CN112342225B - 一种抗旱基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗旱基因，该抗旱基因在棉花中克隆所得，编码一种被预测为表皮特异性分泌糖蛋白EP1‑like的蛋白质，通过参考基因组定位和序列比对，我们将编码此蛋白的基因命名为GhA01EP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，该抗旱基因的ORF序列为利用同源克隆法在棉花品种冀2658根部的cDNA中克隆得到，序列全长1371 bp，编码456个氨基酸。

Description

一种抗旱基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗旱基因及其应用。

背景技术

在长期进化过程中，植物应对不断变化的生物和非生物胁迫，发展出独特的、高度复杂的生物调控机制来精确地控制其生长发育，研究人员已进行了许多探索以揭示此类机制。但是，与细胞内信号传导通路的组成和效应相比，植物分泌蛋白在植物胁迫反应中的作用还未被引起足够重视。分泌蛋白作为植物与外界信息、物质、能量交流和交换的重要载体，对生理活动的调控起着非常重要的作用，因此，对分泌蛋白的研究有助于补充和完善人们对植物抵抗环境胁迫的调节机制的认知。

研究表明，分泌蛋白在细胞壁结构形成、细胞间相互作用、细胞外/细胞内信号传递、细胞对环境刺激的响应和病原体防御等方面具有重要的生物学功能，目前研究较多的为分泌蛋白在植物逆境适应中的功能。诸如许多实验证实，环境胁迫能够明显地影响分泌蛋白的质量和数量，盐、低温、水杨酸、金属毒害和病原菌入侵等都对植物分泌蛋白质组具有较大影响。Song比较了水稻盐处理和未处理的分泌蛋白组后，鉴定出37种差异表达分泌蛋白，它们主要参与碳水化合物代谢、氧化还原、蛋白质的加工和降解等。对沙棘的分泌蛋白质组进行分析，鉴定出61种响应低温的蛋白，在34个上调表达的蛋白质中，主要涉及信号传导、氧化还原调节和防御相关蛋白。而对棉花响应大丽轮枝菌侵染的质外体蛋白组学分析共分离到49个差异蛋白，这些差异蛋白参与活性氧代谢、防御反应、细胞壁修复、信号传导等多个生物学过程。质外体蛋白质组学研究不断深入的同时，抗逆相关质外体蛋白的功能研究也取得了一些进展。张磊研究表明，质外体蛋白 OsAPRLK1 在水稻抗盐反应中起着调控作用。Wang 等发现大豆细胞质外体定位 BURP 结构域蛋白（GmRD22）的表达增强了对非生物胁迫的耐受性。李元宝发现质外体蛋白GbNRX1和GbCRR1对于植物提高病原菌抗性具有作用。在小麦中，定位在细胞质、细胞膜和质外体的 TaXTH-7A 蛋白可以提高转基因拟南芥的抗旱性。此外，孙金月和简令成等研究发现，在环境胁迫下，抗逆性强的品种细胞表面分泌的糖蛋白增多增厚，而敏感型品种细胞表面糖蛋白则会变少，甚至脱落。梁欣欣将诱导相关抗逆基因表达的逆境诱导转录因子 DREB 转入小麦中，在盐胁迫下，转 DREB 基因小麦植株叶片的细胞表面糖蛋白层较为致密，而对照植株叶片的细胞表面糖蛋白层出现细胞壁外缘脱落现象。由此可见，在逆境条件下，细胞分泌蛋白的增多对提高植株抗逆性具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗旱基因及其应用，具体的，本申请人前期测定了耐旱棉花品种冀 2658 根系早期（1 h）干旱胁迫应答的蛋白质组（数据未发表），发现一个推测为表皮特异性分泌糖蛋白 EP1-like 的蛋白质在干旱胁迫早期差异表达倍数较高，通过参考基因组定位和序列比对，我们将编码此蛋白的基因命名为 GhA01EP1，用 qRT-PCR 也证实此基因在干旱胁迫12 h时差异表达倍数最大。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种抗旱基因，该抗旱基因在棉花中克隆所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该抗旱基因为利用同源克隆法在冀2658根部的cDNA中克隆得到，基因的ORF全长1371 bp，编码456个氨基酸。该ORF序列编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的抗旱基因可用于提高植物的抗旱性。

本发明所述的抗旱基因可用于提高棉花的抗旱性。

本研究通过陆地棉根部蛋白质组测序发现，一个被预测为表皮特异性分泌糖蛋白EP1-like的蛋白质在干旱胁迫下上调表达，我们将合成此蛋白的基因命名为GhA01EP1，通过对过表达GhA01EP1基因的拟南芥株系进行抗旱鉴定发现，转基因拟南芥相比野生型抗旱性增强，胁迫覆水后更容易恢复到正常生长状态，说明GhA01EP1 基因调控植物抗旱性，在干旱胁迫下可以提高植株的抗旱性。

克隆抗旱基因，培育抗旱性更强的植物新品种，不仅可节约我国农田用水，还可以减少地膜污染，对确保我国棉花产业绿色发展，减少农资投入，减轻环境污染具有重要意义。

附图说明

图1 GhA01EP1氨基酸序列的结构分析

图2基因组织表达分析；

图中：**代表数值达到极显著（P < 0.01）差异水平。

图3基因参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径（部分截图）；

图中：红色填充代表此基因在代谢途径中上调表达。

图4 GhA01EP1 蛋白3D模型。

图5 GhA01EP1蛋白氨基酸序列比对

图6 GhA01EP1蛋白的进化树分析（图上GhA01EP1 [Gossypium. hirsutum）。

图7 GhA01EP1的亚细胞定位；

图中：GFP代表绿色荧光场，CHI代表叶绿体自发荧光场，DIC代表明场，Merge代表叠加场。

图8 转基因拟南芥抗旱鉴定；

其中：图A、B和C分别是拟南芥生长在0、250和300mM D-甘露醇培养基中；图D、E和F分别是在0、250和300mMD-甘露醇培养基中野生型和转基因株系根的长度；图G为300mM D-甘露醇胁迫下野生型和转基因株系植株子叶之间的距离；图H为转基因拟南芥干旱胁迫下的表型。*和**分别代表数值在转基因株系与野生型之间达到显著(P ＜0.05)和极显著(P＜0.01)差异水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

GhA01EP1基因的克隆与结构分析

利用同源克隆法在冀2658的cDNA中克隆得到GhA01EP1基因的ORF序列，序列全长1371 bp，编码456个氨基酸。利用Seqhunter软件在陆地棉基因组中进行本地化blast，发现EP1-like基因位于A01号染色体上。将氨基酸序列在NCBI上进行在线结构分析，发现GhA01EP1氨基酸序列包含B-lectin，S-locus-glycoprotein和Plant PAN/APPLE 3个结构域（图1），其结构与植物类受体激酶S-receptor kinase（SRK）的胞外序列结构类似。

基因表达分析

幼苗在水培条件下生长到二叶一心时，取植株的根、茎和叶片提取RNA，反转录后进行qRT-PCR分析基因的组织表达。从图2中可看出，基因在根、茎和叶片中都表达，但是在根中表达量最高。

GhA01EP1的代谢通路分析

KEGG Pathway富集分析发现，该基因在7种代谢途径中上调表达，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、异喹啉类生物碱的生物合成、β-丙氨酸代谢、莨菪烷类、哌啶、吡啶生物碱生物合成、酪氨酸代谢、mRNA监视通路等。其中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢可信度较高，在此代谢途径中，基因参与合成甲基乙二醛（Methylglyoxal，MG）（图3）。近几年的研究表明，高浓度的MG是一种细胞毒素，而低浓度的MG作为一种信号分子，可调节多种生理过程和耐逆性的形成。在植物遭受胁迫时，MG含量迅速上升，成为植物响应环境胁迫的信号。P值紧随其后的为苯丙氨酸代谢，苯丙氨酸代谢途径是植物中形成木质素和芪类化合物等次级代谢产物的重要途径，而木质素是细胞壁的重要组成部分，木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于疏导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。通过以上论述，干旱胁迫下GhA01EP1可能通过以下2种途径响应干旱胁迫：一是通过合成过量MG作为响应胁迫的信号，二是通过细胞壁增厚利于疏导水分运输用来抵抗干旱胁迫。

氨基酸序列理化性质分析

利用ExPASy-ProtParam分析得到GhA01EP1蛋白的分子式为C₂₂₅₇H₃₄₆₄N₆₀₂O₆₈₄S₂₁；分子质量为50649.21D；理论等电点（PI）为6.61；不稳定指数（ΙΙ）计算为37.20，为稳定性蛋白；总亲水性平均数为-0.235。EP1-like蛋白包含456个氨基酸，其中亮氨酸（Leu）占10.1%，丝氨酸（Ser）占9.9%，苏氨酸（Thr）占7.2%，甘氨酸（Gly）占7.5%。

氨基酸序列的信号肽和跨膜结构域预测

利用SignalP 5.0 Server在线软件分析表明，GhA01EP1在N端存在信号肽的概率为68.7%，信号肽剪切位点位于第42个与第43个氨基酸之间。另外，又利用PSI进行了亚细胞定位分析，显示此基因产物被定位在细胞外的概率远大于定位在其他位置的概率。TMHMM预测EP1-like不存在跨膜区域。以上结果说明，GhA01EP1蛋白存在信号肽，合成后被分泌到细胞外发挥作用。

氨基酸序列的蛋白结构预测

SOPMA在线预测蛋白的二级结构表明，α-螺旋占8.55%，延伸主链占32.02%，无规则卷曲占53.29%，β-折叠占6.14%。Phyre2进行3D模型预测如图4，模型的置信度达到100%，氨基酸序列的覆盖度达到83%，因此，可以认为该蛋白结构的预测是可靠的。

进化树分析

将 GhA01EP1 基因编码的蛋白在 UniProt 上进行在线 blast，选取相似度在80%以上的序列进行比对分析和信号肽分析，结果如图5所示，和其他序列相比，编号为A0A1U8KDH7 的序列和本研究序列同源性最高，只有一个氨基酸的差异，并且都在起始信号肽的位置多16个氨基酸，而其他序列所含有的信号肽只有20个氨基酸左右，说明这两个蛋白可能与其他蛋白分泌到细胞外的方式不同。经分析，A0A1U8KDH7 序列来自于墨西哥棉和陆地棉，但是A0A1U8KDH7基因功能尚未被注释。此外，我们将相似度最高的10条序列进行了进化树分析（图6），这些序列明显被分成了3大类，来源于棉属的序列被聚成一类。

亚细胞定位

通过构建好的 GhA01EP1::GFP 蛋白融合表达载体，利用农杆菌 GV3101 注射到本氏烟草叶片，激光共聚焦显微镜下观察 GhA01EP1::GFP 融合蛋白的发光情况，进行GhA01EP1 的亚细胞定位分析。结果显示，共聚焦观察下对照 35S::GFP 的绿色荧光分布在整个细胞中，GhA01EP1蛋白在正常定位状态下判断定位于细胞膜或者细胞壁上，但经质壁分离实验发现，GhA01EP1蛋白可以被分泌到细胞壁和细胞膜之间（图7），这与在线预测的结果一致。

干旱胁迫下转基因拟南芥抗旱测定

将野生型和转基因T₃代种子（共5 个株系：D1-D5）灭菌后种在MS 培养基上4 天，然后将幼苗转入含有250mM，300mM D-甘露醇的MS 培养基中，用不含甘露醇的培养基做对照，将培养基垂直放置在人工培养箱中，8 天后观察野生型和转基因株系的根长。

从图8 中可看出，在0mM D-甘露醇MS 培养基（图8A）中，野生型和转基因株系根长没有明显差异（图8D），在250mM（图8B）和300mM（图8C）D-甘露醇MS 培养基中，野生型和转基因株系生长受到抑制，根系变短，叶片变小。而且随着浓度的增加，抑制程度更强，但转基因株系比野生型植株根系长。

在250mM D-甘露醇胁迫下，D3 和D4 株系与野生型根长呈极显著差异（图8E），在300mM D-甘露醇胁迫下，D1、D2 和D5 与野生型根长呈显著差异，D3 和D4株系与野生型根长呈极显著差异（图8F）。同时，我们对300mM D-甘露醇胁迫下野生型和转基因株系植株子叶之间的距离进行了比较，从图8G 可以看出，D1、D2 和D5 与野生型呈极显著差异，D3 和D4 株系与野生型差异不显著。

为了对转基因拟南芥株系进行抗旱鉴定，将正常生长条件下生长 3 周左右的野生型和转基因拟南芥植株进行干旱处理。停止浇水 30 天以后，几乎所有植株都受到胁迫影响，叶片发黄、干枯、萎蔫，但是某些转基因植株受胁迫的影响较小，叶片较绿，萎蔫程度低。复水 5 天后，部分转基因植株可以恢复正常生长状态，野生型植株大部分死亡。以上结果表明，GhA01EP1 可以提高干旱胁迫下转基因拟南芥的抗旱性，说明 GhA01EP1 与提高植物抗旱性相关。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Sequence List

<110> 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所）

<120> 一种抗旱基因及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列（atgcttggct gctccatctc catatcatca aagctttcat atccaacaatgtctcttcac 60

tcttctctca ccatgtcatt gctgtctttc tccttcttgt tgctgtttac ttttagtgcc 120

aaagctgttg ttcctccatc tgaaactttt aggtttgtca acgacggaga atttgggccg 180

tttgttgttg aatatgatgc aaattaccgt gtcataagca tagctaatgc ccccttccag 240

cttgcgtttt ataacaccac ccctaatgcc ttcacccttg cgttacgcat ggctacaacg 300

cgttccgagt cgctcttccg atgggtttgg gaggccaaca gggggaaccc tgttcgcgag 360

aacgccacgt tctctctcgg gactgacggg aaccttgtct tggctgatgc cgatggtcgg 420

attgcttggc aaagtaacac tgccaacaaa ggtgtggtag ggttccaatt gttgcctaat 480

ggtaacatgg tgttacacga ttccaatggc aagttcattt ggcaaagttt tgatcatcca 540

actgatacac tcttggtggg tcagtcgctt agaatcggag gggcgacgaa gcttgtgagt 600

cgggcttctg ctcaaaacaa tgttgacgga gcctatagct tggtgatgga gcctaaacag 660

ttggttttgc agtacaaggg aatgaactct cctaaaccac ttgtctattt caaatcatct 720

gtttggccaa gtacacaaga tggtacttta caaactgtga cactaaatgt tgaggaaaca 780

aatgatggct ttgcttataa cgttttgtta gactacacag tggctaactc gtccatcggg 840

accggaaatc tcatcttgac aaggccgaaa tacaacagca cattgtcgat tcttcgactc 900

gggatcgatg gaaacctgag ggtttttacc tactatgaca aggttgattc acaggcatgg 960

gaagagactt tcactctctt ctctagggac tcaatatggg gcactgaatg cgaactgccg 1020

gagaggtgtg ggaactttgg actctgtgag gagaaccaat gcgttgcttg cccgtcaaca 1080

aacggattac tcggttggag ccagaattgt cagccgaaga aggtgaattg taggccgaat 1140

ggtttcagct actacaagct agaaggagtt gaccatttca tgagccagta caacgaagga 1200

gaagggataa aggagagtga ttgtgggagg aaatgcacct ctgattgcaa gtgtttgggg 1260

tacttttacc acagggaaac atccaaatgt tggatcgcta atgagttgaa aacccttgct 1320

aaaacctcta actcttccca tgttggttat ataaaggcac ccaacaagtg a 1371）

<400> 1

<210> 2

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列（mlgcsisiss klsyptmslh ssltmsllsf sflllftfsa kavvppsetfrfvndgefgp 60

fvveydanyr visianapfq lafynttpna ftlalrmatt rseslfrwvw eanrgnpvre 120

natfslgtdg nlvladadgr iawqsntank gvvgfqllpn gnmvlhdsng kfiwqsfdhp 180

tdtllvgqsl riggatklvs rasaqnnvdg ayslvmepkq lvlqykgmns pkplvyfkss 240

vwpstqdgtl qtvtlnveet ndgfaynvll dytvanssig tgnliltrpk ynstlsilrl 300

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yfyhretskc wianelktla ktsnsshvgy ikapnk 456）

<400> 2

Claims (4)

1.一种抗旱基因在提高棉花抗旱性中的应用，其特征在于：该抗旱基因在棉花根系的cDNA中克隆所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：该抗旱基因为利用同源克隆法在棉花品种冀2658根部的cDNA中克隆得到的序列，ORF序列全长1371 bp，编码456个氨基酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：该ORF序列编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：该抗旱基因可用于提高棉花的抗旱性。

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