JPH02501886A - ヒト腫瘍抗原に対し特異性を有するキメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍抗原に対し特異性を有するキメラ抗体本発明は、ヒト腫瘍抗原特異性の ある抗体を産生ずるための組換えＤＮＡ方法、それについてコードする遺伝子配 列、及びこのような配列を得るための方法に関する。

背景技術 ］−ラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｌｌｓｔｅｉｎ）　Ｃネーチ＋ 　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（ｏンドン）、第２５６巻、第４９５頁。

１９７５年〕によるモノクローナル抗体産生のための細胞対細胞融合の適用は、 組換えＤＮＡクローニングの発明による場合と衝撃度の点で匹敵する生物学上の 革命を引き起こした。ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体は、臨 床的及び基礎的な科学的研究において既に広く使用されている。ヒトＢ細胞ノー イブリドーマ産生モノクローナル抗体の適用は、癌、ウィルス及び微生物感染症 、抗体産生が低下するＢ細胞免疫不全症、並びに免疫系の他の疾患及び障害の治 療に関して多大な有望性を有していた。

抗体の開発に関して存在する。このことは、癌の診断及び治療用のヒト腫瘍抗原 に対するモノクローナル抗体を開発しようとした場合に特にあてはまる。これら 腫瘍抗原の多くはヒト免疫系により外来抗原として認識されず、したがってこれ らの抗原はヒトにおいて免疫原ではない。

逆に、マウスにおいて免疫原であるヒト腫瘍抗原は、ヒト抗原を特異的に認識し かつヒトの場合に治療上使用されるマウスモノクローナル抗体の産生のために用 いることができる。しかしながら、ヒトにマウス抗体のような°外来“抗体を繰 返し注射した場合には、有害な過敏反応を生じさせてしまい、しかも抗体がそれ らの標的部位に到達しえない程に循環抗体分子のクリアランス速度を高めてしま うことがある。

免疫学者が直面する他の問題は、細胞培養物中で得られる大部分のヒトモノクロ ーナル抗体が７ｇＭタイプであるということである。ＩｇＧタイプのヒトモノク ローナル抗体を得ることが望まれる場合には、しかしながら、７ｇＭタイプの抗 体を産生ずる多数の中からＩｇＧ又は他のタイプの抗体を産生ずる少数の細胞を 確認かつ単離するために細胞選別のような技術を用いることが必要であった。し たがって、既に決めた又は望ましい抗原特異性のあるいずれか所定の抗体につい て抗体クラスを切替える有効な方法に関して必要性が存在するのである。

本発明は、キメラヒト／非ヒト抗体の産生のために迅速かつ有効な方法及びそれ に基づく産物を得るために、ハイブリドーマと遺伝子工学技術との双方を結び付 けている。

本発明のキメラ抗体は、マウス−マウスハイブリドーマ由来モノクローナル抗体 及びヒトモノクローナル抗体の有利な特徴を兼ね備えている。マウスモノクロー ナル抗体のようなキメラモノクローナル抗体はヒト標的抗原を認識しかつそれと 結合しうるが、しかしながらマウスモノクローナル抗体と異なりキメラ抗体の種 特異性はインビボでヒトにおいて用いられた場合に有害な過敏反応の発現をさけ て、しかもクリアランスに対して耐性にさせうる。しかも、本発明で開示された 方法を用いれば、いかなる望ましい抗体イソタイプも具体的な抗原結合部位上に 指し向けることができる。

８注二本情報の開示は、３７Ｃ，Ｆ、　Ｒ，１，９７（ｂ）の規定に基づく。更 に、出願人らは、開示されたいかなる刊行物よりも彼らの発明が先に行われたこ とを証明するための権利を保有している。

キメラ抗体を産生ずる際の問題に対するアプローチについては、様々な著者によ って公表されている。

モリソン、　Ｓ、　Ｌ、ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンスＵＳＡ。

第８１巻、第６８５１−６８５５頁（１９８４年１１月）ＣＭｏｒｒｌｓｏｎ、 Ｓ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｌｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ＾ｃａ ｄｅａ＋ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（Ｎｏ ｖｅｍｂｅｒ　１９８４））では、所定の抗原結合特異性のあるマウス−ヒト抗 体分子の産生について開示しているが、これは組換えＤＮＡ技術を用いて公知の 抗原結合特異性のあるマウス抗体産生ミエローマ細胞系の可変領域遺伝子をヒト 免疫グロブリン不変領域遺伝子に結合させることによって産生された。ミエロー マ細胞系５１０７からのＨ鎖可変領域エキソンがヒトＩｇＧ１又はＩ　ｇＧ２Ｈ 鎖不変領域エキソンと結合され、しかも同一ミエローマからのＬ鎖可変領域エキ ソンがヒトにＬ鎖エキソンと結合されたキメラ遺伝子が組立てられた。これらの 遺伝子はミエローマ細胞系ａｎｄにトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）さ れた。その結果、キメラマウス−ヒト抗ホスホコリン抗体を産生ずる形質転換細 胞が得られた。

モリソン、Ｓ、Ｌ、らの欧州特許公開第１７３４９４号明細書（１９８６年３月 ５日付公開）では、ある種に由来する可変領域及び他種由来の不変領域を有する キメラ“レセプター”　（例えば、抗体）について開示している。遺伝子を組立 てるためにｃＤＮＡクローニングを用いると記載されているが、但しｃＤＮＡク ローニング又はブライミング（ｐｒｉｍｌｎｇ）の詳細については示されていな い（第５．７及び８頁参照）。

更に、ボーリアン、　Ｇ、　Ｌ、　（Ｂｏｕｌｌａｎｎｅ、Ｇ、Ｌ、）ら、ネー チャー、第３１２巻、第６４３頁（１９８４年１２月１３日）は、マウス可変領 域がヒト不変領域に結合された抗体を産生じた。彼らは、トリニトロフェニル（ ＴＮＰ）ハブテンに特異的なマウス可変領域についてコードするＤＮＡセグメン トがヒトμ及びに不変領域についてコードするセグメントに結合された免疫グロ ブリン遺伝子を組立てた。これらのキメラ遺伝子は機能性ＴＮＰ結合キメラＩｇ Ｍとして発現された。

ボーリアンら及びモリソンらの研究に関する論評については、マンｏ　−（Ｍｕ ｎｒｏ）　、ネーチャー、第３１２巻。

第５９７頁（１９８４年１２月１３日）；ディクソン。

ゲネティック・エンジニアリング・ニューズ、第５巻。

第３号（１９８５年３月）　［Ｄｉｃｋｓｏｎ、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ、５．　Ｎｏ、３（Ｍａｒｃｈ　１９８５）　）　；又はマ ルクス、サイエンス、第２２９巻、第４５５頁（１９８５年８月）　（Ｍａｒｘ 、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９：４５５（Ａｕｇｕｓｔ　１９８５）　）参照。

更に、ニューバーガー、　Ｍ、Ｓ、　（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、Ｓ、）ら。

ネーチャー、第３１４巻、第２６８頁（１９８５年３月２５日）では、４−ヒド ロキシ−３−ニトロフェナセチル（Ｎ　Ｐ）ハブテンに特異的なマウス可変領域 についてコードするＤＮＡセグメントがヒトε領域についてコードするセグメン トに結合されたキメラＨ鎖免疫グロブリン遺伝子を組立てた。このキメラ遺伝子 がＪ５５８Ｌ細ｉ系にトランスフェクトされた場合には、ＮＰノ１ブテンと結合 しかつヒトＩｇＥ特性を有する抗体が産生された。

更に、ニューバーガー、　Ｍ、Ｓ、らは、Ｆｃ部分が活性酵素部分〔ウィリアム ス、Ｇ、及びニューバーガー。

Ｍ、Ｓ、、ジーン、第４３巻、第３１９頁、１９８６年（Ｖｆｌｌｆａａｓ、Ｇ 、ａｎｄ　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、Ｓ、、Ｇｅｎｅ、４３：３１９．１９８Ｂ ））又はｃ−ｍｙｃ抗原決定基を示すポリペプチド（ネーチャー、第３１２巻、 第６０４頁、１９８４年）のいずれかで置き換えられたハブテン特異性抗体を分 泌する細胞系の産生について示した研究も公開している。

ニューバーガー、Ｍ、らのＰＣＴ公開ＷＯ第８６１０１５３３号明細書（１９８ ６年３月１３日付公開）ではキメラ抗体の産生について開示しく第５頁参照）、 その技術の多くの用法の中で“クラススイッチイング（ｃｌａｓｓ　ｓｗｉｔｃ ｈｉｎｇ）の概念について示唆している（第６頁参照）。

タニグチ２Ｍ、は、欧州特許公開第１７１４９６号明細書（１９８５年２月１９ 日付公開）において、実験動物由来の腫瘍特異性のある可変領域及びヒト由来の 不変領域を有するキメラ抗体の産生について開示している。

対応Ｈ及びＬ鎖遺伝子はゲノム体で産生され、哺乳動物細胞内で発現される。

タケダ、Ｓ、ら、ネーチャー、第３１４巻、第４５２頁（１９８５年４月４日） は、レトロウィルスベクターの使用により除去されたイントロン配列を有するキ メラ免疫グロブリン遺伝子の組立て可能な方法について記載していた。しかしな がら、予想外のスプライスドナ一部位がＶ領域リーダー配列の欠失を引き起こし た。したがって、このアプローチでは完全なキメラ抗体分子を得ていなかった。

キャビンー、Ｓ、（Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｓ、）ら、プロシーディング・オブ争ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第３２７３−３２７ ７頁（１９８４年６月）では、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体のＨ鎖及び／又は Ｌ鎖の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｆｃｈｌａ　ｃｏｌｌ）内合成を指示するプラスミ ドについて記載している。別のプラスミドは、大腸菌におけるＨ鎖（Ｆ　ｄ）フ ラグメントの端部欠失（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）体の発現用に組立てられた。機能 性ＣＥＡ結合活性は、Ｌ鎖と共に一部のＨ鎖の大腸菌抽出物中におけるインビト ロ再組立てにより得られた。

キャビンー、Ｓ、ら、欧州特許公開第１２５０２３号明細書（１９８４年１１月 １４日付公開）では、キメラ免疫グロブリン遺伝子、それらの推定産物及び他の 修正体について記載している。第２１．２８及び３３頁では、ｃＤＮＡクローニ ング及びプライミングについて述べている。

ボス、　Ｍ、　Ａ、　（Ｂｏｓｓ、Ｍ、Ａ、）らの欧州特許出願第１２０６９４ 号明細書（１９８４年１０月３日付公開）では、４−ニトロフェニル特異性のあ る非キメラ免疫グロブリン鎖の大腸菌内発現について示している。キメラ抗体に 関して広汎な記載があるが、但し詳しくはない（第９頁参照）。

ウッド、Ｃ，Ｒ，（νｏｏｄ、Ｃ，Ｒ，）ら、ネーチャー。

第３１４巻、第４４６頁（１９８５年４月）は、酵母内でマウス抗ＮＰ抗体タン パク質の合成を指示するプラスミドについて記載している。Ｈ鎖μ抗体タンパク 質は、酵母細胞内でグリコジル化されるようであった。Ｈ及びＬ鎖の双方が同一 細胞内で合成された場合には、酵母細胞から得られる可溶性タンパク質中の抗Ｎ Ｐ結合活性により検出されるように、一部のタンパク質は集合して機能性抗体分 子を形成していた。

アレキサングー、Ａ、ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー− オブ争すイエンスＵＳＡ、第７９巻、第３２６０−３２６４頁、１９８２年は、 １９アミノ酸リーダー続いてＶ領域の最初の１５残基を含む異常に短いヒトＩｇ γＨ鎖（ＯＭＭγ３ＨＣＤ血清タンパク質血清タンパク−ドするｃＤＮＡ配列の 産生について記載している。広範囲の内部欠失により、■の残り及び完全ＣＨｌ ドメインを除去している。これは、内部欠失分子についてコードするｃＤＮＡで ある。

ドルビー、Ｔ、Ｗ、ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−争オ ブ・サイエンスＵＳＡ。

′１ｓ７７１００００２７−６０３１頁、１９８０年は、μ及びにヒト免疫グロ ブリンポリペプチドについてコードするｃＤＮＡ配列及びそれを含む組換えプラ スミドの産生について記載している。組換えＤＮＡ分子の１つは、ＣＨ３不変領 域ドメインの一部及び完全３′非コ一ド配列に関するコドンを含んでいた。

七ノ１Ｍ、ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。

第１１巻、第７１９−７２６頁、１９８３年［５ｅｎｏ、Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１１ニア１９ −７２８（１９８３））は、ヒトＩｇＥ　Ｈ鎖（ε鎖）の可変領域の一部及び不 変領域の全部についてコードするｃＤＮＡ配列及びそれを含む組換えプラスミド の産生について記載している。

クロカワ、Ｔ、ら、前掲、第１１巻、第３０７７−３０８５頁、１９８３年では 、ヒトＩｇＥ　Ｈ鎖の不変領域についてコードする３種の発現プラスミドのｃＤ ＮＡを用いた組立て法について示している。

リー、Ｆ、Ｔ、（Ｌｌｕ、Ｐ、Ｔ、）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ。

第８１巻、第５３６９−５３７３頁（１９８４年９月）は、ヒトＩｇＥ　Ｈ鎖に おけるＣＨ２ドメインの約２／３並びにＣ３及びＣＨ４ドメインの全部について コー■ ドするｃＤＮＡ配列及びそれを含む組換えプラスミドの産生について記載してい る。

ツジモト、Ｙ、ら、ヌクレイツク・アシッズφリサーチ、Ｍ１２巻、第８４０７ −８４１４頁（１９８３年１１月）は、ｃＤＮＡ合成用のプライマー（ｐｒｌｍ ａｒ）として複製不変領域遺伝子を利用することによる、Ｉｇλ産生ヒトバーキ ットリンパ腫細胞系からのヒトＶλｃＤＮＡ配列の産生について記載している。

マーフィー、Ｊ、　（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｊ、）のＰＣＴ公開ＷＯ第８３１０３９７ １号明細書（１９８３年１１月２４日付公開）では、毒素及び細胞特異性リガン ド（これはおそらく抗体であろうと示唆されている）を含むフラグメントから構 成されるハイブリッドタンパク質について開示している。

タンら、ジャーナルーオブ・イムノロジー、第１３５巻、第８５６４頁、１９８ ５年１１月（Ｔａｎ、ｅｔ　ａｔ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉａ＋＋ｅｕｎｏｌｏｇｙ、１３５：８５６４（Ｎｏｖ ｅｍｂｅｒ　１９８５）　）は、マウスミエローマ細胞中へのトランスフェクト 後にキメラヒト−マウス免疫グロブリンゲノム遺伝子を発現させていた。

ジョーンズ、Ｐ、　Ｔ、　（Ｊｏｎｅｓ’、Ｐ、Ｔ、）ら、ネーチャー。

第３２１巻、第５５２頁（１９８６年５月）は、マウスモノクローナル抗体から の可変領域のＣＤＲドメインがヒト抗体中で対応ドメインの代わりに用いられた ゲノム構造体を組立てかつ発現させた。

サン、　Ｌ、　Ｋ、　、ハイブリドーマ−２第５巻、補巻第１号、Ｓ１７．１９ ８６年（Ｓｕｎ、Ｌ、Ｘ、ｅｔ　ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｉａ。

５．５ｕｐｐ１．１．５１７（１９８Ｂ）　）は、腫瘍特異性が存在しうるキメ ラヒト／マウス抗体について記載している。キメラＨ及びＬ鎖遺伝子はゲノム構 造体であって、咄乳動物細胞中で発現される。

サバガン（Ｓａｈａｇａｎ）ら、ジャーナル・オブ争イムノロジー、第１３７巻 、第１０６６−１０７４頁（１９８６年８月）はヒト腫瘍関連抗原に特異性のあ るキメラ抗体について記載しており、その遺伝子はゲノム配列から組立てられて いる。

この分野の最近の論評に関しては、更にモリソン、ｓ。

Ｌ、、サイエンス、第２２９巻、第１２０２−１２０７頁（１９８５年９月２０ 日）及びオーイ、　Ｖ、　Ｔ、ラ。

バイオテクニクス、第４巻、第２１４頁（１９８６年）（Ｏｌ、Ｖ、Ｔ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｂｌｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４，２１４（１９８Ｂ）　）参照。

オーイらの論文は、酵母及び／又は細菌内におけるｃＤＮＡ構造体からのキメラ 抗体の産生が必ずしも有利でないと述べていることから関連する。

更に、バイオテクノロジー、第４巻、１９８６年）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ、４（１９８Ｂ）　）の第８３５頁における論評参照。

発明の要旨 本発明は、Ｌ及びＨ鎖の遺伝子クローニング及び発現を介して、所望の可変領域 特異性及び不変領域特性のある遺伝子工学処理キメラ抗体を提供する。複製され た免疫グロブリン遺伝子産物は、遺伝子工学処理細胞内での発現により産生ずる ことができる。

様々な原核及び真核細胞内におけるオリゴデオキシヌクレオチド合成、組換えＤ ＮＡクローニング及び特異的免疫グロブリン鎖産生の適用により、ヒト腫瘍抗原 に特異性のあるキメラヒト／マウスモノクローナル抗体の大規模産生用の手段が 提供される。

本発明は、不変ヒト領域及び可変非ヒト領域を含む免疫グロブリン鎖についてコ ードするｃＤＮＡ配列を提供する。免疫グロブリン鎖はＨ又はＬのいずれかであ る。

本発明は、所望の特異性のあるｃＤＮＡ可変領域を含む免疫グロブリン鎖につい てコードする遺伝子配列を提供する。これらはヒト起源のゲノム不変領域と結合 させることができる。

本発明は、所望の原核及び真核細胞宿主内で発現しうる、プラスミドベクター等 のビヒクル中の組換えＤＮＡ分子中に存在する上記のような配列を提供する。

本発明は、培養によりキメラ抗体を産生しうる宿主及びこれら宿主の使用方法を 提供する。

本発明は、ヒト腫瘍抗原特異性のある可変領域及びヒト不変領域を有する、個々 のキメラ免疫グロブリン単鎖及び完全集合分子も提供するが、この場合双方の可 変領域とも同一の結合特異性を有している。

他の免疫グロブリン鎖及び／又は分子としては、本発明により下記のものが提供 される： （ａ）■ヒト腫瘍抗原特異性のある可変領域及びヒト不変領域を含む２本の同一 キメラＨ鎖、及び０２本の同−全（非キメラ）ヒトＬ鎖 を含んだ完全機能性免疫グロブリン分子；（ｂ）■示されたような可変領域及び ヒト不変領域を含む２本の同一キメラＨ鎖、及び ■２本の同−全（非キメラ）非ヒトＬ鎖を含んだ完全機能性免疫グロブリン分子 ；（ｃ）■示されたような可変領域及びヒト不変領域を含む２本の同一キメラＨ 鎖、及び ■１本のみがＨ鎖の可変領域と同様の特異性を有する、２本の異なるＬ鎖（得ら れた抗体分子はその一端のみと結合し、したがって二価結合することができない ） を含んだ一価抗体、即ち完全機能性免疫グロブリン分子。

キメラ鎖又は非キメラ鎖の前記組合せについてコードする遺伝子配列、特にｃＤ ＮＡ配列も、本発明で提供される。

本発明は、免疫グロブリン鎖とは異なるポリペプチド（例えば、酵素）について コードする配列に作動可能に結合された、抗体分子Ｈ及び／又はＬ鎖の所望の特 異性のある可変領域についてコードする遺伝子配列、特にｃＤＮＡ配列も提供す る。これらの配列は、本発明の方法により集合されかつ発現せしめられて、混合 機能性分子を産生ずる。

ｃＤＮＡ配列の使用は、ｃＤＮＡ配列が適切なＲＮＡスプライシング系を欠く細 菌又は他の宿主内で発現されうるという点で、（イントロンを含む）ゲノム配列 よりも特に有利である。

図面の簡単な説明 第１図は、免疫グロブリンμ及びγＨ鎖遺伝子のＤＮＡ再配列及び発現について 示している。これはヒトＨ鎖遺伝子複合体の概略図であるが、等尺度で示されて いない。Ｈ鎖可変Ｖ領域形成は、ＶＤ及びＪＨ遺伝Ｈゝ 子セグメントの適切な結合を介している。これは活性μ遺伝子を生じる。“クラ ススイッチングと呼ばれる別種のＤＮＡ再配列で、μ不変Ｃ領域の隣接部から他 のＨ鎖Ｃ領域の隣接部に結合ＶＤ及びＪＨ領領域置換えＨゝ る（γへのスイッチングがここでは図示されている）。

第２図は、ヒト及びマウスＪ領域の公知ヌクレオチド配列について示している。

Ｊ領域に関するコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は、実際の配列の下に 示されている。

マウスにＪ領域コンセンサス配列の下のオリゴヌクレオチド配列は、ユニバーサ ルやイムノグロブリン・ジーン（Ｌｌｎ！ｖｅｒｓａｌ　Ｉｍｓｕｎｏｇｌｏｂ ｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ）　（Ｕ　Ｉ　Ｇ）オリゴヌクレオチドである。各免疫グロ ブリン遺伝子座中には、特に不変領域近くで、各々保存された配列のあるＪ領域 がわずかしかないことに留意せよ。

第３図は、マウスＪ領域のヌクレオチド配列について示している。オリゴヌクレ オチドブライマーＤＩＧ−Ｈ及びＵＩＧ−Ｋがその下に示されている。各々制限 酵素部位を含むことに留意せよ。それらは、ｍＲＮＡ可変領域に相補的なｃＤＮ Ａ合成用のプライマーとして使用することができ、インビトロで複製ｃＤＮＡを 突然変異させるためにも使用可能である。

第４図はヒト不変ドメインモジュールについて示している。ヒトＣＩ１クローン ｐＧＭＨ６は、細胞系ＧＭ２１４６から単離された。そのＪＨ−ＣＨ１結合部の 配列が示されている。２つの制限酵素部位は、ＣＨ１遺伝子を異なるｖＨ遺伝子 と再結合させる際のジヨイントとして有用である。ＢｓｔＥＩＩ部位はＪＨ領領 域存在するが、マウス−ヒトキメラＨ鎖免疫グロブリンの前組立て時に使用され る。Ａｐａｌはヒトγ１のＣＨｌコードドメイン中への１６ヌクレオチド残基で あり、本出願で記載された組立て時に使用される。

ヒトＣＫクローンｐ　ＧＭＬ　６０は２種のＣＤＮＡクローン、即ち１つはＧＭ １５００　（ｐＫ２−３）から単離されたクローン、他はＧＭ２１４６　（ｐＧ ＭＬｌ）から単離されたクローンの混合体である。示されたＪＫ−ＣＫ結合配列 は、ｐＫ２−３に由来する。オリゴヌクレオチドＪ　Ｋ　Ｈｉｎ　ｄ　ｍを用い るインビトロ突然変異誘発は、Ｊ−Ｃ結合部の５゛側におけるＨｉｎｄＩ［Ｉ部 位１４ヌクレオチド残基を工学処理するために行われた。これはヒトＧＴＧコド ンをＣＴＴコドンに変化させる。

第５図は、Ｌ　６　Ｖ　ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンｐＨ３−６ａのＶ領域のヌ クレオチド配列を示している。配列は、遺伝子フラグメントのＭ１３サブクロー ンを用いるジデオキシターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ ｎ）法により決定された（以下参照）。白丸は、ペプチド配列により確認された アミノ酸残基を示している。ＣＤＲ３領域中のＤＳＰ、２と相同的な配列には下 線が引かれている。

第６図は、Ｌ　６　Ｖ　Ｋ　ＣＤ　Ｎ　ＡクローンｐＬ３−１２ａのＶ領域のヌ クレオチド配列を示している。特定部位突然変異誘発に用いられたオリゴヌクレ オチドブライマーは、ＪＫ５セグメントの下に示されている。白丸は、ペプチド 配列により確認されたアミノ酸残基を示している。

第７図は、キメラＬ６−ＶＨ＋ヒトＣγ１発現プラスミドの組立て法について示 している。パネル（ａ）は、ＢＡＬ　−３１欠失クロ一ンＭ１３ｍｐ１９−ＣＩ −δ４（Ｃ１−６４）及びＭ１３ｍｐ１９−ＣＩ−６２１（Ｃ１−６２１）の配 列について示している。ｃ　ＤＮＡクローンりＨ３−６ａの５゛末端は矢印で示 されている。

Ｍ１３配列には下線が引かれている。この実験で用いられたオリゴヌクレオチド ブライマーはＲ３−６ａ（５’−ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧ−３°）であ って、これは成熟Ｎ末端近くのＦＲＩでブライミングする。パネル（ｂ）は、各 々３１量体オリゴヌクレオチドＭＪＨ２−Ａｐａ１２０ｎｇとアニーリングされ たクローンＣ１−６４及びＣ１−６２１１μｇの特定部位突然変異誘発法につい て示している。ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントでの相補鎖合成は、 室温で３０分間、しかる後１５℃で７２時間であった。トタンスフェクトされた ファージプラークはニトロセルロースに吸着され、ＮａＯＨで固定され、４ｘＴ ＢＳ　（０，６Ｍ　ＮａＣ１，０，０４ＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、０ ．００４Ｍ　ＥＤＴＡ）＋１０％硫酸デキストラン中６５℃で１８時間かけて３ ２ｐ標識ＭＪＨ２−Ａｐａｌオリゴヌクレオチドとハイブリッド化された。フィ ルターの最終洗浄は、６５℃で４ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより１５分間で あった〔マニアティス、Ｔ、ら、モレキュラー争クローニングニラボラトリー− ｖニニアル、１９８２年（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８２））。

陽性プラークはコダック（Ｋｏｄａｋ）　ＸＡＲフィルムへの一夜露出により検 出され、増殖及びＲＦ　ＤＮＡの制限酵素分析用に直接選別された。マウスＣＨ １に対するＭＪＨ２−Ａｐａｌルミｌオリゴヌクレオチドマツチ（ｌｉＳｌａｔ ｃｈ）が示され、オリゴヌクレオチドの下に示されたコード変更が生じた。パネ ル（Ｃ）は、ｐＩＮＧ２１１１及びｐＩＮＧ２１１２を産生ずるために、キメラ 発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２の常在Ｖａの代わりに各々変異Ｌ６−ＶＨモジ ュールを置換える方法について示している。

第８図は、キメラし６発現プラスミド ルｌＮＧ２１１９の組立てについて示している。

ｐＩＮＧ２１００からのＳａｉｌ−ＢａｍＨＩフラグメントは、ｐＩＮＧ２０１ ２Ｅからの５ａｌＩ〜ＢａｍＨＩ　Ａフラグメントと同一である。

第９図は、Ｌ鎖及びＨ＋Ｌ鎖発現プラスミドを組立てる場合におけるＶＫ遺伝子 の修正及びその用法について示している。

（ａ）Ｌ６のｖＫの５′側におけるオリゴｄ　（ＧＣ）セグメントの欠失。オリ ゴヌクレオチドは２２量体であって、Ｓａｉｌ部位を含んでいる。３つのミスマ ツチが示されている。突然変異誘発後のＶＫ遺伝子は、Ｓａ　ｌ　ｌ−Ｈｌｎｄ Ｉ［ＩフラグメントとしてヒトＣＫモジュールに結合されている。その結果形成 された発現プラスミドは、Ｉ］ｌＮＧ２１１９である。

（ｂ）Ｈ＋Ｌ鎖発現プラスミドｐｌＮＧ２１１４゜発現プラスミドｐｌＮＧ２１ １４は、ｐＩＮＧ２１１１からのＬ６Ｈ鎖キメラ遺伝子及びｐｌＮＧ２１１９か らのキメラＬ鎖を含んでいる（太線）。

第１０図は、Ｌ６キメラ抗体発現プラスミドの組立てに際して行われる配列変更 の要旨について示している。

５′非翻訳領域における下線部分残基は、複製されたマウスに及びＨ鎖遺伝子に 由来する。Ｖ／Ｃ境界部において丸で囲まれた残基は、この領域で制限酵素部位 を工学処理するだめの突然変異誘発操作から生じている。

Ｌ６Ｈ鎖キメラ中小丸で示された残基も突然変異誘発により生じている。それら はサイレント変化である。

一般に、抗体は２本のし及び２本のＨ鎖骨子がら構成されている。Ｌ及びＨ鎖は 、構造及び機能相同性のドメインに分けられる。Ｌ　（Ｖ、）及びＨ（ｖＨ）鎖 双方の可変ドメインは、認識性及び特異性を決定している。

Ｌ（ＣＬ）及びＨ（ＣＨ）鎖双方の不変領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、胎 盤移動性、補体結合性等のような重要な生物学的性質を示す。

一連の複合化現象により、Ｂ細胞中で免疫グロブリン遺伝子を発現させる。抗原 特異性及び結合性を示すＶ領域遺伝子配列は、Ｖ　Ｈ−Ｄ及びＪＨ；又はＶ、及 びＪ。

と呼ばれる異なる生殖系（ｇｅｒｍ　１ｉｎｅ）遺伝子セグメント中に存在して いる。これらの遺伝子セグメントはＤＮＡ再配列により結合されて、Ｈ及びＬ鎖 で各々発現される完全Ｖ領域を形成する（第１図）。その場合に、再配列され結 合された（Ｖ、−ＪＬ及びＶＨ−Ｄ−ＪＨ）Ｖセグメントは、Ｌ及びＨ鎖の完全 可変領域又は抗原結合ドメインについてコードしている。

定義 ある語句は明細書及び請求の範囲において用いられている。下記定義は明確化及 、び一貫性のために示されている。

１、発現ベクター：ベクター中に挿入された、いずれかの遺伝子配列に由来する ｍＲＮＡの合成のために必要な調節シグナルを含んだプラスミドＤＮＡ。

２、モジュールベクター：不変又は可変領域遺伝子モジュールを含んだプラスミ ドＤＮＡ０ ３、発現プラスミド：キメラ免疫グロブリン遺伝子のような挿入遺伝子を含んだ 発現ベクター。

４、遺伝子クローニング：遺伝子の合成、ＤＮＡベクター中への挿入、ハイブリ ッド化による確認、配列分析等。

５、トランスフェクション：唾乳動物細胞中へのＤＮＡの移入。

遺伝プロセス及び産物 本発明は、ヒト腫瘍抗原に特異性のあるヒト／マウスキメラ抗体のクローニング 及び産生のための新規アプローチを提供する。抗原は、キャンサー・リサーチ。

第４６巻、第３９１７−３９２３頁、１９８６年（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、４６：３９１７−３９２３（１９８Ｂ））及びプロシーディング・オブφ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第７０５９−７ ０６３頁（１９８６年）で記載されたモノクローナル抗体により結合されるもの である。このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、１９８４年１２ 月６日付でメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー０コレ クシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ）に受理ＮαＮＢ８６７７として寄託された。

産生方法は下記５つの要素を結合させている：（１）モノクローナル抗体を産生 するマウスＢ細胞ハイブリドーマ系からのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ） の単離、それからのクローニング及びｃＤＮＡ産生；（２）ハイブリドーマ細胞 系由来し及びＨ鎖ｍＲＮＡ中の可変領域遺伝子セグメントのクローニング用のプ ライマー及び／又はプローブとして有用なユニノく−サル・イムノグロブリン− ジーン（Ｕ　Ｉ　Ｇ）オリゴヌクレオチドの産生、及びそれからのｃＤＮＡ産生 ；（３）ｃＤＮＡ産生及びクローニング、又はゲノム遺伝子産生及びクローニン グによる不変領域遺伝子セグメントモジュールの産生： （４）複製されたヒト不変領域遺伝子セグメントモジュールへの上記（２）で複 製された特異的免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの結合による完全Ｈ又 はＬ鎖コード配列の組立て； （５）インビトロでの抗体分子の分離醗酵としかる後のアセンブリー、又は同一 細胞中での双方の鎖の産生のいずれかにより、原核及び真核細胞を含む選択され た宿主内におけるし及びＨ鎖の発現及び産生。

すべての免疫グロブリンＬ及びＨ鎖遺伝子並びにコードされたメツセンジャーＲ ＮＡにおいて共通した１つの特徴は、いわゆるＪ領域（即ち、結合領域、第１図 参照）である。Ｈ及びＬ鎖Ｊ領域は異なる配列を有しているが、但し高度の配列 相同性（８０％以上）がＨＪＨ領域又はにＬ鎖Ｊ領域内の特に不変領域近くで存 在している。この相同性は本発明で活用されており、Ｌ及びＨ鎖Ｊ領域のコンセ ンサス配列は免疫グロブリンＬ又はＨ鎖ｍＲＮＡ又は遺伝子をクローニングする ためのプライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド（Ｕ　Ｉ　 Ｇとして本明細書では示されている）をデザインするために用いられた（第３図 ）。具体的ＵＩＧの配列に応じて、それは単一特異性Ｊ配列を含むすべての免疫 グロブリンｍＲＮＡ又は遺伝子とハイブリッド化することができるであろう。具 体的ＵＩＧプローブの他の有用性は、すべてのマウスＪＫ含有配列（第２図）を 検出するＵＩＧ−ＭＪＫのような特異的不変領域のＬ鎖又はＨ鎖ｍＲＮＡとのハ イブリッド化である。ＵＩＧのデザインとしては、免疫グロブリン遺伝子のｃＤ ＮＡコピー中に制限酵素部位を導入するための配列もある（第３図参照）。本発 明では、例えば、免疫グロブリンｍ　ＲＮ　Ａ内の修正■領域のクローニング用 のＵＩＧプローブを産生するために化学的遺伝子合成を利用してもよい。他方、 オリゴヌクレオチドは、免疫グロブリンｍＲＮＡ中に存在する具体的Ｊ領域を確 認する際の診断補助物としてＪ領域の保存が少ない５゛領域を個々に認識するた めに合成することができる。

一方、オリゴヌクレオチドは、１ｇｍＲＮＡ中に存在する具体的Ｊ領域を確認す る際の診断補助物としてＪ領域の保存が少ない５゛領域を個々に認識するために 合成することができる。

多段階操作は、ハイブリドーマ細胞り及びＨ鎖ｍ　ＲＮ　Ａから完全Ｖ＋Ｃ領域 ｃＤＮＡクローンを産生ずるために用いられる。最初に、オリゴｄＴ−ブライミ ング処理ｃＤＮＡの相補鎖が合成され、この二重鎖ｃＤＮＡがｐＢＲ３２２のよ うに適切なｃＤＮＡクローニングベクターでクローニングされる〔ガブラー及び ホフマン、ジーン、第２５巻、第２６３頁、１９８３年（Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ 　Ｈｏｆ’ｆｉａｎ、Ｇｅｎｅ、２５：２８３（１９８３）））　ｏクローンは ＵＩＧオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド化によりスクリーニングさ れる。このスクリーニング操作により確認される陽性Ｈ及びＬ鎖りローンは、■ 領域及びリーダーコード配列を含んだものを選択するために地図化されかつ配列 決定される。次いで、例えばＵＩＧオリゴヌクレオチドの使用を含むインビトロ 突然変異誘導が、所望の制限酵素開裂部位を工学処理するために行われる。

もう１つの方法は、ｃＤＮＡ合成用のプライマーとして合成ＵＩＧオリゴヌクレ オチドを用いることである。

第二に、ｃＤＮＡ不変領域モジュールベクターはヒト細胞から得られる。これら のｃＤＮＡクローンは、必要であれば、ヒト配列中の同様の位置に又は不変領域 の境界近くの他の所望の位置に制限部位を入れるために特定部位突然変異誘発に より修正される。もう１つの方法では、Ｃ領域モジュールベクター源としてゲノ ムＣ領域クローンを利用する。

第三に、上記のようにして得られる複製されたＶ領域セグメントは切り出され、 Ｌ又はＨ鎖Ｃ領域モジュールベクターに結合される。例えば、あるものは完全ヒ トにＬ鎖Ｃ領域及び完全ヒトγ□Ｃ領域を複製しうる。更に、あるものは、終結 コドンを導入しもってＦａｂ分子のＨ鎖部分についてコードする遺伝子配列を得 るために、ヒトγ□領域を修正しうる。

次いで、機能的に結合されたＶ及びＣ領域を有するコード配列は、適切な原核又 は真核宿主内での発現のために適切な発現ビヒクル中に移される。“機能的に結 合された２とは、トリブレット読取り枠の変更又は妨害なしに連続翻訳可能な遺 伝子配列を誘導しうるようにコード配列が枠内で結合されていることを意味する 。

本発明でｃＤＮＡ遺伝子配列を用いた場合の１つの具体的な利点は、それらがＨ 又はしいずれかの免疫グロブリン鎖に関して連続的にコードしているという事実 である。“連続的′とは、配列がイントロンを含んでいない（即ち、逆転写によ りｍ　ＲＮ　Ａから誘導されることから、ゲノム配列ではなく、むしろ隣接エキ ソンどうしの配列である）ことを意味する。本発明で得られるＣＤＮＡ配列のこ の特徴によって、細菌のような原核宿主又は酵母のようなより下等の真核宿主内 でそれらを発現させることができるのである。

ｃＤＮＡクローニング方法のもう１つの利点は、可変領域遺伝子モジュールを得 ることが容易かつ簡単であることである。

“不変”及び“可変”という用語は、天然非キメラ抗体内の可変及び不変領域に より保持される性質及び特徴についてコードするＨ又はＬ鎖いずれかの免疫グロ ブリン鎖のそのような領域を表すために機能的に用いられる。

前記のように、機能的に作動する領域が存在かつ利用可能である限り、存在すべ き可変又は不変領域に関する完全コード領域は不要である。

発現ビヒクルとしては、プラスミド又は他のベクターがある。これらの中では、 適切な付着端をもついずれの可変Ｈ又はＬ鎖配列も容易に内部に挿入されうるよ うに工学処理された適切な制限部位を有する機能的に完全なヒト不変Ｈ又はＬ鎖 配列を保育したビヒクルが好ましい。

したがって、ヒト不変Ｈ又はＬ鎖配列含有ビヒクルは本発明の重要な態様である 。これらのビヒクルは、あらゆる適切な宿主内におけるあらゆる所望の完全Ｈ又 はＬ鎖の発現用の中間体として使用することができる。

１つの好ましい宿主は酵母である。酵母は免疫グロブリンＬ及びＨ鎖の産生にと って実質的な利点を付与する。

酵母は、グリコジル化を含めた翻訳後ペプチド修正を行うのである。現在、酵母 内での所望のタンパク質の明白な産生のために使用可能な高コピー数プラスミド 及び強プロモーター配列を利用したいくつかの組換えＤＮＡ方法が存在する。酵 母は複製された唾乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識して、リーダー配列 含有ペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する〔ヒラマン（）Ｉｉｔｚｍａｎ ）ら、酵母、遺伝学及び分子生物学国際会議、モントビーリア、フランス、１９ ８２年９月１３−１７日〕。

酵母遺伝子発現系は、Ｈ及びＬ鎖産生、タンパク質安定性並びに分泌のレベルに 関してルーチン的に評価することができる。酵母がグルコースに富む培地中で増 殖された場合に多量に産生される解糖酵素に関してコードする活性発現遺伝子か らのプロモーター及び終結要素を組込んだいずれの一連の酵母遺伝子発現系も、 利用することができる。公知の解糖遺伝子は、非常に有効な転写コントロールシ グナルも供することができる。例えば、イソ−１−チトクロームＣ（ＣＹＣ−１ ）遺伝子のプロモーター及びターミネータ−シグナルも利用可能である。

下記アプローチは、酵母内での複製免疫グロブリンｃＤＮＡ発現用の最適発現プ ラスミドを評価するために採用することができる。

（１）■及びＣ領域結合複製免疫グロブリンＤＮＡが異なる転写プロモーター及 びターミネータ−ＤＮＡフラグメントに結合される； （２）キメラ遺伝子は酵母プラスミド上に置かれる〔例えば、ブローチ、Ｊ、　 Ｒ，、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１０１巻、第３０７頁１編集者ウ ー。

Ｒ１ら、１９８３年（Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚ） ａｌｏ１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、１０１：３０７．ｅｄ、Ｗｕ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、１ ９８３）参照〕　；（３）酵母リーダーペプチドのような付加遺伝子ユニットが 、抗体分泌を得るために免疫グロブリンＤＮＡ構造体上に組込むこともできる； （４）一部の配列、しばしば遺伝子配列の最初の６〜２０コドンが、好ましい酵 母コドン用法を示すように修正することもできる； （５）キメラ遺伝子は、酵母染色体への組込み用に用いられるプラスミド上に置 かれる。

下記アプローチは、酵母内でＬ及びＨ鎖遺伝子の双方を同時に発現させるために 採用することができる。

（１）Ｌ及びＨ鎖遺伝子は、酵母プロモーター及びターミネータ−配列に各々結 合され、同一プラスミド上に置かれる。このプラスミドは、酵母内での自律的複 製又は酵母染色体中の特定位置への組込みのいずれかのためにデザインすること ができる； （２）Ｌ及びＨ鎖遺伝子は、異なる選択マーカーを含む別々のプラスミド上の酵 母プロモーター及びターミネータ−配列に各々結合される。例えば、Ｌ鎖遺伝子 は選択マーカーとしてｔ　ｒｐｌ遺伝子を含むプラスミド上に置かれ、一方Ｈ鎖 遺伝子は選択マーカーとしてＵｒａ３を含むプラスミド上に置かれる。プラスミ ドは、酵母内での自律的複製又は酵母染色体中の特定位置への組込みのいずれか のためにデザインすることができる。双方の選択マーカーを欠く酵母株は、Ｌ鎖 遺伝子を含むプラスミド及びＨ鎖遺伝子を含むプラスミドで同時又は連続的のい ずれかで形質転換される； （３）Ｌ及びＨ鎖遺伝子は、上記（２）で記載のように異なる選択マーカーを各 々含む別々のプラスミド上の酵母プロモーター及びターミネータ−配列に各々結 合される。Ｌ及びＨ鎖発現プラスミド上に存在する選択マーカー（上記鋼中のｔ ｒｐｌ及びＵｒａ３）を欠く酵母接合型“ａ″株は、２種の選択マーカーの一方 （上記鋼中のｔｒｐｌ）についての選択によりＬ鎖遺伝子を含むプラスミドで形 質転換される。“ａ′株と同様の選択マーカー（即ち、例としてｔ　ｒｐｌ及び ｕ　ｒ　ａ　３）を欠く酵母接合型“α”株は、代わりの選択マーカー（即ち、 上記鋼中のｕ　ｒ　ａ　３）についての選択によりＨ鎖遺伝子を含むプラスミド で形質転換される。Ｌ鎖プラスミドを含む“ａ′株（表現型二上記鋼中のＴｒｐ ”Ｕｒａ−）及びＨ鎖プラスミドを含む株（表現型二上記鋼中のＴｒｐ　Ｕｒａ ”）は接合され、上記選択マーカーの双方に関して原栄養性である（上記鋼中の ＋ Ｔｒｐ　Ｕｒａ＋）二倍体が選択される。

形質転換宿主として利用可能な細菌宿主の中では、大腸菌に１２株２９４　（Ａ ＴＣＣ３１４４６）が特に有用である。使用可能な他の微生物株としては、大腸 菌Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）がある。前記株、並びに大腸菌Ｗ３１１ ０　（ＡＴＣＣ２７３２５）及びサルモネラ・チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ　ｔｙｐｈｉａｕｒｉｕｍ）もしくはセラチア−フルセラセンス（Ｓｅｒ ｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような他の腸内細菌、及び様々なシュー ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種も使用可能である。

一般に、宿主細胞と適合的な種由来のレプリコン及びコントロール配列を含むプ ラスミドベクターは、これらの宿主に関して使用される。ベクターは通常、複製 部位並びに形質転換細胞中で表現型選択しうる特定遺伝子を有している。例えば 、大腸菌は大腸菌種由来プラスミドｐＢＲ３２２を用いて容易に形質転換される 〔ポリバー（Ｂｏｌｌｖａｒ）ら、ジーン、第２巻、第９５頁、１９７７年〕。

ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含んで おり、したがって形質転換細胞を確認しうる容易な手段を与える。ｐＢＲ３２２ プラスミド又は他の微生物プラスミドは、それ自体のタンパク質の発現のために 微生物により利用されつるプロモーターを含んでいるか又は含むように修正され ねばならない。

組換えＤＮＡ組立てで最も一般的に用いられるプロモーターとしては、β−ラク タマーゼ（ベニシリナーゼ）及びラクトース（β−ガラクトシダーゼ）プロモー ター系〔チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、ネーチャー、第２７５巻。

第６１５頁、１９７８年；イタクラら、サイエンス。

第１９８巻、第１０５６頁、１９７７年〕並びにトリプトファンプロモーター系 〔ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第８巻、 第４０５７頁。

１９８０年、ＥＰＯ公開公開第３６７婦６これらは最も一般的に用いられるが、 他の微生物プロモーターも開示されかつ利用されていた。

例えば、いかなるＨ又はＬキメラ免疫グロブリン鎖用の遺伝子構造体も、バクテ リオファージλ（ＰＬ）の左方プロモーターの制御下に置くことができる。この プロモーターは制御可能な最強の公知プロモーターの１つである。コントロール はλリプレッサーにより行使されるが、隣接制限部位は公知である。

免疫グロブリン鎖配列の発現も、非形質転換状態で生物と“相同性゛である他の レギュレーター配列の制御下に置くことができる。例えば、ラクトース依存性大 腸菌染色体ＤＮＡは、酵素β−ガラクトシダーゼ合成によりラクトース消化を媒 介するラフロース又はｌａｃオペロンを含んでいる。ｌａｃコントロール要素は 、大腸菌に感染しやすいバクテリオファージλｐＬＡＣ５がら得られる。ｌａｃ プロモーター−オペレーター系はＩ　ＰＴＧにより誘導することができる。

他のプロモーター／オペレーター系又はその部分も同様に使用可能である。例え ば、アラビノース、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカルホスファターゼ、ト リプトファン、キシロース、ｔａｃ等も使用可能である。

他の好ましい宿主は、組織培養中インビトロで又は動物中インビボで増殖される 哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、リーダーペプチド除去、Ｈ及びＬ鎖の正 確な折りたたみ及びアセンブリー、正確な部位における適切なグリコジル化、並 びに機能性抗体タンパク質の分泌を含めて、免疫グロブリンタンパク質分子に翻 訳後修正を加えることができる。

抗体タンパク質産生用の宿主として有用な哺乳動物細胞としては、ハイブリドー マＳｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）もしくはミエローマＰ３ Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ　ＴｉＢ２）及びその誘導体のようなリンパ源の細胞が ある。他には、Ｖｅｒ。

（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ８１）又はＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＲＬ６１）のような 繊維芽細胞源の細胞がある。

数種の可能なベクター系が、哺乳動物細胞内における複製されたＨ及びＬ鎖遺伝 子の発現用として利用可能である。１つのクラスのベクターは、宿主細胞ゲノム 中への望ましい遺伝子配列の組込みに依存している。安定的に組込まれたＤＮＡ を有する細胞は、大腸菌ｇｐｔ（マリガン、Ｒ，　Ｃ．　（Ｍｕｌｌｌｇａｎ． Ｒ．Ｃ．）及びバーブ，Ｐ。

（Ｂｅｒｇ．Ｐ．）　、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンスＵＳＡ，第７８巻。

第２０７２頁，１９８１年〕又はＴｎ５ｎｅｏ　（サウザーン，Ｐ．Ｊ．及びバ ーグ．Ｐ．，ジャーデル・オブ・モル・アプリ・ゲネテ，第１巻．第３２７頁， １９８２年（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ．Ｐ．Ｊ．ａｎｄ　Ｂｅｒｇ．Ｐ．、Ｊ．Ｍｏ１ ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．。

１：３２７（１９８２）））のような薬物耐性遺伝子を同時に導入することによ って選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮ Ａ遺伝子配列に結合されるか、又は同時トランスフェクトにより同一細胞中に導 入される〔ウィグラー、Ｍ．ら、セル、第１６巻。

第７７頁，１９７９年（Ｖｌｇｌｅｒ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ｃｅｌｌ，１６：７７ （１９７９））　）。第二のクラスのベクターでは、染色体外プラスミドに自律 的複製能を付与しうるＤＮＡ要素を利用している。これらのベクターは、ウシパ ピローマウィルス〔サーバー、　Ｎ，　（Ｓａｒｖｅｒ．Ｎ．）ら、プロシーデ ィング・オブ・ナショナル−アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻， 第７１４７頁．１９８２年〕、ポリオーマウィルス〔ディーンズ，　Ｒ．　Ｊ． 　（Ｄｅａｎｓ．Ｒ．Ｊ．）ら。

プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ， 第８１巻，第１２９２頁。

１９８４年〕又はＳＶ４０ウィルス〔ラスキー、Ｍ。

（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．）及びボッチャン、　Ｍ．　（Ｂｏｔｃｈａｎ．Ｍ．）、ネ ーチャー，第２９３巻，第７９頁．１９８１年〕のような動物ウィルスから得る ことができる。

免疫グロブリンｃＤＮＡは抗体タンパク質についてコードする成熟ｍＲＮＡを発 現する配列のみから構成されているため、遺伝子の転写及びＲＮＡのプロセッシ ングを調節する付加遺伝子発現要素が免疫グロブリンｍＲＮＡの合成のために必 要である。これらの要素としては、スプライスシグナル、誘導プロモーター等の 転写プロモーター、エンハンサ−及び終結シグナルがある。

このような要素を組込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、オカヤマ，Ｈ９及び バーグ，Ｐ．８モル・セル・ノくイオル．第３巻，第２８０頁，１９８３年（Ｏ ｋａｙａｉ＋ａ，Ｈ。

ａｎｄ　Ｂｅｒｇ．Ｐ．、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｌｏｌ．、３：２８０（１９８ ３））　；セブコ。

Ｃ．　Ｌ．　（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．）、セル、第３７巻，第１０５３頁。

プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ， 第８２巻．第６８９頁。

１９８５年で記載されたものがある。

宿主としての哺乳動物細胞の他の利点は、ゲノム配列に由来するキメラ免死　グ ロブリン遺伝子を発現しうるそれらの能力である。−の結果、哺乳動物細胞は、 ゲノム配列から全部又は一部構成される可変領域ｃＤＮＡモジュール＋不変領域 からなるキメラ免疫グロブリン遺伝子を発現する。数種のヒト不変領域ゲノムク ローンが既に開示されている〔エリソン、Ｊ、Ｗ、ら、ヌクレイツク・アシッズ ・リサーチ、第１０巻、第４０７１頁。

１９８２年（Ｅｌｌｊｓｏｎ、Ｊ、Ｗ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ １ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　１０：４０７１（１９８２））又はマックス、Ｅ、 　（Ｍａｘ、Ｅ、）。

セル、第２９巻、第６９１頁、１９８２年〕。このようなゲノム配列の使用は、 不変領域遺伝子セグメントと一緒の免疫グロブリンエンハンサ−、スプライスシ グナル及び転写終結シグナルの同時導入のために便利であろう。

異なるアプローチに従い、完全Ｈ２Ｌ　２抗体を得ることもできる。

最初に、Ｌ及びＨ鎖を別々に発現させ、しかる後精製されたし及びＨ鎖をインビ トロで完全Ｈ２Ｌ２１ｇＧ抗体に集合させることができる。細胞内完全Ｈ２Ｌ２ 工ｇＧ分子産主に用いられるアセンブリー経路は詳しく研究されている〔例えば 、シャルフ、Ｍ、、バービー・レクチャーズ、第６９巻、第１２５頁。

１９７４年（Ｓｃｈａｒｒｆ、Ｍ、、Ｈａｒｖｅｙ　Ｌｅｃｔｕｒｅｓ、６９： １２５（１９７４））参照〕。還元単離されたし及びＨ鎖からのＩｇＧ抗体形成 に関するインビトロ反応パラメーターは、ベイチョク。

Ｓ、、免疫グロブリン合成細胞、アカデミツク・プレス。

ニューヨーク、第６９頁、１９７９年（Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｓ、　。

Ｃｅ１ｌｓ　ｏｆ’　１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ ｃａｄｅｉｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐａｇｅ　８９．１９７９）　で規定されている。

第二に、完全Ｈ２Ｌ２ＩｇＧ抗体としてのＨ及びＬ鎖の細胞内会合及び結合を実 現するために、同一細胞内でＬ及びＨ鎖を同時発現させることも可能である。同 時発現は、同−宿主内で同−又は異なるいずれかのプラスミドを用いることによ り生じうる。

ポリペプチド産物 本発明は、Ｈ又はＬ鎖いずれかの“キメラ”免疫グロブリン鎖を提供する。゛キ メラ鎖は、天然ヒト免疫グロブリン中に存在する場合と実質的に同様の不変領域 、及び本発明の、即ち所定のヒト腫瘍抗原に対する所望の抗原特異性を有する可 変領域を含んでいる。

本発明は、分子全体がいずれかの望ましい結合及び認識性を示すように会合され たＨ又はＬ鎖を有する免疫グロブリン分子も提供する。様々なタイプの免疫グロ ブリン分子が提供される：キメラＨ鎖及び非キメラし鎖を有する一価、二価分子 、又は望ましい機能をもつ分子に結合された本発明者らの可変結合ドメインを有 する分子。

同−又は異なる可変領域結合特異性のあるキメラＨ鎖及び非キメラ（即ち、全ヒ ト又は全非ヒト）Ｌ鎖を有する抗体は、所要のポリペプチド鎖の適切な会合によ って得ることができる。これらの鎖は、本発明のモジュラ−アセンブリー法によ って個々に得られる。

用途 ヒト不変領域を有する本発明の抗体は、血清病又はアナフィラキシ−ショックの ような陰性免疫反応を生じることなく、特にヒトの場合の陽性免疫感作に用いる ことができる。勿論、抗体は、検出可能な標識形（例えば、酵素、　ＩＳ　Ｃ， ケイ光標識等）、固定形（ポリマーチューブ、ビーズ等上）又はインビボイメー ジング用標識形（この場合の標識は、放射性エミッター、又はカーボン−１３核 のようなＮＭＲコントラスト化剤、又は重金属核のようなＸ線コントラスト化剤 である）で、従来式免疫診断アッセイ及びキットにおいても利用可能である。抗 体は、適切な標識化によって抗原のインビトロ局在化用にも用いることができる 。

抗体は、治療目的で、それ自体、補体媒介溶解用に用いられるか、又はリシン等 のような毒素もしくは治療部分に結合される。

ミックスされた抗体−酵素分子は、ＥＬＩＳＡのような免疫診断法にも使用可能 である。ミックスされた抗体−ペプチドエフェクター複合体は、高度の効力及び 特異性のあるエフェクタ一部分を標的に向けるためにも使用することができる。

詳しくは、本発明のキメラ抗体は、マウスＬ６モノクローナル抗体が使用可能な あらゆる及びすべての用途に使用することができ、その場合においてキメラ抗体 はヒト抗体と適合的であるという明らかな利点がある。

以上、本発明について一般的に記載しているため、本発明はある具体的な例を参 考にして更に詳しく理解されるであろうが、これは説明のみの目的で本明細書に 組込まれているのであって、特に指摘のない限り限定のためヒト細胞系ＧＭ２１ ４６及びＧＭ１５００をヒユーマン◆ミュータント・セル・レボジトリ−（Ｈｕ ｓａｎ　ＭｕｔａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）　にュージャージー州 カムテン）カラ入手し、ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％牛脂児血清（Ｍ、　Ａ。

バイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　）中で培養した。

細胞系Ｓ　ｐ　２１０をアメリカンψタイプφカルチャー・コレクションから入 手し、ダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋４．５ｇ／Ｎグルコース（Ｍ 、Ａ、バイオプロダクツ）＋１０％牛脂児血清〔ユタ州ローガンのハイクローン 、ステライルーシステムズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ。

５ｔｅｒ１１ｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ））中で増殖させた。培地にペニシリン／スト レプトマイシン〔カリフォルニア州アービンのア−ビン・サイエンティック（Ｉ ｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　）を補充した。

組換えプラスミド及びバクテリオファージＤＮＡプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＬ ｌ及びｐＵｃ１２をコアルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｐ−ＬＢｉｏｅｈｅ■１ｃａｌｓ）　（ウィスコンシン州ミルウォーキー）か ら購入した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ及びｐＳＶ２−ｇｐｔをＢＲＬ　（メ リーランド州ゲーサースバーグ）から入手したが、これらはアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）からトのサブクロー ンである。ヒトＩｇＧ１染色体遺伝子からの単離法については、エリソン、Ｊ、 Ｗ、ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１０巻、第４０７１頁。

１９８２年で記載されている。Ｍ８αＲＸ１２は、Ｍ１３ｍｐｌＯ中に挿入され たＭ６０３染色体遺伝子のＪ−Ｃイントロン領域（デービス、Ｍ、ら、ネーチャ ー。

第２８３巻、第７３３頁、１９７９年）からのマウスＨ鎖エンハンサ−を含む０ ．７Ｋｂ　ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含有している。浮遊密度遠心分 離によるプラスミドＤＮＡの精製、制限エンドヌクレアーゼ切断、アガロースゲ ル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの精製、結合及び大腸菌の形質転換に関す るＤＮＡ操作は、マニアティス、Ｔ、ら、モレキ笠う−・クローニング。

ラボラトリ−・マニュアル、１９８２年による記載と又は他の操作法と同様であ った。制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ／ＲＮＡ修正酵素は、ベーリンガ ーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）　（インディアナ ポリス・インディアナ州）　、ＢＲＬ、ニューイングランド・バイオラプス（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　（７サチユーセツツ州ビバリー）及 びコアルマシアＰ−Ｌから購入した。

オリゴヌクレオチド製造 オリゴヌクレオチドをイト−ら、　（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１ ０巻、第１７５５頁、１９８２年）のトリエステル法により合成するか、又はカ リフォルニア州ロサンゼルスのニレセン（ＥＬＥＳＥＮ）から購入した。

トリチル化された脱保護オリゴヌクレオチドを、セファデックス−Ｇ　５０　（ Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０）上で、しかる後Ｃ１ｇウボンダパック（ｕＢｏｎｄ ａｐａｋ）カラム〔ウォーターズ・アソシエーテス（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ ｉａｔｅｓ）　）上ｐＨ７，２の１０ｄ）リエチルアミンー酢酸中アセトニトリ ルの０〜２５％勾配による逆相ＨＰＬＣで精製した。脱トリチル化を８０％酢酸 中で３０分間行い、しかる後３回蒸発させた。オリゴヌクレオチドを〔γ−３２ Ｐ）ＡＴＰ＋Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識した。

ＲＮＡ産生及び分析 全細胞ＲＮＡをオーフレー、Ｃ，（Ａｕｆｒｒａｙ、Ｃ，）及びルジエオン、Ｆ 、　（Ｒｏｕｇｅｏｎ、Ｆ、）　（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー、第１０７巻、第３０３頁、１９８０年（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｆｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ・１０７：３０３（１９８０））） 又はチャーブウィン、Ｊ、Ｍ。

（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、Ｊ、Ｍ、）ら〔バイオケミストリー、第１８巻。

第５２９４頁、１９７９年（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｉｌｌ：　５２９４ （１９７９））　］の方法により組織培養細胞から得た。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの 産生、メチル水銀アガロースゲル電気泳動及びニトロセルロースへの“ノザーン ′　トランスファーは、マニアティス、Ｔ、ら、前掲による記載と同様であった 。

全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）　＋ＲＮＡを、最初にＲＮＡをホルムアルデヒドで 処理することによって直接ニトロセルロースに結合させた【ホワイト、Ｂ、Ａ、 及びバンクロフト、Ｆ、Ｃ，、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ ー、第２５７巻、第８５６９頁。

１９８２年（Ｗｈｌｔｅ、Ｂ、Ａ、ａｎｄ　Ｂａｎｃｒｏｆｔ、Ｆ、Ｃ，、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ’Ｂ１ｏ１ｏｇ１ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５７：８５ ６９（１９８２）））　、フィルター結合ＲＮＡとのハイブリッド化は、マーギ ュリーズ、Ｄ。

Ｈ，（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｄ、Ｈ，）ら（ネーチャー、第２９５巻、第１６８ 頁、１９８２年）により記載された条件を用いてニック−トランスレート化（ｎ ｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントとで、又は３７℃で 一夜４ＸＳＳＣ，ＩＯＸデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、１００　ｕ　ｇ 　／　ｍｌサケ精子ＤＮＡを用いしかる後３７℃で４ＸＳＳＣにより洗浄して３ ２Ｐ標識オリゴヌクレオチドとで行われた。

ｃＤＮＡ産生及びクローニング オリゴｄＴプライム化ｃＤＮＡライブラリーをランド。

Ｈ，（Ｌａｎｄ、Ｈ，）ら（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。

第９巻、第２２５１頁、１９８１年）並びにガブラー。

Ｖ、　（Ｇｕｂｌｅｒ、Ｖ、）及びホフマン、Ｂ、Ｊ、　（Ｈｏｆ’ｆ’ｍａｎ 、Ｂ。

Ｊ、）（ジーン、第２５巻、第２６３頁、１９８３年）の方法により各々ＧＭ１ ５００及び０Ｍ２１４６細胞のポリ（Ａ）　＋ＲＮＡから得た。ｃＤＮＡライブ ラリーをデ・ランデ（ｄｅ　Ｌａｎｇｅ）ら（セル、第３４巻、第８９１頁。

１９８３年）の操作による３２ｐ標識オリゴヌクレオチドとの又はニック−トタ ンスレート化ＤＮＡフラグメントとのハイブリッド化（マニアティス、Ｔ、、前 掲）によってスクリーニングした。

オリゴヌクレオチドプライマー伸長及びクローニングポリ（Ａ）　＋ＲＮＡ　（ ２０Ｍｇ）を６４ｍＭ　ＫＣｌ４０μｇ中プライマー１．２μｇと混合した。９ ０℃で５分間かけて変性し、しかる後水冷した後、ヒト胎盤リボヌクレアーゼイ ンヒビター（ＢＲＬ）３単位をｐＨ８，３のＩＭトリスＨＣ１３μｇに加えた。

オリゴヌクレオチドを４２℃で１５分間かけてＲＮＡとアニーリングさせ、しか る後１２μｐの０．０５Ｍ　ＤＴＴ。

ｄ　ＡＴ　Ｐ　Ｃ４００Ｃ１／ｗｍｏ１．ニューイングランド・ヌクレア（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　）　２　ａｌｌを加え、しかる後ＡＭ Ｖ逆転写酵素［１９単位／μｇ、ライフ・サイエンシス（１、ｉｒｅ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓ）　］　３　ｕｎを追加した。

４２℃で１０５分間のインキュベート後、０．５ＭＥＤＴＡ２μＮ及びｐＨ７， ６１７１１０＋ａＭ）リス、１ｗＭＥＤＴＡ５０μｇを加えた。組込まれながっ たヌクレオチドをセファデックスＧ−５０スパンカラムクロマトグラフイーによ り除去し、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをフェノールしかる後クロロホルムで抽 出し、エタノールで沈降させた。第二鎖合成、ｄＧＴＰもしくはｄ　ＣＴＰで尾 部形成されるホモポリマー及びホモポリマー尾部形成ベクター中への挿入につい ては、前掲のガブラー及びホフマンによる記載と同様であった。

特定部位突然変異誘発 一重鎖Ｍ１３サブクローンＤＮＡ　（ｌμｇ）をＨｉｎ緩衝液（７ｉＭ　）リス ＨＣＩ、ｐＨ７，６，７１ＭＭｇＣ１２，５０１ｇＭ　ＮａＣ１）１２．５ｔｔ ｒｌ中オリゴヌクレオチドプライマー２０ｎｇと結合させた。密封チューブ中９ ５℃に加熱後、プライマーを７０”Ｃがら３７℃まで９０分間かけて徐々に冷却 することにより鋳型とアニーリングさせた。ｄＮＴＰ類（各１ｓＭ）２μｇ、３ ２Ｐ−ｄＡＴＰ　（１０μＣＩ）　１ｕｎ　、ＤＴＴ　（０，１Ｍ）１ｕｎ及び フレノウＤＮＡ　Ｐｏ　Ｉ　Ｉ　（２ｕ、ベーリンガーーマンハイム）０．４μ ｇを加え、鎖を３７℃で３０分間かけて伸長させた。これにＭ１３リバースプラ イマーにニューイングランド・バイオラブズ）１μｇ　（１０ｎｇ）を加え、加 熱／アニーリング及び鎖伸長ステップをｉ返した。反応をｐＨ８（７）０．５Ｍ 　ＥＤＴＡ　２μｇ＋ｐＨ７，６の１０吐トリスＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ８０ μｇで止めた。産物をフェノール抽出し、セファデックスＧ−５０スパンカラム クロマトグラフイーにより精製し、エタノール沈降させ、しかる後制限酵素で消 化させ、適切なベクターに結合させた。

ミエローマ組織培養細胞のトランスフェクションポツター、　Ｈ，（Ｐｏｔｔｅ ｒ、Ｈ，）ら（プロシーディング・オブ・ナショナル−アカデミ−・オブ・サイ エンスＵＳＡ、第８１巻、第７１６１頁、１９８４年）のエレクトロポレーショ ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｌｏｎ）法を用いた。トランスフェクション後、 細胞を４８〜７２時間がけて完全ＤＭＥＭで回収し、しかる後選択培地存在下の ９６ウエル培養プレート中に１０，０００〜５０，０００細胞／ウエルで播種し た。０４１ｇ　＜ｃｒＢｃｏ）；ｓ択は０．８■／　ｍｌ　ｓ　ミコフェノール 酸〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅａ））は６　μｇ　／　ｍｌ、キサンチ ンは０．２５ａ＋ｇ／ｍｌ、及びＨＡＴ　［シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）は標準濃 度であった。

免疫グロブリン合成及び分泌のアッセイ分泌された免疫グロブリンを組織培養細 胞上澄から直接測定した。細胞質タンパク質抽出物は、１％ＮＰ４０゜０．１５ Ｍ　ＮａＣ１，１０＋ａＭ）リス、１ｓＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，６の１６０ｇｇ中で細胞１０６個を攪拌し、溶解物を０℃で１５分間放 置し、しかる後１０．ＯＯＯＸｇで遠心分離して不溶性残屑を除去することによ り得られた。

アフィニティー精製抗血清を用いた二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ（ボラ−１ Ａ、ら、臨床免疫学マニュアル、第２版２編集ローズ、Ｎ、及びフリートマン、 Ｈｏ。

第３５９−３７１頁、１９８０年（Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、。

Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄ　Ｅｄ 、、Ｅｄｓ、Ｒｏｓｅ、Ｎ。

ａｎｄ　Ｆｒｊｅｄｓａｎ、）１．、ｐｐ３５９−３７１．１９８０）　）が、 特異的免疫グロブリンを検出するために用いられた。ヒトＩｇＧ検出の場合、プ レート結合抗血清は１／１０００希釈時のヤギ抗ヒトＩ　ｇＧ　（ＫＰＬ、メリ ーランド州ゲーサースバーグ）であり、一方ベルオキシダーゼ結合抗血清は１／ ４０００希釈時のヤギ抗ヒトＩｇＧＣＫＰＬ又はタボ（Ｔａｇｏ）、バーリンガ ム）である。ヒト免疫グロブリンに検出の場合、プレート結合抗血清は１　／　 ５００希釈時のヤギ抗ヒトにタボであり、一方ベルオキシダーゼ結合抗血清は１ ／１０００希釈時のヤギ抗ヒトに〔キャペル（Ｃａｐｐｅｌ））である。

例１ 癌抗原特異性のあるキメラマウス 一ヒト免疫グロブリン （１）抗体Ｌ６ Ｌ６モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ヒト肺癌腫由来細胞で免疫されしかる後 牌臓細胞がＮ５−１マウスミエローマ細胞とハイブリッド化されたマウスから得 られた。抗体は、肝癌（腺上皮及び偏平上皮）、乳癌、結腸癌及び卵巣癌を含め た大半のヒト癌腫由来細胞の表面で多量に発現される過去未確認の炭水化物抗原 と結合するが、但し抗原は成熟宿主由来正常細胞中痕跡量で存在するのみである 。ＭＡｂ　Ｌ６はＩｇＧ２ａであって、Ｌ６陽性腫瘍細胞を溶解させうるように エフェクター細胞源としてヒト末梢血白血球の存在下で抗体依存性細胞毒性ＡＤ ＣＣを媒介し、補体源としてヒト血清の存在下でＬ６陽性腫瘍細胞を溶解させる ；溶解は、４時間のインキュベート期間における標識細胞からの５１Ｃｒ放出に よって検出される。ＭＡｂ　Ｌ６はヌードマウスへ真種移植されたＬ６陽性腫瘍 に局在化することが可能であり、このような腫瘍の増殖しすぎを阻害することが できる。

ＭＡｂ　Ｌ６は、キャンサー・リサーチ、第４６巻、第３９１７−３９２３頁、 １９８６年（ＭＡｂ特異性に関する）及びプロシーディング・オブ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻。

第７０５９−７０６３頁、１９８６年（ＭＡｂ機能に関する）で記載されている 。ＭＡｂ　Ｌ６は、１９８５年１０月１８日付で出願された同時係属出願第７７ ６゜３２１号明細書及び１９８４年１２月２１日付で出願された第６８４．７５ ９号明細書でも記載されており、それら各々の内容は参考のためすべて組込まれ る。

凍結細胞を氷上で１０分間及びしかる後室温で解凍した。懸濁液をＰＢ８１５ｍ ｌで希釈し、細胞を遠心沈降させた。それらをＰＢＳ洗浄後３Ｍ　ＬｉＣ１，６ Ｍ尿素１６ｍ１に再懸濁し、ポリトロン剪断機で破壊した。

ｍＲＮＡの産生及びポリ（Ａ＋）画分の選択をオーフレー、Ｃ，及びルジェ第１ ン、Ｆ、、ヨーロピアン・ジャーナルーオブ・バイオケミストリー、第１０７巻 。

第３０３頁、１９８０年に従い実施した。

Ｌ６由来ポリ（Ａ”）ＲＮＡをノブレガら、アナライティカル・バイオケミスト リー、第１３１巻、第１４１頁、１９８３年（Ｎｏｂｒｅｇａ　ｅｔ　ａｌ、、 ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３１：１４１，１９８３） に記載された条件下で標識Ｊ　１、Ｊ　２、Ｊ　３及びＪＨ４オリゴヌクレオチ ＨＨ ドで個々にハイブリッド化した。次いで、産物を１．７％アガロース−ＴＢＥゲ ル電気泳動に付した。ゲルを１０％ＴＣＡで固定し、乾燥プロットし、オートラ ジオグラフィー用に露出させた。結果は、Ｌ６ｖＨがＪＨ２配列を含んでいるこ とを示した。

Ｖ　Ｋ　ｍ　ＲＮ　Ａの分析のために、ホワイト及びバンクロフト、ジャーナル ーオブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第８５６９頁、１９８２ 年のドツト−プロット法を用いた。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを二トルセルロースフィ ルター上に固定し、４ｘｓｓｃ中４０℃中揉０ブローブーオリゴヌクレオチドと ハイブリッド化させた。これらの実験では、Ｌ６がＪＫ５配列を含んでいること を示していた。ＪＫ２との弱いハイブリッド化が観察された。

Ｌ６ボリ（Ａ”）ＲＮＡ上オリゴ（ｄＴ）でブライミングされたライブラリ・− をマウスＣＫ領域プローブでにクローンに関してスクリーニングした。Ｌ６ライ ブラリーから、いくつかのクローンを単離した。５゛ＪＫ５特異性プローブによ る第ニスクリーニングで、Ｌ６ンは、ＪＨ２オリゴヌクレオチドでのスクリーニ ングにより単離された。

ｃＤＮＡクローンｐＨ３−６ａ及びｐＬ３−１２ａからのＨ及びＬ鎖遺伝子又は 遺伝子フラグメントをヌクレオチド配列分析用にＭ１３バクテリオファージベク ターに挿入した。これらクローンの可変領域の完全ヌクレオチド配列は、ジデオ キシ鎖ターミネーション法により決定された（第５及び６図）。これらの配列は 観察された組成とよく一致するＶ領域アミノ酸組成を予測させ、■領域の部分の 直接アミノ酸配列決定により証明されたペプチド配列を予測させている。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、それらが■ドメインに特徴的なアミノ 酸残基を含むことから、それらが免疫グロブリンＶ領域クローンであることを示 している〔カバット（Ｋａｂａｔ）ら、免疫学的興味のあるタンパク質の配列； ＨＨＳのＵＳ局、１９８３年〕。

Ｌ６ｖＨはサブグループ■に属する。ｃＤＮＡは、公知ｖＨの場合と同一である ２４アミノ酸残基のＮ末端配列を予測している（４５−１６５ＣＲＩ　、マーゴ リーズら、モレキュラー・イムノロジー、第１８巻。

第１０６５頁、１９８１年（Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉ＋ｎｕｎｏ１ｏｇｙ、１８：１０Ｇ５．１９８１））　 ６　Ｌ　６　Ｖ　ＨはＪＨ２配列である。Ｌ６ｖＬはＶＫ−Ｋｐｎ、Ｉ群に由来 しくニジら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンスＵＳＡ、第８２巻。

第６３９９頁、１９８５年）、ＪＫ５を用いている。複製されたＬ６ｖＬは、残 基１８−４０及び８０−９６１：対応するＬ６鎖のペプチドのアミノ酸配列決定 により確認されたアミノ酸配列を予測させている。

（４）ヒトＣモジュールに結合用のＪ領域中制限酵素部位を工学処理しかつＶモ ジュール５゛側のオリゴ（ｄ　Ｃ）を除去するためのインビトロ突然変異誘発オ リゴ（ｄＴ）Ｌ６Ｖ　及びＬ６ｖＨでブライミングに することにより得られた双方のクローンは、修正されねばならない。Ｌ６ｖＫの 場合には、Ｊ領域突然変異誘発プライマーＪ　Ｋ　Ｈｉｎ　ｄ　ｍが、第６図で 示されているように利用された。ｃＤＮＡクローン由来ヒトＣヒトＣモジュール ｉｎｄｍ配列を含むように突然変異させた（第４図参照）。突然変異誘発反応は 、これら遺伝子のＭ１３サブクローン上で生じた。突然変異クローンの発。

現頻度は、得られるプラーク中の０．５〜１％の範囲内であった。

Ｖａキメラ遺伝子中ＡＵＧコドン上流のオリゴ（ｄＣ）配列は１つの具体的な遺 伝子構造における適切なスプライシングを妨げることが、以前に観察されていた 。おそらく７０％もの多くのＲＮＡ転写体がミススプライシングを受けたと評価 されたが、その場合にはリーダー配列中の隠れた３′スプライスアクセプターが 用いられた。

したがって、イニシェークーＡＵＧ上流のオリゴ（ｄＣ）配列はすべてのクロー ンで除去された。

１つのアプローチでは、Ｌ６ＶＫクローンを突然変異させるために５ａ１１部位 を含んだオリゴヌクレオチドが用いられた。このオリゴヌクレオチド部位突然変 異誘発用のプライマーは、オリゴ（ｄ　Ｃ）及びイニシェーク−ｍｅｔコドン間 にＳａｉｌ部位を導入する２２量体である（第９図）。

異なるアプローチでは、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１がＬ６ｖＨクローンｐＨ３− ６ａからオリゴ（ｄＣ）を取去るために用いられた。得られた２種の変異体中の 削除サイズはヌクレオチド配列決定により調べられ、第７図で示されている。こ れら変異体（δ４及びδ２１）の双方において、コード領域５′側のすべてのオ リゴ（ｄ　Ｃ）が削除された。

次いで、これらのクローンはＭＪＨ２−ＡｐａＩプライマーでのオリゴヌクレオ チド部位突然変異誘発により修正された（第７図）。この３１塩基プライマーは 、ヒトＣγ１ｃＤＮＡ遺伝子モジュール中に存在するＡｐａＩ部位と同様の位置 でマウスＣＨ遺伝子にＡｐａＩ部位を導入する。プライマーは、ヒトＣγ１遺伝 子に関する適切なコドンを導入する。その結果、突然変異マウスｖＨ遺伝子モジ ュールをヒトＣＨモジュールに結合することにより得られるキメラＨ鎖遺伝子は 、完全ｖＨ領領域関するヒトアミノ酸を含まないキメラタンパク質についてコー ドするようになる。

ヒトＣγ１遺伝子モジュールは０Ｍ２１４６細胞由来のｃＤＮＡである〔ニュー シャーシー州ニューアークのヒユーマン◆ゲネティック・ミニータント・セル・ レボジトリ−（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ ｏｓｉｔｏｒｙ））。

このＣγ１遺伝子モジュールは、キメラ発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２Ｅを形 成させるために、マウスＶＨ遺伝子モジュールと予め結合された。

（５）Ｌ６６キメラ現プラスミド Ｌ６キメラＨ鎖発現プラスミドは、発現プラスミドｐｌＮＧ２１１１及びｐＩＮ Ｇ２１１２を得るために、ＶａモジュールｐｌＮＧ２０１２Ｅを変異体δ２１及 びδ４の■Ｈモジュールで置換えることにより得られた（第７図）。これらのプ ラスミドは、哺乳動物細胞中にトランスフェクトされた場合にキメラＬ６Ｈ鎖の 合成を指示する。

Ｌ６Ｌ鎖キメラ遺伝子の場合には、マウスＶＫモジュールのＳａｉｌ−Ｈｉｎｄ ｍフラグメントが第８図で略図化された操作によりヒトＣＫモジュールに結合さ れ、ｐＩＮＧ２１１９を形成した。ｎｅｏ配列をｐＳＶ２−ｇｐｔ由来大腸菌ｇ ｐｔ遺伝子で置換えることによりｐｌＮＧ２１２０が得られたが、これは哺乳動 物細胞中にトランスフェクトされた場合にＬ６キメラし鎖を発現しかつミコフェ ノール酸耐性を付与する。

同一プラスミド中にＨ及びＬ鎖双方のキメラ遺伝子を組込んだ場合には、バラン スのとれた遺伝子適用量となるように、トランスフェクトされた細胞中に遺伝子 比１：１でＨ及びＬ鎖遺伝子を組込むことができる。これによれば、至適キメラ 抗体発現用にトランスフェクトされた細胞の発現性を改善しかつその操作量を減 少させることができる。この目的のために、ｐＩＮＧ２１１１及びｐｌＮＧ２１ １９のキメラＨ及びＬ鎖遺伝子から得られるＤＮＡフラグメントを結合させ、発 現プラスミドｐｌＮＧ２１１４を得た（第９図）。この発現プラスミドは、各々 がマウスＨ鎖エンハンサ−を含む各キメラ遺伝子に関して別々の転写単位及び選 択可能なｎｅＯＲマーカーを含んでいる。

Ｌ６キメラ遺伝子の修正及びＶ−Ｃジヨイント領域は、Ｍ２Ｏ図で要約されてい る。

（６）キメラ抗体産生のためのマウスリンパ球細胞の安定的トランスフェクショ ン Ｌ６キメラ発現プラスミドＤＮＡをマウス５ｐ２１０細胞中に導入するために、 エレクトロポレーションを用いた〔ボッターら、前掲；トネグッゾ（Ｔｏｎｅｇ ｕｚｚｏ）ら。

モル・セル・パイオル、第６巻、第７０３頁、１９８６年〕。エレクトロポレー ション技術では、５ｐ２１０細胞の場合に１〜１０ｘ１０−５のトランスフェク ション頻度であった。

２遺伝子発現プラスミドｐｌＮＧ２１１４をＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ での消化により直鎖化し、Ｓ　ｐ　２１０細胞中にトランスフェクトして約５０ のＧ４１８耐性クローンを得、これをヒトＨ及びＬ鎖合成に関してスクリーニン グした。２種のプロデューサーＤ７及び３Ｅ３からのキメラ抗体鎖合成レベルは 、第１表に示されている。キメラム６抗体は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ペニシリン及 びストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭ５ｆｌ中で２Ｘ１０６細胞／　ｍｌ のＤ７）タンスフエクト体細胞を２４時間にわたり培養することにより産生され た。上澄をｐＨ８，０の１０ｄリン酸ナトリウム緩衝液中アミコン（ＡＩＩｉｃ ｏｎ）　Ｙ　Ｍ　３０膜で濃縮した。調製物をＤＥＡＥセルロースカラムにのせ 、免疫グロブリンを未結合及び結合画分に分離した。ＤＥＡＥ未結合、ＤＥＡＥ 結合及び前ＤＥＡＥ調製物（培地１．６ｊ７）からのサンプルをプロティンＡセ ファロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによりｐＨ３，５の０ ．１Ｍクエン酸ナトリウムで溶出させて別々に精製した。溶出抗体を中和し、リ ン酸緩衝液中アミコンセントの収量は、１２μｇ　（ＤＥＡＥ未結合）、６μｇ （ＤＥＡＥ結合）及び９μｇ（前ＤＥＡＥカラム）であった。抗体鎖のウェスタ ーン分析では、それらが天然免疫グロブリンと同様にＨ２Ｌ　２回置体として結 合していることを示した。

ａ、５ｐ２１０．ｐｌＮＧ２１１４．Ｄ７細胞を培地〔１０％牛脂児血清（ハイ クローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）　＃　Ａ　−１１１１−Ｄ）　、ＩＣ１ｗＭ　ＨＥ ＰＥＳ、ｌｘグルタミンーペンーストレブ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−Ｐｅｎ−３ｔ ｒｅｐ）　（アービン・サイエンティフィック＃９３Ｘ６）で補充されたＤＭＥ Ｍ　（ギブコ＃３２０−１９６５））中でＩ×１０６細胞／ｍｌまで増殖させた 。

５９次いで、細胞を４００Ｘｇで遠心分離し、無血清培地中に２Ｘ１０６細胞／ ｍｌで１８〜２４時間にわたり再懸濁させた。

Ｃ０培地をＪＳ−４，２ｏ−ター（３０００ｘ　ｇ）中４０００　ｒｐｔａで１ ５分間遠心分離した。

６９次いで、上澄１．６９を０．４５μフイルターで濾過し、しかる後ＹＭ３０ （アミコン社）フィルターで２５ｍ１に濃縮した。

ｅ、濃縮上澄の電導度をＣＤＭ８０ラジオメーターで５．７〜５．６＋ｏＳ／ｃ ｍに調整し、ｐＨを８．０に調整した。

ｆ、上澄を２０００Ｘｇで５分間遠心分離し、しかる後ｐＨ８，０の１０ｍＭリ ン酸ナトリウムで予め平衡化された４０ｍ１ＤＥＡＥカラムに供した。

２９画分毎の流出液を集め、かつｐＨ８，０の１０＋ｕＭリン酸ナトリウムで予 め平衡化された１ｍｌプロティンＡセファロース（シグマ）カラムに供した。

ｈ、カラムを最初にｐＨ８，０の１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液６ｍｌ、しか る後ｐＩ（３，５の０．１Ｍクエン酸ナトリウム８ｍｌ、次いで０．１Ｍクエン 酸（ｐＨ２，２）６ｍｌで洗浄した。０．５ｍ１画分を２に１トリス塩基（シグ マ）５０Ｍｇ含有チューブ中に集めた。

ｉ、大部分のＩｇＧはｐＨ３，５溶出物であって、これをプールし、セントリコ ン３０（アミコン社）で約０、’０６ｍ１に濃縮した。

ｊ、緩衝液をＰＢＳでの繰返し希釈及び再濃縮によりセントリコン３０中でＰＢ Ｓ　（ｐＨ７，４の１０１リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣ１）に変えた 。

ｋ６次いで、ＩｇＧ溶液を０．１０ｍ１に調整し、牛血清アルブミン〔フラクシ ョンＶ　（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）、米国バイオケミカルズ〕を安定化試薬とし て１．０％まで加えた。

（８）腹水からのキメラム６抗体の産生及び精製ａ、腹水を最初に２０００Ｘｇ で１０　間遠心分離した。

ｂ、上澄の導電度を５．７〜５．　６ｉＳ／艶に調整し、そのｐＨを８．０に調 整した。

Ｃ８次いで、上澄をｐＨ８，０の１０５ＭＮａ２Ｐ０４Ｈで予め平衡化された４ ０ｍ１ＤＥＡＥセフアロースカラムに供した。

ｄ、ＤＥＡＥカラムからの流出液を集め、そのｐＨを７．４に調整し、かつ１． ０ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（）１十Ｌ）　−セファロースカラムに供した。

ｅ、カラムを最初に６ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウ ム、しかる後８ｍｌの０．５ＭＮＨ４ＯＨ及び３Ｍチオシアン酸ナトリウムで洗 浄した。

ｆ、チオシアン酸ナトリウム溶出液をプールし、Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｉに対して一夜透 析した。

抗体は、前記操作のステップｊ及びｋによって更に濃縮することができる。

第１表 Ｓ　ｐ　２１０　トランスフェクト体　から分泌されたキメラム６鎖のレベル ５ｐ２１０．Ｄ７　５ｐ２１０．３Ｅ３１、　２０ｍ１．２日　＋　１７　７７ 　１００　７００播種約２Ｘ１０５／ｍ１ ２、　２００　ｍｌ、２日　＋　０．９　６　８０　２１５播種約２．５Ｘ　１ ０５／　ｍｌ ３、　２００　ｍｌ、１日　−１，９３，８９７２２１播種約２ＸｌＯＢ／ｍ１ ４、８ａｌｂ／ｃ腹水　−５１６０１９１７０ＮＤ　ＮＤ”　−ｐｌＮＧ２Ｌ１ ４（ｐＬ６Ｈいとのエレクトロポレーション（こよりトランスフェクトされた５ ｐ２１０細胞ｂ−ヒトに一ヒ）ベンス・ジョーンズ（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ） タンパク質標準に特異的なＥＬＩＳＡにより測定されたμｇ／１） ０−ヒトγ−ヒトＩｇＧ標準に特異的なＥＬＩＳＡにより測定されたμｇ／ｌ１ ｌ ＮＤ−測定せず ＦＢＳ　：牛脂児血清 （９）キメラム６抗体で実施された研究最初に、サンプルを結合アッセイで試験 したが、その場合にＬ６抗原陽性及びＬ６抗原陰性細胞系の双方の細胞を標準マ ウスモノクローナル抗体Ｌ６、細胞培養上澄から得られるキメラム６抗体及び腹 水から得られるキメラム６抗体（前記）と、しかる後第二試薬のヒト（又はマウ ス、標準として）免疫グルプリンに対するフルオレセイン−イソチオシアネート （Ｆ　Ｉ　ＴＣ）複合化ヤギ抗体と共にインキュベートした。

結合アッセイではＬ６抗原陽性細胞系でキメラＬ６の強い反応性及び陰性細胞系 で反応性の全体的欠如を示したことから、次のステップでは抗原陽性細胞に対す るマウスＬ６の結合性を阻害しうるキメラＬ６の能力に関して試験した；このよ うな阻害アッセイは抗原の二抗体認識同一性を確立するためにルーチン的に用い られる。これらのデータは以下で記載されている（“結合の阻害°）。

これらの研究の一部として、抗体結合活性の大体の評価を行った。

最後に、抗体機能の二側面、即ちヒト末梢血白血球存在下においてＡＤＣＣを媒 介しうる能力及び補体源としてのヒト血清存在下においてＬ６陽性腫瘍細胞を殺 しうる能力について試験した（下記“機能性アッセイ“参照）。

原を発現することが以前に示されたヒト結腸癌腫系由来細胞３３４７を標的とし て用いた。Ｔ細胞系Ｈ３Ｂ２由来細胞は、それらが前記試験によると検出可能量 のＬ６抗原を発現しないことから、陰性コントロールとして用いられた。標的細 胞を最初にマウス腹水から精製されたキメラＬ６又はマウスＬ６標準のいずれか と４℃で３０分間インキュベートした。次いで、これを第二のＦＩＴＣ標識試薬 とインキュベートしたが、これはキメラ抗体の場合にタボ（ＴＡＧＯ）　（カリ フォルニア州バーリンゲーム）から得られたヤギ抗ヒト免疫グロブリンであって 、１：５０希釈倍率で用いられた。マウス標準の場合には、それは同じくタボか ら得られたヤギ抗マウス免疫グロブリンであって、１：５０希釈倍率で用いられ た。

細胞表面に対する抗体結合性は、コールタ−モデルＥＰＪＣ−Ｃ細胞ソーター（ Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＭｏｄｅＩ　ＥＰＪＣ−Ｃｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）を用いて測 定された。

第２表及び第２Ａ表で示されているように、キメラ及びマウス標準Ｌ６はＬ６陽 性３３４７系に対して有意にかつほぼ同程度で結合した。それらはＬ６陰性ＨＳ Ｂ２系とバックグラウンド以上で結合しなかった。

第２表で示された３種の異なるキメラム６サンプルは結合アッセイで同様に挙動 したという事実から、それらを下記阻害試験用にプールした。同様の阻害試験は 、第２Ａ表で示された腹水から得られるキメラＬ６についても行われた。

結合の阻害二次のステップでは、用量を変化させた場合にいかなる程度でキメラ ム６抗体又は標準マウスＬ６が抗原陽性３３４７結腸癌細胞の表面に対するＦＩ ＴＣ標識マウスＬ６の結合性を阻害しつるかについて試験した。

キメラ及びマウス標準Ｌ６は双方とも直接標識Ｌ６抗体の結合性を阻害し、それ らの結合曲線はパラレルであった。キメラ抗体は、プールされたキメラＬ６ＭＡ ｂ３−４ｔｔｇ／ｒｎｌが標準マウスＬ６ＭＡｂ２．０μｇ／ｍｌに匹敵して５ ０％結合阻害に必要でありかつ（腹水から得られた）キメラＬ６５．５μｇ　／ 　ｍｌが標準マウスＬ　６ＭＡ　ｂ　２．　７　ｕ　ｇ／ｍｌに匹敵して５０％ 結合阻害に必要であることを示した結果から判明するように、標準よりもわずか に有効性が低かった。

これら試験の一部として、大体の評価を抗体結合活性に関して行った。標準マウ スＬ６の結合活性は、約４×１０８であることが既に示されていた。データは、 キメラ及びマウスＬ６間の結合活性に有意差がないことを示した。

機能性アッセイ：エフェクター細胞源としてヒト末梢血白血球（抗体依存性細胞 毒性ＡＤＣＣを媒介する）又は補体源としてヒト血清（補体依存性細胞溶解ＣＤ Ｃを媒介する）の存在下でＬ６抗原陽性細胞を溶解しうるキメラＬ６及び標準マ ウスＬ６の能力間の比較を行った。

第３表及び第３Ａ−３Ｄ表で示されているように、キメラＬ６は、４時間の５１ 　ｃ　ｒ放出試験で測定されるように、ＡＤＣＣを起こす点においてマウスＬ６ の同時試験サンプルよりも優れていた。

第４表及び第４Ａ−４Ｂ表は、補体媒介標的細胞溶解に関する試験データを示し ている。この場合には、高い細胞溶解活性がマウス及びキメラム６抗体の双方で 観察上記結果は、本発明のキメラム６モノクローナル抗体に関していくつかの重 要な予想外の特性を明らかにしている。第一に、キメラム６抗体は、マウスＬ６ 標準とほぼ同程度にかつほぼ同じ結合活性でＬ６抗原陽性腫瘍細胞と結合する。

これは、下記理由から重要である：Ｌ６抗体は（ａ）表面炭水化物抗原及び（ｂ ）約２０．０００ドルトンのタンパク質抗原（各々、非小細胞肺癌ｆｉ（ＮＳＣ ＬＣ）及び他のあるヒト癌腫の特徴をなしている）を規定する。重要であるが、 Ｌ６抗体は主な器官中の繊維芽細胞、内皮細胞又は上皮細胞のような正常細胞と 検出可能に結合しない。したがって、キメラム６モノクローナル抗体は、正常細 胞でなく癌細胞に対して特異的である。

悪性細胞及び局在腫瘍と特異的に結合しうる本発明のキメラム６モノクローナル 抗体の能力に加えて、キメラＬＧはその標的との結合性に関して優れた生物学的 効果を発揮するが、そのことがキメラ抗体をＭ癌免疫療法の最優先候補にしてい るのである。本明細書で示された結果は、ＬＧが腫瘍細胞と結合し、結合時にＡ ＤＣＣ又はＣＤＣのいずれかによって腫瘍細胞を殺すことができることを立証し ている。このような腫瘍殺活性は、０、０１　ｔｔ　ｇ／ｍｌ　（１０ｎｇ／ｍ ｌ）程度の低濃度でキメラム６抗体を用いることにより証明された。

モノクローナル抗体を用いて腫瘍療法を試みる見通しは魅力的であるが、一部の 部分的腫瘍縮小が報告されているのみであって、現在までこのようなモノクロー ナル抗体療法は限定的に成功しただけであった〔ツートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ） 、　１９８５年２月、プロシーディング・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンスＵＳＡ。

第８２巻、第１２４２−１２４６頁〕。マウスモノクローナル抗体（これまでに 試みられたものである）の治療効力は、大半の実際的目的にとって低すぎるよう である。

癌抗原に対する特異性のあるキメラＬ６の優れた生物学的活性の発見は、キメラ ム６抗体を腫瘍インビボ治療用の選択治療剤として可能にしている。しかも、キ メラム６モノクローナル抗体をインビボで更にクリアランス耐性にしうる“ヒト 作用のせいで、キメラム６モノクローナル抗体は、未修正キメラ抗体による治療 のみではなく、薬物、毒素、イムノモジュレータ−、アイソトープ等含有の様々 な免疫複合体の開発、並びに適切な標識キメラム６抗体を用いる腫瘍のインビボ イメージング化のような診断目的にも有利に使用される。このような免疫複合化 技術は当業者に公知であって、本発明のキメラム６抗体分子を修正するために用 いることができる。

キメラム６抗体を分泌する２種の例示細胞系は、メリーランド州ロックビルのＡ ＴＣＣに米国出願日前に寄託された。これらは、トランスフェクトされたハイブ リドーマＣ２５５（前記３Ｅ３細胞に相当）ＡＴＣＣＨＢ９２４０及びトランス フェクトされたノ〜イブリドーマＣ２５６（前記Ｄ７細胞）ＡＴＣＣＨＢ９２４ １である。

（１０）Ｌ６鎖の酵母内発現 キメラム６抗体Ｈ及びＬ鎖についてコードする遺伝子配列を作製し、ベクターに 組込んだ。酵母細胞をそれで形質転換し、Ｌ６抗体に関する別々のＨ及びＬ抗体 鎖の発現を検出した。

本発明は、寄託された対象が本発明の一面のあくまでも一例としてであるため、 寄託された細胞系により範囲が限定されるわけではなく、機能的に同等であれば すべての細胞系が本発明の範囲内に属する。実際に、前記のものに加えて、本発 明の様々な修正例が前記説明及び添付図面から技術的に可能である。このような 修正例も請求の範囲内に属すると考えられる。

第２表 Ｌ６抗原陽性及びＬ６抗原陰性細胞系に対するキメラム６抗体及びマウスＬ６モ ノクローナル抗体の結合アッセイ １４３３４７細胞（Ｌ６÷）＊ 標準Ｌ６　５Ｂ、６　４．２ キメラＬ６　ａ　１．３　１１０．３ ｂ　１．３　１１０Ｊ Ｃ１，３１１０Ｊ ）ＩＳＢ−２ｗＡ胞（ＬＧ−）　＊ との結合比率 バッチ　ＧＡ）４　、臥り 標準Ｌ６　１．１　１．１ キメラＬ６　ａ　１．０　１．０ 本すべてのアッセイは１０μｇ　／　ｍｌの抗体濃度で行われた。結合比率値は 、ＣＡＭ　（Ｆ　ＩＴＣ複合化ヤギ抗マウス）又はＧＡＨ（Ｆ　ＩＴＣ複合化ヤ ギ抗ヒト）単独で処理されたコントロールサンプルよりも試験サンプルが明るい 倍数値である。比率１は試験サンプルがコントロールと全（同等に明るいことを 意味し、比率２は試験サンプルがコントロールよりも２倍明るいことを意味する 。

第２Ａ表 Ｌ６抗原陽性及びＬ６抗原陰性細胞系に対するキメラム６抗体及びマウスモノク ローナル抗体の結合アッセイ標準Ｌ　６　Ｓｏ　３８　４ キメラＬ６　３０　２　１０８ （腹水）　１０　２　１０８ キメラＬ６　３０　１　１０５ （細胞培養物）　１０　１　８８ キメラＬ６　１０　１　１ （腹水） キメラＬ６　１０　１　１ 本結合比率値は、ＣＡＭ　（Ｆ　ＩＴＣ複合化ヤギ抗ヒト）単独テ処理されたコ ントロールサンプルよりも試験サンプルが明るい倍数値である。比率１は試験サ ンプルがコントロールと全く同等に明るいことを意味し、比率２は試験サンプル がコントロールよりも２倍明るいことを意味する。

第３表 結腸癌腫細胞系３３４７に対するキメラＬ６（マウス）Ｌ６抗体のＡＤＣＣ 抗体濃度　ＰＢＬ／　細胞溶解率１ 抗体　μｇ　／　ｍｌ　標的細胞　％ キメラＬ　６　１０　１００　８４ 標準Ｌ　６　１０　１００　２４ なし　０　１００　１ 本標的細胞は５１　ｃ　、で標識され、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（Ｐ　Ｂ　 Ｌ）の組合せに４時間さらされ、しかる後５１　ｃ　、の放出量が測定された。

５１　ｃ　、の放出量（非処理細胞からの自発的放出に関する値の補正後）が細 胞溶解率の測定値である。

第３Ａ表 結腸癌腫細胞系３３４７に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体のＡＤ ＣＣ抗体濃度　ＰＢＬ／　細胞溶解率１ 抗体　μｇ　／　ｍｌ　標的細胞　％ キメラＬ　６　２０　１００　８０ （腹水）　１０　１００　７４ ２．５　１００　７１ キメラＬ　６　１０　１００　ｇ４ （細胞培養物）　５　１００　７４ ２．５　１００　６７ 標準Ｌ　６　２０　１００　３２ １０　１００　２Ｂ 本標的細胞は５１Ｃｒで標識され、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ） の組合せに４時間さらされ、しかる後５１Ｃｒの放出量が測定された。５１Ｃｒ の放出量（非処理細胞からの自発的放出に関する値の補正後）が細胞溶解率の測 定値である。

第３Ｂ表 結腸癌腫細胞系３３４７に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体のＡＤ ＣＣ抗体濃度　ＰＢＬ／　細胞溶解率１ 抗体　μｇ　／　ｍｌ　標的細胞　％ キメラＬ　６　５　１００　８４ （腹水）２．５　１００　７８ １．２５　１００　８５ ０．６３　１００　８１ ０Ｊ１　１００　８０ ０．１６　１００　７１ ０．０８　１００　６５ 標準Ｌ　６　５　１００　３２ なし　０　１００　１９ 本標的細胞は５１　ｃ　ｒで標識され、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（Ｐ　Ｂ　 Ｌ）の組合せに４時間さらされ、しかる後５１　ｃ　ｒの放出量が測定された。

５１　ｃ　ｒの放出ｆｆ１（非処理細胞からの自発的放出に関する値の補正後） が細胞溶解率の測定値である。

第３Ｃ表 肺癌腫細胞系Ｈ２６６９に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体のＡＤ ＣＣキメラＬ６　１０　１００　３５ （腹水）　１　１００　３１ ０．１　１００　２７ ０．０１　１００　１５ ０．００１　１００　１３ ０．０００１　０　１５ 標準Ｌ　６　１０　１００　９ なし　０　１００　９ キメラＬ６　１０　１０　１９ （腹水）　１　１０　１５ ０．１　１０　１１ ０．０１　１０　１３ ０．００１　１０　２２ ０．０００１　１０　１１ 標準Ｌ　６　１０　１０　７ なし　０１０８ キメラＬ６　１０　０　４ （腹水） 標準Ｌ６　１０　０　９ ＊標的細胞は５１　ｃ　、で標識され、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（Ｐ　Ｂ　 Ｌ）の組合せに４時間さらされ、しかる後５１Ｃｒの放出量が測定された。５１ Ｃ「の放出量（非処理細胞からの自発的放出に関する値の補正後）が細胞溶解率 の測定値である。

第３Ｄ表 結腸癌腫細胞系Ｈ３３４７に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体のＡ ＤＣＣ抗体濃度　ＰＢＬ／　細胞溶解率１ キメラＬ６　１０　１００　８２ （腹水）　１　１００　６Ｂ ０．１　１［）０　６９ ０．０１　１００　２８ ｏ、ｏｏｉ　ｉｏｏ　ｇ ｏ、０００１　０　３ 標準Ｌ　６　１０　１００　１９ なし　０　１００　８ ＊標的細胞は５１０ｒで標識され、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ） の組合せに４時間さらされ、しかる後５１Ｃｒの放出量が測定された。５１Ｃｒ の放出量（非処理細胞からの自発的放出に関する値の補正後）が細胞溶解率の測 定値である。

第４表 ３３４７からの結腸癌腫細胞に対するキメラ及び標準（マウス）Ｌ６の補体依存 性細胞作用。健常被験者からのヒト血清を補体源として用いた。

Ｌ６標準１０μｇ／ｍｌ　あり　９０ Ｌ６キメラ１０μｇ／ｍｌ　あり　８９Ｌ６標準１０μｇ／ｍｌ　なし　Ｏ Ｌ６キメラ１０μｇ／ｍｌ　なし　１ 第４Ａ表 結腸癌腫細胞系３３４７に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の補体 依存性細胞作用キメラＬ　６　２０　＋　２９ （腹水）　ＩＱ　＋２３ ２０　不活化　０ キメラＬ６　２０．＋　２９ （細胞培養物）　５　＋　２６ 標準Ｌ　６　２０　＋　５５ １０　＋　３７ ２０　不活化　０ ＊補体媒介細胞溶解性は４時間の５１Ｃｒ放出アツセイにより測定された。健常 被験者からのヒト血清を補体源として用いた。

第４Ｂ表 結腸癌腫細胞系３３４７に対するキメラＬ６及び標準（マウス）Ｌ６抗体の補体 依存性細胞作用抗体濃度　ヒト　細胞溶解率１ 抗体　４ｇ　／　ｍ＋　補体　％ キメラＬ　６　１０　＋　２０９ （腹水）５　＋　１５５ 標準Ｌ６１０＋９６ ＊補体媒介細胞溶解性は４時間の５ＩＣ，放出アッセイにより測定された。健常 被験者からのヒト血清を補体源として用いた。

英文テキスト第６１及び６２頁の抄訳 寄託機関：アメリカン・タイプ帝カルチャーーコレクション住　所：　１２３０ １バークローン、ドライブ、ロックビル、メリーランド　２０８５２　、アメリ カ合衆国微生物の表示　寄託臼　寄託番号 ハイブリドーマＣ２５Ｂ　１９８６年１０月２４日　ＨＢ９２４１キメラ抗体Ｄ ７トランスフエクト体 細胞 ハイブリドーマＣ２５５１９８６年１１月１４日　ＨＢ９２４０キメラ抗体３Ｅ ３トランスフェクト体 細胞 浄書（内容に変更なし） ３１　ヨ酵警旺　さ９倶１？屋多　さコ呆【υ　Ｌ＜　Ｃｂり　しυ　へ−ト　 α←（（ｆ−璽　ｌ！：Ｅ　ζ＝　≧３？　コｊ　い−・　・・・・　・・上・ ・　−・　Ｊｌ！：”ｔ；！　ｏ己、ｊ　：：　；８　；＝　Ｇ８　−ロＵ　＞ ＜　コ（Ｌ＋＋　−←　ｎ← ３じ　・己８５ｔｌ：　δ？　シ８　ごビ　民’　”’　”　”　’＝、−”： ｇ　”　”’・−一−−−）−＋（１１％　−ｓ−・−・−１α←　ｆＩＱい　 ＃Ｉｌｊ　ｄ’＋　５　りＯＯヒい　Ｌトい６″ゝ　ｕ（−Ｊ（Ｎ　ＯＨＭ　ｄ 　Ｌｕｔｎ　切ト１　０七　〇会　Ｇ８　５ｔ：　♂　：８　：：　（”υ　コ ロ　Ｏ（Ｌヒ ）−ｅａｎ−′ｕ　＠Ｉ。　・　３じ　計　奄１リ　コロ　慴←　Ｑロ　− ご　１１己０　；８　ｆ！：　きＳ冨　と８　Ｃ璽ｌ：＠と８関　；８＋ｔに　 ４　非 ｂ３　”Ｇ詳会爬２畔＝。ｉツ　２じス　β目（（←　−１ｊ　ＬＩ＋１１１Ｕ 　ζａ　＜　Ｌ　Ｌ５　−　Ｏ乙　’１％ｉ’！　、、；ｅ斗５　（ｊ　Ｑ　− ＋　’、３　．５！　Ｎ　ｊ２１５υ　仁Ｑ　叱ユロ　ｈべ　め←　０イ　ロ８ 　関土・Ｆ　１８　詠　−８〜８ こ　涯　５百　８斥　柱　０　５式 ％式％ ご　５１ニー七　ξｌ：　辱　。α　と８Ｓａｌ　Ｉ　Ｈｉｎｄ　ｍ Ａ。

手続補正書彷式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２８３２ ２、発明の名称 ヒト腫瘍抗原に対し特異性を有するキメラ抗体３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 インターナショナル、ジエネティック、エンジニアリング、インコーホレーテッ ド（ほか１名）平成２年２月２０日 （発送日　平成２年２月２７日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人の欄委任状、図面翻訳文 ７、補正の内容 （１）　別紙の通り 国際調査報告 ｐｃτ／υ５８７７０２Ｂ３２ λｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｔｏ　Ｆｏｒｚ　ｐｃτ／工ＳＡ／２ユＯ；　Ｐａｒｔ 　工。

−１１口ｔ−−＾−””ｌ呻１１−・　ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２８３２ＰＣＴ／ ［１５１４７１０２８３２ ｘｔｔａＣｈｍｅｎＷ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰｃＴ／ＩＳＡ／２１０．　ｐａｒｔ 　ＶＬＩＶ、　Ｃｌａｉｍ　２６　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｉｍａｇｉｎｇ、　Ｃ１ ａｓｓ　１２Ｂ、　５ｕｂｃｌａｓｓ　６５゜

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズミ抗体により結合される 抗原に特異性を有する、免疫グロブリン鎖の可変領域についてコードするｃＤＮ Ａ配列を含むポリヌクレオチド分子。
2. ２．鎖がＨ鎖である、請求の範囲第１項に記載の分子。
3. ３．鎖がＬ鎖である、請求の範囲第１項に記載の分子。
4. ４．ヒト免疫グロブリン鎖の不変領域についてコードする付加配列を更に含む（ 双方の配列は互いに操作可能な結合状態にある）、請求の範囲第１項に記載の分 子。
5. ５．付加配列がｃＤＮＡ配列である、請求の範囲第４項に記載の分子。
6. ６．付加配列がゲノム配列である、請求の範囲第４項に記載の分子。
7. ７．組換えＤＮＡ分子である、請求の範囲第１項に記載の分子。
8. ８．二重鎖ＤＮＡ形である、請求の範囲第７項に記載の分子。
9. ９．発現性ビヒクルである、請求の範囲第７項に記載の分子。
10. １０．ビヒクルがプラスミドである、請求の範囲第９項に記載の分子。
11. １１．請求の範囲第４項に記載された分子で形質転換された原核細胞宿主。
12. １２．細菌である、請求の範囲第１１項に記載の宿主。
13. １３．請求の範囲第４項に記載された分子で形質転換された真核細胞宿主。
14. １４．酵母又は哺乳動物細胞である、請求の範囲第１３項に記載の宿主。
15. １５．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるＬ６ネズミモノクローナル 抗体により結合される抗原に特異性を有する可変領域及び不変ヒト領域を含むＨ 免疫グロブリン鎖。
16. １６．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるＬ６ネズミモノクローナル 抗体により結合される抗原に特異性を有する可変領域及び不変ヒト領域を含むＬ 免疫グロブリン鎖。
17. １７．２本のＬ鎖及び２本のＨ鎖（これら鎖の各々は、細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６ ７７により分泌されるＬ６ネズミモノクローナル抗体により結合される抗原に特 異性を有する可変領域及び不変ヒト領域を含む）を含むキメラ抗体分子。
18. １８．検出可能に標識された形である、請求の範囲第１７項に記載の抗体。
19. １９．水不溶性固相上に固定された、請求の範囲第１７項に記載の抗体。
20. ２０．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズミモノクローナル抗体 により結合される抗原に特異性を有する可変領域及び不変ヒト領域を含む免疫グ ロブリンＨ鎖の産生方法であって、 培養条件下で上記鎖を発現しうる宿主を培養し；及び上記培養物から上記Ｈ鎖を 回収する； ことを特徴とする方法。
21. ２１．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズミモノクローナル抗体 により結合される抗原に特異性を有する可変領域及び不変ヒト領域を含む免疫グ ロブリンＬ鎖の産生方法であって、 培養条件下で上記鎖を発現しうる宿主を培養し；及び上記培養物から上記Ｌ鎖を 回収する； ことを特徴とする方法。
22. ２２．Ｈ鎖及びＬ鎖（これらＨ及びＬ鎖の各々は、細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７ により分泌されるネズミモノクローナル抗体により結合される抗原に特異性を有 する可変領域及び不変ヒト領域を含む）を含むキメラ免疫グロブリンの産生方法 であって、 培養条件下で上記Ｈ鎖もしくは上記Ｌ鎖又は双方を発現しうる宿主を培養し；及 び 上記培養物から上記キメラ免疫グロブリン分子を回収する； ことを特徴とする方法。
23. ２３．宿主が原核細胞である、請求の範囲第２０、２１又は２２項に記載の方法 。
24. ２４．宿主が真核細胞である、請求の範囲第２０、２１又は２２項に記載の方法 。
25. ２５．サンプル中における、細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズ ミモノクローナル抗体と結合しうる抗原の検出用の免疫アッセイ方法であって、 上記サンプルを請求の範囲第１７項に記載された抗体と接触させ；及び 上記抗体が上記抗原と結合するか否かについて検出する； ことを特徴とする方法。
26. ２６．細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズミモノクローナル抗体 と結合しうる抗原を検出するためのインビボ又はインビトロイメージング方法で あって、 上記抗原を請求の範囲第１８項に記載された標識抗体と接触させかつ上記抗体を 検出することを特徴とする方法。
27. ２７．抗原（この抗原は、細胞系ＡＴＣＣＨＢ８６７７により分泌されるネズミ モノクローナル抗体と結合することができる）をその上に担持した細胞の死殺方 法であって、 上記細胞を請求の範囲第１７項に記載された抗体と接触させることを特徴とする 方法。
28. ２８．死殺が細胞の補体媒介溶解により生じる、請求の範囲第２７項に記載の方 法。
29. ２９．死殺がＡＤＣＣにより生じる、請求の範囲第２７項に記載の方法。