FR3096054A1 - Application du gène GhCAL-D07 pour promouvoir la floraison de plantes - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un gène GhCAL-D07 et son application dans la promotion de la floraison des plantes, qui appartient au domaine technique du génie génétique végétal. Le gène GhCAL-D07 a la séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO:1 et peut coder la séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO: 2. L'augmentation de l'expression du gène GhCAL-D07 dans les plantes a été obtenue soit en augmentant l'expression du gène GhCAL-D07 endogène dans les plantes, soit en surexprimant le gène GhCAL-D07 exogène dans les plantes, où la surexpression du gène GhCAL-D07 exogène signifie que ledit gène GhCAL-D07 est exprimé dans les plantes à l'aide d'un vecteur d'expression végétale, par l'intermédiaire de la transformation d’agrobactéries. La présente invention permet de faire avancer considérablement la floraison de l’Arabidopsis thaliana en obtenant la plante d’Arabidopsis thaliana modifiée par le gène GhCAL-D07 par transgénèse. En réduisant davantage le gène GhCAL-D07 dans le coton au silence, le résultat montre que le gène GhCAL-D07 joue un rôle clé dans la promotion de la floraison du coton. La présente invention fournit une ressource génétique favorable à la culture du coton de courte saison.
Description
L’invention concerne le domaine de la technologie du génie génétique des plantes, en particulier l’application du gène GhCAL-D07 pour promouvoir la floraison de plantes
Contexte
La nourriture et l’habillement sont les moyens de subsistance des gens, et notre pays est confronté à la situation de base de plus de populations et moins de terres, il y a donc un grave conflit entre le grain et le coton pour la terre labourée, afin d’atténuer ce conflit, les sélectionneurs se sont engagés à la sélection du coton de courte saison, pour réaliser un système de production agricole de deux récoltes de grains et cotons en une année. Les insuffisances des techniques de la sélection conventionnelles avec des cycles longs ont fait de la sélection moléculaire une tendance, les méthodes transgéniques étant une méthode éprouvée de sélection de nouvelles variétés, de sorte que les inventeurs se consacrent à développer de nouveaux gènes.
Le coton de courte saison est une des variétés de cotons terrestres à courte période de fertilité, et s’est progressivement formé et développé avec les changements de l’environnement écologique et le système de culture agricole, s’adaptant à certaines conditions sociales et économiques, au niveau de développement de la production et au niveau de développement scientifique et technologique. Dans notre pays, le coton de saison courte se divise en écotype ultra précoce du Nord, écotype du bassin du fleuve Jaune et écotype du bassin du fleuve Yangtsé. L’écotype du bassin du fleuve Yangtsé concerne principalement le coton transplanté après blé (colza) ou le coton semé directement, mais le coton transplanté domine ; l’écotype du bassin du fleuve Jaune fait principalement l’objet de deux récoltes, généralement du 25 mai jusqu’au début de juin (dénommé également le coton d’été) ; la zone de coton le plus prématuré du Nord est le coton de printemps en une récolte. Le coton de saison courte est généralement cultivé dans des zones de plus grande latitude et de déficit de chaleur.
Il a été démontré que le gène CAL d’Arabidopsis thaliana appartient à la famille des gènes MADS-box, et que les CAULIFLOWER (CAL) et AP1 de l’Arabidopsis thaliana sont hautement homologues dans leur séquence et ont des fonctions se chevauchant partiellement. Le CAL est exprimé dans le méristème de fleur au début du développement de la fleur et participe à la détermination des propriétés du méristème de fleur. Les plantes transgéniques d'Arabidopsis thaliana de surexpression de CAL ont fleuri beaucoup plus tôt que le type sauvage. Le gène CAL de surexpression chez Arabidopsis thaliana peut favoriser une floraison nettement plus précoce chez Arabidopsis thaliana.
Description de l’invention
Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, l’intervention fournir l’application du gène GhCAL-D07 pour promouvoir la floraison de plantes L’invention est mise en œuvre par la solution technique suivante.
Les inventeurs ont cloné le gène GhCAL-D07 du coton à partir du Gossypium hirsutum, ce gène présente une homologie élevée avec les gènes MADS61 et MADS69 chez Gossypium hirsutum, et est homologue de CAL chez Arabidopsis thaliana. Le profil d’expression montre que ce gène est prioritairement exprimé dans les bourgeons terminaux des jeunes plantes de coton, son niveau d'expression est amélioré pendant la période de trois feuilles(période de différenciation du bourgeon à fleur) du coton, et le niveau d’expression chez les espèces précoces est significativement plus élevé que les espèces tardives; En construisant le vecteur de localisation subcellulaire, il a été constaté que ce gène était localisé dans le noyau; En construisant le vecteur de surexpression de ce gène et en le transformant chez Arabidopsis thaliana par immersion florale (Floral-dip), le boulonnage et la floraison des plantes d’Arabidopsis thaliana surexprimées ont été considérablement avancés, et la tige principale des plantes surexprimées a connu une bifurcation; La technologie de silençage génique induit par virus (VIGS) a permis de vérifier davantage la fonction du GhCAL-D07 chez le coton, et il a été constaté que les plantes réduites au silence présentaient une floraison significativement tardive par rapport à la CK dans les mêmes conditions de croissance. Par conséquent, on croit que le gène GhCAL-D07 joue un rôle important pour avancer la floraison du coton, et peut servir d’une ressource génétique favorable pour la culture du coton de courte saison. La présente invention est ainsi réalisée.
La présente réalisation a présenté l’application du gène GhCAL-D07 à la promotion de la floraison des plantes, le dit gène GhCAL-D07 a la séquence nucléotidique montrée dans SEQ ID NO:1. Le cadre ouvert de lecture de ce gène est de 714bp. L’invention concerne donc le gène GhCAL-D07 qui comprend une séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO : 1.
Dans certains modes d'application de la présente invention, la séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO:1 peut coder pour une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO : 2. Cette séquence d’acides aminés contient 237 acides aminés, la masse moléculaire relative de la protéine est de 27,07kDa, avec un point isoélectrique de 9,72.
La présente invention concerne également l’application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes, comprenant augmenter la quantité d’expression du gène GhCAL-D07 dans une plante pour promouvoir la floraison de plantes.
Ainsi, dans certains modes d’application de la présente invention, le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 est augmenté, afin de favoriser la floraison des plantes.
Dans certains modes d’application spécifiques de la présente invention, l’augmentation de la quantité d’expression du gène GhCAL-D07 dans une plante est obtenue par le procédé suivant : augmenter l’expression du gène GhCAL-D07 endogène de la plante ou surexprimer le gène GhCAL-D07 exogène dans la plante.
La surexpression du gène GhCAL-D07 exogène décrite dans un mode d’application d'une revendication spécifique fait référence au fait que le gène GhCAL-D07 est transformé dans une plante pour l’expression par médiation par Agrobacterium à l’aide d’un vecteur d’expression chez plantes.
Davantage, le gène GhCAL-D07 est transformé dans une cellule, un tissu ou un organe deplante par l’intermédiaire du vecteur d’expression chez plantes.
De manière plus approfondie, le vecteur d’expression chez plantes commande l’expression du gène GhCAL-D07 par un promoteur constitutif ou un promoteur inductible.
Plus précisément, ledit promoteur constitutif est le promoteur 35S.
Pour la présente invention, la promotion de la floraison correspond à faire avancer la période de floraisont des plantes.
Dans la présente invention, la plante est la plante de coton, le maïs, le riz, le blé ou l’Arabidopsis, notamment Arabidopsis thaliana.
Effets positifs de la présente invention :
La présente invention permet de faire avancer considérablement la floraison de l’Arabidopsis thaliana en obtenant la plante d’Arabidopsis thaliana modifiée par le gène GhCAL-D07 par transgénèse. En réduisant davantage le gène GhCAL-D07 dans le coton au silence, le résultat montre que le gène GhCAL-D07 joue un rôle clé dans la promotion de la floraison du coton.
La présente invention fournit une ressource génétique favorable à la culture du coton de courte saison.
Description des figures
Procédé
Des modes techniques sont décrites de manières plus détaillée et complète ci-après en combinant avec les figures ci-jointes et des modes de réalisation spécifiques.
Les exemples suivants servent ici à démontrer les modes de réalisation préférés de la présente invention. Les techniciens spécialisés dans ce domaine savent que les technologies dévoilées dans les exemples suivants représentent les technologies trouvées par les inventeurs et pouvant être utilisées pour l’application de la présente invention, et elles peuvent donc être considérées comme les modes préférés d’application de la présente invention. Néanmoins, les techniciens spécialisés dans ce domaine devraient savoir, conformément au présent descriptif, que les modes de réalisation spécifiques publiés ici peuvent faire l’objet de plusieurs modifications qui permettront toujours d’obtenir les mêmes résultats ou les résultats similaires sans s’écarter de l’esprit ou de la portée de la présente invention.
Sauf définition contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont les mêmes significations que celles comprises par les techniciens spécialisés dans le domaine duquel la présente invention relève, les citations publiques et les documents à partir desquels elles sont citées seront incorporées sous la forme des références.
Ces techniciens dans ce domaine reconnaîtront ou connaîtront par des essais conventionnels de nombreuses technologies équivalentes des modes d’application spécifiques de l'invention décrits ici. Ces équivalents seront inclus dans les revendications.
Exemple d’application 1
1. Matières coton
Les matières coton sélectionnées pour cet exemple d’application sont les espèces Zhong 50, Zhongmiansuo 74, Guoxinmian 11, Bomian 1 du Gossypium hirsutum, qui sont plantées dans le champ d’essai du laboratoire national clé biologique de l’Institut de Recherche sur le Coton de l’Académie des Sciences Agricoles de Chine (CAAS) (à Baibi de la ville d’Anyang), il s’agit d'une gestion normale du champ.
2. Réactifs et consommables
2.1 Enzymes et kits : L’enzyme à haute fidélité GXL DNA Polymerase, le kit de récupération de gel et le kit de purification du produit PCR sont achetés auprès de la société Takara ; le kit de transcription inverse d'ARN, l’enzyme KOD FX Neo (Code.No.KFX-201) sont achetés auprès de la société Toyobo ; le Kit de clonage Ultra One Step est acheté auprès de la société Vazyme ; le kit d’extraction mini de plasmide est acheté auprès de la société Magen ; des endonucléases de restriction (BamH I,Sac I) sont achetées auprès de la société NEB; DNAMarker III et le kit d’extraction d’ARN total de plante ont été achetés auprès de la société TIANGEN ; TransStart Top GreenqPCR SuperMix pour PCR quantitative à fluorescence est acheté auprès de la société TransGen.
2.2 Autres agents : l’agarose est un produit espagnol d’origine, la peptone, l’extrait de levure, le chloroforme, l'alcool isoamylique, l'éthanol, l’isopropanol, le chlorure de sodium, le saccharose, le silwet L-77, le résorcinol, etc. sont de pureté analytique et fabriqués en Chine, la kanamycine, le sulfate de streptomycine, l'ampicilline, etc. sont achetés auprès de la société Takara Biotechnology(Dalian) Co., Ltd., les cellules compétentes E.coli Trans5α sont achetées auprès de la société TransGen Biotech, et les cellules compétentes Agrobacterium LBA4404 sont achetées auprès de la société Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd.
2.3 Milieux de culture : milieu liquide LB : tryptone dosée à 10g/L, extrait de levure (Yeastextract) dosé à 5g/L, chlorure de sodium (NaCl) dosé à 10g/L ; milieu solide LB : tryptone dosée à 10g/L, extrait de levure (Yeastextract) dosé à 5g/L, chlorure de sodium (NaCl) dosé à 10g/L, Agar dosé à 15g/L, avec un volume constant de 1L ; milieu de sélection LB: avant le placage LB, de l’antibiotique de concentration correspondante est ajouté dès que le milieu a fait l’objet d’une stérilisation sous pression à l’aide de l’autoclave et a refroidi à 55°C, et bien secoué avant le placage. Les solutions de différents réactifs mentionnés mais non énumérés dans cet article sont tous préparées par les méthodes indiquées dans la troisième édition du Manuel d'essais pour le clonage moléculaire (Molecular Cloning : A Laboratory Manual), et les réactifs biochimiques sont de propreté analytique ou plus supérieure.
2.4 Instruments essentiels : amplificateur PCR (Eppendorf), centrifugeuse à grande vitesse (Eppendorf 5427R), appareil à électrophorèse (Beijing LIUYI), système d’imagerie sur gel (BIO-RAD), instrument PCR quantitative à fluorescence(ABI7500), microscope à fluorescence(OlympusBX43), oscillateur de culture à température constante (Shanghai Zhicheng), phytotron (Saifu),etc.
Méthode et résultats d’essai
1 Analyse bio-informatique et clonage du gène GhCAL-D07 du coton
1.1 La séquence génique du GhCAL-D07 est obtenue auprès de NCBI, les amorces sont conçues à l’aide du logiciel Primer Premier 5.0, la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) est utilisée pour l’amplification sur l’espèce Zhong 50 du Gossypium hirsutum, le cadre ouvert de lecture est de 714bp, il compte 237 acides aminés codés, la masse moléculaire relative de la protéine est de 27,07kDa, avec un point isoélectrique de 9,72. La séquence cds du gène est la suivante (SEQ ID NO:1) :
ATGGGTAGAGGTAGGGTTCAACTAAGACGGATCGAGAACAATATTAGCAGACAAGTAACATTCTCAAAGAGACGAAGTGGCTTATTAAAGAAAGCTCATGAGATCTCAGTTTTATGCGATGCTGATGTTGCTTTGATTGTTTTCTCTAACAAAGGAAAGCTCTTTGAGTTCTCTTCTGATCCCAGCATGGAGAGGATCCTAGAACGGTACGAACGACAAATATATGCCCCAACTGGTTCTGAATCACAGGCAAATTGGTCTTTGGAATCTTCCAAACTCATGTCAACTATTGAAGTCTTGCAAAGGAACTTGAGGAACTTTCGTGGAGAAGAGCTTGAACCCTTGAGTTTAAGGGACCTGCAACTTTTGGAACAACAAATTGGTAATTCTCTGAAGCGAATACGAACTAGAAAGAACAAACTCATGAATGAATCCATTTCAGTGCTGCAGAAGAGAGAAAAGACATTGCAAGACCAGAACAACATGCTAGCTAAAAAGCTTAAAGAAAAACAGCAGACACCGACGGAACATGCACAACATGAAGTGCAACAAAAATTTGTCCAAAACTCACCACCATCAACATCCGTACAACCACCAACACCACCACCGGCTGCAATACAGTTTCCTTGTTTGACTATTGGAGGGAGTTACGAAGCCATGAAAGGGACAAACAAGGAAGCTGAGCTCAATCTCAACCTAGTACCAAATCAGTGA
La séquence d’acides aminés e est la suivante (SEQ ID NO:2) :
MGRGRVQLRRIENNISRQVTFSKRRSGLLKKAHEISVLCDADVALIVFSNKGKLFEFSSDPSMERILERYERQIYAPTGSESQANWSLESSKLMSTIEVLQRNLRNFRGEELEPLSLRDLQLLEQQIGNSLKRIRTRKNKLMNESISVLQKREKTLQDQNNMLAKKLKEKQQTPTEHAQHEVQQKFVQNSPPSTSVQPPTPPPAAIQFPCLTIGGSYEAMKGTNKEAELNLNLVPNQ
1.2 Le processus spécifique de clonage génétique est comme suit :
(1) Les matières d’essai consistant en espèces précoces Zhong 50, Zhongmiansuo 74 et espèces tardives Guoxinmian 11, Bomian 1 du Gossypium hirsutum sont plantées dans la base expérimentale à Anyang de l’Institut de Recherche sur le Coton de l’Académie des Sciences Agricoles de Chine(CAAS), avec une gestion normale du champ. La méthode d’échantillonnage consiste à prélever la pointe de plante de coton à partir du moment d’aplatissement du cotylédon, un échantillon est prélevé chaque fois qu’une vraie feuille est aplatie, avec trois répétitions biologiques à chaque prélèvement, les matières prélevées sont rapidement placées dans de l’azote liquide pour une congélation et conservées au réfrigérateur à -80°C. L'aplatissement du cotylédon est marqué en 0TLS (0 true-leaf stage), l’aplatissement d’une vraie feuille est marqué en 1TLS (1 true-leaf stage), et ainsi de suite, jusqu’à ce que la cinquième vraie feuille soit complètement étalée. L’extraction d’ARN total des plantes est réalisée en utilisant le kit fabriqué par la société TIANGEN.
(2) Les étapes d’extraction d'ARN sont les suivantes :
1) Homogénéisation: prélever une quantité appropriée d’échantillon de fibres pour un broyage rapide en poudre dans l’azote liquide, secouer vigoureusement l’échantillon immédiatement après avoir ajouté 700μL de SL(ajouter du β-Mercaptoéthanol avant l’utilisation), pour mélanger uniformément l’échantillon;
2) Centrifugation à 12000rpm durant 2min;
3) Transférer le liquide surnageant vers la colonne de filtration CS, pour une centrifugation à 12000rpm durant 2min, ensuite, pipeter soigneusement du liquide surnageant dans le tube de collecte pour le transfert vers un nouveau tube à centrifuger RNase-Free, la pointe de la pipette devrait ne pas toucher des débris cellulaires dans le tube de collecte ;
4) Ajouter de éthanol absolu dont le volume est de 4 fois le volume du surnageant, et les bien mélanger, transférer le mélange vers la colonne d’adsorption CR3, pour une centrifugation à 12000rpm durant 15 secondes, jeter du rejet liquide dans le tube de collecte, et remettre la colonne d’adsorption CR3 dans le tube de collecte ;
5) Ajouter 350μL de solution de déprotéination RW1 dans la colonne d’adsorption CR3, pour une centrifugation à 12000rpm durant 15 secondes, jeter du rejet liquide dans le tube de collecte, et remettre la colonne d’adsorption CR3 dans le tube de collecte ;
6) Solution de travail DNase I: prendre 10μL de solution de réserve DNase I et 70μL de solution RDD et les mélanger doucement ;
7) Ajouter 80μL de solution de travail DNase I dans la CR3, pour un repos à température ambiante durant 15 minutes ;
8) Après le repos, ajouter 350μL de solution de déprotéination RW1 dans la colonne d’adsorption CR3, pour une centrifugation à 12000rpm durant 15 secondes, jeter du rejet liquide dans le tube de collecte, et remettre la colonne d’adsorption CR3 dans le tube de collecte ;
9) Ajouter 500μL de solution de rinçage RW (ajouter de l’éthanol avant l’utilisation) dans la colonne d’adsorption CR3, pour une centrifugation à 12000rpm durant 15 secondes, jeter du rejet liquide dans le tube de collecte, et remettre la colonne d’adsorption CR3 dans le tube de collecte ;
10) Répéter l’étape 9 ;
11) Faire une centrifugation à 12000rpm (~13400×g) durant 2 minutes, mettre la colonne d’adsorption CR3 dans un nouveau tube à centrifuger RNase-Free, instiller 30-50μL de RNase-Free ddH2O dans la partie centrale de la membrane d’adsorption, la laisser reposer durant 2 minutes, faire une centrifugation à 12000rpm (~13400×g) durant 1 minute, pour obtenir ainsi la solution d’ARN. N.B. : Le volume de la solution tampon d’élution ne devrait pas être inférieur à 30μL, un trop petit volume affectera l’efficacité de récupération. Les échantillons d’ARN devraient être conservés à -70°C. Si le rendement en ARN attendu est supérieur à 30μg, on peut verser à nouveau la solution d’ARN obtenue à l’issue de la centrifugation à l’étape 11 dans la colonne d’adsorption CR3, la laisser reposer à température ambiante durant 2 minutes, et faire une centrifugation à 12000rpm (~13400×g) durant 1 minute, pour obtenir une solution d’ARN.
(3) Synthèse d’ADNc. Transcrire de manière inverse 500ng d’ARN en ADNc, en utilisant le kit de transcription inverse FSQ-201 de Toyobo, le système de transcription inverse est le suivant :
Préparer la solution de réaction RT selon les ingrédients suivants (la préparation de la solution de réaction s’effectue sur de la glace):
5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μl
Oligo dT Primer (50 μM) 0.5 μl
Random 6 mers (100 μM) 0.5 μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O up to 10 μL
Les conditions de réaction de transcription inverse sont les suivantes :
15min à 37°C (réaction de transcription inverse) ,
5s à 98°C (réaction d’inactivation de la transcriptase inverse) ;
Diluer la solution d'ADNc du produit de transcription inverse 6 fois pour servir de la matrice de réaction PCR.
(4) Amplification par PCR du gène cible
Le système suivant est préparé sur de la glace, et le gène cible GhCAL-D07 est amplifié en prenant l’ADNc de TM-1 comme matrice. Selon le manuel d’instructions de l’enzyme à haute fidélité TaKaRa GXL DNA Polymerase, le système de réaction PCR est le suivant :
5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 μl
Primer 1 2 μl
Primer 2 4 μl
Matrice d’ADNc 2 μl
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μl
Eau distillée stérilisée jusqu’à 50 μl
Les procédures d’amplification par PCR sont les suivantes :
Conditions de réaction
98°C3min
98°C10s
56°C15s
1 min à 68°C 35 cycles
68°C10min
Séquences d’amorces :
GhCAL-D07-F : 5′-ATGGGTAGAGGTAGGGTTCAA-3′ (SEQ ID NO:3)
GhCAL-D07-R:5′-TCACTGATTTGGTACTAGGTT-3′ (SEQ ID NO:4)
Le produit sera conservé à 4°C après la fin de la réaction, et fera l’objet d’une détection par électrophorèse à 1% d’agarose, le résultat sera considéré valide si la taille de la bande répond à la taille attendue.
(5) Utiliser le kit de récupération de gel pour l’extraction de gel des fragments cibles.
(6) Connecter, conformément au Kit de clonage Ultra One Step, le produit issu de l’extraction de gel ci-dessus au vecteur T pour construire et transformer E.coli.
(7) En matière de la culture à 37°C diurne nocturne, sélectionner des monoclones sur le milieu de culture LB résistant pour un balancement et une culture à 37°C.
(8) Pour la vérification par PCR de la solution bactérienne, des échantillons de clones positifs sont prélevés et envoyés à la société GENEWIZ pour le séquençage, ajouter une certaine quantité de glycérine dans la solution bactérienne dont la séquence est correcte, de manière à ce que la concentration finale du glycérine soit d’environ 20%, avec une conservation à -70°C.
2 Construction du vecteur de surexpression chez plantes pBI121-35S::GhCAL-D07
2.1 Extraction de plasmides et digestion par enzymes
L'extraction de plasmides est réalisée en utilisant le kit d’extraction mini de plasmides de la société Magen, pour extraire des plasmides vecteur de clonage contenant des fragments du gène cible GhCAL-D07, la concentration en plasmides détectée est de 200ng/μL, le test d’électrophorèse au gel d’agarose n’a montré aucune contamination protéique, cela répond aux exigences de l’essai; en même temps, le vecteur de surexpression pBI121 est extrait pour une double digestion avec les endonucléases BamH I et Sac I, la purification après la digestion permet d’obtenir le vecteur pBI121 linéarisé.
2.2 Construction du vecteur de surexpression pBI121-35S::GhCAL-D07
Le vecteur pour cet essai est construit en utilisant le kit de clonage Ultra One Step qui s'adaptent à la connexion entre un vecteur quelconque et un fragment quelconque du gène, le temps de réaction ne dure que 15 minutes, il exige que le fragment intercalaire et le vecteur linéarisé aient une zone de chevauchement de 15bp respectivement à l’extrémité 5′ et à l’extrémité 3′.
Les amorces d’amplification sont les suivantes :
OE-GhCAL-D07F(SEQ ID NO:5):
5′-GGACTCTAGAGGATCCATGGGTAGAGGTAGGGTTCAA-3′
OE-GhCAL-D07R(SEQ ID NO:6):
5′-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCACTGATTTGGTACTAGGTT-3′
Les procédures d’opération sont comme suit : en prenant le vecteur de clonage du gène cible GhCAL-D07 comme matrice, le fragment intercalaire est purifié après l’amplification ; le fragment intercalaire obtenu GhCAL-D07 et le vecteur linéarisé pBI12 constituent un système avec un rapport molaire 2 :1.
Mélanger bien cette solution, pour une réaction à 50°C durant 10 minutes, ensuite, placer la solution sur de la glace, pour transformer des cellules compétentes Trans5α, sélectionner des monoclones et envoyer des échantillons pour le séquençage, afin d'obtenir le vecteur de surexpression contenant le gène cible correct.
La plaque utilisée pour ce processus est un milieu de culture LB résistant à la kanamycine, la kanamycine est dosée à 50mg/mL, et est diluée 1000 fois lors de l’utilisation, c'est-à-dire que 100μL de kanamycine à 50mg/mL est ajouté dans un milieu de culture de 100ml.
3 Construction et infection du vecteur VIGS de coton au gène GhCAL-D07
Le silençage génique induit par virus (Virus induced gene silence，VIGS) est un silençage génique post-transcriptionnel par médiation par ARN dépendant du mécanisme de défense des plantes contre les virus. Un fragment de 322bp du gène cible GhCAL-D07 est connecté au plasmide navette pCLCrV, un vecteur (pCLCrV-GhCAL-D07) est construit pour transformer E.coli (Escherichia Coli), des monoclones sont sélectionnés et envoyés pour être séquencés (GENEWIZ, Suzhou). Les monoclones qui ont réussi au séquençage font l’objet d’une amplification et un balancement pour extraire des plasmides. Le vecteur témoin positif (pCLCrV-VA), le témoin négatif (pCLCrV), le plasmide auxiliaire (pCLCrV-VB) ainsi que le vecteur construit contenant le fragment du gène cible GhCAL-D07 (pCLCrV-GhCAL-D07) sont respectivement utilisés pour transformer la souche d’agrobacterium (Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404. Pendant le stade où les cotylédons sont aplatis et que les vraies feuilles n’ont pas encore poussé, on fait l’injection d’Agrobacterium pour infecter les cotylédons de coton, les étapes détaillées d’opération sont celles indiquées dans le rapport relatif au silençage génique induit par virus établi par Gao et al.(2013) (Gaoetal., Functional genomic analysis of cotton genes with agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing.Methods Mol Biol(2013),975157-65 ; Gu etal., A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs incotton, Plant Biotechnology Journal(2014)12,pp.638–649, le texte est incorporé ici par citation). Les jeunes plants de coton infectés sont bien protégés de la lumière pour 24h, ARN total des feuilles de coton est extrait au bout de 40 jours, pour détecter le silençage du gène par la technologie qRT-PCR.
Les amorces d’amplification sont les suivantes :
pCLCrV-GhCAL-D07F(SEQ ID NO:7):
5′-ATGCCTGCAG ACTAGT GAAGCGAATACGAACTAGAAA-3′
SpeI
pCLCrV-GhCAL-D07R(SEQ ID NO:8):
5′-AGACCTAGGGG CGCGCC TCACTGATTTGGTACTAGGTT-3′
AscI
4 Transformation du gène GhCAL-D07 chez Arabidopsis thaliana par médiation par Agrobacterium
4.1 Les cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens LBA4404 sont transformées par congélation-décongélation, le processus de transformation spécifique est le suivant :
(1) Ajouter 1μg (2-10μL) de plasmide vecteur de surexpression du gène cible déjà construit dans 100μL de cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens LBA4404 en provenance de la société Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd., mélanger bien la solution et la refroidir dans un bain de glace pendant 30 minutes; faire une congélation rapide à l’azote liquide pour 2-3 minutes, qui est suivie d’une excitation thermique à 37°C durant 90s;
(2) Laisser refroidir dans un bain de glace pour une durée de 5 minutes, puis ajouter 800μL de milieu liquide LB;
(3) Après une culture à 190rpm à 28°C durant 4h, faire une centrifugation à 4000rpm durant 5 minutes, pipeter le liquide surnageant jusqu’à un volume restant de 400-500μL, après le pipetage et le mélange à plusieurs reprises, prendre 200μL de solution bactérienne pour l’appliquer sur le milieu sélectif à trois antibiotiques contenant de la kanamycine, du sulfate de streptomycine et de la rifampicine, pour une culture à 28°C durant 36-48h, des colonies résistantes sont visibles;
(4) Sélectionner des colonies uniques pour une culture dans 1ml de milieu liquide LB à trois antibiotiques durant environ 16h, jusqu’à ce que le milieu soit trouble;
(5) Des colonies sont soumises à la PCR et à la digestion enzymatique, pour le dépistage des souches positives d’Agrobacterium, conserver la solution bactérienne à 20% de glycérol à -80°C.
4.2 Transformation d’Arabidopsis thaliana par immersion florale
(1) Inoculer 20μL de solution bactérienne conservée à -80°C dans 1ml de milieu liquide LB, pour une culture oscillante à 180rpm à 28°C pendant toute la nuit, ensuite, prendre 200μL de solution bactérienne activée pour l’ajouter dans 20ml de milieu liquide LB pour une culture oscillante à 180rpm à 28°C ;
(2) Dès que la valeur OD de la solution bactérienne est comprise entre 1,2-1,6, centrifuger la solution bactérienne à 3000rpm pour collecter des bactéries ;
(3) La composition du médium de transformation: 5% de saccharose, 0,03% de silwet L-77 (Steven J, 1998) ;
(4) Suspendre les bactéries dans le médium de transformation ci-dessus, régler OD 600 ＝0,8 pour commencer l’infection;
(5) Placer l’inflorescence d’Arabidopsis thaliana dans le médium de transformation pour une durée de 30-50s, après l’infection, envelopper l'Arabidopsis thaliana avec un film alimentaire pour une culture sombre durant 24h suivie d’une culture dans des conditions normales, récolter les semences après maturation.
5 Identification et détection des plantes transgéniques d’Arabidopsis thaliana
5.1 Les semences récoltées sont stérilisées avec une solution de HgCl à 0,1%, et puis purifiées à 4°C durant 3-4 jours, ensuite, ces semences sont plantées sur 1/2MS contenant de la kanamycine (concentration en agar de 0,6%) , au bout d’environ 10 jours, on peut observer la différence entre les plantes positives et les plantes négatives, celles qui peuvent pousser normalement seraient des plantes positives, transplanter les plantes d’Arabidopsis thaliana qui peuvent pousser normalement vers une chambre de culture.
5.2 L’enzyme utilisée pour la sélection des plantes transgéniques est l’enzyme PCR de KOD FX Neo qui est caractérisée par le fait qu’elle peut être directement utilisée pour la PCR sur les feuilles vivantes sans nécessiter d’extraire l’ADN d’Arabidopsis thaliana. Lors de l’identification, la solution d’Agrobacterium GhCAL-D07 sert du témoin positif, et un système PCR avec de l’eau stérile comme matrice sert du témoin négatif. Les amorces utilisées pour la détection sont les suivantes :
Amorce amont F1 (SEQ ID NO:9) : 5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’
Amorce aval R1 (SEQ ID NO:10) : 5’-TGTCGTTCGTACCGTTCTAGGA-3’
Système de réaction PCR :
Autoclaved, distilled water up to 50μl
2× PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μl
2 mM dNTPs 10 μl
Amorces (10μM each) 1,5 μl
Matrice extrait brut 5μl
KOD FX Neo (1 U/μl) 1 μl
Processus d’amplification par PCR :
94°C, 2 min
98°C, 10 sec.
68°C, 60 sec./ kb 30 cycles
5.3 Prendre séparément une quantité appropriée de produits amplifiés pour une détection électrophorétique sur du gel d’agarose à 1%.
5.4 Sélectionner un total de 7 plants positifs 35S::GhCAL-D07 selon les résultats de l’électrophorèse, pour récolter des semences de génération T0.
6 Identification, observation du phénotype et statistiques des données pour les plants transgéniques
6.1 Après avoir été stérilisées, les semences récoltées sont plantées sur 1/2MS contenant de la kanamycine et puis purifiées à 4°C durant 3 jours, ensuite, ces semences sont transférées vers un phytotron, au bout d'environ 10 jours, les plants positifs poussent normalement, tandis que les plants négatifs connaissent un étiolement des cotylédons et ne poussent plus.
6.2 Les plants d’Arabidopsis thaliana positifs sont transplantés dans de petits pots, et font l’objet d’une extraction de l’ADN et d’une détection par PCR après un mois de croissance. Chaque génération de plants devront être testés pour identifier les plants positifs et les plants négatifs, jusqu’à la génération T3, pour obtenir des plants d’Arabidopsis thaliana homozygotes transgéniques.
6.3 Les plants homozygotes transgéniques de génération T3 sont destinés à l’observation du phénotype et les statistiques des données, comme le montre la figure 1 ;
En observant le phénotype des plants transgéniques de génération T3 et des plants d’Arabidopsis thaliana de type sauvage, les inventeurs constatent qu'il y a une certaine proportion de plants à surexpression 35S::GhCAL-D07 qui présentent un phénotype de branchement ou une bifurcation de la tige, alors les plants de type sauvage ne présentent pas ce phénotype (sous-figure 1, C), les inventeurs présument donc que le GhCAL-D07 peut réguler la croissance et le développement du méristème au sommet des plantes d’Arabidopsis thaliana ; la surexpression du gène GhCAL-D07 permet d’avancer significativement la floraison des plantes d’Arabidopsis thaliana (sous-figures 1A et B), de diminuer significativement le nombre de feuilles de rosette et d’augmenter le nombre de feuilles caulinaires (comme le montre la figure 2). Les analyses génétiques des plants transgéniques ont révélé : après la surexpression du gène GhCAL-D07, le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 chez les plants d’Arabidopsis thaliana augmente de manière significative.
7 Analyse sur les modèles d’expression du GhCAL-D07 dans des matières de différents stades de croissance
7.1 Les matières d’essai consistant en espèces précoces Zhong 50, Zhongmiansuo 74 et espèces tardives Guoxinmian 11, Bomian 1 du Gossypium hirsutum sont plantées dans la base expérimentale à Anyang de l’Institut de Recherche sur le Coton de l’Académie des Sciences Agricoles de Chine(CAAS), avec une gestion normale du champ. La méthode d’échantillonnage consiste à prélever la pointe de plante de coton à partir du moment d’aplatissement du cotylédon, un échantillon est prélevé chaque fois qu’une vraie feuille est aplatie, avec trois répétitions biologiques à chaque prélèvement, les matières prélevées sont rapidement placées dans de l’azote liquide pour une congélation et conservées au réfrigérateur à -80°C. L'aplatissement du cotylédon est marqué en 0TLS (0 true-leaf stage), l’aplatissement d’une vraie feuille est marqué en 1TLS (1 true-leaf stage), et ainsi de suite, jusqu’à ce que la cinquième vraie feuille soit complètement étalée.
7.2 Prélever des différents échantillons ci-dessus, pour extraire l’ARN qui est ensuite transcrit en sens inverse en ADNc, analyser le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 dans de différentes matières, tout en prenant GhActin comme gène de référence interne, les amorces pour la PCR quantitative à fluorescence sont les suivantes :
Amorce amont F1 (SEQ ID NO:11) : 5’- GGGACCTGCAACTTTTGGAAC-3’
Amorce aval R1 (SEQ ID NO:12) : 5’- GTCGGTGTCTGCTGTTTTTCT-3’
Préparer le système de réaction qRT-PCR sur de la glace, pour réaliser la réaction PCR quantitative à fluorescence.
Le système des réactions qRT-PCR est le suivant :
SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) 10.0μL
PCR Forward Primer (10 μM) 0.4μL
PCR Reverse Primer (10 μM) 0.4μL
ROX Reference Dye II (50×) 0.4μL
Matrice d’ADN 2.0μL
dH2O (eau distillée stérilisée) 6.8μL
Total 20.0μL
Procédures de réaction qRT-PCR :
Pré-dénaturation: 95°C 10 minutes,
95°C，5 sec；
60°C, 34 secondes, 40 cycles.
Recueillir des signaux fluorescents pendant la période de recuit (60°C, 34 secondes).
Le méristème terminal des plantes est similaire aux cellules souches des animaux, il se différencie sans cesse en différents tissus et organes au-dessus du sol, si les conditions internes et externes sont convenables, le méristème terminal se différenciera en bourgeons à fleur. D’après les résultats de la réaction qRT-PCR, le gène GhCAL-D07 s'exprime principalement dans les feuilles, les bourgeons terminaux et le petits boutons, et le niveau d’expression dans les feuilles est le plus élevé (sous-figure 3,A). Avec le développement du bourgeon terminal, le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 dans des matières de différents stades de croissance est de plus en plus élevé, à partir du stade pendant lequel la troisième vraie feuille se déploie, le niveau d’expression chez deux espèces précoces Zhong 50 et Yanzao 2 est significativement plus élevé que celui chez les espèces tardives (sous-figure 3, B). Cela montre que le gène GhCAL-D07 est éventuellement lié à la différenciation du bourgeon à fleur ou même au développement de l’organe floral du Gossypium hirsutum.
8. Rôle du GhCAL dans la régulation de la transition de la croissance végétative vers la croissance reproductive
Le GhCAL présente un faible niveau d’expression au niveau des racines, et un niveau d’expression le plus élevé au niveau de la cuspide de tige. L’expression du GhCAL peut également être détectée dans les feuilles, les tiges et les bourgeons (figure 4). Afin de traiter le rôle du GhCAL dans la régulation de la floraison, 3 lignées d’Arabidopsis thaliana génétiquement modifiées par 35S ::GhCAL ont été construites. L’analyse qRT-PCR avec des amorces spécifiques montre que le niveau d’expression du GhCAL chez ces lignées transgéniques est significativement plus élevé par rapport aux plants de type sauvage. Dans les conditions de longue journée, la floraison des plants d’Arabidopsis thaliana génétiquement modifiés par GhCAL est de 3 à 5 jours plus tôt que celle de type sauvage. Une partie de plants transgéniques connaissent un phénomène de bifurcation au cours de la croissance, ce qui modifie la structure des plants d’Arabidopsis thaliana. Ces résultats montrent que la surexpression du GhCAL favorise la transition des plants d’Arabidopsis thaliana à partir de la croissance végétative vers la croissance reproductrice.
Afin de confirmer davantage la fonction du GhCAL chez le coton, le vecteur d'expression de contre-sens contenant la zone codante sur toute longueur de la séquence de contre-sens GhCAL entraînée par le promoteur 35S est construit et transforme l’espèce précoce de coton ZM24. 3 lignées de coton transgéniques T3 dont le gène GhCAL est réduit au silence sont obtenues, à savoir GhCAL-RNAi-1, GhCAL-RNAi-2 et GhCAL-RNAi-3. L’analyse qRT-PCR avec des amorces spécifiques prouve que le niveau d’expression des fragments de contre-sens GhCAL chez les plants de coton transgéniques est élevé, et le niveau de transcription du GhCAL est significativement plus faible par rapport aux plants de type sauvage. Les bourgeons à fleurs des plants de coton transgéniques GhCAL-RNAi se différencient plus tard. Par rapport aux plants de type sauvage, le moment de boutonnage de 3 lignées transgéniques T3 est retardé respectivement de 14 jours, 15 jours et 12 jours, leur moment de floraison est retardé respectivement de 19 jours, 21 jours et 14 jours. Les premières branches portant des fruits des plants de type sauvage apparaissent généralement au niveau du sixième segment ou du septième segment de la tige principale, alors les premières branches portant des fruits des plants de coton transgéniques apparaissent respectivement au niveau du 11e segment, 12e segment et 10e segment. En matière de la hauteur du plant, les 3 lignées de coton transgéniques sont significativement plus courtes que les plants de type sauvage. Ces résultats montrent que la diminution du niveau d’expression du GhCAL retarde la transition du coton à partir de la croissance végétative vers la croissance reproductrice (comme le montre la figure 5).
Le niveau d’expression du GhCAL diminue significativement chez les plants à silençage du gène GhCAL-RNAi. En outre, les niveaux d’expression du GhAGL6 et du GhAP1 diminuent significativement, le gène GhCAL peut directement réguler leur expression. Les données spécifiques sont indiquées dans le tableau 1.
Tableau 1 Comparaison des caractéristiques liées à la maturité précoce entre le coton transgénique et le coton de type sauvage
9. Silençage du gène GhCAL-D07 induit par virus.
Les solutions bactériennes d’Agrobacterium de vecteur de virus témoin positif (pCLCrVA), de vecteur de virus témoin négatif (pCLCrV) et de vecteur de virus du GhCAL-D07 (pCLCrV-GhCAL-D07) sont respectivement injectées dans les cotylédons des jeunes plants de coton. Le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 chez les plants injectés est détecté quatre semaines après l’injection. Comme le montre la figure 6, après avoir été infecté par le vecteur contenant le virus pCLCrV-GhCAL-D07, le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 diminue significativement par rapport au témoin à vecteur vide. Par rapport au plante à vecteur vide pCLCrVA, le plant pCLCrV-GhCAL-D07 dont le niveau d’expression du gène GhCAL-D07 présente un phénotype de floraison tardive et a une petite taille (figure 6, A). Des études montrent que le gène GhCAL-D07 joue peut-être un rôle important pour promouvoir la floraison du coton, et peut servir d’une ressource génétique favorable pour la culture du coton de courte saison.
Évidemment, les modes de réalisation décrits ne concernent que certains modes de réalisation dans le cadre de la présente invention, et ne couvrent pas tous les modes de réalisation. Toutes les autres réalisations obtenues par tout technicien ordinaire dans ce domaine sans faire d’efforts créatifs sur la base des modes de réalisation dans la présente invention seront couvertes par la portée de protection de la présente invention.
Claims (9)
- Gène GhCAL-D07, dans lequel le gène GhCAL-D07 comprend une séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO : 1.
- Gène GhCAL-D07, dans lequel la séquence nucléotidique présentée dans SEQ ID NO : 1 peut coder pour une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO : 2.
- Application du gène GhCAL-D07 selon l’une des revendications 1 ou 2 afin de promouvoir la floraison de plantes, comprenant augmenter la quantité d’expression du gène GhCAL-D07 dans une plante pour promouvoir la floraison de plantes.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon la revendication 3, dans laquelle l’augmentation de la quantité d’expression du gène GhCAL-D07 dans une plante est obtenue par le procédé suivant : augmenter l’expression du gène GhCAL-D07 endogène de la plante ou surexprimer le gène GhCAL-D07 exogène dans la plante.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon la revendication 4, dans laquelle la surexpression du gène GhCAL-D07 exogène fait référence au fait que le gène GhCAL-D07 est transformé dans une plante pour l’expression par médiation par Agrobacterium à l’aide d’un vecteur d’expression végétal.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon la revendication 5, dans laquelle le gène GhCAL-D07 est transformé dans une cellule, un tissu ou un organe de plante.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon la revendication 6, dans laquelle le vecteur d’expression de plante commande l’expression du gène GhCAL-D07 par un promoteur constitutif ou un promoteur inductible.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon la revendication 7, dans laquelle le promoteur constitutif est le promoteur 35S.
- Application du gène GhCAL-D07 afin de promouvoir la floraison de plantes selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, dans laquelle la plante est la plante de coton, le maïs, le riz, le blé ou l’Arabidopsis.
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