CN106047831B - Crk19蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRK19蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即CRK19蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：a1)抑制植物茎叶徒长；a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。CRK19基因过表达植株，相比野生型对照植株，在ABA抑制的茎叶徒长方面表现更加敏感。本发明通过调节CRK19的表达水平来抑制植物茎叶徒长具有重要意义，通过基因工程手段获得CRK19基因高表达、茎叶徒长受到抑制的转基因作物。本发明符合农业可持续发展的目的，可以节约养分、减少化肥和农药的喷施，对于培育绿色无公害新品种提供了可能性，具有广阔的应用前景。

Description

CRK19蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种CRK19蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。

背景技术

果树、水稻、蔬菜和花卉等植物常因雨水过多或者光照时间短等因素而出现茎叶徒长现象。果树徒长除了天气因素外，其品种、苗木本身容易出现茎叶徒长，如梨树、桃树等。水稻徒长又称恶苗病，导致水稻株高变长、茎纤弱、叶片颜色变淡，严重时导致抽穗前死亡或者穗小粒少，产量损失可达30％以上。因此，抑制茎叶徒长在农业生产上具有重大的实际意义。目前控制茎叶徒长的一般手段是通过改善植物栽培条件、加强田间管理以及喷施农药等，但是这些方法具有工作量大、污染环境等特点。因此，培育茎叶徒长受到抑制的新品种变得越发重要，而且随着近年来分子生物学和植物激素作用机制研究的不断深入，通过基因工程向植物中导入外源基因来调控植物的生长发育已经成为现实。

脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是传统的五大植物激素之一，因其具有促进叶片和果实脱落而得名。在植物体内合成ABA的主要组织器官是种子、根尖、果实和花器官；在细胞内，ABA的合成起始于质体，通过β-类胡萝卜素(C40)裂解而成的。ABA有顺式和反式两种旋光异构体，在植物体内有活性并且起主要作用的是S-(+)-ABA。ABA可以通过调控气孔运动以及抗性物质的积累来增强植物对非生物胁迫的抗性。在植物的生长发育过程中，ABA具有抑制种子萌发、抑制幼苗生长、抑制主根发育及促进叶片衰老和脱落等作用。近年来，ABA信号转导机制有了长足的进步，许多参与到ABA信号通路里的关键调节子被鉴定出来，包括ABA受体以及ABA响应基因。这些ABA信号通路调节子的发现有助于人们更深的理解ABA信号转导机制，并且有助于将其应用与农业生产实践。

类受体蛋白激酶RLKs(Receptor-like kinases)已被报道广泛参与调控植物的生长发育和响应外界环境胁迫，包括调控植物育性、根系生长、茎的生长、细胞分化、激素信号转导以及抗病过程等。典型的类受体蛋白激酶由胞外结构域(Extracellular domain)、单次跨膜结构域(Transmembrane domain)和胞内激酶结构域(Cytoplasmic kinase domain)三部分组成。胞外结构域的功能一般是感受外界信号或刺激，并将信号传递给胞内结构，以使细胞对刺激做出反应；单次跨膜结构域起到传递胞外信号和支持固定的作用；胞内激酶结构域的功能主要是磷酸化下游底物，进而起到传递信号的作用。富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶CRKs(Cysteine-rich receptor-like protein kinases)是RLKs的一个亚家族，其胞外区域有保守的富含半胱氨酸的C-8X-C-2X-C结构域，这种结构域的功能可能与蛋白之间的互作有关系。CRKs的功能也逐渐被阐释，已有研究表明CRKs参与植物对生物胁迫和非生物胁迫的响应过程。CRK19基因在拟南芥tair网站上的基因号为AT4G23270(https://www.arabidopsis.org/)。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRK19蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用。所述茎叶徒长即农作物、果树或者花卉园艺植物茎叶发育过望并且导致土壤养分过度浪费以及产量降低的现象。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK19蛋白)在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

B.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK19蛋白)的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)抑制植物茎叶徒长；

a2)选育茎叶徒长受到抑制的植物品种。

在本发明中，以上a2)中的所述选育茎叶徒长受到抑制的植物品种的方法，具体可包括将所述CRK19蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育茎叶徒长受到抑制的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育茎叶徒长受到抑制的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CRK19蛋白)的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比茎叶徒长受到抑制。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即CRK19基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第31至1968位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2823个核苷酸组成，为所述CRK19基因在拟南芥基因组中序列，其中第797-887、1026-1116、1239-1528、1740-1822、2061-2143及2298-2383位均为内含子序列；序列2由2099个核苷酸组成，为所述CRK19基因的cDNA序列，其中第31-1968位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由645个氨基酸残基组成。

在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述CRK19基因插入pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点Sma I与Kpn I之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述CRK19基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的再一个目的是提供一种抑制植物茎叶徒长的方法。

本发明所提供的抑制植物茎叶徒长的方法，具体可包括如下步骤：

(1)向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；

(2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中或者向所述转基因植物喷施外源ABA。

在步骤(2)中，所述ABA在所述基质中的含量为0.5μM。所述基质具体可为培养基(如MS培养基)或土壤。

在所述方法中，所述抑制植物茎叶徒长具体体现为：在0.5μM ABA条件下，与所述受体植物相比，所述转基因植物的子叶转绿受到抑制(所述转基因植物的子叶转绿率显著低于所述受体植物)。

另外，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述蛋白质的编码基因在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

b1)降低植物对ABA的耐受性；

b2)选育对ABA耐受性降低的植物品种。

在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。

进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。

在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Sma I和Kpn I之间插入序列2的第31-1965位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。

本发明研究结果表明CRK19蛋白正调节ABA信号转导。实验证明，相比野生型对照植株，CRK19基因过表达植株的茎叶以及根系生长受到明显抑制，因此，可以通过基因工程的方法获得CRK19基因高表达、茎叶徒长受到抑制的转基因作物。本发明符合农业可持续发展的目的，可以节约养分、减少化肥和农药的喷施，对于培育绿色无公害新品种提供了可能性，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测过表达材料中CRK19mRNA的表达情况。

图2为ABA对CRK19过表达植株幼苗生长的影响分析结果。A表示野生型Col-0以及CRK19基因高表达株系C19OE-1和C19OE-2在MS平板上培养10天后的子叶转绿情况。B表示野生型Col-0以及CRK19基因高表达株系C19OE-1和C19OE-2在含有0.5μM ABA的MS平板上培养10天后的子叶转绿情况。C是对A和B的统计结果。D表示野生型Col-0和转空载体株系GFP-OE在MS平板(左图)和含有0.5μM ABA的MS平板(右图)上培养10天后的子叶转绿情况。E是对D的统计结果。误差线表示标准误差(SE)，不同字母代表同一ABA浓度下各处理之间差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination byagroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。

拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)的产品。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6bgene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。

实施例1、CRK19转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的CRK19基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2823个核苷酸组成，为所述CRK19基因在拟南芥基因组中序列，其中第797-887、1026-1116、1239-1528、1740-1822、2061-2143及2298-2383位均为内含子序列；序列2由2099个核苷酸组成，为所述CRK19基因的cDNA序列，其中第31-1968位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由645个氨基酸残基组成。

一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK19的构建

提取拟南芥野生型(Col生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约2000bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第31-1965位核苷酸序列。

引物1：5’-TCCCCCGGGATGTCTTCTCTGATCTCTTTC-3’(下划线部分为Sma I的识别位点，该序列的第10-30位为序列2的第31-51位)；

引物2：5’-GGGGTACCACGAGGAGTTACACGAGTAATG-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，该序列的第9-30位为序列2的第1944-1965位的反向互补序列)。

用限制性内切酶Sma I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Sma I和Kpn I之间插入序列2的第31-1965位所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-CRK19。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK19中，启动所述CRK19基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK19的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的CRK19基因为模板。

二、CRK19转基因拟南芥的获得及鉴定

1、CRK19转基因拟南芥植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK19导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2(同上)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有CRK19基因(PCR目的条带大小为2000bp左右)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK19。

采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK19转化拟南芥野生型(Col生态型)。

转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-CRK19的拟南芥植株(T₁代)。

实验同时设置向拟南芥野生型(Col生态型)中转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照。

2、CRK19转基因拟南芥鉴定

(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝CRK19转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。

(2)转基因拟南芥C19OE-1和C19OE-2纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，从中随机选择二个单拷贝CRK19转基因拟南芥株系，分别记为C19OE-1和C19OE-2(T₁代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因拟南芥C19OE-1和C19OE-2的纯合系植株，作为实验材料进行后续实验分析。

三、转基因拟南芥C19OE-1和C19OE-2纯合系中CRK19基因表达量分析

提取拟南芥野生型(Col-0生态型)和过表达植株(C19OE-1和C19OE-2)的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中CRK19基因在转录水平上表达情况。具体如下：

1、转录水平分析(RNA表达量)

以上述获得的转基因拟南芥植株(C19OE-1和C19OE-2)及拟南芥野生型(Col-0生态型)为实验材料。取生长4周左右的拟南芥幼苗，提取RNA并且反转录cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析CRK19基因在各实验材料中的表达情况。

其中，扩增CRK19基因的引物序列为：

CRK19RT-F1：5’-GACTGTCTGAAAATAGGCATC-3’(序列2的第649-669位)；

CRK19RT-R1：5’-CCTTCTCATTAAGCGTCC-3’(序列2的第902-919位的反向互补序列)。

以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：

Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

上述引物的反应条件如下:

(1)反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。

(3)反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

(4)数值分析，以2^-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中CRK19基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。

CRK19相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，CRK19基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中CRK19基因的表达为1。从图中可以看出，转基因拟南芥C19OE-1和C19OE-2中CRK19mRNA表达量均显著高于野生型(Col-0)中CRK19mRNA表达量(P<0.05)。

实施例2、CRK19转基因植物幼苗生长试验分析

ABA是植物抵抗外界逆境胁迫的重要信号分子，具有广泛生理效应。ABA可以促进种子成熟和休眠过程以及种子成熟过程中贮藏蛋白的积累、抑制种子萌发和幼苗生长、抑制主根发育、促进侧根发育以及促进叶片衰老和脱落等。因此当有外源ABA存在的条件下，植物的根长和茎叶的生长受到明显抑制，根据野生型与CRK19转基因植物对ABA的敏感性可以检测CRK19是否参与到ABA抑制的茎叶徒长过程。

将野生型拟南芥(Col-0生态型)、实施例1得到的单拷贝插入的T₃代纯合体C19OE-1和C19OE-2的种子直接播种在无ABA和含有0.5μM ABA的MS板子上(每种实验材料播种80-100粒)，4℃层积3天，然后放在光照培养箱中正常培养5天后拍照并且统计子叶转绿情况。实验重复3次，误差线表示标准误差(SE)，不同字母代表同一ABA浓度下各处理之间差异显著(P<0.05)。

实验同时设置向拟南芥野生型(Col生态型)中转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照(空载对照),即GFP-OE株系。

结果如图2所示，在无ABA的条件下，CRK19高表达株系C19OE-1和C19OE-2以及野生型拟南芥(Col-0生态型)的子叶均转绿，它们之间的子叶转绿率没有差异(P>0.05)。当有ABA(0.5μM)存在时，各种基因型的子叶转绿率均受到抑制，但是实施例1得到的单拷贝插入的T₃代纯合体CRK19转基因株系C19OE-1和C19OE-2相对于野生型拟南芥(Col-0生态型)受到抑制的程度更高(P<0.05)。而对于空载对照植株GFP-OE，无论是在无ABA的条件下，还是在有ABA(0.5μM)存在的条件下，其子叶转绿率与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异(P>0.05)。

综合以上结果，相对于野生型Col-0，实施例1得到的T₃代纯合体CRK19转基因株系(C19OE-1和C19OE-2)在ABA抑制的子叶转绿方面更加敏感，表现出ABA超敏表型，由于子叶转绿变慢会直接导致茎叶生长受到抑制，因此这在农业生产上可应用与抑制作物的茎叶徒长，也可以抑制园艺植物和果树的徒长，从而起到保持养分的作用。

Claims (2)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述蛋白质的编码基因在如下任一中的应用：

b1）降低植物对ABA的耐受性；

b2）培育对ABA耐受性降低的植物品种；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下1）或2）或3）：

1）序列表中序列2自5’末端第31至1968位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子。