CN105461791B - Myb37蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即MYB37蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：a1)提高植物的胎萌抗性；a2)选育胎萌抗性提高的植物品种。本发明可通过调节MYB37的表达水平控制植物种子的萌发率，通过基因工程手段获得MYB37基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于提高种子食用品质和贮藏品质等方面具有重要的实用价值和市场前景。

Description

MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用。
背景技术
植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)早在20世纪60年代被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落而得名。ABA在植物生长发育的各阶段都发挥重要作用，包括种子休眠、种子萌发、幼苗生长、气孔运动以及营养生长向生殖生长转换等过程；同时，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫响应中也起着重要作用，例如干旱、高盐、冷和机械伤害等非生物胁迫，以及病虫害等生物胁迫。
近30年来，植物中ABA受体及其信号转导功能组分的筛选与鉴定、ABA生物代谢及转运以及ABA信号转导通路模型的构建及与其它植物激素间的交叉对话等研究均取得了重要进展，有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同的ABA受体或候选受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、G蛋白偶联受体GTG1和GTG2以及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体。ABAR/CHLH是第一个被鉴定出来的植物ABA受体；研究表明：ABAR/CHLH介导的ABA信号通路非常复杂，转录因子WRKY18/40/60和伴侣蛋白CPN20被报道参与其中。
MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域通常含有1-4个不完全重复的氨基酸序列(R)，每一个重复序列R中大约有52个氨基酸，形成3个α螺旋，每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸(W)残基，所以每一个重复中共有3个规则间隔色氨酸。MYB转录因子在动植物中都存在；目前为止，拟南芥中已鉴定出超过200个以上MYB转录因子，MYB转录因子广泛参与调控植物响应外界各种逆境胁迫、植物次生代谢调控、细胞形态发生、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。目前为止，拟南芥中已报道的参与ABA信号通路中的MYB转录因子有：MYB2、MYB7、MYB15、MYB20、MYB30、MYB33、MYB44、MYB52、MYB96和MYB101；这10个参与调节ABA信号转导的MYB转录因子中，只有MYB7、MYB20和MYB30是负调节子，其余均为正调节子。MYB37在拟南芥tair网站上的基因号为AT5G23000(https://www.arabidopsis.org/)，MYB37被报道调控侧生分生组织形成和营养阶段的发育。
植物对ABA信号的响应水平还与种子胎萌相关。种子胎萌是指种子收获前早萌现象，泛指种子收获前在田间母体植株上发芽的现象。水稻、小麦、油菜、玉米等禾本科植物，收获时如遇雨和高温，种子收获前在田间母体植株上会出现提前发芽的胎萌现象，胎萌消耗其部分营养和贮藏物质，致使种子食用品质、贮藏品质下降，严重劣化了种子的品质、种用价值和耐贮性，将给农业生产造成较大的损失。种子的胎萌现象取决于种子的休眠特性，而ABA是种子休眠的主导因素，对ABA反应不敏感可导致种子胎萌的发生。
随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物种子萌发、避免胎萌现象、提高种子品质和耐贮性成为研究前沿。
发明内容
本发明的目的是提供一种MYB37蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用。
本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(MYB37蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：
a1)提高植物的胎萌抗性(或降低植物种子的萌发速率)；
a2)选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速率降低的植物品种)。
B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(MYB37蛋白)的编码基因在如下a1)或a2)中的应用：
a1)调控植物的胎萌抗性(或调控植物种子的萌发速率)；
a2)选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速率降低的植物品种)。
在本发明中，以上a2)中的所述选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速率降低的植物品种)的方法，具体可包括将所述MYB37蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，为培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法(或培育种子萌发速率降低的转基因植物的方法)，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高(或种子萌发速率降低)；
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即MYB37基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列1由1793个核苷酸组成，为所述MYB37基因在拟南芥基因组中序列，其中第236-327及458-854位均为内含子序列；序列2由1304个核苷酸组成，为所述MYB37基因的cDNA序列，其中第100-1089位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由329个氨基酸残基组成。
在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将所述MYB37基因插入pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点Xba I与Kpn I之间后得到的重组质粒。
在上述方法中，将携带有所述MYB37基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本发明的再一个目的是提供一种降低植物种子萌发速率的方法。
本发明所提供的降低植物种子萌发速率的方法，具体可包括如下步骤：
(1)向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物，所述转基因植物表达由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中。
在步骤(2)中，所述ABA在所述基质中的含量为0.5-3μM。所述基质具体可为培养基(如MS培养基)或土壤。
在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入序列2的第100-1086位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
本发明研究发现MYB37蛋白是ABA信号传导的核心正调节子。本发明可通过调节MYB37的表达水平控制植物种子的萌发率，通过基因工程手段获得MYB37基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物种子胎萌机制、改良遗传特性、提高种子食用品质和贮藏品质等方面具有重要的实用价值和市场前景。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测过表达材料中MYB37mRNA的表达情况。
图2为ABA对MYB37过表达植株种子萌发的影响分析结果。**表示在P<0.01水平上差异极显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination byagroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)的产品。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6bgene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。
实施例1、MYB37转基因植物的获得及鉴定
本实施例中所涉及的MYB37基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1793个核苷酸组成，为所述MYB37基因在拟南芥基因组中序列，其中第236-327及458-854位均为内含子序列；所述MYB37基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由1304个核苷酸组成，为所述MYB37基因的cDNA序列，其中第100-1089位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由329个氨基酸残基组成。
一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37的构建
提取拟南芥野生型(Col-0生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1000bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第100-1086位核苷酸序列。
引物1：5’-CTAGTCTAGAATGGGAAGAGCTCCGTGTT-3’(下划线部分为Xba I的识别位点，该序列的第11-29位为序列2的第100-118位)；
引物2：5’-CGGGGTACCGGAGTAGAAATAGGGCAAGC-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，该序列的第10-29位为序列2的第1067-1086位的反向互补序列)。
用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入序列2的第100-1086位所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-MYB37。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37中，启动所述MYB37基因转录的启动子为35S启动子。
在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的MYB37基因为模板。
二、MYB37转基因拟南芥的获得及鉴定
1、MYB37转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得
将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB37及pCAMBIA-1300-221空载体通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有MYB37基因(PCR目的条带大小为1000bp左右)的农杆菌GV3101命名为pCAMBIA-1300-221-MYB37；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。
采用用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal,1998,16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌pCAMBIA-1300-221-MYB37(或空-GFP/pCAMBIA-1300-221)转化拟南芥野生型(Col-0生态型)。
转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-MYB37的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株(T1代)。
2、MYB37转基因拟南芥鉴定
(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝MYB37转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
(2)转基因拟南芥OE1和OE6纯合系的筛选
经上述鉴定分析后，选择其中二个具有代表性的单拷贝MYB37转基因拟南芥株系，分别记为OE1和OE6(T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE1和OE6的纯合系植株，作为实验材料进行以下胎萌抗性检测分析。
三、转基因拟南芥OE1和OE6纯合系中MYB37基因表达量分析
提取拟南芥野生型(Col-0生态型)和过表达植株(OE1和OE6)的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中MYB37基因在转录水平上表达情况。具体如下：
1、转录水平分析(RNA表达量)
以上述获得的转基因拟南芥植株(OE1和OE6)及拟南芥野生型(Col-0生态型)为实验材料。各实验材料在平皿中生长12天后进行收样，提取各实验材料的总RNA，反转录成单链cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析MYB37基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增MYB37基因的引物序列为：
MYB37RT-F1：5’-CGACAAGACAAAAGTGAAGCGA-3’(序列2的第120-141位)；
MYB37RT-R1：5’-TGGCAGCGAAGAGACTAAAAATG-3’(序列2的第333-355位的反向互补序列)。
以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
上述引物的反应条件如下:
(1)反应体系的建立
实时荧光定量PCR反应体系
(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
(3)反应程序的设定：
实时荧光定量PCR反应程序
(4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中MYB37基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
MYB37相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，MYB37基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中MYB37基因的表达为1。从图中可以看出，相比拟南芥野生型(Col-0)，步骤二获得的转基因拟南芥OE1和OE6中MYB37mRNA表达量均显著高于野生型(Col-0)中。
实施例2、MYB37转基因植物种子萌发试验分析
ABA在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种子萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ABA调节。随着外源ABA浓度的增加，拟南芥野生型(Col-0生态型)种子的萌发率会逐渐降低。统计种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一。
以拟南芥野生型(Col-0生态型)、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体MYB37转基因株系OE1和OE6为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ，0.5μΜ，1μM和3μΜ)(每种实验材料播种80-100粒)。4℃下低温层积3天后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到72h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验同时设置实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的植株[Col-0(35SGFP)]作为对照。t检验用于分析差异显著性(**P<0.01)。实验重复3次，结果取平均值。
结果如图2所示，在含有0μM ABA的培养基上，转基因株系OE1和OE6相对于野生型(Col-0生态型)种子萌发速率显著变慢。在含有不同浓度ABA的培养基上，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体MYB37转基因株系OE1和OE6相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)种子萌发速率更慢，都明显的表现出ABA超敏的表型(对胎萌抗性增强)。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株[Col-0(35S GFP)]，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异。以上结果显示，转基因株系OE1和OE6对胎萌抗性增强，MYB37是ABA信号通路中一个正调节子。另外，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上(0.5μΜ，1μM和3μΜABA)，转基因株系OE1和OE6相对于野生型种子萌发速率均变慢，对ABA更加敏感，这正是农业生产所需要的，能够很好的抑制种子过早萌发，抑制胎萌，减少胎萌所消耗营养和贮藏物质，使种子食用品质、贮藏品质提升，使种子质量提高，给作物生产提高更大的经济利益。

Claims (9)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)或a2)中的应用：
a1)提高植物的胎萌抗性；
a2)选育胎萌抗性提高的植物品种；
所述植物为拟南芥。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)或a2)中的应用：
a1)提高植物的胎萌抗性；
a2)选育胎萌抗性提高的植物品种；
所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子。
4.培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高；
所述植物为拟南芥。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第100至1089位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
8.一种降低植物种子萌发速率的方法，包括如下步骤：
(1)向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；
(2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中；
所述植物为拟南芥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述ABA在所述基质中的含量为0.5-3μM。
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