CN105018502B

CN105018502B - 青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因及其用途

Info

Publication number: CN105018502B
Application number: CN201510494025.6A
Authority: CN
Inventors: 贺小彦; 曾建斌; 邬飞波
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2015-08-12
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2035-08-12
Also published as: CN105018502A

Abstract

本发明公开了一种青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因，为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了该青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因编码的蛋白质，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该基因用于调控大麦的根毛的生长，从而增强大麦的耐旱性。该基因能调控青藏高原一年生野生大麦XZ5中根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关，对XZ5的耐旱性发挥作用。本发明为培育耐旱大麦品种提供了新的基因资源。

Description

青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因的克隆和分析，还涉及利用BSMV-VIGS方法研究该基因在青藏高原一年生野生大麦XZ5根毛生长及耐旱性中的作用。

背景技术

干旱是影响农作物生长与产量的一个主要环境因素。干旱胁迫引起植株体内一系列生理生化和基因表达的变化。植物的耐旱性或对干旱的适应能力是一个复杂的性状，涉及很多代谢途径和表型特征(Hu和Xiong，2014)，因此解密植物的耐旱机制仍然是一个具有挑战性的任务。

根毛是根表皮细胞的管状突起，在养分和水分的吸收、根系土壤固着以及根与土壤微生物的互作等方面具有重要的作用(Libault等，2010)。研究发现，很多经过长期驯化的植物根系常常具有发达的根毛，这也被视为现代分子育种的一个重要特征。

Expansin是非酶性质的细胞壁松弛和重构蛋白，参与细胞壁的伸长与扩张，因此在种子萌发、根系生长，叶片伸长和果实成熟等多种生物学过程中发挥着重要功能(Cosgrove，2015)。根据expansin家族基因的序列特征，该家族基因被分成四个亚家族：EXPA、EXPB、EXLA和EXLB，其中EXPB对单子叶植物细胞壁的作用更明显(Zhou等，2014；Han等，2015)。EXPB基因一般都含有内含子，但是不同个体间内含子的长度和数量存在明显差异。EXPB蛋白包括DPDD_1和Pollen_allerg_1两个功能域及其它一些保守结构如：DPDD_1功能域中6-8个保守的半胱氨酸残基(Cys，C)、Pollen_allerg_1中4个保守的色氨酸(Trp，W)和HFD(His-Phe-Asp)保守结构，这些序列特征对其功能的发挥是不可或缺的。很多的实验证据已经表明expansin与根毛的生长与发育有关。拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)AtEXP7和AtEXP18在根毛细胞中特异表达，并且能够调控根毛的发生和伸长(Lin等，2011)。水稻(Oryza sativa L.)OsEXPB2、OsEXPB5和大麦(Hordeum vulgare L.)HvEXPB1都被证明对根系建成和根毛生长发育起到调控作用(Kwasniewski和Szarejko 2006；Won等，2010；Zou等，2015)。

与传统的转基因方法验证基因功能相比，病毒诱导基因沉默技术具有速度快、操作简单、高通量、成本低等优势，能够高效鉴定当代植株基因功能缺失的生理和表型变化，从而明确基因功能。但是大多数的VIGS载体都只适合在双子叶植物上应用。基于大麦条纹花叶病毒改造的BSMV载体(由RNAα、RNAβ和RNAγ组成，其中外源基因片段可插入RNAγ的NheI酶切位点间，形成RNAγ:目标基因重组载体，侵染植株时三条RNA链缺一不可)是专一针对单子叶植物的VIGS载体(Wang等，2010)，目前为止，已经在一些重要的单子叶粮食作物如大麦、小麦(Triticum aestivum L.)，水稻和玉米(Zea mays L.)上得到了成功应用，弥补了其它一些VIGS载体不能应用于单子叶粮食作物的不足，是近年来VIGS研究的一个热点(Lee等，2012)，但是在野生大麦上的应用还未见报道。

与栽培大麦相比，青藏高原一年生野生大麦(Hordeum vulgareL.ssp.spontaneum)具有丰富的遗传多样性(Dai等，2012；2014)，并且由于其长期受到各种恶劣生长环境的驯化，形成了一套独特的抗(耐)性基因调控网络，因此从青藏高原一年生野生大麦中发掘优异的抗(耐)性相关基因，进而应用于栽培大麦或其他作物，对作物品种改良具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从青藏高原一年生野生大麦XZ5中克隆的HvEXPB7基因，及其对干旱条件下XZ5根毛生长的作用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因，为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。备注说明：HvEXPB7cDNA来源于青藏高原一年生野生大麦(Hordeum vulgare L.ssp.spontaneum)XZ5。

本发明还同时提供了上述HvEXPB7基因编码的蛋白质，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。备注说明：HvEXPB7氨基酸序列来源于青藏高原一年生野生大麦(Hordeum vulgareL.ssp.spontaneum)XZ5。

本发明还同时提供了一种BSMV:HvPDS重组载体，将SEQ ID No：3所示的286bp的HvPDS基因片段连入RNAγ载体的NheI位点间，从而构建而得。备注说明：SEQ ID No：3为用于构建BSMV:HvPDS重组载体的HvPDS基因片段来源于青藏高原一年生野生大麦(Hordeumvulgare L.ssp.spontaneum)XZ5。

本发明还同时提供了一种BSMV:HvEXPB7重组载体，将SEQ ID No：4所示的258bp的HvEXPB7基因片段连入RNAγ载体的NheI位点间，从而构建而得。备注说明：SEQ ID No：4为用于构建BSMV:HvEXPB7重组载体的HvEXPB7基因片段来源于青藏高原一年生野生大麦(Hordeum vulgare L.ssp.spontaneum)XZ5。

本发明还同时提供了一种BSMV-VIGS体系，利用重组质粒BSMV:HvPDS在青藏高原一年生野生大麦XZ5上建立而得。

本发明还同时提供了上述HvEXPB7基因的用途：该基因用于调控大麦的根毛的生长，从而增强大麦的耐旱性。

作为本发明的HvEXPB7基因的用途的改进：该基因可以调控青藏高原一年生野生大麦XZ5中根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关，对XZ5的耐旱性发挥作用。

备注说明：利用重组质粒BSMV:HvEXPB7在青藏高原一年生野生大麦XZ5上研究HvEXPB7基因的用途。

本发明以发明人前期筛选到的高耐旱青藏高原一年生野生大麦XZ5为材料(Zhao等，2010)，克隆和分析干旱胁迫下野生大麦根毛生长调控关键基因，对阐明野生大麦根毛响应干旱胁迫的分子机理和耐旱育种及生产具有重要意义。

本发明的方案具体如下：

本发明利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)方法克隆了青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因的全长cDNA序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明还利用BSMV-VIGS方法在青藏高原一年生野生大麦XZ5中成功沉默了HvPDS报告基因，首次建立了野生大麦的BSMV-VIGS体系，并利用该体系验证了干旱胁迫下HvEXPB7基因对XZ5根毛生长的调控作用。

HvEXPB7基因克隆与分析：基于根毛转录组测序结果中唯一一个在干旱条件下于XZ5根毛中高表达的EXPB基因片段，通过RACE方法从XZ5中克隆了该基因的全长cDNA序列，命名为HvEXPB7。HvEXPB7基因cDNA全长1278bp，编码一个306aa的蛋白序列，该蛋白分子量为32kDa，等电点pI＝4.79。将HvEXPB7蛋白序列通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)网站进行功能域预测分析，结果显示该蛋白含有两个功能域：DPDD_1功能域和Pollen_allerg_1功能域。将HvEXPB7蛋白序列和水稻OsEXPB7(UniProtKB：Q9LD07)、玉米ZmEXPB7(GeneBank：AAK56130.1)和小麦TaEXPB7(GeneBank：AAS48884.1)的蛋白序列进行保守域分析，结果显示在DPDD_1功能域及其附近含有6个保守的半胱氨酸残基(Cys，C)，Pollen_allerg_1功能域含有4个保守的色氨酸(Trp，W)，另外还有一个HFD(His-Phe-Asp)保守结构。

BSMV:HvPDS和BSMV:HvEXPB7重组载体构建：将一个286bp的HvPDS和一个258bp的HvEXPB7基因片段分别连入RNAγ载体的NheI位点间。反向插入的阳性克隆一方面送公司测序，另一方面将测序正确的单克隆提质粒进行酶切验证，确保了重组载体的准确性。

野生大麦XZ5中BSMV-VIGS体系的建立：PDS基因沉默会引起植株叶片表现出可见的光漂白表型，因此常被用作VIGS体系是否成功的一个报告基因。用MluI限制性内切酶将RNAα和RNAγ:HvPDS质粒充分酶切，用SpeI限制性内切酶将RNAβ质粒充分酶切，使其线性化，以保证后续体外转录生产BSMV病毒。使用体外转录试剂盒将纯化后的线性化产物进行体外转录，将体外转录的BSMV:HvPDS接种两叶期野生大麦XZ5的第二片叶，接种21d后，与对照植株相比(模拟接种BSMV:γ的植株)，接种BSMV:HvPDS植株新长出的叶片表现出明显的光漂白表型。将具有光漂白表型的叶片与对照植株相应叶位的叶片进行HvPDS基因的RT-PCR分析，结果显示，与对照植株相比，接种BSMV:HvPDS植株HvPDS基因的表达量被抑制了94.7％。这些结果说明BSMV-VIGS体系在野生大麦XZ5上得到了成功应用，可以利用该体系在野生大麦XZ5上验证HvEXPB7基因的功能。

利用BSMV-VIGS方法在野生大麦XZ5上验证HvEXPB7基因功能：用MluI限制性内切酶将RNAα和RNAγ:HvEXPB7质粒充分酶切，用SpeI限制性内切酶将RNAβ质粒充分酶切，使其线性化，以保证后续体外转录生产BSMV病毒。使用体外转录试剂盒将纯化后的线性化产物进行体外转录，将体外转录的BSMV:HvEXPB7接种两叶期野生大麦XZ5的第二片叶。为了研究HvEXPB7基因的功能并确定BSMV:HvEXPB7沉默效果，共设置四个处理，分别是：叶片接种BSMV:γ(处理1)，叶片接种BSMV:γ并进行20％PEG 6000模拟干旱处理(处理2)，叶片接种BSMV:HvEXPB7(处理3)，叶片接种BSMV:HvEXPB7并进行20％PEG 6000模拟干旱处理(处理4)。接种21d后(接种BSMV:HvPDS植株的叶片表现出明显光漂白表型的时期)，观察主根根尖根毛生长情况。干旱条件下，无论是模拟接种BSMV:γ的植株还是接种BSMV:HvEXPB7的植株，根毛的长度和数量都大于其相应的对照植株(处理2vs.1，处理4vs.3)。另外，在干旱条件下，模拟接种BSMV:γ的植株和接种BSMV:HvEXPB7的植株根系中HvEXPB7基因的表达量分别是其对照植株的2.3倍和1.1倍(处理2vs.1，处理4vs.3)。对于接种BSMV:HvEXPB7的植株来说，无论是在非干旱还是干旱条件下，与其对照植株相比，根系中HvEXPB7基因的表达量分别被抑制了72.9％和87.4％(处理3vs.1，处理4vs.2)，并且接种BSMV:HvEXPB7植株(处理3，处理4)主根根尖部分根毛的长度和数量明显小于对照植株(处理1，处理2)这些结果说明HvEXPB7基因对XZ5根毛的生长发挥着重要作用。

本发明的意义：通过对青藏高原一年生野生大麦XZ5根毛中HvEXPB7基因的克隆和分析，并结合BSMV-VIGS技术在XZ5上对该基因进行功能验证发现，HvEXPB7参与调控XZ5根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关。本发明为大麦耐旱育种与生产提供了理论依据和相关基因。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

附图说明

图1是HvEXPB7功能域预测图；数字代表氨基酸序列位点。

图2是HvEXPB7与水稻OsEXPB7、玉米ZmEXPB7、小麦TaEXPB7氨基酸序列比对分析。箭头标出部分为DPDD_1和Pollen_allerg_1功能域。(★)指出6个保守的半胱氨酸，(+)指出4个保守的色氨酸，横线为HFD保守结构。

图3是BSMV:HvPDS和BSMV:HvEXPB7载体构建图。(A)BSMV:HvPDS和BSMV:HvEXPB7载体示意图。(B)RNAγ:HvPDS酶切产物琼脂糖凝胶电泳图。(C)RNAγ:HvEXPB7酶切产物琼脂糖凝胶电泳图。1是RNAγ:HvPDS，2是RNAγ:HvPDS经MluI酶切，3是RNAγ:HvPDS经NheI酶切，4是RNAγ:HvEXPB7，5是RNAγ:HvEXPB7经MluI酶切，6是RNAγ:HvEXPB7经NheI酶切。箭头所指为从载体上酶切下来的HvPDS和HvEXPB7基因片段。M1是15000bp DNA marker，M2是2000bp DNA marker。

图4是BSMV-VIGS诱导野生大麦XZ5中HvPDS基因沉默。(A)接种21d后，与接种空载体BSMV:γ的对照植株相比，接种BSMV:HvPDS植株新长出的叶片表现出明显的光漂白表型。(B)接种21d后，与接种空载体BSMV:γ的对照植株相比，接种BSMV:HvPDS植株新长出的叶片HvPDS基因表达变化。

图5是利用BSMV-VIGS方法在野生大麦XZ5上验证HvEXPB7基因的功能。(A)体视显微镜观察根毛表型。(B)RT-PCR分析根中HvEXPB7基因的表达情况。处理(1)是接种BSMV:γ并在基本培养液(BNS)中生长21d，处理(2)是接种BSMV:γ并在BNS中生长16d，再进行20％PEG 6000模拟干旱处5d，处理(3)是接种BSMV:HvEXPB7并在BNS中生长21d，处理(4)是接种BSMV:HvEXPB7并在BNS中生长16d，再进行20％PEG 6000模拟干旱处理5d。

具体实施方式

实施例1、HvEXPB7基因全长cDNA序列的克隆和分析

1、大麦根毛分离

青藏高原一年生野生大麦XZ5种子用2％H₂O₂消毒30min后，蒸馏水冲洗5次，于铺有湿润滤纸的发芽盒中发芽，于培养箱中进行暗培养(22℃/18℃)至萌发，萌芽种子转移至含0.8％琼脂糖的1/2MS基础培养基加20％PEG 6000的平板上(干旱处理)(pH 5.8±0.1)(Verslues等，2006)。所有培养皿用聚乙烯膜封口，避免杂菌污染，置于大麦生长室垂直放置进行培养(22℃/18℃，白天/夜间)。从处理第3d上午10点到处理第5d中午12点期间，每隔5h分别取根毛样(第3d 10点、15点、20点；第4d 1点、6点、11点、14点、21点；第5d 2点、7点、12点。每个点至少10株苗)，以减小根毛不同发育期造成的影响。分离根毛时，将幼苗主根从平板上剪下，立即置于液氮中，用液氮充分预冷的镊子固定住根的一端，再用液氮充分预冷的不锈钢刀将根毛从根上轻轻刮下，并将取过根毛的根丢弃。在根毛的整个分离过程中，确保所有器皿和用具以及大麦根始终置于液氮中。当收集到需要量的根毛后，将含有根毛的液氮倒入50mL预冷的塑料离心管中，置于冰上放置，直到液氮挥发至10mL时，将管子盖上钻有小孔的盖子，置于-80℃保存备用。

2、HvEXPB7基因全长cDNA序列的克隆

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，德国)，根据说明书的步骤提取XZ5根毛总RNA。并用DNaseI(Takara，日本)去除总RNA中基因组DNA污染。按照SMARTer^TMRACE cDNAAmplification Kit(Clontech，美国)说明书将总RNA反转录成单链cDNA，反转录所用到的引物为：

SMARTer II A Oligonucleotide：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'，

3'-RACE CDS Primer A：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N-3'，(N＝A，C，G，T；V＝A，G；C)，

5'-RACE CDS Primer：5'-(T)25V N-3'，(N＝A，C，G，T；V＝A，G；C)。根据测序结果所得HvEXPB7的部分序列信息设计基因特异引物GSPF和GSPR，并结合RACE试剂盒的接头引物UPM-S和UPM-L分别扩增基因的3'端和5'端未知序列，具体引物信息为：

GSPF：5'-TTCAAGGACGGCAAGGGATG-3'，

GSPR：5'-GTTCGACCCCTTCTCCACGT-3'，

UPM-S：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，

UPM-L：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。

将扩增的3'端和5'端序列连入pMD18-T载体(Takara，日本)，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送公司测序。将测序正确的3'端和5'端序列进行拼接，确保具有完整的编码框，并从拼接好的序列两端设计一对引物EXPB7F和EXPB7R扩增HvEXPB7完整的cDNA序列(如SEQID No：1所示)，连入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送公司测序，测序正确的单克隆分别进行菌液甘油保存和提质粒保存。所得质粒为pMD18-T-HvEXPB7质粒。EXPB7F和EXPB7R引物序列为：

EXPB7F：5'-AATCTCCCCAACGGCATTAAC-3'，

EXPB7R：5'-TTTATACACACCAGTGACATAAT-3'。

PCR引物和基因测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

3、HvEXPB7基因序列分析

通过BioXM 2.6将HvEXPB7基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列(最长编码框，如SEQ ID No：2所示)，然后将该氨基酸序列通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白功能域分析(如图1所示)，并利用DNAMAN软件将该蛋白序列与水稻OsEXPB7(UniProtKB：Q9LD07)、玉米ZmEXPB7(GeneBank：AAK56130.1)和小麦TaEXPB7(GeneBank：AAS48884.1)的蛋白序列进行保守结构分析(如图2所示)。

备注说明：该核苷酸序列包括5'端非翻译区(71bp)、编码区ORF+终止密码子TGA(921bp)和3'端非翻译区(286bp)。该核苷酸序列的ORF为918bp(如下划线所述)，按每相邻的3个核苷酸序列确定一个氨基酸残基的原则，编码氨基酸序列为306aa。方框为终止密码子TGA。

实施例2、BSMV-VIGS方法验证HvEXPB7基因功能

1、BSMV:HvPDS和BSMV:HvEXPB7载体构建

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，德国)，根据说明书的步骤提取正常条件下生长的XZ5叶片RNA，并用DNaseI(Takara，日本)去除总RNA中基因组DNA污染。根据PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，日本)说明书步骤将叶片RNA反转录成cDNA。根据NCBI中大麦的PDS基因同源序列(GeneBank：AY062039.1)设计一对引物，从XZ5中扩增获得一段286bp的HvPDS序列(如SEQ ID No：3所示)。

上述扩增的体系为：

Takara ExTaq体系	μL
		10×ExTaq Buffer	5
2.5mM dNTP	4
		PDS-γ-F	1
PDS-γ-R	1
		ExTaq	1
cDNA	1
		ddH₂O	37
总体积	50

扩增程序为：94℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃30s)35个循环，72℃6min。

另外，以保存的pMD18-T-HvEXPB7质粒(实施例1所得)为模板，扩增258bp的HvEXPB7基因片段(如SEQ ID No：4所示)。

上述扩增的体系为：

Takara ExTaq体系	μL
		10×ExTaq Buffer	5
2.5mM dNTP	4
		EXPB7-γ-F	1
EXPB7-γ-R	1
		ExTaq	1
cDNA	1
		ddH₂O	37
总体积	50

引物序列分别为(下划线标出的部分为酶切位点)：

PDS-γ-F：5'-GTACGCTAGCCGACGAGGTTTTTATTGC-3'，

PDS-γ-R：5'-GTACGCTAGCAGTTATTTGAGTCCCGTC-3'，

EXPB7-γ-F：5'-GTACGCTAGCACCCCATACCTACACCTG-3'，

EXPB7-γ-R：5'-GTACGCTAGCATCCCTTGCCGTCCTTG-3'。

分别将HvPDS和HvEXPB7基因片段连入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送公司测序，测序正确的单克隆摇菌提质粒。用NheI限制性内切酶将HvPDS和HvEXPB7从pMD18-T载体上切下来，分别和经同样限制性内切酶酶切并去磷酸化的RNAγ载体进行连接反应。分别将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并用RNAγ载体上的引物γ-stain-F和HvPDS基因正向引物PDS-γ-F以及HvEXPB7基因正向引物EXPB7-γ-F验证反向插入，反向插入的阳性克隆送公司测序，测序正确的单克隆提质粒保存并进行酶切验证(如图3所示)。所得的质粒分别命名为RNAγ:HvPDS和RNAγ:HvExPB7。引物γ-stain-F的序列为：

γ-stain-F：5'-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3'。

2、BSMV载体线性化和体外转录

分别将RNAα、RNAγ、步骤1中所得RNAγ:HvPDS和RNAγ:HvEXPB7用限制性内切酶MluI单酶切，将RNAβ质粒用限制性内切酶SpeI单酶切，分别使其线性化，并进行胶回收纯化。于RNase-free的环境下，将纯化后一定浓度的RNAα、RNAβ、RNAγ、RNAγ:HvPDS和RNAγ:HvExPB7按照RiboMAX^TMLargeScale RNA Production System-T7kit和Ribo m⁷G CapAnalog kit说明书要求进行体外转录(Promega，美国)。将体外转录的RNAα、RNAβ和RNAγ按照1:1:1的体积比混合；将体外转录的RNAα、RNAβ和RNAγ:HvPDS按照1:1:1的体积比混合；将体外转录的RNAα、RNAβ和RNAγ:HvEXPB7按照1:1:1的体积比混合，分别加入三倍体积的RNase-free水进行稀释，另外，向稀释产物中加入等体积的2×GKP缓冲液(1％膨润土，1％硅藻土545，50mM甘氨酸，30mM磷酸氢二钾，pH9.2)，充分混匀，用于后续接种。所得产物命名为BSMV:γ、BSMV:HvPDS和BSMV:HvEXPB7。

3、BSMV接种前大麦幼苗培养

青藏高原一年生野生大麦XZ5种子用2％H₂O₂消毒30min后，蒸馏水冲洗5次，于铺有湿润滤纸的发芽盒中发芽，于培养箱中进行暗培养(22℃/18℃)至萌发，然后进行补光(22℃/18℃，白天/夜间)。第7d时，选取长势一致的幼苗移栽到5L盛有大麦基本培养液(BNS)的黑色塑料桶中，用9孔塑料板覆盖，每孔移栽两株，并用海绵固定，置于大麦生长室进行培养。BNS的组成为(mg L^-1)为：MgSO₄，65.9；(NH₄)₂SO₄，48.2；K₂SO₄，15.9；KNO₃，18.5；Ca(NO₃)₂，59.9；KH₂PO₄，24.8；ZnSO₄·7H₂O，0.11；CuSO₄·5H₂O，0.04；MnCl₂·4H₂O，0.9；HBO₃，2.9；H₂MoO₄，0.01；Fe-citrate,5。每5d更换一次培养液，培养液的PH用NaOH或HCl调至5.8±0.1，整个培养过程用气泵持续通气。

4、野生大麦BSMV-VIGS体系建立

选取两叶期大麦的第二叶进行BSMV摩擦接种(于RNase-free的环境下进行)，每个植株8μL BSMV:γ(RNAα、RNAβ、RNAγ和GKP缓冲液等体积混合物)或8μL BSMV:HvPDS(RNAα、RNAβ、RNAγ:HvPDS和GKP缓冲液等体积混合物)。接种后的植株立即喷施少量RNase-free水，并用保鲜膜覆盖保湿三天，置于大麦生长室继续培养(22℃/18℃，白天/夜间)，定时观察植株表型。对照是：接种BSMV:γ并在BNS中生长21d，处理是：接种BSMV:HvPDS并在BNS中生长21d。对照和处理各5个重复，每个重复5个植株。接种21d后，用EOS 7D(Canon，日本)相机对具有BSMV:HvPDS沉默表型的植株叶片进行拍照。所得结果为：与对照植株相比，接种BSMV:HvPDS植株新长出的叶片表现出明显的光漂白表型(如图4A所示)。

5、BSMV接种验证基因功能

选取两叶期大麦的第二叶进行BSMV摩擦接种(于RNase-free的环境下进行)，每个植株8μL BSMV:γ(RNAα、RNAβ、RNAγ和GKP缓冲液等体积混合物)或8μL BSMV:HvEXPB7(RNAα、RNAβ、RNAγ:HvEXPB7和GKP缓冲液等体积混合物)。接种后的植株立即喷施少量RNase-free水，并用保鲜膜覆盖保湿三天，置于大麦生长室继续培养(22℃/18℃，白天/夜间)，定时观察植株表型。为了研究HvEXPB7基因的功能并确定BSMV:HvEXPB7沉默效果，共设置四个处理，分别是：接种BSMV:γ并在BNS中生长21d(处理1)，接种BSMV:γ并在BNS中生长16d，再进行20％PEG 6000模拟干旱处5d(处理2)，接种BSMV:HvEXPB7并在BNS中生长21d(处理3)，接种BSMV:HvEXPB7并在BNS中生长16d，再进行20％PEG6000模拟干旱处理5d(处理4)。每个处理5个重复，每个重复5个植株。用SZX12(Olympus，日本)体视显微镜观察根毛表型。所得结果为：干旱条件下，无论是模拟接种BSMV:γ的植株还是接种BSMV:HvEXPB7的植株，根毛的长度和数量都大于其相应的对照植株(处理2vs.1，处理4vs.3)。接种BSMV:HvEXPB7植株(处理3，处理4)主根根尖部分根毛的长度和数量明显小于其相应的对照植株(处理1，处理2)(如图5A所示)。

6、RT-PCR验证HvPDS和HvEXPB7基因的表达量

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，德国)，根据说明书的步骤分别提取XZ5不同处理样本的RNA，用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)将各样本RNA分别反转录成cDNA。利用SYBR绿色荧光酶复合物(Bio-Rad，美国)和CFX96PCR仪(Bio-Rad，美国)对相应样本中HvPDS和HvEXPB7基因的表达进行荧光定量PCR分析(qRT-PCR)，并用一个内参基因Actin对表达值进行矫正处理。

PCR体系为：

Bio-Rad SYBR绿色荧光酶体系	μL
		2×iTaq SYBR Green supermix	10
PDS-RT-PCR-F	0.5
		PDS-RT-PCR-R	0.5
cDNA	1
		ddH₂O	8
总体积	20

Bio-Rad SYBR绿色荧光酶体系	μL
		2×iTaq SYBR Green supermix	10
EXPB7-RT-PCR-F	0.5
		EXPB7-RT-PCR-R	0.5
cDNA	1
		ddH₂O	8
总体积	20

Bio-Rad SYBR绿色荧光酶体系	μL
		2×iTaq SYBR Green supermix	10
Actin-F	0.5
		Actin-R	0.5
cDNA	1
		ddH₂O	8
总体积	20

PCR的具体程序为：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)40个循环。溶解曲线程序为：60℃-95℃，每步反应5s，按0.5℃递增。利用2^-ΔΔCq相对定量方法计算基因表达值变化。每组实验重复三次。另外，对相应样本中HvPDS和HvEXPB7基因的表达进行半定量PCR分析，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。RT-PCR引物序列为：

PDS-RT-PCR-F：5'-AGTCTTTGGGTGGTGAGGTC-3'，

PDS-RT-PCR-R：5'-CTTGAAGATATCGACTGGTG-3'，

EXPB7-RT-PCR-F：5'-TCAAGAACGTGAACCTGCCG-3'，

EXPB7-RT-PCR-R：5'-CTTGCCCACGCACCTTATCT-3'，

Actin-F：5'-AAGCATGAAGATACAGGGAGTGTG-3'，

Actin-R：5'-AAATTTATTCTCGGAAGAGGTTGTACA-3'。

所得结果为：将具有光漂白表型的叶片与对照植株相应叶位的叶片进行HvPDS基因的RT-PCR分析，结果显示，与对照植株相比，接种BSMV:HvPDS植株HvPDS基因的表达量被抑制了94.7％(如图4B所示)。另外，在干旱条件下，模拟接种BSMV:γ的植株和接种BSMV:HvEXPB7的植株根系中HvEXPB7基因的表达量分别是其对照植株的2.3倍和1.1倍(处理2vs.1，处理4vs.3)。对于接种BSMV:HvEXPB7的植株来说，无论是在非干旱还是干旱条件下，与其对照植株相比，根系中HvEXPB7基因的表达量分别被抑制了72.9％和87.4％(处理3vs.1，处理4vs.2)(如图5B所示)。

综上所述，通过对青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7的克隆和分析，并结合BSMV-VIGS技术在青藏高原一年生野生大麦XZ5上对该基因进行功能验证发现，HvEXPB7可以调控XZ5中根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关，对XZ5的耐旱性发挥作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.野生大麦HvEXPB7基因，其特征是：为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的野生大麦HvEXPB7基因编码的蛋白质，其特征是：为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.BSMV:HvEXPB7重组载体，其特征是：将SEQ ID No：4所示的258bp的HvEXPB7基因片段连入RNAγ载体的NheI位点间，从而构建而得。

4.如权利要求1所述野生大麦HvEXPB7基因的用途，其特征是：该基因用于调控大麦的根毛的生长，从而增强大麦的耐旱性。

5.根据权利要求4的野生大麦HvEXPB7基因的用途，其特征是：该基因能调控野生大麦XZ5中根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关，对XZ5的耐旱性发挥作用。