CN1375011A - 含有压力诱导型启动子序列和二苯乙烯合成酶编码基因序列的核酸 - Google Patents
含有压力诱导型启动子序列和二苯乙烯合成酶编码基因序列的核酸 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及对某些二苯乙烯敏感性病原体具有改良抗性的植物,更具体地,涉及联合了一个可被生物压力,尤其是所述病原体造成的生物压力诱导的植物启动子和二苯乙烯合成酶编码基因的一组构建体。
Description
本发明涉及对某些二苯乙烯敏感性病原体具有改良抗性的植物，更具体地，涉及联合了一个可被生物压力(stress)，尤其是所述病原体造成的生物压力，诱导的植物启动子和一或多个二苯乙烯合成酶编码基因的一组构建体。
通常全球种植植物收成的一大部分被寄生物和病原体所毁坏。在减少或防止这些寄生物侵害种植植物的可能的选择中，化学控制(植物保护处理)是最常用的方法。然而，化学品的应用会产生环境后果并且有时会出现技术问题，例如新的抗性致病株的出现，或在酿酒领域发酵过程出现困难(固醇生物合成抑制剂的使用会妨碍发酵后期酵母的生长)或存在化学品如有时在酒中发现的抗灰霉病产品腐霉利。
旨在提高种植植物对这些病原体所致疾病的抗性的控制方法已被提出作为一种能克服化学控制缺点的方法。例如，在第一个方法中，可通过有性途径，即采用经典遗传学方法，将需提高抗性的植物与耐受性品种杂交来实现这种改良。然而，该方法并不总是可行(天然耐受性品种未知)，或为立法所禁止，例如在葡萄栽培业中法国对“初始名称控制”(Appellations d’Origine Controlée，A.O.C.)(初始注册名称)立法，对用于一个给定称谓(名称)的葡萄栽培品种作了限制。
在第二个方法中，可采用细胞和分子生物学现代技术将一或多个同源或异源基因整合至植物基因组，表达或超表达蛋白质性质的目标分子，以增加代谢物的产量或代谢途径，或开启一个新的生物合成途径，或合成一个新的分子例如用于增强新生物合成途径的开放，例如通过增强植物对所述病原体的防卫机制来增加植物的抗性。
植物中有几种不同的该类型防卫机制。一些机制可被认为是被动的，与植物的细胞、表皮组织和/或器官的物理化学特性相关。其它机制涉及基因/基因相互作用的动力学(植物抗性基因和病原体无毒基因，宿主/病原体相互作用机制)。尽管这些相互作用会导致出现超敏反应(为阻止微生物在植物中建群，在感染位点周围植物细胞的快速死亡)，其也会导致一整套化合物的合成和积累。其中，一些是参与感染点周围“物理”屏障形成的周壁成分(愈创葡聚糖、木质素、富含羟脯氨酸的蛋白：HRGP，等)，而其它的化合物是具有抗微生物功能的或多或少已有描述的分子(植物抗毒素、病原体相关蛋白：PR蛋白(致病相关蛋白)，等)。在例如宿主/病原体相互作用的过程中由植物合成并积累的植物抗毒素类分子包括具有毒性、尤其是对微生物具有毒性的二苯乙烯。术语二苯乙烯定义为一组具有反式-二苯-1，2-乙烯骨架共同基本结构的化学物质，其中白藜芦醇和赤松素是最简单的。该基本骨架在植物中是通过二苯乙烯合成酶或相关酶从底物如丙二酰辅酶A、肉桂酰辅酶A或香豆酰辅酶A合成的，这些底物存在于所有植物中(类黄酮前体)。二苯乙烯合成酶或相关酶的基因已被分离、测序和克隆，尤其是来自花生、兰花和葡萄树的酶。使用这些基因，可转化植物如马铃薯、苜蓿或烟草，使其对病原体的侵袭表现出比未转化植物更大的抵抗力(EP-309862；EP-648839；MELCHIOR，F.等，Arch.Biochem.Biophys.1991，288，2，552-557；WIESE，W.等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)1994，26，2，667-677；HAIN，R.等，自然(Nature)1993，361，153-156)。
这些具有抗微生物功能的分子的表达或超表达可使植物具有一种对压力，尤其是微生物类型压力的“天然”的抗性。然而，该类型蛋白的组成型超表达必然对植物不利(能量消耗、生长减缓等)(FISCHER，R.等，植物杂志(The Plant Journal)1997，11，3，489-498)。
另一方面，在某些植物如葡萄树或草本植物中，二苯乙烯仅存在于一些健康组织中，而且浓度很低。相反，感染或损伤之后，在感染或损伤部位二苯乙烯极大地增加，这是因为这些二苯乙烯合成酶基因是可被生物或非生物压力(例如创伤，紫外线等)条件诱导的。
然而，这种调控在目标农作物中很少存在，或是存在但不足够有效。例如，在葡萄树中对植物抗毒素合成的研究显示，存在二苯乙烯(包括白藜芦醇)的健康组织仅是健康的木质组织。另一方面，当葡萄浆果遭受压力如病原体(引起灰霉病的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)或引起葡萄霜霉病的葡萄生单轴霉(Plasmopora viticola))侵袭时，在浆果组织中会发现存在二苯乙烯，而且另一方面，这种现象仅发生在幼果开始成熟之前。相反，从开始成熟至完全成熟，二苯乙烯浓度极大地降低。然而，由例如葡萄孢属(Botrytis)引起的损伤在浆果开始成熟前很少碰到，但在接近成熟的时期却相反。因此，二苯乙烯合成酶基因的表达必须用避开基因天然调节的、可诱导的尤其是可被压力本身诱导的强启动子来控制。本发明特别涉及这种性质的启动子。
本发明涉及含有连接了至少一个二苯乙烯合成酶编码基因序列的苜蓿PR蛋白质启动子序列的核酸。
本发明尤其涉及根据本发明的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白质启动子是一种可在植物中以或不以组织特异方式被生物或非生物压力诱导的启动子。
本发明还涉及根据本发明的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白质启动子的序列选自：
a)IND S1序列，和
b)相当于IND S1序列片段并在植物中具有启动子序列作用的任何
序列。
苜蓿PR蛋白质启动子序列优选与IND S1序列有至少80％同源性。这些序列尤其优选与所述序列有至少90％或95％同源性。
根据本发明的苜蓿PR蛋白质启动子序列来自PR蛋白基因的调节序列。利用苜蓿(紫苜蓿，Medicago Sativa)和丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv pisi)之间的宿主/寄生物关系产生的不相容反应(超敏反应，HR)，可分离负责该反应的基因的调节序列。
假单胞杆菌属(Pseudomonas)侵袭苜蓿时，在细菌感染产生的坏死的邻近区域可观察到植物反应的出现。
因此，取细菌侵袭后的植物材料以构建坏死邻近区域产生的信使RNA的cDNA文库。采用豆科植物的PR蛋白基因保守基序相应的合成寡核苷酸，聚合酶链式反应(PCR)扩增产生放射性探针，然后将该探针用于从cDNA文库中筛选转录本。其中一个转录本(cDNA-PR7)因测序后表现出与已知其它植物来源的相应PR蛋白编码基因有良好的同源性而被采用(参见图1和1a，显示分离该启动子的一般方案)。
分析显示，根据VAN LOON(1994)分类，其相应于编码第10类PR蛋白的基因。因此该基因命名为Ms PR10-1(紫苜蓿PR第10类蛋白，克隆1)。由于在分离和克隆的cDNA PR7中存在一个内部Bam HI位点(图1中的B)，从而可获得两个探针。这两个探针，EB和BE(E相应于图1中的EcoRI位点)分别被命名为5’和3’探针，用于筛选苜蓿基因组文库。从由5’和3’探针识别所获得的克隆中，选择了一个克隆C15并进行了测序(6.1kb)。合乎逻辑地，其本身也具有一个BamHI位点，从而可获得两个新片段：2.4kb EB片段和3.7kb BE片段，分别命名为E-B(g)和B-E(g)，g代表所获片段的基因组性质(见图1a)。位于C15克隆5’的E-B(g)片段含有启动子和部分Ms PR10-1基因编码序列，将该片段插入bluescript质粒的EcoRI和BamHI位点。通过切割位于E-B(g)片段内BamHI位点上游的Pst I位点，将该质粒线性化。对该片段进行3’到5’的缺失，直到获得IND S1启动子序列(图3)。平端连接可在C15克隆内部、Ms PR10-1基因启动子末尾再产生另一个BamHI位点。在这种情况下，C15克隆内部的该BamHI位点上游的Ms PR10-1基因编码序列的13个核苷酸就并入了IND S1启动子序列：经EcoRI/BamHI消化可作为一个整体分离(见实施例1)。
在本文中，PMs PR10-1也指任何具有植物启动子作用的IND S1序列的核酸片段和含有下面所述的Ms PR10-1基因编码序列的13个核苷酸的IND S1序列。
本发明还涉及根据本发明的核酸，其特征在于同源或异源的二苯乙烯合成酶编码基因序列选自从花生、兰花、葡萄树和松树基因组中分离的基因(EP-309 862，EP-464 461)。
在所述核酸中，优选编码葡萄树二苯乙烯合成酶的核酸，尤其是在如下文献中描述的核酸：HAIN，R.等，自然1993，361，153-156，和WIESE，W.等，植物分子生物学，1994，26，2，667-677；最优选与所述文献中vst1序列相对应的核酸。
使二苯乙烯合成酶基因获得表达的核酸除了包含所述基因外，自然还包含尤其是编码序列3’端的聚腺苷酸化序列和来自于所述基因或其它基因的增强子序列。
很自然地，有必要修饰核酸序列以确保所述基因的确与启动子以正确阅读框阅读，并且可预见的是，如果有必要，可使用相同类型的若干启动子和若干增强子序列。
还可采用根据本发明的核酸表达几个串联的或位于不同表达系统上的二苯乙烯合成酶基因。
根据本发明的核酸可用于构建植物表达系统，根据转化的植物组织或器官，该系统可是诱导型和/或组成型的(参见实施例2、3和4)。
因此，本发明还涉及在植物中表达至少一个二苯乙烯合成酶基因的系统，其特征在于它包含至少一个根据本发明的核酸。根据本发明的系统中，优选转化载体，尤其是质粒型转化载体。优点是，所述转化载体具有可转移至农杆菌(Agrobaterium)株系中的特征。
将能够由根据本发明的核酸表达的二苯乙烯合成酶基因置于PMsPR10-1启动子控制下，以便激活植物对二苯乙烯尤其是白藜芦醇、赤松素(pinosyl grapevine)或其糖基化衍生物如云杉苷、或寡聚物如葡萄抗霉素敏感的病原体的抗性机制。可提及的对二苯乙烯敏感的寄生物有灰葡萄孢，葡萄生单轴霉，Eutypa lata，等。
优选根据本发明的具有可被生物或非生物压力诱导特性的表达系统。
在根据本发明的所述生物压力中，尤其优选由二苯乙烯敏感性寄生物如病毒、细菌、酵母、真菌，尤其是灰葡萄孢或葡萄生单轴霉侵袭引起的生物压力。
在根据本发明的所述非生物压力中，尤其优选由机械损伤尤其如昆虫或物理现象如风或霜引起的损伤产生的非生物压力。
本发明还涉及转化了根据本发明的系统或载体的植物细胞。优选所述细胞是葡萄树细胞。
本发明还涉及采用微生物学技术包括根据本发明的系统或载体转化植物细胞的方法。
本发明进一步涉及获得表达一种(或几种)二苯乙烯合成酶基因的植物的方法，其特征在于采用根据本发明的系统或载体转化所述植物细胞，筛选表达所述基因的细胞，和从这些细胞再生植株。
可提及的最常用转化方法尤其是那些使用农杆菌，无论是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的方法，颗粒轰击或任何其它技术(电穿孔等)。
这些技术是已知的(REAM，W.，1989；NEGRETIU，I.和GHARTI-CHHETRI，G.B.，1991；CASSE-DELBART，F.，1996；STANFORS，J.C.，1990)，不再作详细描述。
利用尤其是质粒系统的技术首先是实施质粒向感受态菌株通常是大肠杆菌(E.coli)的转化，以克隆并检测质粒结构。然后，使用该菌株将重组质粒转移至农杆菌菌株，再用该农杆菌株转化植物细胞。
含有根据本发明的表达系统或细胞的植物是本发明的一部分。
通过实施根据本发明的方法获得的植物也是本发明的一部分。
最后，本发明还涉及根据本发明的植物，其特征在于该植物是农业上感兴趣的植物，尤其是葡萄树植物。
根据本发明的构建体和方法的其它特征将通过以下实施例来说明。
附图说明：图1和1a：描述分离相应于IND S1序列的可诱导启动子PMs PR10-1的方法步骤的总流程。图2：与cDNA-PR7内部BamHI(B)位点划分的5’和3’部分发生Southern杂交的各种分离克隆的图示。
限制性位点：E＝Eco RI，B＝Bam HI
图中所示值以kb(千碱基)表示。图3：相应于IND S1序列的DNA序列，其是可诱导性苜蓿启动子PMs PR10-1的分离的基因组序列。图4：相应于添加了接头的修饰的葡萄树二苯乙烯合成酶基因(修饰的vst1)序列的DNA序列。
修饰部分以斜体表示。
编码和非编码(内含子)部分分别用大写和小写字母表示。图5：含有可诱导启动子PMs PR10-1序列(相应于小写的IND S1序列)和与其相连的加有接头的葡萄树二苯乙烯合成酶基因序列(修饰的vst1，相应于图4)的DNA序列。这两者之间(该序列中加框者)是(小写的启动子末尾和大写的含有翻译起始密码的基因的开头)来自于Ms PR10-1基因编码框内部序列的13个核苷酸；由于ATG已置于修饰的vst1基因的阅读框中，因此这些核苷酸已整合在vst1编码框中。
可诱导启动子PMs PR10-1的序列包括了Ms PR10-1基因序列的这13个核苷酸中的7个(框中以小写字母表示)。
相应于葡萄树二苯乙烯合成酶基因序列的编码和非编码(内含子)部分分别用大写字母和小写字母表示。图6：图示以UV光诱导二苯乙烯合成酶编码基因。
用紫外光诱导后17小时，从大约1g叶中提取RNA。取10-20ug RNA上样至甲醛/甲酰胺变性凝胶中。电泳后(3V/cm)，将RNA转移至尼龙膜上，以紫外光照射固定(254nm，33mJ/cm2)。用生物素标记的探针vst1在65℃杂交过夜，获得Northern印迹。
用作初始材料的外植体包括从41B(对照)试管植物(vitroplant)或已转化整合了额外拷贝数的处于其自身启动子控制之下的葡萄树二苯乙烯合成酶编码基因的构建体(含有作为一个葡萄树基因组片段的两个完整二苯乙烯合成酶基因vst1和vst2和另一个截短的二苯乙烯合成酶基因vst3的13kb插入片段)的41B试管植物分离的叶子(克隆2和3分别相应于克隆55-2和55-3)。41B：stock-vine杂交种：V.viniferaChasselas×V.berlandierii。图7：紫外光诱导后二苯乙烯合成酶mRNA积累的动力学。
从约1g叶子中提取RNA。取10-20ug RNA上样至甲醛/甲酰胺变性凝胶中。电泳后(3V/cm)，将RNA转移至尼龙膜上，以紫外光照射固定(254nm，33mJ/cm2)。用生物素标记的探针vst1在65℃杂交过夜，获得Northern印迹。
外植体是从41B试管植物分离的叶子。未遗传转化的克隆作为对照，与之相反，克隆2和3(分别与克隆55-2和55-3对应)在基因组中整合了含有葡萄树二苯乙烯合成酶基因(vst1+vst2)的13kb插入片段(见上)。41B：stock-vine杂交种：V.vinifera Chasselas×V.berlandierii。图8：紫外光处理8分钟后在不同时期分析的试管植物叶子中存在的白藜芦醇的量。
白藜芦醇的量以ug/g新鲜材料表示。
NI：未诱导的
对照是取自未转化41B的叶子。PCT 55-2和55-3是两个整合了含有两个完整葡萄树二苯乙烯合成酶基因(vst1+vst2)的13kb插入片段的转化体。图9：灰葡萄孢菌丝体916T株在20℃7天后的生长抑制。
该菌丝体培养于含有不同浓度白藜芦醇的麦芽/葡萄糖培养基上。图10：平板1的照片
在给试管植物叶子接种了分生孢子悬液之后5天，宏观观察与灰葡萄孢相互作用的不同品种葡萄树-未转化植物的特征。上排：
-左：Folle blanche品种，克隆280，敏感。
-右：Pinot noir品种，克隆386，中等耐受。下排：
-左：Ugni-blanc品种，克隆479，耐受。
-右：41B stock-vine，耐受。图11：平板2的照片
在给试管植物叶子接种了分生孢子悬液之后5天，宏观观察与灰葡萄孢相互作用的转化了不同构建体(145：Ms PR10-1启动子-vst1基因；55：含有两个处于其自身启动子控制之下的基因vst1和vst2的13kb插入片段)的41B stock-vine克隆的特征。上排：
-左：克隆145-2。
-右：克隆145-5。下排：
-左：克隆145-6。
-右：克隆55-3。图12：平板3的照片
在给试管植物叶子接种了分生孢子悬液之后5天，用荧光显微镜观察与灰葡萄孢相互作用的不同品种葡萄树的特征。
荧光：滤光器A(激发光340-380nm；终止滤光片425mm)。白藜芦醇发青白色和蓝色(取决于其浓度)荧光，而叶绿素发红色荧光。黑色区域相应于真菌感染部位或小的坏死区。上排：
-左：Folle blanche品种，克隆280，敏感，很少或无白藜芦醇合成。
-右：Pinot noir品种，克隆386，中等耐受，在叶脉及真菌侵染区有白藜芦醇合成。下排：
-左：未转化的stock-vine，耐受。在叶脉和小而非常集中的感染(坏死区)周围的叶片中有强的白藜芦醇合成。
-右：转化了145构建体即vst1基因启动子PMs PR10-1的stock-vine41B，克隆145-5，极耐受。在感染区及其周围、叶脉、叶子的几乎整个叶片均具有很强的白藜芦醇合成。
实施例1含有苜蓿PR蛋白基因调控序列的基因组克隆的获得A)获得用于寻找启动子的探针(参见图1和1a)
利用苜蓿(紫苜蓿)和丁香假单胞菌豌豆致病变种的宿主/寄生物关系中的不相容反应(超敏反应，HR)，可构建cDNA文库。从细菌感染引起的坏死邻近区域抽提并纯化信使RNA，再由此制备cDNA文库。植物材料取自细菌悬液浸润后6小时。
已知豆科植物的PR蛋白具有保守基序；这些保守基序根据已完成的豌豆和大豆PR蛋白测序来确定，因此，可合成相应于这些基序的寡核苷酸。PCR扩增获取放射性探针，用于在上述cDNA文库筛选转录本。采用其中一个测序后显示与豌豆和大豆PR蛋白编码基因有87％同源性的克隆cDNA-PR7。分析显示该克隆实际上相应于根据VAN LOON等(1994)分类法的第10类PR蛋白的编码基因。将该克隆命名为Ms PR10-1(紫苜蓿PR第10类蛋白，克隆1)。
通过Northern印迹法对苜蓿进行的对照实验显示，不相容反应中相应转录本在感染后3小时内开始积累，在第24至48小时间达到最大，72小时后缓慢减少。
该片段的特征是存在一个内部Bam HI位点(图2中标示为B)，它将该片段划分为两个部分：-5’端部分，约340个碱基，包括ATG上游区(转录但不翻译)和304个碱基的下游序列。-3’端部分，包括编码部分的末端即165个碱基，和非翻译3’区即从终止密码子至多聚A开始处的186个核苷酸。B)分离含有PR蛋白启动子的基因组克隆1)基因组克隆的分离
本实验采用了用EMBL4(滴度：7.108 p.f.u.(噬斑形成单位)×ml-1)制备的苜蓿基因组文库，以6×105 p.f.u.铺平板。以Ms PR10-1(cDNAPR7)的5’片段作为探针筛选该文库，45个克隆出现信号，其中13个克隆有强信号。限制性作图和采用Ms PR10-1的5’和3’片段进行的杂交表明有7个不同的克隆(参见图2)。比较筛选该文库获得的这7个克隆的大小(9.3；6.5；6.1；5.8；4.8；4.2；2.2kbp)与苜蓿基因组DNA印迹检测到的条带的大小，显示出这两组实验数据间很好的一致(参见图2)。因此，由此可推断PR7蛋白编码基因属于一个小的多基因家族。
然后，将这些克隆(除了克隆C12)的(EcoRI/EcoRI位点)片段的整体或部分亚克隆，并进行测序。2)测序
首先选择了一个克隆即克隆C15用于测序(参见图1和1a)。
最初的测序工作显示在PR蛋白编码基因的开放阅读框中存在一个约315个核苷酸的内含子。BamHI消化该克隆后，对其进行了分析(参见图1a)。克隆C15：6.1kb
用EcoRI和BamHI分析该克隆，可获得两个片段，即E-B(约2.4kbp)和B-E(约3.7kbp)。测序并比较(被600个核苷酸的内含子中断的)该编码序列和Ms PR10-1(cDNA PR7)的序列，结果表明该基因组克隆与该参考cDNA完全相同。3)在苜蓿/假单孢杆菌属系统中分析分离克隆的表达
这些实验集中在克隆C15上进行，而且为确定在防卫反应诱导过程中实际转录的信使分子采用了5’延伸技术。该技术的另一个优点是可定位转录起始位点。结果说明，实际上克隆C15作为苜蓿/假单孢杆菌属相互作用的一部分在防卫反应诱导过程中表达于叶中。实施例2为验证分离克隆的启动子活性进行遗传转化A)所用启动平区
用于验证性转化的两个启动子是：对照启动子和分离自苜蓿基因组、源于C15的PR启动子(即PMs PR10-1启动子)。1)CaMV-35S启动子
该启动子是组成型的，用作标准启动子。它相应于调控花椰菜镶嵌病毒(CaMV)35S RNA亚单位基因转录的序列。用于构建gus报告基因结构的启动子区实际上是该启动子的一部分，该部分以EcoRI/BamHI片段的形式从质粒pDH51(PETRZAK等，1986)中重新分离。2)PR启动子
对C15基因组克隆的启动子区域进行研究。以下称该启动子为PMsPR10-1。PMs PR10-1：
它来源于克隆C15的2.4kb的EcoRI/BamHI(E/B)片段(图1a)。由于克隆C15的TATA盒(转录起始)和ATG(翻译起始)间没有限制性位点，所以将该片段整合至二元质粒的报告基因上游(见下)是困难的。因此进行缺失实验，直到获得一个约1.5kb的片段(序列IND S1)。然后通过平端连接在所获片段上添加一个BamHI位点，以便将其插入下面使用的不同编码序列的上游。因此该片段包括(参考用于克隆该片段及上游启动子区域的cDNA进行表示)：Ms PR10-1基因的5’UTR(非翻译区)的39个末端核苷酸(其距离起始ATG密码子10bp)，Ms PR10-1基因的ATG，以及紧密位于整合的BamHI位点上游的一小段该基因编码区片段(10bp)。考虑到克隆位点，以此方法构建的该启动子具有一个潜在的ATG，因此在构建嵌合基因时会存在相距很近的两个ATG密码子。这样就会有改变所用基因(报告基因或二苯乙烯合成酶基因)编码框的危险。
对于用报告基因进行的转化实验，同样采用的是克隆在STRATAGENEBluescript pSK+/-质粒中的PMs-PR10-1(PRI)。它可以以约1.5kbEcoRI/BamHI片段的形式再分离。3)所用质粒a)p35S-gus intron(VANCANNEYT等，1990)
该质粒是pBin19(BEVAN，1984)的衍生物，本身具有二元质粒的左右边界，使用农杆菌可将位于这两个边界之间的片段插入植物中。
gus内含子(源于马铃薯LSI基因的内含子)报告基因的开发可消除由农杆菌污染引起的假阳性(尤其是瞬时表达过程中)。这是因为这些细菌不能拼接内含子。
在标准系统中，该基因编码β-葡糖醛酸酶，在使用特定底物(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸)时会产生蓝色反应。该蓝色说明所分析的植物已被转化，从而也说明该酶基因的编码序列获得了转录，因此也说明控制该基因的启动子获得了诱导。b)pBR97
该质粒由参加测试启动子效率课题的其中一个实验室构建(P.RATET，ISV，参见SZABADOS等，1995)。该质粒特别的优点是具有一个多克隆位点，从而可实现与含有LSI内含子的gus基因(大肠杆菌uid A)编码框的转录融合。该质粒还具有以前质粒p35S gus内含子的一些特征(用于整合入植物基因组的边界，赋予新霉素类抗生素抗性的筛选基因：npt II基因)。
其启动子活性可通过GUS类型的组织化学和酶学实验来观察和测定。4)pPR97的衍生物
制备两个主要的构建体，然后用于模型植物的转化。a)pR97-35S
以EcoRI/BamHI片段的形式切下克隆在质粒pDH51(参见下面第5段)中的35S启动子，将其插入pPR97中报告基因上游的多克隆位点。该质粒既可作为阳性对照显示该构建体如何发挥作用，也可作为参照，因为35S启动子和从PR蛋白克隆分离的启动子处于相同环境。b)pPR97-PMs PR10-1
将1.5kb片段也以EcoRI/BamHI片段的形式插入如上所述的相同多克隆位点。c)pG3-3
通过克隆两个反向串联35S启动子获得该质粒，可作为组化和酶学检测的强阳性对照。这样，这两个启动子的激活子序列可协同作用。然后将gus内含子基因的编码框置于这两个启动子之一的控制之下。5)制备农杆菌菌株
通过在氯化钙介质中热激以不同质粒转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。在含有抗生素(卡那霉素)的培养基上筛选转化细菌，并小量制备检查其是否为重组子，然后通过三亲结合法采用含有可自转移质粒pRK2013(DITTA等，1985)的大肠杆菌HB101将这些细菌中的重组质粒转移至农杆菌菌株。
所用的两个农杆菌菌株是：用于再生转化植物(稳定转化)的除毒根癌农杆菌EHA105，和用于获得毛根反应和复合植物的根毛农杆菌A4TC24，该复合植物的根被转化，否则其表型与原来的表型一致。6)模型植物的遗传转化
用三种模型植物，即Nicotiana benthamiana，Medicago truncatula和百脉根(Lotus corniculatus)，进行两种类型的转化(瞬时转化和稳定转化)。
所给结果主要来自用N.benthamiana进行的实验。7)瞬时转化
首先进行一系列实验以快速验证用gus基因制备的构建体在真核细胞中起作用。
因此，切下N.benthamiana的叶，在琼脂培养基上与不同的EHA105衍生株共培养。然后在转化后48小时进行组织化学实验，随后在孵育过夜(12小时)后进行检验。
对照质粒，p35S gus intron和pPR97-35S，均给出阳性GUS显色反应，尽管第二个质粒只有弱反应。
这种弱反应活性无疑是由于结构问题引起的，因为在转录起始位点和gus基因ATG的附近保留了部分多聚接头。因为该多聚接头含有一个重复序列，从而干扰了基因的转录。
pPR97-PMs PR10-1构建体的gus基因活性与35S gus内含子阳性对照的活性相似。因此，被期望是可诱导的该启动子表现出组成型启动子类似的效果。
对该结果的解释可能是在采样或培养过程中叶片遭受了细菌感染或损伤。由于第一个假说不能被验证，所以修改了实验方法以减少对外植体造成的压力(采用10-30g/l的蔗糖浓度以增加共培养基的渗透压，使用较高的真空范围：10-80mm水银的相对真空，并通过对表皮的强度或中度挤压以产生相对较重的损伤)。
结果说明随着压力的增加转化细胞的数量也增加。然而，为了实现稳定转化，应寻找一个折中，因为用这种方法获得的大量瞬时转化结果常常证明是对细胞致死的。后者并不能产生愈伤组织并由此再生芽和植物。无论如何，该启动子的可诱导特性已被部分证实，因为35S-gus内含子结构引起的显色可在共培养后长达5天的时间内检测到，而用Ppr97-PMsPR10-1-gus内含子获得的显色更快，在第48小时出现，但之后很快减弱了。8)稳定转化a)烟草：N.benthamiana
用Ppr97-35S、pPR97-PMs PR10-1和pG3-3进行一系列转化。由这一系列转化获得足够数量的小植株。期望是对于所采用的每一个质粒，获得至少7株驯化植物。但对p35S-gus intron这是不可能的，因为它仅有5株植物再生和驯化。所获结果编辑于表1。表1：以根癌农杆菌菌株EH 105及其衍生物转化N.benthamiana所获得的稳定转化。
表1说明：结果以所获量表示。Accl.：驯化苗每个外植体的芽数：对于第一个系列括弧内的数为一个月所获的芽数。对于该系列(包含35S gus内含子构建体)，为获得最大数目的芽数以及因此产生的可驯化植物数，愈伤组织在培养基上培养了更长时间。对于第二个系列，一个月后已获得足够数量的芽，故之后停止了实验。遗传转化：这些实验均按标准方法在1cm2的叶片上进行，这些叶片在农杆菌悬液中浸泡30秒，之后共培养48小时，再继代培养于细胞分裂和生茎(caulogenesis)用的琼脂培养基上(MURASHIGE等，1962)，该培养基含有0.1mg/l NAA(萘乙酸)、1mg/l BAP(苄氨基嘌呤)，400mg/l氨噻肟头孢菌素(清除农杆菌)和70mg/l卡那霉素(用于筛选转化细胞的试剂)。一旦出现第一个芽(大约共培养后一个月)，将培养物移植于生根培养基，该培养基除了不含植物激素外，与上述培养基相同。
| 构建体 | 培养的愈伤组织/外植体 | 获得的芽 | 小植株 | |
| 体内 | Accl. | |||
| p35-gus intron | 10(45) | 6(1) | 5 | 5 |
| pPR97-35S gus intron | 115/122 | 23 | 13 | 12 |
| pPR97-PMs PR10-1 gus intron | 135/139 | 27 | 20 | 7 |
| 反向串联的pG3-3-35S(强启动子) | 未测定 | 37 | 28 | 20 |
根据gus内含子基因的表达(其取决于位于该基因上游的启动子的性质)对结果进行的快速分析，显示在所有测试启动子中PMs PR10-1启动子的结果最好。更为详细的分析见下。9)PMs PR10-1启动子的特性质粒pPR97-PMs PR10-1-gus intron
该启动子给出的结果最好，而且不同的测试器官有不同的gus基因组成型表达。a)在愈伤组织中的活性
发现强组成型表达。孵育几分钟足以产生阳性组织化学测试结果。因此，在这种类型的材料中该启动子被强烈诱导，与VAN LOON(1985)所获结果一致。体外培养的愈伤组织处于应激状态中而在这些情况下PR蛋白获得表达。b)在驯化的全株植物中的活性根
在孵育2小时后(在使用35S启动子时需5小时)该启动子被诱导，组织化学测试表现为阳性。在烟草根中gus基因活性并不一致；仅在陈年部位的表皮和顶端分生组织出现该测试特征性的蓝色。根据文献，在常规情况下也可在根中观察到防卫基因活性。花
在该构建体转化的所有烟草植物的花中，尤其是花药和花粉中均发现强组成型表达。萼片的毛状体(trichome)中也可检测到gus基因活性，而花瓣中的gus基因活性则更弱。这些结果也与VAN LOON的结果相一致(1985)，说明在花的各部分中防卫基因可被诱导。叶
在成熟植物新叶的毛状体中观察到弱组成型gus基因活性。对于烟草，有大叶的丛生期是幼年期，种子形成期是老年期。这种弱活性主要出现在多细胞的毛状体中。就我们所知，PR蛋白在该组织中的表达还从未被描述过。
因此，尽管在烟草(7株植物中3株)叶的毛状体中分离的PMs PR10-1启动子可能具有组成型诱导活性，但该活性看来受发育阶段的影响。
因此，在无病原体诱导的情况下，烟草中该启动子的活性局限于根、花的一些部分(花药和花粉)和气生部分的一些细胞(基本上是毛状体)。实施例3转化的其它植物物种1)Medicago trunculata
对于该物种，我们尝试形成复合植物，即该植物同时具有(非遗传转化的)野生型气生部分和转化的根。
采用新萌芽的植物。主根发育后，切下胚轴，将其浸泡在携带质粒p35S-gus intron或质粒pPR97-PMs PR10-1-gus intron的根癌农杆菌EHA105悬液中，以便之后获得新形成的转化根。一周后，获得根并进行组织化学GUS实验。该实验的对照是采用前批材料同样的方法(切下胚轴，但不将其浸泡在农杆菌悬液中)处理的新萌芽植物。
所有对照组的外植体在一周内形成新根，相反，农杆菌处理组仅有50％外植体起反应。无论何种处理，所有根对GUS实验均没有阳性反应。另一方面，即使坏死，处理组下胚轴的底部也常常发生反应，显现蓝色(存在转化细胞)。然后，切下外植体的坏死部分，使它们再生根。之后50％发育新生根，其中一些在少数区域对该实验呈阳性。
由此得到嵌合根(兼有转化细胞和未转化细胞的根)，其转化部分相应于在基本干细胞中整合了所述构建体的细胞系。
两个测试构建体，即p35S-gus intron和pPR97-PMs PR10-1 gusintron，分别在每批用于实验的6个外植体的3个和2个中产生了这些转化根细胞系。
尽管该实验模型并不适合该研究课题(研究与根瘤菌引起的生瘤现象有关的PR蛋白表达)，但其说明了PMs PR10-1启动子在该植物中与在原先的植物(紫苜蓿)中一样是起作用的。2)百脉根
同样在该例中，实验的目的是研究与共生菌苜蓿中华根瘤菌Rhizobium meliloti NZP 2037(PETIT等，1987)引起的生瘤有关的所述启动子的诱导。因此，为了获得毛根现象(毛根表型)，采用毛根农杆菌株A4TC24转化Lotier新萌芽植物的下胚轴细胞以制备复合植物。一旦出现该现象，切下主根并将小植株移至液体培养基以扩大发展该现象。植物驯化后，将这些苗置于生瘤条件(BLONDON，1964)下以研究与固氮共生现象相关的启动子的诱导。用于该研究的这两个启动子与用于M.trunculata实验的启动子一样：35S和PMs PR10-1。采用这两个结构，在具有毛根现象的根中少于10％的出现GUS实验阳性。一般来说，具有该表型的根比对照根产生较少的根瘤。
就含有35S启动子的构建体所获得的结果而言，仅有根瘤出现了GUS实验阳性反应；而对于另一个构建体(PMs PR10-1启动子)，除了次生根的起始点，根的所有部分均出现颜色反应。除此之外，这后一种构建体不能使毛根来源的根与苜蓿中华根瘤菌相互作用获得根瘤。实施例4用含有苜蓿PR基因启动子和gus内含子基因的结构转化烟草以研究超敏反应A)转化了连接有苜蓿PR基因启动子和gus内含子基因的构建体的N.benthamiana的超敏反应1)超敏反应(HR)实验
本研究采用由N.benthamiana/丁香假单胞菌豌豆致病变种相互作用产生的超敏反应。驯化在其基因组中整合了质粒p35S gus intron和pPR97-PMs PR10-1-gus intron的不同插入片段的转化烟草，然后用丁香假单胞菌(ESNAULT等，1993)悬液以每毫升109个细菌的浓度浸润该烟草。用皮下注射器将该溶液注射至叶片中。采用这种模型，HR反应被认为在48小时后会很好地产生。在接种后第24、48和96小时采取细菌悬液浸润的叶，以便用GUS组化实验评价所研究的不同启动子的诱导。对浸润叶下方的叶也进行同样的组织化学实验以评价任何可能的系统反应。2)HR反应条件下启动子诱导的研究a)35S组成型启动子
对于35S组成型启动子(例如，质粒pG3-3)，丁香假单胞菌的接种并不改变对所述实验的反应，即在孵育几分钟后出现明显的该反应。因此，细菌的浸润并不改变用35S启动子获得的组成型葡糖醛酸酶活性。b)PR蛋白基因启动子：Ms PR10-1启动子
正如表2所示，该启动子易于被病原体的侵袭所诱导。在第24小时HR反应还未完全产生时(第48小时完全出现)，GUS实验已是阳性。对于获得的转化烟草植物苗，颜色反应弱且主要出现在浸润叶的叶片中。
关于系统反应，即感染叶下部的叶的反应，显色仅在叶片中存在。成熟(已发育出茎但仍未开花)和幼年(丛生)烟草植物具有相同的反应，即组织化学实验测定的弱gus基因活性。
对于有花或种子的更老的烟草植物，该实验获得的显色更强，尤其是在感染叶的叶脉和毛状体中，而对于系统反应显色仅存在于这些组织。
因此，这些观察说明报告基因的不同表达取决于植物的年龄。这种依赖于植物发育阶段的反应在大多数对植物PR蛋白进行的研究中均有发现。由于接种细菌后96小时报告基因的表达不再明显，故PMs PR10-1的诱导是一个短暂的现象。
该诱导也不局限于植物/细菌相互作用产生的HR反应。采用PMsPR10-1-gus intron结构在真菌感染一个外植体时获得了同样类型的反应。之后除了污染的坏死区外整个感染叶均有明显的gus基因的类似表达。表2：与N.benthamiana和丁香假单胞菌间的HR反应相关的所研究的不同启动子的诱导
表2说明：
| 构建体 | 接种24小时后 | 接种96小时后 | |
| 浸润叶 | 下面的叶 | 浸润叶的HR反应 | |
| PMs PR10-1 | 6/7 | 6/7 | 0/3 |
| pG3-3(35S) | 3/3 | 3/3 | 2/2 |
结果表示为GUS组织化学实验阳性反应的植物数与所分析的植物数之比。B)不同启动子控制的gus内含子基因的定量表达
该方法以酶学实验为基础。
该方法采用：a)转化烟草植物中获得的gus基因编码酶的粗提物，和b)底物，即对硝基苯基-葡糖苷酸。底物的水解速度用分光光度计检测，并与抽提物中的蛋白总量相关。另一方面，由于该方法并不十分敏感，故需要在gus基因上游存在一个强启动子。
因此，不能用于与组织化学实验用底物(X gluc：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸)孵育12或更多小时的方法。
在这样的实验条件下，位于质粒pG3-3中的35S启动子产生的底物水解速度(以任意单位表示)比采用位于质粒pPR97中的PMs PR10-1启动子所获得的速度高5倍。另一方面，PMs PR10-1启动子比位于质粒p35S-gus intron中的35S启动子产生更强的gus基因表达。实际上，在后一种情况中未检测到底物的水解。
同样，采用其它构建体也不可能获得分光光度法可检测的值。实施例5相应于二苯乙烯合成酶基因的DNA的分离和二苯乙烯合成酶的表达
采用两个方法获取葡萄树二苯乙烯合成酶编码基因。一方面，从文献数据(WIESE等，1994)可获得基因序列。另一方面，BAYER AG(AgrochemicalDivision Research/Biotechnology-Pflanzenschutzzentrum，MONHEIM，D-51368 LEVERKUSSEN)提供了大约13kb的基因组插入片段。应详细说明的是，BAYER公司在德国Deutsche Sammiung von Mikroorganismen(DSM)保藏了含有携带葡萄树二苯乙烯合成酶基因(参见EP-464 461)的质粒的大肠杆菌菌株：大肠杆菌Fier 1 pVst 1(DSM 6000，1990年6月18保藏)、大肠杆菌Fier 2 pVst 2(DSM 6003，1990年6月18保藏)和大肠杆菌Fier pVst1 2至3(DSM 6346，1991年2月11保藏)。BAYER还保藏了含有质粒pGS 828.1的大肠杆菌Nurdug 2010(DSM 4243，1997年9月17保藏)，该质粒携带花生二苯乙烯合成酶基因(参见EP-309862)。用于进行以下工作的插入片段实际上是一个复杂的基因组克隆，其含有2个完整的功能性二苯乙烯合成酶基因(vst1和vst2基因)序列和一个不完整的vst3序列。随后，选择vst1基因序列，将其整合入制备的构建体中。该序列是一个4.9kb的基因组片段(包括启动子的功能性序列)，但其没有任何限制性位点可将其直接克隆至通常用作转化载体的质粒中。因此，通过中间克隆至质粒pCDNA II给其添加额外的位点。A)通过中间克隆至质粒pCDNA II添加增补位点
以EcoRI/PstI片段(2.1kb)从vst1基因已克隆的原始质粒中分离vst1基因的上述基因组片段，再克隆至质粒pUC19。克隆之后，将vst1片段插入质粒pCDNA II的相同位点(EcoRI/PstI)，以便改变限制性位点，缺失该基因的终止子，并分离BamHI/BamHI(1.8kb)插入片段。就是相应于该基因开放阅读框的这个片段，用于构建具有不同启动子(包括那些分离自苜蓿基因组文库的启动子)的构建体(参见图4)。采用Southern杂交证实合适的限制性酶消化获得的不同片段的大小，然后将该插入片段克隆至pBIN 19。B)vst1基因表达的研究
为验证葡萄树植物中二苯乙烯合成酶编码基因的表达，从在大肠杆菌HB101中扩增的质粒pCDNA II制备含有vst1基因的探针(1.8kb)。在用从对照或转化葡萄树植物抽提的核酸进行的Southern和Northern杂交中，为便于用化学发光检测二苯乙烯合成酶编码基因或转录物，采用Polar Plex试剂盒(Plex化学发光试剂盒，Millipore)用随机引物法在该探针上标记生物素。1)采用vst1探针分析抽提自葡萄树41B(V.vinifera Chasselas×V.berlandieri杂种；stock-vine)的基因组DNA
用EcoRI消化抽提的基因组DNA，之后进行Southern杂交分析。采用vst1探针获得了大量的条带(约15条)。实际上这些条带相应于含有二苯乙烯合成酶编码序列的片段，这些片段构成了一个多基因家族(根据WIESE等1994有6至8个基因)。其中，vst1，vst2和vst3之间表现出高度同源性。此外，其它基因可被该探针识别，尤其是查耳酮合成酶多基因家族的相应基因。这是因为这两种酶具有相同的结构和大小(41-44kb大小的亚基的二聚体)。它们还使用同样的底物，而且至少在活性位点它们的氨基酸序列表现出高度同源性。
提取两个质粒的DNA以证实这种交叉杂交是否可能。其中一个质粒pCDNA II含有vst1基因，而另一个质粒pPCV 002含有Rosier查耳酮合成酶基因，这两个质粒均可在实验室获得。同时制备相应于Rosier查耳酮合成酶基因的生物素标记探针。进行交叉杂交获得的Southern印迹表明事实上vst1探针识别了Rosier查耳酮合成酶片段，同样反之亦然。但交叉杂交所发出的信号较弱。2)葡萄树植物叶中白藜芦醇的分析
在含有液氮的研钵中将新鲜植物材料叶或茎制成粉末，用甲醇(1ml/100mg新鲜材料：f.m.)提取该非极性化合物。
离心除去碎片之后，将甲醇提取物通过0.45μm滤膜过滤，然后在氮气中蒸发至干。用纯甲醇(100μl/100mg f.m.)溶解残余物。然后，为了除去色素(特别是叶绿素)，将样品通过一个用甲醇预平衡的C18柱(Sep-pach WATERS)。提取物的定性和定量分析在与二极管阵列检测器(990.WATERS型)连接的WATERS HPLC(600 E型)上用HPLC(高压液相色谱)进行。色谱填料是反相C18柱(C18 ultra base，205×4.6mm，5μm；Shandon)。提取化合物的分析是在无梯度条件下进行的，移动相由35/65(V/V)的乙腈/水混合物组成，流速为1ml/min。
在200-400nm之间每2秒检测一次吸收光谱，白藜芦醇在其最大吸收305nm处被检测。
白藜芦醇的定量用外标法采用标准曲线进行，标准曲线通过测定5、10、20、50、100μg/ml商业白藜芦醇(Sigma)的色谱来获得。白藜芦醇的浓度由该分子相应峰下的面积测定，该浓度与f.m或d.m.(干物质)的单位重量或分析样品的叶绿素量相关。实施例6葡萄树二苯乙烯合成酶与不同启动子连接的核酸构建体1)采用组成型启动子的构建体
使用两个相关启动子构建允许组成型表达的遗传构建体。
在第一个构建体中，葡萄树二苯乙烯合成酶(vst1)的DNA置于一个调节序列的控制之下，该调节序列包含一个含有两个(以相同方向)串联排列的CaMV 35S启动子的盒子。在vst1基因编码序列末端还添加了一个35S聚腺苷酸化序列。因此，用这种方式构建的该嵌合构建体可总结于下：(CaMV)p35S-(CaMV)p35S-vst1-(CaMV)35S polyA
在第二个构建体中，vst1基因编码序列置于4个增强子序列的控制之下，增强子序列分离自CaMV 35S启动子，并在CaMV 35S启动子和该葡萄树基因(vst1)天然增强子序列的上游串联排列。以该方式产生的这两个嵌合序列首先插入质粒PMP 90RK，然后将该质粒转入农杆菌菌株GV3101。
这两个调节序列被认为是“强”的组成型启动子。2)采用13kb插入片段(在其天然启动子控制下的vst1基因)的同源构建体
大小约13kb的葡萄树基因组DNA片段阐述如下。具体地，它包括两个功能性葡萄树二苯乙烯合成酶编码基因(vst1和vst2)和一个不完整(无功能)基因(vst3)。将该葡萄树序列共整合至质粒pGV3850中，然后将后者导入农杆菌菌株。因此，该序列相应于处于其天然启动子控制之下的vst(葡萄树二苯乙烯合成酶)基因开放阅读框。
获得若干转化了含有13kb片段的质粒的41B植物系列后，采用3个不同探针(nptII基因的1.8kb探针；氨苄青霉素抗性基因的2.4kb探针和质粒pBIN 19左边界含有TDNA最后整合序列的1kb探针)用Southern杂交对其研究和分析。所用植物的大部分可与这些探针之一杂交。这些克隆进行如下编号：所述构建体55，所获不同转化体分别为2、3、5、6、7和9。3)采用可诱导性PMs PR-10-1启动子的构建体
构建含有分离自苜蓿基因组PR克隆的PMs PR-10-1启动子的构建体(参见图5)。质粒pBin 19-PMs PR-10-1-vst1-35S终止子基因的构建
因为分离自苜蓿的PMs PR-10-1启动子和vst1基因均含有翻译起始密码子ATG，所以构建一个接头以将vst1基因克隆至该构建体而无需额外ATG。该接头以两个11bp的寡核苷酸的形式合成，一个含Bam HI，另一个含Mun I。然后将该接头插入已克隆至质粒pUC19的vst1基因的MunI位点。随后用Bam HI消化回收该插入片段，克隆至pBIN 19的PMs PR-10-1启动子和35S终止子之间。因此，vst1基因插入片段和接头一起，位于PMs PR-10-1启动子和35S终止子之间。在这种状况下，vst1基因的ATG已除去，在该基因vst1编码框上游包含了3个额外密码子。通过测序检查该基因的开放阅读框仍然和该构建体的其余部分相符合。
用特别含有嵌合序列：PMs PR-10-1-启动子-vst1基因35S终止子的插入片段转化41B植物后，采用已描述过的nptII探针进行Southern杂交分析转化体。然而，用该方法特别是该探针不可能完全阐明完整整合，因为在农杆菌系统中，一般认为植物基因组中的插入开始于左边界并终止于右边界。因为在所用结构中nptII基因靠近右边界，因此有可能整合是部分的，nptII基因已经插入但在到达左边界之前随后整合中断。转化体编码为145，并给这些转化体分配数码2、5和6，结果给出如下。实施例7葡萄树的遗传转化和所研究启动子的效率的分析
如上所述(实施例6)，制备了4个主要构建体用于转化41B stock-vine(葡萄(V.vinifera)×V.berlandieri)实验室模型系统。使用该系统的原因是它具有在用农杆菌转化胚发生细胞悬浮物时可获得理想结果的优点。实验中采用0.1-1μl P.C.V.(细胞密实体积)胚发生细胞平均获得约50个转化体。而且，筛选、转化胚的发育和再生植株均很迅速。体外培养两个月可获得具有6-8片发育良好的叶的小植株。A)用含有处于组成型启动子控制之下的vst1基因的载体遗传转化41B
测定两个构建体，一个在vst1基因上游含有串联排列的35S双启动子，另一个含有由4个位于CaMV 35S启动子上游的串联排列的CaMV 35S增强子序列组成的调节序列，该调节序列作为一个整体位于含有其天然增强子序列的vst1基因的上游。为了转化葡萄树胚发生细胞，进行4个系列试验(每一个构建体两个)。植物甚至胚均不能再生。在所有实验中，与农杆菌共培养48小时后，胚发生细胞悬液迅速坏死。这些构建体不能用于获取组成型表达这些“强”启动子控制下的vst1基因的转化植物。可提出一个假说；有可能由于二苯乙烯植物抗毒素的产生引起潜在的胚发生细胞迅速坏死，该基因的表达阻断了再生胚的过程。
由含有35S类组成型启动子的构建体获得的这些阴性结果说明通过能被诱导特别是被病原体诱导的同源或异源启动子控制vst1基因超表达的重要性。
这些结果与FISHER和HAIN在1994年发表的结果类似，后者强调他们在烟草中使用CaMV 35S启动子以高水平组成型表达花生二苯乙烯合成酶基因时，没有获得成功。根据这些作者，当采用这种构建体时，如果植物遭受病原体的侵袭该基因的表达将被负调节。根据他们的假说，该调节可能是由于植物采取了可被病原体(特别是PR蛋白的合成)正常诱导并可抑制病毒启动子的防卫机制。B)用含有处于可被非生物和/或生物压力诱导的启动子控制之下的vst1基因的载体遗传转化41B1)在以存活状态分离的切下的叶子，和41B葡萄树试管植物全株对照或已转化了13kb插入片段的41B葡萄树试管植物全株中，研究vst基因的表达及其用UV光诱导的动力学
已证明作为二苯乙烯合成酶催化反应产物的白藜芦醇(主要葡萄树植物抗毒素)的合成可被紫外光(UV)，即非生物压力条件诱导(LANGCAKE等，1977；SBAGHI等，1933)。在正常情况下，葡萄树合成很少或不合成白藜芦醇；相反，用UV光诱导(在254nm照射UV光10分钟，UV灯发射600μW.cm-2)之后，置于黑暗中20小时，在切下的叶中合成了该植物抗毒素。a)所用方法叶的照射：-试管植物的叶：UV灯发射600μW.cm-2，在254nm照射13分钟，-分离自试管植物的叶：UV灯发射600μW.cm-2，在254nm照射8分钟，-从植物材料抽提和分析mRNA并在诱导后一个给定时间通过365nm激发后产生的荧光估计白藜芦醇的量。
每一个样品包括3片叶，其分离自同一植物，并分开用UV光诱导，但然后合并抽提和分析。检测的对象是分离自试管植物的切下的叶子或在琼脂培养基上培养的具有6-7片发育良好叶子的试管植物。取每一株小植株的最老的3片叶，用于检测。叶子的上表面暴露于UV光中。分析后，所获白藜芦醇的量以每克分析叶子鲜重或每克干重(以离心和用甲醇抽提后的沉淀估测)的μg产物或以每克叶绿素的白藜芦醇mg数表示。
下表显示41B和55-X克隆获得的值，这些克隆转化了13kb基因组克隆结构，其中均处于其天然启动子控制下的两个基因vst1和vst2存在于该插入片段序列中。b)非生物压力(UV光)对切下的叶子的研究(实验1)
与构建体55(13kb插入片段)和克隆2(55-2)和3(55-3)相应的结果见下面的表3和4(白藜芦醇分析)，并阐述于图6和7(转录本分析)。二苯乙烯合成酶编码基因表达的Uy光诱导动力学研究，在UV光诱导之后的一段时间后进行，分析时间或者固定在诱导后17小时(参见表3和图6)或者在诱导后0、8、17、24、32小时几个不同时间(参见表4和图7和8)。表3：在未诱导的对照和转化叶中或在用UV光诱导后17小时的对照和转化叶中检测到的白藜芦醇的量(以μg/g新鲜材料表示)
表3的说明：从41B试管植物切下叶片，然后用UV光诱导。克隆55-2和55-3对应已整合了含有二苯乙烯合成酶编码基因的13kb插入片段的转化植物。
| 未转化对照 | 克隆55-2 | 克隆55-3 | |||
| 未诱导 | 诱导 | 未诱导 | 诱导 | 未诱导 | 诱导 |
| 0 | 12 | 0 | 11 | 0 | 13 |
在约450nm的蓝色/紫色范围观察到的荧光，在切下的叶片叶脉处非常强，并均匀分布于叶子的整个表面。没有用UV光诱导的对照叶片没有任何荧光。这些结果说明二苯乙烯合成酶编码基因的特异表达。用vst1探针进行的Northern杂交对转录本的分析说明，存在一个大小约1.8kb的片段，其发出的信号在用UV光诱导的叶片中非常强，而在未诱导植物中没有或非常弱(参见图6)。表4：在41B试管植物叶中白藜芦醇浓度的发展动力学：用UV光诱导，再从培养于琼脂培养基上的植物取下叶片，然后分离和分析其在诱导后各种不同时间的白藜芦醇含量。
表4的说明：结果以μg/g新鲜材料表示。分别转化了PCT 55-2和PCT 55-3的两株植物与对照比较分析。NI：未用UV光诱导。
| 诱导后的时间(h) | 白藜芦醇的量(μg/g新鲜材料) | ||
| 对照 | PCT 55-2 | PCT 55-3 | |
| NI08172432 | 00.630.856.883.215.5 | 0012.171.781.47.7 | 0094735.2151.8 |
在这些条件下，用UV光刺激后，在对照中发现的白藜芦醇的量是在诱导后第24小时最大(41B约80μg/g新鲜材料)，然而，根据在试管植物传代培养周期(微繁周期)中的分析时间不同有显著不同的变化。
用vst1探针进行Northern杂交分析后获得的结果显示于图7。检测到至少两种类型大小非常相似的转录本(约1.8kb)。尽管不能排除与查耳酮合成酶转录本交叉杂交的可能，但被识别的不同信使RNA可能对应不同二苯乙烯合成酶基因的表达。因此，在葡萄树中已显示(WIESE等，1994；KINDL，个人交流)在诱导编码二苯乙烯合成酶的多基因家族不同基因的动力学中存在差别。
Northern杂交分析显示，在从葡萄树41B切下然后暴露于UV光照射的非生物压力的叶子中，二苯乙烯合成酶转录本在诱导后的第17-32小时显示最大表达。这些结果与用葡萄树细胞培养物获得的结果类似，后者也显示相同的表达模式，但存在两个最大值(WIESE等，1994)。c)在分离的存活叶片中研究非生物压力(UV光)(实验2)：在叶片分离之前对试管植物诱导
下面的表5给出了用已整合了13kb插入片段的第二系列转化体获得的结果。用UV光诱导二苯乙烯合成酶编码基因表达的动力学研究在UV光诱导之后第20、40、或60小时的不同时间后进行。表5：在紫外光诱导和不同存活时间抽提后葡萄树试管植物分离的叶子中白藜芦醇的浓度
表5的说明：白藜芦醇的浓度以μg/g干物质表示。41B stock-vine杂种：V.vinifera Chasselas×V.Berlandierri。
| UV光诱导(254nm，8分钟)后白藜芦醇提取前从试管植物分离的叶片的存活时间 | |||
| 所研究的克隆 | 20小时 | 40小时 | 60小时 |
| 未诱导的41B-对照 | 0 | 0 | 0 |
| 诱导的41B-对照 | 281 | 165 | 6 |
| 诱导的克隆55-2 | 135 | 918 | 58 |
| 诱导的克隆55-3 | 44 | 931 | 301 |
| 诱导的克隆55-5 | 392 | 83 | 657 |
| 诱导的克隆55-6 | 339 | 235 | 43 |
| 诱导的克隆55-7 | 263 | 411 | 148 |
| 诱导的克隆55-9 | 386 | 823 | 54 |
表5给出的结果可区分两组植物：-第一组对应对照和两个转化体55-6和55-7。总的来说，它们显示的最大白藜芦醇浓度在280和410μg/g干物质之间，最大值一般是在诱导后20小时，克隆55-7除外，它是在40小时。-第二组显示的最大值更高，几乎是第一组的两倍(820-930μg/g干物质)。这一组只包括转化体(55-2、55-3和55-9)。最大值在用UV光诱导后的40小时；另一方面，在诱导后的20小时，这些植物中的浓度常常比第一组低得多。例如，克隆55-2和55-3就是这样(分别为135和44μg/g干物质)。但是，值得注意得是其中一个克隆即55-9，其表现出的白藜芦醇浓度在所有时候均高于对照(诱导后20、40和60小时分别为386、823和54μg/g干物质)。
在此存活叶系统中，未诱导对照不出现白藜芦醇，而且几乎所有情况(除了克隆55-5有不同表现)中，白藜芦醇浓度在诱导后60小时均大幅度降低。d)对培养在琼脂培养基上的试管植物受到的非生物压力(UV光)的研究
对生长于琼脂培养基上的植物进行的该研究使得可在其它植物防卫机制表达时分析白藜芦醇的产生，这些防卫机制至少包括可在体外培养条件下表达的机制。而且，该研究使得可以在一个更长的时期监测白藜芦醇的合成(在前面的研究中，超过72小时分离的叶会坏死)。
用UV光在与前相同的条件下(254nm照射8分钟)处理培养中的4个转化41B试管植物克隆(55-2、3、5和6)，仅在诱导后20小时采取植物的叶。所获结果与未转化对照、Vitis rupestris的一个克隆和本领域已知其浆果对葡萄孢属的侵袭有相对高易感性的Vitis vinifera品种3个克隆进行比较。
实际上文献(SBAGHI等，1993)说明，浆果对葡萄孢属的易感性(葡萄园中进行的评价)和UV光诱导的试管植物叶中的白藜芦醇含量之间存在相关性。结果见下面的表6。表6：在以254nm UV光诱导几种不同葡萄树品种8分钟后第20小时进行的白藜芦醇HPLC分析结果。
表6说明：
| 测试品种 | (白藜芦醇)ug/g干重 |
| Rupestris 215Stock-vine 41BUgni-blanc 479Pinot noir 386Folle blanche 280Pct 55-2Pct 55-3Pct 55-5Pct 55-6 | 3512372098637361235115539 |
对培养在琼脂培养基上的试管植物进行UV光诱导。处理后20小时采取叶并抽提用于分析。
PCT 55-2，3，5和6是其基因组中整合了13kb插入片段的转化体。结果显示了3次重复的平均值。
这些结果很好地说明了在这些品种和葡萄树植物中对葡萄孢属的敏感性与诱导后20小时叶中的白藜芦醇含量之间存在相关性。在未转化品种和葡萄树植物中可区分出两组。第一组包括V.ruspestris，V.vinifera×V.berlandieri(41B)和Ugni-blanc，相应于对真菌相对耐受的植物。第二组包括Pinot noir和Folle blanche，代表被认为是中度耐受和非常易感的植物(例如Folle blanche)。
就转化体而言，其白藜芦醇含量在诱导后20小时平均高于或等于非转化41B对照(对于克隆55-6，55-2和55-3分别为539，362和236μg/g干物质，对照为237μg/g干物质)。
相反，转化克隆55-5中所获得的浓度是对照的一半。如果将以μg/g干物质表示的这些值与分离的叶的值(表5)进行比较，可以看出就对照而言这些值是相似的，而另一方面对于在诱导后20小时分析的转化体而言却存在差异。有时这些差异非常显著(对于克隆55-2，诱导的分离叶的值是135而诱导的试管植物的值是362；对于克隆55-3分别是44和236；对于克隆55-5分别是392和116；对于克隆55-6分别是339和540)。此外，不同重复间也存在很大的差异。2)在转化了13kb插入片段和转化了含有PMs PR10-1控制的vst1基因的构建体的41B葡萄树试管植物中比较研究vst基因的表达和生物压力诱导的该基因表达的动力学。
在通过遗传转化整合了额外拷贝的二苯乙烯合成酶基因(以含有两个功能性vst1和vst2序列的13kb插入片段形式)的试管植物中获得的上述结果(第一章)说明，在某些转化体中当这些基因处于其自身的启动子控制下时响应非生物压力例如UV照射，由二苯乙烯合成酶催化反应产生的白藜芦醇是有可能超量生产的。
然后就这些结果在两类转化体中验证白藜芦醇的产生，第一类转化体的代表是整合了13kb插入片段(处于其自身的启动子控制下的vst1和vst2二苯乙烯合成酶基因)的41B克隆，第二类的代表是仅整合了处于苜蓿防卫基因调控序列PMs-PR10-1控制下的vst1基因的几个克隆。在灰葡萄孢引起的生物压力诱导后进行该比较。a)所用方法α)白藜芦醇分子对灰葡萄孢的真菌毒性作用的确证
关于该分子的真菌毒性性质文献数据并不一致。根据DAI(1994)，白藜芦醇确实表现出对葡萄生单轴霉(霉病因素)的游动孢子的发育有抑制作用；相反，PONT和PEZET(1990)认为其并不能阻断灰葡萄孢分生孢子的出芽。
在含有10-1M至3.7.10-3M稀释范围的白藜芦醇的麦芽/琼脂培养基上培养灰葡萄孢，菌丝在环境温度下孵育7天，以研究该分子对菌丝体菌丝生长的影响。结果说明该分子有抑制作用(IC50＝500μmol.l-1)，对于大于125μmol.l-1的浓度，真菌的平均生长直径呈指数降低。另一方面，37μmol.l-1的浓度对菌丝的生长仅有非常小的抑制活性(参见图9)。然而，在这些条件下培养7天后这种抑制逐渐增加，本来这些条件非常适合真菌的生长。20天后，真菌最终感染了整个培养物表面。B)耐受灰葡萄孢的葡萄树试管植物的筛选实验
该实验的方法是：通过其上表面沉积20μl培养于麦牙/葡萄糖培养基中的含有1×10-4分生孢子/ml(每滴200个分生孢子)的分生孢子悬液，接种体外培养于微繁培养基上的幼苗的叶子。然后，将4个不同叶片已被接种的幼苗培养于气候箱中(光周期：白天16小时，夜晚8小时；温度：24℃；湿度：70％)。接种两天后，检查第4排的叶子即最小的叶子(用一台与电视监视器连接的照相机计数存在的坏死和侵染)，并用甲醇提取以分析葡萄孢属侵袭引起合成的白藜芦醇。在第5天，采取2号叶用荧光显微镜观察。对3号叶也进行宏观观察(叶上的坏死和侵染)并计数显示真菌孢子果(分生孢子)的叶子。最后，在第9天，用甲醇提取与真菌相互作用的并取自3个不同植物的叶子，以分析白藜芦醇。γ)通过在试管植物叶子上沉积含有灰葡萄孢孢子的悬液诱导生物压力-检测对葡萄孢属的耐受性
这种直接对抗实验采用已描述过的技术进行(参见上文)。采用相同的观察方法。每一品种或转化克隆使用4个试管植物，对于每一个这些试管植物，给在第2、3和4排长出的3个叶子上接种分生孢子悬液(20μl麦牙/葡萄糖培养基的200个分生孢子)。因此，每一品种或克隆进行了12次接种，并进行下列分析和观察：→接种两天后：
-检查第4排叶子的叶症状(真菌侵染区或坏死斑点，包括位于真菌孢子周围小的带黑色的褐色区，或没有可见的症状)，和
-在相同叶子中分析白藜芦醇。→接种五天后：
-检查第3排叶子的叶症状，计数带有分生孢子(真菌孢子果)的叶子，和
-用荧光显微镜检查第2排叶子，以定位白藜芦醇合成区。→接种九天后：
-在来自3株不同植物并与寄生物相互作用的3片叶子中分析白藜芦醇。
对每一实验系列，研究其叶子对葡萄孢属侵袭具有不同易感性的3个Vitis vinifera品种：Folle blanche(易感)，Pinot noir(中等耐受)和Ugni blanc(耐受)，以及stock-vine 41B(耐受)及其4个转化体：一个具有插入的二苯乙烯合成酶编码基因的额外拷贝，即克隆55-3，和其它3个代表含有PMs PR10-1启动子-vst1基因结构的转化体，即克隆145-2、145-5和145-6。b)所获结果
接种后第2或第5天观察到的叶症状的结果显示于表7和8，白藜芦醇分析结果(相对于干重或叶绿素含量)在表9和10中给出。表7：第2天试管植物叶/灰葡萄孢相互作用的宏观观察
表7的说明：
| 实验品种 | 在4株不同植物中观察到的显示下列症状的4号叶的数目 | ||
| 侵染区 | 坏死斑点 | 无可见症状 | |
| Folle Blanche 280Pinot noir 386Ugni-blanc 47941BPct 55-3Pct 145-2Pct 145-5Pct 145-6 | 43102001 | 14243311 | 00100132 |
-侵染区：葡萄孢属迅速破坏植物细胞的宽而扩散的区域。这些区域呈亮浅褐色。
-坏死斑点：以真菌为中心的非常小的区域。这些斑点呈黑褐色。表8：第5天试管植物叶/灰葡萄孢相互作用的宏观观察
表8的说明：
| 实验品种 | 在4株不同植物中观察到的显示下列症状的3号叶的数目 | ||
| 侵染区 | 坏死斑点 | 无可见症状 | |
| Folle Blanche 280Pinot noir 386Ugni-blanc 47941BPct 55-3Pct 145-2Pct 145-5Pct 145-6 | 4321.521.50.53 | 01122242 | 42.50.50.51101 |
-侵染区：葡萄孢属迅速破坏植物细胞的宽而扩散的区域。这些区域呈亮浅褐色。
-坏死斑点：以真菌为中心的非常小的区域。这些斑点呈黑褐色。表9：对与灰葡萄孢相互作用2天后的不同葡萄树品种进行的白藜芦醇的HPLC分析结果
表9的说明：-Folle B 280：Folle Blanche 280；Pinot N 386：Pinot noir 386；Ugni B 479：Ugni-blanc 479；Stock-g41 B：Stock-vine 41B表10：对与灰葡萄孢相互作用9天后的不同葡萄树品种进行的白藜芦醇的HPLC分析结果
→接种两天后：
| 实验品种 | 白藜芦醇mg/g叶绿素 | 白藜芦醇μg/g干重 |
| Folle B 280Pinot N 386Ugni B 479Stock-g41 BPct 55-3Pct 145-2Pct 145-5Pct 145-6 | 5.14.33.95.74.66.92.24.3 | 1011028611211817083107 |
| 实验品种 | 白藜芦醇mg/g叶绿素 | 白藜芦醇μg/g干重 |
| Folle Blanche 280Ugni-blanc 479Stock-vine 41BPct 145-5 | 4.031.711.9602.1 | 38145592558 |
观察最小叶(第4排)。除41B和克隆145-2和145-5外，几乎所有情况均观察到侵染区(真菌形成集群)。易感型葡萄树品种比耐受品种在更大程度上显示这些区域：Folle blanche和Pinot noir分别显示4和3个侵染区，而在Ugni blanc品种仅有1个侵染区。只有145转化体(PMsPR10-1启动子-vst1基因)和Ugni blanc叶子没有可见症状。作为植物防卫反应的坏死区，主要出现在41B及其转化体以及葡萄树品种PinotNoir和Ugni blanc中。
如果将这些观察结果与白藜芦醇分析相比较(表9)，不可能建立任何相关性，因为当涉及干重时，这些叶子中白藜芦醇的含量都在100μg/g干物质左右。在所有被检试管植物中，该含量在4和5mg/g叶绿素之间。
只有stock-vine 41B，特别是转化体145-2具有更高的值。克隆145-5的值更低(约一半大小)。
还可与前面用UV光诱导试管植物后20小时获得的白藜芦醇含量(表6)比较。尽管取样时间是不可比的(尽管已考虑了孢子出芽必需的时间，非生物压力为20小时，相比较生物压力为48小时)，生物压力诱导后观察的白藜芦醇含量通常更低(对Ugni blanc，在一半或三分之一)，除了Pinot noir(其含量类似)和Folle blanche(其含量大3倍左右)。
在所有分析的样品中，应强调的是，在进行的不同重复实验获得的数值间存在显著分散性。这种相同植物的不同叶子之间的变异性(前面是用经过UV光诱导的样品观察到的)，可能是由于若干不同因素引起的(在后一种情况下也一样)。可提到的最合理的假说是：
同一克隆的不同试管植物之间在面对真菌侵袭时的反应存在很大的变异性。接种葡萄孢属孢子后获得的叶子症状各异，似乎证实了这一点(感染的变异性、每一株植物的生理状态的变异性等等)。
对整个叶子进行的分析并不代表在形成该叶子的每个细胞中存在的白藜芦醇合成的变化。因此，一般认为，在对寄生物的超敏反应中，并非所有的叶片细胞都合成防卫分子。仅仅靠近真菌侵袭区的细胞才诱导合成植物抗毒素。因此，该实验进行的分析仅代表与寄生物相互作用的叶片中存在的平均白藜芦醇水平对应的值。因此，在诱导合成植物抗毒素的细胞中存在的浓度和分析整个叶片时得到的数值之间，会产生相当大的稀释效应。这种效应在植物防卫反应表达的早期无疑更显著。→接种五天后：
症状观察显示(1号和2号平板照片)(图10、图11和表8)在所有葡萄树品种、stock-vine和所研究的转化体中形成了相对较多的侵染区。这些侵染区常常和分生孢子(真菌孢子果)的存在相关。葡萄树品种和对照stock-vine 41B、Folle blanche(对葡萄孢属最易感的物种)的所有研究的叶子均显示侵袭和分生孢子。如果给症状的严重性建立等级，那么接下来是Pinot noir，然后是Ugni blanc，最后是41B。然而，在后两个品种，分生孢子仅在一个半叶上发生。考虑到转化体，3个克隆55-3、145-2和145-6的反应或多或少相似。只有克隆145-5显示对寄生物良好的耐受性，因为仅在半个叶上发现一个侵染区，并且没有可见的分生孢子。
另一方面，该克隆的大多数叶子通过形成坏死区对侵袭发生反应。2号平板照片显示了一个例子(图11)。
为了确证这些结果是否令人满意地对应白藜芦醇合成诱导的显著差异，因而对应二苯乙烯合成酶编码基因的表达，用荧光显微镜检查接种了葡萄孢属孢子的叶子(滤光器A：激发滤光片340-380nm；终止滤光片425nm)。在这些条件下，叶绿素发红色荧光，而白藜芦醇根据其浓度不同发青白色荧光或更深的蓝色荧光。用这种方法研究了两个葡萄树品种Folle blanche(易感)和Pinot noir(中等耐受)、the stock-vine 41B(耐受)及其一个转化体145-5(PMs PR10-1启动子-vst1基因结构)。从这些观察得到的照片见3号平板照片(图12)。可看出惊人的差异。在Folle blanche中，寄生物菌丝体(照片中的黑色)已经形成并集群于植物组织。基本上没有可见的淡蓝色细胞。在Pinot noir品种，可观察到一个淡蓝色区，该区域在接种区和初期真菌集群的周围和其中形成一个屏障。菌丝体的生长被这种屏障减慢了(如果不是中断的话)，即使组织侵染过程已经开始。在叶脉上还存在更强的蓝色着色。在对照stock-vine41B研究的区域中，分布于整个叶片上的星散细胞呈现出比叶脉更强的亮蓝色荧光。真菌集群过程还没有开始，可见限于少数细胞的分散的坏死区。对于转化了PMs PR10-1启动子-vst1基因结构的41B，克隆145-5的结果是惊人的。真菌的初始组织集群已经开始了(黑色区)，合成白藜芦醇的细胞屏障已在该区域周围非常迅速地形成，从而阻止其扩大。真菌侵染区仍然可见蓝色细胞。而且，许多不与真菌接触的叶片细胞本身合成白藜芦醇。叶脉也呈现强烈的蓝色着色。
这些观察说明，在给试管植物接种葡萄孢属孢子后产生的叶子症状的严重性与叶子中二苯乙烯植物抗毒素的含量之间存在相关性。最耐受的植物是那些在叶片大部分区域显示白藜芦醇合成的植物。含有处于PMsPR10-1启动子控制下的二苯乙烯合成酶编码基因的转化体145-5就是如此，其中启动子分离自苜蓿。→接种九天后：
症状观察说明，在该实验中Folle blanche试管植物对葡萄孢属侵袭同样特别易感。在第九天，它们全部大批感染了真菌，在大多数情况下其叶绿素显著降解。对于Ugni-blanc品种和stock-vine 41B，叶子症状的表现观察不到任何差异。一般而言，第5天得到的症状观察结果此时再次遇到，只有侵染区有一点儿发展。另一方面，显示分生孢子的大多数叶子已经坏死。
分析了4个品种的白藜芦醇含量：Folle blanche(易感)、Ugni-blanc(耐受)、41B(耐受)和145-5(转化了PMs PR10-1启动子-vst1基因结构的41B)。接种9天后，145-5仍然没有显现任何葡萄孢属侵袭的显著症状。白藜芦醇含量分析结果在表10中给出。当以μg白藜芦醇/g干重或mg/g叶绿素表示时，白藜芦醇的浓度可用于以下列方式给品种分级，从最低值到最高值进行：Folle blanche＜4lB＜Ugni-blanc＜转化的41B株145-5。
浓度差异是非常显著的，因为转化体145-5的值比41B对照大几乎43倍(每g干重)，如果以每g叶绿素表示则大50倍。因此，该分析很好地确证了第5天得到的荧光显微镜评价(见3号平板照片，图12)。
关于Ugni-blanc和41B，表10显示，无论用何种单位前者的白藜芦醇比后者多3倍左右。然而，这两个品种在叶子症状上以相同的方式发生反应。这种在耐受性上的相似可用白藜芦醇合成以外的因素解释。还必需注意，在所述实验条件下，植物/葡萄孢属对抗对后者是特别有利的。体外容器中存在的环境条件保证，在培养20天左右之后，所有试管植物无论其性质均被真菌感染。c)葡萄树遗传转化和所研究启动子效率的分析结论
从对转化了含有不同构建体的根癌农杆菌的41B(stock-vine杂种：V.vinifera×V.Berlandieri)胚胎发生细胞的实验，再生具有包含处于35S启动子或其衍生物控制下的vst1基因之构建体的植物是不可能的。因此不可能在整株上获得任何强组成型活性。
相反，获得了含有PMs PR10-1-vst1基因和13kb插入片段构建体(处于其天然启动子的控制之下的vst1和vst2基因)的葡萄树植物。这样就有可能将这些遗传转化植物和对照(未转化的41B)相比较，并通过微繁殖将它们扩大。
与未转化的对照相比，用13kb插入片段制备的不同转化体在UV光压力(生物压力)下获得的白藜芦醇的浓度几乎没有观察到差别，其中该插入片段序列存在均处于其天然启动子控制下的两个基因vst1和vst2。
相反，结果说明，在感染后第9天，在灰葡萄孢引起的生物压力存在下，嵌合的PMs PR10-1-vst1基因构建体可实现植物抗毒素白藜芦醇(二苯乙烯合成酶催化反应的产物)大约50倍的超表达。然后，与对照或用13kb插入片段获得的转化体相比，这些植物显示了最大的耐受性。
因此，在葡萄树植物中转化连接了可诱导性苜蓿启动子PMs PR10-1和二苯乙烯合成酶基因的构建体，可以响应压力如病原体侵袭使二苯乙烯合成酶超表达。
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Claims (29)
1.包含与至少一个二苯乙烯合成酶编码基因序列连接的苜蓿PR蛋白启动子的核酸。
2.根据权利要求1的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白启动子是可在植物中以或不以组织特异方式被生物或非生物压力诱导的启动子。
3.根据权利要求1和2之一的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白启动子的序列选自：
a)IND S1序列，或
b)相当于IND S1序列片段并在植物中具有启动子序列作用的任
何序列。
4.根据权利要求3的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白启动子的序列显示与IND S1序列至少80％同源性。
5.根据权利要求3的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白启动子的序列显示与IND S1序列至少90％同源性。
6.根据权利要求3的核酸，其特征在于苜蓿PR蛋白启动子的序列显示与IND S1序列至少95％同源性。
7.根据权利要求1-6之一的核酸，其特征在于二苯乙烯合成酶编码基因的序列选自从花生、兰花、葡萄树和松树基因组分离的基因。
8.根据权利要求7的核酸，其特征在于二苯乙烯合成酶编码基因的序列是葡萄树二苯乙烯合成酶编码基因的序列。
9.根据权利要求8的核酸，其特征在于葡萄树二苯乙烯合成酶编码基因的序列是选自如下基因的序列：
a)vst1基因，
b)vst2基因。
10.用于在植物中表达二苯乙烯合成酶基因的系统，其特征在于它包含至少一个根据权利要求1-9之一的核酸。
11.根据权利要求10在植物中表达二苯乙烯合成酶基因的系统，其特征在于该系统是一种载体。
12.根据权利要求11的表达载体，其特征在于该载体是质粒。
13.根据权利要求10-12之一的表达系统，其特征在于它可转入农杆菌菌株。
14.根据权利要求10-13之一的表达系统，其特征在于它可在植物中被生物或非生物压力诱导。
15.根据权利要求14的表达系统，其特征在于所述生物压力是寄生物侵袭。
16.根据权利要求15的表达系统，其特征在于所述寄生物是细菌、酵母、真菌或病毒。
17.根据权利要求16的表达系统，其特征在于所述寄生物是灰葡萄孢或葡萄生单轴霉。
18.根据权利要求14的表达系统，其特征在于所述非生物压力是机械损伤。
19.根据权利要求18的表达系统，其特征在于所述机械损伤是昆虫造成的。
20.根据权利要求18的表达系统，其特征在于所述机械损伤是由物理现象如风或霜造成的。
21.转化了根据权利要求10-20之一的系统或载体的植物细胞。
22.根据权利要求21的细胞，其特征在于它是葡萄树细胞。
23.获得根据权利要求20-21之一的细胞的方法，其特征在于植物细胞是采用包括根据权利要求10-20之一的系统或载体的微生物学方法转化的。
24.获得表达二苯乙烯合成酶基因的植物的方法，其特征在于采用根据权利要求10-20之一的系统或载体转化所述植物的细胞，筛选表达所述基因的细胞并从这些细胞再生植物。
25.包含根据权利要求10-20之一的表达系统的植物。
26.包含根据权利要求21和22之一的细胞的植物。
27.通过实施根据权利要求23和24之一的方法获得的植物。
28.根据权利要求25-27之一的植物，其特征在于它是农业上感兴趣的植物。
29.根据权利要求28的植物，其特征在于该植物是葡萄树。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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