CN104592374A - Ztl蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ZTL蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用为由序列3所示蛋白质在如下任一中的应用：a1)调控植物抗旱性；a2)选育抗旱性降低或提高的植物品种。ZTL基因突变株，相比野生型对照植株，对干旱逆境胁迫的耐受性显著提高。本发明对植物抗干旱分子机制的研究具有重要意义，在提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性和耐受性，及作物抗干旱品种的选育等方面具有广阔的应用前景。

Description

ZTL蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种ZTL蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术
陆生植物在整个生长发育阶段都有可能受到外界多种逆境胁迫的影响，其中干早、盐碱、低温等非生物胁迫是强烈制约植物生长和作物产量的重要因素。由于植物是固着生物，面对不良环境时不能像动物通过移动位置来躲避不良环境，所以植物为生存进化出一系列抵抗逆境胁迫的策略。有关植物抗逆性的研究一直是植物学领域的研究的热点。传统的育种技术培育和改良耐胁迫性状难度相对较大，不能很好的得到更多优良的抗旱品种。而随着分子生物学技术的发展，以及对植物抗逆分子机制的深入研究，分子水平抗逆基因工程取得重大进展。采用转基因等基因工程手段向植物导入抗逆性外源基因已成为改良植物抗逆性的新途径之一。研究植物抗逆分子调控网络以及培养出更多优良抗旱品种具有非常广阔的前景和十分重要的意义。
植物对逆境的适应过程涉及到多种信号传导途径，植物激素可能作为启动抗逆基因表达的关键激素。脱落酸(abscisic acid，ABA)作为最重要的植物激素之一，广泛的参与调控植物生长发育的各个阶段，包括种子萌发，幼苗生长，气孔运动，以及由营养生长向生殖生长转换等多个方面。同时，ABA在植物抵抗外界各种逆境胁迫过程中起着重要作用，尤其是在盐、干旱、低温以及渗透胁迫等过程中。植物响应ABA的过程非常复杂，随着科学研究的发展，更多参与ABA信号通路基因被大量发现，一个崭新的ABA信号网络逐步呈现在人们面前。
光是影响植物生长发育最重要的环境因子之一，主要是通过光强、光量、光质、光向和光周期来影响植物的生长发育过程。光信号通过光受体进入生物钟，使中央振荡器产生振荡，从而改变生物钟的输出信号，引起植物各种生理生化反应。光调控植物从种子萌发到开花过程的每个阶段。
生物钟(circadian clock)是指生物体存在的昼夜节律的调控机制，它使生物的基因表达、生理生化行为及新陈代谢表现出以近似24h为周期的昼夜节律性，这个昼夜调控机制在大多数生物体中都存在，最早由法国天文学家Mairan观察到植物的“睡眠运动”，通过简单的实验，认为这种运动受植物内源性控制。植物生物钟研究，尤其是在拟南芥中关于生物钟分子机制的研究已取得了很大的进展。为了便于对生物钟的理解，高等植物体内生物钟被人为简单地化分为3个功能组分：(1)输入途径(inputpathway)根据外界的光照、温度、水分等环境信号通过光受体或信号分子向中央振荡器初步传输的过程；(2)中央振荡器(central oscillator)，控制并产生近似24小时的昼夜节律振荡(3)输出途径(output pathway)，产生与昼夜节律一致的振荡，这3个组分相互联系相互影响，并在各组分之间存在着重叠，其中中央振荡器是生物钟的核心部分。
目前为止共发现3类蓝光受体，它们分别是：隐花色素(CRY1，CRY2，CRY3)，趋光色素(phot1、phot2)及含LOV/F-box/Kelch结构蓝光受体(ZTL，FKF，LKP2)。这8个蓝光受体，是光信号的一个输入因子，通过它们共同感受外界环境中光的变化，从而调节植物自身生理发育过程。ZTL、FKF和LKP2它们介导一些关于生物钟或者开花相关的基因的表达或蛋白的降解。作为光受体FKF1是目前研究的相对较为透切。fkf1突变体在长日条件下是晚花，在蓝光及红光下较之野生型其下胚轴变短。FKF1的mRNA是生物钟调控的，但是其本身没有任何生物钟的功能，这也许是因为它是生物钟输出基因。研究发现FKF1调控CO的表达，其中蓝光起着增强性的作用。CDF1是CO转录的抑制子，FKF1作为CDF1的E3在蓝光下特异地结合，并泛素化CDF1，使其被26S蛋白酶体降解。ZTL作为TOC1与PRR5(PSEUDORESPONSEREGULATOR 5)的E3促进它们通过26S蛋白酶体降解。ZTL、FKF1都是蓝光依赖地与GI(GIGATEA)相互作用，进而使得两个蛋白在蓝光下变的更稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种ZTL蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(ZTL蛋白)在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物抗旱性；
a2)选育抗旱性降低或提高的植物品种。
B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(ZTL蛋白)的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物抗旱性；
a2)选育抗旱性降低或提高的植物品种。
在本发明中，以上a1)中的所述调控植物抗旱性均体现为：ZTL蛋白的表达量越高，则所述植物的抗旱性越弱；ZTL蛋白的表达量越低，则所述植物的抗旱性越强。
在本发明中，以上所有a2)中的所述选育抗旱性降低的植物品种的方法，均具体可包括将所述ZTL蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤；所述选育抗旱性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述ZTL蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。
其中，所述ZTL蛋白的表达量为具有正常功能的未突变的ZTL蛋白的表达量。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法为如下(A)或(B)：
(A)培育抗旱性降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性降低。
(B)培育抗旱性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即ZTL基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第171至2000位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列1由3164个核苷酸组成，为所述ZTL基因在拟南芥基因组中序列，其中第416-1245位均为内含子序列；序列2由2334个核苷酸组成，为所述ZTL基因的cDNA序列，其中第171-2000位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由609个氨基酸残基组成。
在所述(A)的方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pRTL2、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将所述ZTL基因插入pRTL2载体的多克隆位点Kpn I与BamH I之间后得到的重组质粒。
在上述方法中，将携带有所述ZTL基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物(如十字花科植物)，也可为单子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为十字花科植物拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(C24生态型)。
在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pRTL2载体的多克隆位点Kpn I与BamH I之间插入序列2的第174-2000位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
实验证明，ZTL基因突变株，相比野生型对照植株，对干旱逆境胁迫的耐受性显著提高，而ZTL转基因植株，对干旱逆境胁迫的耐受性在显著降低。本发明对植物抗干旱分子机制的研究具有重要意义，在提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性和耐受性，及作物抗干旱品种的选育等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为ZTL基因突变体ztl-1的示意图。ztl-1点突变体突变位点位于ZTL基因第二个外显子区域，即序列1中从起始密码子(ATG)开始第2103个碱基G突变为A，导致序列3中第425个氨基酸天冬氨酸(D)置换为天冬酰胺(N)，从而使ZTL蛋白功能发生变化(Somers D E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes aNovel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.Cell,2000(101),319-329)。
图2为western blot检测ZTL过表达材料中ZTL蛋白的表达情况。
图3为ZTL各遗传材料在MS培养基生长10天的情况。
图4为ZTL各遗传材料在ABA促进气孔关闭实验中的反应情况。*表示与C24组相比，差异极显著(P<0.05)；**表示与C24组相比，差异极显著(P<0.01)。
图5为ZTL各遗传材料在植株离体失水实验中的反应情况。
图6为ZTL各遗传材料在干旱实验中的反应情况。
图7为ZTL各遗传材料在复水后的存活率情况。**表示与C24组相比，差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
pRTL2载体：由Andrew J.Leinicke教授赠送(记载文献：Carrington J C,Freed DD,Leinicke A J.Bipartite Signal Sequence Mediates Nuclear Translocation of the PlantPotyviral Nla Protein.The Plant Cell,1991(3),953-962.)在pRTL2载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pRTL2载体中，含有YFP基因(Clontech,http://www.clontech.com/)。
拟南芥野生型(C24生态型)：拟南芥野生型种子，为拟南芥生物研究中心(ABRC)产品。
ZTL突变体ztl-1种子：由Steve A.Kay教授赠送，背景为C24(记载文献：SomersD E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PASProtein from Arabidopsis.Cell,2000(101),319-329)。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant CellReports,1992(11):192-195.)。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。
GFP蛋白鼠源单克隆抗体：由北京亚太恒信生物公司提供，货号ZA009，由于YFP蛋白是GFP蛋白的衍生变种蛋白，蛋白质序列上只有几个氨基酸的区别，所以GFP抗体可以同时识别GFP和YFP(记载文献：Wu XY,Shi YP,Li JR,et al.A role for theRNA-binding protein MOS2in microRNA maturation in Arabidopsis.Cell Research,2013(23),645-657)。
实施例1、ZTL转基因植物的获得及鉴定
本实施例中所涉及的ZTL基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由3164个核苷酸组成，其中第416-1245位为内含子序列；所述ZTL基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2334个核苷酸组成，其中第171-2000位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由609个氨基酸残基组成。
一、重组表达载体pRTL2-ZTL的构建
提取拟南芥野生型(C24生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1800bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第174-2000位核苷酸序列(ZTL基因的编码序列，ORF)。
引物1：5’-CGGGGTACCGGGAGTGGGACAGTGGTTC-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，该序列的第12-28位为序列2的第174-190位)；
引物2：5’-CGCGGATCCCTTACGTGAGATAGCTCGC-3’(下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第11-28位为序列2的第1983-2000位的反向互补序列)。
用限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pRTL2载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pRTL2载体的酶切位点Kpn I和BamH I之间插入“GG+序列2的第174-2000位+G”所示DNA片段的重组质粒命名为pRTL2-ZTL。在重组表达载体pRTL2-ZTL中，启动所述ZTL基因转录的启动子为35S启动子。
在重组表达载体pRTL2-ZTL的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的ZTL基因为模板。
二、ZTL基因突变体鉴定
ZTL突变体，将其命名为ztl-1，由Steve A.Kay教授赠送，通过EMS诱变得到的点突变突变体，通过PCR技术鉴定出纯合体。
ztl-1突变体中的ZTL基因(序列1)从起始密码子(ATG)开始第2103位G突变为了A(图1)，导致序列3中第425个氨基酸天冬氨酸(D)置换为天冬酰胺(N)，从而使ZTL蛋白功能发生变化，丧失了其原有的功能(Somers D E,Schultz T F,Milnamow M,et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein fromArabidopsis.Cell,2000(101),319–329)。
所用引物序列如下：
ZTL-WT-F：5’-CCGGCGTTCTTCTAAGTG-3’；
ztl-1-F：5’-CCGGCGTTCTTCTAAGTA-3’；
ZTL-R(gen)：5’-ACACACCTCCAACAAGGCTC-3’。
三、ZTL转基因拟南芥的获得及鉴定
1、ZTL转基因拟南芥及转入pRTL2空载体的拟南芥植株的获得
将步骤一构建的重组表达载体pRTL2-ZTL及pRTL2空载体通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有ZTL基因(PCR目的条带大小为1800bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pRTL2-ZTL；将转入pRTL2空载体的农杆菌GV3101命名为空-YFP/pRTL2。
采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pRTL2-ZTL(或空-YFP/pRTL2)转化拟南芥野生型(C24生态型)。
转化后进行basta抗性筛选，在含12mg/L basta的MS培养基上培养，收集具有basta抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有basta抗性的两种转基因苗，即转入pRTL2-ZTL的拟南芥植株和转入pRTL2空载体的拟南芥植株(T1代)。
2、ZTL转基因拟南芥鉴定
(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计basta抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝ZTL转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
(2)转基因拟南芥OE纯合系的筛选
经上述鉴定分析后，因为已有文献报道在拟南芥中过表达ZTL基因会导致拟南芥幼苗下胚轴增长(Somers D E,Kim W-Y,Geng R S.The F-Box Protein ZEITLUPEConfers Dosage-Dependent Control on the Circadian Clock,Photomorphogenesis,andFlowering Time.The Plant Cell,2004(16),769–782.)，所以反过来就是只要转入ZTL基因下胚轴增长的拟南芥就是ZTL基因过表达的转基因植株。所以从其中下胚轴增长的单拷贝ZTL转基因拟南芥株系中随机选择一个，记为OE(T1代)，播种于含12mg/L bastaMS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具basta抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE纯合系植株，作为实验材料进行以下抗旱性试验分析。
三、转基因拟南芥OE纯合系中ZTL基因蛋白表达分析
提取拟南芥野生型(C24生态型)、T3代转基因拟南芥OE的总蛋白，同时以转入pRTL2空载体的植株为对照，利用免疫印迹技术，检测转基因拟南芥OE和对照中ZTL蛋白的表达情况。具体如下:
1、ZTL蛋白表达检测
(1)拟南芥总蛋白提取
1)取适量植物材料(平皿中生长12天)，在液氮中充分研磨，粉末移入遇冷的离心管中，称重并记录；
2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在旋转仪上4℃上下颠倒混匀15分钟分钟；
3)4℃下12000rpm离心2次，每次10分钟，取上清，液氮速冻，-80℃保存。
(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE
1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；
2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：
分离胶配方
浓缩胶配方
3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL l×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。
(3)蛋白质免疫印迹Western blot
1)按照Bio-Rad湿转法转膜的要求进行电泳(100mA恒流电泳8～10h)，将胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上；
2)用丽春红染色液染硝酸纤维膜2分钟，检测蛋白提取是否有问题，以及是否转到硝酸纤维膜上。
3)用水将膜上的丽春红染色液完全洗掉。
4)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；
5)封闭结束后，把膜放入一抗(GFP蛋白抗体，鼠源单克隆抗体)溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；
6)用TBSTl洗膜3次，每次l0min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
7)把膜放入二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品名称为AlkalinePhosphatase Horse Anti-Mouse IgG(H+L)，货号为ZB-2310，为马抗鼠抗体)溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；
8)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
9)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；
10)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH2O中，终止反应。
实验以Rubisco为对照。
ZTL蛋白表达的分析结果如图2所示。以Rubisco为对照，拟南芥野生型(C24生态型)和ZTL过表达植株OE中Rubisco量是一样的，证明野生型(C24)和ZTL过表达植株OE总蛋白提取没有问题，因为拟南芥野生型(C24生态型)中没有GFP蛋白，所以用GFP一抗孵育，拟南芥野生型(C24生态型)中检测不到信号，而ZTL过表达植株OE能检测到大小约为93KD的ZTL-YFP蛋白(标签蛋白YFP的大小约为27KD，ZTL蛋白大小约为66KD)。另外，由于转入pRTL2空载体的植株也表达了GFP抗体能够检测的YFP标签蛋白，所以也有检测信号，其条带大小约为27KD。各遗传材料所检测的结果，包括条带大小，均与预期结果一致。以上结果说明ZTL过表达植株OE中确实表达了ZTL蛋白。另外，图3所示ZTL各遗传材料在MS培养基生长10天的情况，可以看出ZTL转基因植株相对于拟南芥野生型(C24生态型)下胚轴增长，也进一步证明了ZTL过表达植株OE中ZTL基因表达量提高，确实为过表达系(Somers D E,Kim W-Y,Geng R S.The F-Box Protein ZEITLUPE ConfersDosage-Dependent Control on the Circadian Clock,Photomorphogenesis,and FloweringTime.The Plant Cell,2004(16),769–782.)。
实施例2、ZTL转基因植物抗干旱性分析试验
ABA是植物抵抗外界逆境胁迫的重要信号分子。在干旱条件下，ABA能够通过调节气孔保卫细胞的离子通道促进气孔关闭以减少水分流失。钙离子、蛋白激酶、磷酸酶等均参与ABA介导的保卫细胞信号转导及ABA相关抗逆基因的信号调控。因此利用ABA诱导气孔运动实验、离体叶片失水实验和干旱实验检测ZTL在ABA调控植株干旱胁迫响应的过程中是否发挥作用。
1、ABA促进气孔关闭实验
将生长3-4周左右的拟南芥野生型(C24生态型)、ztl-1突变体和实施例1得到的T3代纯合体OE的叶片浸于表皮条缓冲液中，用200μmol·m-2·s-1光强的冷光源照射2.5h使叶片气孔开到最大值，撕取叶片表皮条，在显微镜下观察并记录气孔开放情况。再将C24、ztl-1和OE的叶片浸入20μM含有ABA的表皮条缓冲液中，相同条件下，在光照1h和3小时时，分别撕取叶片下表皮，在显微镜下观察并记录气孔开度。实验同时设置实施例1得到的转入pRTL2空载体的植株作为对照。实验重复3次。
结果如图4所示，在冷光源照射2.5h后，C24、ztl-1和OE气孔的起始大小基本相同，ABA处理3小时后，ztl-1气孔关闭强度大于C24(P<0.05)，表现对ABA超敏；ABA处理1小时和3小时后，OE气孔关闭强度明显小于C24(P<0.01)，表现对ABA脱敏；表明ZTL在ABA诱导气孔关闭过程中具有负调节作用。而转入pRTL2空载体的植株其气孔关闭强度在各相同时间点均与C24基本一致，无统计学差异。
2、植株离体失水实验
将土中生长2-3周发育完全的拟南芥野生型(C24生态型)、ztl-1突变体和实施例1得到的T3代纯合体OE幼苗放在塑料平皿内，每个平皿放入3棵幼苗，一次实验内每个样品做3个重复，将所以样品置于超净工作台内，打开平皿的盖子，打开超净工作台风机，前两个半小时，每隔半小时称重一次，然后每隔一个小时称重一次，计算叶片失水率。实验同时设置实施例1得到的转入pRTL2空载体的植株作为对照。实验重复3次。
实验结果如图5所示，在相同时间点，ztl-1相对于C24失水速率略微慢一些，可能是因为ztl-1是点突变的突变体而不是T-DNA插入的突变体的缘故；而OE在相同时间点失水速率相对于C24明显快很多，该实验进一步验证了ZTL是ABA调节叶片气孔运动中的负调节子。而转入pRTL2空载体的植株其失水速率在各相同时间点均与C24基本一致，无统计学差异。
3、干旱实验
将拟南芥野生型(C24生态型)、ztl-1突变体和实施例1得到的T3代纯合体OE平皿中生长12天的幼苗移入土壤，正常浇水一周后进行干旱实验。把幼苗分为正常浇水的对照组和停止浇水的干旱组进行观察记录。生长3周左右待出现表型差异后拍照记录，然后将进行干旱实验组进行复水实验，复水3天后，统计复水后各种遗传材料的存活率(各遗传材料数量均为80-100株)。实验同时设置实施例1得到的转入pRTL2空载体的植株作为对照。实验重复3次。
结果如图6所示，18天后，对照组中各植株生长没有明显差异。干旱组中OE与C24相比，叶片萎蔫更加严重，几乎已经失水致死，表现出不耐旱性。ztl-1植株较C24生长相对正常，对干旱胁迫的敏感性降低，表现出抗旱性。如图7所示，干旱组复水3天后，OE与C24相比存活率明显低很多(P<0.01)；而ztl-1植株相对于C24存活率明显高很多(P<0.01)。

Claims (7)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物抗旱性；
a2)选育抗旱性降低或提高的植物品种。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a2)任一中的应用：
a1)调控植物抗旱性；
a2)选育抗旱性降低或提高的植物品种。
3.培育转基因植物的方法，为如下(A)或(B)：
(A)培育抗旱性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性降低；
(B)培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。
4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第171至2000位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述(A)中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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