JP2001517423A - ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ンジ領域を含むタンパク質および薬物における前記タンパク質の使用に関する。
ばしばin vivoにおける有効な抗体親和性を達成するために必要であるが、エフ ェクター機能またはFcドメインによって付与される長期の血清耐久性を有さない
(文献番号1〜3−本明細書中、文献は番号によって表されている。本明細書の
以下に記載の「参考文献」のリストを参照のこと)。F(ab')2分子は、この必要 性を満たし、適切なイソタイプのモノクローナル抗体のタンパク質分解切断また
はE. coli中で産生されたドメイン由来の組換え免疫グロブリンの使用して産生 することができる。
とは、E. coliを使用することにより、費用効果および巨大市場に供給するのに 必要とされる抗体物質を迅速に生産することができる(文献番号4、5)。操作
されたFab'は、しばしばたった1個のヒンジ−システインで発現する。このシス
テインは、F(ab')2を作製するための他のFab'の付着または放射性核種、酵素、 またはトキシンなどの治療エフェクター分子の付着に使用することができる(文
献番号6)。
合種を産生するためのいくつかのタンパク質工学アプローチが報告されている。
単純なヒンジ修飾では、E. coli由来の二量体種は、in vivoで実質的に得られな
い(文献番号7〜9)。in vivoで二量体化を増大させる技術は十分に特徴づけ られているが、これらは、しばしば潜在的に免疫原性で、溶解タンパク質の発現
レベルを非常に減少させることが可能な巨大な非免疫グロブリン二量体化モチー
フを使用する(文献番号10〜13)。二量体抗原結合種の最も単純なルートと
しては、in vitroでのFab'の直接的ジスルフィドまたは化学的架橋がある(文献
番号2、7、14、15)。2つのFab'の間の共有結合の選択は、非常に重要な
選択である。(Fab')2がin vivoで切断されるならば、得られたFab'は結合活性の
喪失および循環系からの非常に迅速な浄化値の両方が欠点となる(文献番号1、
2)。一本のジスルフィド結合は、保護されたジスルフィド、スルフィド、また
はチオエーテル結合よりもin vivoにおいて切断の影響を受けやすいことが公知 である(文献番号2、9、16)。しかし、IgG1のタンパク質分解切断から単 離された(Fab')2のヒンジ領域に見出される2つのジスルフィド結合は、血清耐 久性によって判断された1つのチオエーテル結合と同じぐらい強力であることが
以前に見出されている(文献番号9)。
in vivo切断の問題を克服する非免疫原性二量体抗体種が必要である。本発明者 らは、今回、Fab'フラグメントなどの巨大タンパク質の一部である場合、効率よ
く二量体を作製し、そしてin vitroでの化学的還元に高い耐性があり、かつin v
ivoで長い血清耐久性時間を有する二量体を産生するペプチドを見出した。有利 には、ペプチドはE. coli中で非常に耐性があり、本発明者らの今回の試験にお いて免疫原性を示さなかった。
ドを提供するN TCPPCPXYCPPCPAC...(1) (式中、XおよびYは同一でも異なっていてもよく、かつそれぞれ中性脂肪族Lア ミノ酸残基、ならびに保護され、反応性のあるその誘導体である)。
アミノ酸残基を示すために従来の一文字表記を使用する。上付き文字の「N」お よび「C」は、それぞれペプチドのN−およびC−末端を示すために使用する。
ルボキシル基が保護誘導体に結合しているN−およびC−末端保護誘導体が含まれ
る。N−保護誘導体には、例えば、ベンジルオキシ−カルボニルアミノ、アリル オキシカルボニルアミノ、シクロアルキルオキシカルボニルアミノ、t−ブトキ シカルボニルアミノ、トリフルオロアセチルアミノ、フタリルアミノ、アラール
キルアミノ、例えば、ベンジルアミノ、ジフェニルメチルアミノもしくはトリフ
ェニルメチルアミノ、トシルアミノまたはホルミルアミノ誘導体又はこれらの置
換体が含まれる。C−保護誘導体には、任意に置換されたエステル、例えばアル キルエステル(メチル、エチルまたはt−ブチル)、アラールキルエステル(例 えば、ベンジルまたはベンツヒドリル)、シリルエステル(例えば、トリメチル
シリル)および、フタリミドメチルエステルならびにポリマーとのエステル(例
えば、官能基化スチレンベースの樹脂)が含まれる。
ゲン化物、アシルシアニドまたはアジド、無水物、エステル(例えば、N−ヒド ロキシスクシンイミド、p−ニトロフェニルまたはペンタクロロ−フェニルエス テル)、N−アシルイミダゾール、ピラゾールもしくはトリアゾールなどのN−ア
シル複素環またはカルボジイミドもしくはイソキサゾリウム試薬の添加によって
形成された活性酸である。
を含む。別の好ましい態様においては、Yは特にトレオニン残基である。本発明
の特に有用なペプチドは、以下の式(2)N TCPPCPATCPPCPAC...(2) およびそれらの保護され、反応性のあるその誘導体である。
ience、(1985)、232、341〜347を参照のこと)を用いて適切に 活性化および/または保護されたアミノ酸(例えば、式(1)のペプチドと共に
記載された型の反応性誘導体および保護基を利用する)から調製してもよい。
および/またはチオエーテル結合を形成する4つの反応中心を提供し、よってチ
オール反応基を含む他の分子との反応を可能にする。特に、二量体タンパク質は
、タンパク鎖中にペプチドを組み込むことによって得られ、本発明はこのような
用途にも関する。タンパク質の二量体化を達成するために、式(1)のペプチド
は、現存のタンパク質に最初にカップリングされるか、またはde novoでその一 部として合成されるかしなければならない。従って、本発明の別の態様において
、鎖がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC(式中、XおよびYは、式(1)のペプチ
ドとして規定される)によって特徴づけられる1つのポリペプチド鎖を含むタン
パク質を提供する。
介して共有結合された2つのポリペプチド鎖を含むタンパク質に関する。従って
、本発明の更なる態様では、本発明者らは、2つのポリペプチド鎖を含むタンパ
ク質であって、各鎖がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC(式中、XおよびYは式(
1)のペプチドとして規定される)を含み、そして各々の鎖は、前記各アミノ酸
配列に存在する1、2、3または4つのシステイン残基のいずれかを介して共有
結合していることを特徴とするタンパク質を提供する。
、配列NTCPPCPAYCPPCPACであるかNTCPPCPXTCPPCPACであり、特に配列NTCPPCPATC
PPCPACである。
存在するタンパク質かまたはアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPACが組み込まれた組換
えタンパク質であってもよい。タンパク質は、一般に、構造タンパク質または、
特に結合タンパク質であってもよい。特定の結合タンパク質には、ホルモン、サ
イトカイン、コロニー刺激因子、成長因子、放出因子、イオンキャリア、トキシ
ンおよびそれらのレセプター(細胞表面結合分子への結合に関連するレセプター
、T細胞レセプター、CD4、CD8,CD28、サイトカインレセプター(例えば
、インターロイキンレセプター、TNFレセプターまたはインターフェロンレセプ ター)、コロニー刺激因子のレセプター(例えば、G-CSFまたはGM-CSF)を含む )、血小板由来成長因子(例えば、PDGF-αおよびPDGF-β)ならびに特に、抗体
およびそのフラグメントに結合する抗体種の全体又は一部分が含まれる。
を有する場合、タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく1つまたはそれ
以上の他のポリペプチド鎖に別々に連結して包括的な多量体構造を形成してもよ
い。共有結合したNTCPPCPXYCPPCPAC配列を有する2つのポリペプチド鎖を含む本
発明のタンパク質において、タンパク質は、少なくとも二量体であることは明確
であるが、他の、別々に連結した鎖から成り、包括的な多量体構造を形成しても
良い。二量体および多量体は、1つ以上の型のポリペプチド鎖で構成されてよく
、ホモメリックまたはヘテロメリックであっていてもよい。
パク質およびペプチドの活性化され保護された誘導体を使用するタンパク質およ
び式(1)のペプチドの化学的カップリングが含まれる。この方法では、例えば
、式(1)のペプチドは、適切なC−活性化タンパク質のC−末端に部位特異的に
カップリングできる。
いて、タンパク質をコードするDNAを、DNAをベクター中の必要とされる任意の発
現調節エレメントに操作可能に連結して任意の適切な発現ベクターに導入して、
そのベクターを用いて適切な任意の原核生物または真核生物宿主細胞を形質転換
してもよい。適切な技術のより詳細な記載を、本発明の明細書中の抗体産生に関
する箇所に示す。これらは、一般に、組換え手段による本発明の任意のタンパク
質の産生を可能にすることを後に行いおよび/または容易に適用してもよい。組
換えDNA技術の使用は、タンパク質中の所望の任意の部位で式(1)のペプチド の容易な操作および挿入できるという点で、本発明のタンパク質に対する柔軟な
アプローチを提供する。従って、式(1)のペプチドをコードするDNAは、特に 有用であり、本発明の更なる態様を形成する。アミノ酸配列NTCPPCPATCPPCACを コードする以下のヌクレオチド配列: 5'ACATGCCCGCCGTGCCCGGCGACCTGCCCGCCGTGCCCGGCG3' (各文字はヌクレオチドの標準的な記号を示す)を含むDNAは、特に有用である 。本発明は、本配列ならびに遺伝コードの縮重によって1つまたはそれ以上のヌ
クレオチドが置換されているその変異体を含むDNAに関する。本発明はまた、式 (1)のペプチドをコードするDNAを含む組換えプラスミド、前記プラスミドを 含む細胞、および前記細胞を培養することにより所望のタンパク質を発現させ、
培養物からタンパク質を回収する工程を包含する本発明のタンパク質産生法に関
する。
領域として機能する細胞表面レセプターまたは抗体などの結合タンパク質と使用
するのに特に有用である。従って、例えば、有効なレセプター結合に必要な個々
のレセプター鎖の二量体化を促進するためのこれらの配列を組み込む組換えレセ
プター(例えば、国際特許明細書WO92/100591、WO92/15322、WO
93/19163、WO95/02686およびWO97/23613を参照のこと) がデザインされる。本発明は、式(1)のペプチドを少なくとも1つ含む組換え
レセプターに関する。このようなレセプターは、例えば、細胞に再指向するかま
たは活性化するのに有用である(上記特許明細書を参照のこと)。本発明は、式
(1)のペプチドを少なくとも1つ含む組換えレセプターを発現する細胞を含む
。
領域は、天然に存在する免疫グロブリンのCH1とCH2ドメインとの間に位置する
)に対する置換物として使用できる。配列は、本目的に特に適切であり、本発明
の好ましい態様では、本発明者らは、ヒンジ領域がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCP
AC(式中、XおよびYは、式(1)で規定されている)を有することによって特
徴づけられる、ヒンジ領域を含む抗体を提供する。この例において、ヒンジ領域
は、好ましくは、アミノ酸配列NTCPPCPAYCPPCPACまたはNTCPPCPXTCPPCPACを有し
、特にNTCPPCATCPPCPACを有する。
抗体を含むことが意図される。従って、例えば、本発明の一価の抗体は、免疫グ
ロブリン重鎖可変(VH)ドメインおよび好ましくはVHドメインのC−末端で直接
付着したNTCPPCPXYCPPCPACヒンジ領域を含む一本鎖であってもよい。あるいは、
VHドメインおよびヒンジ領域は、互いにまたは抗体の他の部分とペプチド結合す
る1つまたはそれ以上のアミノ酸を含むスペーサー領域によって分離してもよい
。スペーサー領域は、例えば、1つまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖(CH)
または軽鎖(CL)定常ドメインまたはそのフラグメント(例えば、CH1ドメイン
またはそのフラグメントおよび/またはCH2および/またはCH3ドメインまたは
そのフラグメント)であってもよい。所望の場合、上に述べた通り、ヒンジ領域
が、そのC−末端に付着した1つまたはそれ以上のアミノ酸(例えば、1つまた
はそれ以上の免疫グロブリン定常領域ドメインまたはそのフラグメント)を有す
ることができる。VHドメインは、単量体または二量体でよく、そしてVH−VHまた
はVH−VL(VLは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン)二量体(VHおよびVL鎖は 、非共有結合的に連結している)を含む。しかし、必要であれば、鎖は、2つの
可変ドメイン間のジスルフィド結合を介する等して直接、若しくはペプチドリン
カー等のリンカーを介して共有結合的にカップリングし、一本鎖ドメインを形成
することができる。本発明の一価の抗体の特定の例として、各々が配列NTCPPCPX
YCPPCPACを有するヒンジ領域を含む、Fv、一本鎖FV、および特にFabまたはFab' フラグメントが含まれる。
は4つのシステイン残基を介して共有結合された上に記載の2つの単量体鎖を含
む。結合は単純なジスルフィド結合とすることができ、例えば、国際特許明細書
WO90/09195およびWO90/09196に記載のリンカー基を介することが
できる。特定の二価の抗体は、F(ab)2およびF(ab')2フラグメントを含む。
した上記の3つまたは4つの単量体の鎖を含む三価または四価の抗体が含まれ、
それは、例えば、国際特許明細書第92/22583号に記載されている。
合性抗原(例えば、T細胞、内皮細胞または腫瘍細胞マーカーなどの細胞表面抗
原)であってもよく、あるいは可溶性抗原であってもよい。細胞表面抗原の特定
の例として、接着分子、例えばE−セレクチン、P−セレクチンまたはL−セレク チンなど、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、
CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52 、CD69、癌胎児性抗原(CEA)、ヒト乳脂肪グロブリン(HMFG1および2)、M
HCクラスIおよびMHCクラスII抗原およびVEGFならびに適切な場合そのレセプター
が含まれる。可溶性抗原には、インターロイキン例えばIL-1、IL-2、IL-3、I
L-4、IL-5、IL-6、IL-8またはIL-12など、ウイルス抗原例えばRSウイルス
またはサイトメガロウイルス抗原など、インターフェロン例えばインターフェロ
ン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γなど、腫瘍壊死因子−α
、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子例えばGCSFまたはGM-CSFなど、および血
小板由来成長因子例えばPDGF−αおよびPDGF−βなど、ならびに適切ならば、そ
のレセプターが含まれる。
ジョンであってもよい。操作バージョンとは、組換えDNA操作技術を用いて作製 された可変領域ドメインを意味する。このような操作バージョンには、例えば、
天然の抗体のアミノ酸配列の挿入、欠損または置換により、天然の抗体可変領域
から作られたものが含まれる。この型の具体例として、少なくとも1つの相補性
決定領域(CDR)および必要に応じて1つまたはそれ以上の第一の抗体由来のフ レームワークアミノ酸ならびに第二の抗体由来の可変領域ドメインの残りの部分
を含む操作された可変領域ドメインが含まれる。
な抗体、特に完全なモノクローナル抗体から、任意の適切な標準的酵素切断およ
び/または分解技術(例えば、ペプシンで処理後、式(1)のペプチドまたはそ
の保護あるいは活性化誘導体を、式(1)のペプチドの産生に関する上記の慣用
のタンパク質合成技術を用いて化学的にカップリングする)により、得ることが
できる。あるいは、本発明の抗体は、抗体の可変領域および/または定常領域を
コードするDNAの操作および再発現を包含する組換えDNA技術の使用によって調製
できる。このようなDNAは公知および/または例えば、ファージ−抗体ライブラ リーを含むDNAライブラリーから容易に得られる(Chiswell、D.J.およびMcCafer
ty、J. Tibtech.、10、80〜84、1992を参照のこと)かまたは所望で あれば合成できる。DNAを配列決定および操作するために、標準的な分子生物学 および/または化学手順が使用される。例えば、配列NTCPPCPXYCPPCPACを作製す
るためにコドンを移入し、他のアミノ酸またはドメインを所望の通り修飾、付加
または欠損させる。
およびリーダー配列)を含むべきである。本方法における特定の抗体産生法は、
周知であり、そして慣用的に使用されている。例えば、基本的な分子生物学的手
順は、Maniatisら(Molecula Cloning、Cold Spring Harbor Latoratory、New Y
ork、1989)によって記載されている。DNA配列決定は、Sangerら(PNAS、7
4、5463、1997)およびAmersham International plc sequencing hand
bookに記載のように行い得る。部位特異的変異誘発は、Kramerらの方法(Nucl.
Acids Res.、12、9441、1984)およびAnglian Biotechnology社のハ ンドブックに従って行い得る。さらに、DNAの操作による抗体の調製、発現ベク ターの作製および適切な細胞の形質転換に適切な技術を説明する特許明細書を含
む多数の出版物が存在し、これらは例えば、Mountain AおよびAdair J RのBiote
chnology and Genetic Engineering Review(Tombs, MP編、10、第1章、19
92、Intrercept、Andover、UK)および国際特許明細書第WO91/09967に
概説されている。一旦発現すると、抗体は宿主細胞から分離され、標準的な遠心
分離、濾過、クロマトグラフィーおよび他の分離/精製技術例えば、以下の実施
例に記載されているものを用いて精製され得る。
はそれ以上のエフェクターまたはレセプター分子を有していても良い。本発明は
、このような修飾タンパク質および、特に、抗体に関する。エフェクターおよび
レポーター分子は、タンパク質中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖また
は末端アミノ酸官能基(例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ
ル基またはカルボキシル基)を介してタンパク質に付着し得る。しかし、好まし
くは、分子は、アミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC中のシステイン残基に付着しても
よい。これらの配列を含む二量体は、in vitroにおける化学的還元に特に耐性を
示し、エフェクターまたはレポーター分子が付着される反応性チオールを曝露す
るのに有利に部分的還元できる。1、2、3、または4つのエフェクターまたは
レポーター分子がこの方法で付着できる。
の酵素活性トキシンおよびそのフラグメント(例えばリシン(ricin)およびその フラグメント)など)、生物学的に活性なタンパク質(例えば酵素)、合成また
は天然に存在するポリマー、核酸およびそのフラグメント(例えば、DNA、RNAお
よびそのフラグメント)、放射性核種(特に放射性ヨウ素)ならびにキレート化
金属が含まれる。適切なレポーター基には、キレート化金属、蛍光化合物または
NMRまたはESR分光法によって検出し得る化合物が含まれる。
トロジェンマスタードなどのアルキル化剤(例えば、クロラムブシル、メルファ
ラン、メクロレタミン、シクロホスファミドまたはウラシルマスタード)および
その誘導体、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブ
スルファンまたはシスプタチン、代謝拮抗物質例えばメトトレキセート、フルオ
ロウラシル、フロクスウリジン(floxuridine)、シタラビン、メルカプトプリン 、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸、抗生物質例えばブレオ
マイシン(例えば、ブレオマイシンスルフェート)、ドキソルビシン、ダウノル
ビシン、ミトマイシン(例えば、ミトマイシンC)、アクチノマイシン(例えば
、ダクチノマイシン)、プリカマイシン、カリカエミシンおよびその誘導体また
はエスペラミシンおよびその誘導体など;有糸分裂インヒビター例えばエトポシ
ド、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびその誘導体など;アルカロイド
例えばエリプチシンなど;ポリオール例えばタキシシン−Iまたはタキシシン−I
Iなど;ホルモン例えばアンドロゲン(例えば、ドロモスタノロンまたはテスト ラクトン)、プロゲスチン(例えば、メゲストロールアセテートまたはメドロキ
シプロゲステロンアセテート)、エストロゲン(例えば、ジメチルスチルベスト
ロールジホスフェート、ポリエストラジオールホスフェートまたはエストラムス
チンホスフェート)またはアンチエストロゲン(例えば、タモキシフェン))、
アントラキノン例えばミトキサントロンなど、尿素例えばヒドロキシ尿素;ヒド
ラジン例えばプロカルバジンなどまたはイミダゾール例えばダカルバジンなどが
含まれる。
は分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマ
ー例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアル
コールおよび特に、メトキシポリエチレングリコール、または分枝状および非分
枝状多糖類例えばラクトース、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンな
どのホモまたはヘテロ多糖が含まれる。
まれる。このような金属の具体例として、テクネチウム(Tc)、レニウム(Re)
、コバルト(Co)、銅(Co)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、ビスマス(Bi)
、インジウム(In)、ガリウム(Ga)、イットリウム(Y)、テルビウム(Tb) 、ガドリニウム(Gd)、スカンジウム(Sc)が含まれる。一般に、金属は放射性
核種である。特定の放射線核種には、99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu 、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y 、160Tb、153Gdおよび47Scが含まれる。
式ポリマー、ポリエーテル(例えば、クラウンエーテル、およびその誘導体)、
ポリアミド、ポルフィリン、および炭素環式誘導体でキレート化された金属の上
記タイプの1つであってもよい。
ンジュゲートにおける1つの特に有用なキレート試薬の基は、非環式および環式
ポリアミン、特にポリアミノカルボン酸例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸
およびその誘導体、巨大環式アミン例えば環式トリ−アザおよびテトラ−アザ誘
導体(例えば、国際特許明細書WO92/22583に記載されている)、および ポリアミド、特にデスフェリオックスアミンおよびその誘導体である。
ば、南アフリカ特許明細書第85/8794号、同第88/8127および同第9
0/2839を参照のこと)。
を所望する場合、タンパク質が直接かまたはカップリング剤を介してエフェクタ
ーまたはレポーター分子に連結される標準的な化学または組換えDNA手順によっ て調製しうる。特定の化学手順には、例えば、国際特許明細書WO93/0623 1、WO92/22583、WO90/09195およびWO89/01476および官 能基(例えばタンパク質中のチオールおよび必要なら適切に活性化されたエフェ
クターおよびレポーター分子(例えば、標的がタンパク質チオール基であるマレ
イミドなどのチオール選択性誘導体))を利用した本明細書中の実施例に記載の
手順が挙げられる。あるいは、エフェクターまたはレポーター分子がタンパク質
またはポリペプチドであるならば、結合は、組換えDNA手順例えば、本明細書、 国際特許明細書WO86/01533および欧州特許明細書第392745号に記 載されている手順を用いて達成できる。
することができる。このような疾患または障害には、感染症例えば、ウイルス感
染、炎症性疾患/自己免疫(例えば、慢性リウマチ関節炎、骨関節炎、炎症性腸
疾患)、癌、アレルギー性/アトピー性疾患(例えば、喘息、湿疹)、先天性疾
患(例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血)、皮膚病(例えば、乾癬)、神経
疾患(多発性硬化症)、移植(例えば、器官移植片拒絶、移植片対宿主病)、お
よび代謝/特発性疾患(例えば、糖尿病)等の一般的な項に記載の疾患または障
害が含まれ得る。
きる。本発明のさらなる態様では、本発明者らは、薬学的に受容可能な賦形剤、
希釈剤またはキャリアとともに本発明のタンパク質を含む薬学的組成物を提供す
る。上記説明のように、本発明の本態様におけるタンパク質は、必要に応じて1
つまたはそれ以上のエフェクター基あるいはレポーター基に連結できる。
えば、注射または注入(例えば、ボーラス注射または連続的注入による)に適切
な形態を取り得る。組成物が注入又は注射用であるならば、油性または水性ビヒ
クル中の懸濁液、溶解液または乳濁液の形態を取ることができ、そして懸濁剤、
保存剤、安定剤および/または分散剤などの製剤を含んでもよい。
形態であってもよい。
ガイモ、トウモロコシまたは小麦デンプンなどのデンプン、もしくはセルロース
または微結晶セルロースなどのセルロースまたはデンプン誘導体、シリカ、ラク
トースなどの種々の糖、炭酸マグネシウムおよび/またはリン酸カルシウムなど
の添加物を含むことができる。製剤が経口投与用である場合、患者の消化系に対
して良好な耐性を有することが望ましい。この目的のため、処方において粘液形
成および樹脂を含むことが望ましい。胃液に不溶なカプセルにタンパク質を入れ
ることで耐性を改善することが望ましい。放出調節製剤中にタンパク質または組
成物を含ませることが好ましい。
潤滑剤例えば、重合グリコール、ゼラチン、ココアバターまたは他の植物性ワッ
クスまたは脂肪を含んでいてもよい。
タンパク質をヒト被験体に投与する工程を包む。投与すべき正確な量は、タンパ
ク質の使用および年齢、性別および患者の健康状態によって変化するが、典型的
には、約0.1mg〜1000mg(例えば、1mg〜500mg)で変化する。タンパ ク質は、単回量または期間中連続様式で投与できる。用量は、適切に反復できる
。典型的な用量は、例えば、0.1〜50mg/kg体重/単回治療用量、詳細には 、0.1〜20mg/kg体重/単回治療用量であり得る。
EG ポリエチレングリコール。
のある鎖間の任意のジスルフィド結合を最小にするために、鎖間のジスルフィド
結合を全てのFab'から取り除いた。ジ−Fab'の鎖間のジスルフィド結合の除去は
、血清耐久性時間で判断したように、タンパク質の安定性に影響を与えないこと
が以前に示されている(文献番号9)。PCR変異誘発を使用して、cκおよびCH1
の鎖間システインをセリンと交換した。これはまた、非還元SDS-PAGEによる周辺
質抽出物の分析後、重鎖(HC)特異的ウエスタンブロッティングによってジ−Fa
b'形成%の分析を可能とした。従って、このアプローチは、振盪フラスコ規模で
の多数の構築物の分析を可能にした。利点は、アニーリングオリゴヌクレオチド
カセットとして新規のヒンジ配列の迅速なクローニングを促進するために、SpeI
制限部位を移入してCH1の変異誘発を得たことである。この部位を移入するため
に、重鎖中の鎖間のジスルフィドCysに付くSer N末端をThrに置換し、それによ りCH1のC末端がNKSCDKTHTCAACからNKTSDKTHTCAACに変化した。(変更部は下線 )
ractical Approach」(Rees、AR、Starnberg、M.J.E.およびWetzelら編)、IRL
Press、Oxford、303〜326頁)に基づき、そしてW3110(野生型E. col
i ATCC 27325)を形質転換するために使用した。
TGAAGCTC-3'を用いるPCR変異誘発によってSerと置換した。
TTGGGCTCAACTTTC-3'を用いてSpeI制限部位を移入した。
ヒンジ配列を、同様に制限したA5B7g3 HCプラスミドのみを介して5'SpeI-Hi nd III3'末端を有するアニーリングオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、
その後最終ジシストロン発現プラスミドの再構築によって産生した。
GGAGAGTCTTGAGGAGGAAAAAAAAATGAAG-3'を用いて変異した。
ラスミドへ移動させた。 Fab 40.4最終発現プラスミドpDPH40中のSpeI部位
がユニークだったので、5'SpeI-NotI3'突出部を有するアニーリングオリゴヌ クレオチド対を同様の制限pDPH40に直接ライゲーションすることにより、更な
るヒンジ変異体が作製可能であった。ヒンジ配列およびプラスミドの詳細を、表
1に示す。DNA操作工程の間、Wada, K.N.ら、Nucleic Acidds Res.、1991、
19、1981に規定のE. coliの好ましいコドンを選択した。
験であり、10μgml-1のテトラサイクリンを必要としたことを除いて本質的に 前記のように行った(Humphreys, D.P.、ら、FEBS Lett.、1996、380、 194)。A5B7を用いる全ての実験にL-Brothを使用し、可能な限り最高な細 胞密度を得るために、2×TYをFab 40.4を用いる実験のために使用した。酸 化還元活性化合物を固体として添加して、必要な場合1mMの最終濃度にした。サ
ンプルを、0、1、2および4時間後誘導として採取した。
0.02 g/L MnSO4・4H2O、0.005 g/L CuSO4・5H2O、0.004 g/L CoSO 4 ・6H2O、0.0967 g/L FeCl3・6H2O、0.0003 g/L H3BO3、0.000
2 g/L NaMoO4)。炭素源としてグリセロールを3%(w/v)で使用し、MAZUを消
泡剤として0.02%(v/v)で使用した。pHを50%(v/v)NH4OHで調節した。
Fab'発現を、炭素源を5%(w/w)のラクトースと切り替えることによって誘導 し、細胞を24〜36時間の誘導後に回収した。Fab'回収率は、典型的には10
0〜150mg/Lであった。
5倍量のdH2Oで希釈し、非還元SDS-PAGEローディング緩衝液で5分間ボイルし、
4〜20% Tris−グリシンゲル(Novex)により、125vで1.75時間電気泳
動した。タンパク質を、100mAで2時間PVDFメンブラン(Novex)にトランス ファーした。メンブランを50ml/メンブランの「ブロッキング緩衝液」(PBS /0.1%(v/v)Tween 20/2%(w/v)スキムミルク)を用いて室温で1時 間ブロッキングし、「抗体緩衝液」(PBS/0.1%(v/v)Tween 20/0.1%
「ブロッキング緩衝液」)中、1/1000(v/v)で5ml/メンブランの抗Fd 抗体(ヒツジIgG抗ヒトIgG(Fd)、ref.PC075、The Binding Site、Biringha
m、U.K.)を用いて室温で1時間振盪した。メンブランを大量のPBS/0.1(v/v
)Tween 20で洗浄し、「抗体緩衝液」中、1/1000(v/v)で5ml/メン ブランのロバ抗ヒツジHRP複合化抗体(ウサギF(ab')2抗ヒツジIgG Fcフラグメ
ントHRPコンジュゲートref.313-036-046 Jackson)を用いて室温で1時間振盪し
た。メンブランを大量のPBS/0.1%(v/v)Tween 20で洗浄し、DAB基質(Pie
rce)で現像した。LC交差反応バンドを、それぞれ、図1と2のレーン4および 1に示す。ブロットのライフサイズ陽性透明度を、ImageQuantソフトウェアバー
ジョン4.2を用いて、Molecular Dynamics モデル300Aマシンによるレーザ ースキャニングデンシトメトリーのために使用した。電気泳動の間に、ジ−Fab 由来の重鎖(ジ−HC)を、Fab由来HC(遊離HC)から分離する。各レーンにおけ る容易に同定できる2つのバンドの相対強度の定量により、形成されたジ−Fab %の評価を得た。これにより、相対的に一定レベルHCが産生され、LCと異なるFa
b'変異体との間に会合が生じたと推測される。使用したpTTO-1由来のプラスミ ドは、LCを過剰に産生し、周辺質の遊離HCは、検出不可能であった(Shauna Wes
t、personal communication)。鎖間のジスルフィド結合を欠くタンパク質のジ −HCは、鎖間にジスルフィド結合を有する精製Fab'スタンダードと類似した移動
度で移動する(図1のレーン11および3を比較のこと)。各ピークの全吸光度
を定量化し、各サンプルのジ−Fab%を以下のように計算した:ジ−HC バンドの 吸光度÷ジ−HCバンドの吸光度+HCバンドの吸光度。
2.5M TrisでpHを6.5まで上昇させ、P.B.S.で予め平衡化したProteinG sepha
rose(GammaBind、Pharmacia Biotech)カラムに供した。P.B.S.で洗浄して非結
合の物質を取り除いた後、Fab'関連物質を0.1M Glycine.Cl(pH 2.7)でカ ラムを洗浄することによって溶出した。溶出物のpHを、4℃で保存するために2
.5MのTris で中性まで上昇させた。精製後のFab'濃度は、典型的には0.2mgm
l-1以下であった。
、中央のヒンジ配列リピートの数を示し、ローマ数字はスペーサー残基の数を示
し、タンパク質が鎖間のジスルフィド結合形成システインを有するか欠いている
かを示す。例えば、pDPH34は、A5B7g3ヒンジ2ivインターを発現し、これ は4つのアミノ酸によってスペースが空けられた、鎖間のジスルフィド結合を欠
く2つのヒンジ反復を有するA5B7のグラフト3である。pDPH42はFab'40. 4ヒンジ20+Cysを発現し、2つのヒンジリピートを有し、スペーシング残基を
有さず、鎖間にジスルフィド結合を有する)。これらを、振盪フラスコ培地中の
ジ−Fab'を形成する能力についてウェスタンブロッティングおよびヒンジ1/2 およびヒンジ1構築物と比較して判断することによって評価した。結果を表IIに
示す。
o」は、中位量のジ−Fab'を産生した(それぞれ、7.3%および4.8%)。次 いで、これらのバージョンをより高く発現させたFab 40.4において作製し、 これらのFabの周辺質タンパク質濃度の増加がin vivoでのジ−Fab'形成の増加に
影響を及ぼすかを観察し、漸増数のヒンジリピートの数を増やすことの相対メリ
ットを識別した。
可能なジ−Fab'を産生しなかったことは、驚くべきである。これらのスペーシン
グ領域の長さおよび柔軟性が増加することにより、ヒンジリピートの第2のコピ
ーが再び折り畳まれ、イントラ−HCジスルフィド結合を形成でき、それにより、
所望のインター−HCジスルフィド結合の形成からシステインを遮蔽する。この仮
定を直接証明することは非常に難しいが、堅いポリプロリンIIヘリックスの間の
内因性スペーシング残基の1つ(Ala)または2つ(Ala-Thr)を取り除くことに
よってスペーシング/柔軟性が減少した2つの新規の構築物をFab 40.4を用 いてデザインした。表IIに示した結果は好ましくなかったので、ヒンジの3つの
コピーを有するFab'40.4(「ヒンジ30」)を作製した。
定して減少することを示す。このジ−Fab'%の減少は、タンパク質がよりシステ
インリッチになるにつれて周辺質中のタンパク質の毒性が増大することによると
推測され得る。ジ−Fab'%の減少は、低いO.D.600ピークで示されるジFab'誘導 後の細胞の生存能力の減少およびより遅い時点での細胞溶解の増大と相関関係が
ある。E. coli周辺質中のジスルフィド酸化還元機構は、よく理解されているが 、小胞体の配置よりも複雑なジスルフィド配置を有するタンパク質に対処するよ
うにはうまく適用されていないと思われる(Humphreyら、1996、同書に概説
)。複雑なヒンジは耐性が低いと思われる。
い。「Fab'40.4インターヒンジ2-1」は、「ヒンジ20」変異体と比較してジ
−Fab'の減少を示す(25.1%±8.43と比較して8.1%±4.3(表IIを参
照のこと))。「Fab'40.4インターヒンジ2-2」は、49.8%±16.78 ジ−Fab'を示す。この数字は、高レベルのジ−Fab'産生を示唆する。実際、この
タンパク質は実質量の全長Fab'すら産生不可能であるようである。これは、図1
に示されたウエスタンブロットのレーン7におけるタンパク質分解バンドの数お
よび強度によって示される。従って、Fab'の量と非常に関連があるジ−Fab'の量
が少ないが、いずれのタンパク質も、「ヒンジ1」および「ヒンジ20」に関連 してほとんど産生されない。これらのスペーシング残基の一方または両方が取り
除かれると、ヒンジ領域は非常に非柔軟になり、システインが天然のE. coliタ ンパク質にタンパク質分解的に曝露され、反応性となるコンフォメーションを強
いられるということが仮定できる。非修飾1ヒンジがiv vivoで最大のジ−Fab' を産生したため、他のヒンジイソタイプをそれらの効率について試験することと
した。
は、人為的に高かった。このタンパク質分解の例を図2のレーン4に示す。長い
IgG3ヒンジは高度に柔軟であると考えられ(Brekke, O.H.ら、1985、Immun
ol. Today、16、85)、これはこのイソタイプのいくつかの特性に原因する 。周辺質において、曝露されたペプチドのこの長さはタンパク質分解を受けやす
く、このことがこのタンパク質の産生レベルが低い理由であろう。IgG2様ヒン ジは、妥当な量のジ−Fab'を産生する(20.8%±3.58)。しかし、IgG1 誘導体を用いる場合以上の増加は認めれなかった。ジ−Fab'産生におけるIgG4 様Fab'の相対的不能(8.63%±1.41)が認められた。IgG4様ヒンジとIgG
1ヒンジとの間にはたった1つのアミノ酸の相違が存在するだけである(それぞ
れCPSPに対してCPPC)。この結果は以前の研究(文献番号22、23)に一致す
るが、これは、IgG4がIgG1よりインター−HCジスルフィド結合を形成する能力
が低いことが見出されたというものである。2つのシステインの間のセリンの存
在により、中位ヒンジの柔軟性が増加され、それによりインター−HCジスルフィ
ド形成をブロックするイントラHCジスルフィドが形成される。
る18アミノ酸長のC−末端を有し、それらは重合に関与する。両方のテール片
の最後から2番目の残基はシステインである。非共有結合に加えて、これと他の
HCのシステインは、重合体形成に関与することが公知であるにも関わらず、正
確なジスルフィド体制は、完全には理解されていない(Davis,A.C.ら、1989
、EMBO J.、8、2519およびWirsma、E.J.およびShulmanM.J.、1995、J.
Immunol.、154、5265)。テール片は4つ全てのIgGイソタイプに付加さ
れると、更なるHCシステインの付加および非共有結合性の相互作用残基がIgMお よびIgAに存在しなくても、それらの重合に影響を与える(Smith、R.I.F.ら、1
995、J. Immunol.、154、2226)。Sorensen, V.ら、1996、J. Im
munol.、156、2858に記載の野生型およびテール片配列を、「ヒンジ1」
配列を含むFab'40.4に付加した。テール片HCに供給するため少なくとも1 つの遊離システインがIgMのCys414の模倣物として作用することが必要とされ、 互いに、IgMのCys337によって提供されるものと考えられるような直接
のインター−HC相互作用をなす可能性があると見られたので、「ヒンジ1」配
列を選択した。pDPH50および51で構築した配列を、表1に示す。
よってFab'を分析した。「ヒンジ1」が30%までのジ−Fab'形成しか与えない
ことは知られていたが、テール片のいずれかの存在が、ジ−Fab'形成を完全にな
くすことが見出された。非還元ネイティブのウエスタンブロットおよびSDS-PAGE
で判断されたような高度な重合状態の形成についての証拠は見出されていない。
「ヒンジ1」に固有の二量体形成の消滅は、テール片の再折りたたみによりテー
ル片のCysとヒンジ中のCysの1つとの間のイントラ-HCジスルフィドを形成する ということによるものと推測された。この可能性はかなり高いと思われる。なぜ
ならば、テール片配列が、テール片Cysをヒンジに近づけることを可能にする1 つのβ鎖を形成しうると考えられるからである(Pumphrey,R.、1986、Immun
ol. Today、7、174)。
ヒンジシステインの存在が、in vivo でのジ−Fab'形成を促進する最も重要な因
子であり、「ヒンジ1」および「ヒンジ20」が最高の配列であることを示す。 1ヒンジの他のバージョンを用いても、試験した他の任意の3IgGイソタイプを 用いても、これ以上の利点は見出されなかった。単純なヒンジが最も有用であり
、ヒンジが長くなるほど、ジ−Fab'産生%は低く、細胞死の率が上がることが示
された。これは、IgG1ヒンジ配列すなわち、ヒンジ1、20、30のコピー数の 増加および長く柔軟なIgG3の切断の両方で認められた。
した。スペーシング領域が非常に長くなる場合、おそらくヒンジシステインをマ
スクするヒンジの再ループ形成によるジ−Fab'形成は完全に破壊されスペーシン
グが非常に短い場合は、ヒンジはin vivoであまり破壊されない。
本明細書における結果は、in vivo培養ではジ−Fab'は5〜10%以上産生する ことは困難であるが、再生産可能であることを示す。ヒンジ配列に加えて、これ
らの相違はFab'発現レベル、培養条件および宿主株の相違によって説明できる。
本明細書でのFab'回収は、Rodringueら(文献番号9)に記載のものより5〜1 0倍低かった。しかし、特定の条件によって自発的で効率の良い(約80%)、
精製の間のバッチ特定のジ−Fab'形成を引き起こす。このようなタンパク質精製
条件は、これらの小規模実験では使用されていなかった。
び複雑性によってinter aliaを調節される有効でないプロセスである。2つのヒ
ンジ配列(「ヒンジ1」および「ヒンジ20」)は、ジ−Fab'形成に最も有効で あるin vivoでの選択条件下で確認された。
、購入できる最高のものである。パイロージェンフリーの「Flowfusor」水がク ロマトグラフィーに使用された(Fresenius, Basingstoke,UK)。他の全ての研 究試薬は、BDH(UK)の試薬グレードである。
変しているが、実施例1に記載のように行った。E. coli周辺質タンパク質を、 100mM Tris/10mM EDTA(pH 7.4)の1回の培養回収体積で、250rpmで
振盪しながら30℃で一晩のインキュベーションによる培養細胞ペーストから抽
出した。粗抽出物の電導性およびpHを、水および氷酢酸をそれぞれ添加すること
により、3.5mScm-1以下および4.5以下に変化させた。次いで、粗抽出液を、
80ml(圧縮)のベッド体積のStreamline SP陽イオン交換樹脂(Pharmacia Bio
tech)上に拡大したベッドモードで通した。樹脂を、拡大したベッドモードで、
50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)で事前に平衡化した。十分に洗浄した後、結
合した物質を50mM酢酸ナトリウム/200mM NaCl(pH 4.5)を用いて圧縮 モードで溶出した。ピークフラクションのpHは、2.5M Trisで6.5以上に上昇
させ、PBSで事前に平衡化したProtein G sepharoseカラムに供した。PBSで洗浄 して非結合の物質を取り除いた後、Fab'物質を0.1MグリシンCl(pH2.7)で 溶出した。溶出液を2.5M Trisで中性にし、4℃で保存した。
液とした。ヒンジチオールを活性化し、最終タンパク質濃度によっては、F(ab') 2 の痕跡を37℃、45分間、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)中9m
M β-MAで還元することによって取り除いた。0.1Mリン酸緩衝液(pH 8.0) で事前に平衡化したG25M sephadexカラム(PD10)(Pharmacia Biotech)で
脱塩することによって還元剤を取り除いた。室温で一晩のインキュベーションに
より、 F(ab')2を形成させた。任意の残存チオール基をPBS中10mM NEMとのイ ンキュベーションによってブロックし、SDS-PAGE(4〜20%Tris/グリシンゲ
ル、Novex UK)およびHPLC(0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)で平衡
化したGF-250カラム)によって分析した。
カラム)または大規模の場合は疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によ ってFab'と分離した。固体(NH4)2SO4を、Fab'/F(ab')2混合物に0.75Mまで 添加し、50mMリン酸緩衝液(pH 7.0)/0.75M(NH4)2SO4で平衡化したp
henyl-sepharose HPカラムにロードした。平衡化緩衝液で洗浄した後、結合物質
を、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)で溶出した。二量体種は、単量
体のFab'よりもHICマトリックスに高い親和性を有する。全ての精製F(ab')2は、
HPLCでは100%F(ab')2、クマジー染色SDS-PAGEでは95% 以上のF(ab')2と 判断された。
した(文献番号2)。
5分間0〜2mMのβ−MAで処理した。還元をNEMの10mMまでの添加によって停 止し、F(ab')2およびFab'の相対量をHPLC分析によって計算した。
予備的な部分的還元のために用いた。
(Shearwater Polymers社、Birmingham、Alabama、USA)中、同体積の25kDa直
鎖状PEG-マレイミドと混合して、最終モル過剰30倍のPEG:F(ab')2を得た。室
温で一晩反応させた後、F(ab')2−PEGを、予備スケールのHPLCを用いて残存F(ab
')2のバルクから分離した。濃縮およびPD10カラムを用いて50mM酢酸ナトリ ウム(pH 4.5)に緩衝液を交換した後、 F(ab')2−PEG/非反応PEGフラクショ
ンを、BioCad Vision workstation上のベッド体積1.6mlのPoros HSカラム(Pe
rSeptive Biosystems、Hertford、UK)にロードした。5カラム体積で洗浄して 非結合PEG−マレイミドを取り除き、F(ab')2-PEGを、50mM酢酸ナトリウム/4
0mMNaCl(pH 4.5)で溶出し、 F(ab')2を50mM酢酸ナトリウム(pH 4.5
)の、40mM〜1M NaClでの直線的勾配でカラムから取り除いた。フラクション
を濃縮し、緩衝液を0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)と交換し、タン
パク質の濃度をA280を用いて評価した。タンパク質を、4〜12%Tris-MESゲル
(Novex、UK)を用いたSDS-PAGEで分析した。
を用いて125I標識し、比活性を0.22〜0.33μCi/μgとした。
e)でのFisons VG Quatro triple quadrupole装置を用いて測定した。
/群、ただし「ヒンジ20」のn=10を除く)。投与の0.5、2、4、6、2
4、48、72および144時間後に尾から連続的に動脈採血を行った。サンプ
ルを、COBRA(商標) Autogammaカウンター(Canberra Packard)を用いてカウ ントした。データをプロットし、曲線の下側の領域をGraphPad Prism(GraphPad
Software Incorporated)で計算し、%注射用量時間(%id.hr)として表した 。t1/2βを24、48、72の時間点として規定する。データの平均および平均
の標準誤差(SEM)を示す。
CPAC。これらは、それぞれ1、2および4ヒンジシステインを含む。「ヒンジ1
」および「ヒンジ20」タンパク質はまた、「ヒンジ1/2」とは異なるアミノ酸を
1つ含み、実施例1に記載のように、CH1のC末端のSerがThrへ変化されている 。
クエンチングするための酸化処理の間サンプルを取り出すことによって、約60
%の達成可能なF(ab')2が酸化の最初の60分以内で形成した(図3を参照のこ と)。「ヒンジ1/2」および「ヒンジ20」の両方が、一晩のインキュベーション
後に類似の最終収率(〜65%)に達成したが、最初の30分以内のF(ab')2形 成は、「ヒンジ1/2」より「ヒンジ20」の方が迅速であった。これは、おそらく
、より多数のヒンジシステインがFab'−Fab'ヒンジシステイン相互作用をおこす
機会が増大した結果である。「ヒンジ20」を用いたF(ab')2の収量は、単にFab'
の濃度が20mgml-1以上に増加することにより、80%に増加する。
」は、イントラ−ヒンジジスルフィド結合を迅速に受けることによりインター−
ヒンジジスルフィド形成からチオールをキャッピングすることが可能である。
るという可能性を取り除ける。「ヒンジ1」および「ヒンジ20」の還元由来のH
Cは、質量分析法によって以下の完全長分子を示した:「ヒンジ1」は、予想分 子量24705.12Daと比較して24703.65±0.55Da、「ヒンジ20」
は予想分子量25374.88Daと比較して25366.40±6.13Da。
で、「ヒンジ1」および「ヒンジ20」を超える利点を有する。これに対して、 「ヒンジ1」は、3つの異なるF(ab')2種を形成することができ、それには1つ または2つのジスルフィドおよび「ヘッド−ヘッド」および「ヘッド−テール」
種(図4を参照のこと)を含む。事態は、「ヒンジ20」の場合より複雑になり うる。一次配列を考慮すると(モデリングによる予想なしに)、多数の種を形成
することができることが示される。これらは、ジスルフィド結合の数(1〜4)
、直鎖状配置のずれ、そして大まかな4次構造(「ヘッド−ヘッド」および「ヘ
ッド−テール」形成の両方)において異なる。ジスルフィド結合の周りの回転は
、「ヒンジ20」の単一のジスルフィド結合化形式は、チオールキャッピング剤 の非存在下で一時的よりも長く残存することはなさそうに思わせる。
の存在は、それ自身が高度なジスルフィド結合化ヒンジをもたらさない(文献番
号9)。従って、2つのより大きなヒンジが1つを超える数のジスルフィド結合
を含むかどうかを示すことが重要である。精製Fab'中に混入しているF(ab')2の すべてを還元させるために、「ヒンジ20」が高いβ−MA濃度を必要とする還元 /酸化条件を最適化している間に行われた観察において有利な点を得た。異なる
精製F(ab')2タンパク質がFab'への還元に耐えるそれらの能力において相違を示 すことが可能であった。0.25mgml-1およびpH 7.0で、「ヒンジ1/2」は12
5μMβ−MAによって完全に還元されることが見出された(図5を参照のこと) 。β−MA及び同じ濃度で、68.3%の「ヒンジ1」調製物がまだ二量体であっ た。これは、「ヒンジ1」 F(ab')2の集団の約68%が2つのジスルフィド結合
を有することをことを意味する。わずかにより高い166μMのβ−MA濃度では 、100%の「ヒンジ20」調製物がまだ二量体である。従って、外挿によって 、68%を超える「ヒンジ20」分子が2本を超えるジスルフィド結合(すなわ ち、3または4)を有するはずである。ヒンジ構造の相違がヒンジジスルフィド
の接近しやすさまたは化学反応性に効果を有するはずであるにも関わらず、それ
らが図5に見られる顕著な相違を引き起こすのに十分であるとは考えにくい。従
って、「ヒンジ1」および「ヒンジ20」は、高い程度に多ジスルフィド結合を 有する。
それらの薬物動態をラットモデルにおいて追跡し得るよう、125I標識された。表
IIIに示されたデータは、in vitroでの「ヒンジ1/2」、「ヒンジ1」と「ヒンジ 20」の比較をサポートしている。1つのヒンジジスルフィドを有するF(ab')2「
ヒンジ1/2」は、AUC166.2±9.8%注射用量、時間(%id.hr)で循環系から
最も迅速に浄化される。同一のタンパク質配列を有するがチオエーテル結合で連
結しているF(ab')2は、AUC=384.2±32.1%(%id.hr)でより遅く浄化 される。これは、in vivoでのFab'へのより迅速な破壊を導く、チオエーテル結 合以上のジスルフィドの不安定さの証拠となると解釈される。より小さなFab'は
腎臓を介してF(ab')2より迅速に排出される。「ヒンジ1」および「ヒンジ20」
におけるヒンジ中のジスルフィド結合の平均の数の増加により、「ヒンジ1/2」 の数を超えるAUC(それぞれ423.6±35.0および509.7±31.3(%i
d.hr))の増加がもたらされる。試験した4つのF(ab')2分子についてのラット の循環からの浄化値の曲線を、図6に示す。これは、異なるヒンジ安定性の主要
な効果が、α−相であるようだということをありありと示す。「ヒンジ1/2」F(a
b')2の最初の浄化値は、より互いに集団化する他の3つのF(ab')2分子よりもさ らに迅速である。おそらくは、循環血液中の還元またはタンパク質分解力に対す
る「ヒンジ1」、「ヒンジ20」およびDFMF(ab')2の増大した耐性は、より大き なF(ab')2種として、より長い分子の残存をもたらし、循環系からより遅く浄化 される。
つも活性化されたチオールに破壊され脱カップリングされる可能性がある。この
ようなチオールは、放射性ヌクレオチド、トキシン、またはPEGのようなエフェ クターまたはレセプター基の付着に特に有用であろう。血清耐久性を増大させる
単純なルートであり、免疫原性を減少させ、そしてin vivoでのタンパク質分解 を減少させるので、PEGのタンパク質への共有結合は魅力的である。
、1.8mM β−ME以下で、100%のF(ab')2集団が二量体のままであることが 見出された。この数字は、ヒンジジスルフィド占有の不均一により、F(ab')2の バッチ間で変化し得る。DTDPを用いた1.3mMβ−MEチオールアッセイは、F(ab'
)2あたり1.034±0.090チオールが反応のために遊離されたことを示した
。β−MEで未処理のF(ab')2は、F(ab')2あたりほとんど遊離のチオールを示さな
かった。 F(ab')2のPEG化効率を、陽イオン交換によるF(ab')2−PEGの精製後に 計算し、A280におけるタンパク質濃度が1.3%以下であると評価した。
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ン1および2は還元され、レーン3〜12は還元されていない。スタンダードの
分子量(kDa)を右に示した。 LCのみのコントロール(レーン4)が5倍過剰で
あることを除いて全ての周辺質サンプルを等量ロードした。レーン1、pDPH52
Fab 40.4ヒンジ1+cys、レーン2、pDPH44 Fab 40.4ヒンジ1インタ ー、レーン3、精製Fab' 40.4+cysコントロール、レーン4、Fab 40.4 軽鎖コントロールのみ、レーン5、pDPH42 Fab40.4ヒンジ20+cys、レー ン6、pDPH52 Fab40.4ヒンジ1+cys、レーン7、pDPH54 Fab40.4ヒ ンジ2-2インター、レーン8、pDPH53 Fab40.4ヒンジ2-1インター、レー ン9、pDPH69 Fab40.4ヒンジ30インター、レーン10、pDPH41ヒンジ2 0 インター、レーン11、 pDPH44ヒンジ1インター、レーン12、pDPH40ヒ
ンジインター。
ロット。スタンダードの分子量(kDa)を右に示した。LCのみのコントロール( レーン1)が5倍過剰であることを除いて全ての周辺質サンプルを等量ロードし
た。レーン1、Fab40.4軽鎖のみコントロール、レーン2、精製Fab'40.0 +cysコントロール、レーン3、pDPH63 Fab 40.0「IgG4様」ヒンジインタ
ー、レーン4、pDPH62 Fab 40.4「IgG3様」ヒンジインター、レーン5、p
DPH62 Fab 40.4「IgG2様」ヒンジインター、レーン6、pDPH44 Fab 4 0.4ヒンジ1インター(IgG1)。
効果を示す図である。pH 8.0および室温で行われた3つの独立した実験の平均
およびSDを示す。
形成したF(ab')2、およびB、「ヒンジ20」で形成したF(ab')2。「ヒンジ20」
については「ヘッド−ヘッド」形態のみを示す。従って、可能な「ヘッド−テー
ル」形式は「×2」を用いて示す。
0を除いて、各群6匹の動物を用いた。
Claims (8)
- 【請求項1】 式(1)で示されるペプチドN TCPPCPXYCPPCPAC...(1) (式中、XおよびYは同一でも異なっていてもよく、かつそれぞれ中性脂肪族Lア ミノ酸残基、ならびに保護され、反応性のあるその誘導体である)。
- 【請求項2】 Xがアラニン残基である、請求項1に記載のペプチド。
- 【請求項3】 Yがトレオニン残基である、請求項1または2に記載のペプ チド。
- 【請求項4】 1つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、前記鎖は
アミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC(XおよびYは請求項1に規定される通り)を含
むことを特徴とする、タンパク質。 - 【請求項5】 2つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、前記各鎖
はアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC(XおよびYは請求項1に規定される通り)を
含み、各鎖は、前記各アミノ酸配列に存在する1、2、3または4つのシステイ
ン残基を介して他と共有結合することを特徴とする、タンパク質。 - 【請求項6】 抗体またはそれらの抗原結合部位である、請求項4または5
に記載のタンパク質。 - 【請求項7】 FabまたはFab'フラグメントである、請求項6に記載のタン
パク質。 - 【請求項8】 1つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子が
付着されていることを特徴とする請求項4から7のいずれか1項に記載のタンパ
ク質。
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