WO1999041392A1 - Acide nucleique comprenant la sequence d'un promoteur inductible par un stress et une sequence d'un gene codant pour une stilbene synthase - Google Patents

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Rüdiger Hain
Peter-Helmut Schreier
Michel Boulay
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Champagne Moet & Chandon
Bayer Aktiengesellschaft
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Definitions

  • the present invention relates to plants having improved resistance to certain pathogens sensitive to stilbenes, and more particularly relates to a set of constructs associating a plant promoter inducible by biotic stress, generated in particular by said pathogens, to one or more genes. coding for a stilbene synthase.
  • the control method consisting in improving the resistance of cultivated plants to diseases caused by these pathogens has been considered. It is possible for example, in a first approach, to obtain this improvement by sexual means, by classical genetics, by hybridizing the plants whose resistance is to be improved with tolerant varieties. However, this approach is not always feasible (tolerant natural variety not known) or is not authorized by the legislation such as for example in viticulture by French legislation on Appellations d'Origine Contrôlée (AOC) which limits the grape varieties to be used for a given appellation.
  • AOC Appellations d'Origine Contrôlée
  • these defense mechanisms are of several kinds. Some can be considered passive and are linked to the physico-chemical characteristics of cells, epidermal tissues and / or organs of the plant. The rest belong to the dynamics of gene to gene interactions (plant resistance and pathogen avirulence genes, mechanisms of host-pathogen interactions). These interactions can lead to the development of the hypersensitivity reaction (rapid death of plant cells around the point of infection to block the colonization of the plant by the microorganism) but also to the synthesis and accumulation of a whole series of compounds.
  • some may be wall constituents, involved in the formation of a "physical" barrier around the point of infection (callose, lignin, protein rich in hydroxyproline: HRGP, etc.), other compounds may be molecules with more or less well defined antimicrobial functions (phytoalexins, proteins associated with pathogens: PR proteins (Pathogenesis Related protein), etc.).
  • phytoalexins proteins associated with pathogens: PR proteins (Pathogenesis Related protein), etc.
  • stilbene designates a group of chemicals having the trans-diphenyl-1,2-ethylene skeleton as a common basic structure, resveratrol and pinosylvin being among the simplest.
  • This basic skeleton is synthesized in plants by stilbene synthase or related enzymes, from substrates such as malonyl-CoA, cinnamoyl-CoA or coumaroyl-CoA, substances found in all plants (precursors of flavonoids).
  • the genes for stilbene synthase or related enzymes have been isolated, sequenced and cloned, in particular from peanuts, orchids and vines.
  • stilbenes are found only in certain healthy tissues and at very low concentrations.
  • these stilbenes strongly increase at the infected or injured site, the genes of stilbene synthase being inducible under conditions of biotic or abiotic stress (for example wounds, ultraviolet, etc.).
  • this regulation is rarely present in plants of agronomic interest or when it is present, it may not be sufficiently effective.
  • the study of the synthesis of phytoalexins has shown the presence of stilbenes, including resveratrol, in healthy tissue only for wood.
  • the present invention relates to nucleic acids comprising the promoter sequence of a PR alfalfa protein associated with at least one sequence of a gene coding for a stilbene synthase.
  • the invention relates particularly to nucleic acids according to the invention, characterized in that the promoter of a PR protein of alfalfa is a promoter inducible in plants, specific or non-specific tissues, by biotic or abiotic stress.
  • the invention also relates to nucleic acids according to the invention, characterized in that the promoter sequence of a PR alfalfa protein is chosen from the group comprising: a) the sequence IND SI, b) any sequence corresponding to a fragment of the sequence IND SI and having effect of promoter sequence in plants.
  • promoter sequences of a PR alfalfa protein which have at least 80% homology with the sequence IND SI. Particularly preferred are those which have at least 90% or 95% homology with said sequence.
  • the protein PR promoter sequences in alfalfa according to the invention were obtained from the protein PR gene regulatory sequences by taking advantage of the incompatible response (HR hypersensitivity reaction) obtained in the host-parasite relationship between alfalfa (Medicago sa tiva) and Pseudomonas syringae pv pi ⁇ i to isolate regulatory sequences of genes responsible for this reaction.
  • HR hypersensitivity reaction obtained in the host-parasite relationship between alfalfa (Medicago sa tiva) and Pseudomonas syringae pv pi ⁇ i to isolate regulatory sequences of genes responsible for this reaction.
  • the attack of alfalfa by Pseudomonas the appearance of a reaction of the plant is observed in the area near the necrosis caused by the bacterial infection.
  • the plant material was therefore removed after the bacterial attack in order to constitute a cDNA bank from the messenger RNAs produced in the areas adjacent to the necrosis.
  • Amplification by polymerase chain reaction (PCR) using synthetic polynucleotides corresponding to conserved motifs of PR genes from legume proteins, made it possible to obtain a radioactive probe which was then used to select transcripts in the cDNA bank.
  • PCR polymerase chain reaction
  • one of them was chosen because, after sequencing, it exhibited good homology with equivalent genes coding for PR proteins, known for other plants (cf. Figures 1 and Ibis representing the general scheme of the promoter's isolation method).
  • PR10-1 was inserted into the Eco RI and Bam HI sites of the bluescript plasmid.
  • the plasmid was linearized thanks to a Ps t I site, located upstream of Bam HI in the fragment E-
  • PMs PR10-1 is also understood to mean any nucleic acid fragment of the sequence IND
  • the invention also relates to nucleic acids according to the invention, characterized in that the sequence of a gene coding for a stilbene synthase, whether it is homologous or heterologous, is chosen from the genes isolated from the genomes of the peanut, orchid, vine and pine (EP-309,862, EP-464,461).
  • nucleic acids encoding a vine stilbene synthase, in particular those described in the article by HAIN, R. et al., Nature 1993, 361, 153-156 and in that of IESE, W. et al., Plant Mol. Biol. , 1994, 26, 2, 667-677, the nucleic acid corresponding to the sequence vs tl of said articles is the most preferred.
  • the nucleic acids allowing the expression of the stilbene synthase gene (s) may of course comprise, in addition to said gene (s), sequences in particular of polyadenylation at the 3 ′ end of the coding strand, as well as sequences "Enhancer" of said gene or of a different gene.
  • nucleic acid sequences will have to be adapted in order to ensure that the gene will actually be read in the correct reading phase with the promoter and it will obviously be possible to plan to use, if necessary, several promoters of the same type as well as several "enhancer" sequences.
  • nucleic acids according to the present invention several genes of stilbene synthase, either placed in cascade, or carried by different expression systems.
  • the nucleic acids according to the invention can be used for the production of expression systems in plants, systems which can be inducible and / or constitutive depending on the transformed tissues or organs of the plant (cf. Examples 2, 3 and 4).
  • the present invention therefore also relates to systems for expressing at least one stilbene synthase gene in plants, characterized in that they comprise at least one nucleic acid according to the invention.
  • the transformation vectors and in particular the plasmid type transformation vectors are preferred.
  • said transformation vectors are characterized in that they can be transferred into strains of Agrobacterium.
  • the stilbene synthase genes which can be expressed by the nucleic acids according to the present invention are placed under the control of the promoter PMs PR10-1 in order to trigger in plants mechanisms of resistance to pathogens which are sensitive to stilbenes, in particular to resveratrol, to pinosylvin or their glycosylated derivatives such as picé ⁇ de or to oligomers such as viniferins.
  • pathogens which are sensitive to stilbenes, in particular to resveratrol, to pinosylvin or their glycosylated derivatives such as picé ⁇ de or to oligomers such as viniferins.
  • these parasites sensitive to stilbenes mention may be made of Botrytis cinerea, Plasmopora vi ticola, Eu typa la ta, etc.
  • the expression systems according to the invention preference is given to those characterized in that they are inducible in plants by biotic or abiotic stress.
  • the biotic stresses generated by the attack of a parasite sensitive to stilbenes such as a virus, a bacteria, a yeast, a fungus, in particular Botrytis cinerea or Plasmopora vi ti, are particularly preferred. cola.
  • abiotic stresses caused by a mechanical injury such as that caused in particular by an insect or by a physical phenomenon such as wind or frost.
  • the present invention also relates to plant cells transformed by a system or a vector according to the invention.
  • said plant cells are vine cells.
  • the present invention also relates to methods for transforming plant cells using a microbiological process including the systems or vectors according to the present invention.
  • the invention further relates to methods for obtaining plants expressing one (or more) stilbene synthase gene (s), characterized in that plant cells of said plants are transformed using a system or a vector according to the invention, the cells expressing said gene (s) are selected and a plant is regenerated from these cells.
  • the technology starting in particular from plasmid systems, makes it possible to carry out a first transformation of a strain of competent bacteria, in general E. coli, which makes it possible to clone and control the structure of the plasmids.
  • the strain is then used to transfer the recombinant plasmids into strains of agrobacteria which will then be used to transform plant cells.
  • Plants comprising an expression system or cells according to the invention form part of the invention.
  • the invention relates to plants according to the invention, characterized in that they are plants of agronomic interest, in particular the vine.
  • Figures 1 and 1 bis: General diagram representing the different stages of the method of isolation of the inducible promoter PMs PR10-1 corresponding to the sequence IND SI.
  • Figure 2 Presentation of the various clones isolated and corresponding to the Southern blot, hybridized with the 5 ′ and 3 ′ parts of the cDNA-PR7, delimited by an internal Bam HI (B) site, detected in this AD c.
  • Figure 4 DNA sequence corresponding to the sequence of a vine stilbene synthase gene modified by the addition of an adapter (modified vstl).
  • the modified part is shown in italics.
  • the coding and non-coding parts are represented in upper and lower case letters respectively.
  • Figure 5 DNA sequence comprising the sequence of the inducible promoter PMs PR10-1 (corresponding to the sequence IND SI in lower case) associated with the sequence of a gene of vine stilbene synthase modified by the addition of an adapter (mod vstl, corresponding to Figure 4). Between the two (framed in the sequence) are (written in lower case, end of the promoter and upper case, start of the gene containing the translation initiation codon) the 13 nucleotides coming from an internal sequence of the coding phase of the gene Ms PR10-1, 1 ⁇ TG having been put in reading phase with the modified vs tl gene, these nucleotides are therefore integrated into the coding phase of vstl.
  • the sequence of the inducible PMs PR10-1 promoter includes 7 of the 13 nucleotides of the Ms PR10-1 gene sequence (in lower case in the box).
  • the coding and non-coding (intron) parts of the part corresponding to the sequence of the vine stilbene synthase gene are represented in upper and lower case letters respectively.
  • Figure 6 Demonstration of the induction of a gene encoding a stilbene synthase by U.V ..
  • RNAs are extracted from approximately 1 g of leaves 17 hours after UV induction. 10 to 20 ⁇ g are deposited on a formaldehyde-formamide denaturing gel. After migration (3 V.c ⁇ f 1 ), the RNAs are transferred to a nylon membrane and fixed by exposure to UV (254 nm, 33 mJ.cm "2 ). The Northern blot is obtained by hybridization at 65 ° C overnight with the biotinylated vstl probe.
  • the initial explant consists of leaves isolated from vitroplants of 41B (control) or 41B genetically transformed with a construct (insert 13 kb, comprising two complete stilbene synthase genes vs tl, vst2, a piece of genomic vine DNA and another gene for stilbene synthase of vine (vst3) truncated) integrating supernumerary copies of genes coding for stilbenes synthases of vine under control of their own promoters (clones 2 and 3 corresponding respectively to clones 55-2 and 55-3) .
  • 41B V. vinifera, Chasselas x V. berlandieri hybrid rootstock.
  • Figure 7 Kinetics of accumulation of stilbene synthase mRNAs after UV induction.
  • RNAs are extracted from approximately 1 g of leaves. 10 to 20 ⁇ g are deposited on denaturing formaldehyde gel- 12
  • RNAs After migration (3 V.c ⁇ f 1 ), the RNAs are transferred to a nylon membrane and fixed by exposure to UV (254 nm, 33 mJ.cm "2 ). The Northern blot is obtained by hybridization at 65 ° C overnight with the biotinylated vstl probe.
  • the explants are leaves isolated from vitroplants of 41B.
  • the control is a clone not genetically transformed unlike clones 2 and 3 (corresponding respectively to clones 55-2 and 55-3) which have integrated into their genome 1 insert 13 kb (see above) containing genes coding for vine stilbenes synthases (vstl + vs t2).
  • 41B V. vinifera, Chasselas x V. berlandieri hybrid rootstock.
  • Figure 8 Quantities of resveratrol present in the leaves of vitroplants, treated for 8 min in UV and analyzed at different periods after induction.
  • the quantities are expressed in ⁇ g per g of fresh material.
  • NI not induced.
  • the control consists of leaves taken from untransformed 41B.
  • PCT 55-2 and 55-3 represent two transformants having integrated the 13 kb insert comprising two complete stilbene synthase genes (vstl and vst2).
  • Figure 9 Inhibition of growth of the mycelium of Botrytis cinerea, strain 916T, after 7 days at 20 ° C.
  • the mycelium culture is carried out on malt-glucose medium containing the different concentrations of resveratrol.
  • FIG. 10 Photo plate 1 Macroscopic observations characteristic of the different varieties of vine interacting with Botrytis cinerea 5 days after inoculation of the leaves of vitroplants with a suspension of conidia - Unprocessed plants. Up :
  • Macroscopic observations characteristic of 41B rootstock clones, transformed by different constructions 145: Promoter PMs PR10-1 - vstl gene; 55: 13 kb insert comprising two genes vstl and vst2 under the control of their own promoters), in interaction with Botrytis cinerea, 5 days after inoculation of vitroplanting leaves with a suspension of conidia. Above: - Left: Clone 145-2.
  • Fluorescence filter block A (excitation from 340 to 380 nm; stop filter at 425 nm). Resveratrol emits fluorescent light in bluish white and blue (depending on its concentration), chlorophyll in red. The black area corresponds to the area of infection by the fungus or to necrotic areas when they are small. Up :
  • Rootstock 41B (tolerant) unprocessed. Synthesis of intense resveratrol in the veins and in the limbus around small and very localized areas of infection (necrotic areas).
  • Rootstock 41B transformed by construction 145 that is to say the PMs PR10-1 promoter vstl gene, clone 145-5 very tolerant. Strong synthesis of resveratrol around and, in the area of infection, in the veins and on almost the entire leaf blade.
  • the incompatible response obtained in the host-alfalfa parasite relationship (Medicago sa tiva) and Pseudomonas syringae pv pisi, made it possible to build a cDNA library. It was carried out using messenger RNAs extracted and purified from the area near the necrosis caused by the bacterial infection. The plant material samples were taken 6 hours after infiltration with the bacterial suspension.
  • PR proteins are known to have conserved motifs, this has enabled the synthesis of oligonucleotides corresponding to these defined motifs from the sequencing already carried out on PR pea and soy proteins.
  • PCR amplification made it possible to obtain a radioactive probe, which was then used to select transcripts from the cDNA library.
  • cDNA-PR7 was chosen because after sequencing it presented 87% homology with the genes coding for the PR pea and soy protein. Analysis showed that it actually corresponded to a gene 15
  • Ms PR10-1 Medi cago sa ti va PR protein class 10, clone 1).
  • a control carried out in alfalfa by Northern blot, showed that the corresponding transcript accumulated as early as 3 hours after infection in the case of the incompatible reaction, passed by a maximum between 24 and 48 hours and decreased slowly from 72 hours.
  • This fragment is characterized by the existence of an internal Bam HI site (denoted B in FIG. 1) which delimits two parts:
  • - one called 5 ' of about 340 bases, includes the upstream region of ATG (which is transcribed but not translated) and a downstream sequence corresponding to 306 bases, - the other called 3', corresponds to end of the coding part, ie 165 bases and the 3 'untranslated region, or 186 nucleotides of the stop codon until the start of poly A.
  • PR7 protein corresponded to a small multigenic family.
  • a clone was chosen to be sequenced first, the clone C15 (cf. FIG. 1 bis).
  • Example 2 Energetic transformations carried out to verify the promoter activity of the isolated clone 17
  • control transformations two promoters were chosen: a control promoter and the PR promoter isolated from the alfalfa genome, derived from C15 (corresponding to the PMs promoter PR10-1).
  • This promoter said to be constitutive, is conventionally used. It corresponds to the regulatory sequence for the transcription of the gene for the 35S RNA subunit of the cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • PMs PR10-1 II comes from the EcoRI / BamHI (E / B) fragment of E / B
  • This fragment therefore includes, with reference to the cDNA which served to clone it and in addition to the upstream promoter region: 39 terminal nucleotides of the 5'UTR (UnTranslated Region) of the Ms PR 10-1 gene, located 10 bp from the codon Initiating ATG, the ATG of the Ms PR10-1 gene and a short fragment of its coding region (10 bp), just upstream from the integrated Bam HI site.
  • the promoter thus constructed presents a potential ATG which could lead to the presence of two ATG codons, at a short distance from each other, during the construction of chimeric genes.
  • a risk of modification of the coding phase of the gene used could then exist.
  • STRATAGENE It could be isolated again in the form of an EcoRI / BamHI fragment of approximately 1.5 kb.
  • This plasmid was constructed by one of the laboratories participating in the project to test the effectiveness of promoters (P. RATET, ISV, cited in SZABADOS et al.,
  • the promoter activity can be revealed and measured by histochemical and enzymatic tests of the GUS type.
  • the 35S promoter cloned in the plasmid pDH51 (cf. paragraph 5 below), was extracted and inserted into the multiple cloning site of pPR97, upstream of the reporter gene, in the form of an EcoRI / BamHI fragment.
  • This plasmid is both a positive control, to demonstrate that the construction is functional, and a reference because the 35S promoter was placed in the same environment as the promoter isolated from the PR protein clones.
  • pPR97-PMs PR10-1 The 1.5 kb were inserted into the same cloning site as that defined above, again in the form of an EcoRI / BamHI fragment.
  • pG3-3
  • the different plasmids were used to transform competent bacteria E. coli strain DH5 ⁇ 20
  • agrobacteria Two strains of agrobacteria were selected: EHA 105, AgroJbac eriu-n tumefaciens disarmed, allowing the regeneration of transformed plants (stable transformations), and A4TC24, Agrobacterium rhizogenes used to obtain the reaction of root hair type (Hairy root) and composite plants, with transformed roots but whose rest of the plant has the same phenotype as the original.
  • Leaves of N. ben thamiana were therefore excised and cocultured on agar medium with the different derivatives of the EHA 105 strain. Histochemical tests were then performed 48 h after transformation and then examined after overnight incubation.
  • Construction pPR97-PMs PR10-1 showed gus gene activity similar to that of the positive control
  • Number of buds per explants the number in brackets corresponds to the number of buds obtained at one month, for the first series. For this one (including construction 35S gus intron), the calluses were left more 23
  • the promoter is induced and the histochemical test is positive after 2 hours of incubation (against 5 hours with the 35S promoter).
  • the activity of the gus gene is not uniform in tobacco roots, only the epidermis of the old parts and the apical meristem gave the blue coloration characteristic of the test. According to the literature, the activity of defense genes in the roots is also conventionally observed.
  • a constitutive inducing activity of the isolated promoter PMs PR10-1 is therefore possible in the trichomes of tobacco leaves (3 plants out of 7) but it seems to be under the influence of the development stages.
  • the activity of the promoter in tobacco is therefore limited to the root, to the floral parts (anthers and pollen) and to a few cells of the aerial part (mainly trichomes). 25
  • the aim of the experiment was to study the induction of the promoter during nodulation by the symbiont bacterium Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT et al., 1987).
  • Composite plants were therefore produced by transforming hypocotyl cells from young Lotier germinations with Agrobacterium rhizogenes strain A4TC24, to obtain the phenomenon of root scalp (hairy root phenotype). Once this developed, the main roots were excised and the seedlings were placed in a liquid medium to increase the development of the phenomenon.
  • the hypersensitivity reaction developed in the interaction N. ben thamiana - Pseudomonas syringae pv. pisi, was used in this study.
  • Transformed tobacco plants having incorporated into their genome the various inserts of the plasmids p35S gus intron and pPR97-PMs PR10-1-gus intron, were acclimatized and then infiltrated with a suspension of P. syringae (ESNAULT et al., 1993) at a concentration of 10 9 bacteria per ml.
  • the solution was injected into the limbus using a hypodermic syringe. With such a model, in 48 hours, the HR type reaction is considered to be well developed.
  • PR protein gene promoters PR10-1 PMs promoter
  • this promoter is very inducible by attack by a pathogen.
  • the HR type reaction is not yet fully developed (48 hours for full exposure), however, the GUS test is already positive. With the young transformed tobacco plants obtained, the coloration is weak and produced mainly in the leaf blade of the infiltrated leaf.
  • the coloration obtained during the test is more intense, especially in the veins and trichomes of the infected leaf and only in these tissues for the systemic response.
  • Induction is also not limited to the HR type reaction obtained during the plant / bacteria interaction.
  • the same type of response was obtained with the PMs PR10-l-gus intron construct during infection of one of the explants by a fungus.
  • a homogeneous expression of the gus gene was then visible on the entire infected leaf, except for the area of contamination which itself became necrotic.
  • Table 2 Induction of the various promoters studied during the HR type reaction between N. benthamiana and P. syringae.
  • the method is based on an enzymatic test. It uses: a) a crude extract of the enzyme encoded by the gus gene obtained from transformed tobacco plants, and b) a substrate, p nitrophenyl glucuronide. The rate of hydrolysis of the substrate is followed by a spectrophotometer and is related to the total amount of protein in the extract. However, the method requires 30
  • the promoter 35S placed in the plasmid pG3-3, gave a rate of hydrolysis of the substrate (expressed in arbitrary unit) 5 times higher than the promoter PMs PR10-1, meanwhile placed in the plasmid pPR97.
  • the PMs PR10-1 promoter gave a stronger expression of the gus gene than the 35S promoter, if the latter is placed in the plasmid p35S-gus intron. Indeed, in the latter case, no detection of hydrolysis of the substrate was obtained.
  • the insert used to carry out the work reported below corresponds in fact to a complex genomic clone comprising two complete functional sequences of stilbene synthase genes (genes vstl and vst2) and an incomplete sequence vst3. Subsequently, the sequence of the vstl gene was selected to be incorporated into the constructions made. It corresponds to a 4.9 kb genomic fragment (functional sequence including the promoter) which does not have adequate restriction sites to allow direct cloning in the plasmids usually used as transformation vectors. Additional sites were therefore added by intermediate cloning into a plasmid pCDNA II.
  • the genomic fragment of the vstl gene already indicated was isolated from the original plasmid in which it had been cloned, in the form of an EcoRI / Ps tI fragment (2.1 kb) and cloned again in a plasmid pUC19. Once cloned, the vstl fragment was incorporated into the same sites (EcoRI / PstI) of the plasmid pCDNA II to change the restriction sites, delete the gene terminator and allow the isolation of a Ba HI / BamHI insert (1 , 8 kb).
  • a probe (1.8 kb), comprising the vstl gene, was prepared from the plasmid pCDNA II multiplied in the bacteria E. col i HB 101.
  • the probe was then biotinylated by random priming, with the Polar Plex kit (Plex chemiluminescent kits, Millipore), to allow detection of the genes or transcripts coding for a stilbene synthase by chemiluminescence on Southern and Northern blots, made from nucleic acids extracted from control or transformed vine plants.
  • vstl Southern blot analyzes were carried out after extraction of genomic DNA and then digestion of the latter with EcoRI.
  • the vstl probe made it possible to obtain a large number of bands (approximately 15). These actually correspond to fragments containing sequences coding for a stilbene synthase which constitute a multigenic family (6 to 8 genes according to WIESE et al., 1994).
  • vstl, vst2 and vst3 are highly homologous to each other.
  • other genes can be recognized by this probe, in particular those corresponding to the multigenic family of chalcone synthetase.
  • the two enzymes are in fact of the same structure and the same size (subunit dimers from 41 to 44 kb). They also use the same substrate and their amino acid sequence has a high rate of homology, at least at the active site.
  • pCDNA II contained the vstl gene, and the other, pPCV 002, a Rosier chalcone synthase gene, available in the laboratory.
  • pPCV 002 a Rosier chalcone synthase gene, available in the laboratory.
  • a biotinylated probe corresponding to Rosier's chalcone synthase gene was also prepared.
  • the fresh plant material, leaves or stems, is reduced to powder in a mortar containing liquid nitrogen and the apolar compounds are extracted with methanol (1 ml per 100 mg of fresh material: m.f.).
  • the methanolic extract is filtered through a 0.45 ⁇ m filter and then evaporated to dryness under nitrogen. The residue is taken up in pure methanol (100 ⁇ l / 100 mg mf). In order to remove the pigments (chlorophylls in particular), the sample is then passed through a column C18 (Sep-pack WATERS), previously equilibrated with methanol.
  • CL. HP High Pressure Liquid Chromatography
  • HP WATERS Model 600 E
  • a diode array detector Model 990. WATERS
  • the chromatography support is composed of a C18 reverse phase column (ultra-base Cl8, 205 x 4.6 mm, 5 ⁇ m; Shandon).
  • the analysis of the compounds of the extract is carried out under isocratic conditions, the mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile-water 35/65, V / V with a flow rate of 1 ml. min "1 .
  • An absorption spectrum is produced every two seconds between 200 and 400 nm and resveratrol is detected at its maximum adsorption at 305 nm.
  • resveratrol concentration measured from the area of the peak corresponding to the molecule, is reported 34
  • a 35S (CaMV).
  • the vst1 coding sequence was placed under the control of four “enhancer” sequences isolated from the CaMV 35S promoter and, connected in series in front of the CaMV 35S promoter and the vineyard gene promoter's own “enhancer” sequence (vstl).
  • the two chimeric sequences thus produced were first inserted into the plasmid PMP 90RK then the plasmids were subsequently incorporated into the agrobacterial strain GV3101.
  • the approximately 13 kb fragment of vine genomic DNA has been described above. It notably includes 2 functional genes (vstl and vst2) coding for enzymes stilbene synthases and a gene (vstJ3) incomplete (not 35
  • This vine sequence was co-integrated with a plasmid pGV3850 which was then introduced into a strain of agrobacteria. It therefore corresponds to open reading frames of vst genes (vine stilbene synthase) under the control of their own promoters.
  • the promoter PMs PR10-1 isolated from alfalfa and the vstl gene each comprising an ATG codon initiating translation an adapter was made to clone the vstl gene without additional ATG in the construction.
  • This adapter was synthesized in the form of two oligonucleotides of 11 bp each, one compatible Bam HI, the other a compatible I.
  • the adapter was then incorporated into the Mun I site of the vst1 gene cloned into the plasmid pUC19.
  • the insert was then recovered by Bam HI digestion, then cloned into pBIN 19 between the PMs PR10-1 promoter and the 35S terminator.
  • the insertion of the vstl gene with its adapter was therefore located between the PMs PR10-1 promoter and the 35S terminator. Under these conditions, the ATG of the gene 36
  • vstl has been eliminated and 3 additional codons have been included in the coding phase of vstl, upstream of the gene. It was verified by sequencing that the open reading frame of the gene was still in phase with the rest of the construction.
  • the transformants were analyzed by Southern blot, using the npt11 probe already described.
  • full integration cannot be fully demonstrated by this method and especially by this probe, since in the Agrobacterium system it is accepted that insertion into the genome of the plant begins at the right border and ends at that from the left.
  • the nptIJ gene being located, in the construction used, near the right border, a partial integration, nptll gene inserted but subsequent blocking of integration before the left border, is therefore possible.
  • the transformants were coded 145 and assigned the numbers 2, 5, 6 for those whose results are presented below.
  • vitro having 6 to 8 well developed leaves, can be obtained in two months of culture.
  • Each sample is made up of 3 leaves isolated from the same plant, induced separately by UV rays but combined for extraction and dosing. The test is carried out on excised sheets, isolated from vitroplants, or on 39
  • vitroplants in culture on agar medium having 6 to 7 well-developed leaves.
  • the three oldest leaves of each seedling are taken and used for the test.
  • Exposure to UV rays is carried out on their upper side.
  • the amounts of resveratrol obtained are expressed in ⁇ g of product, reported either per gram of fresh weight of leaves analyzed, or per gram of dry matter (evaluated on the pellet, after centrifugation after methanolic extraction) or in mg of resveratrol per g of chlorophyll.
  • UV expression of the genes coding for stilbene synthase was carried out after a period separating UV induction from the analyzes fixed at 17 hours
  • Clones 55-2 and 55-3 correspond to transformed plants having integrated a 13 kb insert containing genes coding for a stilbene synthase.
  • Table 4 Kinetics of the evolution of resveratrol concentrations on leaves of vitroplants of 41B, induced by UV taken from the plants in culture on agar medium, then isolated and analyzed for their resveratrol content at different periods after induction.
  • the amount of resveratrol found in the control sheets is maximum 24 hours after induction (of the order of 80 ⁇ g.g * 1 mf for 41B).
  • Table 5 presents the results obtained for a second series of transformants having integrated the 13 kb insert.
  • the study of the kinetics of UV induction of the expression of genes coding for stilbene synthase was carried out after a period separating UV induction from analyzes varying from 20, 40 or 60 hours.
  • Resveratrol concentrations are expressed in ⁇ g.g -1
  • the first corresponds to the control and to two of transformants 55-6 and 55-7. They generally have a maximum resveratrol concentration of between 280 44
  • the second group has higher maxima, almost double the first (820 to 930 ⁇ g. g "1 dry matter). It consists only of transformants (55-2, 55-3 and 55-9) The maximum is expressed 40 hours after induction with UV, on the other hand, 20 hours after induction, these plants often have concentrations much lower than those of the first group. This is the case for example of clones 55-2 and 55 -3 (135 and 44 ⁇ g.g "1 of dry matter respectively).
  • One of the clones, 55-9 is however interesting since it shows higher resveratrol concentrations than those of the control in all cases (386, 823 and 54 ⁇ g.g "1 of dry matter for times of 20, 40 and 60 hours after induction).
  • UV induction is carried out on vitroplants in culture on agar medium. The leaves are removed and extracted for analysis 20 hours after treatment.
  • the results represent the average of 3 repetitions.
  • the transformants meanwhile, have resveratrol contents, 20 hours after induction, greater than or equal to the untransformed control 41B (539,
  • the concentration obtained is half that of the control. If we compare these values, expressed in ⁇ g.g "1 dry weight, with those of the isolated leaves (Table 5), we see that they are similar for the control but on the other hand that the variations exist for the transformants analyzed 20 hours after induction. These are sometimes very important (135 for induction on isolated sheets and 362 for induction on vitroplants for clone 55-2; 44 against 236 for clone 55-3; 392 against 116 for clone 55-5 and 339 against 540 for 55-6). In addition, there is great variability between the different repetitions.
  • the action of the molecule was studied on the growth of the mycelial hyphae of Botrytis cinerea in culture on a Malt-Agar medium, comprising a range of 48
  • the test developed consisted in inoculating seedling leaves, cultivated in vitro on microbouturage medium, by depositing on their upper face 20 ⁇ l of a suspension of conidia at 1.10 "4 conidia. Ml " 1 (200 conidia per deposit) in a malt-glucose medium.
  • the seedlings thus inoculated on 4 different leaves, are then cultivated in a climatic chamber (photoperiod 16 h day, 8 h night; temperature 24 ° C; humidity 70%). Two days after inoculation, the youngest row 4 leaves were observed (necrosis and maceration present, counted using a camera connected to a television monitor) and extracted with methanol to allow the dosing of the resveratrol synthesized in response.
  • leaves number 2 were removed to be observed under fluorescence microscopy. Macroscopic observation (necrosis and maceration on the leaves) and a count of foil with fruiting bodies' mushroom (conidiophores) has also been made on the leaves number 3. Finally at 9 days of leaves 49
  • leaf symptoms (maceration area of the fungus or necrotic spots, consisting of small black-brown areas, located around the spores of the fungus, or with no visible symptoms)
  • Maceration zones large and diffuse zone where Botrytis rapidly destroys plant cells. These areas have a light brown beige color.
  • Necrotic spots very small areas circumscribed around the fungus. These spots are brown-black in color.
  • Maceration zones large and diffuse zone where Botrytis rapidly destroys plant cells. These areas have a light brown beige color.
  • Table 9 Results of the resveratrol assays by H.P.L.C. on different vine varieties interacting with Botrytis cinerea for 2 days
  • Resverate variety mg.g "1 resverate. ⁇ g.g " 1 tested chloroph. dry weight
  • resveratrol resveratrol
  • chloroph. chlorophyll Folle B 280: Folle blanche 280;
  • Pinot N 386 Pinot noir 386;
  • Ugni B 479 Ugni-blanc 479;
  • Porte-g41 B Rootstock 41B.
  • the dosage, carried out on the entire sheet, is not representative of the variations in synthesis of resveratrol existing in each cell that composes it. It is, in fact, generally accepted that, in hypersensitivity reactions to a parasite, not all limbus cells synthesize defense molecules. Only the cells located near the attack zones of the fungus are induced to synthesize phytoalexins. The analyzes carried out in this test therefore only represent values corresponding to an average level of resveratrol present in the leaf blade interacting with the parasite. A significant dilution phenomenon can therefore occur, especially for resistant plants, between the concentrations present in the cells induced in the synthesis of phytoalexin and the value found during the analysis of the entire leaf.
  • Table 10 shows that the former has approximately 3 times more resveratrol than the latter, regardless of the units 58
  • vine plants having incorporated the PMs PR10-1-vstl gene and 13 kb insert constructs were obtained. These genetically transformed plants could be compared to the control (41B not transformed) and multiplied by micropropagation.
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  • VAN LOON L.C PIERPOINT W.S., BOLLER T., CONEJERO V., 1994. Recommendations for naming plant pathogenesis related proteins. Plant Mol. Biol. Rep 12, 245-264.

Abstract

La présente invention concerne des plantes présentant des résistances améliorées à certains agents pathogènes sensibles aux stilbènes, et concerne plus particulièrement un ensemble de constructions associant un promoteur végétal inductible par un stress biotique, engendré notamment par lesdits pathogènes, à un ou des gène(s) codant pour une stilbène synthase.

Description

ACIDE NUCLEIQUE COMPRENANT LA SEQUENCE D'UN PROMOTEUR INDUCΗBLE PAR UN STRESS ET UNE SEQUENCE D'UN GENE CODANT POUR UNE STILBENE SYNTHASE
La présente invention concerne des plantes présentant des résistances améliorées à certains agents pathogènes sensibles aux stilbènes, et concerne plus particulièrement un ensemble de constructions associant un promoteur végétal inductible par un stress biotique, engendré notamment par lesdits pathogènes, à un ou des gène (s) codant pour une stilbene synthase.
Une grande partie de la récolte mondiale de plantes cultivées est constamment détruite par les parasites et les pathogènes. Parmi les possibilités permettant de diminuer ou d'empêcher l'attaque des plantes cultivées par ces parasites, la lutte chimique (traitements phytosanitaires) est la méthode la plus utilisée. Néanmoins, l'application de produits chimiques n'est pas sans conséquence pour l'environnement et pose parfois des problèmes technologiques comme par exemple l'apparition de nouvelles souches pathogènes résistantes ou, dans le domaine de l'oenologie, les difficultés qui peuvent survenir au cours des fermentations (l'utilisation d'inhibiteurs de la biosynthèse des stérols peut bloquer la croissance des levures en fin de fermentation) ou la présence de produits chimiques retrouvés parfois dans les vins comme la procymidone, produit anti-Botrytis.
Pour pallier les inconvénients liés à la lutte chimique, la méthode de lutte consistant à améliorer la résistance des plantes cultivées aux maladies provoquées par ces pathogènes a été envisagée. Il est possible par exemple, dans une première approche, d'obtenir cette amélioration par voie sexuée, par la génétique classique, en hybridant les plantes dont on veut améliorer la résistance avec des variétés tolérantes. Néanmoins, cette approche n'est pas toujours réalisable (variété naturelle tolérante non connue) ou n'est pas autorisée par la législation comme par exemple en viticulture de par la législation française sur les Appellations d'Origine Contrôlée (A.O.C.) qui limite les cépages à utiliser pour une appellation donnée. Dans une deuxième approche, il est possible, en utilisant les techniques modernes de la biologie cellulaire et moléculaire, d'intégrer dans le génome de la plante un ou plusieurs gènes homologues ou hétérologues permettant la surexpression ou l'expression d'une molécule d'intérêt de nature protéique afin d'augmenter la production d'un métabolite ou d'une voie métabolique ou d'ouvrir une nouvelle voie de biosynthèse ou de synthétiser une nouvelle molécule permettant par exemple d'accroître l'ouverture d'une nouvelle voie de biosynthèse, permettant par exemple d'accroître la résistance de la plante en renforçant ses mécanismes de défense vis-à-vis des pathogènes en cause.
Chez les végétaux, ces mécanismes de défense sont de plusieurs ordres. Les uns peuvent être considérés comme passifs et sont liés aux caractéristiques physico-chimiques des cellules, des tissus épidermiques et/ou des organes de la plante. Les autres appartiennent à la dynamique des interactions gène à gène (gènes de résistance du végétal et d'avirulence du pathogène, mécanismes des interactions hôte-pathogène) . Ces interactions peuvent conduire au développement de la réaction d'hypersensibilité (mort rapide des cellules du végétal autour du point d'infection pour bloquer la colonisation de la plante par le microorganisme) mais aussi à la synthèse et à l'accumulation de toute une série de composés. Parmi ceux-ci, certains peuvent être des constituants pariétaux, impliqués dans la formation d'une barrière « physique » autour du point d'infection (callose, lignine, protéine riche en hydroxyproline : HRGP, etc.), d'autres composés peuvent être des molécules aux fonctions antimicrobiennes plus ou moins bien définies (phytoalexines , protéines associées aux pathogènes : PR protéines (Pathogenesis Related protein) , etc.) . Parmi les molécules de type phytoalexines qui sont synthétisées et accumulées par les plantes lors, par exemple, des interactions hôte-pathogène, on trouve notamment les stilbenes qui sont toxiques, notamment pour les micro-organismes. Le terme de stilbene désigne un groupe de substances chimiques possédant le squelette trans-diphényl-1, 2-éthylène comme structure de base commune, le resvératrol et la pinosylvine étant parmi les plus simples. Ce squelette de base est synthétisé dans les plantes par une stilbene synthase ou des enzymes ap- parentées, à partir de substrats comme le malonyl-CoA, le cinnamoyl-CoA ou le coumaroyl-CoA, substances que l'on trouve dans toutes les plantes (précurseurs des flavonoïdes) . Les gènes de stilbene synthase ou des enzymes apparentées ont été isolés, séquences et clones, notamment à partir de l'arachide, de l'orchidée et de la vigne. On a pu réaliser à partir de ces gènes la transformation de plantes telles que la pomme de terre, la luzerne ou le tabac, présentant, par comparaison aux plantes non transformées, une résistance supérieure à l'attaque par des pathogènes (EP-309862 ; EP-648839 ; MELCHIOR, F. et al., Arch. Bioche . Biophys . 1991, 288, 2, 552-557 ; WIESE, W. et al., Plant Mol. Biol . 1994, 26, 2, 667-677 ; HAIN, R. et al., Nature 1993, 361, 153-156).
L'expression ou la surexpression de ces molécules aux fonctions antimicrobiennes peut permettre d'obtenir une résistance « naturelle » des plantes en réponse à des stress, notamment des stress de type microbien. Cependant, une surexpression constitutive de ce type de protéines ne peut être envisagée sans inconvénient pour la plante (coût énergétique, ralentissement de la croissance, etc.)
(FISCHER, R. et al., The plant Journal 1997, 11, 3, 489-
498) .
D'autre part, dans le cas de certaines plantes comme par exemple la vigne ou des plantes herbacées, on trouve des stilbenes uniquement dans certains tissus sains et à des concentrations très faibles. Par contre, à la suite d'une infection ou d'une lésion, ces stilbenes augmentent fortement au niveau du site infecté ou lésé, les gènes de stilbene synthase étant inductibles en conditions de stress biotique ou abiotique (par exemple blessures, ultraviolets, etc.). Néanmoins, cette régulation est rarement présente chez les plantes d'intérêt agronomique ou lorsqu'elle est présente, elle peut ne pas être suffisamment efficace. Par exemple, dans le cas de la vigne, l'étude de la synthèse de phytoalexines a montré la présence de stilbenes, dont le resvératrol, dans les tissus sains seulement pour le bois.
Dans les tissus de la baie de raisin, la présence de stilbenes est trouvée lorsque, d'une part, la baie est soumise à un stress comme 1 ' attaque par un pathogène
(Botrytis cinerea pour la pourriture grise ou Plas opora vi ticola pour le Mildiou), et, d'autre part, uniquement jusqu'à la véraison du jeune fruit. En revanche, la concentration de stilbenes diminue fortement de la véraison à la maturation. Or, les dégâts dus par exemple à Botrytis sont rarement rencontrés jusqu'à la véraison mais plutôt lorsqu'on se situe près de la maturation de la baie. C'est pourquoi il est nécessaire de contrôler l'expression de gènes de stilbene synthase par des promoteurs forts, échappant à la régulation naturelle du gène, promoteurs devant être inductibles et en particulier inductibles par le stress lui-même. C'est précisément l'objet de la présente invention.
La présente invention concerne des acides nucléiques comprenant la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne associée à au moins une séquence d'un gène codant pour une stilbene synthase.
L'invention concerne particulièrement des acides nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que le promoteur d'une PR protéine de la luzerne est un promoteur inductible dans les plantes, tissus spécifiques ou non, par un stress biotique ou abiotique.
L'invention concerne également des acides nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne est choisie dans le groupe comprenant : a) la séquence IND SI, b) toute séquence correspondant à un fragment de la séquence IND SI et ayant effet de séquence promotrice chez les plantes.
On préfère les séquences du promoteur d'une PR protéine de la luzerne qui présentent au moins 80 % d' homologie avec la séquence IND SI. Particulièrement préférées sont celles qui présentent au moins 90 % ou 95 % d' homologie avec ladite séquence.
Les séquences de promoteurs de PR protéines chez la luzerne selon l'invention ont été obtenues à partir des séquences régulatrices de gènes de PR protéines en mettant à profit la réponse incompatible (réaction d'hypersensibilité HR) obtenue dans la relation hôte-parasite entre la luzerne {Medicago sa tiva) et Pseudomonas syringae pv piβi pour isoler des séquences régulatrices de gènes responsables de cette réaction. Lors de l'attaque de la luzerne par Pseudomonas , l'apparition d'une réaction de la plante est observée dans la zone voisine de la nécrose provoquée par l'infection bactérienne .
Le matériel végétal a donc été prélevé après l'attaque bactérienne afin de constituer une banque d'ADNc à partir des ARNs messagers produits dans les zones voisines de la nécrose. Une amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , utilisant des poly- nucléotides de synthèse correspondant à des motifs conservés de gènes de PR protéines de légumineuses, a permis d'obtenir une sonde radioactive qui a été ensuite utilisée pour sélectionner des transcrits dans la banque d'ADNc. Parmi ceux-ci, l'un d'entre eux (ADNc-PR7) a été retenu car, après séquençage, il présentait une bonne homologie avec des gènes équivalents codant pour des PR protéines, connus pour d'autres plantes (cf. Figures 1 et Ibis représentant le schéma général de la méthode d'isolement du promoteur).
L'analyse a montré qu'il correspondait à un gène codant pour une PR protéine de classe 10 selon la classification de VAN LOON (1994) . C'est pourquoi ce gène a été dénommé Ms PR10-1 (Medi cago sa ti va PR protéine classe
10, clone 1). L ' ADNc PR7 isolé et clone a permis d'obtenir deux sondes grâce à la présence d'un site Bam HI interne (B sur la Figure 1). Celles-ci, EB et BE (E correspondant au site Eco RI sur la Figure 1) nommées respectivement 5' et
3 ' , ont été utilisées pour cribler une banque génomique de luzerne. Parmi les clones obtenus, reconnus par les sondes
5' et 3', l'un d'entre eux, C15, a été sélectionné et séquence (6,1 b) . Il possède lui aussi comme il est logique un site Bam HI qui a permis d'obtenir deux nouveaux fragments EB de 2,4 kb et BE de 3,7 kb nommés respectivement E-B(g) et B-E(g), g indiquant la nature génomique des fragments obtenus (voir Figure Ibis) . Le fragment E-B(g), situé en 5 ' du clone C15, comprenant le promoteur et une partie de sa séquence codante du gène Ms
PR10-1 a été inséré dans les sites Eco RI et Bam HI du plasmide bluescript. Le plasmide a été linéarisé grâce à un site Ps t I, situé en amont de Bam HI dans le fragment E-
B(g) . Sur ce fragment, une délétion de 3' en 5' a été réalisée jusqu'à obtenir la séquence promotrice IND SI
(Figure 3) . Une ligature en bout franc a permis de repositionner un autre site Bam HI, interne au clone C15, à la fin de la séquence promotrice du gène Ms PR10-1. Dans ces conditions, 13 nucléotides de la séquence codante du gène Ms PR10-1, situés en amont de ce site Bam HI interne du clone C15, ont été ainsi intégrés à la séquence promotrice IND SI, l'ensemble peut être isolé par une digestion Eco RI / Bam HI (voir Exemple 1) .
Dans la description, on entend également par PMs PR10-1 tout fragment d'acide nucléique de la séquence IND
SI à effet de promoteur chez les plantes et la séquence IND SI avec 13 nucleotides de la séquence codante du gène Ms PR10-1 telle que décrite ci-dessous.
L'invention concerne également des acides nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que la séquence d'un gène codant pour une stilbene synthase, qu'il soit homologue ou hétérologue, est choisie parmi les gènes isolés à partir des génomes de l'arachide, de l'orchidée, de la vigne et du pin (EP-309 862, EP-464 461) .
Parmi lesdits acides nucléiques, on préfère les acides nucléiques codant pour une stilbene synthase de vigne, notamment celles décrites dans l'article de HAIN, R. et al., Nature 1993, 361, 153-156 et dans celui de IESE, W. et al., Plant Mol. Biol . , 1994, 26, 2, 667-677, l'acide nucléique correspondant à la séquence vs tl desdits articles est le plus préféré.
Les acides nucléiques permettant l'expression du ou des gène (s) de stilbene synthase pourront bien entendu comporter, outre ledit ou lesdits gène (s), des séquences notamment de polyadénylation à l'extrémité 3' du brin codant, ainsi que des séquences « enhancer » dudit gène ou d'un gène différent.
Bien entendu, les séquences des acides nucléiques devront être adaptées afin de s'assurer que le gène sera effectivement lu en phase de lecture correcte avec le promoteur et il sera évidemment possible de prévoir d'utiliser, si cela est nécessaire, plusieurs promoteurs du même type ainsi que plusieurs séquences « enhancer ».
Il est également possible d'exprimer à l'aide des acides nucléiques selon la présente invention plusieurs gènes de stilbene synthase, soit placés en cascade, soit portés par des systèmes d'expression différents.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être utilisés pour la réalisation de systèmes d'expression dans les plantes, systèmes pouvant être inductibles et/ou constitutifs suivant les tissus ou organes de la plante transformés (cf. Exemples 2, 3 et 4) . La présente invention a donc également pour objet des systèmes d'expression d'au moins un gène de stilbene synthase chez les plantes, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un acide nucléique selon l'invention. Parmi les systèmes selon l'invention, on préfère les vecteurs de transformation et notamment les vecteurs de transformation de type plasmidique. Avantageusement, lesdits vecteurs de transformation sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être transférés dans des souches d' Agrobacterium .
Les gènes de stilbene synthase pouvant être exprimés par les acides nucléiques selon la présente invention sont placés sous le contrôle du promoteur PMs PR10-1 afin de déclencher chez les plantes des mécanismes de résistance aux pathogènes qui sont sensibles aux stilbenes, notamment au resvératrol, à la pinosylvine ou à leurs dérivés glycosylés comme le picéïde ou à des oligomères comme les viniférines. Parmi ces parasites sensibles aux stilbenes, on peut citer Botrytis cinerea , Plasmopora vi ticola , Eu typa la ta , etc..
Parmi les systèmes d'expression selon l'invention, on préfère ceux caractérisés en ce qu'ils sont inductibles dans les plantes par un stress biotique ou abiotique . Parmi lesdits stress biotiques selon l'invention, on préfère en particulier les stress biotiques engendrés par l'attaque d'un parasite sensible aux stilbenes tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon, notamment Botrytis cinerea ou Plasmopora vi ti cola . Parmi lesdits stress abiotiques selon l'invention, on préfère en particulier les stress abiotiques engendrés par une blessure mécanique, telle que celle causée notamment par un insecte ou par un phénomène physique tel que le vent ou le gel. La présente invention a également pour objet des cellules végétales transformées par un système ou un vecteur selon l'invention. Avantageusement, lesdites cellules végétales sont des cellules de vigne.
La présente invention concerne également des procédés permettant de transformer des cellules végétales à l'aide d'un procédé microbiologique incluant les systèmes ou les vecteurs selon la présente invention.
L'invention concerne en outre des procédés d'obtention de plantes exprimant un (ou plusieurs) gène (s) de stilbene synthase, caractérisés en ce qu'on transforme des cellules végétales desdites plantes à l'aide d'un système ou d'un vecteur selon l'invention, on sélectionne les cellules exprimant ledit ou lesdits gène (s) et l'on régénère une plante à partir de ces cellules.
Parmi les méthodes de transformation les plus utilisées, il faut citer notamment les méthodes mettant en oeuvre Agrobacterium, qu'il s'agisse d 'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, de biolistique ou toutes autres techniques (électroporation, etc.).
Ces méthodes sont connues (REAM, W., 1989 ; NEGRETIU, I. et GHARTI-CHHETRI , G.B., 1991 ; CASSE-DELBART, F., 1996 ; STANFORD, J.C., 1990) et elles ne seront pas décrites de nouveau en détail .
La technologie, partant notamment de systèmes plasmidiques , permet d'effectuer une première trans- formation d'une souche de bactéries compétentes, en général E. coli , ce qui permet de cloner et de contrôler la structure des plasmides. La souche est ensuite utilisée pour transférer les plasmides recombinants dans des souches d' agrobactéries qui seront ensuite utilisées pour transformer les cellules végétales.
Les plantes comportant un système d'expression ou des cellules selon l'invention font partie de l'invention.
Font également partie de l'invention, les plantes obtenues par la mise en oeuvre des procédés selon l'invention. 10
Enfin, l'invention concerne les plantes selon l'invention, caractérisées en ce qu'il s'agit de plantes d'intérêt agronomique, notamment la vigne.
D'autres caractéristiques et avantages des constructions et des procédés selon la présente invention pourront être mis en évidence dans les exemples qui vont suivre .
Légendes des Figures
Figures 1 et 1 bis : Schéma général représentant les différentes étapes de la méthode d'isolement du promoteur inductible PMs PR10-1 correspondant à la séquence IND SI.
Figure 2 : Présentation des divers clones isolés et correspondant au Southern blot, hybride avec les parties 5' et 3' de l'ADNc-PR7, délimitées par un site Bam HI (B) interne, détecté dans cet AD c .
Sites de restriction : E = Eco RI, B = Bam HI . Les valeurs indiquées sur la figure sont exprimées en kb (kilo bases) .
Figure 3 : Séquence d'ADN correspondant à la séquence IND
SI, séquence génomique isolée du promoteur inductible de luzerne PMs PR10-1.
Figure 4 : Séquence d'ADN correspondant à la séquence d'un gène de stilbene synthase de vigne modifiée par l'ajout d'un adaptateur (vstl modifié).
La partie modifiée est représentée en caractère italique .
Les parties codantes et non codantes (intron) sont représentées respectivement en lettres majuscules et minuscules .
Figure 5 : Séquence d'ADN comprenant la séquence du promoteur inductible PMs PR10-1 (correspondant à la séquence IND SI en minuscule) associée à la séquence d'un gène de stilbene synthase de vigne modifiée par l'ajout d'un adaptateur (vstl modifié, correspondant à la Figure 4) . Entre les deux (encadré dans la séquence) se trouvent (écrits en minuscule, fin du promoteur et en majuscule, début du gène contenant le codon d'initiation de la traduction) les 13 nucleotides venant d'une séquence interne de la phase codante du gène Ms PR10-1, 1 ' ΛTG ayant été mis en phase de lecture avec le gène vs tl modifié, ces nucleotides sont donc intégrés à la phase codante de vstl.
La séquence du promoteur inductible PMs PR10-1 inclut les 7 des 13 nucleotides de la séquence du gène Ms PR10-1 (en minuscule dans l'encadré). Les parties codantes et non codantes (intron) de la partie correspondant à la séquence du gène de stilbene synthase de vigne sont représentées respectivement en lettres majuscules et minuscules.
Figure 6 : Mise en évidence de l'induction de gène codant pour une stilbene synthase par les U.V..
Les ARNs sont extraits d'environ 1 g de feuilles 17 heures après induction aux U.V.. 10 à 20 μg sont déposés sur gel dénaturant formaldéhyde-formamide . Après migration (3 V.cπf1), les ARNs sont transférés sur membrane nylon et fixés par exposition aux U.V. (254 nm, 33 mJ.cm"2) . Le Northern blot est obtenu par hybridation à 65°C pendant une nuit avec la sonde vstl biotinylée.
L'expiant de départ est constitué de feuilles isolées de vitroplants de 41B (témoin) ou de 41B transformés génétiquement avec une construction (insert 13 kb, comprenant deux gènes de stilbene synthase complets vs tl , vst2, un morceau d'ADN génomique de vigne et un autre gène de stilbene synthase de vigne (vst3) tronqué) intégrant des copies surnuméraires de gènes codant pour des stilbenes synthases de vigne sous contrôle de leurs propres promoteurs (clones 2 et 3 correspondant respectivement aux clones 55-2 et 55-3) . 41B : porte-greffe hybride V. vinifera , Chasselas x V. berlandieri .
Figure 7 : Cinétique d'accumulation des ARNms de stilbene synthase après induction aux U.V..
Les ARNs sont extraits d'environ 1 g de feuilles. 10 à 20 μg sont déposés sur gel dénaturant formaldéhyde- 12
formamide . Après migration (3 V.cπf1), les ARNs sont transférés sur membrane nylon et fixés par exposition aux U.V. (254 nm, 33 mJ.cm"2). Le Northern blot est obtenu par hybridation à 65°C pendant une nuit avec la sonde vstl biotinylée.
Les explants sont des feuilles isolées de vitroplants de 41B. Le témoin est un clone non transformé génétiquement contrairement aux clones 2 et 3 (correspondant respectivement aux clones 55-2 et 55-3) qui ont intégré dans leur génome 1 ' insert 13 kb (voir ci-dessus) contenant des gènes codant pour des stilbenes synthases de vigne (vstl + vs t2) . 41B : porte-greffe hybride V. vinifera , Chasselas x V. berlandieri .
Figure 8 : Quantités de resvératrol présentes dans les feuilles de vitroplants, traitées 8 min aux U.V. et analysées à différentes périodes après induction.
Les quantités sont exprimées en μg par g de matière fraîche .
NI : non induit . Le témoin est constitué par des feuilles prélevées sur 41B non transformé. PCT 55-2 et 55-3 représentent deux transformants ayant intégré 1 ' insert de 13 kb comprenant deux gènes de stilbene synthase complets (vstl et vst2) . Figure 9 : Inhibition de croissance du mycélium de Botrytis cinerea , souche 916T, après 7 jours à 20°C.
La culture du mycélium est réalisée sur milieu malt- glucose contenant les différentes concentrations de resvératrol .
Figure 10 : Planche photo 1 Observations macroscopiques caractéristiques des différentes variétés de vigne en interaction avec Botrytis cinerea 5 jours après inoculation des feuilles de vitroplants par une suspension de conidies - Plantes non transformées . En haut :
- Gauche : Cépage Folle blanche, clone 280 sensible. 13
- Droite : Cépage Pinot noir, clone 386 moyennement tolérant .
En bas :
- Gauche : Cépage Ugni-blanc, clone 479 tolérant. - Droite : Porte-greffe 41B tolérant.
Figure 11 : Planche photo 2
Observations macroscopiques caractéristiques de clones de porte-greffe 41B, transformés par différentes constructions (145 : Promoteur PMs PR10-1 - gène vstl ; 55 : insert de 13 kb comprenant deux gènes vstl et vst2 sous contrôle de leurs propres promoteurs) , en interaction avec Botrytis cinerea , 5 jours après inoculation de feuilles de vitroplants par une suspension de conidies. En haut : - Gauche : Clone 145-2.
- Droite : Clone 145-5. En bas :
- Gauche : Clone 145-6.
- Droite : Clone 55-3. Figure 12 : Planche photo 3
Observations caractéristiques, en microscopie à fluorescence, de différentes variétés de vigne en interaction avec Botrytis cinerea , 5 jours après inoculation de feuilles de vitroplants par une suspension de conidies .
Fluorescence : bloc de filtres A (excitation de 340 à 380 nm ; filtre d'arrêt à 425 nm) . Le resvératrol émet une lumière de fluorescence en blanc bleuté et bleu (selon sa concentration), la chlorophylle en rouge. La zone noire correspond à la zone d'infection par le champignon ou à des zones nécrotiques lorsqu'elles sont petites. En haut :
- Gauche : Cépage Folle blanche, clone 280 sensible, peu ou pas de synthèse de resvératrol . - Droite : Cépage Pinot noir, clone 386 moyennement tolérant . Synthèse de resvératrol dans les nervures et dans la zone de macération du champignon. 14
En bas :
Gauche : Porte-greffe 41B (tolérant) non transformé. Synthèse de resvératrol intense dans les nervures et dans le limbe autour des zones d'infection petites et très localisées (zones nécrotiques) .
Droite : Porte-greffe 41B transformé par la construction 145, c'est-à-dire le promoteur PMs PR10-1 gène vstl, clone 145-5 très tolérant. Forte synthèse de resvératrol autour et, dans la zone d'infection, dans les nervures et sur la presque totalité du limbe de la feuille.
Exemple 1
Obtention de clones génomiques comprenant des séquences régulatrices de gênes PR protéine de luzerne
A) Obtention d'une sonde pour la recherche des promoteurs (cf. Figures 1 et 1 bis)
La réponse incompatible (réaction d'hypersensibilité HR) , obtenue dans la relation hôte-parasite luzerne {Medicago sa tiva) et Pseudomonas syringae pv pisi a permis de constituer une banque d'ADNc. Elle a été réalisée à partir d'ARNs messagers extraits et purifiés de la zone voisine de la nécrose provoquée par l'infection bactérienne. Les prélèvements de matériel végétal ont été effectués 6 heures après l'infiltration par la suspension bactérienne .
Chez les légumineuses, les PR protéines sont connues pour avoir des motifs conservés, ceci a permis la synthèse d' oligonucléotides correspondant à ces motifs définis à partir des séquençages déjà réalisés sur PR protéines de pois et de soja. Une amplification par PCR a permis d'obtenir une sonde radioactive, utilisée ensuite pour sélectionner dans la banque d'ADNc des transcrits. Parmi ceux-ci, un des clones : ADNc-PR7 a été retenu car après séquençage il a présenté 87 % d' homologie avec les gènes codants pour les PR protéines de pois et de soja. L'analyse a montré qu'il correspondait en fait à un gène 15
codant pour une PR protéine de classe 10 selon la classification de VAN LOON et al. (1994) . Il a été nommé Ms PR10-1 (Medi cago sa ti va PR protéine classe 10, clone 1).
Un contrôle, effectué chez la luzerne par Northern blot, a montré que le transcrit correspondant s'accumulait dès 3 heures après l'infection dans le cas de la réaction incompatible, passait par un maximum entre 24 et 48 heures et diminuait lentement à partir de 72 heures.
Ce fragment est caractérisé par l'existence d'un site Bam HI interne (noté B sur la figure 1) qui délimite deux parties :
- l'une dite 5', d'environ 340 bases, inclut la région amont de l'ATG (qui est transcrite mais non traduite) et une séquence aval correspondant à 306 bases, - l'autre dite 3', correspond à la fin de la partie codante soit 165 bases et à la région 3 ' non traduite soit 186 nucleotides du codon stop jusqu'au début du poly A.
B) Isolement de clones génomiques comprenant des promoteurs de PR protéines
1) Isolement de clones génomiques
Une banque génomique de luzerne, préparée dans EMBL4 (titre : 7.108 p.f.u. (plate forming units) . ml"1), a été utilisée à cette occasion et 6.105 p.f.u. étalées. Pour cribler cette banque, le fragment 5' de Ms PR10-1 (ADNc-PR7) a servi de sonde et 45 clones ont donné un signal, intense sur 13 d'entre eux. Les cartes de restriction et les hybridations, réalisées avec les fragments 5' et 3' de Ms PR10-1, ont permis de conclure à l'existence de 7 clones distincts (cf. Figure 2) . La comparaison des tailles des 7 clones (9,3 ; 6,5 ; 6,1 ; 5,8 ; 4,8 ; 4,2 ; 2,2 kb) obtenus à partir du criblage de la banque, à celle des bandes détectées sur blot d'ADN génomique de luzerne a montré une bonne concordance entre ces deux types de données expérimentales (cf. Figure 2) . Il a donc été possible d'en déduire que les gènes codant pour 16
la protéine PR7 correspondaient à une petite famille multigénique .
Les fragments (sites EcoRI/EcoRI) de ces clones (hormis le clone C12) ont ensuite été sous clones en totalité ou en partie et les séquençages entrepris.
2) Séquençages réalisés
Un clone a été choisi pour être séquence en premier, le clone C15 (cf. Figure 1 bis) .
Les premiers travaux de séquençage ont mis en évidence la présence d'un intron d'environ 315 nucleotides dans le cadre ouvert de lecture du gène codant pour la PR protéine. Le clone étudié a été analysé ensuite après digestion par Bain HI (cf. Figure Ibis) . Clone C15 : 6 , 1 kb L'analyse du clone par Eco RI et Bam HI a permis d'obtenir deux fragments E-B (environ 2,4 kb) et B-E (environ 3,7 kb) . Après séquençage et comparaison de la séquence codante (interrompue par un intron de 600 nucleotides) avec celle du Ms PR10-1 (ADNc-PR7) , il est apparu que ce clone génomique était absolument identique à cet ADNc de référence.
3) Analyse de l'expression des clones isolés dans le système luzerne - Pseudomonas
Les expériences ont porté sur le clone C15, en utilisant la technique d'extension en 5', pour déterminer les messagers effectivement transcrits lors de l'induction des réactions de défense. Cette technique a en outre l'avantage de permettre de localiser le site d'initiation de la transcription. Les résultats ont montré que le clone C15 était effectivement exprimé lors de l'induction des réactions de défense dans les feuilles, lors de l'interaction luzerne - Pseudomonas .
Exemple 2 Transformations qénétigues réalisées pour vérifier 1 ' activité promotrice du clone isolé 17
A) Régions promotrices utilisées
Pour ces transformations de contrôle, deux promoteurs ont été retenus : un promoteur témoin et le promoteur PR isolé du génome de la luzerne, issu de C15 (correspondant au promoteur PMs PR10-1) .
1) Promoteur CaMV-35S
Ce promoteur, dit constitutif, est classiquement utilisé. Il correspond à la séquence de régulation de la transcription du gène de la sous unité ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) . La région promotrice qui a été utilisée pour réaliser la construction avec le gène rapporteur gus , correspond en fait à une fraction de ce promoteur, isolée de nouveau sous forme d'un fragment EcoRI/BamHI à partir du plasmide pDH51 (PIETRZAK et al., 1986) .
2) Promoteur PR
La région promotrice du clone génomique C15 a été étudiée. Ce promoteur a été appelé par la suite PMs PR10-1. PMS PR10-1 : II provient du fragment EcoRI/BamHI (E/B) de
2.4 kb du clone C15 (Figure Ibis) . L'intégration de ce fragment dans le plasmide binaire, en amont du gène rapporteur (voir ci-après) , a été rendue délicate car aucun site de restriction n'existait sur le clone C15 entre la boîte TATA (initiation de la transcription) et l'ATG (initiation de la traduction) . Des expériences de délétion ont donc été réalisées jusqu'à obtenir un fragment de
1.5 kb environ (séquence IND SI) . Puis, par ligation en bout franc, un autre site Bam HI a été ajouté au fragment ainsi obtenu pour permettre son insertion en amont des différentes séquences codantes utilisées par la suite. Ce fragment comprend donc en se référant à 1 ' ADNc qui a servi à le cloner et outre la région promotrice amont : 39 nucleotides terminaux de la 5'UTR (UnTranslated Région) du gène Ms PR 10-1, située à 10 bp du codon ATG initiateur, l'ATG du gène Ms PR10-1 et un court fragment de sa région codante (10 bp) , juste en amont du site Bam HI intégré. Tenant compte des sites de clonage, le promoteur ainsi construit présente un ATG potentiel ce qui pourrait conduire à la présence de deux codons ATG, à faible distance l'un de l'autre, lors des constructions de gènes chimériques. Un risque de modification de la phase codante du gène utilisé (gène rapporteur ou gène de stilbene synthase) pourrait alors exister.
Pour les expériences de transformation avec le gène rapporteur, PMs-PR10-l (PRI) a été utilisé tel quel après clonage dans le plasmide pSK+/- Bluescript de
STRATAGENE. Il a pu être de nouveau isolé sous la forme d'un fragment EcoRI/BamHI de 1,5 kb environ.
3) Plasmides utilisés a) p35S - gus intron (VANCANNEYT et al. 1990) Ce plasmide est un dérivé de pBinl9 (BEVAN, 1984) et possède comme tel les bordures droite et gauche des plasmides binaires permettant l'insertion de la partie comprise entre ces bordures dans les plantes via agrobactéries . Le développement du gène rapporteur gus intron
(intron dérivé du gène LSI de la pomme de terre) a permis d'éliminer les faux positifs (notamment en expression transitoire) dus aux agrobactéries contaminantes. Elles sont incapables d'épisser les introns . Classiquement ce gène, codant pour une β- glucuronidase, permet, en utilisant un substrat particulier (le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β glucuronide) , d'obtenir une coloration bleue. Celle-ci indique alors la nature transformée de la plante analysée et par voie de conséquence la transcription de la séquence codante du gène correspondant à l'enzyme, donc l'induction du promoteur qui la commande. b) pPR97
Ce plasmide a été construit par l'un des laboratoires participant au projet pour tester l'efficacité de promoteurs (P. RATET, ISV, cité dans SZABADOS et al.,
1995) . Il a notamment l'avantage de posséder un site de 19
clonage multiple, permettant une fusion transcriptionnelle avec la phase codante du gène gus ( uid Λ d ' E. col i ) contenant 1 ' intron LSI . Il possède en outre certaines des caractéristiques du plasmide précédent p35S - gus intron (bordures d'intégration dans le génome des plantes, gène de sélection permettant la résistance aux antibiotiques de type néomycine : npt II gène) .
L'activité du promoteur peut être révélée et mesurée par des tests histochimique et enzymatique de type GUS.
4) Dérivés de pPR97
Deux constructions principales ont été faites et utilisées par la suite pour la transformation de plantes modèles . a)pPR97 - 35S
Le promoteur 35S, clone dans le plasmide pDH51 (cf. paragraphe 5 ci-dessous), a été extrait et inséré dans le site de clonage multiple de pPR97, en amont du gène rapporteur, sous forme d'un fragment EcoRI/BamHI . Ce plasmide est à la fois un contrôle positif, pour démontrer que la construction est fonctionnelle, et une référence car le promoteur 35S a été placé dans le même environnement que le promoteur isolé des clones de PR protéine. b) pPR97-PMs PR10-1 Les 1,5 kb ont été insérées dans le même site de clonage que celui défini ci-dessus, sous la forme là aussi d'un fragment EcoRI/BamHI . c) pG3-3
Il a permis de réaliser un contrôle positif fort pour les tests histochimique et enzymatique en clonant deux promoteurs 35S en tandem inversé. Les séquences activatrices des promoteurs agissent alors en synergie. La phase codante du gène gus intron a été alors placée sous le contrôle de l'un des deux promoteurs 35S. 5) Les souches d' agrobactéries réalisées
Les différents plasmides ont été utilisés pour transformer des bactéries compétentes E . coli souche DH5α 20
par choc thermique en milieu chlorure de calcium. Après sélection des bactéries transformées sur milieu antibiotique (Kanamycine) et contrôle par miniprep de leur nature recombinante, elles ont servi à transférer les plasmides recombinants dans des souches d ' agrobactéries par conjugaison triparentale, en utilisant la souche d ' E . coli HB101 contenant le plasmide pRK2013 autotransférable (DITTA et al. , 1985) .
Deux souches d ' agrobactéries ont été retenues : EHA 105, AgroJbac eriu-n tumefaciens désarmée, permettant la régénération de plantes transformées (transformations stables), et A4TC24, Agrobacterium rhizogenes utilisée pour obtenir la réaction de type chevelu racinaire (Hairy root) et des plantes composites, possédant des racines transformées mais dont le reste de la plante est de phénotype identique à celui d'origine.
6) Transformations génétiques sur plantes modèles
Deux types de transformations (transitoires et stables) ont été réalisés en utilisant trois plantes modèles Ni co tiana ben thamiana , Medicago trunca tula et Lotus cornicula tus .
On exposera principalement les résultats obtenus avec N. benthamiana .
7) Transformations transitoires Cette première série d'expérience a été réalisée pour permettre une vérification rapide de la fonctionnalité des constructions réalisées avec le gène gus dans les cellules d' eucaryotes .
Des feuilles de N. ben thamiana ont donc été excisées et mises en coculture sur milieu gélose avec les différents dérivés de la souche EHA 105. Des tests histochimiques ont été ensuite pratiqués 48 h après la transformation puis examinés après une nuit d'incubation
(12 h) . Les plasmides de contrôle p35S-gus intron et pPR97-35S ont donné une coloration GUS positive bien que faible avec le second plasmide. 21
Cette faible réactivité vient sans doute d'un problème de construction car à proximité du site d'initiation de la transcription et de l'ATG du gène gus une partie du polylinker a dû être gardée. Celle-ci comportant une séquence répétée peut gêner la transcription du gène .
La construction pPR97-PMs PR10-1 a montré une activité du gène gus semblable à celle du contrôle positif
35S-gus intron. Ce promoteur que l'on attendait inductible, a donc présenté un effet comparable à un promoteur constitutif .
Ce résultat peut être expliqué comme la conséquence soit de l'infection bactérienne soit des blessures effectuées sur les feuilles lors du prélèvement ou de la mise en culture. La première hypothèse ne pouvant être vérifiée, le protocole expérimental a été modifié pour diminuer le stress causé aux explants (élévation de l'osmolarité du milieu de coculture en utilisant des concentrations de saccharose de 10 à 30 g.l"1, réalisation d'une gamme de vide plus ou moins poussée : de 10 à 80 mm de mercure de vide relatif et création de lésions plus ou moins fortes sur les feuilles avec écrasement important ou moyen de l'épiderme) .
Les résultats ont montré que plus la pression était importante, plus le nombre de cellules transformées était élevé. Cependant, un compromis doit être trouvé pour obtenir des transformations stables car les nombreuses transformations transitoires, obtenues dans ce cas, se révèlent par la suite souvent létales pour les cellules. Elles sont alors incapables de donner des cals et donc de régénérer des bourgeons puis des plantes. Par ailleurs, la nature inductible du promoteur est en partie confirmée car si la coloration due à la construction 35S-gus intron est détectable jusqu'à 5 jours après la coculture, celle obtenue avec pPR97 - PMs PR10-l-gus intron apparaît plus rapidement à 48 heures mais décroît ensuite très vite. 8) Transformations stables 22
a) Tabac : N. ben thamiana
Une série de transformations a été réalisée avec pPR97-35S, pPR97-PMs PR10-1 et pG3-3. Un nombre important de plantules a été obtenu pour cette série de transformations. Pour chacun des plasmides utilisés, on a cherché à obtenir au moins 7 plantes acclimatées. Cependant, cela n'a pas été possible pour p35S-gus intron où seulement 5 plantes ont été régénérées et acclimatées. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau 1.
Tableau Transformations stables obtenues sur N. benthamiana par transformation avec la souche EHA 105 d 'Agrobac erium tumefaciens et ses dérivés.
Cals/explants Bourgeons Plantules
Constructions mis en obtenus culture In vivo Accl .
p35S-gus intron 10(45) 6(1) 5 5
pPR97-35S gus 115/122 23 13 12 intron
pPR97-PMs PR10-1 135/139 27 20 7 gus intron
pG3-3-35S en tandem inversé non évalué 37 28 20 (promot. Fort)
Figure imgf000024_0001
Légende du tableau 1 :
Les résultats sont exprimés en quantité obtenue.
Accl. : plantules acclimatées.
Nombre de bourgeons par explants : le chiffre entre parenthèses correspond au nombre de bourgeons obtenus à un mois, pour la première série. Pour celle-ci (comportant la construction 35S gus intron) , les cals ont été laissés plus 23
longtemps sur le milieu de culture afin d'obtenir un maximum de bourgeons et donc de plantes à acclimater. Pour la seconde série, après un mois, un nombre suffisant de bourgeons a été obtenu et l'expérience a alors été arrêtée. Les transformations génétiques : elles sont faites classiquement sur des morceaux de limbe de feuilles de 1 cm2, immergés 30 secondes dans la suspension d * Agrobacterium puis, cocultivés 48 heures avant repiquage sur milieu gélose de division cellulaire et de caulogénèse (MURASHIGE et al., 1962), ANA (acide naphtalène acétique)
0,1 mg.l"1, BAP (benzyl amino purine) 1 mg.l"1, cefotaxime
400 mg.l"1 (élimination des agrobactéries) et kana ycine 70 mg.l"1 (agent de sélection des cellules transformées).
Dès l'apparition des premiers bourgeons (environ un mois après coculture), ils sont placés sur milieu d'enracinement identique au premier mais ne comprenant pas d'hormones végétales .
L'analyse rapide des résultats, en fonction de l'expression du gène gus intron selon la nature du promoteur situé en amont de la phase codante du gène, montre que le promoteur PMs PR10-1 donne les meilleurs résultats de l'ensemble des promoteurs testés. Une analyse plus détaillée est présentée ci-après.
9) Caractéristiques du promoteur PMs PR10-1 Plasmide pPR97-PMs PR10-l-gus intron
Ce promoteur a donné les meilleurs résultats avec des différences d'expression constitutive du gène gus selon les organes testés. a) Activité dans les cals Une expression constitutive forte a été trouvée.
Quelques minutes d'incubation ont suffi pour obtenir un test histochimique positif. Le promoteur est donc fortement induit dans ce type de matériel, ce qui est en accord avec les résultats obtenus par VAN LOON (1985) . Les cals en culture in vitro sont en état de stress et dans ces conditions les PR protéines sont exprimées. 24
b) Activité sur plantes entières acclimatées Racines
Le promoteur est induit et le test histochimique est positif après 2 heures d'incubation (contre 5 heures avec le promoteur 35S) . L'activité du gène gus n'est pas uniforme dans les racines de tabac, seuls l'épiderme des parties âgées et le méristème apical ont donné la coloration bleue caractéristique du test. Selon la littérature une activité des gènes de défense dans les racines est aussi classiquement observée.
Fleurs
Chez tous les tabacs transformés par cette construction, une forte activité constitutive a été trouvée dans les fleurs et plus particulièrement dans les anthères et le pollen. Une activité du gène gus a aussi été décelée dans les trichomes des sépales et plus faiblement dans les pétales. Ces résultats sont aussi en accord avec ceux de VAN LOON (1985) qui indiquent une induction des gènes de défense dans les pièces florales. Feuilles
Une faible activité constitutive gus a été observée dans les trichomes de jeunes feuilles de plantes adultes. Chez le tabac, le stade rosette à larges feuilles correspond au stade juvénile et le stade vieillissant à celui de la formation des graines. Cette faible activité a été constatée majoritairement dans les trichomes pluri- cellulaires . L'expression d'une protéine PR dans de telles structures n'a jamais été décrite à notre connaissance.
Une activité inductrice constitutive du promoteur isolé PMs PR10-1 est donc possible dans les trichomes des feuilles de tabac (3 plantes sur 7) mais elle semble sous l'influence des stades de développement.
En l'absence d'induction par un pathogène, l'activité du promoteur chez le tabac est donc limitée à la racine, aux pièces florales (anthères et pollen) et à quelques cellules de la partie aérienne (trichomes essentiellement) . 25
Exemple 3
Autres espèces végétales transformées
1) Medicago trunca tula
Pour cette espèce, on a cherché à réaliser des plantes composites, c'est-à-dire possédant à la fois une partie aérienne de type sauvage (non transformée génétiquement) et des racines transformées.
De jeunes germinations ont été utilisées. Après développement de la racine principale, les hypocotyles excisés, ont été trempés dans une suspension d' Agrobacterium tumefaciens EHA 105 possédant soit le plasmide p35S-gus intron soit le plasmide pPR97-PMs PR10-1- gus intron, de façon à obtenir par la suite des racines néoformées transformées. Après une semaine, des racines ont été obtenues et un test histochimique GUS a été réalisé. Pour cette expérimentation, le témoin a été constitué par de jeunes germinations traitées de manière identique aux lots précédents (hypocotyles excisés mais non trempées dans la suspension d' agrobactéries) . Tous les explants du lot témoin ont néoformé des racines en une semaine, par contre, 50 % seulement ont réagi pour les lots traités par les agrobactéries. Quel que soit le traitement, aucune racine n'a donné de réponse positive au test GUS. En revanche, la base des hypocotyles des lots traités, bien que nécrosée, a souvent réagi pour donner une coloration bleue (présence de cellules transformées) . La partie nécrosée des explants a alors été excisée et ils ont été remis en enracinement. 50 % ont alors développé des racines néoformées dont certaines se sont révélées, dans quelques zones, positives au test.
Ce sont donc des racines chimériques (cellules transformées et non transformées) qui ont été obtenues, les parties transformées correspondant à des lignées cellulaires ayant intégré la construction dans une cellule souche de base . 26
Les deux constructions testées, p35S-gus intron et pPR97-PMs PR10-l-gus intron, ont donné ces lignées cellulaires racinaires transformées dans respectivement 3 et 2 explants sur les 6 mis en expérimentation pour chaque lot.
Bien que le modèle expérimental ne soit pas adapté à l'étude poursuivie (étude de l'expression des protéines PR lors du phénomène de nodulation par Rhizobium) , il n'en a pas moins démontré que le promoteur PMs PR10-1 est tout aussi fonctionnel dans cette plante que dans la plante d'origine (Medicago εa tiva) .
2 ) Lotus corniculatus
L'expérimentation avait, là aussi, pour but d'étudier l'induction du promoteur lors de la nodulation par la bactérie symbiote Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT et al., 1987). Des plantes composites ont donc été réalisées en transformant des cellules de l'hypocotyle de jeunes germinations de Lotier par Agrobacterium rhizogenes souche A4TC24, pour obtenir le phénomène de chevelu racinaire (phénotype hairy root) . Une fois celui-ci développé, les racines principales ont été excisées et les plantules ont été placées en milieu liquide pour accroître le développement du phénomène . Une fois les plantes acclimatées, l'étude de l'induction des promoteurs lors de la symbiose fixatrice d'azote a été réalisée en plaçant les plantules en conditions de nodulation (BLONDON, 1964) . Les deux promoteurs d'étude retenus ont été les mêmes que ceux utilisés lors de l'expérimentation menée avec M. trunca tula : 35S et PMs PR10-1. Pour ces deux constructions, moins de 10 % des racines à phénotype hairy root ont montré des racines positives au test GUS. D'une manière générale, les racines ayant ce phénotype ont donné moins de nodules que les racines témoins . Pour celles obtenues avec la construction comportant le promoteur 35S, seuls les nodules ont présenté 27
une réponse positive au test GUS, alors que pour l'autre (promoteur PMs PR10-1), la coloration s'est développée sur toute la racine, exceptée au point d'initiation des racines secondaires. Par ailleurs, cette dernière construction n'a pas permis d'obtenir de nodules sur les racines issues de chevelu racinaire en interaction avec Rhizobi um meliloti .
Exemple 4
Etude de la réaction d'hypersensibilité du tabac transformé avec les constructions utilisant des promoteurs du gène PR de luzerne et le gène crus intron
A) Réaction d'hypersensibilité sur N. benthamiana transformé avec les constructions associant le promoteur du gène PR de luzerne et le gène crus intron 1) Test de réaction d'hypersensibilité (HR)
La réaction d'hypersensibilité (HR) , développée dans l'interaction N. ben thamiana - Pseudomonas syringae pv. pisi , a été utilisée dans cette étude. Des plants de tabac transformés, ayant incorporé dans leur génome les différents inserts des plasmides p35S gus intron et pPR97- PMs PR10-l-gus intron, ont été acclimatés puis infiltrés par une suspension de P . syringae (ESNAULT et al., 1993) à une concentration de 109 bactéries par ml. La solution a été injectée dans le limbe à l'aide d'une seringue hypodermique. Avec un tel modèle, en 48 heures, la réaction de type HR est considérée comme bien développée. Les feuilles, infiltrées par les suspensions de bactéries, ont été prélevées 24, 48 et 96 heures après inoculation pour évaluer, par test histochimique GUS, l'induction des différents promoteurs étudiés. L'analyse d'une éventuelle réponse systémique a été aussi évaluée, en utilisant le même test histochimique, sur des feuilles situées en dessous de la feuille infiltrée.
2) Etude de l'induction des promoteurs en conditions de réaction de type HR a) Promoteur constitutif 35S 28
Dans le cas du promoteur constitutif 35S
(plasmide pG3-3 par exemple), l'inoculation par P . syringae n'a pas modifié la réponse au test et cela en quelques minutes d'incubation. L'infiltration par les bactéries n'altère donc pas l'activité glucuronidase de type constitutif obtenue avec le promoteur 35S. b) Promoteurs de gènes de protéines PR : Promoteur PMs PR10-1
Comme le montre le tableau 2, ce promoteur est bien inductible par l'attaque par un pathogène. A 24 heures, la réaction de type HR n'est pas encore entièrement développée (48 heures pour l'exposition complète), cependant, le test GUS est déjà positif. Avec les jeunes plants de tabac transformés obtenus, la coloration est faible et produite majoritairement dans le limbe de la feuille infiltrée.
En réponse systémique, réponse au niveau de la feuille inférieure à la feuille infectée, la coloration est uniquement dans le limbe. Les plants de tabac adultes (tiges développées mais n'ayant pas encore fleuries) et juvéniles (en rosette) ont le même type de réponse avec une activité faible du gène gus, déterminée par le test histochimique .
Pour les tabacs plus âgés, en fleur ou portant des graines, la coloration obtenue lors du test est plus intense, surtout dans les nervures et les trichomes de la feuille infectée et uniquement dans ces tissus pour la réponse systémique .
Des différences d'expression du gène rapporteur sont donc mises en évidence selon l'âge de la plante. Cette réponse, dépendante du stade de développement de la plante, a été trouvée dans la plupart des études menées sur les protéines PR des végétaux. L'induction du promoteur PMs PR10-1 est un phénomène transitoire puisque l'expression du gène rapporteur n'est plus visible 96 heures après l'inoculation par les bactéries. 29
L'induction n'est pas non plus limitée à la réaction de type HR obtenue lors de 1 ' interaction plante/bactérie. Le même type de réponse a été obtenu avec la construction PMs PR10-l-gus intron lors d'une infection de l'un des explants par un champignon. Une expression homogène du gène gus a alors été visible sur l'ensemble de la feuille infectée, hormis la zone de contamination qui, elle, s'est nécrosée.
Tableau 2 : Induction des différents promoteurs étudiés lors de la réaction de type HR entre N. benthamiana et P. syringae .
24h après .inoculation 96h après inoculât.
Construction Feuille Feuille feuille infiltrée infiltrée inférieure réaction type HR
PMs PR10-1 6/7 6/7 0/3
pG3-3 (35S) 3/3 3/3 2/2
Figure imgf000031_0001
Légende du tableau 2 :
Les résultats sont présentés en nombre de plantes répondant positivement au test histochimique GUS par rapport au nombre de plantes analysées .
B) Expression quantitative du gène gus intron sous contrôle des différents promoteurs
La méthode est basée sur un test enzymatique. Elle utilise : a) un extrait brut de l'enzyme codée par le gène gus obtenu à partir des plants de tabac transformés, et b) un substrat, le p nitrophényl glucuronide . La vitesse d'hydrolyse du substrat est suivie au spectrophotomètre et est rapportée à la quantité totale de protéines de l'extrait. La méthode nécessite par contre la 30
présence d'un promoteur fort, en amont du gène gus , car elle est peu sensible.
En conséquence, elle n'a pas été appliquée aux essais pour lesquels 12 heures ou plus d'incubation avec le substrat, utilisé pour le test histochimique (X gluc : 5- bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - β glucuronide) , ont été nécessaires .
Dans ces conditions expérimentales, le promoteur 35S, placé dans le plasmide pG3-3, a donné une vitesse d'hydrolyse du substrat (exprimée en unité arbitraire) 5 fois plus élevée que le promoteur PMs PR10-1, placé quant à lui dans le plasmide pPR97. Par contre, le promoteur PMs PR10-1 a donné une plus forte expression du gène gus que le promoteur 35S, si celui-ci est placé dans le plasmide p35S- gus intron. En effet, dans ce dernier cas, aucune détection d'hydrolyse du substrat n'a été obtenue.
De même, les autres constructions n'ont pas permis de donner de valeurs détectables au spectro- photomètre .
Exemple 5
Isolement de l'ADN correspondant à un gène de stilbene synthase et expression de la stilbene synthase
Deux méthodes ont été utilisées pour obtenir un gène codant pour une stilbene synthase de vigne. D'une part, les données de la littérature (WIESE et al., 1994) ont permis de connaître la séquence d'un gène. D'autre part, un insert génomique de 13 kb environ a été fourni par BAYER AG (Agrochemical Division Research / Biotechnology- Pflanzenschutzzentrum, MONHEIM, D-51368 LEVERKUSSEN) . Il est précisé que la société BAYER a déposé auprès du Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) , en Allemagne, des souches d ' E. coli contenant des plasmides portant des gènes de stilbene synthase de vigne (cf. EP-464 461) : la souche E. coli Fier 1 pVst 1 (DSM 6002, déposée le 18 Juin 1990), la souche E. coli Fier 2 pVst 2 (DSM 6003, déposée 3 1
le 18 Juin 1990) , et la souche E. coli Fier pVst 1 2 t 3
(DSM 6346, déposée le 11 Février 1991) . BAYER a également déposé la souche E. col i Nurdug 2010 (DSM 4243, déposée le
17 Septembre 1997) qui contient le plasmide pGS 828.1 qui porte un gène de stilbene synthase d'arachide (cf. EP-309
862). L' insert utilisé pour réaliser les travaux rapportés ci -après correspond en fait à un clone génomique complexe comprenant deux séquences complètes fonctionnelles de gènes de stilbene synthase (gènes vstl et vst2) et une séquence incomplète vst3. Par la suite, la séquence du gène vstl a été sélectionnée pour être incorporée aux constructions réalisées. Elle correspond à un fragment génomique de 4,9 kb (séquence fonctionnelle dont le promoteur) qui ne possède pas de sites de restrictions adéquates pour permettre un clonage direct dans les plasmides utilisés habituellement comme vecteurs de transformation. Il a donc été ajouté des sites complémentaires par clonage intermédiaire dans un plasmide pCDNA II.
A) Ajout de sites complémentaires par clonage intermédiaire dans un plasmide pÇDNA II
Le fragment génomique du gène vstl déjà indiqué a été isolé, du plasmide d'origine dans lequel il avait été clone, sous forme d'un fragment EcoRI/Ps tI (2,1 kb) et clone à nouveau dans un plasmide pUC19. Une fois clone, le fragment vstl a été incorporé dans les mêmes sites (EcoRI/PstI) du plasmide pCDNA II pour changer les sites de restriction, supprimer le terminateur du gène et permettre l'isolement d'un insert Ba HI/BamHI (1,8 kb) . C'est ce fragment, correspondant au cadre ouvert de lecture du gène, qui a été utilisé pour faire les constructions avec les différents promoteurs dont ceux isolés de la banque génomique de luzerne (cf. Figure 4) . Cet insert a par la suite été clone dans pBIN 19 après vérification par Southern blot des tailles des différents fragments obtenus après digestion par les enzymes de restriction adéquates. 32
B) Etude de l'expression du gène vstl
Pour vérifier l'expression des gènes codant pour la stilbene synthase dans les plants de vigne, une sonde (1,8 kb) , comprenant le gène vstl, a été préparée à partir du plasmide pCDNA II multiplié dans la bactérie E. col i HB 101. La sonde a été ensuite biotinylée par random priming, avec le kit Polar Plex (Plex chemiluminescent kits, Millipore) , pour permettre une détection des gènes ou des transcrits codant pour une stilbene synthase par chimio- luminescence sur des Southern et Northern blots, réalisés à partir d'acides nucléiques extraits de plants de vigne témoins ou transformés.
1) Utilisation de la sonde vstl pour l'analyse d'ADN génomique extrait de vigne 41B (Hybride V. vinifera Chasselas x V. berlandieri ; porte greffe)
Des analyses par Southern blot ont été réalisées après extraction d'ADN génomique puis digestion de celui-ci par EcoRI . La sonde vstl a permis d'obtenir un grand nombre de bandes (environ 15) . Celles-ci correspondent en fait à des fragments contenant des séquences codant pour une stilbene synthase qui constituent une famille multigénique (6 à 8 gènes selon WIESE et al., 1994). Parmi ceux-ci, vstl, vst2 et vst3 sont fortement homologues entre eux. En outre d'autres gènes peuvent être reconnus par cette sonde, notamment ceux correspondant à la famille multigénique de la chalcone synthétase. Les deux enzymes sont en effet de même stucture et de même taille (dimères de sous unité de 41 à 44 kb) . Elles utilisent aussi le même substrat et leur séquence d'acides aminés présente un fort taux d' homologie, au moins au niveau du site actif .
Pour vérifier si une telle hybridation croisée était possible, l'ADN de deux plasmides a été extrait. L'un, pCDNA II, contenait le gène vstl, et l'autre, pPCV 002, un gène de chalcone synthase de Rosier, disponible au laboratoire. Une sonde biotinylée correspondant au gène de chalcone synthase de Rosier a aussi été préparée. Les 33
Southern blots obtenus, en réalisant les hybridations croisées, ont montré que la sonde vstl reconnaissait effectivement le fragment de chalcone synthase de Rosier et inversement. Les signaux émis sont alors plus faibles dans ce cas d'hybridation croisée.
2) Dosage du resvératrol à partir de feuilles de plantes de vigne
Le matériel végétal frais, feuilles ou tiges, est réduit en poudre dans un mortier contenant de l'azote liquide et les composés apolaires sont extraits par le méthanol (1 ml pour 100 mg de matière fraîche : m.f .) .
Après centrifugation pour éliminer les débris, l'extrait méthanolique est filtré sur filtre 0,45 μm puis évaporé à sec sous azote. Le résidu est repris dans le méthanol pur (100 μl / 100 mg m.f.). Afin d'éliminer les pigments (chlorophylles notamment), l'échantillon est passé ensuite sur une colonne C18 (Sep-pack WATERS) , préalablement équilibrée au méthanol. L'analyse qualitative et quantitative des extraits est réalisée par CL. H. P. (Chromatographie Liquide Haute Pression) sur une CL. H. P. WATERS (Modèle 600 E) , couplée à un détecteur à barrette de diodes (Modèle 990. WATERS). Le support de chromatographie est composé d'une colonne C18 phase inverse (ultra base Cl8, 205 x 4,6 mm, 5 μm ; Shandon) . L'analyse des composés de l'extrait est effectuée en conditions isocratiques, la phase mobile étant constituée d'un mélange acétonitrile-eau 35/65, V/V avec un débit de 1 ml. min"1.
Un spectre d'absorption est réalisé toutes les deux secondes entre 200 et 400 nm et le resvératrol est détecté à son maximum d'adsorption à 305 nm.
La quantification du resvératrol est réalisée par étalonnage externe à partir d'une droite étalon, obtenue par chromatographie de solutions à 5, 10, 20, 50 et 100 μg.ml"1, réalisées à partir de resvératrol du commerce (Sigma) . La concentration en resvératrol, mesurée à partir de l'aire du pic correspondant à la molécule, est rapportée 34
à l'unité de masse de m. f. ou de m. s. (matière sèche) ou de masse de chlorophylle de l'échantillon dosé.
Exemple 6 Constructions d'acide nucléique associant le gène codant pour une stilbene synthase de vigne à différents promoteurs
1) Constructions utilisant des promoteurs constitutifs
Deux promoteurs apparentés ont été utilisés pour réaliser les constructions génétiques devant permettre une expression constitutive.
Dans la première construction, l'ADN de stilbene synthase de vigne (vstl) a été placé sous contrôle d'une séquence de régulation constituée par une cassette contenant deux promoteurs 35S du CaMV montés en série (dans la même orientation) . A la fin de la séquence codante du gène vstl on a aussi ajouté une séquence de polyadénylation du 35S. La construction chimérique ainsi réalisée peut donc se résumer ainsi : p35S (CaMV) - p35S (CaMV) - vstl - poly
A 35S (CaMV) . Dans la deuxième construction, la séquence codante vstl a été placée sous le contrôle de quatre séquences « enhancer » isolées du promoteur 35S du CaMV et, montées en série devant le promoteur CaMV 35S et la propre séquence « enhancer » du promoteur du gène de vigne (vstl) . Les deux séquences chimériques ainsi réalisées ont été d'abord insérées dans le plasmide PMP 90RK puis les plasmides ont été incorporés par la suite dans la souche d' agrobactéries GV3101.
Ces deux séquences de régulation sont considérées comme des promoteurs constitutifs « forts ».
2) Construction homologue utilisant 1 ' insert de 13 kb (gènes vst sous contrôle de leurs propres promoteurs)
Le fragment d'environ 13 kb d'ADN génomique de vigne a été décrit ci-dessus. Il comprend notamment 2 gènes fonctionnels (vstl et vst2) codant pour des enzymes stilbene synthases et un gène (vstJ3) incomplet (non 35
fonctionnel) . Cette séquence vigne a été co-intégrée à un plasmide pGV3850 qui a ensuite été introduit dans une souche d' agrobactéries . Elle correspond donc à des cadres ouverts de lecture de gènes vst (stilbene synthase de vigne) sous contrôle de leurs propres promoteurs.
Plusieurs séries de plantes 41B, transformées par le plasmide comportant le fragment de 13 kb, ont été obtenues et ont été étudiées et analysées par Southern blot en utilisant 3 sondes différentes (sonde de 1,8 kb du gène nptll ; de 2,4 kb du gène de résistance à l' ampicilline et de 1 kb de la bordure gauche du plasmide pBIN 19 comprenant la séquence de fin d'intégration du TDNA) . La majorité des plantes retenues a réagi à l'une ou l'autre de ces sondes. Ces clones ont été numérotés selon un code : 55 pour la construction et 2, 3, 5, 6, 7, 9 pour les différents transformants obtenus.
3) Constructions utilisant le promoteur inductible PMs PR-10-1
La construction comprenant le promoteur PMs PR- 10-1, isolé à partir des clones génomiques PR de luzerne, a été réalisée (cf. Figure 5).
Construction du plasmide pBin 19 - PMs PR-10-1 - gène vstl- Terminateur 35S
Le promoteur PMs PR10-1 isolé de la luzerne et le gène vstl comportant chacun un codon ATG initiateur de la traduction, un adaptateur a été réalisé pour cloner le gène vstl sans ATG supplémentaire dans la construction. Cet adaptateur a été synthétisé sous la forme de deux oligo- nucléotides de 11 bp chacun, l'un Bam HI compatible, l'autre un I compatible. L'adaptateur a ensuite été incorporé au site Mun I du gène vstl clone dans le plasmide pUC19. L' insert a alors été récupéré par une digestion Bam HI, puis clone dans pBIN 19 entre le promoteur PMs PR10-1 et le terminateur 35S. L'insertion du gène vstl avec son adaptateur s'est donc située entre le promoteur PMs PR10-1 et le terminateur 35S. Dans ces conditions, l'ATG du gène 36
vstl a été éliminé et 3 codons supplémentaires ont été inclus dans la phase codante de vstl, en amont du gène. Il a été vérifié par séquençage que le cadre ouvert de lecture du gène se trouvait toujours en phase avec le reste de la construction.
Après transformation des plants de 41B, avec 1 ' insert comprenant entre autre la séquence chimérique : promoteur PMs PR10-l-gène vstl terminateur 35S, les transformants ont été analysés par Southern blot, en utilisant la sonde nptll déjà décrite. Néanmoins, l'intégration complète ne peut être démontrée pleinement par cette méthode et surtout par cette sonde, puisque dans le système d ' Agrobacterium il est admis que l'insertion dans le génome de la plante commence à la bordure droite pour se terminer à celle de gauche. Le gène nptIJ étant situé, dans la construction utilisée, près de la bordure droite, une intégration partielle, gène nptll inséré mais blocage ultérieur de l'intégration avant la bordure gauche, est donc possible. Les transformants ont été codés 145 et affectés des numéros 2, 5, 6 pour ceux dont les résultats sont présentés ci-dessous.
Exemple 7
Transformation génétique de la vigne et analyse de l'efficacité des promoteurs étudiés
Comme il a été décrit ci-dessus (Exemple 6) , quatre constructions principales ont été réalisées pour transformer le système modèle du laboratoire porte-greffe 41B (V. vinifera x V. berlandieri ) . Ce dernier a en effet l'avantage de donner de bons résultats en transformation de suspensions cellulaires embryogènes par les agrobactéries. Environ 50 transformants sont obtenus en moyenne par expérimentation en utilisant 0,1 à 1 μl de P. C.V. (Packed Cell Volume) de cellules embryogènes. De plus, la sélection, le développement des embryons transformés et la régénération en plantes sont rapides . Des plantules in 37
vitro, ayant 6 à 8 feuilles bien développées, peuvent être obtenues en deux mois de culture.
A) Transformation génétique du 41B avec des vecteurs avant le gène vstl sçys contrôle de promoteurs constitutifs
Deux constructions ont été testées, l'une comprenant le promoteur double 35S monté en série devant le gène vstl et la seconde, constituée par une séquence de régulation composée de 4 séquences « enhancer » 35S (CaMV) montées en série devant le promoteur 35S du CaMV, le tout situé en amont du gène vstl possédant sa propre séquence « enhancer ». Quatre séries d'essais ont été réalisées (deux pour chacune des constructions) afin de transformer les cellules embryogènes de vigne. Aucune n'a permis de régénérer des plantes ni même des embryons. Dans tous les cas, une nécrose rapide des suspensions cellulaires embryogènes a été obtenue après les 48 heures de coculture avec les agrobactéries. Ces constructions ne permettent donc pas d'obtenir des plantes transformées exprimant, de manière constitutive, le gène vstl sous contrôle de ces promoteurs « forts ». Une hypothèse peut être avancée, l'expression de ce gène pourrait bloquer la régénération en embryons par nécrose rapide des cellules à potentiel embryogène en réponse à la production de phytoalexines stilbéniques .
Ces résultats négatifs, obtenus avec les constructions comportant des promoteurs constitutifs de type 35S, démontrent l'intérêt de contrôler une surexpression du gène vstl par un promoteur homologue ou hétérologue inductible notamment par un pathogène.
Ces résultats obtenus sont à rapprocher de ceux publiés par FISHER et HAIN en 1994 qui soulignent le fait qu'ils n'ont pas réussi à faire exprimer de façon constitutive un gène de stilbene synthase de l'arachide à un taux élevé chez le tabac, en utilisant le promoteur 35S du CaMV. Selon ces auteurs il y aurait, avec une telle construction, une régulation négative de l'expression du 38
gène en condition d'attaque de pathogène. Celle-ci, selon leur hypothèse, pourrait résulter de la mise en place par la plante de mécanismes de défense, induits normalement par les pathogènes (synthèse de PR protéines notamment) qui exerceraient une inhibition sur les promoteurs viraux.
B) Transformations génétiques du 41B par des vecteurs avant le gène vstl sous contrôle de promoteurs inductibles par des stress abiotiques et/ou biotiques
1) Etude de l'expression des gènes vst et de leurs cinétiques d'induction par U.V. sur feuilles excisées, isolées en survie et sur plante entière de vitroplants de vigne 41B témoins ou transformés par 1 ' insert de 13 kb
Il a été montré que la synthèse de resvératrol (phytoalexine principale de la vigne) , produit de la réaction catalysée par une enzyme stilbene synthase, était inductible par les ultraviolets (U.V.), donc sous conditions de stress abiotique (LANGCAKE et al., 1977 ; SBAGHI et al., 1993). En conditions normales, la vigne ne synthétise pas ou très peu de resvératrol, par contre après induction aux U.V. (exposition de 10 minutes aux U.V. à 254 nm, pour une lampe dissipant 600 μW.cm"2), suivie d'une période de 20 heures d'obscurité, la phyto-alexine est synthétisée dans les feuilles excisées, a) Méthode utilisée Irradiation des feuilles :
- feuilles de vitroplants : à 254 nm pendant 13 minutes pour une lampe dissipant 600 μW.cm"2,
- feuilles isolées de vitroplants ou vitroplants : à 254 nm pendant 8 minutes pour une lampe dissipant 600 μW.cm"2, - extraction et analyse des ARNms du matériel végétal et estimation du resvératrol par fluorescence après excitation à 365 nm à un temps donné après l'induction.
Chaque échantillon est constitué par 3 feuilles isolées d'un même plant, induites séparément aux U.V. mais réunies pour l'extraction et le dosage. Le test est réalisé sur des feuilles excisées, isolées de vitroplants, ou sur 39
des vitroplants en culture sur milieu gélose, possédant 6 à 7 feuilles bien développées. Les trois feuilles les plus âgées de chaque plantule sont prélevées et utilisées pour le test. L'exposition aux U.V. est effectuée sur leur face supérieure. Après analyse, les quantités de resvératrol obtenues sont exprimées en μg de produit rapportés soit au gramme de poids frais de feuilles analysées, soit au gramme de matière sèche (évaluée sur le culot, après centrifugation après l'extraction méthanolique) ou en mg de resvératrol par g de chlorophylle.
Dans les tableaux ci-dessous, sont indiquées les valeurs obtenues pour des clones de 41B, 55-X, transformés par la construction du clone génomique de 13 kb, où sont présents, dans la séquence utilisée comme insert, deux gènes complets vstl et vst2, gènes tous deux sous contrôle de leurs propres promoteurs . b) Etude de stress abiotique (U.V.) sur feuille excisée (expérience N° 1)
Les résultats, correspondant à la construction 55 (insert 13 kb) et aux clones 2 (55-2) et 3 (55-3) , sont présentés dans les tableaux 3 et 4 ci-dessous (dosage du resvératrol) et représentés par les figures 6 et 7 (analyse des transcrits). L'étude de la cinétique d'induction par
U.V. de l'expression des gènes codant pour la stilbene synthase a été réalisée après une période séparant l'induction par les U.V. des analyses fixée à 17 heures
(cf. tableau 3 et Figure 6), ou variant de 0 , 8, 17, 24 ou
32 heures après induction (cf. tableau 4 et Figures 7 et
8) . O 99/41392
40
Tableau 3 Quantités de resvératrol détectées dans les feuilles témoins et transformées, non induites ou 17 heures après induction aux U.V. (exprimées en μg.g"1 de matière fraîche)
Témoins non Clone 55-2 Clone 55-3 transformés
Non Induit Non Induit Non Induit induit induit induit
0 12 0 11 0 13
Figure imgf000042_0001
Légende du tableau 3 : Les feuilles ont été excisées de vitroplants de 41B avant induction aux U.V.. Les clones 55- 2 et 55-3 correspondent à des plantes transformées ayant intégré un insert de 13 kb contenant des gènes codant pour une stilbene synthase.
La fluorescence, observée dans le bleu-violet à environ 450 nm, est très forte dans les nervures des feuilles excisées et répartie uniformément sur la totalité de la surface de la feuille. Les feuilles témoins, non induites aux U.V. , ne présentent pas, quant à elles, de fluorescence. Ces résultats mettent en évidence une expression spécifique des gènes codant pour des stilbene synthases . L'analyse des transcrits par Northern blot, réalisée par la sonde vstl, montre la présence d'un fragment d'environ 1,8 kb dont le signal émis est très intense chez les feuilles induites aux U.V. alors qu'il est absent ou très faible chez les plantes non induites (cf. Figure 6) . 41
Tableau 4 : Cinétique de l'évolution des concentrations en resvératrol sur des feuilles de vitroplants de 41B, induites aux U.V. prélevées sur les plants en culture sur milieu gélose, puis isolées et analysées pour leur contenu en resvératrol à différentes périodes après induction.
Temps après Quantité de resvératrol induction (h) (en μg.g"1 de Matière Fraîche)
Témoin PCT 55-2 PCT 55-3
NI 0 0 0 0 0,6 0 0 8 30,8 12,1 9 17 56,8 71,7 47 24 83,2 81,4 35,2 32 15,5 7,7 151,8
Figure imgf000043_0001
Légende du tableau 4 : Les résultats sont exprimés en μg. g"1 de matière fraîche. Deux plantes transformées PCT 55-2 et PCT 55-3 ont été analysées en comparaison avec le témoin. NI : Non induit aux U.V..
Dans ces conditions, après stress aux U.V., la quantité de resvératrol retrouvée dans les feuilles témoins est maximale 24 heures après l'induction (de l'ordre de 80 μg.g*1 m.f. pour le 41B) . Cependant, des variations importantes existent selon la date de l'analyse dans le cycle de repiquage des vitroplants : cycle de micro- bouturage .
Les résultats obtenus après analyse par Northern blot, en utilisant la sonde vstl sont présentés à la Figure 7. Au moins deux types de transcrits, de tailles très proches (environ 1,8 kb) , ont été détectés. Bien qu'une hybridation croisée avec un tanscrit de chalcone synthase ne soit pas à exclure, les différents ARNs messagers reconnus correspondent vraisemblablement à l'expression de différents gènes de stilbene synthase. Il a en effet été 42
montré chez la vigne (WIESE et al., 1994 ; KINDL, communication personnelle) que des différences existaient dans les cinétiques d'induction des différents gènes de la famille multigénique codant pour les stilbene synthases . L'analyse par Northern blot a mis en évidence que chez les feuilles excisées de vigne 41B, soumises ensuite au stress abiotique que constitue l'exposition aux U.V., les transcrits de stilbene synthase présentent un maximum d'expression environ 17 heures à 32 heures après induction. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus avec des cultures de cellules de vigne qui ont montré elles aussi le même modèle d'expression mais avec la présence de deux maxima (WIESE et al., 1994). c) Etude de stress abiotique (U.V.) sur feuille isolée en survie (expérience N° 2) , induction sur vitro-plants avant isolement des feuilles
Le tableau 5 ci-dessous présente les résultats obtenus pour une seconde série de transformants ayant intégré 1 ' insert de 13 kb. L'étude de la cinétique d'induction par U.V. de l'expression des gènes codant pour la stilbene synthase a été réalisée après une période séparant l'induction par les U.V. des analyses variant de 20, 40 ou 60 heures.
43
Tableau Concentration en resvératrol de feuilles isolées de vitroplants de vigne après induction aux ultraviolets et extraction à différents temps de survie.
Temps de survie des feuilles isolées de vitroplants après induction aux U.V. (8mn à 254 nm) et avant extraction du resvératrol
Clone étudié 20 heures 40 heures 60 heures
41B - Témoin 0 0 0 non induit
41B - Témoin 281 165 6 induit
Clone 55-2 135 918 58 induit
Clone 55-3 44 931 301 induit
Clone 55-5 392 83 657 induit
Clone 55-6 339 235 43 induit
Clone 55-7 263 411 148 induit
Clone 55-9 386 823 54
Figure imgf000045_0001
induit
Légende du tableau 5 :
Les concentrations en resvératrol sont exprimées en μg.g -1
de matière sèche.
41B porte-greffe hybride V. vinifera Chasselas x V
Berlandierri .
Les résultats présentés dans le tableau 5 permettent de distinguer deux groupes de plantes :
- le premier correspond au témoin et à deux des transformants 55-6 et 55-7. Ils présentent en général un maximum de concentration en resvératrol compris entre 280 44
et 410 μg.g"1 matière sèche et cela en général 20 heures après l'induction sauf pour le clone 55-7 où il est situé à 40 heures ;
- le second groupe présente quant à lui des maxima plus élevés soit presque le double du premier (820 à 930 μg . g"1 matière sèche) . Il est constitué uniquement de transformants (55-2, 55-3 et 55-9) . Le maximum est exprimé 40 heures après l'induction aux U.V., par contre, 20 heures après induction, ces plantes ont souvent des concentrations très inférieures à celles du premier groupe. C'est le cas par exemple des clones 55-2 et 55-3 (135 et 44 μg.g"1 de matière sèche respectivement). L'un des clones, 55-9, est cependant intéressant puisqu'il montre des concentrations en resvératrol supérieures à celles du témoin dans tous les cas (386, 823 et 54 μg.g"1 de matière sèche pour des temps de 20, 40 et 60 heures après induction) .
Dans ce système de feuille en survie, un témoin non induit ne présente jamais de resvératrol et dans presque tous les cas (hormis le clone 55-5 qui a un comportement particulier) , la concentration en resvératrol chute de manière drastique 60 heures après induction. d) Etude de stress abiotique (U.V.) effectuée sur vitroplants en culture sur milieu gélose Cette étude, effectuée sur plante en croissance sur milieu gélose, permet d'analyser la production de resvératrol en condition d'expression éventuelle d'autres mécanismes de défense de la plante, tout au moins ceux susceptibles de s'exprimer dans les conditions de culture in vitro. De plus, elle permet de suivre la synthèse de resvératrol sur une période plus longue (dans les études précédentes, la feuille isolée se nécrose au-delà de 72 heures) .
Quatre clones de vitroplants en culture de 41B transformés (55-2, 3, 5, 6) ont été traités par les U.V. 45
dans les mêmes conditions que précédemment (8 min à 254 nm) , les feuilles n'étant prélevées sur la plante que 20 heures après induction. Les résultats obtenus ont été comparés au témoin non transformé ainsi qu'à un clone de Vitis rupes tris et à 3 clones de cépage Vi tis vinifera , connus sur le terrain pour avoir une sensibilité plus ou moins grande aux attaques de Botrytis sur les baies.
La littérature (SBAGHI et al., 1993) montre en effet qu'une corrélation existe entre la sensibilité des baies à Botrytis, évaluée au vignoble, et la teneur en resvératrol de feuilles de vitroplants induites aux U.V.. Les résultats sont présentés au tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6 Résultats des dosages du resvératrol par H.P.L.C. réalisés 20 h après induction 8 mn aux U.V. 254 mn sur différentes variétés de vigne.
Variété testée (resvératrol) μg.g .-"1 poids sec
Rupestris 215 351 Porte-greffe 41B 237 Ugni-blanc 479 209 Pinot noir 386 86 Folle blanche 280 37 Pet 55-2 361 Pet 55-3 235 Pet 55-5 115 Pet 55-6 539
Légende du tableau 6 : L'induction aux U.V. est réalisée sur des vitroplants en culture sur milieu gélose. Les feuilles sont prélevées et extraites pour analyse 20 heures après le traitement. 46
PCT 55-2, 3, 5, 6 - transformants ayant intégré 1 ' insert 13 kb dans leur génome. Les résultats représentent la moyenne de 3 répétitions.
Ces résultats indiquent bien qu'une corrélation existe chez les variétés et cépages entre sensibilité à Botrytis et teneur en resvératrol des feuilles 20 heures après induction. Deux groupes sont identifiables parmi les variétés et cépages non transformés. Le premier, formé de V. ruspestris, V. vinifera x V. berlandieri (41B) et Ugni- blanc, correspond à celles et à ceux qui sont relativement tolérants au champignon. Le second, constitué du Pinot noir et de la Folle blanche représente ceux considérés comme moyennement tolérants voire très sensibles (Folle blanche par exemple) .
Les transformants ont, quant à eux, en moyenne, des teneurs en resvératrol, 20 heures après induction, supérieures ou égales au témoin non transformé 41B (539,
362 et 236 μg.g"1 matière sèche pour respectivement les clones 55-6, 55-2 et 55-3 et 237 pour le témoin) .
Pour le clone transformé 55-5 par contre, la concentration obtenue est la moitié de celle du témoin. Si l'on compare ces valeurs, exprimées en μg.g"1 de poids sec, à celles des feuilles isolées (tableau 5), on s'aperçoit qu'elles sont similaires pour le témoin mais par contre que les variations existent pour les transformants analysés 20 heures après induction. Celles-ci sont quelquefois très importantes (135 pour l'induction sur feuilles isolées et 362 pour induction sur vitroplants pour le clone 55-2 ; 44 contre 236 pour le clone 55-3 ; 392 contre 116 pour le clone 55-5 et 339 contre 540 pour 55-6) . De plus, une grande variabilité existe entre les différentes répétitions .
2) Etude comparée de l'expression du gène vst et de sa cinétique d'induction par stress biotique sur vitroplants de vigne 41B, transformés par 1 ' insert de 13 kb et par la 47
construction comprenant uniquement le gène vstl sous contrôle du promoteur PMs PR10-1.
Les résultats ci-dessus (chapitre 1) , obtenus sur des vitroplants ayant intégré par transformation génétique des copies supplémentaires des gènes de stilbene synthase
(sous forme d'un insert de 13 kb comprenant deux séquences fonctionnelles vstl et vst2) , montrent qu'une surproduction de resvératrol, produit de la réaction catalysée par l'enzyme stilbene synthase, est possible dans certains transformants lorsque ces gènes sont sous contrôle de leurs propres promoteurs et en réponse à un stress abiotique tel que l'irradiation par les U.V..
Par rapport à ces résultats, la production de resvératrol sur deux types de transformants a ensuite été vérifiée, le premier représentant un clone de 41B ayant intégré 1 ' insert de 13 kb (gènes de stilbene synthase vstl et vst2 sous contrôle de leurs propres promoteurs) , le second plusieurs clones ayant incorporé le gène vstl seul sous contrôle de la séquence de régulation de gènes de défense de la luzerne PMs-PR10-l. Cette comparaison a été faite après induction par un stress biotique causé par Botrytis cinerea . a) Méthodes utilisées α) Mise en évidence de la fongitoxicité de la molécule resvératrol sur Botrγtis cinerea
Les données de la littérature sur la molécule en tant que fongitoxique sont contradictoires . Selon DAÏ (1994) , le resvératrol montre bien une action inhibitrice sur le développement des zoospores de Plasmopora vi ticola (agent du Mildiou) . Par contre, selon PONT et PEZET (1990) il ne bloque pas la germination des conidies de Botrytis cinerea .
L'action de la molécule a été étudiée sur la croissance des hyphes mycéliens de Botrytis cinerea en culture sur un milieu Malt-Agar, comprenant une gamme de 48
dilution de resvératrol variant de 10"1 M à 3,7.10"3 M et incubés à température ambiante 7 jours. Les résultats ont montré une action inhibitrice de la molécule (CI50 ≈ 500 μmoles.l"1), avec diminution exponentielle du diamètre moyen de croissance du champignon pour des concentrations supérieures à 125 μmoles.l"1. Par contre, des concentrations de 37 μmoles.l"1 n'inhibent que très peu la croissance du mycélium (cf. Figure 9). Cette inhibition est cependant levée progressivement après 7 jours de culture dans ces conditions, par ailleurs très favorables à la croissance du champignon. Au bout de 20 jours, le champignon finit par contaminer l'ensemble de la surface de culture . β) Test de criblage de la tolérance de vitroplants de vigne à Botrytis cinerea
Le test mis au point a consisté à inoculer des feuilles de plantules, cultivées in vitro sur milieu de microbouturage, par dépôt sur leur face supérieure de 20 μl d'une suspension de conidies à 1.10"4 conidies .ml"1 (200 conidies par dépôt) dans un milieu malt -glucose . Les plantules, ainsi inoculées sur 4 feuilles différentes, sont cultivées ensuite en chambre climatique (photopériode 16 h jour, 8h nuit ; température 24 °C ; humidité 70 %) . Deux jours après l'inoculation, les feuilles de rang 4, les plus jeunes, ont été observées (nécroses et macérations présentes dénombrées grâce à une caméra reliée à un moniteur de télévision) et extraites au méthanol pour permettre de doser le resvératrol synthétisé en réponse à l'attaque par Botrytis . A 5 jours, les feuilles numéro 2 ont été prélevées pour être observées en microscopie à fluorescence. Une observation macroscopique (nécroses et macérations sur les feuilles) et un dénombrement des feuilles présentant des organes de fructification' du champignon (conidiophores) ont aussi été réalisés sur les feuilles numéro 3. Enfin à 9 jours, des feuilles en 49
interaction avec le champignon, prélevées sur trois plantes différentes, ont été extraites par le méthanol pour doser le resvératrol .
Y) In uction, â≤ stress biotique par dépôt de suspension contenant des spores de Botrytis cinerea sur des feuilles de vitroplants - test de tolérance à Botrvtis
Ce test de confrontation directe a été réalisé selon la technique déjà décrite (cf. paragraphe précédent). Il en est de même pour les observations effectuées. Pour chaque variété ou clone transformé, quatre vitroplants ont été utilisés et pour chacun d'entre eux trois feuilles développées de rang 2, 3, 4 ont été inoculées par la suspension de conidies (200 conidies dans 20 μl de milieu malt-glucose) . Douze inoculations ont donc été réalisées pour chaque variété ou clone et les analyses et les observations suivantes ont été faites : Deux jours après inoculation :
- observation des feuilles de rang 4 pour les symptômes foliaires (zone de macération du champignon ou spots nécrotiques, constitués de petites zones brun noir, localisées autour des spores de champignon, ou sans symptômes visibles) , et
- dosage du resvératrol sur ces mêmes feuilles. Cinq jours après inoculation : - observation des feuilles de rang 3 pour les symptômes foliaires avec dénombrement de celles qui portent des conidiophores (organes de fructification du champignon) , et
- observation en microscopie à fluorescence des feuilles de rang 2 pour localisation des zones de synthèse du resvératrol . Neuf jours après inoculation :
- dosage du resvératrol dans trois feuilles, issues de trois plantes différentes, en interaction avec le parasite.
Pour chaque série expérimentale, trois cépages de Vitis vinifera ayant des sensibilités différentes aux attaques de Botrytis sur les baies ont été étudiés : Folle 50
blanche (sensible) , Pinot noir (moyennement tolérant) , Ugni-blanc (tolérant) et le porte-greffe 41B (tolérant) ainsi que quatre de ses transformants : l'un ayant inséré des copies surnuméraires des gènes codant pour une stilbene synthase (insert 13 kb) , clone 55-3 et les trois autres, représentant des transformants de la construction promoteur PMs PR10-l-gène vstl soient les clones 145-2, 145-5 et 145- 6. b) Résultats obtenus
Les résultats sont présentés dans les tableaux 7 et 8, pour les symptômes foliaires observés 2 ou 5 jours après l'inoculation et, dans les tableaux 9 et 10, pour les dosages de resvératrol rapportés soit au poids sec, soit à la teneur en chlorophylle .
Tableau 7 : Observations macroscopiques des interactions feuilles de vitroplants-Botrytis cinerea à 2 jours
Nombre de feuilles n° 4, observées sur
Variété testée 4 plantes différentes, où apparaissent les symptômes suivants
Zones de Spots Aucun macération nécrotiques symptôme visible
Folle blanche 280 4 1 0
Pinot noir 386 3 4 0
Ugni-blanc 479 1 2 1
41B 0 4 0
Pet 55-3 2 3 0
Pet 145-2 0 3 1
Pet 145-5 0 1 3
Pet 145-6 1 1 2 51
Légende du tableau 7 :
Zones de macération : zone large et diffuse où Botrytis détruit rapidement les cellules végétales. Ces zones ont une couleur beige marron clair.
- Spots nécrotiques : zones très petites circonscrites autour du champignon. Ces spots sont de couleur brun-noir.
Tableau 8 : Observations macroscopiques des interactions feuilles de vitroplants-Botrytis cinerea à 5 jours
Nombre de feuilles n° 3, observées sur
Variété testée 4 plantes différentes, où apparaissent les symptômes suivants
Zones de Spots Aucun macération nécrotiques symptôme visible
Folle blanche 280 4 0 4
Pinot noir 386 3 1 2,5
Ugni-blanc 479 2 1 0,5
41B 1,5 2 0,5
Pet 55-3 2 2 1
Pet 145-2 1,5 2 1
Pet 145-5 0,5 4 0
Pet 145-6 3 2 1
Figure imgf000053_0001
Légende du tableau 8 :
Zones de macération : zone large et diffuse où Botrytis détruit rapidement les cellules végétales. Ces zones ont une couleur beige marron clair.
- Spots nécrotiques : zones très petites circonscrites autour du champignon. Ces spots sont de couleur brun-noir. 52
Tableau 9 : Résultats des dosages du resvératrol par H.P.L.C. sur différentes variétés de vigne en interaction avec Botrytis cinerea depuis 2 jours
Variété resvérat . mg.g"1 resvérat. μg.g"1 testée chloroph. poids sec
Folle B280 5,1 101
Pinot N386 4,3 102
Ugni B479 3,9 86
Porte-g41B 5,7 112
Pet 55-3 4,6 118
Pet 145-2 6,9 170
Pet 145-5 2,2 83
Pet 145-6 4,3 107
Figure imgf000054_0001
Légende du tableau 9 :
- resvérat. : resvératrol ; chloroph. : chlorophylle Folle B 280 : Folle blanche 280 ; Pinot N 386 : Pinot noir 386 ; Ugni B 479 : Ugni-blanc 479 ; Porte-g41 B : Porte- greffe 41B.
Tableau 10 : Résultats des dosages du resvératrol par H.P.L.C. sur différentes variétés de vigne en interaction avec Botrytis cinerea depuis 9 jours
Variété testée resvératrol mg.g"1 resvératrol μg.g"1 chlorophylle poids sec
Folle blanche 280 4,0 38 Ugni-blanc 479 31,7 145 Porte-greffe 41B 11,9 59 Pet 145-5 602,1 2558 53
Φ Deux jours après inoculation :
L'observation a porté sur les feuilles les plus jeunes (rang 4) . Dans presque tous les cas, hormis le 41B et les clones 145-2 et 145-5, des zones de macération ont été observées (colonisation du champignon) . Les cépages sensibles en ont présenté plus que les cépages tolérants : Folle blanche et Pinot noir respectivement 4 et 3 zones contre 1 seulement pour le cépage Ugni-blanc. Seuls les transformants 145 (promoteur PMs PR10-l-gène vstl) et l'Ugni-blanc ont donné des feuilles sans symptômes visibles. Les zones nécrotiques, réaction de défense de la plante, sont apparues principalement sur le 41B et ses transformants et, pour les cépages, sur Pinot noir et Ugni- blanc . Si l'on compare ces observations aux dosages de resvératrol (tableau 9) , aucune corrélation ne peut être établie puisque, ramenées au poids sec, les teneurs en resvératrol de ces feuilles sont comparables avec environ
100 μg.g"1 de matière sèche. Elles s'établissent pour l'ensemble des vitroplants examinés à des valeurs comprises entre 4 et 5 mg.g"1 chlorophylle.
Seuls le porte-greffe 41B et surtout le transformant 145-2 ont des valeurs supérieures. Le clone 145-5 quant à lui a une valeur plus faible (de moitié environ) .
Une comparaison peut aussi être établie avec les teneurs en resvératrol obtenues précédemment 20 heures après induction des vitroplants aux U.V. (tableau 6) . Bien que la période de prélèvement ne soit pas comparable (20 heures pour le stress abiotique contre 48 heures pour les stress biotiques, mais il faut prendre en compte le temps nécessaire à la germination des spores) , on constate en général des teneurs plus faibles en resvératrol après un stress biotique (de moitié ou du tiers, cas de l'Ugni- blanc) , sauf pour le Pinot noir où elle est comparable et 54
pour la Folle blanche où elle est environ trois fois plus forte .
Dans tous les échantillons analysés, on peut souligner une forte dispersion des valeurs obtenues dans les différentes répétitions effectuées. Cette variabilité entre différentes feuilles d'un même plant, déjà observée avec les échantillons ayant subi les inductions aux U.V. , pourrait, là aussi, avoir plusieurs origines. Parmi les hypothèses les plus plausibles, on peut citer : Une grande variabilité de réaction entre vitroplants d'un même clone face à l'agression du champignon. Les symptômes foliaires variables, obtenus après inoculation par les spores de Botrytis semblent le confirmer (variabilité dans l'infection, dans l'état physiologique de chaque plante, etc.).
Le dosage, effectué sur la feuille entière, n'est pas représentatif des variations de synthèse du resvératrol existant au niveau de chaque cellule qui la compose. Il est, en effet, généralement admis que, dans les réactions d'hypersensibilité à un parasite, toutes les cellules du limbe ne synthétisent pas les molécules de défense. Seules sont induites à la synthèse de phytoalexines les cellules situées près des zones d'attaque du champignon. Les analyses, réalisées dans ce test, ne représentent donc que des valeurs correspondant à un taux moyen de resvératrol présent dans le limbe des feuilles en interaction avec le parasite. Un phénomène de dilution important peut donc se produire, notamment pour les plantes résistantes, entre les concentrations présentes dans les cellules induites à la synthèse de la phytoalexine et la valeur trouvée lors de l'analyse de la feuille entière. Ceci est sans doute plus marqué dans la première période d'expression des réactions de défense de la plante. Cinq jours après l'inoculation : Les observations des symptômes montrent (planches photos n° 1 et 2 (Figures 10 et 11) et tableau 8) que des zones de macération sont formées, en plus ou moins grand 55
nombre, chez tous les cépages, porte-greffe et transformants étudiés. Celles-ci sont souvent associées à la présence de conidiophores (organes de fructification du champignon) . Parmi les cépages et le porte-greffe 41B témoin, la Folle blanche, espèce la plus sensible à Botrytis , présente des attaques sur toutes les feuilles étudiées et aussi des conidiophores. Si l'on établit une hiérarchie dans la gravité des symptômes viennent ensuite le Pinot noir, puis 1 'Ugni-blanc et enfin le 41B. Cependant, pour ces deux derniers, les conidiophores ne sont développés que sur une demi-feuille seulement. En ce qui concerne les clones transformants, trois clones ont donné des réactions plus ou moins similaires : 55-3, 145-2 et 145-6. Seul le clone 145-5 a présenté une bonne tolérance au parasite, puisqu'une demi-feuille seulement a permis le développement d'une zone de macération et aucun conidiophore n'est visible.
Par contre, pour ce clone, la majorité des feuilles a réagi à l'agression en formant des zones nécrotiques. Un exemple est d'ailleurs présenté sur la planche photo 2 (Figure 11) .
Pour vérifier si ces résultats correspondaient bien à des différences notables dans l'induction de la synthèse du resvératrol et donc à l'expression de gène (s) codant pour une stylbène synthase, des feuilles, inoculées par les spores de Botrytis, ont été observées en microscopie à fluorescence (équipé du filtre A : filtre excitation de 340 à 380 nm ; filtre d'arrêt à 425 nm) . Dans ces conditions, la chlorophylle fluoresce en rouge, le resvératrol en blanc bleuté ou bleu plus foncé selon sa concentration. Deux cépages, Folle blanche (sensible) et
Pinot noir (moyennement tolérant) , le porte-greffe 41B
(tolérant) et un de ses transformants 145-5 (construction
Promoteur PMs PR10-l-gène vstl) ont été étudiés par cette méthode. Les photographies de ces observations sont présentées planche photo 3 (Figure 12) . Des différences remarquables sont visibles. Sur la Folle blanche, le 56
mycélium du parasite (en noir sur la photo) s'est développé et a colonisé les tissus. Pratiquement aucune cellule bleutée n'est observable. Sur le cépage Pinot noir on note une zone bleutée formant barrière autour et dans la zone d'inoculation et de début de colonisation du champignon. La croissance du mycélium est ralentie voire bloquée par cette barrière, même si un processus de macération des tissus a déjà été engagé. Une coloration bleue plus intense existe aussi dans les nervures. Sur le porte-greffe 41B témoin, dans la zone étudiée, des cellules éparses, réparties dans tout le limbe, montrent une fluorescence bleue claire avec une intensité plus grande dans les nervures. Aucun processus de colonisation du champignon n'a été engagé et des zones nécrotiques éparses, limitées à quelques cellules, sont visibles. Sur le 41B transformé par la construction promoteur PMs PR10-l-gène vstl, les résultats sont spectaculaires pour le clone 145-5. Un début de colonisation des tissus par le champignon a été engagé
(zone noire) mais, très vite, une barrière cellulaire, synthétisant du resvératrol, s'est formée autour de cette zone, bloquant ainsi son extension. Dans la zone de macération du champignon des cellules bleues sont encore visibles. En outre, une grande partie des cellules du limbe de la feuille qui ne sont pas en contact avec le champignon, ont synthétisé, elles aussi, du resvératrol. Les nervures aussi présentent une intense coloration bleue. Ces observations mettent en évidence qu'il existe donc une corrélation entre l'intensité des symptômes foliaires, développés après inoculation de vitroplants par des spores de Botrytis , et la teneur en phytoalexine de type stilbénique des feuilles. Les plantes les plus tolérantes sont celles qui présentent une synthèse de resvératrol répartie sur une grande partie du limbe. Ceci est réalisé avec le transformant 145-5, comportant un gène codant pour une stilbene synthase sous contrôle du promoteur PMs PR10-1, isolé de la luzerne. 57
Neuf jours après inoculation :
Les observations des symptômes ont montré que les vitroplants de Folle blanche étaient aussi dans ce test particulièrement sensibles aux attaques de Botrytis . A neuf jours, ils sont tous envahis par le champignon et ont, dans la plupart des cas, une forte dégradation de leur chlorophylle. En ce qui concerne le cépage Ugni-blanc et le porte-greffe 41B, aucune différence n'a pu être constatée dans l'expression des symptômes foliaires. D'une manière générale, les résultats des observations des symptômes effectuées à cinq jours sont retrouvés en un peu plus développés pour les zones de macération. Par contre, les feuilles qui présentaient des conidiophores se sont nécrosées dans la plupart des cas. 4 variétés ont été analysées pour leur teneur en resvératrol : la Folle blanche (sensible), 1 'Ugni-blanc (tolérant) , le 41B (tolérant) et le 145-5 (41B transformé Promoteur PMs PR10-l-gène vstl) . Pour le 145-5, neuf jours après inoculation, il. ne présentait toujours pas de symptômes notables d'attaque par Botrytis . Les résultats des analyses de teneur en resvératrol sont présentés tableau 10. Exprimées en μg de resvératrol .g"1 de poids sec ou en mg.g"1 de chlorophylle, les concentrations de resvératrol permettent le classement suivant des variétés, en allant de la plus faible valeur vers la plus forte : Folle blanche < 41 B < Ugni-blanc < 41B transformé 145-5.
Les différences de concentration sont très importantes, puisque le transformant 145-5 a une valeur près de 43 fois supérieure à celle du 41B témoin (en g"1 de poids sec) et de 50 fois supérieure si elle est exprimée en g"1 de chlorophylle. Les dosages confirment donc bien les évaluations effectuées en microscopie à fluorescence à cinq jours (voir planche photo 3, figure 12) .
En ce qui concerne l 'Ugni-blanc et le 41B, le tableau 10 montre que le premier a environ 3 fois plus de resvératrol que le second, quelles que soient les unités 58
choisies. Pourtant, ces deux variétés réagissent de manière identique en terme de symptômes foliaires. D'autres phénomènes que la synthèse de resvératrol peuvent être mis en jeu pour expliquer cette similitude de tolérance. Il faut noter aussi que dans les conditions du test, la confrontation plante-Botrytis est particulièrement favorable à ce dernier. Les conditions d'environnement existant dans un conteneur in vitro font qu'après 20 jours de culture environ, tous les vitroplants quels qu'ils soient, sont infectés par le champignon. c) Conclusions sur la transformation génétique de la vigne et l'analyse de l'efficacité des promoteurs étudiés
Les expériences sur cellules embryogènes de 41B (porte-greffe hybride V. Vinifera x V. Berlandieri ) transformées par Agrobacterium tumefaciens comprenant les différentes constructions, n'ont pas permis de régénérer des plantes avec les constructions qui comportaient le gène vstl sous contrôle du promoteur 35S ou de ses dérivés. Aucune activité constitutive forte sur l'ensemble de la plante n'a donc pu être obtenue.
Par contre, des plants de vigne ayant incorporé les constructions PMs PR10-l-gène vstl et insert 13 kb (gènes vstl et vst2 sous contrôle de leurs propres promoteurs) ont été obtenus. Ces plantes, transformées génétiquement, ont pu être comparées au témoin (41B non transformé) et multipliées par micropropagation.
Comparées aux témoins non transformés, peu de différences ont pu être constatées sous stress U.V. (stress biotique) dans les concentrations en resvératrol des différents transformants obtenus avec 1 ' insert de 13 kb, où sont présents dans la séquence utilisée comme insert deux gènes vstl et vst2, gènes tous deux sous contrôle de leurs propres promoteurs .
Par contre, les résultats montrent que la construction chimérique PMs PR10-l-gène vstl permet une surexpression de la phytoalexine resvératrol (produit de la 59
réaction catalysée par une stilbene synthase) , en présence d'un stress biotique causé par Botrytis cinerea de l'ordre de 50 fois plus, 9 jours après infection. Ces plantes montrent alors une meilleure tolérance si on les compare soit au témoin, soit à des transformants obtenus avec 1 ' insert 13 kb.
Ainsi, la transformation avec la construction associant le promoteur inductible PMs PR10-1 de luzerne avec les gènes de stilbene synthase, permet de surexprimer dans les plants de vigne les gènes de stilbene synthase en réponse à un stress comme par exemple l'attaque d'un pathogène .
60
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Claims

63REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant la séquence du promoteur d'une PR protéine de luzerne associée à au moins une séquence d'un gène codant pour une stilbene synthase.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur d'une PR protéine de la luzerne est un promoteur inductible dans les plantes, tissus spécifiques ou non, par un stress biotique ou abiotique .
3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne est choisie dans le groupe comprenant : a) la séquence IND SI, b) toute séquence correspondant à un fragment de la séquence IND SI et ayant effet de séquence promotrice chez les plantes .
4. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne présente au moins 80 % d' homologie avec la séquence IND SI .
5. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne présente au moins 90 % d' homologie avec la séquence IND SI .
6. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne présente au moins 95 % d' homologie avec la séquence IND SI. 64
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence du gène codant pour une stilbene synthase est choisie parmi les gènes isolés à partir des génomes de l'arachide, de l'orchidée, de la vigne et du pin.
8. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence du gène codant pour une stilbene synthase est la séquence d'un gène codant pour une stilbene synthase de vigne.
9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence du gène codant pour une stilbene synthase de vigne est une séquence choisie parmi : a) le gène vstl, b) le gène vst2.
10. Système d'expression d'un gène de stilbene synthase chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
11. Système d'expression d'un gène de stilbene synthase chez les plantes selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.
12. Vecteur d'expression selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
13. Système d'expression selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il peut être transféré dans des souches d'Agrobacterium.
14. Système d'expression selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il est inductible dans les plantes par un stress biotique ou abiotique . 65
15. Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que le stress biotique est l'attaque d'un parasite .
16. Système d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce que le parasite est une bactérie, une levure, un champignon ou un virus.
17. Système d'expression selon la revendication 16, caractérisé en ce que le parasite est Botrytis cinerea ou
Plasmopora vi ticola .
18. Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que le stress abiotique est une blessure mécanique.
19. Système d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que la blessure mécanique est causée par un insecte.
20. Système d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que la blessure mécanique est causée par un phénomène physique tel que le vent ou le gel .
21. Cellule végétale transformée par un système ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 20.
22. Cellule selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule de vigne.
23. Procédé d'obtention de cellule selon l'une des revendications 21 et 22, caractérisé en ce qu'on transforme une cellule végétale à l'aide d'un procédé microbiologique incluant un système ou vecteur selon l'une des revendications 10 à 20. 66
24. Procédé d'obtention de plantes exprimant un gène de stilbene synthase, caractérisé en ce qu'on transforme des cellules végétales desdites plantes à l'aide d'un système ou d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 20, on sélectionne les cellules exprimant ledit gène et l'on régénère une plante à partir de ces cellules.
25. Plante comportant un système d'expression selon l'une des revendications 10 à 20.
26. Plante comportant des cellules selon l'une des revendications 21 et 22.
27. Plante obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 23 et 24.
28. Plante selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une plante d'intérêt agronomique .
29. Plante selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'il s'agit de la vigne.
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