KR20190041656A - 내염성 및 내건성 증진 ＯｓＺＦ１Ｍ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내염성 또는 내건성을 증진시키는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 신규 합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M 신규 합성 유전자, 상기 유전자를 포함하는 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체, 및 상기 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, OsZF1M 신규 합성 유전자를 이용하여 내염성 및 내건성을 지닌 내재해성 증진 작물 개발에 활용 가능하며, 식물체 내 내생(endogenous) ABA(abscisic acid) 함량을 조절하여 생장 발달 조절에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

내염성 및 내건성 증진 ＯｓＺＦ１Ｍ 유전자 및 이의 용도{A novel OsZF1M gene for enhancing salt and drought resistance and uses thereof}

본 발명은 내염성 또는 내건성을 증진시키는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 신규 합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M 신규 합성 유전자, 상기 유전자를 포함하는 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체, 및 상기 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

농업은 타 산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성이 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물 가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물 가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 가뭄이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물의 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다. 한발(가뭄, 건조)은 강수부족으로 수량 손실을 야기하거나 일정한 강수 기간이 없어 관개수에 의존하여 작물을 재배하는 것으로 한발은 재배기간 중 어느 때라도 발생할 수 있고 지역에 따라서는 연중 발생하기도 한다. 생육초기에는 이앙시점이나 파종이 지연되고 중기에 발생한 한발이 지속되면 개화시기의 지연으로 수량에 치명적인 영향을 미친다. 우리나라는 연 강수량이 1,250 mm 정도로 풍부하지만 7-8월에 편중되어 있어 봄, 가을에는 반 건조성 기후의 성격을 띠고 있다. 따라서 봄, 가을은 상습적으로 한발이 일어나고 때에 따라서는 7-8월에도 강우가 부족하여 한해(旱害)를 입기도 한다.

작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분 함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양 수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물 개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염해에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다.

특히, 염해와 한발은 작물의 삼투압에 의한 수분 부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물 호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등도 야기한다.

현재 인구 증가에 따라 식량 증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후 변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상 재해면적이 연평균 162.8천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업 생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

한편, 전사 인자(transcription factor)는 환경 자극에 대한 식물 세포 및 생리학적 반응의 필수적인 조절자로 알려져 있다. 전사 인자는 CBF(C-repeat binding factors), DREB(dehydration responsive element binding factors), NAM(no apical meristem), CUC(cup-shaped cotyledon), NAC 전사 인자, bZIPs 및 일부 징크 핑거(zinc finger) 단백질과 같은 환경 스트레스에 대해 중요한 조절자인 여러 패밀리들을 특이적으로 포함한다. 징크 핑거 단백질(zinc finger protein, ZFP)은 가장 많이 연구된 전사 인자 패밀리들 중 하나이고, 전사 활성화, 세포 사멸(apoptosis) 조절, 단백질 폴딩(folding) 및 조립(assembly)을 포함한 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 한다. ZFP의 징크-결합 모티프는 구조적으로 뿐만 아니라 기능면에서도 매우 광범위하게 다양한데, 이것은 단백질-단백질 간의 상호작용 및 막 결합에 대한 DNA 또는 RNA 결합을 포함할 수 있다. ZFP의 한 그룹(group)은 아연의 두 원자에 결합하는 40 내지 60개의 AA 잔기로 이루어진 RING-핑거 모티프를 포함하는데, 추가로 RING-H2(C3H2C3) 및 RING-HC(C3HC4) ZFP와 같은 2개의 일반적인 클래스(class)로 구분될 수 있다. 상기 ZFP의 최초 동정 이래, RING 핑거 단백질을 코딩하는 많은 유전자들이 동물, 식물 및 바이러스를 포함하는 다양한 생물체에서 분리되었으며, 다양한 범위의 생물학적 기능을 보유하고 있는 것으로 나타났다(Ma K. et al., 2009 Gene 444, 33-45). C3HC4-유형 RING 핑거 단백질은 애기장대(Arabidopsis)에서 게놈 규모로 연구된 바 있다.

식물은 고염, 고온, 저온 뿐만 아니라 건조와 같은 다양한 비생물적 스트레스에 대해 생존하도록 반응하는 능력을 가지고 있다. 작물의 성장 및 생산성을 제한하는 것으로 알려진 상기 불리한 환경 스트레스 또한 ZFP를 포함하는 다양한 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다(Islam et al., 2009 Plant and Cell Physiology 50, 1171-1175). 다양한 식물 유래의 RING 징크 핑거 단백질에 대한 선행 연구에서, 상기 단백질이 건조 및 다른 비생물적 스트레스를 포함하는 수많은 환경 스트레스의 프로세스 뿐만 아니라 질병 내성에도 연관된 것으로 나타났다. 또한, ZFP는 광 인지 및 퍼옥시좀 형성을 포함하는 스트레스 프로세스와 연계되어 있는 형성, 발생 또는 신호전달 프로세스 및 종자 및 뿌리가 발생하는 동안 작용하는 것으로 알려져 있다(Prestele et al., 2010 Proceedings of the National Academy of Science 107, 14915-14920).

한편, 한국등록특허 제10-0742193호에는 '신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1258079호에는 '배추 유래의 BrCIPK3 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있다. 그러나, 벼 유래 전사 인자로서 징크 핑거 도메인 유전자군 중에서 선발한 OsZF1 유전자를 토대로 개발한 본 발명의 신규 합성 유전자 OsZF1M을 이용한 환경 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 환경 스트레스 내성, 특히 염 및 건조 스트레스 내성을 가지는 생육 및 발달이 조절된 신기능성 작물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼 유래의 OsZF1 유전자를 토대로 개발한 본 발명의 신규 합성 유전자 OsZF1M을 포함하는 제조합 벡터를 형질전환시킨 벼 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 벼 식물체가 염 및 건조 스트레스 처리시 야생형 식물체보다 내염성 및 내건성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-0742193호 한국등록특허 제10-1258079호

Ma K. et al., 2009 Gene 444, 33-45 Islam et al., 2009 Plant and Cell Physiology 50, 1171-1175 Prestele et al., 2010 Proceedings of the National Academy of Science 107, 14915-14920

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 유전자를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내염성 또는 내건성 증진용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 유전자를 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내염성 또는 내건성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른, OsZF1M 신규 합성 유전자를 이용하여 내염성 및 내건성을 지닌 내재해성 증진 작물 개발에 활용 가능하며, 식물체 내 내생(endogenous) ABA(abscisic acid) 함량을 조절하여 생장 발달 조절에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 벼 유묘의 뿌리에서 (A) 염화나트륨(NaCl) 및 (B) 앱시스산(ABA) 처리에 의한 OsZF1 유전자(Oryza sativa zinc finger 1 gene; Os09g30160) 발현 증가 정도를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 OsZF1M 합성 유전자의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 OsZF1M 합성 유전자와 OsZF1(Os09g30160) 유전자의 염기서열을 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 (A)는 OsZF1M 단백질의 기능 도메인을 개략적으로 나타낸 도이며, (B)는 벼 원형질체에서 OsZF1M-GFP 융합 단백질의 세포 내 위치를 형광 분석하여 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 OsZF1M 합성 유전자 과발현 재조합 벡터의 모식도이다. 여기에서, TL은 left T-DNA border이고, 35ST는 CaMV 35S terminator이고, Hygromycin(R)은 hygromycin resistant이며, NOS는 nopaline synthase gene이고, OsZF1M은 Oryza sativa zinc finger 1 codon modified이고, 35SP는 Cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter이고, TR은 right T-DNA border이다.
도 6은 본 발명의 OsZF1M 유전자 과발현 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, DJ는 대조구인 야생형 동진벼이며, T753-7, T755-6, T756-2, 및 T757-7은 OsZF1M 유전자가 삽입된 형질전환 벼이다.
도 7은 본 발명의 OsZF1M 유전자 과발현 형질전환 벼의 내생(endogenous) ABA 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다. 여기에서, DJ는 대조구인 야생형 동진벼이며, T752, T753, T755, 및 T757은 OsZF1M 유전자가 도입된 형질전환 벼이다.
도 8은 본 발명의 OsZF1M 유전자 과발현 형질전환 벼의 내건성(A) 및 내염성(B) 증진 효과를 확인한 도이다. 여기에서, DJ는 대조구인 야생형 동진벼이며, 757-7, 753-7 및 756-2는 OsZF1M 유전자가 도입된 형질전환 벼이다. 스트레스 인덱스(stress index)는 벼 형질전환체별로 스트레스 지수를 0 내지 5로 정량화한 수치이다.
도 9는 본 발명의 OsZF1M 유전자 과발현 형질전환 벼의 잎의 수분 손실률을 분석하여 나타낸 그래프이다. 여기에서, DJ는 대조구인 야생형 동진벼이며, 757-7, 753-7 및 756-2는 OsZF1M 유전자가 도입된 형질전환 벼이다. *는 T-Test 분석결과이며, **는 P-value < 0.01이며, *는 P-value < 0.05이다.

본 발명은 내염성 또는 내건성을 증진시키는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 신규 합성 유전자, 상기 유전자를 포함하는 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체, 및 상기 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 유전자를 제공한다.

본 발명에서 용어 "내염성(salt tolerance)"은 식물이 높은 염분 환경에 견디어 생육할 수 있는 성질로, 토양의 높은 염농도에 대한 식물의 저항성을 의미한다.

본 발명에서 용어 "내건성(drought tolerance)"은 식물이 한해(drought damage)에 견뎌낼 수 있는 성질, 즉 가뭄을 견디는 성질로서 내건성 또는 한발저항성이라고도 한다.

본 발명에서 "OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 유전자"는 염화나트륨(NaCl) 및 앱시스산(Abscisic acid, ABA) 처리에 의해 발현이 증가하는 벼 유래 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 토대로, OsZF1 유전자가 암호화(encoding)하는 아미노산 서열에 맞추어, 벼에서 사용 가능한 코돈(codon)을 활용하여 코돈을 변경하여 합성한 신규 유전자로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 OsZF1M 유전자 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 OsZF1M 유전자는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsZF1M 단백질을 암호화하는 것일 수 있다.

또한, 상기 OsZF1M 단백질의 기능적 동등물이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 OsZF1M 단백질은 C3HC4 형태의 징크 핑거 모티프(zinc finger motif)를 가지고 있으며, N-말단에 신호 펩타이드를 가지고 있다(도 4의 A).

본 발명에 있어서, 상기 OsZF1M 신규 합성 유전자는 당해 유전자의 염기서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 상기 유전자가 유래한 생물, 바람직하게는 벼의 mRNA를 추출하여 이를 주형으로 목적한 상기 내염성 또는 내건성 증진용 합성 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 실시함으로써 이의 cDNA를 합성 및 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 OsZF1M 유전자는 염화나트륨(NaCl) 및 앱시스산(Abscisic acid, ABA) 처리에 의해 발현이 증가하는 벼 유래 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 토대로, OsZF1 유전자가 암호화(encoding)하는 아미노산 서열에 맞추어, 벼에서 사용 가능한 코돈(codon)을 활용하여 코돈을 변경하여 합성한 신규 유전자로 OsZF1 유전자와 75.5%의 상동성을 나타내었으며, 상기 OsZF1M 유전자가 도입된 OsZF1M 과발현 형질전환 벼 식물체의 내건성 및 내염성이 증가되었음을 확인하였다(도 3 및 도 8).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 포함하는, 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsZF1M 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsZF1M 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 pCAMBIA1300N 벡터에 OsZF1M 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pCAMBIA1300-OsZF1M을 예시하고 있으나(도 5), 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsZF1M 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 OsZF1M 유전자 도입에 의해 형질전환된 식물의 내염성 또는 내건성이 증가되는 것을 의미한다.

상기 식물체는 단자엽 식물인 것이 바람직하고, 벼(Oryza sativa L.)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 OsZF1M 유전자를 포함한 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 사용하여 OsZF1M 유전자가 과발현된 형질전환 벼 식물체를 제작하였으며, 상기 OsZF1M 과발현 형질전환 벼 식물체의 내건성 및 내염성이 증가되었음을 확인하였다(실시예 4 및 도 8).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법에 의하면 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 과발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 OsZF1M 단백질의 세포 내 수준(level)을 높임으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 조절할 수 있다.

상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 OsZF1M 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 OsZF1M 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 OsZF1M 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 식물체는 단자엽 식물인 것이 바람직하고, 벼(Oryza sativa L.)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, OsZF1M 유전자가 포함된 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 벼에 형질전환시켰다. OsZF1M 유전자 과발현 벼 형질전환체를 수득해 염 또는 건조 스트레스를 가한 결과, 대조구인 동진벼에 비해 스트레스 피해 인덱스가 낮은 것을 확인하였다.

또한, 염 스트레스 조건 하에서 식물 스트레스 호르몬인 ABA 함량이 대조구인 동진벼에 비해 OsZF1M 유전자 과발현 벼 형질전환체에서 2배 내지 3배 이상 높게 유지되는 것을 확인하였으며, 건조 스트레스 조건 하에서 잎의 수분 손실 속도가 대조구인 동진벼에 비해 OsZF1M 유전자 과발현 벼 형질전환체에서 낮아지는 것을 확인하였다.

따라서, OsZF1M 유전자 과발현 형질전환체는 내염성 또는 내건성이 증진됨을 확인할 수 있었다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내염성 또는 내건성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성, 구체적으로 내염성 또는 내건성을 증진시킬 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼 유묘의 뿌리에서 염화나트륨(NaCl) 반응 전사체 분석 및 전사인자 선발

염 스트레스 또는 건조 스트레스와 같은 환경 스트레스와 관련된 유전자를 탐색하기 위해, 발아 후 3일 된 동진벼를 100 mM의 염화나트륨(NaCl)을 포함하거나, 포함하지 않은 0.3% 아가(Agar) 배지에 옮긴 후 6일간 키운 뿌리에서 RNA를 분리하여 Affymetrix GeneAtlas Rice(Jp) Gene 1.1 ST Array Strip으로 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행하였다. 염화나트륨(NaCl) 처리에 의해 발현이 증가하는 ZF 도메인(Zinc finger domain) 유전자군 중에서 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 선발하였다(도 1의 A). 공공데이터베이스(RiceXPro) 분석 결과로부터 OsZF1 유전자(Os09g30160)가 뿌리에서 앱시스산(Abscisic acid, ABA) 처리 후 3시간 이내에 초기에 발현이 증가하는 유전자라는 것을 확인하였다(도 1의 B).

실시예 2: OsZF1M 유전자 합성 및 식물 발현 벡터 제작

상기 실시예 1에서 염 스트레스 또는 건조 스트레스와 같은 환경 스트레스와 관련된 유전자로서, 염화나트륨(NaCl) 및 앱시스산(ABA) 처리에 의해 발현이 증가하는 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 확인하였다.

상기 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 토대로 환경 스트레스 내성을 증진시키는 합성 유전자를 확보하고자, 상기 OsZF1 유전자(Os09g30160)가 인코딩(encoding)하는 아미노산 서열에 맞추어서, 벼에서 사용 가능한 코돈(codon)을 활용하여 코돈이 변경된 합성 유전자(artificial DNA 또는 synthetic gene)로서, OsZF1M으로 명명한 합성 유전자를 제작하였다. 상기 OsZF1M 합성 유전자의 염기서열을 서열번호 1로 표시하였으며(도 2), 상기 OsZF1M 합성 유전자의 염기서열은 OsZF1(Os09g30160) 유전자와 75.5% 상동성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3). 상기 OsZF1M 합성 유전자의 염기서열에 의해 암호화된 OsZF1M 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였다.

실시예 3: OsZF1M - GFP 융합 단백질의 세포 내 위치 분석

OsZF1M 단백질은 C3HC4 형태의 징크 핑거 모티프(Zinc finger motif)를 가지고 있으며, N-말단에 엽록체로 타겟(target) 될 것으로 예측되는 신호 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있다(도 4의 A).

OsZF1M 단백질의 세포 내 위치를 규명하기 위하여, 단백질의 C-말단에 형광 단백질(GFP, green fluorescent protein)을 융합한 벡터를 제작하고, 벼의 원형질체에서 일시발현시킨 후, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope; Leica TCS SP8)으로 세포 내 형광 위치를 분석하였다.

그 결과, 하기 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, OsZF1M 단백질이 엽록체 위치가 아닌 세포 내 다른 소기관에 위치하고 있음을 확인하였으며, OsZF1M 단백질의 세포 내 위치가 핵이나 세포막이 아님을 확인하였다.

실시예 4: OsZF1M 합성 유전자가 도입된 발현 벡터가 삽입된 형질전환 벼 제작

OsZF1M이 인코딩하는 단백질의 기능을 연구하기 위하여, OsZF1M 유전자가 CaMV 35S 프로모터에 의해 상시 과발현되는 벡터를 제작하였다(도 5). 상기 제작한 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입한 후, 동진벼의 캘러스(callus)에 감염시키고 30 ㎍/ℓ의 하이그로마이신(hygromycin) 조건하에서 벼 형질전환체를 선발하여 온실에서 생육하였다.

상기 선발한 벼 형질전환체의 잎에서 RNA를 분리한 후, 하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였다.

그 결과, 형질전환 벼에서 도입된 OsZF1M 유전자가 높은 수준으로 발현되고 있음을 확인하였다(도 6).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')
3	Os09g30160-52F	정방향	5'-GGA CAG CCT GGT CCT GTA CGT G-3'
4	Os09g30160-421R	역방향	5'-CAC GTC GCA TGA TCG TAG TCG-3'

실시예 5: OsZF1M 합성 유전자 과발현 형질전환 벼의 내생 ABA 함량 분석

상기 실시예 4에서 OsZF1M 합성 유전자의 발현이 확인된 형질전환 벼와 대조구인 동진벼를 1/2MS0-아가(Agar) 배지에서 10일간 키운 유묘를 200 mM의 염화나트륨(NaCl)이 포함된 1/2MS0 용액에 옮겨 24시간 동안 처리한 후 줄기부에서 내생(endogenous) ABA 함량을 정량하였다.

구체적으로, 식물조직을 액체질소로 마쇄한 후 내부 표준(internal standard)인 d6-ABA(50ng)가 포함된 추출액(50% 메탄올(methanol), 1% 아세트산(acetic acid))으로 추출하고, 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 상등액을 얻어 건조시켰다. 상기 건조액을 50% 메탄올 용액에 녹여 TQ-LC MS로 분석한 후, 내부 표준(internal standard)을 기준으로 내생 ABA 함량을 정량하였다.

그 결과, 하기 도 7에 나타낸 바와 같이, 형질전환 벼(T752, T753, T755 및 T756)의 ABA 함량이 대조구인 동진벼(DJ)에 비해 2배 내지 5배 이상 높은 것을 확인하였다. 또한, 200 mM의 염화나트륨(NaCl)을 처리하여 염 스트레스를 가하면, 식물 스트레스 호르몬인 ABA 수준이 높아지는데, 염 스트레스 조건하에서 형질전환 벼의 ABA 함량이 대조구인 동진벼에 비해 2배 내지 3배 이상 높게 유지되는 것을 확인하였다(도 7).

실시예 6: OsZF1M 합성 유전자 과발현 형질전환 벼의 내염성 및 내건성 분석

상기 실시예 1에서 염화나트륨(NaCl) 및 앱시스산(ABA) 처리에 의해 발현이 증가하는 OsZF1 유전자(Os09g30160)를 선발하였으며, 이를 토대로 벼에서 사용 가능한 코돈(codon)을 활용하여 코돈이 변경된 합성 유전자(artificial DNA 또는 synthetic gene) OsZF1M을 제작하였으며, 상기 실시예 5에서 상기 OsZF1M 합성 유전자를 벼에서 과발현시켰을 때 식물 스트레스 호르몬인 ABA 농도가 크게 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, OsZF1M 합성 유전자가 벼의 내재해성 반응에 관여할 가능성이 크다는 것을 알 수 있었다.

이에, 상기 OsZF1M 합성 유전자가 과발현된 형질전환 벼의 내염성 및 내건성을 대조구인 동진벼와 비교하여 분석하였다.

구체적으로, 1/2 MS0 배지에서 10일간 키운 형질전환 벼와 대조구인 동진벼의 유묘를 토양이 들어있는 화분에 각 10개체씩 옮겨 온실에서 2주간 생육하였다. 200 mM의 염화나트륨(NaCl) 용액을 처리하거나, 혹은 물 공급이 없는 조건하에서 5~12일간 생육 후 개체별로 스트레스 피해 인덱스를 측정하였다.

상기와 같이 염 또는 건조 스트레스를 처리한 후 정상 조건으로 회복시킨 1주일 후에 내재해성 검정 실험은 3 계통씩 2 반복 이상 수행하였다.

그 결과, 하기 도 8에 나타낸 바와 같이, OsZF1M 합성 유전자 과발현 형질전환 벼가 건조(도 8의 A) 또는 염(도 8의 B) 스트레스 조건하에서 모두 대조구인 동진벼에 비해 뚜렷하게 스트레스 피해 인덱스가 낮은 것을 확인하였다.

따라서, OsZF1M 합성 유전자의 과발현을 통하여 벼의 내염성 및 내건성을 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: OsZF1M 합성 유전자 과발현 형질전환 벼 잎의 수분 손실률 분석

4주간 온실에서 생육한 OsZF1M 합성 유전자 과발현 형질전환 벼와 대조구인 동진벼에서 상위엽(upper leaf)을 3개씩 채취하여 28℃ 온도 조건의 명배양실에서 자연건조시키면서 시간 경과에 따른 잎의 무게 변화를 측정하여 수분 손실률을 조사하였다.

그 결과, 하기 도 9에 나타낸 바와 같이, 형질전환 벼(757-7, 753-7 및 756-2)에서 잎의 수분 손실 속도가 대조구인 동진벼(DJ)에 비해 상당히 낮아진 것을 확인하였다.

상기 OsZF1M 합성 유전자의 발현을 조절한 벼 형질전환체의 잎의 수분 손실 속도가 감소하는 특성을 통해, OsZF1M 합성 유전자가 작물의 내건성을 증진시키는데 유용한 기능을 지님을 알 수 있었다.

<110> Republic of Korea <120> A novel OsZF1M gene for enhancing salt and drought resistance and uses thereof <130> P17R12C0810 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsZF1M gene <400> 1 atgggcatct cgtcaatgcc ggcaccgaag gacagcctgg tcctgtacgt gctctataac 60 gcggtcgtct ccgtggcagc cctcgctggc gtagttagag ccgcgcttgt gttcttgggc 120 ttgccaaccc ccccttcgct tctcttgctg cttgggggag aggaaggggg cgaggacgct 180 gcagtcgccg tttcagtctc cgcggcagct gctgccgctg gaccatctct ggcggatacc 240 ttcagggcac gctttcgccc cgctaggttt ggacatcggc gttgcggggg tggtgcgact 300 gccgattgtc gggtgtgctt ggttcgcttc gaggccgagg cggtggtaaa taggctgccg 360 tgcggccaca ttttccaccg ggcgtgcctc gaaacctggc tcgactacga tcatgcgacg 420 tgcccactct gtcgctccag acttcttgcg gactctagta gccctcctgc cgccgctgcc 480 gcactcgcca ggacatga 498 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsZF1M protein <400> 2 Met Gly Ile Ser Ser Met Pro Ala Pro Lys Asp Ser Leu Val Leu Tyr 1 5 10 15 Val Leu Tyr Asn Ala Val Val Ser Val Ala Ala Leu Ala Gly Val Val 20 25 30 Arg Ala Ala Leu Val Phe Leu Gly Leu Pro Thr Pro Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Leu Leu Leu Gly Gly Glu Glu Gly Gly Glu Asp Ala Ala Val Ala Val 50 55 60 Ser Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Asp Thr 65 70 75 80 Phe Arg Ala Arg Phe Arg Pro Ala Arg Phe Gly His Arg Arg Cys Gly 85 90 95 Gly Gly Ala Thr Ala Asp Cys Arg Val Cys Leu Val Arg Phe Glu Ala 100 105 110 Glu Ala Val Val Asn Arg Leu Pro Cys Gly His Ile Phe His Arg Ala 115 120 125 Cys Leu Glu Thr Trp Leu Asp Tyr Asp His Ala Thr Cys Pro Leu Cys 130 135 140 Arg Ser Arg Leu Leu Ala Asp Ser Ser Ser Pro Pro Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Arg Thr 165 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os09g30160-52F <400> 3 ggacagcctg gtcctgtacg tg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os09g30160-421R <400> 4 cacgtcgcat gatcgtagtc g 21

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 내염성 또는 내건성 증진에 이용되는 OsZF1M(Oryza sativa zinc finger 1 codon modified) 유전자.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsZF1M 단백질을 암호화하는 것인 유전자.
   
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 포함하는, 내염성 또는 내건성 증진용 재조합 벡터.
   
4. 제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 내염성 또는 내건성이 증진된 형질전환 식물체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것인 형질전환 식물체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa L.)인 것인 형질전환 식물체.
   
7. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 식물체에 과발현시킴으로써 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 내염성 또는 내건성을 증진시키는 방법.
   
9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsZF1M 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내염성 또는 내건성 증진용 조성물.

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