ES2344775B2 - Uso de las ciclodextrinas para la produccion y extraccion de fitoesteroles en cultivos celulares. - Google Patents
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Abstract
Uso de las ciclodextrinas para la producción y
extracción de fitoesteroles en cultivos celulares.
Procedimiento para incrementar la producción y/o
extracción de fitoesteroles estableciendo cultivos de células
vegetales y adicionando al medio ciclodextrinas y, opcionalmente,
jasmonato de metilo.
Description
Uso de las ciclodextrinas para la producción y
extracción de fitoesteroles en cultivos celulares.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biotecnología y la farmacia, y se refiere a un
procedimiento para incrementar la producción y extracción de
fitoesteroles a partir de cultivos de células vegetales mediante la
adición al medio de cultivo de ciclodextrinas y, opcionalmente,
jasmonato de metilo.
Los fitoesteroles y los fitoestanoles (formas
reducidas de los fitoesteroles) son compuestos derivados del
escualeno cuya característica común es la presencia de un anillo
esteral, diferenciándose en sus cadenas laterales. Su función
principal es la de actuar como componentes estructurales, ya que son
constituyentes de las membranas celulares vegetales, aunque algunos
fitoesteroles presentan también una acción hormonal
(Azcón-Bieto & Talón., 2000. Ed.
McGraw-Hill).
Los fitoesteroles pertenecen a la familia de los
triterpenos, son esteroles de origen vegetal, cuya estructura
química es muy similar a la del colesterol, que se encuentran
presentes en los frutos, semillas, hojas y tallos de prácticamente
todos los vegetales conocidos (Ling & Jones, 2005. Life
Sci. 57:195-206). Por este motivo, los
incorporamos normalmente en nuestra dieta. Se estima que la ingesta
promedio diaria de fitoesteroles se encuentra en un rango que va
desde los 160 mg/día hasta los 500 mg/día. Los fitoesteroles
químicamente identificados suman más de 25 estructuras diferentes,
pero son sólo tres los que están en mayor proporción: el
\beta-sitosterol (C29), el campesterol (C28) y el
estigmasterol (C29), quienes en su conjunto constituyen el 95%-98%
de los fitoesteroles identificables en extractos vegetales. Los
fitoesteroles comparten con el colesterol el núcleo central de la
molécula, la estructura ciclopentano perhidrofenantreno
(D-5 insaturado, conservando el grupo -OH que
sustituye el carbono 3 de la estructura cíclica). La diferencia
estructural de los fitoesteroles con el colesterol radica en la
cadena hidrocarbonada lateral. En el colesterol esta cadena está
formada por ocho carbonos y es saturada. En los fitoesteroles, la
cadena lateral es más larga (9 o 10 carbonos) y en algunos de ellos
presenta un doble enlace (estigmasterol). Los fitoestanoles están en
menor proporción que los fitoesteroles en el reino vegetal, se
forman por la reducción del doble enlace de la posición
D-5 de la estructura cíclica. Se ha propuesto que la
diferencia estructural en la cadena lateral de los fitoesteroles y
de los fitoestanoles con el colesterol es responsable de los
particulares efectos hipocolesterolémicos.
Numerosas evidencias experimentales han
demostrado que los esteroles vegetales tienen un importante efecto
hipocolesterolémico, reduciendo tanto los niveles de colesterol
total como los de colesterol ligado a proteínas de baja densidad
(LDL) (Varady y cols., 2007. Transl Res 149:
22-30.). El efecto más y mejor estudiado de los
esteroles vegetales es la inhibición de la absorción intestinal de
colesterol, tanto el procedente de la dieta (300 mg/día) como el
colesterol endógeno circulante en la bilis (100 mg/día) que, al ser
parcialmente pero extensamente reabsorbido en el intestino,
constituye la principal forma de captación. Los esteroles vegetales,
al ser más hidrofóbicos que el colesterol, pueden competir con él y
desplazarlo de las micelas de absorción, habiéndose demostrado,
tanto en estudios in vivo como in vitro, que se
produce una disminución de la incorporación del colesterol en las
micelas lo que se traduce en una disminución de la absorción
intestinal de colesterol. A dosis elevadas de esteroles vegetales la
absorción de colesterol disminuye un 30-50% (Ostlund
& Lin, 2006. Curr Atheroscler rep 8:
487-491). Además, los esteroles vegetales podrían
reducir la tasa de esterificación del colesterol en el enterocito
(afectando a la actividad de las enzimas implicadas) y
consecuentemente, de esta forma se reduciría la cantidad de
colesterol exportado a la sangre en forma de quilomicrones. También
se ha sugerido que, en presencia de esteroles vegetales, el
colesterol que ya de por si es poco soluble, puede aumentar la tasa
de precipitación y por tanto desplazarse a una forma no- absorbible
o menos absorbible.
Actualmente, se sabe que los fitoesteroles y
fitoestanoles poseen propiedades inmunomoduladoras que podrían ser
beneficiosas para la prevención del cáncer de colon (McCann y cols.,
2003. J Nutr. 133:1937-1942), cáncer de mama
(Awad y cols., 2000. Anticancer Res.
20(2A):821-824.), control de la hiperplasia
prostética benigna (Awad y cols., 2001. Eur J Cáncer Prev
10(6):507-513) y daño tisular asociado a
inflamación (Lowe & Ku, 1996. Urology 1996;
48:12-20).
Estudios recientes sugieren que una dieta rica
en fitoesteroles puede ser fuertemente protectora contra estos tipos
de cáncer, desencadenando respuestas como, aumento de la respuesta
antitumoral, la inhibición del crecimiento tumoral; también afectan
al ciclo celular y promueven la apoptosis a través de la inducción
del metabolismo de esfingolípidos y la estimulación de la formación
de ceramidas (Awad y cols., 2000. Anticancer Res.
20(2A):821-824). Además, los esteroles
aumentan la respuesta celular de los linfocitos T tanto in
vivo como in vitro (Bouic y cols., 1996. Int J
Immunopharmacol. 18:693-700) y promueven la
expresión o actividad de factores endógenos inhibidores de la
angiogénesis, proceso necesario para el crecimiento de tumores y
desarrollo de la metástasis (Quesada y cols., 2006. Med. Res.
Rev. 26:483-530). Asimismo, los fitoesteroles
también presentan acción antimicrobiana, antifúngica y
antibacteriana (Ling & Jones, 1995. Life Sci.
57:195-206).
Los fitoesteroles más importantes, desde el
punto de vista económico, son el \beta-sitosterol,
el campesterol y el estigmasterol. En la actualidad, estos
compuestos se obtienen mediante un proceso extractivo de la materia
prima vegetal. Este proceso de extracción es de bajo rendimiento ya
que a partir de 1.6 kg de hoja seca de Pandanus tectorius se
obtienen 26.8 mg de una mezcla de estigmasterol y el
\beta-sitosterol en una proporción 2:1 (Mario y
cols., 2008. J Nat Med. 62:232-235).
Asimismo, a partir de 5 kg de fruto de banana se obtuvieron 325, 76,
y 65 mg/kg de \beta-sitosterol, campesterol y
estigmasterol respectivamente (Oliveira y cols., 2008. J Agric
Food Chem. 56(20):9520-9524).
El cultivo in vitro constituye una
alternativa a los métodos clásicos de extracción convencional a
partir de materia prima vegetal y se trata de un área emergente y de
gran potencial de crecimiento para la síntesis de compuestos
bioactivos. El cultivo de células vegetales in vitro ha
abierto nuevos caminos como fuente de obtención de compuestos
bioactivos de gran valor añadido debido a las ventajas que presenta
su utilización ya que estos cultivos son independientes de factores
geográficos, estacionales y ambientales, reconocidos como sistemas
de producción estables ya que aseguran la obtención continua de
compuestos con calidad y productividad uniformes y los
requerimientos de espacio para el desarrollo de la producción son
reducidos. Además, el proceso de purificación del compuesto de
interés es más fácil y se optimiza cuando éste se libera al medio de
cultivo, la producción del compuesto se puede realizar a gran escala
y, existe la posibilidad de obtener productos nuevos que no son
sintetizados por las plantas de forma natural. La optimización de la
producción de metabolitos incluye el establecimiento de las
condiciones óptimas de cultivo y el ajuste de los parámetros de
crecimiento celular. Cuando además se quiere comercializar el
producto a nivel industrial, es necesario realizar un escalado en
sistemas que garanticen la producción elevada del metabolito de
interés (en biorreactores) para alcanzar niveles económicamente
rentables. Además, existen otros factores que incrementan la
productividad entre los que destaca la elicitación del cultivo
celular. Mientras que la planta responde a la presencia de
elicitores sintetizando metabolitos de forma localizada allá donde
se produce la interacción, el cultivo celular responde globalmente,
ya que el elicitor entra en contacto con toda la biomasa. Por
lo tanto, la cantidad total de metabolitos sintetizados es mucho
mayor que en la planta y está en función de la biomasa de células
elicitada (Bru y cols., 2006. J Agr Food Chem.
54(1):65-71).
Debido a las propiedades beneficiosas
anteriormente descritas, desde 1997 se venden margarinas
enriquecidas con fitoesteroles en Finlandia, y actualmente en varios
países de Europa existen productos lácteos enriquecidos con los
mismos. Además, desde septiembre del año 2000, la FDA ha autorizado
declarar en los envases de los alimentos ricos en fitoesteroles, el
beneficio que para la salud presenta su consumo en relación a un
menor riesgo de enfermedades coronarias. Sin embargo, el coste de
estos productos es elevado, y se estima que debido a la gran
cantidad de materia vegetal necesaria para extraer una cantidad
significativa de fitoesteroles con las fuentes naturales mundiales
actuales sólo se podría abastecer a un 10% de la población
occidental (Law 2000. BMJ 320:861-864).
Existe por tanto la necesidad de encontrar un
método que mejore el rendimiento de extracción de fitoesteroles a
partir de los recursos naturales, permitiendo que un mayor
porcentaje de la población se beneficie de los efectos positivos que
tienen dichos fitoesteroles sobre la salud.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la producción y extracción de fitoesteroles con
rendimientos elevados. Los autores de la presente invención han
observado que estableciendo cultivos de células vegetales y
adicionando al medio ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de
metilo, se incrementa el rendimiento de producción y extracción de
fitoesteroles.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento para incrementar la producción y/o
extracción de fitoesteroles que comprende:
- a)
- añadir ciclodextrinas a un medio de cultivo,
- b)
- poner en contacto células potencialmente productoras de fitoesteroles con el medio de cultivo de a),
- c)
- incubar las células del paso b) en el medio de cultivo del paso a),
- d)
- separar los fitoesteroles obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
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Medios de cultivo adecuados son conocidos en el
estado de la técnica. Así, y sin limitar el alcance de la invención,
un medio de cultivo adecuado para células vegetales se describe para
cada especie utilizada en los ejemplos de la invención. A este medio
se le pueden adicionar otros componentes dependiendo de la especie a
la que pertenezcan las células vegetales. Las ciclodextrinas se
incorporan en el medio de cultivo en el momento de su
preparación.
Las células potencialmente productoras de
fitoesteroles pueden provenir de hojas, tejidos u órganos que han
sido establecidas previamente o no, en cultivos in vitro. Por
tanto, se entiende por células potencialmente productoras de
fitoesteroles, cualquier línea celular capaz de producir
fitoesteroles, bien de forma natural o tras modificación
genética.
Cualquier órgano, tejido o célula vegetal capaz
de producir fitoesteroles puede ser empleado en la invención. Esto
incluye aquellas células procedentes de un organismo que, aunque no
posea de forma natural la capacidad-de sintetizar
fitoesteroles, ha adquirido dicha capacidad mediante procesos de
manipulación genética. En una realización preferida, son tejidos o
células vegetales procedentes de plantas de los géneros que se
seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum,
Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
El término "planta" u "organismo"
incluye partes, tejidos, células o protoplastos procedentes de la
planta o del organismo, cultivos de células, cultivos de tejidos,
callos, óvulos, embriones y semillas procedentes en última instancia
de la planta o el organismo
Taxonómicamente los organismos del género
Rosa se definen como organismos celulares, que pertenece al
supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Rosales, familia Rosaceae,
Subfamilia Rosoideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Daucus se definen como organismos celulares, que pertenece al
supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Apiales, familia Apiaceae,
Subfamilia Apioideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Daucus se definen como organismos celulares, que pertenece al
supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Apiales, familia Apiaceae,
Subfamilia Apioidea.
Taxonómicamente los organismos del género
Capsicum se definen como organismos celulares, que pertenece
al supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Solanales, familia
Solanaceae, Subfamilia Solanoideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Lactuca se definen como organismos celulares, que pertenece
al supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Asterales, familia
Asteraceae, Subfamilia Cichorioideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Catharanthus se definen como organismos celulares, que
pertenece al supereino Eukaryota, reino Viridiplantae,
phylum Streptophyta, orden Gentianales, familia
Apocynaceae, Subfamilia Rauvolfioideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Lycopersicum se definen como organismos celulares, que
pertenece al supereino Eukaryota, reino Viridiplantae,
phylum Streptophyta, orden Solanales, familia
Solanaceae, Subfamilia Solanoideae.
Taxonómicamente los organismos del género
Taxus se definen como organismos celulares, que pertenece al
supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Coniferales, familia
Taxaceae.
Taxonómicamente los organismos del género
Vitis se definen como organismos celulares, que pertenece al
supereino Eukaryota, reino Viridiplantae, phylum
Streptophyta, orden Vitales, familia
Vitaceae.
De esta manera, se establecen cultivos de
células potencialmente productoras de fitoesteroles en medios de
cultivo adecuados que han sido enriquecidos con ciclodextrinas. El
término "cultivo de células" en esta memoria, hace referencia a
un cultivo de células aisladas del mismo o diferente tipo de tejido,
preferiblemente de una planta, o una colección de tales células
organizadas en partes de una planta o en tejidos (cultivos
tisulares). Tipos de cultivos de este tipo son, por ejemplo,
cultivos de protoplastos, callos (grupo de células vegetales
indiferenciadas capaces de regenerar una planta completa) y células
vegetales que están aisladas de plantas o partes de las plantas,
tales como embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen,
hojas, raíces, raíz inclina, antera, pistilo, flor, semilla, vaina o
vástago de la planta.
También se entienden como células potencialmente
productoras de fitoesteroles aquellas que provienen de vitroplantas,
órganos o tejidos de dichas vitroplantas, y específicamente, de
vitroplantas, órganos o tejidos de vitroplantas de los géneros que
se seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum,
Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
Así, en otra realización preferida de este
aspecto de la invención, las células potencialmente productoras de
fitoesteroles proceden de vitroplantas.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos
que se forman en algunos
procesos de degradación del almidón. A veces
también son llamadas cicloamilosas. Presentan un exterior
hidrofílico y una cavidad interior hidrofóbica donde pueden atrapar
moléculas orgánicas no polares. Para cambiar las propiedades físicas
y químicas de las ciclodextrinas se han desarrollado diversos
derivados. Unos de los más utilizados son los derivados parcialmente
metilados que tienen una solubilidad en agua hasta 150 veces
superior a la del producto de partida.
Así, en otra realización preferida, las
ciclodextrinas que se añaden en el paso a) del procedimiento de la
invención se eligen del grupo que comprende cliclodextrina metilada
aleatoriamente (CDMA) o ciclodextrina hidroxipropilada (CDHA).
Preferiblemente, el grado de sustitución de los metilos por unidad
de glucosa (anhidra) de la CDMA es de entre 1 y 3, y más
preferiblemente, el grado de sustitución por metilos por unidad de
glucosa (anhidra) de la CDMA es de 2.
En otra realización preferida de la invención,
la ciclodextrina hidroxipropilada aleatoriamente tiene un grado de
sustitución por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9.
\newpage
En otra realización preferida de este aspecto de
la invención la ciclodextrina es un maltooligosacárido cíclico
constituido por 7 unidades de D-glucosa unidas por
enlaces glucosídicos de tipo \alpha (1\rightarrow4)
(\beta-ciclodextrinas).
En otra realización preferida la concentración
de ciclodextrinas en el medio de cultivo del paso (a) del
procedimiento de la invención es de entre 6.5 y 130 g/L de medio de
cultivo. Más preferiblemente la concentración de ciclodextrinas es
de entre 10 y 100 g/L medio de cultivo y aún más preferiblemente es
de entre 50 y 75 g/L medio de cultivo.
El jasmonato de metilo es un regulador del
crecimiento, modulando múltiples aspectos del desarrollo de las
plantas (maduración de frutos, viabilidad del polen, crecimiento de
la raíz, curvatura de los zarcillos) y que promueve el
envejecimiento foliar, produciendo senescencia. Parece actuar de
forma específica sobre la expresión de genes implicados en la
defensa de las plantas a ataques de insectos y patógenos y genes que
codifican para proteínas de reserva.
En otra realización preferida, además de añadir
ciclodextrinas, se añade jasmonato de metilo al medio de cultivo del
paso a) del procedimiento de la invención. En otra realización más
preferida de la presente invención la concentración de jasmonato de
metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre 5 y 500
micromoles por litro de medio de cultivo. Más preferiblemente la
concentración de jasmonato de metilo es de entre 25 y 150
micromoles/L de medio de cultivo y aun más preferiblemente de entre
75 y 125 micromoles/L de medio de cultivo.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de una composición, de ahora en adelante composición de la
invención, que comprende ciclodextrinas para incrementar la
producción y/o extracción de fitoesteroles en células potencialmente
productoras de los mismos. En una realización preferida, la
composición de la invención comprende, además de ciclodextrinas,
jasmonato de metilo. Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un medio de cultivo, de ahora en adelante medio de cultivo de la
invención, que comprende ciclodextrinas para incrementar la
producción y/o extracción de fitoesteroles en células potencialmente
productoras de los mismos. En una realización preferida, el medio de
cultivo de la invención comprende, ademas de ciclodextrinas,
jasmonato de metilo.
Tanto la densidad celular en el medio de cultivo
como el fotoperiodo pueden variar en función de la procedencia de
las células potencialmente productoras de fitoesteroles. El
fotoperiodo se ajustará preferiblemente a un ciclo natural de entre
12-16 horas de luz y 8-12 horas de
oscuridad.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
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A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto el efecto del uso de las ciclodextrinas y el jasmonato de
metilo en la producción de fitoesteroles a partir de suspensiones
celulares de diferentes especies vegetales.
La línea celular de Rosa mini (Rosa sp.)
se inició a partir de hojas de plantas cultivadas en los
invernaderos de Viveros Bermejo S.L. Para ello las hojas se lavaron
tres veces con agua jabonosa. Posteriormente se llevó a cabo la
desinfección con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuación se
sumergieron durante 15-20 minutos en una disolución
de hipoclorito sódico al 10% que contenía Tween 20 al 0.1%.
Transcurrido este tiempo, las hojas se lavaron tres veces con agua
destilada estéril trabajando a partir de este lavado y en las etapas
siguientes en la cabina de flujo laminar.
Una vez desinfectadas se cortaron en fragmentos
de 1.5-2.0 mm y se depositaron sobre placas petri
que contenían un medio de cultivo óptimo para la inducción de callos
basado en el descrito por Murashige & Skoog, 1962 (Physiol.
Plant. 15:473-497), suplementado con pantotenato
cálcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01 mg/l),
piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l).
Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (30 g/l) y
2.4-diclorofenoxiacético (1.1 mg/l) y benciladenina
(0.45 mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 6 y se
esteriliza mediante la aplicación de calor húmedo (autoclave)
durante 20 min a 1.2 atm de presión, adquiriendo la consistencia
sólida mediante la adición de agar purificado (8 g/l), cuando el
medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de los callos friables obtenidos, en matraces de 250 ml de
capacidad que contenían 80 ml del medio cultivo descrito sin agar.
Las células en medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a
100 rpm, a 25ºC bajo un fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se
subcultivaron cada 14-16 días.
Línea celular: Daucus carota L. var.
sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106
Línea celular: Daucus carota L. cv.
Chantenay.
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La línea celular Daucus carota L. var.
sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 fue obtenida
de Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ;
Braunschweig, Alemania).
Para la inducción de callos de Daucus
carota L. cv. Chantenay se utilizaron vitroplantas que se
obtuvieron por germinación in vitro de semillas.
El objetivo fundamental de la germinación de
semillas in vitro es la obtención de plantas estériles para
su utilización en la inducción de líneas celulares de los diferentes
órganos de la planta: raíz, tallo y hoja.
Para obtener la vitroplanta de zanahoria se
utilizaron semillas suministradas por Viveros Bermejo S.L. Las
semillas se sometieron a un proceso de desinfección con etanol al
70% durante 1 minuto y a continuación se sumergieron durante
15-20 minutos en una disolución de hipoclorito
cálcico al 7% que contenía Tween 20 al 0.1%. Transcurrido este
tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada
estéril trabajando a partir de este lavado y en las etapas
siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a
tubos que contenían el medio de cultivo basado en el descrito por
Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant.
15:473-497), suplementado con pantotenato cálcico (1
mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01 mg/l), piridoxina (1
mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l) y hidrolizado de
caseína (300 mg/L). Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (25
g/l). Este medio se ajusta a pH 5.8 y se esteriliza mediante la
aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de
presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de
agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfría.
Los tallos de las vitroplantas se utilizaron
como fuente de explantos. Las placas petri con los explantos se
mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de
oscuridad a una irradiancia de 4.6 w/m^{2} a 25ºC, observándose al
cabo de 2-3 semanas la aparición de microcallos que
se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad que contenían 100
ml del medio de cultivo anteriormente descrito suplementado con
ácido naftalenacético (2 mg/l) y benciladenina (0.2 mg/l).
A partir de la línea celular generada bajo las
condiciones descritas se originó una línea celular en oscuridad con
el fin de comparar la producción de fitoesteroles en luz y
oscuridad.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que
contenían 80 ml de medio cultivo sin agar. Las células en medio
líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, en las
mismas condiciones de luz y Tª y se subcultivaron cada 20 días.
Para la inducción de callos de Capsicum
se utilizaron vitroplantas obtenidas a partir de semillas germinadas
in vitro.
Para obtener la vitroplanta de Capsicum
se utilizaron semillas que se sometieron a un proceso de
desinfección con etanol al 70% durante 2 minutos y a continuación,
se sumergieron durante 20 minutos en una disolución de hipoclorito
sódico al 20% que contenía Tween 20 al 0.1%. Transcurrido este
tiempo, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada
estéril, trabajando a partir de este lavado y en las etapas
siguientes en la cabina de flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a
tubos que contenían el medio de cultivo basado en el descrito por
Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant.
15:473-497), suplementado con pantotenato cálcico (1
mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01 mg/l), piridoxina (1
mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l) e hidrolizado de
caseína (300 mg/L). Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (25
g/l). Este medio se ajusta a pH 5.8 y se esteriliza mediante la
aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de
presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de
agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfría. Los tubos de
cultivo in vitro se mantienen en una cámara de germinación
durante 15 días, a 25ºC bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8
horas de oscuridad.
Una vez crecidas las plántulas se utilizarán
hipocotilos como fuente de explanto, para la obtención de los
microcallos en el medio de cultivo descrito anteriormente
suplementado con ácido naftalenacético (2 mg/l) y benciladenina (0.2
mg/l). Los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas
de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4.6 w/m^{2} a
25ºC, observándose al cabo de 2 semanas la aparición de estos
microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad
que contenían 100 ml del mismo medio de cultivo.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que
contenían 80 ml de medio cultivo sin agar. Las células en medio
líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm en las
mismas condiciones de luz y Tª y se subcultivaron cada 20 días.
Para la inducción de callos de Lactuca
sativa se utilizaron hojas de vitroplantas obtenidas por
germinación in vitro.
Para obtener las vitroplantas de Lactuca
sativa se utilizaron semillas suministradas por Ramiro Arnedo
S.L. Las semillas se sometieron a un proceso de desinfección con
etanol al 70% durante 1 minuto y a continuación se sumergieron
durante 15 minutos en una disolución de hipoclorito cálcico al 7%
que contenía Tween 20 al 0.1%. Transcurrido este tiempo, las
semillas se lavaron tres veces con agua destilada estéril trabajando
a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de
flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a
tubos que contenían el medio de cultivo basado en el descrito por
Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant.
15:473-497), suplementado con pantotenato cálcico (1
mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01 mg/l), piridoxina (1
mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l) e hidrolizado de
caseína (300 mg/L). Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (25
g/l). Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la
aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de
presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de
agar purificado (8 g/l), cuando el medio se enfría.
Una vez crecidas las plántulas se utilizaron las
hojas y la raíz como fuente de explantos para la obtención de los
microcallos en placa petri. Las placas petri con los explantos se
mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de
oscuridad a una irradiancia de 4.6 w/m^{2} a 25ºC, observándose al
cabo de 2-3 semanas la aparición de microcallos que
se transfirieron a matraces de 250 mL de capacidad que contenían 100
ml del medio de cultivo anteriormente descrito suplementado con
ácido naftalenacético (1 mg/l) y quinetina (1 mg/l).
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de porciones de callos friables, en matraces de 250 ml de
capacidad que contenían 80 ml de medio cultivo sin agar. Las células
en medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a
25ºC en las condiciones descritas anteriormente y se subcultivaron
cada 16 días.
La línea celular de C. roseus (L.) G.Don
fue obtenida de Germán Collection of Microorganisms and Cell
Cultures (DSMZ; Braunschweig, Alemania, número
PC-1101).
Los callos se mantuvieron a 25ºC en oscuridad,
en matraces de 250 ml de capacidad que contenían 100 ml de un medio
que contenía medio basal LS (Linsmaier & Skoog, F. 1965
Physiol. Plant. 18, 100-127) suplementado con
tiamina (0,4 mg/l) y mio-inositol (100 mg/l) y
sacarosa (30 g/l) como fuente carbonada, ácido
alfa-naftalenacético (0.19 mg/l) y
2.4-diclorofenoxiacético (0.22 mg/l) como hormonas.
Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la aplicación
de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de presión,
adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de agar
purificado (8 g/l) cuando el medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que
contenían 80 ml del medio LS sin agar. Las células en medio líquido
se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25ºC en la
oscuridad.
Línea celular: Lycopersicon esculentum
variedad Micro-Tom
Línea celular: Lycopersicon esculentum
variedad Durinta
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares derivadas del tomate
Durinta suministrado por la Wester Seed (Holanda) fueron obtenidas a
partir de diferentes tejidos (epidermis y pericarpo) del fruto.
Para ello los frutos se lavaron tres veces con
agua jabonosa. Posteriormente se llevó a cabo la desinfección con
etanol al 70% durante 1 minuto e hipoclorito cálcico al 7% durante
20 minutos. Tras la desinfección, se enjuagaron con abundante agua
destilada estéril. Una vez desinfectadas se seleccionaron explantos
de 1.5-2.0 mm y se depositaron sobre placas petri
que contenían un medio de cultivo óptimo para la inducción de callos
basado en el descrito por Murashige y Skoog (1962), suplementado con
pantotenato cálcico (1 mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01
mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1
mg/l) e hidrolizado de caseína (250 mg/l); como fuente carbonada se
utilizó sacarosa (30 g/l) y 2.4-diclorofenoxiacético
(1 mg/l) como hormona. Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza
mediante la aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a
1.2 atm de presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la
adición de agar purificado (7.5 g/l) cuando el medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que
contenían 80 ml de medio cultivo sin agar. Las células en medio
líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25ºC bajo
un fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se subcultivaron cada
14-16 días.
Línea celular: Lycopersicon esculentum
variedad Micro-Tom
\vskip1.000000\baselineskip
Para la inducción de callos de Lycopersicon
esculentum variedad Micro-Tom se utilizaron
vitroplantas obtenidas por germinación in vitro.
Para obtener las vitroplantas de Lycopersicon
esculentum se utilizaron semillas suministradas por Ramiro
Arnedo S.L. Las semillas se sometieron a un proceso de desinfección
con etanol al 70% durante 1 minuto y a continuación se sumergieron
durante 15 minutos en una disolución de hipoclorito cálcico al 7%
que contenía Tween 20 al 0.1%. Transcurrido este tiempo, las
semillas se lavaron tres veces con agua destilada estéril trabajando
a partir de este lavado y en las etapas siguientes en la cabina de
flujo laminar.
Las semillas desinfectadas se transfirieron a
tubos que contenían el medio de cultivo basado en el descrito por
Murashige & Skoog, 1962 (Physiol. Plant.
15:473-497), suplementado con pantotenato cálcico (1
mg/l), mioinositol (100 mg/l), biotina (0.01 mg/l), piridoxina (1
mg/l), tiamina (1 mg/l), ácido nicotínico (1 mg/l) e hidrolizado de
caseína (250 mg/l). Como fuente carbonada se utilizó sacarosa (30
g/l). Este medio se ajusta a pH 6 y se esteriliza mediante la
aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a 1.2 atm de
presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la adición de
agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfría.
Una vez crecidas las plántulas se utilizaron las
yemas axilares como fuente de explanto, para la obtención de los
microcallos en el medio de cultivo descrito anteriormente
suplementado con ácido naftalenacético (2 mg/l) y benciladenina (2
mg/l). Los explantos se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 16 horas
de luz, 8 horas de oscuridad a una irradiancia de 4.6 w/m^{2} a
25ºC, observándose al cabo de 2 semanas la aparición de estos
microcallos que se transfirieron a matraces de 250 ml de capacidad
que contenían 100 ml del mismo medio de cultivo.
Las suspensiones celulares se iniciaron, a
partir de porciones de callos friables, en matraces de 250 ml de
capacidad que contenían 80 ml del medio cultivo sin agar. Las
células en medio líquido se mantuvieron en un agitador orbital a 100
rpm, a 25ºC en las condiciones descritas anteriormente y se
subcultivaron cada 16 días.
La línea celular de Taxus sp se inició a
partir de hojas de plantas cultivadas en los invernaderos de Viveros
Bermejo S.L. Para ello las hojas se lavaron tres veces con agua
jabonosa. Posteriormente se llevó a cabo la desinfección con etanol
al 70% durante 1 minuto y a continuación se sumergieron durante 20
minutos en una disolución de hipoclorito cálcico al 8% que contenía
Tween 20 al 0.1%. Transcurrido este tiempo, las hojas se lavaron
tres veces con agua destilada estéril trabajando a partir de este
lavado y en las etapas siguientes en la cabina de flujo laminar.
Una vez desinfectadas las hojas se cortaron en
fragmentos de 1.5-2.0 mm y se depositaron sobre
placas petri que contenían un medio de cultivo óptimo para la
inducción de callos que contiene sales Gamborg (3.05 g/l)
suplementado con pantotenato cálcico (1 mg/l), mioinositol (100
mg/l), biotina (0.01 mg/l), piridoxina (1 mg/l), tiamina (1 mg/l),
ácido nicotínico (1 mg/l) e hidrolizado de caseína (500 mg/l). Como
fuente carbonada se utilizó sacarosa (30 g/l) y
2.4-diclorofenoxiacético (2 mg/l) y quinetina (0.2
mg/l) como hormonas. Este medio se ajusta a pH 5.8 y se esteriliza
mediante la aplicación de calor húmedo (autoclave) durante 20 min a
1.2 atm de presión, adquiriendo la consistencia sólida mediante la
adición de agar purificado (8 g/l) cuando el medio se enfría.
Las suspensiones celulares se iniciaron a partir
de callos friables, en matraces de 250 ml de capacidad que contenían
80 ml del medio cultivo sin agar. Las células en medio líquido se
mantuvieron en un agitador orbital a 100 rpm, a 25ºC bajo un
fotoperiodo 16 h de luz, 8 de oscuridad y se subcultivaron cada 20
días.
La línea celular de Vitis vinifera cv.
Monastrell se obtuvieron a partir de frutos inmaduros de este
cultivar de vid. Para ello, los frutos inmaduros, de aproximadamente
5 mm de diámetro, se esterilizaron superficialmente por inmersión en
una disolución de hipoclorito cálcico al 7% durante 15 minutos.
Transcurrido este tiempo, y siempre bajo condiciones estériles, las
bayas se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se
eliminaron las semillas y se dividieron en cuatro porciones. Cada
una de estas porciones se depositaron en una placa petri que
contenía un medio de cultivo basado en el descrito por Murashige
& Skoog, 1962 (Physiol. Plant.
15:473-497), suplementado con vitaminas, hormonas,
hidrolizado de caseína, sacarosa y agar, ajustándose el pH a
6.0.
Las placas con los explantos se mantuvieron en
oscuridad a 25ºC, observándose al cabo de 2-3
semanas la aparición de microcallos, que se transfirieron a matraces
de 250 ml de capacidad que contenían 100 ml del medio anteriormente
descrito. Los callos friables obtenidos se subcultivaron cada tres
semanas.
Posteriormente, estos callos se transfirieron a
medio de cultivo Gamborg B5, suplementado con quinetina (0.2 mg/l),
ácido naftalenacético (0.1 mg/l), hidrolizado de caseína (250 mg/l)
y sacarosa (20 g/l). Los callos se mantuvieron friables en este
estado en condiciones para la obtención de suspensiones celulares,
en oscuridad a 25ºC.
Las suspensiones celulares se iniciaron mediante
la transferencia de porciones de callo friable en matraces de 250 ml
de capacidad, que contenían 100 ml de medio de cultivo líquido
Gamborg descrito anteriormente. Después de varios subcultivos de las
suspensiones en este volumen se procedió al escalado en matraces de
500 ml de capacidad que contenían 200 ml de medio de cultivo. Se
mantuvieron en agitación a 105 rpm, en iguales condiciones de
oscuridad y temperatura que las descritas para las anteriores y se
subcultivaron cada 14-16 días.
En cada experiencia de elicitación se tomaron,
en condiciones de esterilidad, entre 420 y 110 gramos de peso fresco
de células por litro, que habían sido previamente lavadas con medio
fresco y filtradas. Utilizando esta densidad celular, las células se
repartieron en matraces de 250 ml que contenían 100 ml de medio
fresco:
- \bullet
- sólo con una \beta-ciclodextrina metilada aleatoriamente con un grado de sustitución por metilos de entre 1,6 y 1,9 (CDMA) a una concentración de 62,5 g/l.
- \bullet
- hidroxipropilada aleatoriamente con un grado de sustitución por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9 (CDHA), a una concentración de 62,5 g/l.
- \bullet
- con una de las ciclodextrinas anteriormente mencionadas (CDMA) o (CDHA) a una concentración 62,5 g/l y con jasmonato de metilo a una concentración 100 micromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
El jasmonato de metilo se esteriliza por
filtración, disuelto en etanol, y posteriormente se mezcla con el
resto del medio estéril. La concentración final de etanol en el
medio de cultivo es de 0.043 moles por litro.
Los matraces se incubaron en las mismas
condiciones descritas anteriormente para su mantenimiento en medio
líquido durante 96 horas.
Los cultivos celulares incubados con elicitores
se recogieron a las 96 horas de tratamiento para su análisis.
En el caso de las suspensiones celulares, las
células fueron separadas del medio por filtración realizando un
ligero vacío, recogiendo por separado las células y el filtrado. El
filtrado se utilizó para la extracción de los compuestos y posterior
análisis por cromatografía de gases/masas.
Una vez realizados los experimentos de
elicitación, la extracción de los compuestos secretados al medio de
cultivo de las diferentes líneas celulares, se llevó a cabo mediante
partición de fases entre acetato de etilo y agua que contenía,
NaHCO_{3} al 3% (p/v) y NaCl al 10% (p/v). La fase orgánica se
recogió y se evaporó en un rotavapor a 40ºC a vacío; el residuo seco
se resuspendió en 1 ml de metanol y se procedió a su análisis en el
cromatógrafo de gases/masas.
Los ensayos se realizaron utilizando un sistema
cromatográfico Agilent Technologies 6890 Network GS System equipado
con un detector de masas Agilent 5973. La separación de los
compuestos se llevó a cabo sobre una columna capilar Agilent 19091
S-433 HP-5MS, con un flujo de 1.0
ml/min de helio como gas portador. La temperatura del inyector se
ajustó a 250ºC y el volumen de inyección fue de 1 \mul. El
programa de análisis es el siguiente: inicio a 60ºC con subida hasta
310ºC alcanzando una temperatura máxima de 350ºC. La identificación
de los diferentes compuestos se llevó a cabo mediante la combinación
del análisis del espectro de masas y los tiempos de retención.
El tiempo de retención de los diferentes
fitoesteroles y la respuesta del detector a la concentración de los
mismos (curva de calibrado para cuantificación) se determinó usando
patrones externos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Lycopersicon
esculentum se trataron con:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla A.
Los cultivos elicitados sólo con CDs o en
combinación con MeJA, inducen una mayor acumulación extracelular de
estigmasterol siendo el tratamiento con CDHA+MeJA el que produjo un
mayor incremento de la producción respecto al control. Asimismo el
tratamiento que produjo un mayor incremento en la biosíntesis de
fucosterol fue CDHA con MeJA.
Por otro lado se observó que no existían
diferencias significativas en la producción de
\beta-sitosterol en los cultivos tratados con
MeJA, CDMA y la combinación de ambos tras 96 horas de elicitación.
Sólo los tratamientos con CDHA y la combinación de CDHA con MeJA se
tradujo en un incremento en la producción de
\beta-sitosterol.
Estos resultados indican que el tratamiento que
origina mayor producción de fitoesteroles en esta línea celular es
la combinación de CDHA y MeJA.
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Lycopersicon
esculentum se trataron con:
- \bullet
- controles sin CDMA ni MeJA
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular elevada (260 g/pf/l). Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla B.
De todos los ensayos realizados la utilización
de CDHA sola o en combinación con MeJA resulto ser el tratamiento
que indujo un mayor incremento en la acumulación extracelular de
estigmasterol, \beta-sitosterol y fucosterol.
En cuanto a la producción de taraxasterol no se
observaron diferencias significativas con respecto al control.
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Lycopersicon
esculentum se trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular baja (130 g/pf/l). Al cabo
de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada matraz
por separado, las células se pesaron y se determinó la cantidad
total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del
experimento se muestra en la Tabla C.
Los cultivos elicitados solamente con CDs o en
combinación con MeJA originan los mayores incrementos de la
producción de fitoesteroles respecto a los controles o incluso los
tratados solamente con MeJA.
En relación a la producción de fucosterol y
taraxasterol se observó que aquellos cultivos tratados con CDMA solo
o combinado con MeJA son los que producen una mayor acumulación
extracelular.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Rosa sp se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla D.
Tras analizar los resultados se observó que la
inducción de la biosíntesis de fitoesteroles en cultivos celulares
de Rosa sp elicitados sólo con CDs resultó ser mayor que en
los elicitados sólo con MeJA o en combinación con CDs, siendo el
tratamiento con CDMA el que produjo un mayor incremento.
Este hecho sugiere que el verdadero inductor de
la biosíntesis de \beta-sitosterol y fucosterol en
los cultivos de Rosa sp son las CDs.
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Rosa sp se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla E.
El tratamiento que produjo un mayor incremento
de la producción de fitoesteroles es CDMA al igual que los cultivos
celulares de Rosa sp elicitados utilizando una alta densidad
celular (Tabla D). Sin embargo, en estos ensayos la producción de
\beta-sitosterol y fucosterol resultó ser del
orden de 2 y 3 veces menor que en los ensayos realizados utilizando
una densidad celular elevada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Capsicum annuum se
trataron con:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular elevada (367 g/pf/l). Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla F.
La inducción de la biosíntesis de fitoesteroles
en cultivos elicitados sólo con CDs resultó ser menor que en los
elicitados sólo con MeJA. Sin embargo, la abundancia de
fitoesteroles es mayor utilizando la combinación de CDs y MeJA que
individualmente por lo se observa un efecto aditivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Capsicum chinense se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular elevada (367 g/pf/l). Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla G.
Como se observa en la tabla G la biosíntesis de
\beta-sitosterol se incrementa al realizar los
ensayos con CDs sola o en combinación con MeJA mientras que la
elicitación en presencia de MeJA individualmente produce niveles
inferiores. No se detectó producción de campesterol, fucosterol y
estigmasterol en presencia de MeJA pero si con CDs y la combinación
de ambos.
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Daucus carota L.
sativus (Hoffm.) Arcang PC-1106 se trataron
con:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular baja (11.2 g pf/l). Al cabo
de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada matraz
por separado, las células se pesaron y se determinó la cantidad
total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del
experimento se muestra en la Tabla H.
Tras analizar los resultados se observó que
tanto estigmasterol como campesterol y
\beta-sitosterol se identificaron en aquellos
cultivos tratados sólo con CDs o en combinación con MeJA.
La inducción de la biosíntesis de fitoesteroles
en cultivos elicitados con CDMA+MeJA resultó ser similar que en los
realizados en presencia sólo de CDMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones se trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular baja (11.2 g pf/l). Al cabo
de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada matraz
por separado, las células se pesaron y se determinó la cantidad
total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del
experimento se muestra en la Tabla I.
Al igual que ocurría en los experimentos de
elicitación de células de Daucus carota L. sativus
utilizando una densidad celular baja (Tabla H), estigmasterol,
campesterol y \beta-sitosterol solamente se
identificaron en aquellos cultivos tratados con CDs individualmente
o en combinación con MeJA, siendo los niveles de producción de
fitoesteroles similares en todos los tratamientos.
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Daucus carota
variedad Chantenay se trataron:
- \bullet
- controles sin CDMA ni MeJA
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla J.
Estos resultados indican que la producción de
fitoesteroles en esta línea celular es similar en todos los
tratamientos con CDs sólo o en combinación con MeJA.
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Vitis vinifera se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular elevada (300 g/pf/l). Al
cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada
matraz por separado, las células se pesaron y se determinó la
cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla K.
La biosíntesis de fitoesteroles se produjo al
realizar los ensayos con CDs mientras que en los cultivos celulares
tratados sólo con MeJA no se produjo acumulación extracelular.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Catharanthus roseus
(L.) G. Don se trataron con:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular baja (11.2 g pf/l). Al cabo
de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada matraz
por separado, las células se pesaron y se determinó la cantidad
total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del
experimento se muestra en la Tabla L.
Los cultivos elicitados solamente con CDs o en
combinación con MeJA originaron producción de fitoesteroles. Los
ensayos realizados en presencia de CDs originaron un aumento de la
acumulación extracelular de fitoesteroles. En todos los casos se
observa una producción baja de fitoesteroles por lo que el efecto o
el agente inductor son las CDs.
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Catharanthus roseus
(L.) G.Don se trataron con:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo utilizando una densidad celular baja (110 g pf/l). Al cabo
de 96 horas, se recolectaron las células y el medio de cada matraz
por separado, las células se pesaron y se determinó la cantidad
total de fitoesteroles en el medio extracelular. El resultado del
experimento se muestra en la Tabla M.
Solamente los cultivos celulares elicitados con
CDs incrementaron la producción de campesterol y
\beta-sitosterol respecto al resto de
tratamientos. Por lo cual en Catharanthus roseus (L.) G.Don
las CDs producen un aumento de la biosíntesis de fitoesteroles.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Control: medio de cultivo sin elicitores.
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA.
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA.
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA.
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Lactuca sativa se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla N.
Los cultivos elicitados sólo con CDs o en
combinación con MeJA, inducen una mayor acumulación extracelular de
fitoesteroles siendo el tratamiento con CDMA el que produjo un mayor
incremento de la producción respecto al control y los cultivos
tratados sólo con MeJA.
Por otro lado se observó que no existían
diferencias significativas en la producción de fitoesteroles en los
ensayos realizados con CDMA+MeJA, CDHA y CDHA+MeJA.
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de Lactuca sativa se
trataron:
- \bullet
- sin CDMA ni MeJA (controles)
- \bullet
- con MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDMA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l)
- \bullet
- con CDHA (62.5 g/l) y MeJA (100 micromoles/l)
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado en matraces de 250 ml conteniendo 100 ml de medio de
cultivo. Al cabo de 96 horas, se recolectaron las células y el medio
de cada matraz por separado, las células se pesaron y se determinó
la cantidad total de fitoesteroles en el medio extracelular. El
resultado del experimento se muestra en la Tabla Ñ.
Al igual que ocurría en los experimentos de
elicitación de células de Lactuca sativa obtenidas a partir
de hoja (Tabla N), estigmasterol, campesterol y
\beta-sitosterol solamente se identificaron en
aquellos cultivos tratados con CDs individualmente o en combinación
con MeJA, siendo los niveles de producción de fitoesteroles
similares en todos los tratamientos.
Control: medio de cultivo sin elicitores
MeJA: tratamiento con 100 micromoles/l de
MeJA
CDMA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
CDMA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDMA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA
CDHA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
CDHA+MeJA: tratamiento con 62.5 g/l de CDHA
combinado con 100 micromoles/l de MeJA.
Claims (18)
1. Procedimiento para incrementar la producción
y/o extracción de fitoesteroles que comprende:
- a.
- añadir ciclodextrinas a un medio de cultivo,
- b.
- poner en contacto células potencialmente productoras de fitoesteroles con el medio de cultivo de (a),
- c.
- incubar las células del paso b) en el medio de cultivo del paso a),
- d.
- separar los fitoesteroles obtenidos tras el paso c) del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación
anterior, donde las células potencialmente productoras de
fitoesteroles del paso (a) proceden de plantas de los géneros que se
seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum,
Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde las células potencialmente
productoras de fitoesteroles proceden de vitroplantas.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde las ciclodextrinas se
seleccionan del grupo que comprende cliclodextrina metilada
aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada.
5. Procedimiento según la reivindicación 4 donde
la ciclodextrina metilada aleatoriamente tiene un grado de
sustitución por metilos de entre 1 y 3.
6. Procedimiento según la reivindicación 5 donde
la ciclodextrina metilada aleatoriamente es dimetilada.
7. Procedimiento según la reivindicación 4 donde
la ciclodextrina hidroxipropilada aleatoriamente tiene un grado de
sustitución por hidroxipropilos de entre 0,6 y 0,9.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 donde la ciclodextrina es una
\beta-ciclodextrina.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 donde la concentración de ciclodextrinas en
el medio de cultivo del paso (a) es de entre 6.5 y 130 g/l.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 donde la concentración de ciclodextrinas en
el medio de cultivo del paso (a) es de entre 10 y 100 g/l.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 donde la concentración de ciclodextrinas en
el medio de cultivo del paso (a) es de entre 50 y 75 g/l.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 donde además de añadir ciclodextrinas al
medio de cultivo del paso (a) se añade jasmonato de metilo.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
donde la concentración de jasmonato de metilo en el medio de cultivo
del paso (a) es de entre 5 y 500 micromoles/litro.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12-13, donde la concentración de
jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre
25 y 150 micromoles/litro.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, donde la concentración de
jasmonato de metilo en el medio de cultivo del paso (a) es de entre
75 y 125 micromoles/litro.
16. Uso de una composición que comprende
ciclodextrinas para incrementar la producción y/o extracción de
fitoesteroles en células potencialmente productoras de los
mismos.
17. Uso de un medio de cultivo que comprende
ciclodextrinas para incrementar la producción y/o extracción de
fitoesteroles en células potencialmente productoras de los
mismos.
18. Uso de una composición según la
reivindicación 16 o de un medio de cultivo según la reivindicación
17, donde la composición o el medio de cultivo además comprende
jasmonato de metilo.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200803107A ES2344775B2 (es) | 2008-10-31 | 2008-10-31 | Uso de las ciclodextrinas para la produccion y extraccion de fitoesteroles en cultivos celulares. |
| EP09823118.6A EP2351846B1 (en) | 2008-10-31 | 2009-10-27 | Use of cyclodextrins for the production and extraction of phytosterols in cell cultures |
| ES09823118.6T ES2625491T3 (es) | 2008-10-31 | 2009-10-27 | Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares |
| PCT/ES2009/070463 WO2010049563A1 (es) | 2008-10-31 | 2009-10-27 | Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares |
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| ES09823118.6T Active ES2625491T3 (es) | 2008-10-31 | 2009-10-27 | Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares |
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|---|---|---|---|---|
| FR2775001B1 (fr) * | 1998-02-13 | 2000-05-12 | Lvmh Rech | Acide nucleique comprenant la sequence d'un promoteur inductible par un stress et une sequence d'un gene codant pour une stilbene synthase, cellule et plante transformees par cet acide nucleique |
| ES2190771B2 (es) * | 2002-01-24 | 2004-03-01 | Univ Alicante | Procedimiento para la produccion de resveratrol en cultivos celulares. |
-
2008
- 2008-10-31 ES ES200803107A patent/ES2344775B2/es active Active
-
2009
- 2009-10-27 EP EP09823118.6A patent/EP2351846B1/en active Active
- 2009-10-27 WO PCT/ES2009/070463 patent/WO2010049563A1/es active Application Filing
- 2009-10-27 ES ES09823118.6T patent/ES2625491T3/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LEE, M.H. et al.: "{}Enhanced Triterpene and Phytosterol Biosynthesis in Panax ginseng Overexpressing Squalene Synthase Gene"{}, Plant Cell Physiol. (2004) vol. 45 (8), pp.: 976-984. * |
| MANGAS, S. et al.: "{}The Effect of Methyl-Jasmonate on Triterpene and Sterol Metabolisms of Centel the asiatica, Ruscus aculeatus and Galphimia glauca Cultured Plants"{}, Phytochemistry (2006), vol. 67 pp.: 2041-2049. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2344775A1 (es) | 2010-09-06 |
| ES2625491T3 (es) | 2017-07-19 |
| EP2351846B1 (en) | 2017-01-04 |
| WO2010049563A1 (es) | 2010-05-06 |
| EP2351846A1 (en) | 2011-08-03 |
| EP2351846A4 (en) | 2012-10-10 |
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