JP2013543506A

JP2013543506A - プラスモジウム種に対するｔ細胞応答を誘導するための方法及び組成物

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Publication number: JP2013543506A
Application number: JP2013533004A
Authority: JP
Inventors: ローアー，ピーター，エム．; ブロックステット，ダーク，ジー．; ダベンスキー，トーマス，ダブリュー．
Original assignee: アデュロバイオテック
Priority date: 2010-10-10
Filing date: 2011-10-10
Publication date: 2013-12-05
Also published as: US20130323275A1; CA2814176A1; WO2012051097A1; AU2011313913A1; EP2624862A1

Abstract

本発明は、被験体において、プラスモジウム種抗原に対するＴ−細胞応答を誘導する方法に関する。これら方法は、そのアミノ酸配列が、野生型プラスモジウムＬＳＡ1、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰ配列に由来する１つ以上のアミノ酸配列を含む、１つ以上の免疫原性ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を被験体に投与することを含み、前記アミノ酸配列は、（ｉ）前記細菌における発現のための、野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）野生型配列中に存在する少なくとも１つの疎水性領域の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合、野生型配列中に存在する反復単位の最小化、によって誘導される。
【選択図】図１

Description

本発明は、全ての表、図面及び特許請求の範囲を含めるその全体が本明細書に組み込まれるものとする、２０１０年１０月１０日に出願された、米国仮特許出願第６１／３９１，６５０号からの優先権を主張するものである。

本発明の背景技術の以下の説明は、本発明を理解する上で本書の読者を補助するために提供されるものにすぎず、本発明に先行技術を記載するか又は構成するように認められるものではない。

マラリアは、毎年５億人を発症させかつ２，７００万人の死亡を引き起こす主要な感染性疾患である。マラリアの重篤性は、１つには、感染を効果的に取り除きかつ感染防御免疫性を発生するための宿主の免疫システムの欠損によるものである。樹状細胞（ＤＣｓ）は、病原体の構成成分を循環するＴ細胞に提供し、これによって、感染を除去するための極めて特異的な免疫応答を誘導する。しかしながら、ＤＣｓはマラリア原虫によって変性され、適応性免疫システムの非効率的初回刺激をもたらすことが報告されている。例えば、Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら著、ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．３（１０）：ｅ１４３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．００３０１４３を参照されたい。その結果、プラスモジウム感染への細胞媒介性及び体液性応答の双方に及ぼす有害作用で、Ｔ−細胞機能及び移動が抑制される。

プラスモジウム種への効果的な免疫応答を刺激するための組成物及び方法に対するこの分野における要求が未だに存在する。

本発明は、プラスモジウム抗原を組換え的にコード化しかつ発現する細菌を用いて、１つ以上のプラスモジウム抗原の送達のための組成物及び方法を提供する。

本発明の第１の態様では、本発明は、被験体においてプラスモジウム種抗原に対するＴ−細胞応答を誘導する方法に関する。これら方法は、１つ以上の免疫原性ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を被験体に投与することを含み、このポリペプチドのアミノ酸配列は、野生型プラスモジウムＬＳＡ１（肝臓−ステージ抗原１）、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ（スポロゾイト周囲タンパク質）、及び／又はＴＲＡＰ（トロンボスポンジン関連接着タンパク質、これはスポロゾイト表面タンパク質２又はＳＳＰ２としても知られる）配列に由来する１つ以上のアミノ酸配列を含み、ここにおいて、前記アミノ酸配列は、（ｉ）前記細菌における発現のための野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）野生型配列中に存在する少なくとも１つの疎水性領域の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合には、野生型配列中に存在する反復単位の最小化によって誘導される。

本明細書に記載されるように、このような方法は、組換え的に発現された免疫原性プラスモジウムポリペプチドに対する抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋）応答を被験体において刺激することができる。好ましくは、本発明の組成物は、被験体に送達される場合、前記送達後２４時間でのＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、及びＭＣＰ−１からなる群から選択される蛋白質の１つ以上、及び好ましくはそれぞれの蛋白質の血清濃度における増加を誘導し、並びにこの細菌によって発現された前記免疫原性プラスモジウム抗原ポリペプチド（複数可）の１つ以上に対するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する。

本発明の関連する態様では、本発明は、被験体においてプラスモジウム種へのＴ−細胞応答を誘導するために有用な組成物に関する。このような組成物は、核酸分子を含有する細菌を含み、この核酸分子の配列は、１つ以上の免疫原性ポリペプチドをコード化し、このアミノ酸配列は、野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰ配列に由来する１つ以上のアミノ酸配列を含み、ここにおいて、前記アミノ酸配列は、（ｉ）前記細菌における発現のための野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）野生型配列中に存在する少なくとも１つの疎水性領域の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合には、野生型配列中に存在する反復単位の最小化によって誘導される。

別の関連する態様では、本発明は、単離された核酸分子に関し、この配列は、１つ以上の免疫原性ポリペプチドをコード化し、このアミノ酸配列は、野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰ配列に由来する１つ以上のアミノ酸配列を含み、ここでは、前記アミノ酸配列は、（ｉ）前記細菌における発現のための野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）野生型配列中に存在する少なくとも１つの疎水性領域の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合には、野生型配列中に存在する反復単位の最小化によって誘導される。

適切な免疫原性ポリペプチド配列を送達させるための方法は、以下に詳細に記載され、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰから誘導された例示の免疫原性ポリペプチド配列が提供される。選択法は、リステリア属ＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性の５０％を超える疎水性の領域を有さないＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰアミノ酸配列で、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコード化すると予測されるアミノ酸配列の選択を含むことができる。このようなポリペプチドがＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を発生する能力は、本明細書に詳細に記載され、並びに当該技術分野で周知である多様な方法によって確認され得る。

ある実施形態では、免疫原性ポリペプチド（複数可）は、配列番号７、９、１１、１３、１５、及び１７、若しくはこれら配列からの少なくとも３０個のアミノ酸で少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、このような免疫原性ポリペプチド（複数可）をコード化する核酸は、配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６、若しくはこれら配列からの少なくとも９０個の残基と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。

多数のプラスモジウム種が、本発明の抗原ポリペプチド（複数可）、及び対応するアミノ酸の原料として役立つことができる。マラリア原虫の５つの種がヒトに感染する可能性があり、この疾患の最も重度な症例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍによって発症されるので、これが好ましい。しかしながら、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ）及び四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ）は一般的に致死性ではないがヒトで発症する。第４番目の種である二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉ）は、マカク属サルでマラリアを発症するがヒトでも感染する可能性がある人畜共通感染性である。

いくつかの細菌種がワクチンとして使用するために開発されてきて、本発明ではワクチンプラットフォームとして使用され得、これらは、フレキシナ赤痢菌（ＳｈｉｇｅｌｌａＦｌｅｘｎｅｒｉ）、大腸菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ）、単球症リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、腸炎エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）又はマイコバクテリウム種が挙げられるが、これに限定されない。この列記は限定されることを意味するものではない。本発明は、ワクチンプラットフォームとして、弱毒化され、共生する、及び／又は殺さなく代謝活性な細菌株の使用に関する。好ましい実施形態では、この細菌は、細菌による発現のために、１つ以上の本発明のプラスモジウム由来抗原ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。この核酸は、細菌のゲノムに最も好ましく組み込まれる。Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの弱毒化されかつ殺さなく代謝活性な形態が特に好ましく、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢ中に減衰性突然変異を保持するＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが、好ましい実施形態で以下に記載される。

本明細書に記載されるワクチン組成物は、プラスモジウム感染を防止する又は処置するための適切な免疫応答を誘導するのに十分な量で、単独又は薬学的に許容可能な賦形剤との組み合わせのいずれかで宿主に投与され得る。被験体においてＴ細胞応答を誘導するよう選択される好ましい条件は、ワクチンプラットフォームを被験体に静脈内投与することを含むが、投与は、経口、静脈内、皮下、経皮、皮内、筋肉内、経粘膜、非経口、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼球内、血管内、結節内、乱刺法による、経肛門、腹腔内、又は様々な投与の周知の経路のいずれか１つ又はその組み合わせであってもよい。

ある好ましい実施形態では、免疫応答を初回刺激するために被験体が免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの有効用量を投与された後に、第２のワクチンが投与される。これは、当該技術分野では「プライム−ブースト」療法と呼ばれる。このような療法では、本発明の組成物及び方法は、「プライム」送達、「ブースト」送達、又は「プライム」及び「ブースト」の双方として用いられ得る。このような療法の例は、以下に記載される。

本発明における使用に好ましいＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅは、発現されたｐｒｆＡ転写因子を構成的に活性な状態にロックするｐｒｆＡ遺伝子における突然変異を含む。例えば、ＰｒｆＡ^＊変異体（Ｇ１５５Ｓ）が、プライム−ブースト血管内又は筋肉内免疫化療法に続いて、機能的細胞性免疫を増強することが示されている。

ある実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチド（複数可）は、インフレーム分泌シグナル配列を含む１つ以上の融合蛋白質として発現され、これによって、細菌による可溶性ポリペプチド（複数可）としてそれらの分泌をもたらす。多数の例示のシグナル配列が、細菌発現システムでの使用のために当該技術分野で既知である。細菌がＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅである場合、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅのシグナル配列であり、最適には、ＡｃｔＡシグナル配列であることが好ましい。追加的ＡｃｔＡ又は他のリンカーアミノ酸もまた、免疫原性ポリペプチド（複数可）に融合して発現され得る。好ましい実施形態では、１つ以上の免疫原性ポリペプチド（複数可）は、インフレームＡｃｔＡ−Ｎ１００配列（例えば、配列番号３７、３８、及び３９からなる群から選択される）又は前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質（複数可）として発現される。

好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅを含み、この融合タンパク質は、
（ａ）配列番号３７、３８、及び３９からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、又はこのようなＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
（ｂ）配列番号７、９、１１、１３、１５、及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はこれら配列の１つからの少なくとも３０個のアミノ酸で少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含み、ここにおいて、この融合タンパク質は、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅのＡｃｔＡプロモーターに操作可能に結合される核酸配列から発現される。

上述したように、ある実施形態において、抗原ポリペプチド（複数可）をコード化する核酸配列は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ）による発現のために、コドン最適化されている。以下に記載するように、異なる生物体は、「コドンバイアス」、すなわち、特定のアミノ酸をコード化する所与のコドンが、遺伝子コードで出現する程度が生物体間でかなり変動することを、しばしば示す。一般的には、ある遺伝子が含有するレアコドンが多くなればなるほど、異種タンパク質がその特定な宿主系内で相当なレベルで発現されることの確率がより低くなる。これらレベルは、レアコドンがタンパク質のクラスタ又はＮ末端部分で出現する場合には、更に低減する。アミノ酸配列を修飾することなく宿主系のコドンバイアスをより緊密に反映する他のもので置き換えることは、機能的タンパク質発現のレベルを増加させること可能である。コドン最適化のための方法は、以下に記載される。

本発明は、以下の記載又は図面における説明で記述された構築物の詳細及び構成成分の配置へのその用途において限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明は、記載されたものに加えての実施形態で可能であり、並びに様々な方法で実践かつ実行されることが可能である。更に、本明細書で使用される表現及び専門用語、並びに要約書は、説明の目的のものであり、限定するものとみなされるべきではないことも理解されるべきである。

このように、本開示が基づく概念は、本発明のいくつかの目的を実行するために、他の構造、方法及びシステムの設計に基礎として容易に使用され得ることを当業者は理解されたい。したがって、特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、このような等価構造を包含するものとみなされることが重要である。

リステリア菌ワクチン株から分泌されたＬＳＡ１融合タンパク質の概略図である。合成ＬＳＡ１コード配列が、アミノ末端ではＡｃｔＡＮ１００コード配列で、カルボキシ末端ではＳＬ８タグとインフレーム融合された。最小化反復配列が注目され並びにＨ−２Ｋ^ｄＴ細胞エピトープが免疫原性研究で使用される。カイト・ドーリットルのグラフが完全長構築物で示される。リステリア菌ワクチン株から分泌されたＣｅｌＴＯＳ融合タンパク質の概略図である。合成ＣｅｌＴＯＳコード配列が、アミノ末端ではＡｃｔＡＮ１００コード配列で、カルボキシ末端ではＳＬ８タグでインフレーム融合された。カイト・ドーリットルのグラフが、完全長構築物で示される。リステリア菌ワクチン株から分泌されたＣＳＰ融合タンパク質の概略図である。合成ＣＳＰコード配列が、アミノ末端ではＡｃｔＡＮ１００コード配列で、カルボキシ末端ではＳＬ８タグでインフレーム融合された。最小化反復配列が注目される。免疫原性研究で使用されるＨ−２Ｋ^ｄＴ細胞エピトープ及びヒト免疫学研究からのＴ^＊エピトープ領域が示される。カイト・ドーリットルのグラフが、完全長構築物で示される。リステリア菌ワクチン株から分泌されたＴＲＡＰ融合タンパク質の概略図である。合成ＴＲＡＰコード配列が、アミノ末端ではＡｃｔＡＮ１００コード配列と、カルボキシ末端ではＳＬ８タグでインフレーム融合された。カイト・ドーリットルのグラフが、完全長構築物で示される。感染したマウスの樹状細胞からのＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、及びＣＳＰ構築物のＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ活性化プロファイルを示す。図１〜３に示される構築物が、ＳＩＮＦＥＫＬ提示及びβ−ガラクトシダーゼ活性化、インビトロＴ細胞活性化の測定に関してテストされた。最上部パネルは、生弱毒化リステリア菌株背景におけるワクチン候補である。底部パネルは、ＫＢＭＡリステリア菌株背景におけるワクチン候補である。最も有効なアクチベータは、完全長ＬＳＡ１構築物、完全長ＣｅｌＴＯＳ構築物、及びａａ１−２２４を含有するＣＳＰ構築物（図１〜３）であった。感染したマウスの樹状細胞からのＴＲＡＰ構築物及び二価ワクチン菌株のＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ活性化プロファイルを示す。最上部パネルは、ＴＲＡＰ構築物（図４）がＳＩＮＦＥＫＬ提示及びβ−ガラクトシダーゼ活性化に関してテストされたものである。最も有効なアクチベータはＴＲＡＰ（２４−４９７）であった。底部パネルは、二価ワクチン構築物が、Ｂ３Ｚ活性化に関して確認されたものである。候補Ｌｍワクチン株で感染されたＤＣ２．４細胞中のコード化マラリア抗原（ＣＳＰ、ＬＳＡ１、及びＣｅｌＴＯＳ）の発現及び分泌を示す。左側パネルは、完全長抗原及び高発現の対照及び低発現の対照であり、右側パネルは、欠失した疎水性領域を有する抗原サブ断片を示す。ゲル記号は、（^＊）がマラリア抗原であり、（＞）が高抗原発現対照であり、（≫）が低抗原発現対照である。赤色のテキストで太字にされた菌株（ＢＨ２２０２、ＢＨ２２００、及びＢＨ２２１０）は、高発現のマラリア抗原である。Ｌｍワクチン菌種で感染されたＤＣ２．４細胞中のコード化マラリア抗原（ＴＲＡＰ及び二価の候補）の発現及び分泌を示す。左側パネルは、様々なＴＲＡＰワクチン構築物の発現であり、右側パネルは、別の遺伝子座（底部右側で表中に記されたｔＲＮＡ^Ａｒｇ又はｃｏｍＫ）からの単一の抗原を発現する候補二価株からの発現を示す。ＤＣ２．４細胞中の候補二価ワクチン及び三価ワクチン候補の発現及び分泌を示す。融合タンパク質として２つの抗原（Ａｇ２−ＣＳＰ又はＣＳＰ−Ａｇ２）を発現する二価株からの発現（レーン３及び４）、又は１つのゲノム遺伝子座でのＡｇ２−ＣＳＰ又はＣＳＰ−Ａｇ２融合タンパク質と別の遺伝子座からのＬＳＡ−１の発現との組み合わせをコード化する三価株からの発現（レーン５及び６）を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクチン株候補の一次サロゲート免疫原性を示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、それぞれのワクチン株の５×１０^６ｃｆｕ（コロニー形成単位）をＩＶでワクチン接種した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞免疫能を、一次応答のピークである７日目に細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）又はＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。（Ａ）最上部は、ＴＲＡＰに関するワクチン菌株を示し、底部は、非刺激の（左）及び刺激された（右）、ＩＣＳによって測定された各菌株に関する脾臓ＳＬ８免疫原性を示す。（Ｂ）最上部は、ＣｅｌＴＯＳを陽性対照として用いる、ＴＲＡＰに関するワクチン株を示し、底部は、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された、非刺激の（左）及び刺激された（右）、各菌株に関する脾臓ＳＬ８免疫原性を示す。ＣＳＰ−又はＬＳＡ−１特異的Ｔ細胞応答が、一次応答のピークで、ＩＣＳにより脾臓及び肝臓において決定されたことを示す。最上部パネルは、脾臓及び肝臓におけるＣＳ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、底部パネルは、脾臓及び肝臓におけるＬＳＡ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。ＣＳＰ−又はＬＳＡ−１特異的Ｔ細胞応答が、一次応答及び二次応答のピークで、ＩＣＳにより脾臓及び肝臓において決定されたことを示す。肝臓Ｔ細胞応答は、抗原提示細胞としてのＰ８１５細胞の存在下又は不在下で決定された。最上部パネルは、脾臓及び肝臓におけるＣＳ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、底部パネルは、脾臓及び肝臓におけるＬＳＡ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの１回又は２回のワクチン接種後のＣｅｌＴＯＳ特異的Ｔ細胞応答を示す。ＣｅｌＴＯＳ特異的Ｔ細胞応答は、一次及び二次応答のピークで、ＩＣＳによって脾臓及び肝臓において決定された。肝臓Ｔ細胞応答は、抗原提示細胞としてのＥＬ−４細胞の存在下又は不在下で決定された。左側パネルは、脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、右側パネルは、肝臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。Ｌｍ−ｐｆＡｇ一価及び二価ワクチン株の免疫原性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＣＳタンパク質（ＢＨ２２２４）又はＬＳＡ−１（ＢＨ２２１４）のいずれかをコード化する一価Ｌｍワクチン株若しくはＣＳＰ及びＬＳＡ−１（ＢＨ２３７０）の双方をコード化する二価ワクチン株の２×１０^６ｃｆｕをＩＶで一回ワクチン接種した。（Ａ）は、ＣＳに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、（Ｂ）は、ＬＳＡ−１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｌｍ−ｐｆＡｇ一価及び三価ワクチン株の免疫原性を示す。最上部パネルは、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＣＳタンパク質（ＢＨ２２２４）又はＬＳＡ−１（ＢＨ２２１４）のいずれかをコード化する一価Ｌｍワクチン株若しくはＣＳＰ、ＬＳＡ−１、及びＣｅｌＴＯＳ（ＢＨ２４４８）をコード化する三価ワクチン菌株の２×１０^６ｃｆｕをＩＶで一回ワクチン接種したものを示す。底部パネルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣｅｌＴＯＳ（ＢＨ２２１６）をコード化する一価Ｌｍワクチン菌株又はＣＳＰ、ＬＳＡ−１、及びＣｅｌＴＯＳ（ＢＨ２４４８）をコード化する三価ワクチン株の２×１０^６ｃｆｕをＩＶで一回ワクチン接種したものを示す。

本発明は、ヒト又は動物の疾患を引き起こすプラスモジウム種から誘導された１つ以上のＴ−細胞抗原細菌をコード化かつ発現する細菌を用いて、予防療法又は免疫療法の送達のための組成物及び方法に関する。

本発明は、以下の記載又は図面における説明で記述された構築物の詳細並びに構成成分の配置へのその用途に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、記載されたものに加えての実施形態で可能であり、並びに様々な方法で実践かつ実行されることが可能である。更に、本明細書で使用される表現及び専門用語、並びに要約書は、説明の目的のものであり、限定するものとみなされるべきではないことが理解されるべきである。

このように、本開示が基づく概念は、本発明のいくつかの目的を実行するために、他の構造、方法及びシステムの設計のために基礎として容易に使用され得ることを当業者は理解されたい。したがって、特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、このような等価構造を包含するものとみなされることが重要である。
１．用語の定義

遺伝子における突然変異、又は遺伝子を含む細菌における突然変異を示すよう使用される略語は、以下のようである。例えば、略語「Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡ」とは、ａｃｔＡ遺伝子の一部又は全てが欠失されたことを意味する。デルタ記号（Δ）は欠失を意味する。上付きマイナス記号を含む略語（ＬｉｓｔｅｒｉａＡｃｔＡ⁻）は、例えば、欠失、点変異、又はフレームシフト変異によってａｃｔＡ遺伝子が突然変異されたことを意味するが、突然変異のこれらの種類に限定されない。

ヒト、哺乳類、哺乳類被験体、動物、獣医学被験体、プラセボ被験体、研究被験体、実験被験体、細胞、組織、臓器、又は生物学的液体に適用されるような「投与」とは、限定されるものではないが、被験体、細胞、組織、臓器、又は生物学的液体などへの外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬製剤、治療薬剤、診断薬剤、又は組成物の接触を指す。「投与」とは、例えば、治療的、薬物動態学的、診断的、研究、プラセボ、及び実験的方法も指す。細胞の治療は、細胞への試薬の接触、並びに液体が細胞に接触している中での液体への試薬の接触を包含する。「投与」はまた、例えば、試薬、診断薬、結合組成物、又は別の細胞による、細胞のインビトロ又はエクスビボ治療も包含する。

リガンド及び受容体に関して用いられる「作動薬」は、受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体、又は試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の作動薬は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのムテインは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド疑似体、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を疑似する小分子、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含する。

リガンド及び受容体に関して用いられる「拮抗薬」は、受容体を阻害し、それに抵抗し、ダウンレギュレートし、及び／又はそれを脱感作する分子、分子の組み合わせ、又は複合体を含む。「拮抗薬」は、受容体の構成活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成活性は、リガンド／受容体相互作用の不在下でのマニフェストのようなものである。「拮抗薬」はまた、受容体の刺激された（又は調節された）活性を阻害又は抑制する任意の試薬も包含する。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ受容体の拮抗薬としては、いかなる限定も加えるものではないが、リガンド（ＧＭ−ＣＳ）に結合しかつそれが受容体に結合することを抑制する抗体、又は受容体に結合しかつリガンドが受容体に結合することを抑制する抗体、若しくは抗体が不活性立体配座において受容体をロックする場所が挙げられる。

本明細書で使用する場合、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関しての「類似体」又は「誘導体」とは、元のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と同様な又は同一な機能を有するが、元のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と同様な又は同一のアミノ酸配列又は構造を含む必要はない、別のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。同類体は、以下の少なくとも１つを満たすことが好ましく、（ａ）元のアミノ酸配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤であること、（ｂ）ストリンジェントな条件下で、元のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質性薬剤、並びに（ｃ）元のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質性薬剤である。

「抗原提示細胞」（ＡＰＣｓ）は、Ｔ細胞に抗原を提示するために用いられる免疫系の細胞である。ＡＰＣｓとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、周縁クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞が挙げられる。樹状細胞は、少なくとも２つの系列で発生する。第１の系列は、ｐｒｅ−ＤＣ１、ミエロイドＤＣ１、及び成熟型ＤＣ１を包含する。第２の系列は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻初期前駆多能性細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ４^＋ＩＬ−３Ｒα^＋ｐｒｏ−ＤＣ２細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻形質球様ｐｒｅ−ＤＣ細胞、ヒトリンパ系ＤＣ２形質球様細胞由来ＤＣ２、及び成熟型ＤＣ２sを包含する。

「弱毒化」及び「弱毒化された」は、宿主に対して毒性を低減するよう変性された、細菌、ウィルス、病原体、感染性生物、プリオン、腫瘍細胞、感染性生物中の遺伝子などを包含する。宿主は、ヒト又は動物宿主、又は臓器、組織、又は細胞であり得る。非限定的例を挙げると、細菌は、宿主細胞への結合を低減するために、1つの宿主細胞から別の宿主細胞への伝染を低減するために、細胞外増殖を低減するために、又は宿主細胞における細胞内増殖を低減するために弱毒化され得る。弱毒化は、例えば、毒性の証拠又は指標、ＬＤ_５０、臓器から除去される速度、又は競合指標（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈら著（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６９：５９５３〜５９５７を参照）を測定することによって評価され得る。一般的に、弱毒化は、少なくとも２５％まで、より一般に少なくとも５０％まで、もっとも一般的に少なくとも１００％（２倍）まで；標準的に少なくとも５倍まで、より標準的に少なくとも１０倍まで、もっとも標準的に少なくとも５０倍まで；頻繁には少なくとも１００倍まで、より頻繁には少なくとも５００倍まで、及びもっとも頻繁には少なくとも１０００倍まで；通常で少なくとも５０００倍まで、より通常で少なくとも１０，０００倍まで、及びもっとも通常で少なくとも５０，０００倍まで；並びにもっとも頻繁には１００，０００倍までのＬＤ_５０での増加及び／又は除去の速度での増加をもたらす。

「弱毒化遺伝子」は、宿主への毒性、病理、又は病原性、宿主における増殖、若しくは宿主内の生存を仲介する遺伝子を包含し、ここにおいて遺伝子は、毒性、病理、又は病原性を緩和し、低減し、又は排除する方法で変異されている。この低減又は排除は、変異された遺伝子によって仲介される病原性又は毒性を、非変異（又は親）の遺伝子によって仲介されるものと比較することによって評価され得る。「変異遺伝子」は、遺伝子の調節領域、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、又はこれらの任意の組み合わせにおける欠失、点変異、及びフレームシフト変異を包含する。

「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の双方に適用する。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体とは、同一のアミノ酸配列、又は１つ以上の保存的置換を有するアミノ酸をコード化する核酸を指す。保存的置換の例は、以下の基の１つにおけるアミノ酸の同一の基の別のアミノ酸への交換である（Ｌｅｅらにより提示された米国特許第５，７６７，０６３号；Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２）。
（１）
疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ；
（２）
中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）
塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）
鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）
芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；並びに
（７）
小アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ

「有効量」は、限定されないが、医学的状態又は疾患の症状又は徴候を軽減し、逆転させ、緩和し、防止し、又は診断することが可能な量を包含する。別に明確に記載されない限り、本明細書の内容によって、「有効量」は、病状を軽減するのに十分な最小量に限定されない。

「細胞外液」は、例えば、血清、血漿、血液、腸液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆汁、汗、糞便、及び尿を包含する。「細胞外液」は、例えば、全血又は凝固血などのコロイド又は懸濁液を含むことができる。

ポリペプチドに関する用語「断片」とは、より大きなポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも７０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２００個の隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列、又は少なくとも２５０個の隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを包含する。

「遺伝子」とは、オリゴペプチド又はポリペプチドをコード化する核酸配列を指す。このオリゴペプチド又はポリペプチドは、生物学的に活性、抗原的に活性、生物学的不活性、又は抗原的に不活性などであり得る。用語「遺伝子」は、例えば、特異的オリゴペプチド又はポリペプチドをコード化する、開かれた読み枠（ＯＲＦｓ）の和；ＯＲＦｓに加えてイントロンをコード化する核酸の和；ＯＲＦｓに加えて操作可能に結合されたプロモーター（複数可）の和；ＯＲＦＳ及び操作可能に結合されたプロモーター（複数可）並びに任意のイントロンの和；ＯＲＦＳ及び操作可能に結合されたプロモーター（複数可）、イントロン（複数可）、並びにプロモーター（複数可）、更にエンハンサー（複数可）などの他の調節要素の和である。ある実施形態では、「遺伝子」は、遺伝子の発現を調節するためにシスであることが必要とされる任意の配列を包含する。用語「遺伝子」は、抗原若しくはペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の抗原的に活性な断片を包含するペプチドをコード化する核酸も指す。用語「遺伝子」は、コード化されたペプチド又はタンパク質がいずれかの生物学的活性を有すること、又はペプチド又はタンパク質が抗原的に活性であることを意味することが必ずしも必要ではない。発現不能な配列をコード化する核酸配列は、一般的に偽遺伝子と考えられる。用語「遺伝子」はまた、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はリボザイムなどのリボ核酸をコード化する核酸配列を包含する。

リステリア菌などの細菌の「増殖」は、限定されないが、コロニー形成、複製、タンパク質含量での増加、及び／又は脂質含量での増加に関する細菌生理学及び遺伝子の機能を包含する。別に明確に特記されない限り又は本明細書の内容によって、リステリア菌の増殖は、宿主細胞の外部の細菌の増殖、及び宿主細胞の内部の増殖も包含する。遺伝子に関連する増殖としては、いかなる限定も意味するものではないが、エネルギー生産（例えば、糖分解、クレブス回路、シトクロム）、アミノ酸、糖、脂質、鉱物、プリン、及びピリミジンの同化作用及び／又は異化作用、栄養輸送、転写、翻訳、及び／又は複製を仲介するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、リステリア細菌の「増殖」とは、リステリア細菌の細胞内増殖、すなわち、哺乳類細胞などの宿主細胞の内部の増殖を指す。リステリア細菌の細胞内増殖は、光学顕微鏡又はコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定され得るが、増殖は測定の任意の技術によって限定されるべきではない。リステリア菌抗原、リステリア菌核酸配列、又はリステリア細菌に特異的な脂質などの生化学的パラメータは、増殖を評価するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、増殖を仲介する遺伝子は、細胞内増殖を特異的に仲介する遺伝子である。いくつかの実施形態では、細胞内増殖を特異的に仲介する遺伝子は、限定されるものではないが、遺伝子の不活性化が細胞内増殖の速度を低減するが、検出可能に、実質的に、又は明らかに細胞外増殖（培養液中の増殖）の速度を低減しないような遺伝子、又は遺伝子の不活性化が、細胞内増殖の速度を、それが細胞外増殖の速度を低減するよりも大幅に低減するような遺伝子を包含する。非限定的例を挙げると、いくつかの実施形態では、細胞内増殖の速度を、細胞外増殖の速度を低減するよりも大幅に低減するような遺伝子は、不活性化が細胞内増殖を正常値又は最大値の５０％未満まで低減するが、細胞外増殖を最大値のわずか１〜５％、５〜１０％、又は１０〜１５％まで低減するにすぎない状態を包含する。ある態様では、本発明は、細胞内増殖で弱毒化されているが、細胞外増殖で弱毒化されていないリステリア菌、細胞内増殖で弱毒化されずかつ細胞外増殖で弱毒化されていないリステリア菌、並びに細胞内増殖で弱毒化されていないが細胞外増殖で弱毒化されたリステリア菌を包含する。

「ヒドロパシー分析」とは、カイト・ドーリットルの方法：「ＡＳｉｍｐｌｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｉｓｐｌａｙｉｎｇｔｈｅＨｙｄｒｏｐａｔｈｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆａＰｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１９８２）１０５−１３２によるポリペプチド配列の分析を指す。この方法では、それぞれのアミノ酸に、４．６〜−４．６の間の疎水性スコアが提供される。４．６のスコアは、もっとも疎水性であり、−４．６のスコアはもっとも親水性である。次いでウィンドウサイズが設定される。ウィンドウサイズは、アミノ酸の数であり、そのアミノ酸の疎水性スコアが平均化されてウィンドウの第１のアミノ酸に配分される。計算は、アミノ酸の第１のウィンドウで開始し、そのウィンドウにおける全ての疎水性スコアの平均を計算する。次いで、ウィンドウが１つのアミノ酸の下に移動し、第２のウィンドウにおける全ての疎水性スコアの平均を計算する。このパターンがタンパク質の末端まで続けられ、各ウィンドウに関する平均スコアを計算し、それをウィンドウの第１のアミノ酸に配分する。次いで、この平均値がグラフにプロットされる。ｙ軸は疎水性スコアを表わし、ｘ軸はウィンドウ数を表わす。以下の疎水性スコアは、２０個の一般的なアミノ酸のために使用される。
Ａｒｇ：−４．５Ｓｅｒ：−０．８Ｌｙｓ：−３．９
Ｔｈｒ：−０．７Ａｓｎ：−３．５Ｇｌｙ：−０．４
Ａｓｐ：−３．５Ａｌａ：１．８Ｇｌｎ：−３．５
Ｍｅｔ：１．９Ｇｌｕ：−３．５Ｃｙｓ：２．５
Ｈｉｓ：−３．２Ｐｈｅ：２．８Ｐｒｏ：−１．６
Ｌｅｕ：３．８Ｔｙｒ：−１．３Ｖａｌ：４．２
Ｔｒｐ：−０．９Ｉｌｅ：４．５

「標識付け」される組成物は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、同位体的、又は化学的方法によって、直接的又は間接的のいずれかで検出可能である。例えば、有用な標識としては、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光染料、高電子密度試薬、基質、又は酵素（例えば、酵素結合免疫測定法でもちいられるような）、若しくはフルオレット（例えば、Ｒｏｚｉｎｏｖ及びＮｏｌａｎ著（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照）が挙げられる。

「リガンド」とは、受容体の作動薬又は拮抗薬である、小分子、ペプチド、ポリペプチド、若しくは膜関連又は膜結合分子を指す。「リガンド」はまた、作動薬又は拮抗薬ではなく、かつ作動薬又は拮抗薬特性を有さない結合剤を包含する。慣例では、リガンドが第１の細胞上に膜結合される場所では、受容体は通常第２の細胞上に発生する。この第２の細胞は、第１の細胞と同じ識別（同一名）を有してもよく、第１の細胞と異なる識別（異なる名）を有してもよい。リガンド又は受容体は、完全に細胞内にあり得る、すなわち、これは細胞質ゾル、核、又はいくつかの他の細胞内区画内に存在し得る。リガンド又は受容体は、その場所を変更する、すなわち、細胞内区画から原形質膜の外面に変更する場合がある。リガンド及び受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と名づけられる。リガンド及び受容体がシグナル伝達経路に関与する場所では、リガンドはシグナル伝達経路の上流位置に発生し、受容体はシグナル伝達経路の下流位置に発生する。

「核酸」とは、単鎖、二重鎖形、又は多重鎖形のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。核酸の非限定的例は、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドである。特定の核酸配列はまた、「対立遺伝子変異体」及び「スプライス変異体」も包含する。

プロモーター及びｍＲＮＡをコード化する核酸に関する「操作可能に結合された」とは、このプロモーターが、その核酸の転写を開始するために用いられ得ることを意味する。

用語「パーセント配列同一性」及び「％配列同一性」とは、２つ以上のアミノ酸又は核酸配列の比較又はアラインメントによって見出される配列類似性のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、配列を整列化させて、２つの整列化された配列間での整合の正確な数を計測し、より短い配列の長さで割って、結果を１００で乗じることによって、２つの分子間の配列情報の直接的比較で決定され得る。パーセント同一性を計算するためのアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索アルゴリズムである（例えば、Ｋａｎｎ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ著（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ４８：３６７−３７６；Ａｒｓｌａｎら著（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：３２７−３３７を参照）。

ポリペプチドに関して使用される場合、「精製された」及び「単離された」とは、このポリペプチドが、それが本質的に結びついている他の生物学的マクロ分子の実質的に不在下で存在することを意味する。本明細書で使用される場合、用語「精製された」とは、同定されたポリペプチドが、存在するポリペプチドの重量で、頻繁に少なくとも５０％を占める、より頻繁には少なくとも６０％を占める、典型的には少なくとも７０％を占める、より典型的には少なくとも７５％を占める、もっとも典型的には少なくとも８０％を占める、通常では少なくとも８５％を占める、より通常では少なくとも９０％を占める、もっとも通常では少なくとも９５％を占める、及び一般的には少なくとも９８％、又はそれ以上を占めることを意味する。水、緩衝液、塩、洗浄剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定化剤（アルブミンなどの添加されたタンパク質も含める）、及び賦形剤、並びに１０００未満の分子量を有する分子の重量は、一般的にポリペプチド純度の決定では用いられない。例えば、Ｃｏｖａｃｃｉらにより提示された米国特許第６，０９０，６１１号の純度の説明を参照されたい。

「ペプチド」とは、アミノ酸の短い配列を指し、ここではアミノ酸はペプチド結合によって互いに結合されている。ペプチドは遊離して生じても、マクロ分子、脂質、オリゴ糖又は多糖類、及び／又はポリペプチドなどの別の部分に結合されて生じてもよい。ペプチドがポリペプチド鎖に組み込まれている場所では、用語「ペプチド」は、アミノ酸の短い配列を特定的に指すよう用いられることもできる。「ペプチド」は、ペプチド結合又はいくつかの結合の他の型によって互いに結合され得る。ペプチドは、長さが少なくとも２個のアミノ酸であり、一般的には長さが約２５個未満のアミノ酸であり、ここで最大長は、カスタム又はコンテキストの関数である。用語「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は、互換的に使用され得る。

「タンパク質」とは、ポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を一般的に指す。タンパク質はまた、ポリペプチドの三次元構造も指す。「変性タンパク質」とは、部分的に変性されたポリペプチドで、いくつかの残存する三次元構造を有するもの、あるいは、本質的にランダムな三次元構造、すなわち、全体として変性されたものを指す。本発明は、例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、脱アミド化、異性化、シグナル配列又はリーダー配列処理における開裂点、共有結合又は非共有結合補助因子、酸化変異体などを伴うポリペプチド変異体の試薬及びポリペプチド変異体を用いる方法を包含する。ジスルフィド結合されたタンパク質の形成が記載されている（例えば、Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ及びＲａｉｎｅｓ著（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（１９９５）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照）。

「組換え」は、例えば核酸、細胞、動物、ウィルス、プラスミド、ベクターなどに関して使用される場合、外因性の非天然型核酸、天然型核酸の変性物の導入による、又は組換え核酸、細胞、ウィルス、プラスミド、又はベクターからの全体又は一部の誘導による修飾を示す。組換えタンパク質は、例えば、組換え核酸、ウィルス、プラスミド、ベクターなどから誘導されたタンパク質を指す。「組換え細菌」は、ゲノムが組換え法、例えば突然変異、欠失、挿入、及び／又は再配置によって操作される細菌を包含する。「組換え細菌」はまた、組換えゲノム外核酸、例えばプラスミド又は第二染色体を含むよう修飾された細菌、又は存在するゲノム外核酸が変更されている細菌も包含する。

「サンプル」とは、ヒト、動物、プラセボからのサンプル、若しくは研究サンプル、例えば細胞、組織、臓器、液体、気体、エアゾール、スラリー、コロイド、又は凝固材料を指す。「サンプル」は、例えば、ヒト又は動物から除去されることなく、インビボで試験され得るか、又はインビトロで試験され得る。サンプルは、処理（例えば、組織学的方法による）の後に試験され得る。「サンプル」はまた、体液又は組織サンプルを含む細胞若しくは体液又は組織サンプルから分離された細胞を指す。「サンプル」はまた、ヒト又は動物から新規に採取された細胞、組織、臓器、又は体液、若しくは処理されるか保存される細胞、組織、臓器、又は体液も指すことができる。

「選択可能なマーカー」は、それが選択可能なマーカーを含有する細胞を又はその細胞に対して選択することを可能にする核酸を包含する。選択可能なマーカーの例としては、限定されるものではないが、例えば、（１）他の毒性化合物に対して耐性をもたらす産物（例えば抗生物質）をコード化する核酸、又はその他の無害な化合物（例えば、ショ糖）に対する感受性をコード化する核酸、（２）受容細胞において他の方法で欠如する産物をコード化する核酸（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）、（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコード化する核酸、（４）容易に同定され得る産物をコード化する核酸（例えば、β−グルコシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細胞表面タンパク質、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグなどの表現型マーカー）、（５）ハイブリダイゼーション技術、例えばＰＣＲ又は分子標識によって同定され得る核酸、が挙げられる。

「特異的に」又は「選択的に」結合するとは、リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原、又は他の結合対（例えば、サイトカイン受容体に対するサイトカイン）に関して使用される場合、タンパク質の異種集団及び他の生物製剤におけるタンパク質の存在の決定的要因である結合反応を指す。したがって、指定条件下では、特定化されたリガンドは特定の受容体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に著しい量では結合しない。特異的結合はまた、例えば、意図された方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体、又は抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、任意の他の結合化合物の親和性よりも頻繁には少なくとも２５％を超える、より頻繁には少なくとも５０％を超える、もっとも頻繁には少なくとも２０倍を超える、及びもっとも一般的には少なくとも１００倍を超える親和性で、その標的に結合することも意味することが可能である。

典型的実施形態において、抗体は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｍｕｎｓｅｎら著（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）によって決定されたような、約１０^９リットル／モルを超える親和性を有するだろう。一部の結合化合物は、例えば、抗体が、その抗原に、レクチンに、抗体のオリゴ糖を経由して結合する、及び／又は抗体のＦｃ領域を経由してＦｃ受容体に特異的に結合するなど、１つ以上の標的に特異的に結合することができる。

細菌の「伝染」は、「細胞間伝染」、すなわち、例えば、ベヒクルによって仲介されるような、第１の宿主細胞から第２の宿主細胞への細菌の伝搬を包含する。伝染に関する機能としては、アクチンテールの形成、偽足様伸張部の形成、及び二重膜化空胞の形成が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「被験体」とは、ヒト又は非ヒト生物体を指す。したがって、本明細書で記載される方法及び組成物は、ヒト疾患及び獣医学疾患の双方に適用可能である。ある実施形態では、被験体は「患者」、すなわち、疾患又は病状に対して医療ケアを受けている生体ヒトである。これは、病理の徴候に関して検査されている確定された病気がない人も含む。既発のプラスモジウム感染を有する被験体が好ましい。

レコンビナーゼの「標的部位」とは、レコンビナーゼによって識別され、結合され、及び／又は影響を受ける核酸配列又は領域である（例えば、Ｇｒａｈａｍらにより提示された米国特許第６，３７９，９４３号；Ｓｍｉｔｈ及びＴｈｏｒｐｅ著（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７；ＧｒｏｔｈａｎｄＣａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら著（１９９８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：３９１−４０６を参照）。

「治療的有効量」とは、患者の有益性を示す、すなわち、治療される症状又は病状の低減、抑制、又は軽減を生じるのに十分である試薬又は医薬組成物の量として定義される。薬剤又は医薬組成物が、診断的薬剤を含む場合、「診断的有効量」とは、シグナル、画像、又は他の診断的パラメータを作成するために十分な量として定義される。医薬品製剤の有効量は、個人の感受性の程度、年齢、性、及び個人の体重、並びに個人の特異体質応答（例えば、Ｎｅｔｔｉらにより提示された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）などの因子により変化するであろう。

「治療」又は「治療する」（病状又は疾患に対して）とは、好ましくは臨床的結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、疾患に対する有益な又は所望の結果とは、限定されるものではないが、以下の１つ以上が挙げられ、疾患に関する状態を改善すること、疾患を治癒すること、疾患の重篤度を緩和すること、疾患の進行を遅延させること、疾患に関する１つ以上の症状を軽減すること、疾患に冒された人の生存の質を増加させること、及び／又は生存を延長させることである。同様に、本発明の目的のために、病状に対する有益な又は所望の結果としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ、病状を改善すること、病状を治癒すること、病状の重篤度を緩和すること、病状の進行を遅延させること、病状に関する１つ以上の症状を軽減すること、病状に冒された人の生存の質を増加させること、及び／又は生存を延長させることである。

「ワクチン」は、予防ワクチンを包含する。ワクチンはまた、治療用ワクチン、例えば、このワクチンによってもたらされる抗原又はエピトープに関連する病状又は疾患を含む哺乳類に投与されるワクチンも包含する。
２．プラスモジウム抗原

以下の実施例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原配列の使用を扱うものであるが、これは事実上例示に過ぎず、他のプラスモジウム種が、本明細書に記載される方法及び組成物において使用することも可能である。

本明細書で使用される場合、用語「野生型プラスモジウム抗原」とは、組換え体とは対照的に天然供給源から得られる配列を含むアミノ酸配列をコード化するポリペプチドを指す。以下の配列は、代表的野生型と本発明において使用を見出す誘導された配列（この例は本明細書に記載されている）との間を識別するために役立つ。

野生型Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣｅｌＴＯＳ配列（１８２ａａ）：
＞ｇｉ｜１２４８０５８９８｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１３５０５６９．１｜ＣｅｌＴＯＳ、推定［Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ３Ｄ７］
MNALRRLPVICSFLVFLVFSNVLCFRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQS
MNKIGDDLAETISNELVSVLQKNSPTFLESSFDIKSEVKKHAKSMLKELIKVGLPSFENL
VAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDF
FD (配列番号１８)

Ｌｍ発現（野生型配列のａａ２５−１８２）に最適化された誘導体コドン:
FRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNELVSVLQKNS
PTFLESSFDIKSEVKKHAKSMLKELIKVGLPSFENLVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTS
LFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD
(配列番号１９)

ワクチン株に関するＣｅｌｔｏｓ配列（合成配列の１−１５８）:
FRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNELVSVLQKNS
PTFLESSFDIKSEVKKHAKSMLKELIKVGLPSFENLVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTS
LFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD
(配列番号１１)

野生型Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳＰ配列（３９７ａａ）:
＞ｇｉ｜１２４５０４７５９｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１３５１１２２．１｜スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質［Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ３Ｄ７］MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQE
NWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVDP
NANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
NANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
NANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANAN
SAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDY
ANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN (配列番号２０)

Ｌｍ発現に最適化された誘導体コドン（ａａ２１−１４０、最小化反復配列、野生型の２７３−３９７）（全体で２３５ａａ）
QEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQENWYSLKKNSRSLGENDDGNN
EDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPNKNNQGNGQG
HNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGI
QVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN
(配列番号２１)

Ｌｍワクチン菌株に関するＣＳＰ配列（合成配列の１−２２４）:
QEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQENWYSLKKNSRSLGENDDGNN
EDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPNKNNQGNGQG
HNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGI
QVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIG (配列番号９)

野生型Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＬＳＡ１配列（１９０９ａａ）：
>gi|9916|emb|CAA39663.1|肝臓ステージ抗原［Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ］
MKHILYISFYFILVNLLIFHINGKIIKNSEKDEIIKSNLRSGSSNSRNRINEEKHEKKHVLSHNSYEKTK
NNENNKFFDKDKELTMSNVKNVSQTNFKSLLRNLGVSENIFLKENKLNKEGKLIEHIINDDDDKKKYIKG
QDENRQEDLEEKAAKETLQGQQSDLEQERLAKEKLQEQQSDSEQERLAKEKLQEQQSDLEQERLAKEKLQ
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QDNRGNSRDSKEISIIEKTNRESITTNVEGRRDIHKGHLEEKKDGSIKPEQKEDKSADIQNHTLETVNIS
DVNDFQISKYEDEISAEYDDSLIDEEEDDEDLDEFKPIVQYDNFQDEENIGIYKELEDLIEKNENLDDLD
EGIEKSSEELSEEKIKKGKKYEKTKDNNFKPNDKSLYDEHIKKYKNDKQVNKEKEKFIKSLFHIFDGDNE
ILQIVDELSEDITKYFMKL
(配列番号２２)

Ｌｍ配列に最適化された誘導体コドン（ａａ２８−１５４、最小化ＬＳＡ１反復配列、野生型配列の１６３０−１９０９）（全体で４７５ａａ）:
NSEKDEIIKSNLRSGSSNSRNRINEEKHEKKHVLSHNSYEKTKNNENNKFFDKDKELTMS
NVKNVSQTNFKSLLRNLGVSENIFLKENKLNKEGKLIEHIINDDDDKKKYIKGQDENRQE
DLEEKAAEQQSDLEQERLAKEKLQEQQSDLEQERLAKEKLQERLAKEKLQEQQRDLEQER
LAKEKLQEQQRDLEQRKADTKKNLERKKEHGDVLAEDLYGRLEIPAIELPSENERGYYIP
HQSSLPQDNRGNSRDSKEISIIEKTNRESITTNVEGRRDIHKGHLEEKKDGSIKPEQKED
KSADIQNHTLETVNISDVNDFQISKYEDEISAEYDDSLIDEEEDDEDLDEFKPIVQYDNF
QDEENIGIYKELEDLIEKNENLDDLDEGIEKSSEELSEEKIKKGKKYEKTKDNNFKPNDK
SLYDEHIKKYKNDKQVNKEKEKFIKSLFHIFDGDNEILQIVDELSEDITKYFMKL
(配列番号２３)

Ｌｍワクチン株に関するＬＳＡ１配列（合成配列の１−４７５）:
NSEKDEIIKSNLRSGSSNSRNRINEEKHEKKHVLSHNSYEKTKNNENNKFFDKDKELTMS
NVKNVSQTNFKSLLRNLGVSENIFLKENKLNKEGKLIEHIINDDDDKKKYIKGQDENRQE
DLEEKAAEQQSDLEQERLAKEKLQEQQSDLEQERLAKEKLQERLAKEKLQEQQRDLEQER
LAKEKLQEQQRDLEQRKADTKKNLERKKEHGDVLAEDLYGRLEIPAIELPSENERGYYIP
HQSSLPQDNRGNSRDSKEISIIEKTNRESITTNVEGRRDIHKGHLEEKKDGSIKPEQKED
KSADIQNHTLETVNISDVNDFQISKYEDEISAEYDDSLIDEEEDDEDLDEFKPIVQYDNF
QDEENIGIYKELEDLIEKNENLDDLDEGIEKSSEELSEEKIKKGKKYEKTKDNNFKPNDK
SLYDEHIKKYKNDKQVNKEKEKFIKSLFHIFDGDNEILQIVDELSEDITKYFMKL
(配列番号１３)

野生型Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＴＲＡＰ配列（５５９ａａ）:
＞ｇｉ｜１００４８２６１｜ｇｂ｜ＡＡＧ１２３２８．１｜ＡＦ２４９７３９＿１スポロゾイト表面タンパク質２［Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ］
MNHLGNVKYLVIVFLIFFDLFLVNGRDVQNNIVDEIKYREEVCNDEVDLYLLMDCSGSIR
RHNWVNHAVPLAMKLIQQLNLNESAIHLYVNIFSNNAKEIIRLHSDASKNKEKALIIIRS
LLSTNLPYGRTNLSDALLQVRKHLNDRINRENANQLVVILTDGIPDSIQDSLKESRKLND
RGVKIAVFGIGQGINVAFNRFLVGCHPSDGKCNLYADSAWENVKNVIGPFMKAVCVEVEK
TASCGVWDEWSPCSVTCGKGTRSRKREILHEGCTSELQEQCEEERCPPKREPLDVPDEPE
DDQPRPRGDNFAVEKPEENIIDNNPQEPSPNPEEGKGENPNGFDLDENPENPPNPDIPQQ
EPNIPEDSEKEVPSDVPKNPEDDREENFDIPKKPENKHDNQNNLPNDKSDRSIPYSPLPP
KVLDNERKQSDPQSQDNNGNRHVPNSEDRETRPHGRNNENRSYNRKYNDTPKHPEREEHE
KPDNNKKKGGSDNKYKIAGGIAGGLALLACAGLAYKFVVPGAATPYAGEPAPFDETLGEE
DKDLDEPEQFRLPEENEWN
(配列番号２４)

Ｌｍ発現に最適化された誘導体コドン（ａａ２４−５５９）（全体で５３６ａａ）:
NGRDVQNNIVDEIKYREEVCNDEVDLYLLMDCSGSIRRHNWVNHAVPLAMKLIQQLNLNE
SAIHLYVNIFSNNAKEIIRLHSDASKNKEKALIIIRSLLSTNLPYGRTNLSDALLQVRKH
LNDRINRENANQLVVILTDGIPDSIQDSLKESRKLNDRGVKIAVFGIGQGINVAFNRFLV
GCHPSDGKCNLYADSAWENVKNVIGPFMKAVCVEVEKTASCGVWDEWSPCSVTCGKGTRS
RKREILHEGCTSELQEQCEEERCPPKREPLDVPDEPEDDQPRPRGDNFAVEKPEENIIDN
NPQEPSPNPEEGKGENPNGFDLDENPENPPNPDIPQQEPNIPEDSEKEVPSDVPKNPEDD
REENFDIPKKPENKHDNQNNLPNDKSDRSIPYSPLPPKVLDNERKQSDPQSQDNNGNRHV
PNSEDRETRPHGRNNENRSYNRKYNDTPKHPEREEHEKPDNNKKKGGSDNKYKIAGGIAG
GLALLACAGLAYKFVVPGAATPYAGEPAPFDETLGEEDKDLDEPEQFRLPEENEWN
(配列番号２５)

ワクチン株に関するＴＲＡＰ配列（合成配列の１−４７４）:
NGRDVQNNIVDEIKYREEVCNDEVDLYLLMDCSGSIRRHNWVNHAVPLAMKLIQQLNLNE
SAIHLYVNIFSNNAKEIIRLHSDASKNKEKALIIIRSLLSTNLPYGRTNLSDALLQVRKH
LNDRINRENANQLVVILTDGIPDSIQDSLKESRKLNDRGVKIAVFGIGQGINVAFNRFLV
GCHPSDGKCNLYADSAWENVKNVIGPFMKAVCVEVEKTASCGVWDEWSPCSVTCGKGTRS
RKREILHEGCTSELQEQCEEERCPPKREPLDVPDEPEDDQPRPRGDNFAVEKPEENIIDN
NPQEPSPNPEEGKGENPNGFDLDENPENPPNPDIPQQEPNIPEDSEKEVPSDVPKNPEDD
REENFDIPKKPENKHDNQNNLPNDKSDRSIPYSPLPPKVLDNERKQSDPQSQDNNGNRHV
PNSEDRETRPHGRNNENRSYNRKYNDTPKHPEREEHEKPDNNKKKGGSDNKYKI
(配列番号１７)

注記したように、本明細書で使用される抗原（複数可）は、１つ以上のこのような野生型配列「由来の」配列を含むことができる。本明細で使用される場合、「由来の」とは、特定化された野生型ポリペプチドからの１つ以上の単離されたエピトープを含むポリペプチド、又は特定化された野生型ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるペプチド又はポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、野生型ポリペプチド「由来の」抗原は、野生型ポリペプチドの部分的配列（「断片」）を含む。したがって、「誘導抗原」とは、野生型ポリペプチドから得られた少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、又は少なくとも２００個のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコード化するポリペプチドを指すことができる。

この抗原は、元の（完全長）プラスモジウム抗原から得られる少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープをコード化する配列を含むことができる。公に利用可能なアルゴリズムが、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子に結合するエピトープを選択するよう用いられ得る。例えば、予測アルゴリズム「ＢＩＭＡＳ」は、ペプチド／ＨＬＡ複合体の予測半減期解離度に従って、潜在的ＨＬＡ結合エピトープをランク付けする。「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ」アルゴリズムは、一次及び二次ＨＬＡ−結合アンカー残基の存在を説明するスコアに従ってペプチドをランク付けする。双方の計算されたアルゴリズムは、既報のＨＬＡ結合エピトープへの同様な結合モチーフを有する所与のタンパク質範囲内でのアミノ酸配列に基づいて候補エピトープを採点する。他のアルゴリズムもまた、更なる生物学的試験のための候補を同定するよう用いられ得る。

抗原の誘導体もまた、それが誘導される野生型ポリペプチドの部分に対する少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、又は少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用される場合、「免疫原性」とは、抗原が抗原特異的体液性応答又はＴ−細胞応答（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋）を誘発することが可能であることを意味する。本発明のワクチン組成物における使用のための１つ以上の抗原又はその誘導体の選択は、組換え抗体（複数可）を成功裏に発現かつ分泌するための選択の細菌の能力の評価、及び／又は抗原特異的ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を開始するための組換え抗原（複数可）の能力の評価が挙げられる様々な方法で実行され得る。以下に説明されるように、特定の細菌送達ベヒクルでの使用の目的の抗原の最終選択に辿り着くために、組換え抗原（複数可）のこれら属性が、完全なワクチンプラットフォーム（選択された抗原（複数可）に関する選択された細菌発現システムを意味する）の能力と組み合わせられ、固有の免疫応答並びに組換えにより発現させた抗体（複数可）に対する抗原特異的Ｔ細胞応答の双方を誘導することが好ましい。好適な抗原の初期決定は、選択の細菌宿主（例えば、リステリア菌）によって組換えにより成功裏に発現される、かつ免疫原性である抗原（複数可）又は抗原断片（複数可）を選択することでなされ得る。

ある実施形態では、本発明の抗原は、関心の抗原（複数可）を発現するよう融合構築物の一部として用いられるリステリアＡｃｔＡタンパク質又はその断片のピーク疎水性に比較して５０％以上である少なくとも１つの疎水性の領域を欠失することによって、野生型プラスモジウム配列に由来する。好ましくは、抗原は、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性の７０％を超える疎水性の領域を有さないように修飾され、より好ましくは、抗原は、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性の９０％を超える疎水性の領域を有さないように修飾され、更にある実施形態では、抗原は、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を超える疎水性の領域を有さないように修飾され、それぞれの場合、これはカイト・ドーリットルの方法によって測定される（「ＡＳｉｍｐｌｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｉｓｐｌａｙｉｎｇｔｈｅＨｙｄｒｏｐａｔｈｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆａＰｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１９８２）１０５−１３２）。

ウェスタンブロット法における組換え抗原の発現の直接的検出は、組換えにより生成されるプラスモジウム由来抗原配列を検出する抗体を用いて、又は融合タンパク質としてプラスモジウム由来抗原で発現される非プラスモジウム由来配列（「タグ」）を検出する抗体を用いて、実行され得る。以下に記載される実施例において、抗原（複数可）は、リステリアＡｃｔＡタンパク質のＮ−末端部分との融合体として発現され、ＡｃｔＡの成熟Ｎ末端の１８個のアミノ酸に対応する合成ペプチド（ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫ（配列番号２４）に対して惹起された抗−ＡｃｔＡ抗体が、発現されたタンパク質産物を検出するよう用いられ得る。

抗原の免疫原性を試験するためのアッセイ法が本明細書に記載され、これは当該技術分野で既知である。例として、選択の細菌によって組換えで生成された抗原は、抗原のカルボキシル末端にてインフレームで配置された、８個のアミノ酸ＳＩＮＦＥＫＬ（配列番号２５）ペプチド（ＳＬ８及び卵白アルブミン_{２５７−２６４}として既知）をコード化するヌクレオチド配列を含有するよう必要に応じて構築され得る。Ｃ−末端ＳＬ８エピトープなどの組成物は、（ｉ）組換え抗原がＮ−末端からＣ−末端までその全体で発現されることを立証するために、及び（ｉｉ）インビトロ抗原提示アッセイを用いて、ＭＨＣクラスＩ経路を介して組換え抗原を提示する抗原提示細胞の能力を立証するために、サロゲートとして役立つ。このような提示アッセイは、以下記載されるように、Ｂ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ細胞系と共にクローンニングされたＣ５７ＢＬ／６−由来の樹状細胞系ＤＣ２．４を用いて実施され得る。

あるいは、又はこれに加えて、以下に記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて免疫原性がテストされ得る。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｂ細胞分泌抗原特異的抗体を計測するためにもともと開発されたが、後に様々なタスク、特に単一細胞レベルでサイトカイン生成細胞の同定及び計測に適応されたものである。適切なワクチンで接種された動物から脾臓を採取し、単離された脾臓細胞が、細菌ワクチンによって発現された１つ以上のプラスモジウム抗原由来のペプチドの存在下又は不在下で一夜インキュベートされ得る。固定された抗体は任意の分泌されたＩＦＮ−γを捕獲し、これによって、分泌されたＩＦＮ−γの後続の測定、及びワクチンに対する免疫応答の評価が可能になる。
３．細菌発現システム−「ワクチンプラットフォーム」

プラスモジウム由来抗原の送達のためのワクチンプラットフォームの選択は、有効なワクチンのための別の重要な要素である。いくつかの細菌種が、ワクチンとしての使用に開発されていて、本発明において使用されることが可能であり、これらは、フレキシナ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、単球症リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、腸炎エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）又はマイコバクテリウム種が挙げられるが、これに限定されない。このリストは、限定されることを意味しない。それぞれが、全ての表、図面及び特許請求の範囲を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれた、国際特許出願公開第ＷＯ０４／００６８３７号、同第ＷＯ０７／１０３２２５号、同第ＷＯ０７／１１７３７１号を参照されたい。ワクチン組成物で用いられる細菌ベクターは、条件的、細胞内細菌ベクターである。この細菌は、本明細書に記載されるポリペプチドを、宿主生物体における抗原−提示細胞に送達させるよう用いられ得る。本明細書に記載されるように、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、プラスモジウム由来抗原（複数可）の発現のために好ましいワクチンプラットフォームをもたらす。

弱毒化微生物及び共生微生物の双方が、ワクチン抗原用の担体として成功裏に使用されてきたが、プラスモジウム由来抗原又はその誘導体用の細菌担体は、必要に応じて弱毒化又は殺さなく代謝活性（ＫＢＭＡ）される。処方物で用いられる担体菌株の遺伝子背景、弱毒化を達成するために選択される突然変異、及び免疫原の固有特性が、惹起される免疫応答の範囲及び品質を最適化するよう調整され得る。細菌担体によって刺激される免疫応答を最適化すると考えられる一般因子としては、担体の選択；特異的な背景菌株、減衰突然変異及び弱毒化のレベル；弱毒化表現型の安定化及び最適投与量の確立が挙げられる。考えられる他の抗原関連因子としては、抗原の固有特性；発現システム、抗原表示形態及び組換え表現型の安定化；調節分子の共発現及びワクチン接種スケジュールが挙げられる。

ワクチンプラットフォームの好ましい特性は、固有の免疫応答並びに組換えにより発現させたプラスモジウム由来抗原（複数可）に対する抗原に特異的なＴ細胞応答の双方を誘導する能力である。例えば、本明細書に記載されるプラスモジウム由来抗原（複数可）を発現するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、肝臓内Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）並びにケモカイン及びサイトカインの下流カスケードを誘導する。この肝臓内免疫刺激に対する応答では、ＮＫ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）が肝臓に動員される。これら細胞が活性化され、Ｌｍを一掃するためのＴ細胞応答を惹起し、同時にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンプラットフォームによって発現されたプラスモジウム由来抗原に対するＴ細胞応答もまた開始される。ある実施形態では、本発明のワクチンプラットフォームは、被験体へのワクチンプラットフォームの送達後２４時間で、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、及びＭＣＰ−１からなる群から選択されるサイトカイン及びケモカインの１つ以上、又は好ましくはこれらの全ての血清濃度における増加を誘導し、更にワクチンプラットフォームによって発現される１つ以上のプラスモジウム由来抗原に対するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋抗原に特異的なＴ細胞応答を誘導する。他の実施形態において、マウスモデル系におけるＤＸ５、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ４３などの活性化マーカーのアップレギュレーションによって、又は標的細胞として用いられた^５１Ｃｒ標識付けＹＡＣ−１細胞を用いて測定された、ＮＫ細胞仲介細胞溶解活性によって立証されるように、本発明のワクチンプラットフォームはまた、常在する未熟な肝臓ＮＫ細胞の成熟化も誘導する。

様々な実施形態において、本発明のワクチン及び免疫原組成物は、プラスモジウム由来抗原（複数可）を発現するよう構成されたＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むことができる。ワクチンベクターとして役立つためのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの能力は、Ｗｅｓｉｋｉｒｃｈら著、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５８：１５９−１６９（１９９７）で検討されている。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生来の生態のいくつかの望ましい特性が、それをマラリアワクチンへの適用のための魅力的なプラットフォームにさせる。中心となる理論的根拠は、マラリア感染において欠損しているとして知られる、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫性の効果的な刺激を可能にするＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞内ライフサイクルである。ＴＬＲｓ（ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）を含む複数の病原体関連分子構造（ＰＡＭＰ）受容体及びヌクレオチド結合オリゴマー化領域（ＮＯＤ）が、感染時にＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのマクロ分子との相互作用に対する応答において誘発され、固有の免疫エフェクターの総活性化及びＴｈ−１分極サイトカインの放出をもたらし、プラスモジウム由来抗原に対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の進展へ重大な影響を及ぼす。

Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの菌株は、癌又はＨＩＶなどの病原体の注入が原因とならない臨床症状に対する免疫応答を誘導する免疫系に対して抗原の送達をもたらす、異種タンパク質の効果的な細胞内送達ベヒクルとして開発されてきた。例えば、それぞれが、全ての表、図面、及び特許請求の範囲を含むその全体を参照により本明細書に組み込んだ、米国特許第６，０５１，２３７号；Ｇｕｎｎら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：６４７１−６４７９（２００１）；Ｌｉａｕら著、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６２：２２８７−２２９３（２００２）；米国特許第６，０９９，８４８号；国際特許出願公開第ＷＯ９９／２５３７６号；同第ＷＯ９６／１４０８７号；及び米国特許第５，８３０，７０２号を参照されたい。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）抗原を発現するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンもまた、保護的細胞仲介免疫性を抗原に対して誘導することが示されている（Ｓｈｅｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２；３９８７−３９９１（１９９５））。

免疫原性組成物で有用なＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの弱毒化又は殺さなくて代謝活性型が生成されている（それぞれが、全ての表、図面、及び特許請求の範囲を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ０７／１０３２２５号及び同第ＷＯ０７／１１７３７１号を参照）。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＡｃｔＡタンパク質は、アクチン動員及び細胞内移動を左右するポリマー化事象を推進するために十分である。ヒト安定性試験は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのａｃｔＡ／ｐｌｃＢ欠失の弱毒化型の経口投与が、成人で重大な後遺症を起こさないことを報告している（Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｓら著、ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，７０：３５９２−３６０１（２００２））。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの弱毒化型の他の種類もまた記載されている（例えば、異種抗原を発現する栄養要求性の弱毒化リステリア菌株を記載する、国際特許出願公開第ＷＯ９９／２５３７６号及び米国特許第６，０９９，８４８号を参照されたい）。

ある実施形態では、本発明のワクチン組成物で使用されるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢに減衰性変異、及び好ましくはａｃｔＡ及びｉｎｌＢの全て又はその一部に欠失（本明細書では「Ｌｍ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と呼ばれる）を含み、並びに関心のプラスモジウム由来抗原（複数可）の発現をコード化する組換えＤＮＡを含有する生弱毒化株である。これら抗原（複数可）は、ＮＳ５ＢＮＳ３コンセンサス配列抗原の一方又は双方から得られる又は由来の１つ以上の免疫原性配列を含むことが最も好ましい。プラスモジウム由来抗原（複数可）は、好ましくは、細菌発現配列の制御下にあり、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムに安定して組み込まれる。したがって、このようなＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンは、真核細胞転写要素又は翻訳要素ではないものを利用する。

本発明は、また少なくとも１つの調節因子、例えば、プロモーター又は転写因子において弱毒化されたリステリア菌に関する。以下は、プロモーターに関する。ａｃｔＡ発現は、２つの異なるプロモーターによって調節される（Ｖａｚｗｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄら著、（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２１９−２３０）。同時に、ＩｎｌＡ及びＩｎｌＢ発現は、５つのプロモーターによって調節される（Ｌｉｎｇｎａｕら著、（１９９５）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。転写因子ｐｒｆＡは、いくつかのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子、例えば、ｈｌｙ、ｐｌｃＡ、ＡｃｔＡ、ｍｐｌ、ｐｒｆＡ及びｉａｐの転写に必要とされる。ｐｒｆＡの調節特性は、例えば、ＰｒｆＡ−依存性プロモーター（ＰｉｎｌＣ）及びＰｒｆＡ−ボックスによって仲介される。ある実施形態では、本発明は、ＡｃｔＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ＰｒｆＡ、ＰｉｎｌＣ、ＰｒｆＡボックスなどの少なくとも１つで不活性化され、変異され、又は欠失されたものをコード化する核酸を提供する（例えば、ＬａｌｉｃＭｕｌｌｔｈａｌｅｒら著、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０；Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら著、（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７−１５５１；Ｌｕｏら著、（２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９−５２を参照）ＰｒｆＡは、Ｇｌｙ１４５Ｓｅｒ変異、Ｇｌｙ１５５Ｓｅｒ変異、又はＧｌｕ７７Ｌｙｓ変異によって、構成的に活性に組み立てられ得る（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ及びＦｒｅｉｔａｇ著（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：１９１７−１９２６；Ｗｏｎｇ及びＦｒｅｉｔａｇ著（２００４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：６２６５−６２７６；Ｒｉｐｉｏら著（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９；１５３３−１５４０を参照）。

弱毒化は、例えば、熱処理又は化学的改変によって達成され得る。弱毒化はまた、例えば、代謝、細胞外増殖、又は細胞内増殖をモジュレートする核酸の遺伝子修飾、リステリアｐｒｆＡ、ａｃｔＡ、リステリオリシン（ＬＬＯ）、接着仲介因子（例えば、ｉｎｌＡ又はｉｎｌＢなどのインテルナリン）、ｍｐｌ、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子）、上記の任意の組み合わせなどの病原性因子をコード化する遺伝子修飾によって達成され得る。弱毒化は、弱毒化リステリア菌の生物学的機能を適切な親リステリア菌によって示される対応する生物学的機能と比較することで評価され得る。

他の実施形態において、本発明は、架橋結合剤、プソラレン、窒素マスタード、シスプラチン、バルキーアダクト、紫外線、γ放射、これらの任意の組み合わせなどの核酸標的化薬剤による処理によって弱毒化されるリステリア菌を提供する。典型的には、架橋結合剤の１つの分子によって生じる損傷は、二重鎖の両鎖の架橋結合に関与する。本発明のリステリア菌はまた、少なくとも１つの核酸修復遺伝子、例えば、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＡＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｕｖｒＡＢ、ｐｈｒＡ、及び／又は、例えばｒｅｃＡなどの組換え修復を仲介する遺伝子を変異させることで弱毒化され得る。更には、本発明は、核酸標的化薬剤による、及び酸修復遺伝子を変異させることによる双方で弱毒化されたリステリア菌を提供する。加えて、本発明は、プソラレンなどの光感受性核酸標的化薬剤、及び／又はプソラレンなどの光感受性核酸架橋結合剤、続いて紫外線への曝露などの処理を包含する。

本発明で有用な弱毒化リステリア菌は、例えば、それぞれがその全体を参照により本明細書に組み込まれた米国特許出願公開第２００４／０２２８８７７号及び同第２００４／０１９７３４３号に記載されている。リステリア菌の特定の菌株が所望の弱毒性を有するかどうかを評価するための様々なアッセイ法が提供されている（例えば、それぞれが、その全体を参照により本明細書に組み込まれた米国特許出願公開第２００４／０２２８８７７号、同第２００４／０１９７３４３号、及び同第２００５／０２４９７４８号）。

他の実施形態では、本発明のワクチン組成物で使用されるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ由来の殺さなく代謝活性（ＫＢＭＡ）プラットフォームであり、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路のＤＮＡ修復酵素をコード化するｕｖｒＡ及びｕｖｒＢ遺伝子の双方が更に欠失され、並びに関心のプラスモジウム由来抗原（複数可）の発現をコード化する組換えＤＮＡを含有する。これら抗原（複数可）は、ＣＳＰ、ＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１、及び／又はＴＲＡＰの１つ以上から得られた又はそれに由来の１つ以上の免疫原性配列を含むことが最も好ましい。プラスモジウム由来抗原（複数可）は、細菌発現配列の制御下にあり、かつＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓゲノムに安定して組み込まれることが好ましい。ＫＢＭＡプラットフォームは、合成プソラレン、Ｓ−５９、及び長波ＵＶ光線での複合処理による光化学的不活性化に対して非常に感受性がある。殺さなく代謝活性ではあるが、ＫＢＭＡＬｍワクチンは、それらの遺伝子産物を一過性に発現すると同時に、それらが食胞酵素作用を中和することを可能にし、野生型ＷＴＬｍ及び種痘ウィルス攻撃に対する機能的細胞免疫性及び保護を誘導する。

ある実施形態では、弱毒化又はＫＢＭＡのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチン株は、構成的に活性なｐｒｆＡ遺伝子（本明細書では、ＰｒｆＡ^＊変異体と呼ばれる）を含む。ＰｒｆＡは、細胞内で活性化される転写因子であり、これは、適切に操作されたワクチン株において、病原性遺伝子及びコード化された異種抗原（Ａｇｓ）の発現を誘導する。上述したように、ａｃｔＡ遺伝子の発現はＰｒｆＡに左右され、ａｃｔＡプロモーターはＰｒｆＡ応答性調節要素である。ｐｒｆＡＧ１５５Ｓ対立遺伝子の封入は、生弱毒化又はＫＢＭＡワクチンの著しく増強されたワクチン効力をもたらすことが可能である。好ましいＰｒｆＡ変異体が、２００８年５月１９日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧＰＲＦＡ^＊ＭＵＴＡＮＴＬＩＳＴＥＲＩＡＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＵＳＥＴＨＥＲＥＯＦ」と題された米国仮特許出願第６１／０５４，４５４号に記載されていて、これは、全ての表、図面及び特許請求の範囲を含むその全体を参照により本明細書に組み込まれるものとする。

残基１５５にグリシンを含むＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＰｒｆＡの配列は、以下のとおりである（配列番号２６）
MNAQAEEFKK
YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50
ISENGTIMNL
QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100
ELKELLSKNL
THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150
TYVYGKETPD
GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200
YKNSCFYVQN
LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237

残基１５５にセリンを含むＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＰｒｆＡの配列は、以下のとおりである（配列番号２７）
MNAQAEEFKK
YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50
ISENGTIMNL
QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100
ELKELLSKNL
THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150
TYVYSKETPD
GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200
YKNSCFYVQN
LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237
４．抗原構築物

本発明の細菌ワクチン株によって発現される抗原構築物は、最低限でも、発現されるプラスモジウム由来抗原（複数可）に融合された、分泌を支援するための細菌ワクチンプラットフォーム内で操作可能な分泌性配列をコード化する核酸を含み、ここにおいて、得られる融合タンパク質は、細菌ワクチンプラットフォームによるこの融合タンパク質の発現に必要な調節配列（例えば、プロモーター）に操作可能に結合される。本発明は、分泌されるポリペプチド及びペプチド抗原に限定されるものではないが、分泌されない又はリステリア菌又は他の細菌から分泌され得ないポリペプチド及びペプチドも包含する。しかしながら、プラスモジウム由来抗原（複数可）は、この菌株が受容体に接種される場合、細菌ワクチン菌株によって可溶性の分泌された形態で発現されることが好ましい。

表１は、異種抗原などの融合タンパク質パートナー配列での融合で使用するためのシグナルペプチドのいくつかの非限定的例を開示する。シグナルペプチドは、３つのドメイン：正荷電Ｎ−末端（１〜５個の残基長）；中心疎水性ドメイン（７〜１５個の残基長）；及び中性であるが極性のＣ−末端ドメインを含有する傾向がある。

以下に記載されるある例示的実施形態では、プラスモジウム由来の配列（複数可）は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡタンパク質のアミノ末端部分に融合された単一のポリペプチドとして発現され得、これは、ワクチン接種された宿主内において細菌からの融合タンパク質の発現及び分泌を可能にする。これらの実施形態において、この抗原構築物は、融合タンパク質をコード化する核酸配列に操作可能に結合されたプロモーターを含むポリヌクレオチドであることができ、ここでは、この融合タンパク質は、（ａ）修飾ＡｃｔＡ及び（ｂ）修飾ＡｃｔＡ配列に続く融合タンパク質として発現される１つ以上のプラスモジウム由来のエピトープを含む。

「修飾ＡｃｔＡ」とは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡタンパク質の隣接する部分を意味し、これは少なくともＡｃｔＡシグナル配列を含むが、ＡｃｔＡ配列の全体を含まないか、若しくはこのようなＡｃｔＡ配列に少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、又は少なくとも約９８％の配列同一性を有するものを意味する。このＡｃｔＡシグナル配列は、ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡ（配列番号４１）である。いくつかの実施形態では、このプロモーターは、それぞれが、その全体を参照により本明細書に組み込まれた、国際特許出願公開第ＷＯ０７／１０３２２５号及び同第ＷＯ７１／１１７３７１号からのＡｃｔＡプロモーターである。

例として、修飾ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡの少なくとも最初の５９個のアミノ酸、又はＡｃｔＡの少なくとも最初の５９個のアミノ酸に少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、又は少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡの少なくとも最初の１００個のアミノ酸、又はＡｃｔＡの少なくとも最初の１００個のアミノ酸に少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、又は少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を含む。言い換えると、いくつかの実施形態では、修飾ＡｃｔＡ配列は、残基１００又はそれ以降で切断されている、ＡｃｔＡのＮ−末端断片（ＡｃｔＡシグナル配列を含む）に相当する。
ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、以下の配列を有する（配列番号３７）
VGLNRFMRAM
MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50
QPSEVNTGPR
YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

この配列において、第１の残基はバリンと示されているが、このポリペプチドは、リステリア菌によって、この位置でメチオニンを有するよう合成される。したがって、ＡｃｔＡ−Ｎ１００はまた、以下の配列も有する（配列番号３８）
MGLNRFMRAM
MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50
QPSEVNTGPR
YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

ＡｃｔＡ−Ｎ１００はまた、修飾ＡｃｔＡのＣ−末端残基とプラスモジウム由来抗原配列との間に位置する１つ以上の追加の残基を含む。以下の配列において、ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、ＢａｍＨ１部位の封入により添加された２つの残基で伸ばされている。
VGLNRFMRAM
MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50
QPSEVNTGPR
YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100
GS （配列番号３９）
第１の残基がメチオニンで合成される場合、以下の配列を有する。
MGLNRFMRAM
MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50
QPSEVNTGPR
YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100
GS （配列番号４０）

例示的構築物が、後記され、並びに本明細書に参照により組み込まれた、国際特許出願公開第ＷＯ０７／１０３２２５号に記載される。ＡＮＺ−１００（以前はＣＲＳ−１００；ＢＢ−ＩＮＤ１２８８４及びｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ（米国臨床試験登録システム）の識別子ＮＣＴ００３２７６５２として知られる）は、いずれの外因性抗原発現配列も含まないＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢプラットフォームからなる。国際特許出願公開第ＷＯ０７／１０３２２５号に記載される例示的構築物において、このプラットフォームは、ヒトメソテリンをＡｃｔＡ−Ｎ１００との融合物として発現する。このメソテリン発現ワクチンが、ＣＲＳ−２０７（ＢＢ−ＩＮＤ１３３８９及び米国臨床試験登録システム識別子ＮＣＴ００５８５８４５）を用いて、肝転移を伴う進行癌を有する被験体において評価されている。本発明は、メソテリン配列をプラスモジウム由来抗原配列で置き換えることによる、このワクチンの修飾を考慮に入れる。

１つの生物体によってコード化される配列は、選択されたワクチンプラットフォーム細菌株における最適発現のために最適化されたコドンを必ずしも必要としないために、本発明はまた、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの細菌による発現に最適化されたコドンによって改変されている核酸を提供する。

様々な実施形態では、任意の非最適コドンの少なくとも１％が、最適コドンをもたらすように変更され、より一般的には少なくとも５％が変更され、もっとも一般的には少なくとも１０％が変更され、頻繁には少なくとも２０％が変更され、より頻繁には少なくとも３０％が変更され、もっとも頻繁には少なくとも４０％が変更され、通常は少なくとも５０％が変更され、より通常では少なくとも６０％が変更され、もっとも通常では少なくとも７０％が変更され、最適には少なくとも８０％が変更され、より最適には少なくとも９０％が変更され、もっとも最適には少なくとも９５％が変更され、並びに慣習的には、任意の非最適コドンの１００％が、リステリア発現に最適化される（表２）。

本発明は、本発明のワクチンプラットフォームを作成する又は操作するために、いくつかのリステリア菌種及び菌株を供給する。本発明のリステリア菌は、表３に開示される種及び株によって限定されるものではない。

４．治療用組成物

本明細書に記載されるワクチン組成物は、適切な免疫応答を誘導するのに十分な量で、単独で又は薬学的に許容可能な賦形剤と組み合されて宿主に投与され得る。この免疫応答は、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的及び非特異的免疫応答の双方、先天性応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、及びサイトカイン発現を含むことができるが、これに限定されない。本発明のワクチンは、例えば、凍結され、凍結乾燥され、懸濁液として、細胞ペーストとして、固体マトリックス又はゲルマトリックスと複合体を形成されて保存され得る。

ある実施形態では、免疫応答を惹起するために、免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチドを含有するワクチンの有効用量が被験体に投与された後に、第２のワクチンが投与される。このことは、当該技術分野では「プライム−ブースト」療法と呼ばれる。この様な療法において、本発明の組成物及び方法は、「プライム」送達として、「ブースト」送達として、又は「プライム」及び「ブースト」の双方として用いられ得る。

例として、抗原ポリペプチド（複数可）をコード化しかつ発現する、殺さなくて代謝活性リステリア菌からなる第１のワクチンは、「プライム」として送達され得、抗原ポリペプチド（複数可）をコード化しかつ発現する弱毒化（生菌か殺さなくて代謝活性）リステリア菌からなる第２のワクチンは、「ブースト」として送達され得る。しかしながら、プライム及びブーストのそれぞれは、本発明の方法及び組成物を使用することが必ずしも必要ではないことが理解されるべきである。むしろ、本発明は、本発明の細菌ワクチン方法及び組成物と合わせての他のワクチン治療手段の使用を意図する。以下は、好適に混合されたプライム−ブースト療法の例である：ＤＮＡ（例えば、プラスミド）ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト；ウィルスワクチンプライム／細菌ワクチンブースト;タンパク質ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト；ＤＮＡプライム／細菌ワクチンブースト＋タンパク質ワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／ＤＮＡワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／ウィルスワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／タンパク質ワクチンブースト；細菌ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト＋タンパク質ワクチンブーストなどである。この列挙は限定されることを意味していない。

プライムワクチン及びブーストワクチンは、同一経路又は異なる経路で投与され得る。用語「異なる経路」とは、限定されないが、身体上の異なる部位、例えば、口腔内、非口腔、腸内、腸管外、直腸、節内（リンパ節）、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周囲、浸出液、粘膜、鼻腔、脳脊髄空間内又は脳脊髄液などである部位、並びに異なるモード、例えば、経口、静脈内、及び筋肉内によることを意味する。

プライム及びブーストワクチンの有効量は、１回の投与量で提供され得るが、１回の投与量に制限されない。したがって、投与は、ワクチンの２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、又はそれ以上の投与であり得る。本発明の方法において、ワクチン又はワクチン（複数可）の１回以上の投与がある場合、投与は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、又はそれ以上の分の時間間隔によって、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間などの時間間隔によって離間され得る。時間に関して、用語「約」は、３０分以内の任意の時間間隔のプラス又はマイナスを意味する。投与はまた、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、及びこれらの組み合わせの時間間隔で離間され得る。本発明は、時間で等しく離間された投与間隔に限定されるものではないが、ちょうど非限定的例を提供するよう、１日、４日、７日、及び２５日での投与からなる初回抗原刺激計画などの不均等間隔での投与を包含する。

ある実施形態では、ブーストワクチンの投与は、プライムワクチン接種が開始された後約５日で、プライムワクチン接種が開始された後約１０日で、プライムワクチン接種が開始された後約１５日で、約２０日で、約２５日で、約３０日で、約３５日で、約４０日で、約４５日で、約５０日で、約５５日で、約６０日で、約６５日で、約７０日で、約７５日で、約８０日で、約６ヶ月で、及び訳１年で開始され得る。好ましくは、プライム及びブーストワクチン接種の一方又は双方は、本発明の組成物の送達を含む。

「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「診断学的に許容可能な賦形剤」としては、無菌蒸留水、生理食塩水、リン酸塩緩衝溶液、アミノ酸系緩衝液、又は重炭酸塩緩衝溶液が挙げられるが、これに限定されない。選択される賦形剤及び使用される賦形剤の量は、投与のモードに左右されるだろう。投与は、経口、静脈内、皮下、経皮、皮内、筋肉内、経粘膜、非経口、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼球内、筋肉内、血管内、節内、乱刺法によって、経肛門、腹腔内、又は投与の様々な周知の経路の組み合わせであり得る。投与は、注射、輸注、又はこれらの組み合わせを含むことができる。

非経口経路による本発明のワクチンの投与は、免疫寛容を回避することができる。静脈内、皮下、筋肉内、経口、経粘膜、尿管による、生殖管による、胃腸管による、又は吸入による投与に関して、当該技術分野では方法が既知である。

特定の患者に関する有効量は、治療される病状、患者の全身の健康状態、投与の経路及び用量、並びに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。治療及び診断の方法のためのガイドラインが利用可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら著、（１９９６）ＡＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＳＯＰｓｆｏｒＧｏｏｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ，ＩｎｔｅｒｐｈａｒｍＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ著（２００１）ＧｏｏｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄＧｏｏｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ，ＵｒｃｈＰｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照）。

本発明のワクチンは、各用量が少なくとも１００細菌細胞個／ｋｇ体重又はそれ以上；ある実施形態では１０００細菌細胞個/ｋｇ体重又はそれ以上；一般的には少なくとも１０，０００個の細胞；より一般的には少なくとも１００，０００個の細胞；もっとも一般的には１００万個の細胞；頻繁には少なくとも１，０００万個の細胞；より頻繁には少なくとも１億個の細胞；典型的には少なくとも１０億個の細胞；大抵の場合少なくとも１００億個の細胞、通常は少なくとも１０００億個の細胞；並びに時には少なくとも１兆個の細胞／ｋｇ体重を含むような用量、又は投与量で投与され得る。本発明は、細菌投与の単位が、コロニー形成単位（ＣＦＵ）、プソラレン処理前のＣＦＵの等価物である、又はこの単位が細菌細胞の数であるような、上記用量を提供する。

本発明のワクチンは、各用量が、湿重量で、１０^７〜１０^８細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^７〜２×１０^８細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^７〜５×１０^８細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^８〜１０^９細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^８〜２×１０^９細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^８〜５×１０^９細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^９〜１０^１０細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^９〜２×１０^１０細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^９〜５×１０^１０細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^１１〜１０^１２細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^１１〜２×１０^１２細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^１１〜５×１０^１２細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^１２〜１０^１３細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^１２〜２×１０^１３細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^１２〜５×１０^１３細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^１３〜１０^１４細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^１３〜２×１０^１４細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；５×１０^１３〜５×１０^１４細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；１０^１４〜１０^１５細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）；２×１０^１４〜２×１０^１５細菌／７０ｋｇ体重（又は１．７平方メートル表面積当たり、又は１．５ｋｇの肝臓重量当たり）などを含むような、用量、又は投与量で投与され得る。

更に提供されているものは、上記の用量の１つ以上であり、ここでは、この用量が、毎日１回注射、２日毎に１回注射、３日毎に１回注射、４日毎に１回注射、５日毎に１回注射、６日毎に１回注射、又は７日毎に１回注射によって投与され、この注射計画が、例えば、１日間だけ、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、又はそれ以上長く維持される。本発明はまた、例えば、比較的大量の初期細菌用量、続いて比較的少量の後続の用量、又は比較的少量の初期用量、続いて大量の用量など上記用量及び計画の組み合わせを包含する。

例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回などの投与計画が、本発明に利用可能である。この投与計画は、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７か月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、及び１２ヶ月間の総時間期間に関する投与を包含する。

提供されているものは、上記投与計画の周期である。この周期は、例えば、約７日毎、１４日毎、２１日毎、２８日毎、３５日毎、４２日毎、４９日毎、５６日毎、６３日毎、７０日毎などで繰り返され得る。非投与の間隔は、１つの周期間で発生し得、ここでは、間隔は、例えば約７日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、４２日間、４９日間、５６日間、６３日間、７０日間などであり得る。これに関連して、用語「約」は、＋／−１日、＋／−２日、＋／−３日、＋／−４日、＋／−５日、＋／−６日、又は＋／−７日を意味する。

本発明は、経口である、リステリア菌を投与する方法を包含する。更に提供されるものは、静脈内である、リステリア菌を投与する方法である。更には、提供されるものは、経口、筋肉内、静脈内、皮内及び／又は皮下であるリステリア菌を投与する方法である。本発明は、肉系である、又は肉又は動物製品由来のポリペプチドを含有する培地中で増殖させることで調製されるリステリア細菌、又はリステリア細菌の培養物又は懸濁液を供給する。本発明により更に供給されるものは、肉又は動物製品を含有しない培地中で増殖させることで調製される、植物性ポリペプチドを含有する培地上で増殖させることで調製される、酵母製品系ではない培地上で増殖させることで調製される、又は酵母ポリペプチドを含有する培地上で増殖させることで調製される、リステリア細菌、又はリステリア細菌の培養物又は懸濁液である。

追加の治療用薬剤との共投与のための方法は、当該技術分野で周知である（Ｈａｒｄｍａｎら（編集）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ及びＰｅｔｅｒｓｏｎ（編集）（２００１）ＰｈａｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｆｏｒＡｄｖａｎｃｅｄＰｒａｃｔｉｃｅ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ及びＬｏｎｇｏ（編集）（２００１）ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＢｉｏｔｈｅｒｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ）

本発明は、本発明のワクチンと共に投与するための試薬を提供する。これら試薬は、他のマラリア治療薬（クロロキン、メフロキン、プリマキン、プログアニル、ピリメタミン、ファンシダール（スルファドキシン−ピリメタミン）を含む）及び他の免疫療法剤を含む。この列挙は、限定されることを意味しない。この試薬は、本発明のワクチン組成物と同時に又はこれとは独立して投与され得る。例えば、この試薬は、本発明のワクチン組成物の直前（又は直後）に、本発明のワクチン組成物と同日に、１日前（又は後）に、１週間前（又は後）に、１ヶ月前（又は後）に、又は２ヶ月前（又は後）などに投与され得る。

細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起するために有益である追加の薬剤が、同様に使用され得る。この様な薬剤は、本明細書では担体と名づけられる。これらは、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン−２、インターロイキン−γ、ＧＮ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４拮抗薬、ＯＸ−４０／ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミソール、ワクシニアウィルス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、フロイント完全又は不完全アジュバント、無毒化エンドトキシン、鉱油、リポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、及び油又は炭化水素エマルジョンなどの表面活性物質が挙げられるが、これに限定されない。抗体応答に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を優先的に刺激する、Ｔ細胞免疫応答を有するための担体が好ましいが、応答の双方の種類を刺激するものも同様に用いられ得る。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチドそれ自体又はこのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドが投与され得る。この担体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は樹状細胞などの細胞であることができる。抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞などの細胞型を含み得る。他の専門的抗原提示細胞としては、単求、周縁クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、指状突起樹状細胞、濾胞樹状細胞、及びＴ細胞が挙げられる。条件的抗原提示細胞もまた使用され得る。条件的抗原提示細胞の例としては、星状細胞、濾胞細胞、内皮細胞及び線維芽細胞が挙げられる。この担体は、ワクチン接種された個体の細胞中で引き続いて発現される、ポリペプチドを発現するよう又はポリヌクレオチドを発現するよう又はワクチン接種された個体の細胞において引き続き発現されるポリヌクレオチドを送達するよう形質転換された細菌細胞であり得る。水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどのアジュバントが、免疫応答を誘発し、増強し、又は延長させる能力を増加させるように添加され得る。サイトカイン、ケモカイン、及びＣｐＧのような細菌核酸配列、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９作動薬、並びにリポタンパク質、ＬＰＳ、モノホスホリルリピドＡ、リポテイコ酸、イミキモド、レシキモドを含むＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９に関する追加的拮抗薬、及び記載された組成物とは別個に又は組み合わされて使用される免疫調整物質などの追加的材料もまた、潜在的アジュバントである。アジュバントの他の代表的例としては、合成アジュバントＱＳ−２１が挙げられ、これは、キラヤの外皮及びコリネバクテリウム・パルバムから生成される均質サポニンを含む（ＭｃＣｕｎｅら著、Ｃａｎｃｅｒ，１９７９；４３：１６１９）。このアジュバントは、最適化への対象であると理解されるだろう。言い換えれば、当業者は、使用に最適なアジュバントを決定するようルーチン的実験に携わることができる。

治療用薬剤の有効量は、一般的には少なくとも１０％まで、より一般的には少なくとも２０％まで、もっとも一般的には少なくとも３０％まで、典型的には少なくとも４０％まで、より典型的には少なくとも５０％まで、もっとも典型的には少なくとも６０％まで、頻繁には少なくとも７０％まで、より頻繁には少なくとも８０％まで、もっとも頻繁には少なくとも９０％まで、通常的には少なくとも９５％まで、より通常的には少なくとも９９％まで、及びもっとも通常的には少なくとも９９．９％まで症状を低減又は軽減すると考えられる量である。

本発明の試薬及び方法は、ただ１つのワクチン接種を含む、又は第１のワクチン接種を含む、又は少なくとも１つのブースターワクチン接種を含む、又は少なくとも２つのブースターワクチン接種を含む、若しくは少なくとも３つのブースターワクチン接種を含むワクチンを提供する。ブースターワクチン接種のためのパラメータにおけるガイドラインが利用可能である。（例えば、Ｍａｓｒｔｈ著（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ２５：１９９−２０３；Ｒａｍｓａｙら著（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７５：３８２−３８８；Ｇｈｅｒａｒｄｉら著（２００１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：６５５−６６７；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌら著（２００１）ＡｃｔＡＣｌｉｎ．Ｂｅｌｇ．５６：２０９−２１９；Ｇｔｒｉｎｅｒら著（２００２）ＣａｎｓｅｒＲｅｓ．６２：６９４４−６９５１；Ｓｍｉｔｈら著（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７０：追補１：Ｓ３８−Ｓ４１；Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ａｍｏｒら著（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ２０：２７９０−２７９５を参照）。

治療用薬剤の処方物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー水性溶液又は懸濁液の形で、生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤で混合されることによって保存用に調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら著（２００１）ＧｏｏｄｍａｎａｎｄＧｉｌｍａｎ‘ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏら著（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編集）１９９３）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編集）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編集）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＤｉｓｐｅｒｓｅＳｙｓｔｅｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ及びＫｏｔｋｏｓｋｉｅ著（２０００）ＥｘｃｉｐｉｅｎｔＴｏｘｉｃｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹを参照）。
実施例

以下の実施例は、本発明を説明するために役立つ。これら実施例は、本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。
実施例１．細菌株及び抗原選択

Ｌｍワクチンを２つの菌株背景、生−弱毒化（Ｌｍ１１、ａｋａＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ）及びＫＢＭＡＰｒｆＡ^＊（Ｌｍ６７７、ａｋａＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ΔｕｖｒＡＢ／ｐｒｆＡＧ１５５Ｓ）で構築した。前赤血球ステージの熱帯熱マラリア原虫Ｐ．ｆａｌｃｉｏｐａｒｕｍ（「ｐｆ」）抗原ＣＳＰ、ＬＳＡ−１、及びＣｅｌＴＯＳ並びにＴＲＡＰに関する発現カセットを、Ｌｍからの発現及び分泌について分析した。カイト・ドーリットルの疎水性のグラフは、タンパク質の疎水性特性を示すために広く適用されたスケールである。疎水性は、個々のアミノ酸残基に関する溶媒和エンタルピーから計算され、５〜７個のアミノ酸のスライディングウィンドウ全体でこの値を合計する。Ｐ．ｆａｌｃｉｏｐａｒｕｍ抗原の初回のカイト・ドーリットル評価を用いて、ＡｃｔＡ−Ｎ１００から得られたピーク疎水性値未満の又はそれと等しい領域を同定した。これよりも大きな値は、リステリア菌では十分に発現しないポリペプチド配列を示すことができる。ＡｃｔＡシグナル配列に対する抗原の予測された疎水性に従って、発現カセットをデザインし、ある構築物では、シグナル配列の５０％又はそれを超える疎水性を呈するアミノ酸ストレッチを除去した（図１〜４）。次いで、マラリア抗原を、Ｌｍ、すなわち低Ｇ＋Ｃ含量生物体における発現に最適なコドン合成し、ＬＳＡ−１及びｐｆ−ＣＳＰ内の反復単位を、Ｂ及びＴ細胞エピトープを保存するよう最小化し、更に最適リステリア菌Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのコドンを用いて抗原コード化配列を合成した（ＤＮＡ２．０、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）。

発現カセットを、ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片として、ａｃｔＡプロモーターの下流及びＡｃｔＡの１００個のアミノ酸（「ＡｃｔＡ−Ｎ１００」）を備えるインフレームにクローニングし、コード化された異種抗原の発現及び分泌の評価を容易にするＳＩＮＦＥＫＬ（ＳＬ８）、サロゲートＴ細胞エピトープで、カルボキシ末端でタグした。この構築物をｐＰＬ１又はｐＰＬ２の組み込み型ベクターの誘導体のいずれかにクローニングし、それぞれ細菌の染色体のｃｏｍＫ又はｔＲＮＡ^Ａｒｇ遺伝子座で安定して組み込んだ。ＣＳＰ及びＣｅｌＴＯＳ融合構築物を、コード配列の５’（ＳｐｅＩ）及び３’（ＭｆｅＩ）末端で新しい制限部位を導入するＰＣＲによって、（上記に概説された同一の方法を用いて）互いでインフレームにクローニングした。全ての分子構築物を、ＤＮＡ配列決定法により確認した。

全てのマラリア抗原の発現及び分泌に使用された例示的カセットが以下に示され、これらは以下のドメインを含有する：ＫｐｎＩ（下線が引かれ、小文字で示されたｇｇｔａｃｃ（配列番号１））−ａｃｔＡプロモーター（小文字、下線なし）−ＡｃｔＡ−Ｎ１００（大文字、下線なし）ｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔｃａａｔｔｇ（配列番号２）（インフレームクローニングＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｆｅＩのためのリンカー配列；小文字、二重下線）−ＳＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）Ｔ細胞タグ（大文字、下線が引かれた８７個のヌクレオチド）−ＥａｇＩ（ｃｇｇｃｃｇ（配列番号４）太文字の小文字）：
ggtaccgggaagcagttggggttaactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctccaagtgatattcttaaaataattcatgaatattttttcttatattagctaattaagaagataattaactgctaatccaatttttaacggaataaattagtgaaaatgaaggccgaattttccttgttctaaaaaggttgtattagcgtatcacgaggagggagtataagtgggattaaatagatttatgcgtgcgatgatggtagttttcattactgccaactgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattccagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaagtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcagagaaaggtggatccactagtcaattgggtgacggtagtattaaacttagcaaagtattacaattagaaagtattattaattttgaaaaattagctgatggttcagttaaataagcggccg (配列番号５).

上術のように最適化された、以下のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子配列（大文字）は、マラリア抗原（それぞれ、５’及び３’末端での小文字で示されたＢａｍＨ１及びＳｐｅＩ制限部位）の発現に用いられた。
＞ＰｆＣＳＰ合成遺伝子（配列番号６）：

ggatcccaagaatatcagtgttatggaagtagtagcaatactcgcgttttgaatgaactaaattatgataacgcaggtacaaacttatacaatgaattagaaatgaattattacggtaaacaagaaaattggtattcgctaaagaagaatagtcgctcattaggcgagaacgatgatggtaataacgaagataatgagaaattacgaaaacctaaacataagaaacttaaacagccggcagatggaaatccagacccaaatgcaaatccaaatgttgatccaaatgcgaatccgaatgtaaatgctaacccgaacgctaatcctaacgcaaatcctaataaaaataatcaaggaaatggccaaggacataatatgccaaatgatcctaatcgtaatgtcgatgaaaatgctaacgctaattcggcagttaaaaacaataataacgaggaaccaagtgacaaacatattaaagaatatctaaacaaaattcaaaatagtttatcaacggaatggtcgccatgcagtgttacgtgtggcaatggcatacaagtgcgcattaaacctggttcagcgaataaaccgaaagacgaattagattatgcaaatgatattgagaaaaagatttgtaaaatggaaaaatgtagttcagtcttcaatgtagtgaatagctcaataggcttaattatggttcttagcttcctttttctaaacactagt

対応するアミノ酸配列（配列番号７） QEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN

＞ＰｆＣＳＰ（１−２２４）（配列番号８）

ggatcccaagaatatcagtgttatggaagtagtagcaatactcgcgttttgaatgaactaaattatgataacgcaggtacaaacttatacaatgaattagaaatgaattattacggtaaacaagaaaattggtattcgctaaagaagaatagtcgctcattaggcgagaacgatgatggtaataacgaagataatgagaaattacgaaaacctaaacataagaaacttaaacagccggcagatggaaatccagacccaaatgcaaatccaaatgttgatccaaatgcgaatccgaatgtaaatgctaacccgaacgctaatcctaacgcaaatcctaataaaaataatcaaggaaatggccaaggacataatatgccaaatgatcctaatcgtaatgtcgatgaaaatgctaacgctaattcggcagttaaaaacaataataacgaggaaccaagtgacaaacatattaaagaatatctaaacaaaattcaaaatagtttatcaacggaatggtcgccatgcagtgttacgtgtggcaatggcatacaagtgcgcattaaacctggttcagcgaataaaccgaaagacgaattagattatgcaaatgatattgagaaaaagatttgtaaaatggaaaaatgtagttcagtcttcaatgtagtgaatagctcaataggcactagt

対応するアミノ酸配列（配列番号９） QEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSSIG

＞ＰｆＣｅｌＴＯＳ（１−１５８）（完全長合成遺伝子）（配列番号１０）：
ggatccttccgaggtaataacggacataattcatcgtcttccttatataacgggagccaatttatagaacaacttaataacagttttacaagtgcatttttggagtcacagagtatgaataaaatcggtgatgatctagcagaaacaatctcaaacgaattagtcagtgttcttcaaaaaaactcaccaacatttcttgaatcgtccttcgacatcaaaagtgaagtaaagaaacatgcgaaaagtatgcttaaagagcttattaaagtgggcttgccatcgtttgaaaacctagtagcggagaatgtaaaacctcctaaggtcgatccggcgacctatggtatcatcgtgccagttttaacatctttgtttaacaaagtagaaactgctgtaggagctaaagtatcggatgaaatttggaactataattcgccggatgttagcgagtctgaagaatcgctaagtgatgatttcttcgacactagt

対応するアミノ酸配列（配列番号１１） FRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNELVSVLQKNSPTFLESSFDIKSEVKKHAKSMLKELIKVGLPSFENLVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD

＞ＰｆＬＳＡ１（１−４７８）（完全長合成遺伝子）（配列番号１２）：

ggatccatgggtacaaacagtgaaaaagatgagataatcaaaagcaatttacgatctggttcgtctaacagtcgtaaccgtatcaatgaagaaaaacatgaaaagaaacacgtattatcgcataatagctatgagaaaaccaaaaacaatgagaataataaattttttgataaagacaaggagttaacaatgtccaatgtaaagaacgtatcccaaacgaatttcaaatcacttttacgtaacttaggtgtgtccgaaaatatcttcttaaaagagaacaaattgaataaagagggtaaactaattgaacacattattaatgatgatgacgacaaaaagaaatatatcaaaggccaagacgagaatcgtcaagaagatcttgaagaaaaggcggcagaacaacaaagtgatcttgaacaggaaagacttgctaaagagaaattgcaagaacaacagtctgatttagagcaagagcgtttagcgaaagaaaaattacaagaacgactagcaaaagaaaaactacaagagcaacaacgcgatttggaacaggaacgtttggcaaaagagaaacttcaagaacagcaacgcgatcttgaacaacgaaaagcagataccaagaagaatttagaacgcaagaaagaacacggggacgttcttgccgaagatttatatgggcgattagaaatcccagccatcgaattaccatctgaaaatgaacgaggctattatatcccacatcaatcaagccttcctcaggataacagaggtaatagcagagattctaaagaaatttcaattatagagaaaacgaatagagaaagtatcactacaaacgtagaaggacgccgtgatattcataaaggacatttggaagagaagaaagatgggtctatcaaaccggaacagaaggaagataaatccgctgacattcaaaatcacactcttgaaacagttaacattagcgacgtgaacgattttcaaatttctaaatatgaagatgaaattagcgctgaatatgatgattcgcttattgacgaagaagaagatgatgaagaccttgatgaatttaaaccgattgttcaatatgataattttcaagatgaagagaatattggaatctataaggaattagaagatttaatcgagaaaaatgaaaatttagatgatcttgacgaaggtattgaaaaatcctctgaagaactttccgaagagaaaattaagaaaggtaaaaagtacgagaaaactaaagacaacaatttcaaaccaaatgataaaagcctttatgacgagcatattaaaaagtataaaaacgataaacaagtcaataaagaaaaagagaagtttatcaaatctctatttcacatttttgacggtgacaatgaaatccttcaaattgtagatgaattgtccgaagatatcacaaagtattttatgaaattaactagt

対応するアミノ酸配列（配列番号１３） MGTNSEKDEIIKSNLRSGSSNSRNRINEEKHEKKHVLSHNSYEKTKNNENNKFFDKDKELTMSNVKNVSQTNFKSLLRNLGVSENIFLKENKLNKEGKLIEHIINDDDDKKKYIKGQDENRQEDLEEKAAEQQSDLEQERLAKEKLQEQQSDLEQERLAKEKLQERLAKEKLQEQQRDLEQERLAKEKLQEQQRDLEQRKADTKKNLERKKEHGDVLAEDLYGRLEIPAIELPSENERGYYIPHQSSLPQDNRGNSRDSKEISIIEKTNRESITTNVEGRRDIHKGHLEEKKDGSIKPEQKEDKSADIQNHTLETVNISDVNDFQISKYEDEISAEYDDSLIDEEEDDEDLDEFKPIVQYDNFQDEENIGIYKELEDLIEKNENLDDLDEGIEKSSEELSEEKIKKGKKYEKTKDNNFKPNDKSLYDEHIKKYKNDKQVNKEKEKFIKSLFHIFDGDNEILQIVDELSEDITKYFMKL

＞ＰｆＴＲＡＰ合成遺伝子（配列番号１４）：

ggatccaatggtagagatgtacagaacaatatcgtagatgagatcaaataccgcgaagaagtttgcaatgatgaagttgatctttacttgttaatggattgttcaggttcaattcgtcgtcataactgggtcaatcacgcggttcctttggctatgaaacttattcaacaactaaacctaaatgaatctgcgattcacttgtatgttaacatattctcgaacaatgcgaaagaaatcattcgtttacattcggatgcaagcaagaataaagaaaaagcgttgataatcatacgaagcttactaagcactaatcttccgtatggccgaacaaacttatctgatgcattacttcaggttagaaaacatttgaatgatcgcattaaccgtgaaaatgcaaatcagttggttgtgattctaactgatgggattcctgatagcattcaagatagtcttaaagaatcacgaaaactaaatgaccgtggtgtgaaaatcgcagtttttggaattggacaaggcatcaatgttgctttcaatcgattcttagtcgggtgtcatccatccgacggaaagtgcaatttgtatgctgattctgcgtgggagaatgtgaaaaacgttattggaccattcatgaaagccgtatgtgttgaagtagaaaagacagctagttgcggtgtgtgggacgaatggtcaccatgtagtgtgacatgtggcaaaggcacacgctctcgcaaacgtgaaatacttcacgaaggatgcaccagtgaattacaagaacaatgtgaagaagaacgttgtccgccaaaacgtgaaccactagatgtacctgatgaaccagaagatgaccaaccgcgtccgcgtggtgacaactttgctgttgagaaacctgaagagaatatcattgacaataacccacaagagccatccccaaacccagaggaaggtaaaggggaaaatccaaatggtttcgacttagatgaaaatccagaaaatccaccaaatccggatattccacaacaagaaccaaacattccagaagattctgaaaaagaagtacctagtgatgtaccaaagaatccggaggacgatagagaagaaaactttgatattcctaagaaaccggaaaacaaacacgataatcaaaacaatcttccaaacgacaaatcagatagatccattccttatagtcctttaccaccaaaagtacttgataatgaacgcaaacaatcggacccacaatctcaagacaacaatgggaatcgtcatgtgccaaatagcgaagatagagaaactagacctcatggtcgtaacaatgagaatcgatcatacaatcgcaaatacaatgatacgccaaaacatccagaaagagaagaacatgaaaaaccggataacaataagaaaaagggaggtagtgacaacaagtataagattgcaggtggcattgcaggcggattagcattacttgcttgcgcaggcttagcctacaaattcgtagtcccgggtgcagctacgccttatgccggagagccagctccgtttgatgaaacattaggagaagaagataaggatttagatgagcctgagcaattcagattacctgaagaaaatgaatggaatcaattg

対応するアミノ酸配列（配列番号１５） NGRDVQNNIVDEIKYREEVCNDEVDLYLLMDCSGSIRRHNWVNHAVPLAMKLIQQLNLNESAIHLYVNIFSNNAKEIIRLHSDASKNKEKALIIIRSLLSTNLPYGRTNLSDALLQVRKHLNDRINRENANQLVVILTDGIPDSIQDSLKESRKLNDRGVKIAVFGIGQGINVAFNRFLVGCHPSDGKCNLYADSAWENVKNVIGPFMKAVCVEVEKTASCGVWDEWSPCSVTCGKGTRSRKREILHEGCTSELQEQCEEERCPPKREPLDVPDEPEDDQPRPRGDNFAVEKPEENIIDNNPQEPSPNPEEGKGENPNGFDLDENPENPPNPDIPQQEPNIPEDSEKEVPSDVPKNPEDDREENFDIPKKPENKHDNQNNLPNDKSDRSIPYSPLPPKVLDNERKQSDPQSQDNNGNRHVPNSEDRETRPHGRNNENRSYNRKYNDTPKHPEREEHEKPDNNKKKGGSDNKYKIAGGIAGGLALLACAGLAYKFVVPGAATPYAGEPAPFDETLGEEDKDLDEPEQFRLPEENEWN

＞ＰｆＴＲＡＰ（２４−４９７）（配列番号１６）：

ggatccaatggtagagatgtacagaacaatatcgtagatgagatcaaataccgcgaagaagtttgcaatgatgaagttgatctttacttgttaatggattgttcaggttcaattcgtcgtcataactgggtcaatcacgcggttcctttggctatgaaacttattcaacaactaaacctaaatgaatctgcgattcacttgtatgttaacatattctcgaacaatgcgaaagaaatcattcgtttacattcggatgcaagcaagaataaagaaaaagcgttgataatcatacgaagcttactaagcactaatcttccgtatggccgaacaaacttatctgatgcattacttcaggttagaaaacatttgaatgatcgcattaaccgtgaaaatgcaaatcagttggttgtgattctaactgatgggattcctgatagcattcaagatagtcttaaagaatcacgaaaactaaatgaccgtggtgtgaaaatcgcagtttttggaattggacaaggcatcaatgttgctttcaatcgattcttagtcgggtgtcatccatccgacggaaagtgcaatttgtatgctgattctgcgtgggagaatgtgaaaaacgttattggaccattcatgaaagccgtatgtgttgaagtagaaaagacagctagttgcggtgtgtgggacgaatggtcaccatgtagtgtgacatgtggcaaaggcacacgctctcgcaaacgtgaaatacttcacgaaggatgcaccagtgaattacaagaacaatgtgaagaagaacgttgtccgccaaaacgtgaaccactagatgtacctgatgaaccagaagatgaccaaccgcgtccgcgtggtgacaactttgctgttgagaaacctgaagagaatatcattgacaataacccacaagagccatccccaaacccagaggaaggtaaaggggaaaatccaaatggtttcgacttagatgaaaatccagaaaatccaccaaatccggatattccacaacaagaaccaaacattccagaagattctgaaaaagaagtacctagtgatgtaccaaagaatccggaggacgatagagaagaaaactttgatattcctaagaaaccggaaaacaaacacgataatcaaaacaatcttccaaacgacaaatcagatagatccattccttatagtcctttaccaccaaaagtacttgataatgaacgcaaacaatcggacccacaatctcaagacaacaatgggaatcgtcatgtgccaaatagcgaagatagagaaactagacctcatggtcgtaacaatgagaatcgatcatacaatcgcaaatacaatgatacgccaaaacatccagaaagagaagaacatgaaaaaccggataacaataagaaaaagggaggtagtgacaacaagtataagattcaattg
対応するアミノ酸配列（配列番号１７） NGRDVQNNIVDEIKYREEVCNDEVDLYLLMDCSGSIRRHNWVNHAVPLAMKLIQQLNLNESAIHLYVNIFSNNAKEIIRLHSDASKNKEKALIIIRSLLSTNLPYGRTNLSDALLQVRKHLNDRINRENANQLVVILTDGIPDSIQDSLKESRKLNDRGVKIAVFGIGQGINVAFNRFLVGCHPSDGKCNLYADSAWENVKNVIGPFMKAVCVEVEKTASCGVWDEWSPCSVTCGKGTRSRKREILHEGCTSELQEQCEEERCPPKREPLDVPDEPEDDQPRPRGDNFAVEKPEENIIDNNPQEPSPNPEEGKGENPNGFDLDENPENPPNPDIPQQEPNIPEDSEKEVPSDVPKNPEDDREENFDIPKKPENKHDNQNNLPNDKSDRSIPYSPLPPKVLDNERKQSDPQSQDNNGNRHVPNSEDRETRPHGRNNENRSYNRKYNDTPKHPEREEHEKPDNNKKKGGSDNKYKI

実施例２．インビトロ細胞培養

Ｊ７７４、Ｐ８１５、及びＥＬ−４細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、５ｅ４Ｉ．Ｕ．／５ｅ４μｇのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）、１ｘの非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充した、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。ＤＣ２．４及びＢ３Ｚハイブリドーマを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有しないＴ細胞培地で培養した。
実施例３．ペプチドの調製

ＯＶＡ_{２５７−２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＳＬ８）、ｐ６０_{２１７−２２５}（ＫＹＧＶＳＱＤＩ）、ＬＩＯ_{９１−９９}（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ）、及びＬＬＯ_{１９０−２０１}（ＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳ）に関するペプチドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成した。ＬＳＡ−１_{１６７１−１６７９}（ＹＹＩＰＨＱＳＳＬ）、ＰｆＣＳＰ_{３９−４７}（ＮＹＤＮＡＧＴＮＬ）、ＰｂＣＳＰ_{２５２−２６０}（ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）、及びＨＰＶ１６Ｅ７_{４９−５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）に関するペプチドを、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で合成した。１１個のアミノ酸まで重複し、かつＣｅｌＴＯＳの配列をスパンする１５−ｍｅｒペプチドからなるＣｅｌＴＯＳペプチドライブラリーを、ＪＰＴＰｅｐｔｉｄｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。ＣｅｌＴＯＳペプチドライブラリーは、ペプチド＃２５（ＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＲＹ）、＃２６（ＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶ）、＃３４（ＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥ）、及び＃３５（ＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳ）を含む。
実施例４．免疫化

６〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。Ａｄｕｒｏ（及びＡｎｚａ）施設内動物実験委員会承認による動物プロトコルの下で試験が実施された。生−弱毒化細菌を、酵母エキス培地で増殖された一夜培養物から免疫化用に調製した。注射用に、細菌をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈した。生−弱毒化細菌を、２００μＬの容量で尾静脈にｉ．ｖ．投与した。生−弱毒化細菌の注射用ストックを播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を確認した。
実施例５．抗原発現及び免疫応答の評価
ａ．ウェスタンブロット法

ブロス培養物からのウェスタンブロットを、０．７のＯＤ_６００（対数増殖後期）まで酵母エキス培地中で増殖された細菌培養物のＴＣＡ沈殿された上澄み液の等量で実施した。Ｌｍからのウェスタンブロットのために、感染したＤＣ２．４細胞を、１時間、１０の感染多重度（ＭＯＩ）で接種し、細胞をＰＢＳ及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで補充されたＤＭＥＭ培地で３回洗浄した。感染後７時間で細胞を採取した。細胞をＳＤＳサンプル緩衝液で溶解し、収集し、ウェスタンブロット分析用に、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル上に充填し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＡｃｔＡタンパク質の成熟Ｎ−末端に対するポリクローナル抗体を使用した全てのウェスタンブロットを、抗−ｐ６０モノクローナル抗体で、ｐ６０発現（無関係なＬｍタンパク質）に標準化した。抗原検出を、増強化学経口反応（ＥＣＬ）又はＬｉｃｏｒＯｄｙｓｓｅｙＩＲ検出システムでの可視化かつ定量化のいずれかによって可視化した。Ｐｆ抗原構築物に関する結果が、図７〜９に示される。
ｂ．Ｂ３Ｚアッセイ

ＤＣ２．４細胞を、様々なマラリア菌株で感染させて、次いでＯＶＡ_{２５７−２６４}−特異的Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚでインキュベートした。Ｈ−２Ｋ^ｂクラスＩ分子上のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープの提示を、発色体基質を用いてのβ−ガラクトシダーゼ発現を測定することで評価した。Ｐｆ抗原構築物に関する結果が、図５及び６に示されている。
ｃ．フローサイトメトリー用の試薬

ＣＤ４ＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａ７００（Ｌ３Ｔ４，クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ７５０（Ｌｙ−２、クローン５３−６．７）、ＴＮＦＰＥ又はＰＥ−Ｃｙ７（クローンＭＰ６−ＸＴ２２）、ＩＦＮ−γＡＰＣ（クローンＸＭＧ１．２）、ＩＬ−２−ＰＥ（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４）、及びＣＣＲ７−ビオチン（クローン４Ｂ１２）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。ＰＥ−Ｔｅｘａｓレッドストレプトアビジンコンジュゲート及びＧｒＶｉｄは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
ｄ．抗原特異的Ｔ細胞の細胞内染色

それぞれＰｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍａｍｍａｌ（ＣｅｄａｒｌａｎｅＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を用いて肝臓又は末梢血液から単離した脾臓細胞及びリンパ細胞を、ブレフェルジンＡ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）の存在下で、適切なペプチド、１μＭで５時間インキュベートした。Ｐ８１５又はＥＬ−４細胞の同数を、肝臓及び血液からのリンパ細胞でインキュベートした。刺激された細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８について表面染色し、次いで、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、固定し、透過性にした。次いで、細胞をＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−２に関して染色した。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得した。データが、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋事象を特異的に包含するようゲーティングされ、次いでＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、又はＩＬ−２を発現するこれら細胞のパーセンテージを決定した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。結果が図１０〜１５に示されている。
ｅ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ

ネズミＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴＳｐｏｔｐａｉｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）及びＰＶＤＦメンブレン９６−ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。肝臓又は血液からの２×１０^５個の脾臓細胞又は１×１０^５個のリンパ細胞を、適切なペプチドを含むそれぞれのウェルで、３７℃で一夜インキュベートし、アルカリ性ホスファターゼ検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて発色させた。Ｐ８１５又はＥＬ−４細胞のいずれかの抗原提示細胞の同数が、血液及び肝臓リンパ細胞に含まれた。プレートをスキャンし、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレートリーダー及びソフトウェア（ＣＴＬＬｔｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて定量化した。
実施例６：結果

本明細書に提示されるデータからわかるように、前赤血球期のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原ＣＳＰ、ＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１、又はＴＲＡＰをコード化する一価（単一のプラスモジウム抗原配列を発現することを意味する）リステリア菌系ワクチン株は、感染した抗原提示細胞内でマラリア抗原を発現かつ分泌する。感染したＡＰＣ内でＬｉｓｔｅｒｉａＭｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓから発現かつ分泌されたマラリア抗原は処理され、ＭＨＣクラスＩ分子に関して提示される（Ｂ３Ｚデータ）。前赤血球期Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原ＣＳＰ、ＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１、又はＴＲＡＰをコード化する一価リステリア菌系ワクチン株はまた、脾臓、血液及び肝臓において検出される、マラリア抗原特異的免疫性を誘導する。

複数（２つ又は３つ）のマラリア抗原は、同じリステリア菌株（本明細書では、二価及び三価株と呼ぶ）からの感染したＡＰＣｓ内で発現かつ分泌され得る。発現は、それぞれの一価株に匹敵する。２つのリステリア菌遺伝子座から発現された又は１つの遺伝子座からの融合タンパク質として発現されたいずれかの抗原を有する二価リステリア菌ワクチン株は、潜在的な多抗原Ｔ−細胞応答を誘導する。免疫応答の大きさは、それぞれの一価株に匹敵する（図１５）。

三価リステリア菌ワクチン株は、ＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１、及びＣＳＰのそれぞれに対する潜在的抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し、マラリアの予防のための有望な予防ワクチンを生産する。

本発明が、目的を実行し、記述された目標及び利点、並びにその中の固有なものを得るためによく適合していることを、当業者は容易に理解されるであろう。本明細書に提供された実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、これは例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。

多様な置換及び変更が、本発明の範囲及び精神を逸脱しない限りにおいて本明細書に開示された本発明になされ得ることが、当業者には容易に明らかになるであろう。

本明細書で記載される全ての特許文献及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルの指標である。全ての特許文献及び刊行物は、まるで個々の刊行物が、参照により組み込まれるよう特定的かつ個別に指示されたかのような同様な程度まで、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は諸要素、制限又は諸制限の不在下で適切に実行されてもよい。したがって、例えば、各々の例においては、「含むｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「本質的になるｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ」及び「なるｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ」のずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えられ得る。使用されてきた用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定するものではなく、このような用語及び表現の使用では、表示されかつ記載された任意の等価物又はその一部を除外することを意図するものではないが、様々な修正が主張される本発明の範囲内で可能であることが認識されものである。故に、本発明は、好ましい実施形態及び任意の機構によって具体的に開示されてきたが、開示された本明細書の概念の修正及び変形は、当業者に依るものであり得、このような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内で記載される。

Claims

被験体においてプラスモジウム抗原に対するＴ−細胞応答を誘導する方法であって、前記方法が、
前記被験体において、前記Ｔ細胞応答を誘導するよう選択された条件下で、前記被験体に、１つ以上の免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を投与することを含み、このアミノ酸配列が、
野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰ配列に由来するポリペプチド配列を含み、前記アミノ酸配列が、（ｉ）前記細菌における発現のための前記野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）前記野生型配列内に存在する少なくとも１つの疎水性領域での欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合には、前記野生型配列内に存在する反復単位の最小化によって誘導される、方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、配列番号７、９、１１、１３、１５及び１７、若しくはこれら配列からの少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含む、請求項１に記載の方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、前記野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰ配列の少なくとも２つに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、前記野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰ配列の少なくとも３つに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰ配列の１つ以上に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記細菌が、前記細菌の前記ゲノムに組み込まれた前記１つ以上の免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチドをコード化する核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（単球症リステリア菌）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記細菌が、ａｃｔＡ欠失変異体又はａｃｔＡ挿入変異体、ｉｎｌＢ欠失変異体又はｉｎｌＢ挿入変異体、若しくはａｃｔＡ欠失又はａｃｔＡ挿入並びにｉｎｌＢ欠失又はｉｎｌＢ挿入の双方を含むΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ変異体である、請求項６に記載の方法。
１つ以上の前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）をコード化するポリヌクレオチドが、前記細菌の病原性遺伝子中に組み込まれていて、前記ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記病原性遺伝子の発現を阻害し、又は前記病原性遺伝子コード化配列を阻害する、請求項６に記載の方法。
前記病原性遺伝子が、ａｃｔＡ又はｉｎｌＢである、請求項８に記載の方法。
前記細菌が、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項６に記載の方法。
前記細菌が、Ｌｍ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢである、請求項１０に記載の方法。
前記細菌が、核酸を修復するための前記細菌の能力を弱毒化する遺伝子突然変異を更に含む、請求項８に記載の方法。
前記遺伝子突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ及びｒｅｃＡから選択される１つ以上の遺伝子内にある、請求項１２に記載の方法。
前記細菌が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐｒｆＡ変異体であり、その前記ゲノムが、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコード化する、請求項１０に記載の方法。
前記細菌が、殺さなくて代謝活性のＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項６に記載の方法。
前記細菌が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐｒｆＡ変異体であり、その前記ゲノムが、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコード化する、請求項１５に記載の方法。
前記核酸配列が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる発現のためにコドン最適化される、請求項６に記載の方法。
前記被験体において前記Ｔ細胞応答を誘導するよう選択される前記条件が、経口、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮からなる群から選択される投与の１つ以上の経路によって、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを前記被験体に投与することを含む、請求項６に記載の方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、分泌性シグナル配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記分泌性シグナル配列が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡシグナル配列である、請求項１９に記載の方法。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるインフレームＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、又は前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項２０に記載の方法。
前記方法が、融合タンパク質を発現するＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを投与することを含み、前記融合タンパク質が、
配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列か、又は前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
配列番号７の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号９の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１１の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１３の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１５の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１７の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、のうちの１つ以上を含み、
前記融合タンパク質が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅＡｃｔＡプロモーターに操作可能に結合される核酸配列から発現される、請求項１に記載の方法。
前記被験体が、マラリア感染症を有する、請求項１に記載の方法。
前記被験体が、マラリア感染症を有さず、予防的に処置される、請求項１に記載の方法。
前記組成物が、前記被験体に送達される場合、前記送達後２４時間で、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の血清濃度における増加を誘導し、かつ前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）の１つ以上に対するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋抗原に特異的なＴ細胞応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
前記野生型配列における少なくとも１つの疎水性領域の欠失が、前記野生型配列に存在する前記シグナル配列の欠失を含む、請求項１に記載の方法。
組成物であって、前記組成物が、
１つ以上の免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチドを発現する細菌を含み、このアミノ酸配列が、
野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及び／又はＴＲＡＰ配列に由来するポリペプチド配列を含み、前記アミノ酸配列が、（ｉ）前記細菌における発現のための前記野生型配列のコドン最適化、（ｉｉ）前記野生型配列内に存在する少なくとも１つの疎水性領域での欠失、及び／又は（ｉｉｉ）ＬＳＡ１及びＣＳＰの場合には、前記野生型配列内に存在する反復単位の最小化によって誘導される、組成物。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、配列番号７、９、１１、１３、１５及び１７、若しくはこれら配列からの少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含む、請求項２７に記載の組成物。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、前記野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰ配列の少なくとも２つに由来するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の組成物。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、前記野生型プラスモジウムＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、ＣＳＰ、及びＴＲＡＰ配列の少なくとも３つに由来するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の組成物。
前記細菌が、前記細菌のゲノムに組み込まれた前記核酸を含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
前記細菌が、ａｃｔＡ欠失変異体又はａｃｔＡ挿入変異体、ｉｎｌＢ欠失変異体又はｉｎｌＢ挿入変異体、若しくはａｃｔＡ欠失又はａｃｔＡ挿入並びにｉｎｌＢ欠失又はｉｎｌＢ挿入の双方を含むΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ変異体である、請求項３１に記載の組成物。
１つ以上の前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）をコード化するポリヌクレオチドが、前記細菌の病原性遺伝子中に組み込まれていて、前記ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記病原性遺伝子の発現を阻害し、又は前記病原性遺伝子コード化配列を阻害する、請求項３１に記載の組成物。
前記病原性遺伝子が、ａｃｔＡ又はｉｎｌＢである、請求項３３に記載の組成物。
前記細菌が、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項３１に記載の組成物。
前記細菌が、Ｌｍ ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢである、請求項３５に記載の組成物。
前記細菌が、核酸を修復するための前記細菌の能力を弱毒化する遺伝子突然変異を更に含む、請求項３３に記載の組成物。
前記遺伝子突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ及びｒｅｃＡから選択される１つ以上の遺伝子内にある、請求項３７に記載の組成物。
前記細菌が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐｒｆＡ変異体であり、その前記ゲノムが、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコード化する、請求項３５に記載の組成物。
前記細菌が、殺さなくて代謝活性のＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項３６に記載の組成物。
前記細菌が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐｒｆＡ変異体であり、その前記ゲノムが、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコード化する、請求項３１に記載の組成物。
前記核酸が、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる発現のためにコドン最適化される、請求項３１に記載の組成物。
前記組成物が、薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
前記核酸分子が、分泌性シグナル配列を含む融合タンパク質として、前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）をコード化する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
前記分泌性シグナル配列が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡシグナル配列である、請求項４４に記載の組成物。
前記核酸分子が、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９からなる群から選択されるインフレームＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、又は前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質として、前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）をコード化する、請求項４５に記載の組成物。
前記組成物が、核酸分子を含むＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含み、その前記配列が、前記融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質が、
配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列か、又は前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、並びに、
配列番号７の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号９の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１１の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１３の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１５の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、
配列番号１７の配列、又はその少なくとも３０個のアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその修飾物又は断片を含むプラスモジウム由来アミノ酸と、のうちの１つ以上を含み、
前記融合タンパク質をコード化する前記核酸分子が、ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅＡｃｔＡプロモーターに操作可能に結合される、請求項２７に記載の組成物。
前記免疫原性プラスモジウム由来抗原ポリペプチド（複数可）が、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を超える疎水性の領域を有さない１つ以上の隣接するプラスモジウム由来アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
前記野生型配列内に存在する少なくとも１つの疎水性領域の欠失が、前記野生型配列内に存在する前記シグナル配列の欠失を含む、請求項２７に記載の組成物。
被験体におけるマラリア感染症を予防する又は治療する方法であって、前記方法が、
前記被験体において前記Ｔ細胞応答を誘導するよう選択された条件下で、前記被験体に、請求項２６〜４８の一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
前記方法が、前記被験体がマラリア感染症を有する中での治療の方法である、請求項５０に記載の方法。
前記方法が、前記被験体がマラリア感染症を有さない中での予防の方法である、請求項５０に記載の方法。
医薬品製剤であって、
請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の前記組成物と、
薬学的に許容可能な賦形剤と、
を含む医薬品製剤。