padrão

Concentração anticorpo (uG/ml)

Taxa de ligação para células H3347 (L6+)

GAM

GAH

L6 Quimérico (Ascites)

L6 Quimérico (Cultura celular)

108

108

105

60Tabela 2A (continuação)

	Concentração de Anticorpo	Taxa de ligação para* células HSB-2 (L6-)
	(ug/ml)	GAM	GAH
L6 Padrão	10	1	1
L6 Quimérico (Ascites)	10	1	1
L6 Quimérico (cultura celul	10 ar)	1	1

* A taxa de ligação é o número de vezes que uma amostra a testar é mais brilhante que uma amostra testemunha tratada com GAM (cabra anti-humano conjugado com FITC) sozinho. Uma taxa de 1 significa que a amostra a testar é tão brilhante como a testemunha uma taxa de 2 significa que a amostra a testar é duas vezes mais brilhante que a testemunha, etc.

* >

Tabela 3

ADCC de anticorpos L6 quiméricos e

L6 (ratinho) na linha celular de carcinoma do cólon 3347.

	Concentração de	PBL por	%
Anticorpo	Anticorpo	célula alvo	de Citólise*
	(ug/ml)
L6 Quimérico	10	100	64
	5	100	70
	10	0	2
L6 Padrão	10	100	24
	5	100	17
	10	0	2
Nenhum	0	100	1

* As células alvo foram marcadas com 51

Cr e foram expostas durante 4 horas a uma combinação de Mab e leucócitos humanos do sangue periférico (PBL) e o 51

Cr libertado foi medido subsequebtemente. A libertação 51 de Cr (após correcções dos valores de libertação expontânea em células não tratadas) é uma medida de percentagem de citólise.

* ·

Tabela 3A

ADCC anticorpos L6 quiméricos e L6 padrão (ratinho) numa linha celular de carcinoma do cólon 3347.

Anticorpos	Concentração de Anticorpos (ug/ml)	PBL por células alvo	% de citólise*
L6 Quimérico	20	100	80
(Ascites)	10	100	74
	5	100	71
	2,5	100	71
	20	0	0
L6 Quimérico	10	100	84
(cultura celul	ar) 5	100	74
	2,5	100	67
	10	0	3
L6 Padrão	20	100	32
	10	100	26
	20	0	0

* As células alvo tinham sido marca51 das com Cr e foram expostas durante 4 horas a uma combinação de Mab e leucócitos humanos do sangue periférico (PBL) e a libertação de Cr foi medida subsequentemente.

A libertação de Cr (após correcção dos valores para libertação expontânea em células não tratadas) é uma medida da percentagem de citólise

Tabela 3B

ADCC dos anticorpos L6 quiméricos e

L6 padrão (ratinho) numa linha celular de carcinoma do cólon 3347.

Anticorpo	Concentração de Anticorpo (ug/ml)	PBL por célula alvo	% de citólise
L6 Quimérico	5	100	84
(Ascites)	2,5	100	78
	1,25	100	85
	0,63	100	81
	0,31	100	80
	0,16	100	71
	0,08	100	65
	5	0	0
L6 Padrão	5	100	32
	5	0	0
Nenhum	0	100	19

* As células alvo tinham sido marcadas 51 com Cr e foram expostas durante 4 horas a uma combmaçao de Mab e leucócitos do sangue periférico humano (PBL) e a 51 libertação de Cr foi medida subsequentemente. A libertação de S^cr (após correcção dos valores de libertação expontânea em células não tratadas) é uma medida da percentagem.

Tabela 3C

ADCC dos anticorpos L6 quiméricos e L6 padrão (ratinho) numa linha celular de carcinoma do pulmão M 2669

Anticorpo	Concentração de Anticorpo (ug/ml)	PBL por célula alvo	% de citólise
L6 quimérico	10	100	35
(ascites)	1	100	31
	0,1	100	27
	0,01	100	15
	0,001	100	13
	0,0001	0	15
L6 Padrão	10	100	9
	1	100	15
Nenhum	0	100	9
L6 Quimérico	10	10	19
(Ascites)	1	10	15
	0,1	10	11
	0,01	10	13
	0,001	10	22
	0,0001	10	11
L6 Padrão	10	10	7
	1	10	6
Nenhum	0	10	8

Tabela 3C (cont.)

Concentração de	% de citólise
Anticorpo	Anticorpos (ug/ml)	PBL por célula alvo
L6 Quimérico (Ascites)	10	0	4
L6 Padrão	10	0	9

As células alvo tinham sido marca51 das com Cr e foram expostas durante 4 horas a uma combinação de Mab e leucócitos humanos de sangue periférico (PBL) e a libertação de Cr foi medida subsequentemente.

A libertação de Cr (após correcção dos valores por libertação expontânea em células não tratadas) é uma medida da percentagem de citólise.

Tabela 3D

ADCC de anticorpos L6 quiméricos e L6 padrão (ratinho) numalinha celular de carcioma do cólon H 3347.

Anticorpo	Concentração	% de citólise
Anticorpo (ug/ml)	PBL por célula alvo
L6 Quimérico	10	100	62
(Ascites)	1	100	66
	0,1	100	69
	0,01	100	26
	0,001	100	8
	0,0001	. 0	3
	10	0	0
L6 Padrão	10	100	19
	1	100	24
		0	0
Nenhum	0	100	8

* As células alcinas e alvo tinham sido marcadas com Cr e foram expostas durante 4 horas a uma combinação de Mab e leucócitos humanos do sangue peri, férico (PBL) e a libertação de Cr (após correcção dos valores para libertação expontânea em células não tratadas) é uma medida da percentagem de citólise.

Tabela 4

Efeito ci.totóxico dependente do comple mento do L6 quimérico e do L6 padrão (ratinho) em células de carcinoma do cólon da linha 3347, conforme medido pelo ensaio de libertação de Cr de 4 hr. Como fonte do complemento usou-se soro humano de um indivíduo saudável.

Anticorpo	Complemento Humano	%Citólise
L6 Padrão 10 ug/ml	Sim	90
L6 Quimérico 10 ug/ml	Sim	89
L6 Padrão 10 ug/ml	Não	0
L6 Quimérico 10 ug/ml	Não	1

Tabela 4A

Efeito citotóxico dependente do complemento dos anticorpos L6 quimérico e L6 padrão (ratinho) na linha celular de carcinoma do cólon 3347.

Anticorpo	Concentração de	% de Citólise
Anticorpo (ug/ml)	Complemento Humano
L6 Quimérico	20	+	29
(Ascites)	10	+	23
	5	+	18
	2,5	+	8
	20	Inactivado	0
	10	0	0
L6 Quimérico	20	+	29
(cultura celular) 5	+	26
	2,5	+	18
	20	+	4
	10	0	4
L6 Padrão	20	+	55
	10	+	37
	20	Inactivado	0

Nenhum * Citólise mediada pelo complemento foi medida por um ensaio de libertação de Cr de 4 horas.

Usou-se como fonte de complemento soro humano de um indivíduo saudável.

69Efeito citotóxico dependente do complemento dos anticorpos L6 quimérico e L6 padrão (ratinho) na linha celular de carcinoma do cólon 3347.

Tabela 4B

Concentração de	% de Citólise
Anticorpo	Anticorpo (ug/ml)	Complemento Humano
L6 Quimérico	10	+	209
(Ascites)	5	+	155
	2,5	+	166
	1,25	+	114
	0,6	+	63
	0,3	+	17
	10	0	0
L6 Padrão	10	+	96
	5	+	83
	2,5	+	48
	1,25	+	18
	0,6	+	7
	0,3		4
	10	0	2
Nenhum	0	+	0

* Citólise mediada pelo complemento foi medida por um ensaio de libertação de Cr de 4 horas. Usou-se como fonte de complmento soro humano de um individuo saudável.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de uma molécula de polinucleotideo, caracterizado por se incluir na referida molécula uma sequência de cDNA codificadora da região variável de uma cadeia de imnuglobulina, tendo especificidade para o antigénio ligado pelo anticorpo do murganho pela linha celular ATCC 8677.
2. 2â. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida cadeia ser uma cadeia pesada.
3. 3â. - Processo para a preparação de uma molécula, de acordo copiando a reivindicação 1, caracte rizado por a referida cadeia ser uma cadeia mais leve.
4. 4â. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se incluir ainda, na refrida molécula uma sequência adicional codificadora da região constante de uma cadeia de imunoglobulina humana estando ambas as referidas sequên cias em ligação operacional uma com a outra.
5. 5â.- Processo para a preparação de uma molécula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referidas sequência adicional ser uma sequên cia de cDNA.
6. 6§. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida sequência adicional ser uma sequência genómica.
7. 7§. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma molécula de DNA recombinante.
8. 8â. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se obter uma molécula que é uma forma de DNA de cadeia dupla.
9. 9i. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopor se obter uma molécula que é um veiculo de expressão.

   lOâ. - Processo para a preparação de uma molécula de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o referido veiculo ser um plasmideo.

   llâ,- Hospedeiro procariótico, caracte rizado por ser transformado com a molécula preparada de acordo com a reivindicação 4.
10. 12â. - Hospedeiro, de acordo com a rei^ vindicaçãoll, caracterizado por ser uma bactéria.
11. 13â. - Hospedeiro eucariótico, caracte rizado por ser transfectado com a molécula, preparada com e adacordo com a reivindicação 4.
12. 14â. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ser uma levedura ou uma célula de mamifero.
13. 15ê. - Processo para a preparação de uma cadeia pesada de imunoglubilina tendo uma região constante humana e uma região variável especificada para o antigénio ligado pelo anticorpo monoclonal de murganho secretado pela linha celular ATCC HB 8677 caracterizado por compreender:

    a cultura de um hospedeiro capaz de expressar a referida cadeia em condições de cultura e a recuperação da referida cadeia pesada a partir da referida cultura.
14. 16a. - Processo para a preparação de uma cadeia leva de imunoglobulina tendo uma região constante humana e uma região variavel com especificidade para o antigênio ligado pelo anticorpo monoclonal de murganho secretado pela linha celular ATCC HB 8677, caracterizado por compreender:

    a cultura de um hospedeiro capaz de expressar a referida cadeia nas condições de cultura; e a recuperação da referida cadeia leve a partir da referida cultura.
15. 17â. - Processo para a preparação de uma imunoglobulina quimérica contendo uma cadeia pesadza e uma cadeia leve, cada uma das referidas cadeias pesada e leve tendo uma região constante humana e uma região variável com especificidade para o antigénio ligado pelo anticorpo monoclonal de murganho secretado pela linha celular ATCC HB 8677, caracterizado por compreender:

    a cultura de um hospedeiro capaz de expressar a referida cadeia pesada ou a referida cadeia leve, ou ambas em condições de cultura; e a recuperação da referida molécula de imunoglobulina quimérica a partir da referida cultura.
16. 18a. _ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16 ou 17, caracterizado por o referido hospedeiro, ser procariótico.
17. 19â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16 ou 17 caracterizado por o referido hospedeeiro, ser eucariótico.

    I
18. 20a. - Processo para a preparação de uma molécula quimérica de anticorpo caracterizado por se incluir na referida molécula, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, compreendendo cada uma das referidas cadeias uma região constante humana e uma região variável tendo especificidade para o antigénio ligado pelo anticorpo monoclonal L6 de murganho secretado pela linha celular ATCC 8677.
19. 21â. - Processo para a preparação de um anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se obter um anticorpo numa forma detectávelmente marcada.

    225. - Processo para a preparação de um anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se obter um anticorpo imobilizado numa fase sólida insolúvel em água.
20. 23â. - Método de imunoensaio para a detecção de um antigénio capaz de ligar ao anticorpo monoclonal de murganho secretado pela linha celular ATCC 8677, numa amostra caracterizado por:

    se pôr a referida amostra em contacto com o anticorpo preparado de acordo com a reivindicação 20, e se detectar se o referido anticorpo se liga no referido antigênio.
21. 24ã. - Método de visualização in vivo ou in vitro para detectar um antigênio capaz de ligar ao anticorpo monoclonal de murganho secretado, pela linha cemlular ATCC HB 8677, caracterizado por se pôr em contacto o referido antigênio com o anticorpo marcado prepara do de acordo com a reivindicação 21, e se detectar o referi do anticorpo.
22. 25a. _ Método para matar células portadoras de um antigênio, antibeiíio esse que é capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal de murganho secretado pela linha celular ATCC, caracterizado por :

    se pôr as referidas células com o anticorpo obtido de acordo com a reivindicação 20.
23. 26^a. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a referida morte ocorrer por lise das referidas células mediada pelo complemento.

    I

    -7627â. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a referida morte ocorrer por ADCC.