JPH07504334A - Ａ３３抗原に対するヒト化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ３３抗原に対するヒト化抗体 発１１分ｌ一 本発明は、ネズミモノクローナル抗体Ａ３３によって認識されるエピトープに対 して特異性を有する抗体分子、それらの製造方法、それらを含む医薬組成物およ び医療におけるそれらの使用に関する。

見匪五１匙 ネズミモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ａ３３は、耐熱性、プロテアーゼ耐性、ニ ューラミニダーゼ耐性エピトープ（これは、実質的にほとんど全ての原発性、転 移性大腸癌に均質に発現する）を認識するＩ　ｇ　０２　ａ　／　ｋである。こ の抗原の発現は、正常な結腸粘膜上皮および結腸癌に限られ、循環系には放出さ れなイ（Ｗｅｌｔら、　１９９０）、該抗原はＡＳＰＣ−１およびＣｏ１ｏ２０ ５を含む多数のヒト腫瘍細胞系で発現される。

Ａ３３抗体は抗原と結合した後内在化する。それは、結腸直腸癌の肝転移を有す る患者の腫瘍にインビボで局在することが示された（ｗｅｌｔら、　１９９０） 、　”１１標識抗体（０，２ｍｇ。

ｎ＝３　；　２ｍｇ、ｎ＝＝８　；　１０ｍｇ、ｎ＝３　；　２５ｍｇ、ｎ＝３ 　；　５０ｍｇ＋　ｎ＝３　；　２−５ｒｎＣｉで標ｆｆ１）を、手術の７−８ 日前に患者２０人に静注で投与した。腫瘍組織に対する選択的ｍＡｂ３３の局在 化が２０人の患者のうち１９人で認められた。投与後１週間の腫瘍／肝比は６． ９から１００の範囲で、一方、腫瘍／血清比は４．１から２５．２の範囲であっ た。コントロール”’ＩＭＡｂＴａ９９　（２ｍｇのＡ３３を投与した３人の患 者に２ｍｇの投与量で同時投与）を用いた実験で、Ａ３３の腫瘍取り込みは特異 的で、Ａ３３取り込みは２．３から４５倍であることが示された。

しかしながら、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、８人の患者で７日目から 検出され、全ての患者では３００日目でにＨＡＭＡ反応を生じた。最初の優勢な ＨＡＭＡはＩｇＭであったが、３００日目でにＩｇＧ反応もまた検出された。

ＨＡＭＡの反応性は、しかしながらＩｇＧ２ａアイソタイプに限られる。ネズミ ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も患者の血清を用いて検出することができた。したがっ て、被検者はＭＡｂに対する免疫反応を生じ、それを完全に排除するか、または 少なくともその効果を減少させるであろうという事実によって、ヒトの治療薬と してのネズミＭＡｂＡ３３の有用性は制限されるであろうと考えられる。

ヒトでの抗原性が少ない非ヒトＭＡｂを作成するための提案がこれまでに行われ た。そのような技術は、一般に［ヒト化（ｈｕ腫ａｎｉｓａｔｉｏｎ）　Ｊ術と 呼ばれる。これらの技術は、一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤ ＮＡ配列を操作する組換え体ＤＮＡ技術の使用を含む、ヒト化の簡単な形態は、 ネズミの抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域と交換することを含む（Ｍｏｒ ｒｉｓｏｎら、　１９８４；　Ｗｈｉｔｔｌｅら、　１９８７）、多数のこれら マウス可変領域−ヒト定常領域のキメラ抗体が患者に投与された（Ｂａｋｅｒら 、１９９１；　Ｂｅｇｅｎｔら、１９９０；　Ｇｈｒａｙｅｂら、１９９１；　 Ｋｈａｚａｅｌｉら、　１９９２；　Ｋｎｏｘら、　１９９０；　ＬｏＢｕｇｌ ｉｏら、　１９８９；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、　１９９１．１９９２；　５ａｌｅ ｈら、　１９９２；　Ｔｒａｎｇら、　１９９０）。

一般に、免疫反応は、これらキメラ抗体に対してもなお生じるが、その反応の程 度は、ネズミの抗体に対して認められるものより通常低く、さらにその開始も遅 れる。ある例、キメラ１７−ＩＡ（γ１）では、認められた反応は極めて低く。

処置された患者１６人のうち１人だけが、低いレベルの反応を示し、たたけであ る（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、　１９８９；　Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、　１９９１；Ｔ ｒａｎｇら、　１９９０）、他の例では、処置された患者の約５０％が、専らネ ズミの結合部位を含む可変領域に対する反応を生じた。

キメラ抗体に対するＨＡＭＡの反応性の程度の減少は、抗原結合部位外の可変領 域のさらにすすんだヒト化によって、これら領域に対する反応が消失し、さらに 結合部位に対する反応も減少することを期待させる。

抗体のヒト化のもっと複雑な形態は、ネズミの抗体結合部位を構成するアミノ酸 がヒト抗体の可変領域の読み枠中に統合されるように、可変領域ドメインを再構 成することを含む（Ｊｏｎｅｓら、　１９８６）、このようなことを行いえるの は、異なる種の免疫グロブリン間における密接な構造と配列関係の結果である。

可変領域配列内で、多数の非連続性配列（ドメイン当り３個）が、特に変異性に 富む（超可変と呼ばれる）ことが認められた。抗体間で認められたこの配列の変 動は、抗体が広範囲の抗原形を認識し結合することを可能にする変異性を提供す ると説明され、各ドメインのこの３つの超可変領域は相補性決定領域（Ｃｏｍｐ ｌｅ＠ｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ　（ＣＤＲ ’ｓ））と名付けられた（！１１ｕ　＆　Ｋａｂａｔ、　１９７０；　Ｋａｂａ ｔら、　１９８７）、この説は構造研究によって確認されたが、この研究では、 はとんどの部分について、超可変配列は、表面の大きなパッチを形成する一組の ループとして表面に付随しており、さらに、これらの配列は、抗原−抗体複合物 が調べられた例では、抗原と接触することが認められた（Ａｍｉｔら、　１９８ ６；　Ｂｈａｔら、１９９０；　Ｂｏｕｌｏｔら、　１９８７．１．９９０；　 Ｃｏｌ＋ｓａｎら、　１９８７；　Ｄａｖｉｅｓら、１９８９；　Ｐａｄｌａｎ ら、　１９８９；　Ｐｏ１ｊａｋ、　１９９１；　５ｈｅｒｉｆｆら、　１９８ ７）、全ての場合ではないが、はとんどの例で、ＣＤＲ５は、これらの構造ルー プ領域に、これをねずかに越えながらも一致する。

これらの超可変領域単独のヒト抗体への置換は、一般にネズミ抗体の結合親和性 の再構成にはつながらない（Ｖｅｒｈｏｓｙｅｎら、　１９８８；　Ｒｉｅｃｈ ｍａｎｎら、　１９８８）。

したがって、ループまたは超可変領域内の確認されていない残余部が、抗原結合 部位の形態に影響を与え、個々の可変ドメインを安定に束ねることによって、ま たは可変ドメイン間の相互作用を安定化させることによって、直接または間接的 に抗原結合に貢献しているにちがいない、これら手がかりとなる読み枠の位置確 認の方法は利用可能である（例えば、Ａｄａｉｒら、　１９９１；　Ｋｕｒｒｌ ｅら＋　１９９０７Ｌａｗら、　１９９１；　Ｐａｄｌａｎ、　１９９１；　Ｑ ｕｅｅｎら＋　１９９０；　Ｖｘｎｔｓｒ、　１９８７）−ヒト化工程のための ヒト読み枠の選択には、読み枠のアミノ酸についていくつかの位置情報が利用で きるように、Ｘ線結晶学で決定された既知構造が存在する抗体ドメインを用いる か、または、適合する軽鎖と重鎮対を用いるか、または種々のヒトサブグループ 由来の代表的な例を用いるか、あるいは単純に利用可能なヒト配列を検索し１問 題のマウス抗体の種々のドメインと高い相同性を有するヒト抗体ドメインを同定 することが必要である。

ヒト化は、多数の例で完全な抗原結合活性の再形成をもたらした（Ｃｏら、　１ ９９０，１９９２；　Ｃａｒｔｅｒら、　１９９２；　Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら。

１９９１　；国際特許公開第１０９１１０９９６７号、１０９１１０９９６８号 、　１０９２／１１３８３号明細書）。

ヒト化工程で期待される免疫原性の低下は、抗−Ｔａｃ抗体のヒト化形、抗−Ｔ 　ａ　ｃ　−Ｈ（Ｑｕｅｅｎら、　１９８９）を用いてＨａｋｉ＠ｉら（１９９ １）によって調べられた。ヒト化抗体は、ネズミのミエローマ系５ｐ２１０で発 現された。この抗体は、１０工ンドトキシン単位／ｍｇ蛋白未満を含む、抗体は ８群のジノモルガスモンキー（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）　（各群 ４匹）に投与された。この群に、抗−Ｔａｃ−Ｈまたはネズミ抗体（抗−Ｔａｃ −Ｍ）のいずれかを１日当りＯｌｏ、０５．０．５または５　ｍ　ｇ　／　ｋ　 ｇの投与量で１４日間静注し、４２日目に同じ抗体でチャレンジした。薬物動態 および免疫原性をこの実験中にモニターした。４２日目に再チャレンジした抗− Ｔａｃ−Ｈに対する副作用（アナフィラキシ−）が、抗−Ｔ　ａ　ｃ−Ｍの５　 ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇを投与した１匹に、さらに０．０５ｍｇ／ｋｇを投与した４ 匹すべてに認められた。したがって、抗−Ｔａｃ−Ｍの０．５または５　ｍ　ｇ 　／　ｋ　ｇを投与された動物のいずれも４２日目の再チャレンジを受けなかっ た。

ヒト化抗体に対する反応は、ネズミ抗体に対する反応と比べて、絶対量が低く、 さらに開始も遅くなることが認められた。抗−Ｔａｃ−Ｍ群で、１２匹のうち９ 匹において処置工程中に反応が認められたが、一方、ヒト化抗体を投与された動 物では１反応は一般に最後の注射後５から１０日後に認められた１両方の抗体に ついて１反応の程度は一般に投与量に逆比例しているようであった。ネズミ抗体 に対する最も早期の最も劇的な反応は、０．０５ｍｇ／ｋｇ群で認められ、この 場合、１匹の例では２００　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌを越える抗−抗体反応が認めら れた６反対に、最も高い投与量のネズミ抗体を与えられた群は、５　ｍ　ｇ　／ 　ｋ　ｇ群は反応開始遅延を示し、同じような、絶対レベルが低い抗−抗−Ｔａ ｃ−Ｍパターンを示した。この投与量では２匹の動物で反応を認めなかったが、 一方０．５ｍｇ／ｋｇ群では、１匹が反応を示さなかった。

ヒト化抗体を投与された動物については、同じ傾向が認められたが、反応の程度 はずっと低かった。最も強い反応は、０゜５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇを投与された １匹に認められ、この例では、４２日目に６０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌの抗−抗体 が認められた。ネズミ抗体を投与された１２匹のうち９匹がこの反応レベルを越 えた。

繰り返すが、０．０５ｍｇ／ｋｇ群の全ての動物がある程度の反応を示したが（ ５から２５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌの抗−抗体の範囲）、この反応は投与量に反比 例していた。４２日目に第二の投与を行うことができた全ての例で、特異的力価 の大きな増加（〉１０倍）が認められた。

反応のタイプは、競合ＥＬＩＳＡで測定したが、ここでは、ネズミおよびヒト化 抗体の各々は固相に結合され、抗体自体、可溶性ＩＬ−２Ｒまたは非特異的ネズ ミまたはヒトＩｇＧを含む種々の潜在的競合物質の存在下で血清とともに保温さ れた。ネズミおよびヒト化抗体の両方に対する反応は抗−イディオタイプおよび 抗−アイソタイプの両方であることが示された。しかしながら、ヒト化抗体に対 する抗−アイソタイプ反応は最低限界に近かった。ヒト化抗体に対する反応の大 半はヒト化またはネズミ抗−Ｔａｃまたは可溶性ＩＬ−２Ｈの存在によって抑制 することができたが、これはこの反応は専ら抗−結合部位であることを示してい る。

ヒト化抗−ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＬＨの使用に関する３つ の研究が記載された（Ｃｒａｖｅ、　１９９２；　Ｈａｌｅら；　１９８９；Ｍ ａｔｈｉｅｓｏｎら、　１９９０）、最初の研究では、非−ホジキンリンパ腫の ２人の患者が、１から２０ｍｇ／日の範囲で投与量を増しながら４３日間ＣＡＭ ＰＡＴＨ−ＩＨを静脈内に輸液された（Ｈａｌｅら；１９ｇｇ）。抗−抗体反応 は処置の間中検出されなかった。反応の欠如は、抗体自体が免疫抑制性であり、 患者はすでにかれらの疾病の結果として免疫が抑制されていたという事実による かもしれない（）ｔａｌｅら；　１９８８）。

さらにすすんだ症例研究が報告された（Ｍａｔｈｉｅｓｏｎら；１９９０）、Ｃ ＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ抗体は、慢性で、以前難治性であった全身性脈管炎の患者に 緩解を惹起させるために、ラット抗−ヒトＣＤ４と共同で用いられた。リンパ球 集団はＣＡＭＰＡＴＨ−ＬＨの３日間の処置（静注、２ｍｇ／日）で激減し、続 いてラットの抗−ヒトＣＤ４を１２日間、２０ｍｇ／日で静注して、残余のＴＨ 細胞を除去した。処置後、病気の緩解が生じ、１２か月持続した。抗−抗体反応 は検出されなかった。

もっと最近では、さらに、類リューマチ性関節炎の８人の患者をＣＡＭＰＡＴＨ −ＩＨで処置したことが開示された。

患者は、５日間４　ｍ　ｇ　７日を投与され、その後さらに５日間８ｍｇ７日を 投与された。８例中の７例で、痛みと関節疾患についての評価基準において統計 的に顕著な減少があった（Ｃｒｏｗｅ、　１９９２）、抗−抗体反応は処置後数 か月間明らかにならなかった。

Ｈｉｒｄら（１９９１）は、ネズミ抗体Ｈ１７Ｅ　２　（Ｔｒａｖａｒｓ　＆　 Ｂｏｄ−ｓｉｅｒ、　１９８４）由来のヒト化抗ＰＬＡＰ抗体、Ｈｕ２ＰＬＡＰ （Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら；　１９９１）を、卵巣、胃および乳房を含む１種々の 腫瘍をもつ患者に投与した。２人の患者で治療前にヒト抗−マウス抗体の血清レ ベルが上昇した。１症例では、この患者は以前に、大環式ＤＴＰＡと結合させる ことによって”Ｙで標識したネズミ抗体ＨＭＦＧＩで処置されたことがあった。

２番目の患者は、大環式Ｄ　ＯＴ　Ａ　（Ｍｏｉら、　１９８ｇ）と結合させる ことによって１１１　Ｉｎで標識したネズミのＨｌ　７Ｅ２で以前に処置を受け たことがあった６７人の患者は、放射性イメージング用量として２２０から８３ ３ｍｇのＨｕ２ＰＬＡＰ−１１１１ｎ−ＤＯＴＡを静注で投与された。患者を２ ４時間と９６時間にモニターした。以前にＨＡＭＡ反応がなかった患者では、ｊ 　ｌｙｚ　ｂは、ネズミ抗体を投与された患者の２７時間と比べて７３．１時間 であった。以前にＨＡＭＡ反応が認められた例では、患者は４７時間および３９ 時間のｔ１７！５を示した。しかしながら、７人の患者のいずれも９６時間の実 験中には、Ｈｕ２ＰＬＡＰに対する特異的抗体は生じなかった。ただし、３人の 患者は抗−ＤＯＴＡ抗体を生じ、そのうちの１人は以前にネズミＨ１７Ｅ２−１ １”Ｉ　ｎ−ＤＯＴＡで処置されており、既に抗−ＤＯＴＡ反応を示していた。

ｌ肌叫１１ したがって、Ａ３３のヒト化はヒトで免疫原性を減少させ。

ヒトで以前にネズミ抗体を使用したことに伴うＨＡＭＡ反応の問題を克服できる かもしれない。

本発明者らは、ネズミモノクローナル抗体Ａ３３によって！！諏されるエピトー プに対して特異性を有するヒト化抗体分子を製造した。化合物は、一般にインビ ボで良好な腫瘍局在化と高い腫瘍負荷を示した。特定の化合物は標的細胞に対す る嗜好性を驚異的に増し、他の体組織、特に腎から迅速に排除され、その結果、 腫瘍対血液比が改良され、望ましくない副作用が殆どまたは全く出現しなくなる 。

したがって、本発明の第一の特徴によれば、ネズミモノクローナル抗体Ａ３３に よって認識されるエピトープに対する特異性を有し、さらに、可変ドメインの相 補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも１つがマウスモノクローナル抗体Ａ３３ 　（ＭＡｂＡ３３）に由来し、このヒト化抗体分子（ＲＡＭ）の残余の免疫グロ ブリン由来部分がヒト免疫グロブリンもしくはその類似体に由来する抗原結合部 位を有し、当該ＨＡＭが場合によってエフェクターもしくはレポーター分子と結 合されている、ヒト化抗体分子が提供される。

見匪立■１裟ｎ班 本発明のＲＡＭはキメラヒト化抗体またはＣＤＲ移植ヒト化抗体を含むことがで きる。ＨＡＭがＣＤＲ移植ヒト化抗体を含むときは、重鎮または軽鎖の可変ドメ インの各々は１つまたは２つのＡ３３由来ＣＤＲ５のみを含むことができる。

しかしながら、好ましくは、３つの重鎖および軽鎖ＣＤＲｓの全てはＡ３３に由 来する。一般に、本発明のＲＡＭは、少なくともネズミＡ３３抗体に匹敵するか 、またはそれより強い結合能力を有するであろう。

上記に述べたように、ＭＡｂＡ３３は、ｖｅｌｔら（１９９０）が以前に報告し たＩｇＧ２ａ／にモノクローナルである。この抗体の軽鎖および重鎮の可変領域 のアミノ酸配列は、以下の図３に示す。

本発明のＲＡＭは以下のものを含むことができる：完全な長さの重鎖および軽鎖 を有する完全な抗体分子；そのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’　、（Ｆ ａｂ’　）、またはＦ。

フラグメント；単一鎖抗体フラグメント、例えば単一鎖Ｆｖ；軽鎖または重鎖単 量体または二量体；互いに結合構造によって連結された２つ、３つ、４つもしく はそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含む単一特異性を有する多価抗原結 合蛋白；または、これらのいずれかのフラグメントもしくは類子。

ＨＡ、　Ｍの残余の非−Ａ、　３３免疫グロブリン由来部分は、適切なヒト免疫 グロブリンに由来することができる０例えば、ＨＡＭがＣＤＲＩ植ＨＡＭの場合 は、その抗原結合領域が由来するＡ３３ドナ一抗体の種類または型と関係がある 、適切な可変領域読み枠配列を用いることができる。好ましくは、用いられるヒ ト読み枠の型はドナー抗体と同一または類似の種類または型（Ａ３３は１ｇＧ２ −カッパ）のものである。

有利には、該読み枠は、ドナー抗体配列、特にＣＤＲ５に空間的に近接もしくは 隣接した部位における相同性を最大または至適にするように選択される。ＣＤＲ 移植ＲＡＭを構築するために用いることができるヒト読み枠の例は、ＬＡＹ、Ｐ ＯＭ、ＴＵＲ，ＴＥＩ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩおよびＥＵである（Ｋａｂａ ｔら、　１．９８７）　、　ＫＯＬおよびＮＥＷＭは重鎖構築に適切である。Ｒ ＥＩは軽鎖構築に適切で、ＥＵは軽鎖および重鎖の両方の構築に適切である。好 ましくは、しかしながら＋　ＬＡＹ読み枠が、ＭＡｂＡ３３との高度な相同性と いう点から、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインのためのヒト読み枠として用 いられる。

ＨＡＭの軽鎖または重鎖可変領域は、ヒト軽鎖または重鎖定常ドメインに適切に 融合させることができる（本明細書で用いら九るように、１重鎖定常ドメイン」 は別に特定されない限り、ヒンジ領域を含むと解される）、ＨＡＭのヒト定常ド メインは、それが存在する場合は、該抗体の所望の機能、特に必要となる可能性 があるエフェクター機能と関連を有するものが選択される０例えば、重鎮可変領 域に融合される重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇＡ、工ｇＧまたはＩｇＭドメイン である。好ましくは、ヒトＩｇＧドメインが用いられる。

ＲＡＭを治療目的に使用することを望み、さらに抗体のエフェクター機能を必要 とする場合は、ＩｇＧ１およびＩ　ｇＧ３アイソタイプドメインを用いることが できる。また別に、ＨＡＭを抗体エフェクター機能を必要としない目的、例えば 、画像化、診断または細胞毒集中化の目的に使用する場合、工ｇＧ２および１ｇ Ｇ４アイソタイプドメインを用いることができる。軽鎖可変領域に融合させるこ とができるヒト軽鎖定常ドメインは、ヒトラムダまたは特にヒトカッパ鎖を含む 。

ヒト定常ドメインの類似体もまた別に有利に用いることができる。これらは、対 応するヒトドメインより１つまたはそれ以上の付加的アミノ酸を含む定常ドメイ ン、または対応するヒトドメインに存在する１つまたはそれ以上が欠失または変 更されている定常ドメインを含む、そのようなドメインは。

例えばオリゴヌクレオチド特異的変異によって得ることができる。

ＨＡＭの残余物は、ヒト免疫グロブリン由来の蛋白配列のみを含むという必要は ない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖部分をコードするＤＮＡ配列が、ポリペプ チドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列 に融合されている遺伝子を構築してもよい。

本発明の第二の特徴にしたがえば１本発明の第一の特徴を有するＨ　Ａ　Ｍの製 造方法が提供される。該方法は以下の工程を含む： （ａ）可変ドメインを含む抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列で、該可 変ドメインのＣＤＲ５の少なくとも１つがＡ３３マウスに由来し、該抗体鎖の残 余の免疫グロブリン由来部分がヒト免疫グロブリンに由来するＤＮＡ配列を有す るオペロンを発現ベクター内につくり；（ｂ）可変ドメインを含む相補的な抗体 の軽鎖または重鎮をコードするＤＮＡ配列で、該可変ドメインのＣＤＲ５の少な くとも１つがＭＡｂＡ３３に由来し、該抗体鎖の残余の免疫グロブリン由来部分 がヒト免疫グロブリンに由来するＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベクター内 にツ＜す；（ｃ）宿主細胞に両オペロンを形質感染し；（ｄ）該形質感染された 細胞系を培養し、ＲＡＭを製造する。

細胞系に２種のベクター（第一のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする オペロンを含み、第二のベクターは重鎮由来ポリペプチドをコードするオペロン を含む）を形質感染することができる。好ましくは、該ベクターはコード配列を 除いて同一で、さらに、選択マーカーは、各ポリペプチド鎖が等しく発現されて いることを可能な限り確認するために関与する。

また別に、単一のベクターも用いることができるが、このベクターは軽鎖および 重鎮の両方に由来するポリペプチドをコードするオペロンを含む。

さらに別の特徴において、本発明は、本発明のＨＡＭの重鎖および軽鎖をコード するＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列を含むクローニングおよび発現ベクター、こ れらＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞および、形質転換宿主細胞でこれらＤ ＮＡ配列を発現させることを含む重鎖または軽鎖および抗体分子の製造方法もま た含む。

ベクターを構築する一般的方法、形質感染の方法および培養方法それ自体は既知 である（例えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、ＰｒｉｍｒｏｓｅとＯｌ ｄ　（１９８０）および以下の実施例を参照）。

Ａ３３重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（ および対応する推定アミノ酸配列）は。

以下の図３に示す。

ヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡは、いずれの適切な方法でも得るこ とができる１例えば、好ましいヒトアクセプター読み枠のアミノ酸配列、例えば ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＫＯＬ、ＲＥ　１．ＥＵ、ＴＵＲ，ＴＥＩおよびＮＥＷＭは。

当業者にとって広く利用可能である。これらアミノ酸配列をコードする対応する ＤＮＡ配列は、遺伝暗号を逆に利用することによって与えられるか、または推定 できる。同様に、ヒト定常領域ドメインのアミノ酸配列も周知で、それらをコー ドするＤＮＡ配列は容易に推定できる。

分子生物学の標準的技術を、ＣＤＲ移植生成物をコードするＤＮＡ配列を製造す るために用いることができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技 術を用いて、完全にまたは部分的に合成することができる１位置特異的変異（ｓ ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）およびポリメラーゼチェ ーン反応（ＰＣＲ）技術を適切に用いることができる０例えば、オリゴヌクレオ チド特異的合成（Ｊｏｎｓｇら−１９８６）を用いてもよい、また、予め存在す る可変ドメイン領域のオリゴヌクレオチド特異的変異（Ｖｓｒｈｏｅｙｅｎらｔ 　１９ｇ８；　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら；　１９ｇｇ）もまた用いることができる 。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて１間隙のあるオリゴヌクレオチドの酵素によ る充填を行うことができる（Ｑｕｅｅｎら、　１９８９；国際特許公開筒％ｒ０ ９０１０７８８６１号明細書）。

キメラ型またはＣＤＲ移植重鎖および軽鎖をコードするＤ−系も用いることがで きる。有利には、細菌、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）および他の微生物系を 、特に抗体フラグメント（例えばＦ９、ＦａｂおよびＦａｂ’　フラグメントン および単一鎖抗体フラグメント（例えば単一鎖Ｆ、）の発現のために用いること ができる。ｐＡＣｔａｃ（国際特許公開第一０９２１０１０５９号明細書）由来 の発現ベクターで形質転換した大腸菌を用いて本発明に従ってＦａｂフラグメン トを製造する特に有用な方法を以下の実施例で開示し１本発明の特徴をさらに示 す、真核細胞、例えば哺乳類宿主細胞発現系もまた、本発明の抗体を得るために 、特により大きなキメラ型またはＣＤＲ移植抗体生成物（完全な抗体分子を含む ）の製造のために用いることができる。適切な哺乳類宿主細胞はＣＨＯ細胞およ びミエローマ細胞またはハイブリドーマ細胞系１例えばＮＳＯ細胞を含む。

本発明のＨＡＭでは、重鎖および軽鎖可変ドメインは１ＭＡｂＡ３３の完全な可 変ドメインを含むか、またはＭＡｂＡ３３のＣＤＲ５の１つ、いくつかもしくは すべてをその上に移植されたヒト可変ドメインの読み枠領域を含むことができる 。したがって、ＲＡＭは、キメラ型ヒト化抗体またはＣＤＲ移植ヒト化抗体を含 むことができる。

ＲＡＭがＣＤＲ移植ヒト化抗体の場合は、ＣＤＲ５に加えて、特異的可変領域読 み枠の残基に、非ヒトすなわちＡ３３マウスの残基に一致するように変更を加え ることができる。

好ましくは、本発明のＣＤＲ移植ヒト化抗体は、本発明者らの国際特許公開第１ Ｏ−Ａ−９１１０９９６７号明細書で明らかにしたようなＣＤＲ移植ヒト化抗体 を含む、　１Ｏ−Ａ−９１１０９９６７号の開示内容は参照により本明細書に含 まれる。

好ましくは、軽鎖のＣＤＲ５は、ＣＤＲ１（残基２４から３４）およびＣＤＲ２ （残基５０から５６）のカバット（Ｋａ−ｂａｔ）ＭＡｂＡ３３ＣＤＲｓに対応 し、さらに、構造ループ残基（残基９１から９６）またはＣＤＲ３のカバットＭ ＡｂＡ３３ＣＤＲ残基（残基８９から９７）に対応する。（上記および本出願の 他の場所で示した残基の名称は、カバットの番号付はシステム（Ｋａｂａｔら、 　１９８７）にしたがって番号付けされている）。さらに、軽鎖は、残基４６お よび８７の一方または両方にマウスＡ３３残基をもつことができる。好ましい実 施態様では、用いられる読み枠がＬＡＹの場合は、軽鎖は、ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２ およびＣＤＲ３のすべてにカバットＭＡｂＡ３３ＣＤＲｓを含み、さらに好まし くは、４６位および８７位に付加的なＡ３３を含む。

好ましくは、重鎖のＣＤＲ５は、ＣＤＲＩ　（３１から３５）、ＣＤＲ２（５０ から６５）およびＣＤＲ３（９５から１０２）のすべてでカバットＭ　Ａ　ｂ　 Ａ　３３　ＣＤ　Ｒｓに対応する。

さらに、重鎖は、残基１．２７．２８．２９．３０．７２．７３．８２ｂ、８６ および９４の１つまたはそれ以上でマウスＡ３３残基を有することができる。

本発明のＨＡＭは、完全な抗体または、上記に述べたように、そのフラグメント ；単量体もしくは二量体；または特に単一特異性多価結合蛋白であってよい、こ の後者の群のある特定の化合物は、高度な親和性を有し、腫瘍対血液比の改良を 達成するために用いることができるという点で特に有利である。この化合物は、 他の体組織から迅速に排除され、さらに、非腫瘍組織に抗体産物が蓄積するとき 生じる望ましくない副作用を、全体的に殆どまたは全くもたない。

したがって、さらに本発明の特定の特徴にしたがえば、互いに連結構造によって 結合した２つ、３つ、４つまたはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含む 単一特異性多価抗原結合蛋白が提供されるが、この蛋白は天然の免疫グロブリン ではなく、当該抗体またはフラグメントの各々は、ネズミのモノクローナル抗体 Ａ３３によって認識されるエピトープに対して特異性を有し、当該抗原結合蛋白 は場合によってエフェクターまたはレポーター分子と結合している。

本発明のこの特徴では、各抗体またはフラグメントは、本発明の第一の特徴のヒ ト化抗体分子（ＲＡＭ）に関連して上記に定義したように、好ましくはヒト化抗 体またはそのフラグメントで、したがって、単一特異性多価抗原結合蛋白はヒト 化単一特異性多価抗原結合蛋白である。しかしながら、非ヒト化（例えばネズミ ）単一特異性多価抗原結合蛋白も含まれ、本発明はこれらにもまた及ぶことは理 解されるべきである。

好ましくは、多価抗原結合蛋白は、互いに連結構造によって結合した、２つ、３ つまたは４つの抗体、また好ましくはそのフラグメントを含む。

本発明のこの特徴で使用される抗体フラグメントは、本発明のＲＡＭとの関係で 上記で考察したものでもよい、特に有用なフラグメントはＦａｂフラグメントで ある。

したがって、本発明の好ましい特徴にしたがえば、互いに連結構造によって結合 した２つ、３つ、４つのＦａｂフラグメントを含む単一特異性多価抗原結合蛋白 が提供されるが、この蛋白は天然の免疫グロブリンではなく、当該Ｆａｂフラグ メントの各々は、ネズミのモノクローナル抗体Ａ３３によって認識されるエピト ープに対して特異性を有し、当該抗原結合蛋白は場合によってエフェクターまた はレポーター分子と結合している。

このタイプの化合物は、インビボで用いるとき、きわめて良好な腫瘍対血液比を 提供する。特に有利な化合物は、互いに連結構造で結合した４つまたは特に３つ のＦａｂフラグメントを含むもので、これは、インビボでの良好な腫瘍対血液比 を提供することに加え、他の組織（例えば腎）から迅速に排除され、そのような 組織における該フラグメントの蓄積に伴う望ましくない副作用をもたない。

ｒＦａｂＪという用語は、天然の抗体または、化学的もしくは組換え体ＤＮＡ技 術で合成されたものに由来する、場合によって修飾されたＦａｂおよびＦａｂ’ 抗体フラグメントを指すために、本明細書で用いられる。「場合によって修飾さ れた」とは、該フラグメントの結合能力が悪影響を受けない限り、Ｆａｂまたは Ｆａｂ″フラグメントが、そのアミノ酸配列において、もしくはアミノ酸配列に 対して多数の挿入物、欠失または変更を含みうろことを意味する。

各Ｆａｂフラグメントは、好ましくはヒト化フラグメントである。特に有利なＦ ａｂフラグメントは、遺伝子的に修飾されたフラグメントで、これは、そのヒン ジ領域にただ１個の遊離チオール基をもつ。そのようなフラグメントの構築は、 本発明者らの欧州特許公開第３４７４３３号明細書および以下の実施例で開示さ れる。

本発明の多価抗原結合蛋白では、抗体またはそのフラグメントは、好ましくは架 橋結合剤を用いて共有結合で互いに結合している。一般に、架橋結合剤は、架橋 結合分子（例えば蛋白）のために慣用的に用いられる、多数の既知化学的架橋結 合剤のうちのいずれでもよい。しかしながら、好ましくは、架橋結合剤は、該抗 体もしくはフラグメント中の適切なアミノ酸（例えば側鎖チオール、アミノもし くはカルボキシル基を含むアミノ酸）またはＣ−末端のカルボキシル基とその各 々が反応することができる、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の官能基を含む、 特にデザインされた単一リンカ−分子である。

そのようなリンカ−の例は、国際特許公開第１１０−Ａ−９０１０９１９５号お よびＶＯ−Ａ−９０１０９１９６号明細書並びに欧州特許公開第３８４６２４号 、　３８５６０１号、４４６０７１号および４５３０８２号明細書中に見い出す ことができる。特に有用な３−および４−官能基性架橋結合試薬は、本発明者ら の同時係属中の国際特許公開第ＷＯ９２／２２５８３号明細書に記載され、その 開示内容は、本明細書に参照により含まれる。

したがって、例えば、適切な架橋結合剤の特に有用な群は以下の式（１）を含む ； Ｒ’ＣＨ（Ｒ”）ＮＨＣＯＲ” 式中、Ｒ１はカルボキシル（−ｃｏ、ｘ−ｉ）またはエステル他力ルボイ）Ｉｉ Ｃ−ＣＯ”Ｒ）基、カルボキスアミド（−ＣＯＮＨ，）または基−ＣＯＡ　（こ こでＡは、直接または炭素−炭素もしくは炭素−異種原子結合を形成するための スペーサー基を介して一〇〇基に結合させたエフェクターまたはレポーター分子 である）で；Ｒ２およびＲ３（これらは同一でも異なっていてもよい）は、それ ぞれ場合によって置換された直鎖もしくは分枝アルキレン、アルケニレン、もし くはアルキニレン鎖［場合によって１つまたはそれ以上の一〇−もしくは−Ｓ− 原子、またはＮ（Ｒ’）（ここでＲ４は水素原子またはｃｌ−６アルキル基）　 、　Ｎ　（Ｒ’）　ｃｏ−１−ＣＯＮ　（Ｒ’）　＋。

Ｃ８，シクロアルキレン、Ｃ＠−＋Ｚアリーレンまたはｃ、−１゜ヘテロアリー レン基が介在する］で、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の反応性官能基を含む が、その場合Ｒ２およびＲ１を合わせた反応性官能基の総数は２つ、３つまたは それ以上である。

このタイプの架橋結合剤では１反応性官能基は、抗体またはフラグメント中の適 切なアミノ酸と反応し、その結果生じた結合構造が架橋剤の残基となることは理 解されるところである。

より好ましくは、本発明の多価抗原結合蛋白の抗体またはそのフラグメントは、 各抗体またはフラグメントのチオール基に連結された結合構造によって互いに結 合している。

一般に１本発明の多価結合蛋白を製造するための架橋結合反応は、慣用的な方法 を用いて、例えば、抗体またはフラグメントおよび適切なリンカ−を水性溶媒中 に含む出発材料を。

適切な温度（例えば周囲温度から４０℃、例えば約３７℃）で混合することによ って達成できる。用いられる出発材料の相対的濃度は、用いられる架橋結合剤、 それが含む反応性官能基の数、さらに所望される生成物の性状に大きく依存する が、一般には、抗体またはフラグメントは過剰濃度で存在するであろう。

所望の場合は、抗体またはフラグメント出発材料は、使用前に架橋結合剤との反 応を促進するために修飾することができる。したがって、例えば、以下の実施例 で述べるように。

例えば２−イミノチオレンとの反応による慣用的なチオール化反応を用いて、チ オール基をその後の架橋結合剤との反応のために導入することができる。抗体フ ラグメントが遮断チオール基５例えば遮断ヒンジチオール基を有するまた別の実 施例では、遊離チオール基は、適切ないずれかの反応、例えば以下の実施例で述 べるように、β−メルカプトエチルアミンを用いることにより還元によって得る ことができる。

多価抗原結合蛋白を含む、本発明のヒト化抗体分子は、インビボ診断または治療 に、特に結腸直腸腫瘍およびその転移の診断と治療に用いることができる。

診断および治療に使用するために１本発明のＨＡＭは、好ましくはエフェクター またはレポーター分子に結合される。

したがって、例えば、本発明のＲＡＭは、細胞毒性薬剤もしくは細胞増殖抑制剤 のようなエフェクター分子に、またはレポーター基、例えば放射性核種（例えば 放射性ヨウ化物）もしくは人体内で検出可能な放射性核種複合体のような原子も しくは分子に結合させることができる。

エフェクターまたはレポーター分子は、本発明のＲＡＭに直接、場合によって連 結基を介して、またはＲＡＭが結合構造を含む場合は該結合構造を介して結合さ せることができる。

例えば、ＲＡＭは、共有架橋構造によって結合した。金属原子と結合可能な有機 基（例えば大環基）、または毒素（例えばリシン）、または抗腫瘍剤を有する。

また、組換え体ＤＮＡ技術の方法を用いて、完全な分子のＦｃフラグメント、Ｃ Ｈ２またはＣＨ３ドメインが１機能を有する非免疫グロブリン性蛋白（例えば酵 素もしくは毒素分子）によって置換されているか、またはペプチド結合によって そこに結合したＨＡＭを製造することができる。

特に有用なレポーターまたはエフェクター基は１本発明者らの同時係属中の国際 特許公開第１０９２／２２５８３号明細書に記載されており、その開示内容は本 明細書に参照により含まれる。

したがって１例えば、典型的なエフェクターまたはレポーター基は、放射性核種 （特に放射性ヨウ化物）、キレート化金属、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光計で検出で きる化合物の蛍光化合物を含む。

キレート化金属は、配位数が２から８までの２または３陽電荷金属のキレート物 を含む、そのような金属の典型例は。

テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（ＣＯ）、銅（Ｃｕ）、金 （Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（ｐｂ）　、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ） 、ガリウム（Ｇａ）、イツトリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム （Ｇｄ）およびスカンジウム（Ｓｃ）を含む、一般に、金属は好ましくは放射性 核種である。典型的な放射性核種は、””Ｔ　ｃ、””　Ｒｅ、””Ｒｅ、”Ｃ ｏｏ　＠・Ｃｏ、”Ｃｕ。

１”Ａｕ、”’Ａｕ、”’Ａｇ、””Ｐｂ＊　”＠Ｂｉ、”’Ｂｉ＋”１１　ｎ 、”Ｇａ、”Ｇａ、−−Ｙ、うＩＩＹ、１＠１ｌＴｂ、１＊３’ａａおよび”Ｓ ｃを含む。

キレート化金属は、例えば、適切なポリデンテート（ｐｏｌｙｄｅｎｔａｔｅ） キレート剤のいずれか、例えば環状ポリアミン、ポリエーテル、（例えばクラウ ンエーテルおよびその誘導体）；ポリアミド、ポリフィン；及び環状炭素誘導体 でキレート化された上記タイプの金属の１つであろう。

一般に、キレート剤のタイプは、使用する金属に依存する。

しかしながら、本発明の結合物において特に有用なキレート剤群は、非環式およ び環式ポリアミン、特にポリアミノカルボン酸、例えばジエチレントリアミンペ ンタ酢酸およびその誘導体、並びに大環式アミン、例えば環状３−アザおよび４ −アザ誘導体、例えば１，４．７トリアザシクロノナンーＮ。

Ｎ’　、Ｎ”−トリス酢酸、及び１，４，７．１０テトラアザシクロドデカン− Ｎ、Ｎ’　、Ｎ”　、Ｎ”−テトラ酢酸およびその誘導体；並びにポリアミド、 特にデスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）およびその誘導 体である。

特に有用なキレート化金属はキレート化″１１工ｎおよび１Ｙである。

本発明の多価抗原結合蛋白では１例えば、国際特許公開第１１０９２７２２５８ ３号明細書および上記の式（１）に記載されたように、レポーターまたはエフェ クター基は、抗体またはフラグメントを一緒に結合させる連結基部分を構成する ことができる。この点に関して、本発明の特に有用な多価抗原結合蛋白は、Ｃ： Ｔ５５７、ＣＴ５５８またはＣＴ９９８から選ばれる架橋結合剤および金属例え ばイツトリウムまたはそのインジウム複合体によって、互いに結合されているも のである。ＣＴ５５７．ＣＴ５５８およびＣＴ９９８は、以下の式（２）、（３ ）および（４）の化合物で、その製造は、国際特許公開第１０９２／２２５８３ 号明細書に記載されている：Ｚはベンジルオキシカルボニルで； ここで、ＭＡＬおよびＺは、式（２）で定義した通りで；ここでＭＡＬは式（２ ）で定義した通りで、ＭＡＣは：ここで　ｘｌ、Ｒ２、Ｒ１およびＲ４はそれぞ れ一〇　Ｈ，ＣＯ□Ｈ基で、−Ｒ’−は−（ＣＨ，）、ＮＨＣＯ（Ｃ：Ｈ，）、 ＧＯ−基である。Ｃ：Ｔ９９８は実施例２の化合物及び１０９２／２２５１１３ 号に記載される中間体８から製造できる。

ＣＴ５５１．ＣＴ５５８またはＣＴ９９８と金属（例えばイツトリウムまたはそ のインジウム複合体）とによって−緒に結合させた、４つまたは特に３つのＦａ ｂフラグメントは特に有用である。このタイプの化合物では、フラグメントは好 ましくは、各フラグメントに存在するチオール基を介して互いに結合している。

有利には、各フラグメントは、ヒンジ領域に１つのチオール基（架橋結合剤との 反応のため）を含む遺伝子操作によるフラグメントである。

本発明はまた、本発明のＲＡＭ、特にエフェクターもしくはレポーター分子と結 合したＲＡＭを含む共役分子を含む治療用および診断用組成物、およびそのよう な物質の治療および診断、特に結腸直腸腫瘍とそれによる転移の治療および診断 における使用を含む、そのような治療用および診断用組成物は、代表的には本発 明のＲＡＭを１例えばインビボの使用のために医薬的に許容できる賦形剤、希釈 剤または担体とともに含んでいる。

代表的には、治療および診断における使用は、医薬的に有効量の本発明のＲＡＭ を患者に投与することを含む、投与されるべき正確な用量は、ＲＡＭの使用目的 並びに患者の年齢および条件にしたがい変動するが１代表的には、約０．１ｍｇ からｌｏｏｏｍｇ、例えば約１　ｍ　ｇから５００ｍｇまで変動するであろう、 ＲＡＭは、単回投与または一定期間連続的態様で投与することができる。服薬は 適切に繰り返すことができる。ＲＡＭは、どのような適切な投与ルート用にも慣 用的な方法で製剤化することができるが、一般には、例えば静脈内、腹腔内また は筋肉内ルートによる投与のための液体形（例えばＲＡＭの生理的に許容できる 滅菌緩衝液の溶液）である。

の　日 本発明を添付の図面を参考にして実施例によって詳述する。

図１は、ネズミＡ３３の可変領域配列のＰＣＲクローニングのためのオリゴヌク レオチドブライマーを示す。

図２は、キメラＡ３３発現ベクターの概略図である：Ａ、キメラ軽鎖発現ベクタ ー、ｐＲ０１０８Ｂ、キメラ重鎖発現ベクター、ｐＲ０１０７相対的な制限部位 のみを示している。

図３は、Ａ３３軽鎖（Ａ）および重鎮（Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示す。

シグナル配列（下線部）および成熟可変領域（上）の配列が示される。ＰＣＲプ ライマーで規定されるＤＮＡ配列は、イタリック体で示される。ＣＤＲ領域は二 重下線で示す。

図４は、Ａ３３の組立てに用いたオリゴヌクレオチドを示す。ヒト化軽鎖可変領 域のヌクレオチドは下線で示す。シグナル配列（イタリック体）の予想されるコ ード配列、成熟可変領域（上）およびヒトカッパ定常領域（下）のＮ末端配列が 、オリゴヌクレオチド配列の下に示される。ネズミの配列に由来するＣＤＲ領域 および非−ＣＤＲ残基は二重線で示す。

図５は、Ａ３３の組立てに用いたオリゴヌクレオチドを示す、ヒト化重鎖可変領 域のヌクレオチドは下線で示す。シグナル配列（イタリック体）の予想されるコ ード配列、成熟可変領域（上）およびヒトＣＨＩドメイン領域（下）のＮ末端配 列が、オリゴヌクレオチド配列の下に示される。ネズミの配列に由来するＣＤＲ 領域および非−ＣＤＲ残基は二重線で示す。

図６は、競合アッセーの結果を示す。このアソセーでは、ネズミＡ３３（）と、 ＣＨ○−に１一時発現実験（）で調製シたヒト化Ａ３３とを、Ｃｏ　ｌ　ｏ　２ ０５細胞とＦＩＴＣ−標識ネズミＡ３３との結合競合に用いた。細胞に結合した 残留ＦＩＴＣニーｍＡ３３をＦＡＣスキャン分析器で測定し、蛍光（Ｙ軸）と投 入非標識抗体（Ｘ軸）との関係を調べた。

図７は、キメラおよびヒト化Ａ３３ＧＳ発現ベクターの概略図である。

Ａ、キメラＡ３３（γ１）発現ベクター、ｐＧＲ５０Ｂ、ヒト化Ａ３３（γ１） 発現ベクター、ｐＡＬ７１Ｃ，ヒト化Ａ３３ＦＡＢ’　（ｙ４Δａｙｓ）発現ベ クター、ＡＬ７２ 相対的な制限部位のみを示す。

図８は、ＬＳｌ　７４Ｔ腫瘍保持ヌードマウスにおける１１”Ｉｎ−ｃＡ３３　 （ｙｌ）−９Ｎ３結合物の注射後２４．４８．１２０および１９２時間の生体分 布を示す。

図９は、Ｃｏ１ｏ２０５腫瘍保持ヌードマウスにおける”Ｙ−ｂＡ３３　（ｙｌ ）−１２Ｎ４結合物ノ注射後２４．４８．１４４時間の生体分布を示す。

図１０は、ｈＡ３３　（γ１）と　ネズミＡ３３は同様にヒト結腸大腸癌細胞系 ＳＷＩ　２２２の細胞と結合する能力をもつことを示すスキャチャードプロット である。

図１１は、５Ｗ１２２２の皮下異種移植された雌のヌードマウスにおける、注射 後２４．７２および１２０時間の”Ｙ−ｈＡ３３　（１１）−１２Ｎ４．”Ｙ− ｃＡ３３　（ｙ　１）−１２Ｎ４および″′Ｙ−ネズネズ３３−１２Ｎ４結金物 の生体分布の比較である。

図１２は、５Ｗ１２２２皮下異種移植された雌のヌードマウスにおける。注射後 ３．２４．４８および１６８時間の”Ｊ−ｈＡ３３　（ｙｌ）　の生体分布を示 ｔ。

図１３は、ａＹ−Ａ３３　（ｙｌ）−１２Ｎ４Ｍ合物による処置後の雌ヌードマ ウスにおけるＳＷＩ　２２２腫瘍の完全退縮を示すグラフである。

図１４は、ＤＦＭを形成するためのＣＴ５２によるｈＡ３３Ｆａｂ’　（ｙ４Δ ｃｙｓ）架橋結合のＨＰＬＣ像を示す。

Ａ０反応混合物 Ｂ、精製ＤＦＭ 図１５は、ＴＦＭを形成するためのＣＴ５５７を用いたｈＡ３３Ｆａｂ″　（γ ４Δａｙｓ）架橋結合のＨＰＬＣ像を示す。

Ａ６反応混合物 Ｂ、精製ＴＦＭ 図１６は、ＴＦＭを形成するためのＣＴ９９８を用いたｈＡ３３Ｆａｂ’　（ｙ ４Δａｙｓ）架橋結合のＨＰＬＣ像を示す。

図１７は、ｈＡ３３Ａ３３架橋質の非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

シー２１１分子量マーカー；レーン２、ｈＡ３３Ｆａｂ’（γ４Δａｙｓ）；レ ーン３、Ａ３３ＤＦＭ反応混合物；レーン４、Ａ３３ＤＦＭ反応混合物；レーン ５．Ａ３３ＴＦＭ（ＣＴ５５７）反応混合物；レーン６、Ａ３３ＴＦＭ　（ＣＴ ５５７）反応混合物；Ｌ／−ン７、Ａ３３ＴＦＭ　（ＣＴ９９８）反応混合物； レーン ８、精製Ａ３３ＴＦＭ　（ＣＴ５５７）。

図１８は、競合アッセーの結果を示す、ここでは、ｈＡ３３ＴＦＭ　（＋）、ｈ Ａ３３ＤＦＭ　（）、ｈＡ３３　（γ１）（）、またはｈＡ３３Ｆａｂ’　（ｙ ４Δｃｙｓ）（）が、Ｃｏ１ｏ２０５細胞とＦＩＴＣ標識ネズミネズ３との結合 に対する競合に用いられた。細胞に結合した残留ＦＩＴＣ−ｍＡ３３をＦＡＣス キャン分析器で測定し、蛍光（Ｙ軸）と投入非標識抗体（Ｘ軸）との関係を調べ た。

図１９は、”Ｙ標識ｈＡ３３ＴＦＭ　（ＣＴ５５７）−１２Ｎ４、ｈＡ３３ＤＦ Ｍ、およびｈＡ３３　（γ１）−１２Ｎ４のＬＳ１７４Ｔ腫瘍保持ヌードマウス における注射後４８時間の生体分布を示す。

図２０は、′６Ｙ標識ｈＡ３３ＴＦＭ　（ＣＴ５５７）−１２Ｎ４、ｈＡ３３Ｄ ＦＭおよびｈＡ３３　（γ１）−１２Ｎ４のＬＳ１７４Ｔ腫瘍保持ヌードマウス における注射後２４．４８および１４４時間の腫瘍：血液比を示す。

図２１は、”ＹｍＡ３３ＴＦＭ　（９９８）−１２Ｎ４結金物の５Ｗ１２２２Ｔ 腫瘍保持ヌードマウスにおける注射後３．２４．４８．７２および１４４時間の 生体分布を示す。

図２２は、”ＹｍＡ３３ＴＦＭ　（９９８）−１２Ｎ４結合物対ＩｇＧの５ＷＩ ２２２Ｔ腫瘍保持ヌードマウスにおける注射後３．２４．４８．７２および１４ ４時間の改良された腫瘍：血液比を示す。

図２３は、”ＹｍＡ３３ＴＦＭで処置されたＳＷＩ　２２２腫瘍保持ヌードマウ スにおける７０日間の腫瘍容積の減少を示す。

図２４は、”ＹｍＡ３３ＴＦＭ　（９９８）　−１２Ｎ４結合物の雄ダンキンハ ートレーモルモットにおける生体分布を示す。

図２５は、大腸菌発現ベクターｐＭＲＲ６０の模式図である。相対的制限部位の みを示す。

図２６は、一定の範囲の温度で一晩保温した後の大腸菌細胞抽出物のウェスタン 免疫プロットを示す（詳細は明細書中、実施例３を参照）。

図２７は、誘発から採集までの間を３０℃と４６℃で実施した、大腸菌細胞抽出 物の非還元ウェスタンプロットを示す。

図２８は、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（レーン１と２）中での保温または、リゾチ ームによる処理（レーン３−７）によって得られた大腸菌細胞抽出物のウェスタ ン免疫プロットを示す。

図２９は、競合アッセーの結果を示す、ここでは、Ｎ５０および大腸菌細胞から 調製したｈＡ３３ＤＦＭを、ｃｏｌ。

２０５０細胞とＦＩＴＣ−標識ネズミＡ３３との結合に対する競合のために用い た。細胞に結合した残留ＦＩＴＣ−ｍＡ３３をＦＡＣスキャン分析器で測定し、 蛍光（Ｙ軸）と投入非標識抗体（Ｘ軸）との関係を調べた。

図３０は、Ｌ５１７４Ｔ腫瘍保持ヌードマウスにおけるＮ５０および大腸菌から 調製した”’ＩｈＡ３３ＤＦＭの注射後２４時間の生体分布を示す。

本実施例では、以下の略語が用いられる：Ｌ−軽鎖 Ｈ−重鎖 γ４Δａｙｓ−ヒンジ領域に１つの遊離チオール基を含む１ｇＧ４定常領域（欧 州特許公開第３４７４３３号明細書参照） ＤＦＭ−互いに結合した２つのＦａｂフラグメントを含む単一特異性二価結合蛋 白 ＴＦＭ−互いに結合した３つのＦａｂフラグメントを含む単一特異性三価結合蛋 白 ＨＰＬＣ−高速液体クロマトグラフィーＣＴ５５７およびＣＴ９９８は、先に上 記で述べた通りである。

去１漬す。

−Ｚス］≧」」楚 培養上清中または精製調製物中の組立て抗体をＥＬＩＳＡ式アッセー（１＋１ｈ ｉｔｔｌｅら、　１９８７）で測定した。ここでは、キメラ抗体およびセイヨウ ワサビのペルオキシダーゼ（）ＩＲＰ）に連結したヒトカッパ鎖に対するマウス モノクローナル抗体を捕捉するために固相抗−Ｆｃｇ鎖を用いて結合蛋白を明ら かにした。

抗原結合を明らかにするために、直接および競合式結合アッセーを用いた。直接 結合アッセーでは、ＡＳＰＣ−１またはＣｏ　ｌ　ｏ２０５細胞を、種々の量の ネズミＡ３３、キメラＡ３３もしくはヒト化Ａ３３．または非特異的抗体コント ロールの存在下で４℃で１時間保温した。未結合抗体を除去するために細胞を洗 浄した後、結合抗体の存在を、ＦＩＴＣ標識抗ネズミネズは抗ヒトＦｃでさらに 保温し、ＦＡＣスキャン分析器（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で検出 するっことによって明らかにした。

競合式では、被検抗体の量を増加させながら、飽和量のＦＩＴＣＩＪ！！ネズミ 抗体とＡネズＧニー１またはＣｏ　ｌ　ｏ２０５細胞とともに上記のように保温 した。未結合抗体を除去するために細胞を洗浄した後、ＦｒｒｃｌＬｌ！ネズミ 抗体の細ネズの結合をＦＡＣスキャン分析器で検出した。

Ａ３３可　のクローニン、グー ネズミＡ３３　（ＩｇＧ２ａ／ｋ）ＣＷａｉｔら、　１９９０）は、１゜５Ｌの ハイブリドーマ（ＡＴｃｃ、　ＨＢ８７７９）上清から得た。３２゜５ｍｇを蛋 白Ａセファロースによって精製した。この物質をアッセー標準物質として用い、 さらに分離重鎖および軽鎖のＮ末端配列決定を実施した。

可変領域配列は、特定のオリゴヌクレオチドブライマー（Ｊｏｎｅｓ　＆　Ｂｅ ｎｄｉｇ＋　１９９０）を使用して得、セルチックの発現ベクター（図１参照） でクローニングができるように修飾し、Ａ３３ハイブリドーマのｍＲＮＡ＋ポリ Ａ由来ｃＤＮＡで配列を増幅させた。配列増幅は、変性、アニーリングおよび増 幅条件を９２℃、１分；５５℃、１分；７２℃、１分とし。

３０増幅サイクルでＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−ｃｅｔｕｓ 製）とともにボυメラーゼチェーン反応ＣＰＣＲ１Ｓａｉｋｉら、１９８５）を 用いて実施した。アマ−ジャムインターナショナル（＾ｍｅｒｓｈａ＋ｍ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成キットを用いて合成したｌｏｏ ｎｇの第一の鎖のｃＤＮＡと１０ピコモルのオリゴヌクレオチドブライマーを１ ００ｍ１の反応容積中で使用した。

Ｐ　ＣＲ１１＠生成物は、軽鎖ニツイテはＢｓｔＢＩおよび５ｐＩＩを用い１重 鎮のためにはＨｉｎｄＩエエおよびＡ　ｐ　ａ　Ｉを用いて切断した。これらの フラグメントは、ヒトカッパ軽鎖アクセプターベクター、ｐＭＲＲ１５，１、ヒ ト重鎖（ＩｇＧｌ）アクセプターベクター、ｐＭＲＲＯｌｌでそれぞれクローニ ングし、軽鎖のためにはキメラ発現ベクターｐＲ０１０８（図２）を、重鎖のた めにはｐＲＯ１０７をそれぞれ生じる。

各プラスミドについて４つの別々に得られたクローンの可変領域の配列を決定し た。両方の可変領域について、先頭領域（ｐｒｉｍｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ）間 のＤＮＡ配列は４つのクローンの各々において同一であった。先頭領域配列内で 変動性が認められ、これは用いたプライマーの配列内の反復性に由来する。

重鎖と軽鎖の両方について、成熟可変ドメインの最初の１１残基について得られ た推定アミノ酸配列は、ネズミ抗体のＮ末端ペプチド配列決定の結果と一致した 。

ＤＮＡ配列は、読み枠１でアニールする前進プライマー（Ｏｒｌａｎｄｉら、　 １９８９）を用いた第二のＰＣＲ実験によってさらに確認された。得られた配列 は、最初の実験で認められたものと一致した。Ａ３３軽鎖および重鎖可変領域の アミノ酸配列は図３に示す。

ｌらかに　るーめのキメラＡ３３　１ 得られた配列が一体化されＡ３３抗原に結合することができるということを確認 するために、キメラ発現プラスミドｐＲ０１０７およびｐＲ０１０８を２００ｍ Ｌ（７）規模でｃＨｏ−Ｌ７６１ｈ細胞で一時的に同時発現させた（Ｃｏｃｋｅ ｔｔら。

１９９０）、生じた培養上清は、組み立てられた抗体を含むことがＥＬＩＳＡア ッセーで示された。この抗体は蛋白Ａセファロースクロマトグラフィーで精製さ れ、Ａ、　Ｓ　Ｐ　Ｃ−１細胞に濃度依存態様で結合することが示された。該細 胞への抗体の結合は、ＦＩＴＣ，標識抗ヒトＩｇＧを用いて測定し、結合した蛍 光をＦＡＣスキャン分析器で検出した。

ヒト　Ａ３３のｆ含 Ａ３３のネズミ可変領域をＡｄａｉｒら（１，９９１）に記載の方法および抗体 のヒト化に関して最近報告された他の文献（Ｃｏら。

１．９９１）にしたがってヒト化した。Ａ３３のＶＨは、ヒトサブグループＶ、 ＩＨのコンセンサス配列と極めて密接な相同性（７０％）を示し、一方、ｖＬは 、ＶＨおよびＶＬＩＶのコンセンサス配列と極めて高い相同性（６２％）を示す 。これらの群から、、ＶＪＩＩ重鎖とｖ、、工軽鎖を有するＬＡＹをヒト読み枠 として選択した。軽鎖のためには、残基１−２３．３５−４５．４．７−４９． ５７−８６．８８および９８−１０８までがＬＡＹ配列に由来しくＫａｂａｔら 、１９８７）の通りに番号付けした）、残基２４−３４．４６．５０−５６．８ ７および８９〜９７までがネズミ配列に由来した。残基２４−３４．５０−５６ および８９−Ｒ９７は相補性決定領域に一致する（Ｋａｂａｔら、　＋９８７） 　（図４参照）。残基４６および８７は軽鎖および重鎖可変領域の接触領域にあ ると予想される。残基４６は通常ロイシンである。残基８７はフェニルアラニン またはチロシンのどちらかである。

重鎮のためには、残基２−２６．３６−４９．６６−７１．７４−８２ａ、８２ ｃｍ８５．８７−９３および１０３から１１３まではＬＡＹ配列に由来し、一方 、残基１．２７−３５．５０−６５．７２．７３．８２ｂ、８６および９４−１ ０２まではネズミ配列に由来する（図５参照）０重鎖の残基３１−３５．５０− ６５および９５−１０２は、相補性決定領域に一致する（Ｋａｂａｔら、　１． ９８７）、この読み枠領域中のネズミ由来アミノ酸は、以下の理由のために含ま れる。残基１は溶媒の影響を受けやす＜、ＣＤＲ領域の近傍に存在する。ＬＡＹ は残基アラニンを有するが、ヒトおよびネズミｖ８配列のこの部位には通常発見 されず、したがって、ネズミの残基が用いられた６部位７２および７３で、ネズ ミ残基が、ＣＤＲ２との予想される近さのゆえに用いられ、さらにまた、残基７ ２の場合に、可変ドメインにＬＡＹ読み枠の使用によってＮ−結合筒付加部位を 導入する可能性を除去するために用いられたＣＣｏら、　１．９９１ｉ　Ｌａｗ ら、１９９１参照）、ネズミ配列はまた。

ドメイン間残基９４で用いられたが、ここではＡ３３はプロリンを有し、これは この部位には通常認められない、ネズミ残基は、部位８２ｂおよび８６で用いら れた。なぜならば。

ＬＡＹ読み枠を有するヒト化抗体中のこれらの部位のヒトアミノ酸の使用は、重 鎖の発現に有害であることが以前に見い出されたからである（国際特許公開第Ｗ ０９２１０１０５０９号明細書）。

ヒ・　Ａ３３　とＣＨＯにお番るー゛ ヒト化可変領域は、ＰＣＲアッセンブリ一方法（国際特許公開筒［１９２１０１ ０５０９号、ｗＯ９２１０１１３８３号明細書、並びにＤａｕｇｈ−ｅｒｔｙら 、１９９１；　Ｌａｗら、　１９９１）を用いて一部重複オリゴヌクレオチドか ら組み立てた。このオリゴヌクレオチドは、その軽鎖については図４に、重鎮に ついては図５に示されている。

このオリゴヌクレオチドは１重鎖可変領域については１ピコモルの長い内部オリ ゴヌクレオチドを、軽鎖については０゜０１ピコモルを、両方の場合において１ ０ピコモルの短い末端オリゴヌクレオチドとともに用いて組み立てた０反応条件 は、９２℃、１分；５５℃、１分；７２℃、１分の３０サイクルで、Ｔａｑポリ メラーゼを使用した。ＰＣＲ生成物は。

キメラ抗体構築で述べたように適切な制限酵素で消化し、軽鎖についてはｐＭＲ ＲＯ１５，１で、重鎖についてはｐ　Ｍ　ＲＲＯＩＩでクローニングし、それぞ れｐｃＧ１６およびＰＲ０１０９を得た。

ｐＲＯ１０８（ｃＬ発発現ダクターおよびｐｃＧ１６　（ｈＬ発発現ダクターを 、ＣＨＯＬ７６１ｈ細胞に、各々ＰＲＯ１０７（ｃＨ発現ぺ’）！Ｉ−）または ｐＲＯ１０９（ｈＨ発現ベクター）とともに同時に形質感染し、培養上清の抗体 を較正し、これらが、Ｃｏ１ｏ２０５細胞上の抗原に関して、Ｆ工ＴＣＩＩＩ識 ネズミＡ３３との結合について競合することをＦＡＣスキャン分析によって示し た（図６）、完全にヒト化された抗体の相対能力は、競合ＩＣ５ｏ値を基にして ネズミ抗体のそれの７５％であると計算された。

ｃＡ３３　ｙｌ　、ｈＡ３３　ｙｌ　、ｈＦＡｂ’　ｙ４Δｃ　ｓ　：メノＮＳ Ｏ”（１） ＧＳ増幅システム（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、　１９９２；欧州特許公開第２５ ６０５５号明細書）を基に発現ベクターをキメラＡ３３およびヒト化Ａ３３のた めに、さらにまたヒト化ＦＡｂ’　（γ４Δｃｙｓ）フラグメントを産生するこ とができるベクターのために構築した。

ｃＬおよびｃＨ鎖の両方を同時発現することができるキメラ発現ベクターｐＧＲ ５０（図７）を１発現ベクターｐＥＥ１３由来のＢａｍＨｌ−Ｋｐｎｌフラグメ ントを、ｐＲＯ１０８由来のＫｐｎｌ−ＮｏｔｌフラグメントおよびＰＲＯＩＯ ７由来のＮ　ｏ　ｔ　１−　Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１フラグメントと連結することによ って構築した。

ｐＥＥ１３はｐ　Ｅ　Ｅ　１２　（Ｒｏｌｆｅ　＆　Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ、　 １９９２）と同様な発現ベクターであるが、このＰＥＥ１２で、免疫グロブリン ターミネータ−フラグメントを含む１．７ＫｂｐのＢｃｌｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ 配列（Ｌａｗら、　１９８７）がｐＥＥ１２のＢａｍＨ１部位においてクローニ ングされ、そのターミネータ−フラグメントの３′側にＢａｍ８１部位をもつ生 成りローンを選択した。ＰＲＯ１０８がらのＫｐｎｌ−Ｎｏｔｌフラグメントは 、キメラ軽鎖に対して５′側にｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサ−の １コピー（この後に５ｖ４０ポリＡ付加配列が続く）およびＩｇターミネータ− 配列を含む（Ｌａｗら、　１９８７）、　Ｐ　ＲＯ１０７がらのＮｏｔｌ−Ｂａ ｍＨｌフラグメントは、キメラＡ３３（γ１）重鎖をｈｃＭＶ−ＭＩＥプロモー ター／エンハンサ−とＳＶ４０ポリＡ付加配列との間に含む。

ｈＬとｈＨ鎖の両方を同時発現することができるヒト化Ａ３３発現ベクターｐＡ Ｌ７１　（図７）を、ｐｃ：Ｇ１６からのＮｏｔｌ−ＢａｍＨ１ベクターフラグ メント（これはシャトルベクター配列を含む）、ＧＳｃＤＮＡ選択可能マーカー 、ヒト化軽鎖に対して５′側にｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサ−の １コピー（この後にＳＶ４０ポリＡ付加配列が続く）およびＩｇターミネータ− 配列を得ることによって構築した。このベクターフラグメントを、ｐＲ○１０９ からのＮｏ　ｔ　１−ＢａｍＨ１フラグメント（これは、ｈ　ＣＭＶ−ＭＩＥプ ロモーター／エンハンサ−とＳＶ４０ポリＡ付加配列との間にヒト化Ａ３３　（ ｙｌ）重鎮を含む）を連結した。

軽鎖と結合して抗体Ｆａｂ’　フラグメントを生じる重鎖フラグメントは、重鎖 可変ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ配列（または誘導ヒンジ配列）から 成り、またＦｄ’　としても知られている。修飾Ｆｄ’配列（ここでヒンジ配列 はシスティンの１つをアラニンに置換して変更され、ヒンジのシスティンの数を １つに減らされている）はＢｏｄｍｅｒら（１９８９）の文献に記載され、Ｆｄ ’（γ４ΔＣｙｓ）として知られている。

Ａ３３ｈＬおよびＡ３３ｈＨ−Ｆｄ’　（ｙ４ΔＣｙｓ）を産生ずることができ る発現ベクター、ｐＡＬ７２　（図７）を。

ｐＣ，Ｇ１６からのＮｏｔｌ−ＢａｍＨ１ベクターフラグメントとＰＲＯ１０９ からのＮｏｔｌ−ＡＰａｌフラグメント（これはヒト化Ａ３３重鎖可変領域の５ ′側のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサ−をコードする）、ＩｇＧ４ ＣＨＩ、ヒンジ（Ｄｃｙｓ）配列および発現ベクターｐＡＬ４９由来Ａｐａｌ− ＢａｍＨ１フラグメントのＳＶ４０ポリＡ付加配列をともに結合して構築した（ 国際特許公開節ｗ０９２１０１５０９号明細書）。

プラスミドｐＧＲ５０，ｐＡＬ７１およびｐＡＬ７２を、ｐＧＲ５０のためにＰ ｖｕｌ、またｐＡＬ７１およびｐＡＬ７２のためにはＦｓｐｌを用いて直線化し 、さらに５０ｍｇのＤＮＡを、１５００Ｖ、３ｍＦで２×１秒パルスでエレクト ロポレーションにより１０７のＮＳＯ細胞に形質感染した。

この細胞を９６穴（ウェル）の培養皿に１０％透析加熱不活ＣＢ２培地中の５　 ｘ　１０’細胞７５０　ｍ　ｌ　／ウェルで分けた。

３７℃、５％ＣＯ□で２４時間後、さらに、１０ｍＭメチオニンスルフォキシミ ン（ＭＳＸ）を補充した、１０％ｄＦＣ８含有ＣＢ２培養液１００ｍ１を各ウェ ルに加えた。この細胞を２−３週間培養した。明瞭なコロニーを培養後１９日で 認めた。単一コロニーを含むウェルから培養上清を採集し。

抗体産生コロニーを、培養２４時間につき細胞当りの産生抗体のピコグラム（ｐ ｇ）として特異的産生率（ＳＰＲ）の概算のために増殖させた。最も高いＳＰＲ を有する細胞系をさらに分析するために選択した。、ｍ胞ストックを凍結し、細 胞系を〈１％透析仔牛脂児血清を含むＭＭＩ培溶液溶液して増殖させ、抗体精製 のために培養上清を製造した。ｃｌｇＧｌおよびｈＩｇＧ１細胞系である程度の 産生度の損失が最初認められたが、ＭＭＩで培養後、この細胞系の産生度は安定 した。

最も高い産生細胞系は８Ｄ３　（ｃＡ３３　（ｙｌ）、ＳＰＲは３３　ｐ　ｇ／ ＩＩ胞／２４ｈ、小規模培養の蓄積収量は３５ｍｇ／Ｌ）、ＨＣ８６，７（ｈＡ ３３　（γ１）、ＳＰＲは３Ｐｇ／細胞／２４ｈ、小規模培養の蓄積収量は３６ ｍｇ／Ｌ）およびＨＣ８７、２１（ｈ　Ａ　３３　Ｆ　ａ　ｂ　’　（Ｙ　４Δ ａｙｓ）、ＳＰＲは５０ｐｇ／細胞／２４ｈ、小規模培養の蓄積収量は１１２ｍ ｇ／Ｌ、１５Ｌ規模の培養で１７０ｍｇ／Ｌ）である。

ンビボの １、キメラＡ３３　γ１ ｅＡ３３　（ｙｌ）をＮＳＯ細胞系８Ｄ３からキメラＢ７２゜３に関して記載さ れた方法（Ｋｊ、ｎｇら、　１９９２）を用いて精製した。ｃＡ３３　（ｙｌ） の純度は、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅで調べ、Ｃｏ１ｏ２０５細胞上の抗 原と結合するその活性は、ＦＡＣスキャンによる分析でＦｉＴＣ＠識ｍＡ３３を 用いた競合実験でｍＡ３３と匹敵することが示された。

皮下にＬ　Ｓ　１７４．　Ｔ異種移植腫瘍を有するヌードマウスのｃＡ３３　（ γ１）の生体分布を、］、］１１−インジウで標識したときに調べた。１１１− インジウムでの標識のための９Ｎ３マクロサイクルを精製ｃＡ３３（ｙｌ）に、 ９Ｎ３−マレイミド誘導体（ＣｒＢ２、国際特許公開公報ｖ０８９１０１４７５ 号の実施例２ｂの化合物とＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒド ロキシスクシンイミドエステルから調製）を用いて結合させた。精製ｃＡ、３３ ．（γ１）のサンプルの緩衝液を２　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ重炭 酸ナトリウム（ｐＨ８）に交換した。チオール基を続いてｃＡ３３　（γ１）に 、ｃＡ３３（γ１）に対して１０倍モル過剰の２−イミノチオレーンとの室温３ ０分での反応によって導入した。続いてセファデックスＧ−２５（ファルマシア ＰＤ−１０）カラムを用いて、チオール化ｃＡ３３　（ｙｌ）を、２　ｍ　Ｍ　 Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で脱塩し、未反 応２−イミノチオレンを除去した。存在するチオール基の数は、ジチオジピリジ ンで滴定してめた。存在するチオール基の数に対して１０倍モル過剰のＣｒＢ２ を添加し、その後３７℃で２時間保温することによって、９Ｎ３マクロサイクル を続いてチオール化ｃＡ３３（γ１）に結合させた。続いてこの結合物をセファ デックスＧ−２５カラム（ファルマシア、ＰＤ−１０）で０．１Ｍ酢酸ナトリウ ム（ｐＨ５）によって脱塩して精製した。放射能標識は、この結合物に１１１− インジウムを添加することによって実施したが、このとき、結合溶液の緩衝液が 酸性１１１−　Ｉ　ｎ、　Ｃｌ　３を緩衝するに十分であることを確認する。３ ７℃で２０分保温した後。

放射能標識を１．０　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａを添加することによって停止した 。この標識ｃＡ３３　（γ１）を０．２Ｍ燐酸塩溶液（ＰＨ７）中でデュポンゾ ルパックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＧＦ−２５０カラムでゲル濾過ＨＰ　ＬＣ：によっ て精製した。

１１１−インジウム標識ｃＡ３３（’）’１）を５ＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジ オグラフィーで調べた。標識操作によってｃＡ３３　（γ１）の明瞭な分解はな かった。脇腹の皮下に２−３週経過ＬＳ　１７４Ｔヒト腫瘍の異種移植をもつ４ 匹の雌ヌードマウス群に、約２　ｍ　ｇ　／　６　ｍ　ＣｉのｃＡ、３３（γ１ ）を尾静脈から静注した。動物群を２４．４８、および１２０時間で殺処分し、 組織を採集し、重量を測定し、７Ｍの水酸化カリウムに溶解し、ＬＫＢモデル１ ２７０ガンマ計測器で計測した。結果は、組織１グラム当りの注射量の平均％＋ ／−標準偏差（ｎ＝４）として表した。

１１１−インジウム標Ｗｔ　ｃ　Ａ　３３による生体分布実験の結果は良好な腫 瘍局在を示した（図８）。

２、ヒトヒＡ３３　γ１ ｈＡ３３　（γ１）は、ｃＡ３３　（ｙｌ）と同じ方法を用いてＮＳＯ細胞系Ｈ Ｃ８６，７から精製した。精製抗体は、上記に述べた同じ競合アッセーを用いて 活性を有することが示された。

皮下にＣｏ　ｌ　ｏ　２０５異種移植された腫瘍をもつヌードマウスのｈＡ３３ 　（γ１）の生体分布もまた。９０−イツトリウムで標識したときに調べた。９ ０−イツトリウムで標識するために１２Ｎ４マクロサイクルを、１２Ｎ４−マレ イミド誘導体（ＣＴ７７、国際特許公開筒ｗ０８９１０１４７６号明細書の実施 例１ｂの化合物とＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステルとから調製）を用いて精製ｈＡ３３　（γ１）に結合させ た。精製ｈＡ３３（γ１）のサンプルの緩衝液を、２　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ 含有Ｑ、１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に交換した。続いて室温で３０ 分、ｈＡ３３　（γ１）に対して１０倍モル過剰の２−イミノチオレーンで反応 させて、チオール基をｈＡ３３（γ１）に導入した。チオール化ｈＡ３３　（γ １）をその後、セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシアＰＤ−１０）を用 いて２　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８ ）で脱塩し、未反応２−イミノチオレーンを除去した。存在するチオール基の数 はジチオジピリジンにより滴定した。存在するチオール基の数に対して１０倍過 剰モルのＣＴ７７を添加し、その後３７℃で２時間保温して、１２Ｎ４マクロサ イクルをチオール化ｈＡ３３　（γコ、）に結合させた。続いて結合物をセファ デックスＧ−２５カラム（ファルマシア、ＰＤ−１０）を用いて０．１Ｍ酢酸カ リウム（ｐＨ６）で脱塩して精製した。放射能標識は、結合溶液の緩衝液が酸性 ９０−ＴＣ１□を緩衝するために十分であることを確認しながら、結合物に９０ −ＭＣｌ□を添加して実施した。

３７℃で１５分保温後、放射能ｍｍは１０ｍＭＤＴＰＡ（７）添加によって停止 させ、標＠ｈＡ３ａ　（γ１）はデュポンゾルパックスＧＦ−２５０カラムで０ ．２Ｍ燐酸液（ｐＨ７）中でゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。

９０−イ：７ｈ’Ｊウム１’ｌ１ｍしたｈＡ３３　（ｙｌ）　を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ／オートラジオグラフィーによって調べた。４１１１！操作によってｈｃＡ３ ３　（γ１）の明瞭な分解はなかった。

脇腹の皮下に２−３週経過Ｃｏ１ｏ２０５ヒト腫瘍の異種移植をもつ４匹の雌ヌ ードマウス群に、約４ｍｇ／ｌ、８ｍＣ１のｈＡ３３を尾静脈から静注した。動 物群を２４．４８、および１２０時間で殺処分し、組織を採集し、重量を測定し 。

７Ｍの水酸化カリウムに溶解し、ＬＫＢモデル１２７ｏガンマ計測器で計測した 。結果は１組織１グラム当りの注射量の平均％＋／−標準偏差（ｎ＝４）として 表した。

この生体分布実験は、高い腫瘍負荷を有するｈＡ３３　（ｙｌ）の良好な腫瘍局 在を示した（図９）。

ズミＡ３３　しニヒト　Ａ３３　γ１　の　力ｈＡ３３　（γ１）の能力を、ヒ ト結腸大腸癌細胞系５Ｗ１２２２の細胞との結合についてネズミＡ３３のそれと 比較した。精製ヒト化およびネズミＡ３３の蛍光標識結合物を調製し、抗体分子 に付き約１．５分子の蛍光色素を得た。５ＷＩ２２２細胞（２，５ｘｌｏ’／試 験管）を３．５７μｇ　／　ｍｌから１２ｎｇ／ｍｌの範囲の蛍光抗体とともに ５％仔牛脂児血清および０．２％ナトリウムアジド添加ＰＢＳ中で１゜５時間氷 上で培養した。洗浄後、細胞表面に結合した抗体を、蛍光マイクロビーズ標準物 で較正することによって細胞当りの結合抗体分子の数に変換される蛍光シグナル としてＦＡＣｓ　ｃ　ａ　ｎ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって 検出した。このデータは、スキャチャードプロットを作成するために用いたが、 これはヒト化およびネズミＡ３３は等しく能力を有することを示した（図１０） 。

ｃＡ３３　１　と゛スミＡ３３と　し二９０−　−　１ウム　ｈＡ３３ 腫瘍負荷は、ヒト結腸大腸癌細胞系５Ｗ１２２２を用いてさらに異種移植系で示 された。ｈＡ３３　（γ１）、ｃＡ３３（γ１）およびネズミＡ３３の１２Ｎ４ マクロサイクル結合物を製造し、上記と同じ方法を用いて９０−イツトリウムで 標識した。２−３週経過ＳＷＩ　２２２皮下具種移植をもつの雌のヌードマウス に尾静脈から約８μｇのそれぞれの結合物を静注した８組織の採集のために４匹 の動物の群を２４．７２および１２０時間で殺処分し、該組織の重さを測定し、 ７Ｍの水酸化カリウムに溶解し、パッカードコブラ（Ｐａｃｋａｒｄｃｏｂｒａ ）自動ガンマ計測器で計測した。結果は、組織のダラム当りの注射量の平均％＋ ／−標準偏差として表した。

この生体分布実験は、３つの全ての結合物について良好な腫瘍負荷を示し、この 系におけるネズミ、キメラ型およびヒト化抗体が同等であることを明瞭にした（ 図１１）。

１２５−ヨウ　ｈＡ３３の ｈＡ３３　（γ１）をヨードケン法を用いて１２５−ヨウ素で比活性０．８μＣ １／μｇで標識し、セファデックスＧ−２５（ファルマシア、ＰＤＩＯ）でのゲ ル濾過によって精製した。

１２５−ヨウ素標識ｈＡ３３の約１０μｇ／８μＣｉを５Ｗ１２２２異種移植ヌ ードマウス群に注射し、上記のように３．２４．４８．１２０および１６８時間 にめた。

この実験の結果（図１２）は、１２５−ヨウ素標識ｈＡ３３による良好な腫瘍局 在を示した。

血盪失腹 腫瘍治療におけるＡ３３の有効性を、ＳＷＩ　２２２腫瘍具種移植モデルを用い て調べた。Ａ３３の１２Ｎ４マクロサイクル結合物を上記のように調製し、さら に上記の方法を用いて比活性３．２μＣｉ／μｇとなるよう９０−イツトリウム で標識したが、標識蛋白はＨＰＬＣ方法ではなく充填セファデックスＧ−２５カ ラム（ＰＤＩＯファルマシア）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーで精製した 。非特異的抗体ＭＯＰＣ２１の１２Ｎ４結合物も同様な態様で調製しｓｒａした 。

２−３週経過の皮下ＳＷＩ　２２２異種移植をもつ６匹の雌ヌードマウスに約７ ８μｇ　／　２５０μＣｉの標識結合物の各々を尾静脈から静注した。各動物の 腫瘍サイズを実験の開始とその後一定間隔で測定した。

この実験の結果（図１３）はＡ３３結合物の明瞭な抗腫瘍効果を示したが、それ は腫瘍の完全な退縮をもたらした。非特異的なコントロール抗体による処置は、 効果が顕著に低く。

Ａ３３による腫瘍への集中効果を明らかにした。

失１涯Ｉ ｈ　Ａ　３３　Ｆ　ａ　ｂ　’　ｙ　４　Δｃ　ｓ　の　ｈＡ３３ジーＦａｂ’ 　ＤＦＭ　と　Ｉ−Ｆａｂ’　ＴＦＭ　”　−亘匹策五紅會 ｈＡ３３Ｆａｂ’　（ｙ４Δｃｙｓ）（実施例１）を蛋白Ａセファロースでクロ マトグラフィーによってＮＳＯ細胞の組織培養上清から精製した。蛋白Ａセファ ロースのカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウム含有１００ｍＭの硼酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０）で平衡化した。ｈ　Ａ　３３　Ｆ　ａ　ｂ　’　（ｙ　４Δａｙｓ） を発現しているＮＳＯ細胞の組織培養上清に１Ｍトリスを添加してＰＨを８．０ に調整し、カラムに加えた。平衡緩衝液で洗浄後、Ｆａｂ’　を０．１Ｍクエン 酸で溶出し１分画を直接十分量の１Ｍトリスに採集し、分画のｐＨを６と７の間 に調整した。

精製Ｆａｂ’　（ｙ４Δａｙｓ）の緩衝液を２　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０ ．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（ＰＨ６，０）に交換し、限外濾過によ って約８　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌまで濃縮した。

続いて１部分還元を、ｂ−メルカプトエチルアミンを１０ｍＭに加え、さらに３ ７℃１時間保温することによって実施した。その後２　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ 含有０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中でセファデックスＧ−２５（ ＰＤ−１０）のカラムに通し、脱塩することによって、還元剤を除去した。

架橋結合剤ＣＴ５２　（中間体６、欧州特許公開第３８４６２４号明細書）を用 いて、還元し脱塩したばかりのＦａｂ’　（γ４Δｃｙｓ）を架橋結合しジーＦ ａｂ’　を生成した。架橋結合剤は、Ｆａｂ’（γ４ΔＣｙｓ）が、架橋剤に対 して２．２倍モル過剰となるように加え、反応混合物は３７℃で一晩保温した。

架橋の程度は、０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で、デュポンゾルパックス ＧＦ−２５０カラムでＨＰＬＣゲル濾過を用い、さらに５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て調べた（図１４．１７）、典型的には５０−６０％のＦａｂ’　（ｇ４Ｄｃｙ 　ｓ）がジーＦａｂ’　（ＤＦＭ）に架橋結合していた。

続いてＤＦＭを、０．２Ｍ燐酸塩（ｐＨ７，０）中でデュポンゾルパックスＧＦ −２５０ＸＬカラムを通し、ＨＰＬＣで精製した。精製度は５ＤＳ−ＰＡＧＥで 調べた。

架橋結合剤ＣＴ５５７　（国際特許公開第１１０９２／２２５８３号明細書）を 用いて、還元し脱塩したばかりのＦａｂ’　（γ４ΔＣｙｓ）もまた架橋結合し ＴＦＭを生成した。ＣＴ５５７はジメチルホルムアミドに１ｍＭで溶解した。Ｃ Ｔ５５７溶液は、新しく還元、脱塩したＦａｂ’（ｙ４Δａｙｓ）に、ＣＴ５５ ７濃度に対して５倍モル過剰のＦａｂ’　（γ４Δｃｙｓ）が維持されるように 加えた。３７℃で一晩保温後、架橋の程度は、ＨＰＬＣゲル濾過と５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによって調べた（図１５．１７）、典型的には３０−４５％のＦａｂ’　（ ｙ４Δｃｙｓ）がＴＦＭに架橋結合していた。ＴＦＭは、ＤＦＭについて上記で 述べたようにゲル濾過クロマトグララフイーで精製し、その後ＴＦＭＩ製物の純 度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて調べた。ｈＡ３３　（Ｆａｂ’　（ｙ４Δａｙ ｓ）ＴＦＭはまたＣＴ９９８（国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１０４７号 ）テｔＡ１１ｎｔＬり（図１６．１７）　。

架橋ヒト化Ｆａｂ’　（ｙ４Δｃｙｓ）の活性は、ＦＩＴＣ−標識ネズミＡ３３ によるＣｏ　ｌ　ｏ　２０５細胞への結合に対する競合をＦＡＣｓｃａｎ分析に よって調べた。結果は（図１８）、ＤＦＭは期待したようにヒト化１ｇＧにほぼ 匹敵する活性を有し、一方、ＴＦＭは、嗜好性が増すので３価の種類の良好な結 合能の増加を示すことを明らかにした。

Ａ３３ＤＦＭ　ＴＦＭの　と　にお（る１星り化 ｈＡ３３ＤＦＭを、９０−イツトリウムによる放射能標識用に１２Ｎ４マクロサ イクルを含む架橋結合剤ＣＴ５２　（上記参照）で調製した。ＣＴ５５７で作成 したｈＡ３３ＴＦＭを、実施例１でｈＡ３３　（γ１）について述べたように１ ２Ｎ４−マレイミド（ＣＴ７７）に結合させた。続いて、ＤＦＭおよびＴＦＭ− １２Ｎ４の両方を、上記ｈＡ３３　（γ１）について述べたように９０−イツト リウムで放射能標識した。

９０−イツトリウムで標識したｈＡ３３ＤＦＭおよびＴＦＭは、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ／オートラジオグラフィーで調べた。

標識操作ではＤＦＭまたはＴＦＭのいずれも明瞭な分解はなかった。続いて標識 ＤＦＭおよびＴＦＭを、腫瘍局在化について上記のように調製、標識したｈＡ３ ３ＩｇＧ１と比較した。脇腹の皮下に異種移植した２−３週経過のＬＳ　１７４ Ｔヒト腫瘍をもつ４匹の雌ヌードマウスの群に、ＴＦＭを約４゜５ｍｇ／ｍＣｉ 、ＤＦＭを５ｍｇ／１２ｍＣ１，ＩｇＧ１を５ｍｇ／２．３ｍＣ１、尾静脈から 静注した。動物群を２４゜４８、及び１４４時間で組織採集のために殺処分し、 その重量を測定し、７Ｍの水酸化カリウムに溶解し、さらに、ＬＫＢモデル１２ ７０ガンマ計測器で計測した。結果は組織１グこの生体分布実験の結果はｈＡ３ ３　（ｙｌ）　、ＤＦＭおよびＴＦＭの良好な腫瘍局在化を示した（図１９）０ 期待したように、ＤＦＭおよびＴＦＭはＩｇＧ１よりも速く排除されたが、なお 良好な腫瘍への取り込みを示し、これは架橋結合されたフラグメントの腫瘍：血 液比の改良に通じる（図２０）ｍＡ３３　＋　−Ｆａｂ’　ＴＦＭ　’精製ネズ ミＡ３３の緩衝液を０．５Ｍの硫酸アンモニウム含有０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ４，２）に交換し、ペプシンを１：５０（ペプシン：抗体）の比で加えてＦ　（ ａｂ’　）。

に消化した。約４時間保温した後、２Ｍトリスで混合物のｐＨを８に調整して消 化を停止した。生成されたＦ（ａｂ’）、をまず、予め５０ｍＭグリシン−グリ シネート緩衝液で（ｐＨ８，８）平衡化した蛋白Ａセファロースのカラムを通し 。

その次に０．２Ｍ塩化カリウムおよび２ｍＭＤＴＰＡ含有０゜１Ｍ酢酸カリウム （ｐＨ６，０）をセファクリルＳ−２００ＨＲのカラムに流してゲル濾過クロマ トグラフィーで精製した。先ずＦａｂ’　を製造するためにヒンジを選択的に還 元することによってＣＴ９９８でｍＡ３３ＴＦＭを製造するために、精製Ｆ（ａ ｂ’）ｚを用いた。これは、まず、Ｆ（ａｂ’）２の緩衝液を２　ｍ　Ｍ　Ｄ　 Ｔ　Ｐ　Ａ含有０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，９５）に交換し、その 後１０　ｍ　Ｍ　ｂ−メルカプトエチルアミンで３０分３７℃で保温することに よって達成された。生成されたＦａｂ’　を２　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ含有０ ゜１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，９）に脱塩し、還元剤を除去し、さらに ＣＴ９９８架橋結合剤を新しく脱塩したＦａｂ’　に３７℃で１８時間にわたっ て多数回に分けて加え最終比を１．１　：　１　（Ｆａｂ’　：ＣＴ９９８）と した、架橋結合の程度はＨＰＬＣニゲル濾過分析でめたが、ネズミＡ３３ＴＦＭ の典型的な収量は全蛋白の８−２０％であった６続いてネズミＡ３３ＴＦＭを、 ２　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ含有０．２Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）をデュ ポンＧＦ−２５０ＸＬカラムを用いてＨＰＬＣニゲル濾過を行って精製した。

生体分布実験は９０−イツトリウムＩＲＷｔｍＡ３３ＴＦＭで実施し、腫瘍の集 中度を調べた。まずセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシアＰＤＩＯ）で ０．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ６，０）中に流して脱塩し、続いて、ＴＦＭ調製物 中の緩衝液が酸性９Ｏ−ＹＣＩＩを緩衝するために十分であることを確認しなか ら９０−ＹＣｌｍで保温して、ｍ　Ａ　３３　ＴＦＭを９０−イツトリウムで標 識した。室温で１５分保温した後、放射能ＩＩＩＩ：ｌを１０ｍＭＤＴＰＡの添 加によって停止させ、＠＠Ｔ　Ｆ　Ｍを、デュポンゾルパックスＧＦ−２５０カ ラムで０．２Ｍ燐酸塩（ＰＨ７，０）中でＨＰＬＣゲル濾過によって精製した。

続いて生体分布実験は、上記のように５Ｗ１２２２異種移植された雌のヌードマ ウスを用いて実施した。

この実験では、９０−イツトリウム標識ｍＡ３３ＴＦＭを、上記のように調製、 標識した９０−イツトリウム標識ｍＡ３３ＩｇＧと比較した。約７μｇ／２１μ ＣｉのＩｇＧおよび８μｇ／１２μＣｉのＴＦＭを注射した。この実験の結果は 工ｇＧより優れた腫瘍：血液比を有する、ネズミＴＦＭの良好な腫瘍局在化を示 している（図２１および２２）。

ネズミＡ３３ＴＦＭでの腫瘍治療効果を、ＩｇＧで実施（実施例１）したように 、５Ｗ１２２２腫瘍異種移植の治療実験で調べた。上記の方法を用いてＴＦＭを ９０−イツトリウムで比活性３μＣｉ／μｇに標識したが、ただし標識蛋白は、 ＨＰＬＣ方法ではなく、予め充填したセファデックスＧ−２５（ＰＤＩＯ、ファ ルマシア）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。標識 蛋白の純度は、その後ＨＰＬＣと８０５−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィ−で 調べたが、純度は高いことが認められた。皮下に異種移植した２−３週経過の５ Ｗ１２２２をもつ６匹の雌のヌードマウス群に約１００μｇ　／　３００μＣｉ の標識ＴＦＭを尾静脈から静注した。各動物の腫瘍サイズは実験の開始とその後 一定間隔で測定した。

この実験の結果（図２３）は、Ａ３３ＴＦＭは腫瘍治療に有効であることを明ら かにした。

ｈＡ３３ＴＦＭの ｈＡ３３ＴＦＭの生体分布もまたモルモットで調べた。上記のように、ｈＡ３３ ＴＦＭを調製し、９０−イツトリウムで放射能標識した。９０−イツトリウム標 識ｈＡ３３ＴＦＭの約１０μｇ７２０μＣｉを雄のダンキンハートレーモルモッ ト群に耳静脈から注射した。４匹の群を３．２４．４８および１４４時間で組織 採取のために殺処分し、該組織の重量を測定し、７Ｍの水酸化カリウム溶解し、 バッカードコブラ自動ガンマ計測器で計測した。結果は組織１グラム当りの注射 量の平均％＋／−標準偏差として表した。

この生体分布の結果（図２４）は、ｈＡ３３ＴＦＭは血液から迅速に排除され、 いずれの非特異的な組織にも蓄積しないことが示される。これは、ｈＡ３３ＴＭ Ｆはインビボの利用において好ましい生体分布特性を有することを示唆する。

実施例３ ａ）　ベクター Ｆａｂ’　（γ４Δａｙｓ）としてヒト化Ａ３３を大腸菌で発現、分泌させるた めに、ベクターを多段工程で構築した。

第一の工程でｈＬ遺伝子およびｈＨ−Ｆｄ　（γ４Δｃｙｓ）遺伝子を再構成し て、Ｉｇシグナル配列をｏｍｐＡ蛋白（Ｓｋａｒｒａ　＆　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ 、　１９８９）のそれと置き換えた。

ベクターｐｓＫｏｍｐＡをシグナル配列コード領域内でＮｒｕｌで消化し、Ｅｃ ｏＲｌを用いて、ｈＬ遺伝子およびｈＨ＝Ｆｄ’　（７４Δｃｙｓ）遺伝子の両 方をクローニングした。ヒトカッパ定常領域をＳｐＨ−ＥｃｏＲ１フラグメント としてｐＭＲＲＯＩＯ（国際特許１０９２１０１０５９号）から分離し、ヒト化 ｖ６領域をＰＣＲ反応を用いてプライマー５’ＡＡＡ’、ＡＡＧ、ＡＣＡ、ＧＣ Ｔ、ＡＴＣ，ＧＣＧ、ＡＴＴ。

ＯＣＡ、ＧＴＧ、ＯＣＡ、ＣＴＧ、ＧＣＴ、ＧＧＴ、ＴＴＣ。

ＧＣＴ、ＡＣＣ，ＧＴＡ、ＧＣＧ、ＣＡＡ、Ｇ（１：Ｔ、ＧＡＴ。

ＡＴＣ，ＣＡＧ、ＡＴＧ、ＡＣＴ、ＣＡＧ３’により、さらに、Ｎｒｕ１部位か らのｏｍｐＡシグナルのＣ末端配列を成熟Ｖ、配列に同時に結合させ、ｐｃ０１ ６からのｖ４配列をプライマー５’　ＣＣＧ、ＧＣＣ，ＣＧＴ、ＡＣＧ、ＴＴＴ 、ＴＡＣ，ＴＴＣ３’　を用いて増幅させて得た。ＰＣＲフラグメントをＮｒｕ ｌおよび５ｐｉｔで切断し、このクローニング部位を露出させ、フラグメントを ＳｐＨ−ＥｃｏＲ１ヒトＣにフラグメントとともにＮｒｕｌ−ＥｃｏＲ１切断ｐ ＳＫｏｍｐＡベクターでクローニングし、ｐＭＲＲＯ５５を得た。

ヒトＣＨＩおよびヒンジ（Δａｙｓ）ドメインをコードするＤＮＡ配列、読み枠 内停止終了シグナルをｐＭＲＲＯ２２（国際特許１０９３１０６２３１号）から Ａ　ｐ　ａ　１−　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１フラグメントとして分離した。ＰＣＲ反応 により、ヒト化’Ｖｔｌフラグメントをプライマー、５’　ＡＡＡ、ＡＡＧ、Ａ ＣＡ、ＧＣＴ、ＡＴＣ，ＧＣＧ、ＡＴＴ、ＯＣＡ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＣＴＧ、Ｇ ＣＴ、ＧＧＴ、ＴＴＣ，ＧＣＴ、ＡＣＣ，ＧＴＡ。

ＧＣＧ、ＣＡＡ、ＯＣＴ、ＧＡＧ、ＧＴＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ。

ＣＴＧ、ＧＡＧ３’　を用いて得、さらに、プライマー、５′ＧＣＧ、ＣＧＣ， ＧＧＧ、ＣＣＣ，ＴＴＣ，ＧＴＴ、ＧＡＧ３′を用い、同時にＮｒｕ１部位から のｏｍｐＡシグナルのＣ末端配列を成熟Ｖ）配列に繋ぎながらｐ　ＲＯ１０９か らのｖ１配列を増幅させた。このＰＣＲフラグメントをＮｒｕｌおよびＡｐａｌ で切断し、クローニング部位を露出させ、さらにこのフラグメントをＡｐａ−Ｅ ｃｏＲ１ヒトＣＨ１およびヒンジ（Δｃｙｓ）コードＤＮＡフラグメントととも にＮｒｕ−ＥｃｏＲ１切断ｐ　Ｓ　Ｋ　ｏ　ｍ　ｐ　Ａベクターにクローニング し、ｐＭＲＲ５４を生じた。

中等度のコピー数のプラスミドｐＡｃｔａｃ（国際特許ｖＯ９２１０１０５９号 ）を基に発現プラスミドを以下のように構築した。

ｏｍｐＡ−ｈＨ−Ｆｄ’　（Δａｙｓ）遺伝子をＸｂａｌ−８ｍａｌフラグメン トとしてｐＭＲＲ５４から分離し、ｐＳＰ７３のＸｂａｌ　Ｐｖｕ２切断ベクタ ーフラグメント（プロメガ社）内でクローニングして、ｐＭＲＲ５６を作製し、 ＥｃｏＲ１フラグメントとしてｏｍｐＡ−ｈＨ−Ｆｄ’　（ΔＣｙｓ）のその後 の操作を可能にした。

ｏｍｐＡ−ｈＬ遺伝子をｐＭＲＲ５５からのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲ１フラグメント として分離し、ｐＡＣｔａｃの５ａ１１−ＥｃｏＲ，１（部分的）ベクターフラ グメント（部分的Ｅｃ　ｏＲ１消化が、クロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼ遺伝子内の第二のＥｃｏＲ１部位のために必要である）内へクローニ ングし、ｐＭＲＲ５８を作製した。ｐＭＲＲ５８をＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１で部分的に 消化し、ＣＩＰ処理しく仔牛腸アルカリフォスファターゼで処理して５′燐酸基 を除去）、ｐＭＲＲ５６から分離したＥｃｏＲ１フラグメントとしてＯｍｐＡ− ｈＨ−Ｆｄ’　（Δｃｙｓ）遺伝子の挿入用ベクターとして用いた。形質転換後 、コンピテント大腸菌クローンを制限地図で確認した。ｏｍｐＡ−ｈＨ−Ｆｄ’ 　（ΔＣｙｓ）遺伝子を正確な位置に正確な方向で有するプラスミドをｐＭＲＲ ６０と名付けた。ｐＭＲＲ６０の最終的発現ベクターの構成は図２５に示す。

ｐＭＲＲ６０で大腸菌株Ｗ３１１０を形質転換した（ＡＴＣＣ株２７３５）。

ｂ）　でのＡ３３　Ｆａｂの 大腸菌株Ｗ３１１０　（ＰＭＲＲ６０）を下記に述べたように種々の容積の発酵 槽で増殖させた。全ての培養の接種物は。

グロラムフェニコール含有ＬＢ培地（下記参照）中の凍結グリセロールストック から調製した。接種濃度は通常ＬＢ１リットルにつきグリセロールストック３０ ０ｍ１であった。２５０ＲＰＭの回転シェーカー中で３０℃でエーレンマイヤー フラスコで培養増殖させた種培養を、ＯＤ６００ｎｍが３になったとき（通常１ ２−１６時間）に使用した０発酵槽と振盪フラスコは５−１０％容積の接種物を 接種した。　種培養およびその後の発酵に用いた培地および培地成分は下記のよ うに調製し、使用した。

ＬＢ；ルリア（Ｌｕｒｉａ）培地 ＬＢＣｍ　：　ＬＢ＋クロラムフェニコール２５　ｍ　ｇ　／　ｍｌ（ＮＨ４） 、Ｓ０４　５．０ ＮａＨ，ＰＯ４６，２４ ＫＣ１３，８７ Ｍｇ５Ｏ４ＬＨ，００，５６ クエン酸塩　４．０ ５Ｍ６４微量元素溶液　１０　ｍ　ｌ　／　１泡立ち防止剤（Ｍａｚｕ　ＤＦ８ ４３１０％水溶液）１．０ｒｎｌ／１脱イオン水で０．２リツトルにする（５　 ：Ｊｌｌ液）３Ｍ６Ｂ−’ 成分　ｇ／ｌ、１００Ｘストツク溶液 クエン酸塩　１００．０ ＣａＣＬ　・６Ｈ，０５，０ ＺｎＳＯ，・４Ｈ，０２，Ｏ Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・４　Ｈｔ　Ｏ２−ＯＣｕ　Ｓｏ４’　５Ｈ，００，５ ＣｏＳＯ，・６Ｈ，００，４ ＦｅＣ１，・６Ｈ，０９，６７ Ｈｓ　Ｂ　Ｏｓ　０．０３ ＮａＭｏＯ４０，０２ 脱イオン水で１リツトルにする。成分は示したとおりの順序で加え、次の塩を加 える前に完全に溶解させた。

培地５Ｍ６Ｂは５ｘ溶液として保存し、濃縮塩類溶液は誘発の時点まで培養容積 に対して発酵槽に正確な濃度となるように加えた（すなわち、滅菌容積十接種物 ＋グルコース供給液）、乳糖溶液供給によってもたらされる容積増加で生じるそ の後の塩類要求は、乳糖供給時に補給された１発酵槽は滅菌前に脱イオン水で正 確な容積に合わされた。

規定の培地は１２１℃で２０分間その場でオートクレーブした後、３　、６　Ｍ 　Ｎ　Ｈ４０Ｈを用いてｐＨ６，９５とした。

塩溶液の殺菌後グルコースを５０％溶液（ｗ／ｖ）として最終濃度２０ｇ／ｌと なるように発酵槽へ加えた。

グルコースおよび乳糖は５０％水溶液として（ｗ／ｖ）別々にオートクレーブさ れ、培養方法の章で述べるように培養物に加えた。オートクレーブ前に濃硫酸（ １００ｍ　ｌ　／　ｌ　）をグルコース溶液に加えた。

オートクレーブで滅菌したカザミノ酸（ディフコ、２００ｇ／ｌ）水溶液は、乳 糖供給開始時に発酵槽に加え、最終的な総供給量は２０ｇ／ｌ　（最終発酵槽容 積）とした。

大腸菌Ｗ３１１０　（ｐＭＲＲ６０）　（ｉ’）培養（２リツトル、１５リツト ルおよび１５０リツトル）を培地５Ｍ６Ｂで実施した。グルコースは、すべての 培養について最初の炭素およびエネルギー源として用い、培地滅菌後に２０　ｇ 　／　１の濃度で加えた。培養ＰＨは、３．６ＭＮＨ，○Ｈまたは２ＭＨ，Ｓ○ 、の添加によって、６．９５に維持された。

溶解ｒＩＩ素圧（ＤＯＴ）は、撹拌形速度を制御することによって１０％空気飽 和以上に維持した（２リツトルおよび１５リツトルには２５０から１１０００Ｒ Ｐの間、１５０　’Ｊ　ットルには１５０から６５ＯＲＰＭの間）、培養温度は 、培養を通じて３０℃に維持された。培養物は０．７５−１．５ｖ／Ｖ／分で通 気された。１５０リツトル培養の後期には容器に０．４バールまで加圧して、溶 解酸素圧を１０％以上に維持した。酸素利用率（ＯＵＲ）および二酸化炭素発生 率（ＣＥＲ）は、質量分析で実施した排出ガス分析値からめた。ＯＵＲは、記載 した培養においては約１５０ｍｍｏｌ／ｌ／時の最大値に達した。

生成物発現の誘発は、炭素源をグルコースから乳糖へ切り替えることによって開 始された。グルコースはＯＤが約４０まで培養を維持するために供給された（総 添加４０ｇ／ｌ）。

乳糖供給はＯＤが約３５で開始され、６０ｇ／ｌ培養の濃度まで、必要な時に、 または予め指数関数供給プログラムとして６０％乳糖を個々の添加として供給し た。カザミノ酸を加えた場合、これらの添加は、乳糖供給の開始時に行われまた は開始された。

発酵槽は乳糖利用に切り替えた後２４時間で採集した。２リツトル培養は４２０ ＯＲＰＭ、ｒｍａ　ｘ２５０ｍｍで遠心して清澄にした。１５および１５０リツ トル培養は、デュラボアー０．６５ｍｍの膜で約１０リツトル／分／チャンネル の保持（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）流速でミリポアープロスタツク系を用いて、タン ジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって清澄にした。

生成物は、遠心またはＴＦＦによってそれぞれ採取した培養ペレットまたは濃縮 細胞浮遊液を保温することによって、細胞周囲間隙から選択的に遊離された。採 取細胞はトリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７，４）で洗浄し、続いて、１０ 　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，４）で保温し た。保温は４０℃で４時間実施した。細胞の保温を繰り返せばさらに物質が産生 された。また別に、酵素的（たとえばリゾチーム）または機械的な手段による細 胞溶解は、ＥＤＴＡを用いる生成物の選択的遊離よりより活性なｈＡ３３生成物 を遊離することが分かった。

４６℃までの温度範囲で保温した細胞抽出物のウェスタン免疫プロットを図２６ に示す。サンプルを還元または非還元状態で流し、一連の集合および部分的分解 ｈ　Ａ　３３　Ｆ　ａ　ｂの範囲を明らかにした。この抽出物セットは、１０ｍ ＭＥＤＴＡ含有１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で無傷の細胞を一 晩保温してｖＲ製した。

図の中で： レーン１−５のサンプルは２−メルカプトエタノールで還元された。

Ｉノーン６−１０は、非還元状態で流した。

レーン１と６は４℃で、２と７は３０℃で、３と８は４３℃で、４と９は４４℃ で、さらにレーン５と１０は４６℃で実施した抽出物を添加した。

非還元側の標識バンドは： １は組み立てられた無傷のＦａｂで、２と３は部分的に分解されたＦａｂで、４ は無傷の重鎮と軽鎖である。

５つの抽出物の得られた蛋白の力価は色素結合アツセーキット（ピアース）でめ たが、４．３０，４３．４４および４６℃で作製された抽出物についてそれぞれ １．０６．０゜７．０．６６．０．２８および０．２６ｇ／ｌであることが分か った。蛋白の活性は、実施例１で述べた競合アッセーを用いてｍ　Ａ　３３　Ｆ 　ａ　ｂに匹敵することが示された。

図２７は、トリス塩酸／ＥＤＴＡ緩衝液中で３０℃（レーン１−８）および４６ ℃（レーン１Ｏ−１７）で保温して得られた細胞抽出物のウェスタン免疫プロッ トを示す、添加されたサンプルは大腸菌Ｗ３１１０　（ｐＭＲＲ６０）の培養の 時間経過を表している。

有利には、専ら単一バンド物質が４６℃で抽出されたサンプルで得られ、一方４ つの主たるバンドが３０℃で抽出されたサンプルで得られたが、これは簡単な熱 処理を、部分的に分解したＦａｂを含まない実質的に純粋なｈ　Ａ　３３　Ｆ　 ａ　ｂを得るために、さらに軽鎖と重鎮物質を分離するために用いることができ ることを示している。

望ましくないフラグメントを含まず、正確な集合分子量をもつ大腸菌Ｗ３１１０ 　（ｐＭＲＲＲ６０）由来のｈＡ３３Ｆａｂおよび単一鎖を得るために、上昇抽 出温度の使用を図２８にさらに示すが、これはトリス／ＥＤＴＡ緩衝液中での保 温（レーン１と２）によって、またはリゾチームでの処理（レーン３−７）によ って得られた細胞抽出物のウェスタン免疫プロットを示す。

レーン１：抽出は３０℃で実施 レーン２：抽出は４６℃で実施 レーン３−７　：　４６℃で保温機細胞塊をリゾチーム処理かゝ　ｈＡ３３ＤＦ Ｍの　と 上記のように熱処理した後、大腸菌細胞溶解物からｈＡ３３Ｆａｂ’　を精製し た。細胞溶解物を遠心して、残滓を除去し上清を４６℃２４時間熱処理した。１ １００００ｒｐで３０分遠心した後、上清をＯ，１Ｍ硼酸とし、ｐＨを５Ｍの水 酸化ナトリウムで８に調整した。続いて予め０．１Ｍ硼酸塩（ｐＨ８）で平衡化 した蛋白Ａセファロースのカラムに上清を添加し、カラムを同じ緩衝液で洗浄し てＦａｂ’　を精製した。その後、Ｆａｂ’　をＯ，１Ｍクエン酸でカラムから 溶出させた。Ｆａｂ’　を含有する溶出液は２ＭトリスでｐＨ６に調整した。

統いて精製ｈ　Ａ　３３　Ｆ　ａ　ｂ　’　をジーＦａｂ　（ＤＦＭ）に化学的 に架橋結合させた。精製Ｆａｂ’　を超濾過で濃縮し、０゜１Ｍ酢酸カリウム（ ｐＨ６）に緩衝液を交換した。その後β−メルカプトエチルアミンを１１ｍＭの 濃度に加え、３７℃で３０分保温してＦａｂ’　を還元した。セファデックスＧ −２５カラム（ファルマシア、ＰＤＩＯ）でＯ，１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ６）に 脱塩して還元剤を除去し、ＣＴ５２　（上記参照）に対して２．２倍モル過剰の Ｆａｂ’　にＣＴ５２を加えて架橋結合を開始した。実施例２のＮＳＯ由来Ｆａ ｂ’からのＤＦＭについて述べたように、生成されたＤＦＭを続いて精製した。

ＮＳＯ細胞からのｈＡ３３ＤＦＭは、実施例２で述べたように調製し、相対的能 力について大腸菌由来物質と比較した。ＮＳＯ由来または大腸菌由来Ｆａｂ’か ら調製したｈＡ３３ＤＦＭ力価の測定は、ｃｏｌｏ２０５細胞の存在下で飽和濃 度のＦＩＴＣ−結合ネズミＡ３３ＩｇＧを用いて保温して実施した。抗体の内包 化による影響を防止するために、保温液は０．２％ナトリウムアジドを含ませた 。細胞を洗浄し、結合ＦＩＴＣ標識抗体をＦＡＣｓｃａｎ（ベクトンディッキン ソン）で測定した。−価Ｆａｂ’調製物中の夾雑するＦ（ａｂ’）ｘの割合が異 なることによって生じる嗜好性効果に影響を与えうる、結合の差異を避けるため にこの比較ではＤＦＭ分子を用いた。この実験の結果は図２９に示すが、これは 、ＮＳＯおよび大腸菌由来の結合部位は等しく能力を有することを明瞭にした。

この実験の結果は、大腸菌で産生されたｈＡ３３Ｆａｂ’から調製されたＤＦＭ は哺乳類細胞で産生された物質に匹敵するということを明らかにした。大腸菌か らのＤＦＭおよびＮＳ○由来ｈＡ３３Ｆａｂ’　がインビボで同等であるか否か を調べるために、生体分布実験をＬＳ１７４Ｔ異種移植をもつ雌のヌードマウス を用いて実施した。ＤＦＭ調製物を、ポルトン−ハンター試薬（アマ−ジャム） を用いて１２５−ヨウ素で約０．１５μＣｉ／μｇの比活性に標識した。

約３μｇ１０．４μＣｉの大腸菌またはＮＳＯ細胞からの１２５−ヨウ素標識Ｄ ＦＭを、２−３週経過のＬＳ　１７４Ｔ皮下異種移植をもつ４匹の雌のヌードマ ウス群に注射し、その生体分布を上記のように２４時間で調べた。

この実験の結果は、大腸菌からのｈＡ３３Ｆａｂ’で調製したＤＦＭは、ＮＳＯ 細胞で産生された物質に匹敵する生体分布を有することが示された（図３０）。

豊−」二」Ｌ−１ Ａｄａｉｒ＋　Ｊ、　Ｒ，、Ａｔｈｗａｌ、　Ｄ、　Ｓ、、　Ｅｍｔａｇｅ、　 Ｊ、　Ｓ、、　１９９１．　ＨｕＩｌａｎｉｓｅｄ　ａｎｔ堰| ｂｏｄｉｅｓ　（ヒト化抗体）、１０９１１０９９６７＾ｍ１ｉｔ、　Ａ、　Ｇ 、、　Ｍａｒｉｕｚｚａ、　Ｒ，Ａ、、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｓ、　Ｅ、　Ｖ 、、　Ｐｏ１ｊａｋ、　Ｒ，Ｊ、、@１９８６゜ Ｔｈｒｅｅ　ｄｉｍｎｓｉｏｎａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔ ｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｔ　２．W　Ａ　ｒｅ− ｓｏＬｕｔｉｏｎ　（２，８Ａ解析における抗原−抗体複合体の三次元構造）、 ５ｃｉｅｎｃｅ、、　２３：ＬＢａｋｅｒ、　Ｔ、　Ｓ、、　Ｂｅｇｅｎｔ、　 Ｒ，Ｈ，Ｊ、、　Ｄｅｖｊｉ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｃｏｎ１ａｎ、　Ｊ、、　５ｅｃ ｈｅｒ、　c、　Ｓ。

、　１９９１．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ ｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｌｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｕ獅р■秩| ｇｏｉｎｇ　ｒａｄｉｏｉ＋ｕｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　Ｃｈｉｗｅｒ ｉｃ　Ｂ７２．３　（キメラＢ７２．３で放射性免疫治療を受けている患者の免 疫応答の特徴）、Ａｎｔｉｂｏｄ、　Ｉｍｕｎｏｃｏｎｊ、　Ｒａｄｉｏｐｈａ ｒｍ、＋４、７９９−８０９ Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎｅ　Ｃ，Ｒ，、Ｒｅｎｎｅｒ、Ｇ、、Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｓ 、＋　Ｋｉｎｇ、ｏ、ｔ　Ａｂｒａｍｓ、Ｄ、。

Ｙａｒｒａｎｔｏｎ、　Ｇ、　Ｔ、、　１９９２．　Ｈｉｇｈ−１ｅｖｅｌ　ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　≠獅狽奄ｂ盾р■ ｆｒｏｍ　ｍｙｅｌｏａａ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ 　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａｎ　ａｏＩｐ撃奄■奄≠ｂ撃■ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　＆１ｒｋｅｒ　（増幅性、選択性マーカーとしてグルタ ミンシンセターゼ遺伝子を用いるミエローマ細胞からの組換え抗体の高レベル発 現）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ−１ｏｇｙ、　１０．１６９−ｌ６９ −１７５Ｂｅ＋　Ｒ，Ｈ，Ｊ、、　Ｌｅｄｅｒｍｎｎ、　Ｊ、　Ａ、、　Ｂａｇ ｓｈａｖｅ、　Ｋ、　Ｄ、　Ｇｒｅｅｎ、＾、　４　Ｋｅｌ撃凵{ Ａ、　Ｍ、　Ｂ、　Ｌａｎｅ、　Ｄ、、　５ｅｃｈｅｒ、　Ｄ、　Ｓ、、　Ｄｅ ｖｊｉ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｂａｋｅｒ、　Ｔ、　Ｓ、、　１９X０゜ Ｐｈａｓｅ　Ｉ／ＩＩ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｉｉｅｒｉｃ　Ｂ７２．３　 ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｒａｄｉｏｉｍｕｎｏｔｈｅｒａ垂凵@ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ（結腸大腸癌の放射性免疫治療にお けるキメラＢ７２．３抗体のフェーズＩ／ＩＩ試験）、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃ ｅｒ、　６２．４８７Ｂｈａｔ、丁、Ｎ、、Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｇ、Ａ、、Ｆｉｓ ｃｈ＋ａａｎｎ、丁、Ｏ，、Ｂｏｕｌｏｔ、Ｇ、、Ｐｏ１ｊａｋ、Ｒ。

Ｊ＋、　１９９０．　Ｓｍ１ｌ　ｒｅａｒｒａｎｇｅ１１８ｎｔｓ　ｊ、ｎ　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｆｖ　ａｎｄ　Ｆａｂ　ｆｒａ■撃撃■獅狽刀@ｏ ｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｌ、３　ｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　（抗原 結合上の抗体Ｄ１．３のＦｖ及びＦａｂフラグメントの小さな構造的再記Ｗ）、 Ｎａｔｕｒｅ、　３４７．４８３−４８５Ｂｏｄｓｅｒ、阿０ｗ、、＾ｄａｉｒ 、Ｊ、Ｒ，，Ｗｈｉｔｔｌｅ、Ｎ、Ｒ，、１９８９，Ｒｅｃｏ＠ｂｉｎａｎｔ　 ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ　（組み替え体抗体）、１０８９１０１９７４Ｂｏｕｌｏｔ 、　ＧＢ　ｈｓｅｌｅ、　Ｊ−−Ｌ、ｇ　Ｂｅｎｔｌｅｙ、　Ｇ、　Ａ−＋　Ｂ ｈａｔ、　Ｔ−Ｎ−ｔ　ｌ１ａｒｄ、　Ｅ、　r、ｔ Ｂｏｕｌｏｔｐ　Ｇ、、　Ｒｏｊａｓ、　Ｃ，、Ｂｅｎｔｌｅｙ、　Ｇ、　Ａ、 、　Ｐｏ１ｊａｋ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｂａｒｂｉｅｒ、　Ｅ、A　Ｌｅ Ｇｕｅｍ、Ｃ，、Ｃａｚｅｎａｖａ、Ｐ、Ａ＋、１９８７．　Ｐｒｅｌｉｍｉｎ ａｒｙ　ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｅ　５ｔｕｄｙ　盾■ ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　Ｆａｂ　ｆｒａｇｍｎｔ　ｏｆ 　ａ　１ｘｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−１ｙｓｏｚｙｍ　≠獅狽堰| Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９４．５７７−５７９ＵＳＡ、、　８９．４ ２８５−４２８９Ｇｏ、　Ｍ、　Ｓ、、　Ａｖｄａｌｏｖｉｃ、　Ｎ、　Ｍ、、 　Ｃａｒｏｎ、　Ｐ、　Ｃ，、Ａｖｄａｌｏｖｉｃ、　Ｍ、　Ｖ、、　Ｓｃｈ■ 奄氏| ｂｅｒｇ、　Ｄ、　Ａ、ｌ　Ｑｕｅｅｒ＋、　Ｃ，１９９２，ＣｈｉＩｌ１６ｒ ｉｃ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ@ｗｉｔｈ Ｃｏ、　Ｍ、　Ｓ、＊　Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ、　Ｍ、、　Ｖｈｉｔｌｅｙ＋　Ｒ ，Ｊ、、　Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，、１９９１，Ｈｕｍａｎｉｚ■■ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　（抗ウ イルス治療用ヒト化抗体）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８８；　２８６９−２８７３Ｇｏ １ｍａｎ、　Ｐ、　Ｍ、、　Ｌａｖａｒ、　Ｗ、　Ｇ、、　Ｖａｒｇｈｅｓｅ、 　Ｊ、　Ｎ、、　Ｂａｋｅｒ、　Ａ、　Ｔ、、　Ｔｕｌ撃盾モ■A　Ｐ。

Ａ、ｔ　Ａｉｒｙ　Ｇ、　Ｍ、ｌ　Ｖｅｂｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｇ、、　１９８７． 　Ｔｈｒｅｓ−ｄｉｙｎｓＬｏｎａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ@ｏｆ　ａ ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖ ｉｒｕｓ　ｎｅｕｒａｔｉｎｉｄａｓｅ　（インフルエンザE イルスニューラミニダーゼと抗体複合体の三次的構造）、Ｎａｔｕｒｅ、　３２ ６．３５８−３６３Ｃｒｏｖｅ、　Ｓ、、　１９９２．　Ｔｈｅ　ＣＡＭＰＡＴ Ｈ５ｔｕｄｙ：　Ａ　ｒｅｖｉｅｗ、　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉ− ｂｏｄｉｅｓ、５ｔａｔｅ−ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒｔ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　 ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌ奄モ＝| ｔｉｏｎｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）　（総説モノクローナル抗 体研究と臨床利用における当該技術の現状ロンドン（要約） Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ、　Ｂ、　Ｌ、、　ＤｅＭａｒｔｉｎｏ、　Ｊ、　Ａ、、　 Ｌａｗ、　Ｍ、−Ｆ、、　Ｋａｖｋａ、　Ｄ、　ｖ、、　Ｓ奄獅■■秩B １、Ｌ、阿ａｒｋ、Ｇ、Ｅ、、１９９１．　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ 　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ　ｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇ、　ＣＤ Ｒ−ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ 　ｗ＋ｕｒｉｎｅ　５ｏｎｏｃｌｏ獅≠戟@ａｎｔｉ− ｂｏｄｙ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ＣＤ１８　ｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔ　ｏｆ　１ｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ@（ポリメ ラーゼチェーン反応は、クローニング、　ＣＤＲ−移植及び白血球インテグリン のＣＤ１ｇ成分に対するネズミモノクローナル抗体の迅速な発現を促進する）、 Ｎｕｃｌ。

＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１９＋　２４７１−２４７６Ｄａｖｉｓ、　Ｄ＋Ｒ， ５ｈｅｒｉｆｆ、　Ｓ、、　Ｐａｄｌａｎ、　Ｅ、、　１９８９．　Ｃｏｍｐａ ｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　狽浴B Ｆａｂ−１ｙｓｏｚｙｍｅ　ｃｒｙｓｔａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　（２種の Ｆａｂリゾチーム結晶構造の比較実験）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙ＋ａｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏ ｌ、、　５４．２３３−２３８Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、、　Ｋｎｉｇｈｔ、　Ｄ 、　Ｍ、、　Ｌｏｏｎｅｙ、　Ｊ、　Ｅ、、　１９９１．　Ｃｈｉｘｒｉｃ　ｉ ｍｕｎｏｇ撃潤| ｂｕｌｉｎ　ｆｏｒ　ＣＤ４　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　（ＣＤ４レセプターに対す るキメラ免疫グロブリン）。

Ｗ０９１．／１０１０７ ２２）１ａｋｉ、　Ｊ、、　Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ、　Ｒ，、Ｌｕｋｅ、　Ｄ、 　Ｒ，、Ｆａｍｉｌｅｔｔｉ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｂａ１ｌｏｎA　Ｐ、。

Ｋｏｎｄａｓ、　Ｊ、　Ａ−＋　Ｐｉｌｓｏｎ、　Ｒ，Ｓ−＋　Ｌｉｎ、　Ｐ、 、すｅｂｅｒ、　Ｄ、　Ｖ、、　５ｐｅｎｃｅ、　Ｃ，、Ｍ盾獅р奄獅堰{ Ｌ、　Ｊ、ｌ　Ｔｓｉｅｎ、　Ｖ＋−Ｈｌｌ　Ｌｅｖｉｎ、　Ｊ、　Ｅ、ｌ　Ｇ ａ１ｌａｔｉ、　ｖ、　ＬＩ　Ｋｏｒｎ、　Ｌ、＋　Ｖａｌп{ａａｎｎ、　■ 。

＾＋Ｔ　Ｑｕｅｅｎ、Ｃ，、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、ｗ、Ｒ，、１９９１，Ｒｅｄｕ ｃｅｄ　ｉｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｇｍ−ｐｒｏｖｅｄ　ｐｈａ ｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉ−Ｔａｃ　 ｉｎ　ｃｙｎｏｌｌｏｌｇｕｓ　ＩＱ盾獅汲■凾刀@（ジ ノモルガスモンキーにおけるヒト化抗−丁ａｃの免疫原性の低下と薬理学的動態 の改良）、Ｊ、　Ｉ＋ｎｕｎｏ１．、１４７．１３５２−１３５９゜Ｈａｌｅ、 　Ｇ、、　Ｄｙｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｐｈ１ｌｌ ｉｐｓ、　Ｊ、　Ｍ、、　Ｍａｒｃｕｓ、　Ｒ，B Ｒ４ｅｃｈａａｎｎ＋　ＬＩ、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、、Ｖａｌ、ｄｍａｎｎ、Ｈ， 、１９８８＋　Ｒｅ１ｌｉｓｓｉｏｎ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ@ｉｎ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ　１ｙＩｌｐｈｏＩ＆ａ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｈａｐｅｄ 　ｈｕｌＩａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ@ＣＡＭＰＡＴＨ− ＩＨ （再成形ヒトモノクローナル抗体ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１）１による非ホジキンリ ンパ腫における緩解誘発）　Ｌａｎｃｅｔ、　ｉｉ、　１３９４−１３９９Ｂｉ ｒｄ、　Ｖ、、　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｔ　Ｍ、、　Ｂａｄｌｅｙ、　Ｒ，Ａ、、 　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｄ、、　５ｎｏｏｋ、　Ｄ、、　Ｋｏ唐高刀B Ｃ，、Ｇｏｏｄｅｎ、　Ｃ，、Ｂａｌｌ１ａｓ、　Ａ、、　Ｍｅａｒｅｓ、　Ｃ ，、Ｌａｖｅｎｄｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、、　ＥｐｅｎａｔｏｓA　Ａ、　Ａ、。

１９９１、ＴｕＩＩｏｕｒ　１ｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅ　ｒａｄ ｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　１ａｂｅｌｌｅｄ　ｒａｓｈａｐａп@ｈｕｍｎ ＩＯｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｖ射能標識再形成モノクローナル抗 体による腫瘍局在）。

Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　６４．９１１−９１４Ｊｏｎｅｓ、Ｐ、丁、、 Ｄｅａｒ、Ｐ、）１．、Ｆｏｏｔｅ、Ｊ、、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、Ｓ、、ｗ ｉｎｔｅｒ、Ｇ、、１９８６、Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏ＋＊ｐｌｅ＠ ｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒＩＩｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ａ　ｈ ｕＩ浮≠氏@ａｎｔｉ− ｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｆｒｏ＋＊　ａ　Ｉｍｏｕｓｅ　（ヒト抗体 の相補性決定領域のマウス由来のそれによる置換）、Ｎａｔｕｒｅ、　３２１． ５２２−５２５Ｊｏｎｅｓ、　Ｓ、　Ｔ、、　［Ｓｅｎｄｉｇ、　Ｍ、　Ｍ、、 　１９９１．　Ｒａｐｉｄ　ＰＣＲ−ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｌｌ　ｌ■獅 ■狽■ ｉＩｏｕｓｅ　ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ ｓ　（完全な長さのマウス免疫グロブリン可変領域の迅速なＰＣＲ−クローニン グ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　９．８８−８９Ｋａｂａｔ、　Ｅ、　 Ａ、、　Ｍｕ、　Ｔ、　Ｔ、、　Ｒａｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｍ、、　Ｐｅｒｒ ｙ、　）１．　Ｍ、、　Ｇｏｔｔｅｓ{Ｉａｎ、　Ｋ。

Ｓ、、　１９８７．　５ｅｑｕａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉ ｌＩＩＩｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ、４ｔｈ@ｅｄｉｔｉｏｎ （免疫学的に興味のある蛋白の配列、第４版）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ： 　Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍ６ｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａ ｎｄ　Ｈｕｍｎ　５ｅｒｖｉｃａｓＫｈａｚａｅｌｉ、に、　Ｂ、、　５ａｌｅ ｈ、　Ｍ、　Ｎ、、　Ｌｉｕ、　Ｔ、　Ｐ、、　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｒ，Ｆ、 　Ｔｈｅｅｌａ秩A　Ｒ。

Ｈ，、Ｂａｋｅｒ、丁、Ｓ、、Ｋｉｎｇ、Ｄ、、５ｅｃｈｅｒ、Ｄ、、Ａ１１ｅ ｎ、Ｌ、、ｒｏｇｅｒｓ、に、、Ｃｏ１ｃｈｅｒ。

Ｄ、、　Ｓｃｈｌｏｍ、　Ｊ、、　５ｈｏｃｈａｔ、　Ｔ、　Ｄ、、　ＬｏＢｕ ｇｌｉｏ、＾、　Ｆ、、　１９９１．　Ｐｈａｒ＋ａａｃｏ汲奄獅■狽奄モ■ ａｎｄ　ｉ＋ｕｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　１３１１−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ 　１ｌｌｏｕｓｅ／ｈｕｍｎ　Ｂ７２．３　（ｈｕｍａｎ　■≠hＩ＆Ｉ４） ｗｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｌ１ａｎ　（１３１−Ｉキメ ラマウス／ヒト１３７２．３モノクローナル抗体ヒトにおける薬理学的動態と免 疫応答）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　５１．５４６１−５４６６Ｋｉｎｇ、　 Ｄ、　Ｊ、、　Ａｄａｉｒ、　Ｊ、　Ｒ，、Ａｎｇｅｌ、　Ｓ、、　Ｌｏｗ、　 Ｄ、　Ｃ，、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　Ｋ、　ＡA。

Ｌｌｏｙｄ、　Ｊ、　Ｃ，、Ｂｏｄｙｒ＋　Ｍ、、　Ｙａｒｒａｎｔｏｎ、　Ｇ 、　Ｔ、、　１９９２．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ｐｕｒ奄■奄モ＝| ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｊｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＩＩｏｕｓ ｅ：　ｈｕ＆ｌＩｎ　ＣｈｉＩＩｅｒｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄ凵@ａｎｄ　Ｃｈｉ ｉｙ ｒｉｃ　Ｆａｂ’　ｆｒａｇｙｎｔ　（マウス：ヒトキメラ抗体とキメラＦａｂ ’フラグメントの発現、精製及び特徴）、Ｂｉｏｃｈｅｎ、　Ｊ、、　２８１． ３１７−３２３にｎｏｘ、　Ｓ、　Ｊ、、　Ｌｅｖｙ、　Ｒ，、Ｈｏｄｇｋｉｎ ｓｏｎ、　Ｓ、、　Ｂｅ１ｌ、　Ｒ，、Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ、、　Ｗｏｏｄ、@Ｇ 、　Ｓ。

、　Ｈｏｐｐｓ、　Ｒ，、ムｂｅｌ、　Ｅ、　Ａ、、　Ｓｔｅｉｎｍｎ、　Ｌ、 、　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｒ，Ｇ、、　Ｇａ１ｓｅｒ、　Ｃ，、xｏｕｎｇ。

Ｇ、、　Ｂｉｎｄｌ、　Ｊ、、　Ｈａｎｈａｍ、　Ａ、、　Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ、 　Ｔ、、　１９９１．　０ｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　狽■■ ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉ−ＣＤ４　ｌ１１ｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗ奄狽■@Ｍｙｃｏｓ ｉｓ ）”ｕｎｇｏｉｄａｓ　（Ｉ状息肉腫の患者におけるキメラ抗ＣＤ４モノクロー ナル抗体の効果の観察）、Ｂｌｏｏｄ、　７フ、　２０−３０にｕｒｒｌｓ、　 Ｒ，、５ｈａａｒａａｎ、　Ｃ，Ｉｔ、、　Ｍｏｏｒｓ、　Ｇ、　Ｐ、、　５ｅ ｉｌｓｒ、　Ｆ、、　１９９０．　Ｉｍｐ窒盾魔■■ ｓｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｈ＋ ｕ＋ａｎ　ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ　丁−ｃａｌｌ　ｒｅｃｅ垂狽盾秩B ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｓｅ　（ヒトアルファ／ベータ ニー細胞レセプターに対する改良モノクローナル抗体、その製造及び使用）、） ：ｐ０４０３１５６Ｌａｗ、　Ｒ，、Ｋｕｖａｂａｒａ、　Ｍ、　Ｄ、、　Ｂｒ １ｓｋｉｎ、　Ｍ、、　Ｆａｓｅｌ、　Ｎ、、　ＨｅｒｌＩａｎｓｏｎ、　Ｇ、 A　Ｓｉｇ− ａａｎ、　Ｄ、　Ｓ、　Ｗａｌｌ、　Ｒ，、１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎ ｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　ａｔ　ｔｈｅ　ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕ撃奄■ ｓｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ：　Ｐｏ５ ｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ@ｔａｒ社ｎａ− ｔｉｏｎ　（免疫グロブリン膜ポリＡ化シグナルの蛋白結合部位：転写終了にお ける可能な役割）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８４．９１６（）−９１６４Ｌａｗ、　Ｍ、−Ｆ、、　Ｍａｒｋ、　Ｇ、　Ｅ 、、　ＩＩＩ＋　Ｖｉｌｌｉａｍｓｏｎ、＾、　Ｒ，、１９９１，Ｍｅｔｈｏｄ 　ｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｗｕｎｏｇｌｏｂｕ ｌｉｎｓ　（組み換え体免疫グロブリンの製造方法）、！］）０４３８３１０ ＬｏＢｕｇｌｉｏ、　Ａ、　Ｆ、、　！Ｉｈｅｅｌｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ｔｒａｎ ｇ、　Ｊ、、　Ｈａｙｎｅｓ、　Ａ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　j、ｅ Ｈａｒｖｅｙ、　Ｅ、　Ｂ、　Ｓｕｎ、　Ｌ、　Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、、　Ｋ ｈａｚａｅｌｉ、　Ｍ、　Ｂ、ｔ　１９８９．　Ｍｏｕｓｅ^ｈｕｓｕｎ Ｃｈｉｅｅｒｉｃ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｍｎ：に １ｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｉｗｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　iマウ ス／ヒトキメラモノクローナル抗体：その動態と免疫応答）、Ｐｒｏｅ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．４２２０−４２２４Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ 、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（分子クローニングＬ　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ。

Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８２゜阿ａｔｈｉｅｓｏｎ、　Ｐ、　 ’Ｗ、、　Ｃｏｂｂｏｌｄ、　Ｓ、　Ｄ、ｒ　Ｈａｌｅ、　Ｇ、、　Ｃ１ａｒｋ 、　Ｍ、　Ｒ，、０１ｉｖｅ窒＝A　Ｄ。

Ｂ、、　Ｌｏｃｋｖｏｏｄ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｖａｌｄａａｎｎ、　）！、、　１ ９９０．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈ■窒≠垂凵@１ｎ ｓｙｓｔｅｔｉｃ　ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ　（全身性脈管炎におけるモノクロー ナル抗体治療）、ＮｅｗＥｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３２３．２５０−２５ ３Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｋｈａｚａｅｌｉ、　Ｍ、　Ｂ、、　Ｐｌ ｏｔｔ、　ｗ、　Ｅ、、　５ａｌｅｈ、　Ｍ、　Ｎ、、　Ｌｉ普A　Ｔ、＋ Ａ１１ｅｎ、　Ｌ、　Ｆ、、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　Ｃ，Ｄ、、　Ｏｒｒ、　Ｒ， Ａ、、　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　Ｄ、、　Ｓｃｈｌｏｍ、　Ｊ、A　５ｈｏ− ｃｈａｔ、　Ｄ、、　Ｔｈｅｅｌｅｒ、　Ｒ，Ｗ、、　ＬｏＢｕｇｌｉａ、ム、 　Ｆ、、　１９９２．　Ｐｈａｓｅ　Ｉ　ｔｒｉａｌ　ｏｆ@ｌｏｄｉ− ｎｅ−１３１−Ｃｈｉｍｒｉｃ　Ｂ７２．３　（ｈｕｗｎ　Ｉ−）　ｉｎ　ｍｔ ａｓｔａｔｉｃ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　（]移 性結腸大腸癌におけるヨウ素１３１−キメラＢ７２．３　（ヒトＩｇＧ４）のフ ェーズエ試験）。

Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｗｅｄ、、　３３．２３−２９Ｍａｒｅｄｉｔｈ、　Ｒ，Ｆ 、、　ＬｏＢｕｇｌｉｏ、　Ａ、　Ｆ、、　Ｐｌｏｔｔ、　ｖ、　Ｅ、、　Ｏｒ ｒ、　Ｒ，Ａ、、　Ｂｒｅｚｏ魔奄モ■B １、　Ａ、、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ＋　Ｃ，Ｄ、、　）ｌａｒｖｅｙ、　Ｅ、　Ｂ、 ｅ　Ｙｅｓｔｅｒ、　Ｍｅ　Ｖ、　Ｖａｇｎｅｒ、　Ａｎｔ@Ｊｅｔ Ｓｐａｎｃｅｒ、　Ｓｓ　Ａ、ｅ　Ｖｈｅｅｌａｒ、　Ｒｅ　Ｈｏｅ　５ａｌｅ ｈ、　Ｍ、　Ｎａｙ　ｒＯｇ６ｒｇ、に＊　Ｊ、ｓ　Ｐｏ１≠獅唐汲凾買■B ５ａｌｔｅｒ、　Ｍ、　Ｍ、、　Ｋｈａｚａｅｌｉ、　Ｍ＋８．、１９９１．　 Ｐｈａｒ＋ａａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、　ｉｍｕｎｅ　ｒｅWｐｏｎ８ｅｅ ａｎｄ　ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｏｄｉｎｅ−１３１−１ａ ｂｅｌｅｄ　Ｃｈｉｉｗｒｉｃ　ｍｕｓｅ／ｈｕａａｎ　Ｉ■fＬ　ｋ　１ ７１Ａ　ＩＩｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（ヨウ素−１３１１１１ 識キメラマウス／ヒトＩＧＧ１．　ｋ１７１＾モノクローナル抗体の薬理学的動 態、免疫応答及び生体分布）、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍａｄ、、　３２゜１１６ｌ ｌ６２−１ ｌ６８．　Ｍ、　Ｋ、、　Ｍａａｒｅｓ、　Ｃ，Ｆ、、　ＤｅＮａｒｄｏ、　Ｓ 、　Ｊ、、　１９８８．　Ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗａｙ@ｏｆ ＆１ｃｒｏｃｙｃｌｉｃ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ａ ｇｅｎｔｓ：　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　２−（ｐ−Ｎｉ狽窒盾ｂ■獅嘯凾戟 j −１，４，７，１Ｏ−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ、Ｎ’ 　、Ｎ”、Ｎ”−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、ａｎп@５ｔｕｄｙ ｏｆ　ｉｔｓ　Ｙｔｔｒｉｕ＋＊　（ＩＩＩ）　ｃｏｍｐｌｅｘ　（大環式二官 能基キレート剤のペプチドへの使用＝２−（Ｐ−ニトロベンジル）−１，４，７ ，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ、Ｎ’　、Ｎ”、Ｎ″−テトラ酢酸の合 成とそのイツトリウム（ＩＩＩ）複合体の研究）、Ｊ、Ａ膳、　Ｃｈｅ騰、　５ ｏｃｅ＠　１１０、６２６６−６２６７ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、　Ｌ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｍ、　Ｊ、、　Ｈｅｒ ｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｌ、　Ａ、、　Ｏｉ、　Ｖ、　Ｔ、、　P９８４゜ Ｃｈｉｘｒｉｃ　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｘｌｅｃｕｌｅｓ：　Ｍｏｕ ｓｅ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｗｉ、ｎｓ　翌奄狽■ ｈｕｍｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ　ｄｏｉＩａｉｎｓ　（キメラヒト 抗体分子：ヒト定常領域ドメインをもつマウス抗原結合ドメイン）、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８１．６８５１−６８０ｒｌ ａｎｄｉ、　Ｒ，、Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ、　Ｈ，、Ｊｏｎｅｓ、　Ｐ、　Ｔ、、 　ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、、　１９８９．　Ｃｌｏｎｉ獅■ ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍｉｎｓ　ｆｏｒ　ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｘｒａｓｅ　ｃ■≠奄■ ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ポリメラーゼチェーン反応による発現のための免疫グロブ リン可変ドメインのクローニング）、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、、　８６．３８３３−３８３７Ｐａｄｌａｎ、　Ｅ、　Ａ、、 　１９９１．　Ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｐｒｏｓ＜ｕｒａ　ｆｏｒ　ｒｅｄｕｃ ｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｕｎｏ■■氏| ｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏ鳳ａｉｎｓ　ｗ ｈｉｌｅ　ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｈｅｉｒ　ｌｉｇａｎп|ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　（抗体可変領域の免疫原性を低下させる一方でそれらの リガンド結合特性を保持する可能な方法）、Ｍｏ１．　Ｉｗｕｎｏ、、　２８． ４８９−４９８Ｐａｄｌａｎ、　Ｅ、　Ａ、、　５ｉｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｅ、　 Ｖ、、　５ｈｅｒｉｆｆ、　Ｓ、、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｇ、　Ｈ，、Ｓｍｔｈ|Ｇ ｉｌｌ。

ＵＳＡ、、　８６．５９３８−５９４２Ｐｏｌｊａｋ、　Ｒ，Ｊ、、　１９９１ ．５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｅ ｏ＠ｐｌａｘｅｓ　翌奄狽■ ａｎｔｉｇｅｎｓ　（抗体及びそれらの抗原との複合体の構造）、Ｍｏ１．　Ｉ ｍｕｎｏｌ、、　２８．１３４ＰｒｉＩｌｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｏｌｄ、　Ｐｒ１ ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　（遺伝子操作の 基本）。

Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８０゜Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，、５ｃ ｈｎｅｉｄｓｒ、　Ｗ、　Ｐ、ｔ　５ａｌｉｃｋ、　Ｈ，Ｅ、、　Ｐａｙｎｅ、 　Ｐ、　Ｗ、、　Ｌａｎｄｏｌｆ堰A　Ｎ。

Ｆ、、　Ｄｕｎｃａｎ、　Ｊ、Ｆ、、　Ａｖｄａｌｏｖｉｃ、　Ｎ、　Ｍ、、　 Ｌｅｖｉｔｔ、　Ｍ、、　Ｊｕｎｇｈａｎｓ、　Ｒ，Ｐ、、@Ｉｌａｌｄ− ｍｎｎ、　Ｔ、　Ａ、、　１９８９．　Ａ　ｈｕＩＩａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉｂ ｏｄｙ　ｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　１ｎｔｓｒ撃■浮汲奄氏@２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（インターロイキン２に結合するヒト化抗体）、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８６．１００２９−１００３３Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，、５ ｅｌｉｃｋ、　Ｈ，Ｅ、、　１９９０．　ＣｈｉＩＩｅｒｉｃ　ｉｍｕｎｏｇｌ ｏｂｕｌｉｎｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ@ｆｏｒ ｐ５５　ＴＡＣｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ比−２ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（几− ２のＰ５５ＴＡＣ蛋白に特異的なキメラ免疫グロブリ：／）、ｖ０９０１０７８ ６１Ｒｉｅｃｈｓａｎｎｔ　Ｌ−＋　Ｃ１ａｒｋ、　Ｍ、ｔ　Ｖａｌｄｍｎｎ、 　Ｈ，、Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、、　１９８８．　Ｒｅｓｈａｐｉ獅■ ｈｕｅｌａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒａｐｙ　（治療用再形 成ヒト抗体）、Ｎａｔｕｒｅ、　３３３２．３２３−Ｒｏｌｆｅ、　Ｍ、　Ｒ， 、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ、　Ｃ，Ｒ，、１９９２，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　ｕｓｉｎｇ　ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　（Ｃ１ （Ｏ細胞発現ベクターを用いる増＠：分子生物学の今日の手法）、Ｉｎ　Ａｕ５ ｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、、　Ｂｒｅｎｔ、　Ｒ，、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、　Ｒ，Ｃ ，、Ｍｏｏｒｅ、　Ｄ、　Ｄ、。

５ａｉｄａａｎ、　Ｊ、　Ｇ、、　Ｓｍｔｈ、　Ｊ、＾、、　５ｔｒｅｕｈｌ＋ に、１編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ、　Ｅ、　Ｇ、、　Ｌｌｏｙｄ、　１．＊　ＧｏｒＩａｎ、 　Ｓ、　Ｄ、、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｎ、、　Ｖａｌｄｍｎｎ、@Ｈ，、１ ９９１、Ａ　ｈｕａａｎｉｚｅｄ　ｘｎｏｖａｌｅｎｔ　ＣＤ３　ａｎｔｉｂｏ ｄｙ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ａｃｔｉｖａｔｅ　ｈｏｍｏｌ盾■盾浮■ ｃｏｍｐｌｅｗｅｎｔ　（同種補体を活性化できるヒト化−価ＣＤ３抗体）、Ｅ ｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｕｎｏｌ、＊２１、２７１７−２７２５ Ｓａｉｋｉ　Ｒｏに、、　５ｃｈａｒｆ、　Ｓ、、　Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｆ、、 　Ｍｕｌｌｉｓ、に、　９．、　）Ｉｏｒｎ、　Ｇ、、　ＩhＩｒｌｉｃｈ。

Ｈ，Ａ、、　Ａｒｎｈｅｉｎ、　Ｎ、、　１９８５．　Ｅｎｚｙ＆１ｔｉｃ　ａ ｌｌｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂ−ｇｌｏｂｉｎ　ｇ■獅盾高奄■ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　５ｉｃｋｌｅ@ｃｅｌｌ　ａｎ− ｅａｉａ　（ｂ−グロブリンゲノム配列の酵素的増幅と鎌形赤血球貧血診断のた めの制限部位分析）、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０．１３５０−１３５４Ｓａｌｅ ｈ、　Ｍ、　Ｎ、、にｈａｚａｅｌｉ、　Ｍ、　Ｂ、、ｖｈｅｅｌｅｒ、　Ｒ， ｔｌ、、　Ａ１１ｅｎ、　Ｌ、、　Ｔｉ１ｄｅｎ、■AＢ。

、　Ｇｒｉｚｚｌａ、　Ｗ、、　Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ＋　Ｒｅ　Ａｓ２　Ｙｕ、　 Ａ、　Ｌ、、　Ｇ１１ｌｉｅａｅ　Ｓｏ　Ｄ、＊　ＬｏＢｕ■撃奄潤A　Ａ。

Ｇ、、　１９９２．　Ｐｈａｓｅ　Ｉ　ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｉｍｒ ｉｃ　ａｎｔｉ−■２　ｍｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏр■ ｃｈ１４．１８　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍ １ｅｌａｎｏｌＩａ（悪性メラノーマ患者におけるキメラ抗ＧＤ２モノクローナ ル抗体ｃｈ１４．１８のフェーズエ試験）、Ｈｕ＋ｓ、　Ａｎｔｉｂｏｄ。

Ｈｙｂｒｉｄｏｗｓ、　３．１９−２４Ｓｈｅｒｉｆｆ、　Ｓ、、　５ｉｌｖｅ ｒｔｏｎ、　Ｅ、　Ｖ、＃　Ｐａｄｌａｎ、　Ｅ、　Ａ、、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｇ 、　Ｈ，、５Ｉｌｉ狽■|Ｇｉｌｌ。

Ｓ、　Ｊ、、　Ｆｉｎｚｅｌ、　Ｂ、　Ｃ，、Ｄａｖｉｅｓ、　Ｄ、　Ｒ，、１ ９８７，Ｔｈｒｓｅ−ｄｉｍｎｓｉｏｎａｌ　５ｔｒｕｃｔ浮窒■ ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　（抗原−抗 体複合体の三次元構造）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８４．８０７５−８０７９Ｓ ｋｅｒｒａ、Ａ、、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ａ、、１９８９．　Ａｓｓｅｍｂｌｙ 　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｌｌｍｕｎｏｇｌｏｂ普| １ｉｎ　Ｆｖ　ｆｒａｇｌＩｅｎｔ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ 　（機能的免疫グロブリンＦｖフラグメントの大腸菌での組立て）、５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２４０．１１０３８−１０４１Ｔｒａｎ、　Ｊ、　Ｎ、、　ＬｏＢｕｇ ｌｉｏ、　Ａ、　Ｆ、、　Ｖｈｅｅｌｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、）Ｉａｒｖｅｔ、　Ｅ 、　Ｂ、、　Ｓｕ氏A　Ｌ、。

Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、、　Ｋｈａｚａｅｌｉ、　Ｍ、　Ｂ、、　１９９０．　 Ｐｈａｒｓａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ａ　ｍｕｓｅ／■浮高■ ｃｈＬｓｅｒｉｃ　ＷＩＤｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｃ−１７− ＬＡ）　ｉｎ　ｌ１１ｅｔａｓｔａｔｉｃ　ａｄｅｎｏｃａ窒モ奄獅盾香@ｐａ ｔ− ｉｅｎｔｓ　（転移性腺癌患者のマウスｌヒトキメラモノクローナル抗体（Ｃ− １７−ＩＡ）の薬理学的動態）、Ｐｈａｒｍｃｏｌ、　Ｒｅｓ、、　７．５８７ −５９２Ｔｒａｖｅｒｓ、　Ｐ、、　Ｂｏｄｗｒ、　Ｉｌ、、　１９８４．　Ｐ ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ@ｏｆ ｇＩＯｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐｌａｃｅ ｎｔａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ａ獅п@ｏｔｈｅｒ ｈｃ＋ｎａｎ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｄａｔｓｒｍ ｎａｎｔｓ　（胎盤性アルカリフォスフォターゼと他のヒトトロフオブラストと 付随決定基に対するモノクローナル抗体の調製と特徴）、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ ｎｃｅｒ、、　３３．６３３−６４１Ｖｓｒｈｏｅｙｅｎ、　Ｍ、、　Ｂｒｏｄ ｅｒｉｃｋ、　Ｌ、、　Ｅｉｄａ、　Ｓ、、　Ｂａｄｌｅｙ、　Ａ、、　１９９ １．　Ｒｅｓｈａ垂■■ ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉ−ＰＬＡＰ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｅｐｅｎｅｔ ｏｓ、＾、Ａ、（ｅｄ、）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔ奄ｂ盾р奄■■ ＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｌｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｏｎｃｏｌｏｇｙ　（再 形成ヒト抗ＰＬＡＰ抗体：臨床腫瘍学におけるモノクローナル抗体の利用（＾、 Ａ、Ｅｐｅｎｅｔｏｓ編）　Ｐｕｂ、　ＣｈａｐＨａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌルー １ｃａｌ　ｐｐ３７−４３ Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ、　Ｍ、、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，、Ｗｉｎｔｅｒ、　 Ｇ、、　１９８８．　Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ　ｈｕｍｎ　ａｎ狽堰| ｂｏｄｉｅｓ：　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎ　ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍ　ａｃｔｉ ｖｉｔｙ　（再形成ヒト抗体：抗リゾチーム活性の移植）、５ｃｉｅｎｃｅ、　 ２３９．１５３４−１５３６Ｍｅｌｔ、　Ｓ、、　Ｄｉｖｇｉ、　Ｃ，Ｒ，、Ｒ ａａｌ、　Ｆ、　Ｘ、、　Ｙｅｈ、　Ｓ、　Ｄ、、　Ｐｉｌａｒ、　Ｇ、　Ｃ， 、Ｆｉｎ唐狽≠пB Ｃ，Ｌ、、　５ａｋａｅｏｔｏ、　Ｊ、、　Ｃｏｈｅｎ、　Ａ、、　Ｓｉｇｕｒ ｄｓｏｎ、　Ｅ、　Ｒ，、Ｋｅｙｎｙ、　Ｎ、、ムｒｓｖｅ撃k Ｅ、　Ａ、、　０ｅｔｔｆｅｎ、　Ｈ，Ｆ、、　Ｏｌｄ、　Ｌ、　Ｊ、、　１９ ９０．　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏ■@ａｎｔｉ− ｂｏｄｙ　１ｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕ＆Ｉｎ　５ｅｔａｓｔａｔｉ ｃ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ：　５ｔｕｄｉｅｓ　ｗｉｔ■@５ｏｎｏ− ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａ３３　（ヒト転移性大腸癌における抗体局 在の定量的分析）、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．、８．　Ｌ８９４−１８９６Ｗｈｉｔｔｌｅ、　Ｎ、 、　Ａｄａｉｒ、　Ｊ、、　Ｌｌｏｙｄ、　Ｃ，、Ｊｅｎｋｉｎｓ、　Ｌ、、　 Ｄａｖｉｎｅ、　Ｊ、、　Ｓｅｈｌ盾香A　Ｊ、。

Ｒａｕｂｉｔｓｈｅｋ、　Ａ、、　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　Ｄ、、　ＦＳｏｄｌＩｅ ｒ、　Ｍ、、　１９８７．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　bＯ３ｃａｌｌｓ ｏｆ　ａ　ｍｏｕｓｅ／ｈｕＩｌａｎ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｂ１２．３　ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　（マウス／ヒトキメラ８７２．３抗体のωＳ細胞の発現）、Ｐｒｏ ｔ、　Ｅｎｇ、、　１．４９９−５０５Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　Ｐ＋、　１９８ ７．　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ奄■ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　（組換え体抗体とそれらの製造方法）、ＥＰ−０２３９ ４００Ｖｕ、　Ｔ、　Ｔ、、にａｂａｔ、　Ｅ、　Ａ、、　１９７０．　Ａｎ　 ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔ■■ ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｂｅｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ　ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｍｙｅｌｏ膳ａ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉ獅刀@ａｎｄ ｔｈｅｉｒ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｍｐ ｌｅｓｅｎｔａｒｉｔｙ　（ペンスージョンズ蛋白とミエローマ軽鎖の可変領域 の配列分析及び抗体の相補性についてのその意味）、Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１３２．２１１−２５０重鎮前部プライマー 重鎮後部プライマーｖ／ｃ結合部 （Ｊ！ｕ５　’　ＣＡＧＡＴ匡二匡ＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＭＲＧＡＧＡＣ ＤＧＴＧＡ　３６軽鎖前部プライマー ＬＩＧＨＴ　Ｃ）ＩＡＩＮ　ｒＯＲＷＡＲＤ　ＰＲＩＭＥＲＳカッパ軽鎖後部プ ライマーｖ／ｃ結合部キー：　Ｍ−Ａ／Ｃ，Ｒ−Ａ／Ｇ、Ｗ−Ａ／Ｔ、Ｓ−Ｃ／ Ｇ、Ｙ−Ｔ／Ｃ，Ｂ−Ｔ／Ｇ、Ｄ−Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｈ−Ａ、Ｃ，ＴＦＩＧ、　２ Ｂｓｕよ ５′ ＷＬＴｒ）ＡＲＣＤ　工　ＱＭ　τ　ＱＳＰＳＳＬＳＶ３＃ ５ＶＧＤＲＶＴ　工　ＴＣｎＮＶｆｌＴＶＶＡ　ｗ　Ｙ　Ｑ　Ｑ　Ｋ　Ｐ　Ｇ　 Ｌ　Ａ　Ｐ　Ｋ　工　Ｘ、ｘ　Ｙ　Ｌ、−一、１ＲｕＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧ５ ＧＴＤＦＴｒＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩ　Ａ　ＴＹＦ’ＣＬｎｕｗ５３′　５Ｉ ムーーー、シ　Ｆ　Ｇ　Ｑ　Ｇ　Ｔ　Ｋ　ｖ　Ｅ　ｖ　Ｋ　Ｒｔ　９　ｒＦＩＧ 、　４ 五−１二 ５′３ｔ ７ＴＧＶ＃　Ｓ　ｊ、ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰ八＝−ムＷ工３′ ＹＣＡＰへ　Ｔ　＝ｖｖｐｒＡｙＷＧＱＧＴＬＶＴＦＩＧ、　５ 陽−帽　ｋ。

ＲＦ９７：ＬＳ１７４Ｔ腫瘍保持マウスの１１１−Ｉｎ図８ ＲＦ９９：Ｃｏ１ｏ２０５腫瘍保持マウスの９０−Ｙ　ｈＡ３３ＩｇＧ−１２Ｎ ４の生体分布 血液　肝　腎　肺　牌　結腸　筋　大腿骨　腫瘍図９ ← 区 一 一 ％注射量／グラム組織 ％注射量／グラム組織 の 腫瘍容積（ｃ　ｍ”） ＨＰＬＣゲル濾過分析 ａ）反応混合物 ｂ）精１１ＤＦＭ 図１５ ｈＡ３３Ｆａｂ’のＣＴ５５７によるＴＦＭへの架橋結合ｂ）精製ＴＦＭ 図１６ ｈＡ３３　Ｆａｂ’のＣＴ９９ＢによるＴＦＭの架橋結合ＨＰＬＣゲル濾過分析 ｈＡ３３Ｆａｂ’　の架橋結合の５ＤＳ−ＰＡＧＥｌ、分子量マーカー ２、ｈＡ３３　Ｆａｂ’ ３、ｈＡ３３　ＤＦＭ反応混合物 ４、ｈＡ３３　ＤＦＭ反応混合物 ５、ｈ、Ａ３３　ＴＦＭ　（ＣＴ５５７）反応混合物６、ｈＡ３３　ＴＦＭ　（ ＣＴ５５７）反応混合物７、ｈ、Ａ３３　ＴＦＭ　（ＣＴ９９８）反応混合物８ 、精製ｈＡ３３　ＴＦＭ　（ＣＴ５５７）腫瘍容積（ａ　ｍ’） ■ 一団口 ％注射量／ｇ組織 一団口 ％注射量／ｇ／腫瘍：％注射量／ｇ血液％注射量／ｇ組織　へ 区 ロ　の　ｏ　ｈ　ｏ　梢　０ 比 ％注射量／ｇｌＬｊｌ　０３ 区 ｐｔａｃ　ＯｍｐＡｇＬＣ ＦＩＧ、　２５ ＋０９８７６　５４３２１ ＦＩＧ、　２８ 培養細胞の３０℃と４６℃抽出物の非還元ウェスタンプロット分子量（ｋＤａ） ○ の ％注射量／ｇ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号　ＩＧＯＩＮ　３３１５ ３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　９０１５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ ／／Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｂ　９２８４−４ＣＤ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｄ　２０７／４５２　８２１７−４Ｃ（Ｃ１２Ｐ　２ＶＯ８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ、　ＩＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ 、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、Ｃ Ｆ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、 Ｒ○。

ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＵＺ、ＶＮＦ■ ニア２）発明者　オーエンズ、レイモンド、ジョンイギリス国オックスフォード シャー・アールジー５・１エスエイチ、ヘンリー−オンーテムズ、ハミルトン・ アベニュー・２３

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ネズミモノクローナル抗体Ａ３３によって認識されるエピトープに対する特 異性を有するヒト化抗体分子（ＨＡＭ）（ＭＡｂＡ３３）であって、さらに、そ の可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のうち少なくとも１つがマウスモ ノクローナル抗体（Ａ３３）に由来し、さらに該ＨＡＭの残余の免疫グロブリン 由来部分がヒト免疫グロブリンまたはその類似体に由来する抗原結合部位を有し 、当該ＨＡＭが場合によってエフェクターまたはレポーター分子に結合されてい る、ヒト化抗体分子。
2. ２．連結構造によって互いに結合した２つ、３つ、４つまたはそれ以上の抗体ま たはそのフラグメントを含む単一特異性を有する多価抗原結合蛋白であり、該蛋 白は、天然の免疫グロブリンではなく、当該抗体またはフラグメントの各々がネ ズミモノクローナル抗体Ａ３３によって認識されるエピトープに対する特異性を 有し、当該抗原結合蛋白が場合によってエフェクターまたはレポーター分子と結 合させられている、請求の範囲第１項に記載のＨＡＭ。
3. ３．該単一特異性多価抗原結合蛋白が連結構造によって互いに結合した２つ、３ つまたは４つのＦａｂフラグメントを含む、請求の範囲第２項に記載のＨＡＭ。
4. ４．該単一特異性多価抗原結合蛋白が連結構造によって互いに結合した３つのＦ ａｂフラグメントを含む、請求の範囲第３項に記載のＨＡＭ。
5. ５．該連結構造が下記式（１）の架橋結合剤の残基である、請求の範囲第３項ま たは４項に記載のＨＡＭ：Ｒ１ＣＨ（Ｒ２）ＮＨＣＯＲ２ 式中、Ｒ１はカルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）またはエステル化カルボキシル（−Ｃ Ｏ２Ｒ）またはカルボキスアミド（−ＣＯＮＨ２）基または−ＣＯＡ基で、ここ でＡは、−ＣＯ基に直接または炭素−炭素を形成するためのスペーサ基を介して または炭素−異種原子結合を介して結合させたエフェクターまたはレポーター分 子で；Ｒ２およびＲ３は、同一でも異なっていてもよいが、それぞれ任意に置換 された直鎖または分枝アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン鎖［場合に よって１つまたはそれ以上の−Ｏ−または−Ｓ−原子、または−Ｎ（Ｒ４）（こ こでＲ４は水素原子またはＣ１−６アルキル基）、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯ Ｎ（Ｒ４）−、Ｃ５−８シクロアルキレン、Ｃ６−１２アリーレンまたはＣ６− １０ヘテロアリーレン基が介在］で、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の反応性 官能基を含み、それによってＲ２およびＲ２の反応性官能基の総数が合わせて２ つ、３つまたはそれ以上である請求の範囲第３項又は第４項に記載のＨＡＭ。
6. ６．該エフェクターまたはレポーター基が放射性核種またはキレート化放射性核 種である、請求の範囲第１項から５項のいずれか１つに記載のＨＡＭ。
7. ７．該放射性核種が放射性ヨウ化物である、請求の範囲第６項に記載のＨＡＭ。
8. ８．該キレート化放射性核種が、ポリチンテートキレート剤でキレート化された ９９ｍＴｃ、１０６Ｒｅ、１００Ｒｅ、５０Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５ Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、３０７Ｂｉ、１１１ Ｉｎ、６７Ｇａ、６０Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄおよび４ ７Ｓｃから選択された放射性核種を含む、キレート化放射性核種である、請求の 範囲第６項に記載のＨＡＭ。
9. ９．該放射性核種が１１１Ｉｎまたは９０Ｙである、請求の範囲第８項に記載の ＨＡＭ。
10. １０．軽鎖可変領域の残基２４から３４、５０から５６および９１から９６また は８９から９７のＭＡｂＡ３３ＣＤＲｓを含む、請求の範囲第１項から９項のい ずれか１項に記載のＨＡＭ。
11. １１．重鎖可変領域の残基３１から３５、５０から６５および９５から１０２の ＭＡｂＡ３３ＣＤＲｓを含む、請求の範囲第１項から１０項のいずれか１項に記 載のＨＡＭ。
12. １２．重鎖および軽鎖の両方のために、【配列があります】またはＮＥＷＭヒト 可 変領域読み枠配列を含む、先行する請求の範囲のいずれかに記載のＨＡＭ。
13. １３．該読み枠配列がＬＡＹである、請求の範囲第１２項に記載のＨＡＭ。
14. １４．軽鎖可変領域の残基４６および８７の一方または両方にＭＡｂＡ３３残基 をさらに含む、請求の範囲第１３項に記載のＨＡＭ。
15. １５．重鎖可変領域の残基１、２７、２８、２９、３０、７２、７３、８２ｂ、 ８６および９４の１つまたはそれ以上にＭＡｂＡ３３残基をさらに含む、請求の 範囲第１４項に記載のＨＡＭ。
16. １６．先行する請求の範囲のいずれかに記載のＨＡＭを製造する方法であって、 該方法が、 （ａ）可変ドメインのＣＤＲｓの少なくとも１つがＭＡｂＡ３３に由来し、さら に、その抗体鎖の残余の免疫グロブリン由来部分がヒト免疫グロブリンに由来す る可変ドメインを含む、抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有する オペロンを発現ベクターで製造し；（ｂ）その可変ドメインのＣＤＲｓの少なく とも１つがＭＡｂＡ３３に由来し、さらに、その抗体鎖の残余の免疫グロブリン 由来部分がヒト免疫グロブリンに由来する可変ドメインを含む、相補的な抗体の 軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベクターで製造 し；（ｃ）両方のオペロンで宿主細胞を形質感染し；（ｄ）該形質感染細胞系を 培養してＨＡＭを製造する工程を含むＨＡＭの製造方法。
17. １７．該ＨＡＭが抗体フラグメントで、該宿主が細菌細胞である、請求の範囲第 １６項に記載の方法。