CN110878315B - 一种菌类效应因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种菌类效应因子及其编码基因与应用。本发明通过实验研究发现，来自辣椒疫霉菌的效应因子RxLR129113(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)在本氏烟上既能引起过敏性坏死反应(HR)，又能抑制Bax引发的程序性细胞死亡(PCD)，还能抑制INF1引发的细胞死亡。根据RxLR129113的结构对其进行截短，得到的四个截短体(RxLRW1、RxLRW1‑2、RxLRW1‑3以及RxLRW1‑4)并进行功能验证，发现RxLRW1‑3是抑制由Bax和INF1引起的细胞死亡的关键功能域。对RxLR129113和RxLRW1‑3的核输出与核输入功能做了验证，结果证明当RxLR129113定位在细胞质时能产生HR，抑制Bax和INF1的能力强，RxLRW1‑3定位在细胞质时抑制Bax和INF1的能力强。

Description

一种菌类效应因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种菌类效应因子及其编码基因与应用。

背景技术

卵菌引起的病害一旦发生，便无法控制，造成作物大面积的绝产，给人类带来巨大的经济损失。近些年对卵菌全基因组研究取得了极大的进步，但是针对效应因子的研究仍然是焦点。从全基因组测序的结果发现卵菌分泌的效应蛋白比较复杂，数百个RxLR的效应因子在致病过程中通过各种方式来贡献自己的力量。研究病原菌的致病机制，对新型杀菌剂的研发以及卵菌病害的有效防治有重要的意义。

植物病原菌在侵染寄主植物时，会激活植物自身的防卫反应，从而抑制病原菌的侵染；然而病原菌会分泌效应因子来抑制寄主的防卫反应，以保证病原菌更好的侵入植物，获取营养。大量效应因子是通过哪种方式共同合作来破坏植物的防卫反应从而达到病原菌成功侵染的目的需要不断去探索。在分子水平上，对病原菌多寄主致病靶标的研究，为抗病品种的选育及生态农药的研发提供理论基础，解决传统化学防治病害造成的病原菌抗药性增强和药害残留所引发的食品安全问题。随着测序技术的不断发展，重要病原菌的全基因组测序工作将逐步完成，在细菌、卵菌、真菌和线虫中会发现越来越多的效应因子，了解病原物与寄主的相互作用将更加透彻，这将为植物病害的有效防治开辟新的途径。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种菌类效应因子及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种菌类效应因子的编码基因，是如下(1)～(3)中的任一种：

(1)来自于辣椒疫霉菌的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA分子具有51％以上同源性且编码相关蛋白的DNA分子；

所述相关蛋白为可诱导过敏性坏死反应的发生、和/或抑制Bax引发的程序性细胞死亡、和/或抑制INF1引发的细胞死亡、和/或与乙醛脱氢酶互作的蛋白质。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

同源基因优选为分离自烟草疫霉或致病疫霉的基因。

进一步地，本发明提供一种DNA分子，是如下(1)～(3)中的任一种：

(1)核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1～1209bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1～1209bp互补的DNA分子；命名为RxLRW1-4；

(2)核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1～945bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1～945bp互补的DNA分子；命名为RxLRW1-3；

(3)核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1～666bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1～666bp互补的DNA分子；命名为RxLRW1-2。

与此同时，本发明提供另一种DNA分子，其是核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1～396bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1～396bp互补的DNA分子，命名为RxLRW1。

在前述编码基因及其截断序列的基础上，本发明分别提供上述编码基因或4种DNA分子编码表达的菌类效应因子。

为了表达所述菌类效应因子，含有编码基因或4种DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明通过实验研究发现了前述编码基因及其表达的效应因子、以及前文命名为RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4三种DNA分子及其表达的蛋白(效应因子)在如下方面的应用：

(1)诱导寄主产生过敏性坏死反应；

(2)抑制Bax引起的细胞死亡；

(3)抑制INF1引起的细胞死亡；

(4)与乙醛脱氢酶在细胞质互作。

同时，本发明通过实验研究发现了前文命名为RxLRW1的DNA分子及其表达的蛋白(效应因子)在如下方面的应用：

(1)诱导寄主产生过敏性坏死反应；

(2)抑制Bax引起的细胞死亡；

(3)与乙醛脱氢酶在细胞核互作。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明以实验室保存的辣椒疫霉菌株SD33为材料，克隆了效应因子RxLR129113，并将其构建到pBIN-GFP植物表达载体上。利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟上进行功能分析，并通过蛋白质免疫印迹检测蛋白的表达。结果发现RxLR129113既诱导本氏烟产生过敏性坏死反应(HR)，又能抑制Bax引发的程序性细胞死亡(PCD)，还能抑制INF1引发的细胞死亡。由表达模式分析得知，RxLR129113在侵染的早期表达量最高。根据实验室已经解出RxLR129113的结构对其进行截短，得到的四个截短体(RxLRW1、RxLRW1-2、RxLRW1-3以及RxLRW1-4)进行功能验证，发现RxLRW1-3是抑制由Bax和INF1引起的细胞死亡的关键功能域。RxLR129113定位于细胞质和细胞核中，为了明确行使功能的关键位置，对其核输出与核输入进行功能验证，结果证明当RxLR129113定位在细胞质时能产生HR，抑制Bax和INF1的能力强。同时对RxLRW1-3的核输出与核输入功能做了验证，发现其定位在细胞质时抑制Bax和INF1的能力强，初步推测RxLR129113在细胞质行使功能。实验室已经验证了RxLR129113与乙醛脱氢酶(ALDH)互作，RxLRW1-3也与ALDH互作，在本氏烟上利用农杆菌共表达技术分别观察RxLR129113和ALDH、RxLRW1-3和ALDH的共定位。结果发现，RxLR129113和RxLRW1-3均与ALDH在细胞质中互作。在本氏烟中瞬时沉默NbALDH后验证RxLR129113的功能，RxLR129113的功能未发生变化。

本发明为效应因子与互作蛋白的互作机制提供了理论依据，对了解辣椒疫霉的致病机理及病害的防治有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例中所述的pBIN-GFP的载体图谱。

图2为本发明实施例中辣椒疫霉菌株SD33的游动孢子侵染不同时期的RxLR129113的表达量。

图3为本发明实施例中RxLR129113在本氏烟上的致病性分析；其中，A代表的是pBIN-GFP；B代表的是RxLR129113；C代表的是Buffer；D代表的是INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

图4为本发明实施例中瞬时表达RxLR129113、接种致死基因Bax及接种致死基因INF1三种情况下的Western Blot检测结果。

图5为本发明实施例中RxLR129113在本氏烟上抑制Bax引起细胞死亡分析；其中，A代表pBIN-GFP+24h Bax；B代表RxLR129113+24h Bax；C代表Buffer+24h Bax。右侧是台盼蓝染色结果。

图6为本发明实施例中RxLR129113在本氏烟上抑制INF1引起细胞死亡分析；其中，A代表pBIN-GFP+24h INF1；B代表RxLR129113+24h INF1；C代表Buffer+24h INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

图7为本发明所述RxLR129113的截短体模式图。

图8为本发明实施例中RxLR19113的四个截短体在本氏烟上的致病性分析；其中，A代表的是RxLRW1；B代表的是RxLRW1-2；C代表的是RxLRW1-3；D代表的是RxLRW1-4；E代表的是RxLR129113；F代表的是INF1；G代表的是pBIN-GFP；H代表的是Buffer。右侧是台盼蓝染色结果。

图9为本发明实施例中RxLR129113的四个截短体在本氏烟上抑制Bax引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLRW1+24h Bax；B代表的是RxLRW1-2+24h Bax；C代表的是RxLRW1-3+24h Bax；D代表的是RxLRW1-4+24h Bax；E代表的是RxLR129113+24h Bax；F代表的是pBIN-GFP+24h Bax；G代表的是Buffer+24h Bax。右侧是台盼蓝染色结果。

图10为本发明实施例中RxLR129113的四个截短体在本氏烟上抑制INF1引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLRW1+24h INF1；B代表的是RxLRW1-2+24h INF1；C代表的是RxLRW1-3+24hINF1；D代表的是RxLRW1-4+24h INF1；E代表的是RxLR129113+24h INF1；F代表的是pBIN-GFP+24h INF1；G代表的是Buffer+24h INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

图11为本发明实施例中RxLR129113及四个截短体的免疫印迹分析结果；其中，1代表的是pBIN-GFP；2代表的是RxLRW1-4；3代表的是RxLRW1-3；4代表的是RxLRW1-2；5代表的是RxLRW1；6代表的是RxLR129113。

图12为本发明实施例中RxLR129113及四个截短体在本氏烟上的的亚细胞定位观察；其中，pBIN-GFP、RxLR129113、RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4均定位在细胞质和细胞核，RxLRW1定位在细胞核，pBIN-GFP作为对照。

图13为本发明实施例中RxLR129113NES和RxLR129113NLS亚细胞定位结果。

图14为本发明实施例中RxLRW1-3NES和RxLRW1-3NLS亚细胞定位结果。

图15为本发明实施例中RxLR129113(左)/RxLRW1-3(右)核输出、核输入致病性分析；其中，A代表的是RxLR129113NES；B代表的是RxLR129113NLS；C代表的是RxLR129113；D代表的是RxLRW1-3NES；E代表的是RxLRW1-3NLS；F代表的是RxLRW1-3；G代表的是pBIN-GFP；H代表的是INF1；I代表的是Buffer。右侧是台盼蓝染色结果。

图16为本发明实施例中RxLR129113核输出、核输入(左)/RxLRW1-3核输出、核输入(右)抑制Bax引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLR129113NES+24h Bax；B代表的是RxLR129113NLS+24h Bax；C代表的是RxLR129113+24h Bax；D代表的是RxLRW1-3NES+24hBax；E代表的是RxLRW1-3NLS+24h Bax；F代表的是RxLRW1-3+24h Bax；G代表的是pBIN-GFP+24h Bax；H代表的是Buffer+24h Bax。右侧是台盼蓝染色结果。

图17为本发明实施例中RxLR129113核输出、核输入(左)/RxLRW1-3核输出、核输入(右)抑制INF1引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLR129113NES+24h INF1；B代表的是RxLR129113NLS+24h INF1；C代表的是RxLR129113+24h INF1；D代表的是RxLRW1-3NES+24hINF1；E代表的是RxLRW1-3NLS+24h INF1；F代表的是RxLRW1-3+24h INF1；G代表的是pBIN-GFP+24h INF1；H代表的是Buffer+24h INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

图18为本发明实施例中RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS的Western Blot检测结果；其中，A代表的是RxLR129113NES；B代表的是RxLR129113NLS；C代表的是RxLR129113；D代表的是RxLRW1-3NES；E代表的是RxLRW1-3NLS；F代表的是RxLRW1-3；G代表的是pBIN-GFP。

图19为本发明实施例中P.p-RxLR129113和P.i-RxLR129113在本氏烟上的致病性分析；其中，A代表的是P.p-RxLR129113；B代表的是P.i-RxLR129113；C代表的是RxLR129113；D代表的是INF1；E代表的是pBIN-GFP；F代表的是Buffer。右侧是台盼蓝染色结果。

图20为本发明实施例中RxLR129113同源基因的Western Blot检测结果。

图21为本发明实施例中P.p-RxLR129113和P.i-RxLR129113在本氏烟上抑制Bax引起细胞死亡分析；其中，A代表的是P.p-RxLR129113+24h Bax；B代表的是P.i-RxLR129113+24h Bax；C代表的是RxLR129113+24h Bax；D代表的是pBIN-GFP+24h Bax；E代表的是Buffer+24h Bax。右侧是台盼蓝染色结果。

图22为本发明实施例中P.p-RxLR129113和P.i-RxLR129113在本氏烟上抑制INF1引起细胞死亡分析；其中，A代表的是P.p-RxLR129113+24h INF1；B代表的是P.i-RxLR129113+24h INF1；C代表的是RxLR129113+24h INF1；D代表的是pBIN-GFP+24h INF1；E代表的是Buffer+24h INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

图23为本发明实施例中RxLR129113与ALDH共定位。

图24为本发明实施例中RxLRW1-3与ALDH共定位。

图25为本发明实施例中NbALDH-1和NbALDH-2荧光定量PCR表达模式分析。

图26为本发明实施例中RxLR129113在沉默NbALDH的本氏烟上致病性分析；其中，A代表的是RxLR129113；B代表的是INF1；C代表的是pBIN-GFP；D代表的是Buffer。右侧是台盼蓝染色结果。

图27为本发明实施例中RxLR129113在沉默NbALDH的本氏烟上抑制Bax引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLR129113+24h Bax；B代表的是pBIN-GFP+24h Bax；C代表的是Buffer+24h Bax。右侧是台盼蓝染色结果。

图28为RxLR129113在沉默NbALDH的本氏烟上抑制INF1引起细胞死亡分析；其中，A代表的是RxLR129113+24h INF1；B代表的是Avr3a+24h INF1；C代表的是pBIN-GFP+24hINF1；D代表的是Buffer+24h INF1。右侧是台盼蓝染色结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物和菌株

供试烟草为本实验室保存的本氏烟Nicotiana benthamiana，本氏烟在温室中温度24℃左右，湿度70％左右，14h光照，10h黑暗种植，待烟草生长25d后供试验所用。供试辣椒为实验室自交系品种，将辣椒的种子放在铺有吸水纸的大培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养7d左右，待辣椒种子发芽后，将其种植于装有基质的花盆中，覆膜保湿。出苗后的管理和本氏烟一致。

供试菌株Phytophthora capsici LT1534和SD33为本实验室保存；Bax和INF1的农杆菌菌株由南京农业大学植物保护学院窦道龙教授惠赠。供试植物和菌株现均保存于山东蔬菜病虫害生物学重点实验室。

1.1.2载体与质粒

本实验中所用到的载体包括：植物表达载体pBIN-GFP由南京农业大学植物保护学院窦道龙教授惠赠；本实验室保存的N-RFP载体；pTRV﹕RNA1质粒和pTRV﹕RNA2质粒由清华大学刘玉乐老师惠赠。大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α和农杆菌感受态细胞GV3101购自泰安润梦生物技术有限公司。

1.1.3常用酶和生化试剂

TransFast Taq DNA Polymerase、EasyPure Plasmid Miniprep Kit、EasyPureQuick GelExtraction Kit、Trans 5αChemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶FastDigest KpnⅠ、Fast Digest SmaⅠ、FastDigest XbaⅠ均购自ThermoFisher Biotechnology Company；卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)、壮观霉素(Spectinmycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、乙酰丁香酮(Acetosyringone)均购自北京索莱宝科技有限公司；氯化镁(MgCl₂·6H₂O)、碳酸钙(CaCO₃)、氯化钠(NaCl)、脂肪酸甲酯磺酸盐(MES)均购自SIGMA-ALDRICH公司；燕麦、黑麦购自超市；乳酸、苯酚、氯仿、丙三醇、台盼蓝等均购自天津凯通试剂公司；95％的医用酒精购自泰安美兴公司；ChamQ^TMSYBRColor qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自诺唯赞生物公司。

1.1.4相关耗材和仪器

50mL Polystyrene Conical Tube购自FALCON公司；0.22um细菌过滤器购自Millipore公司。各量程移液器购自Thermo Scientific公司；基因扩增仪T20购自LongGeneCompany；CHB-T1-B新型金属浴购自BIOER TECHNOLOGY；台式PH仪购自METTLER TOLEDO公司；Direct Q-3超纯水仪购自Millipore公司；全自动凝胶成像系统购自SAGECREATION；Eppendorf centrifuge 5417R、5810R和5427R高速冷冻离心机购自Eppendorfcentrifuge；电热恒温水浴锅购自Shanghai Boxun Medical Biological InstrumentCorp；SPX智能型生化培养箱购自宁波江南仪器公司；磁力搅拌器购自上海仪电公司；涡旋振荡器购自SCDEALL；电子天平(精天)。

1.1.5常用培养基和相关溶液的配制

(1)LB培养基：NaCl 10g，YEAST EXTRACT 5g，TRYPTONE 10g，定容到1L，待完全溶解后进行分装，121℃灭菌30min后即可使用。固体LB培养基，则每100mL培养基加入1.5g琼脂粉。(2)燕麦培养基：称取25g燕麦，加适量ddH₂O，待煮沸30min后4层纱布进行过滤，定容至1L并用250mL三角瓶分装，则每100mL培养基中加入1.5g琼脂粉。高温高压灭菌后备用。(3)黑麦培养基：取黑麦60g，28℃恒温培养箱中催芽24h，匀浆，4层纱布过滤、加适量去离子水洗涤，收集浆液，加入Sucrose 20g，Agar 15g，定容至1L，1L培养基加入15g琼脂粉，高温高压灭菌即可使用。(4)Amp溶液(50mg/mL)：取1g Amp溶于20mL ddH₂O，0.22μm细菌过滤器进行过滤，分装至离心管中备用，-20℃保存。(5)Kana溶液(50mg/mL)：取1g Kana溶于20mLddH₂O，0.22μm细菌过滤器进行过滤，分装至离心管中备用，-20℃保存。(6)Spec溶液(50mg/mL)：取1g壮观霉素溶于20mL ddH₂O，0.22μm细菌过滤器进行过滤，分装至离心管中备用，-20℃保存。(7)Rif溶液(25mg/mL)：取1g Rif溶于40mL DMSO，0.22μm细菌过滤器进行过滤，分装至离心管中备用，-20℃保存。(8)AS溶液(20mg/mL)：取1g AS溶于50mL DMSO，0.22μm细菌过滤器进行过滤，分装至离心管中备用，-20℃避光保存。(9)0.5M EDTA：称EDTANa₂18.61g溶于80mL ddH₂O，搅拌均匀，同时用NaOH调节pH值为8.0，定容至100mL，高温高压灭菌，于4℃保存。(10)5×TBE缓冲液：称54g Tris Base、27.5g Orthoboric acid、20mL 0.5mol/L EDTA溶液(pH 8.0)，定容到1L，待溶解均匀，常温保存。(11)CTAB溶液：称取CTAB 2g、Tris-HCl 5mL、0.5M EDTA 4mL、5M NaCl 28mL，加ddH₂O溶解并定容到100mL，灭菌后于4℃备用。(12)核酸Loading Buffer：Sucrose20g、Bromophenol blue 0.125g加50mLddH₂O，磁力搅拌器搅拌至溶解，分装，于4℃保存。(13)10mM MgCl₂：称取MgCl₂ 2.032g溶于1000mL ddH₂O，灭菌后备用。(14)台盼蓝母液：称取台盼蓝0.4g，苯酚200mL，乳酸200mL，丙三醇200mL，去离子水200mL，混匀备用。(15)水合氯醛脱色液：称取水合氯醛1.0kg，ddH₂O600mL，混匀后备用。

2.方法

1.2.1RxLR效应因子的生物信息学和理化性质分析

本研究从辣椒疫霉的全基因组中筛选了1个RxLR效应因子。效应因子的具体信息利用DNAMAN软件进行分析，信号肽预测利用SignalP 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行预测。

1.2.2引物设计

本研究利用软件DNAMAN进行引物设计，按照引物设计的原则，设计了克隆辣椒疫霉RxLR效应因子基因的全长引物、构建pBIN载体时所需要的带有酶切位点的引物。设计的引物如下表1，引物由青岛派森诺公司合成。

表1效应因子的全长引物

1.2.3辣椒疫霉LT1534总DNA的提取

将辣椒疫霉菌株LT1534移到固体燕麦平板上，25℃恒温培养箱内培养7d以后收集菌丝。

(1)将收集好的菌丝放入灭过菌的1.5mL离心管中，加上钢珠用破碎仪破碎5min，重复3次。加入650μL提前放置于65℃水浴中融化的CTAB，上下颠倒数次混匀。(2)65℃水浴1h左右，每隔10min轻轻颠倒混匀，颠倒时不可过于剧烈，以防DNA断裂。(3)10000rpm，4℃，离心10min，取上清。(4)加入等体积的氯仿：异戌醇(24:1)，在摇架上摇20min。(5)10000rpm，4℃，离心10min，取上清。(6)加入相同体积Isopropanol，轻轻上下颠倒数次，25℃静置20min。(7)10000rpm，4℃，离心10min，弃上清。(8)用200μL 95％无水乙醇洗涤两至三次，65℃烘干。(9)加入50μL ddH₂O，静置使沉淀充分溶解，于-20℃保存。

1.2.4辣椒疫霉LT1534游动孢子侵染辣椒后总RNA的提取

供试辣椒疫霉菌采用燕麦培养基进行活化，培养一周后，在培养基中移除4块1cm见方的菌丝块，用灭过菌的山泉水每隔30min洗一次，共洗10次左右。将处理后的培养基放置于16℃培养箱中培养12h，待其孢子悬浮液浓度为2×10⁴个/mL，收集游动孢子悬浮液备用。接种前将辣椒叶片用75％的酒精进行表面消毒，用接种针在叶片中间位置扎一个小孔(提前收集辣椒疫霉菌丝为对照材料)，每个辣椒叶片滴加约10μL孢子悬浮液，25℃培养箱中保湿静置培养，于接种后1.5h、3h、6h、12h、24h、48h、72h分别取样，液氮冷冻，于-80℃保存备用。

准备：RB Buffer内加入2.2mL的巯基乙醇，RNA Wash Buffer每瓶分别加入48mL的无水乙醇。

用研钵充分研磨叶片，研磨过程中防止环境中RNA酶降解RNA，将磨碎的叶片加入到预冷的1.5mL离心管中(大约0.75mL左右)。

(1)在样品解冻前立即加入500μL的RB Buffer(已加入巯基乙醇)。用涡旋振荡仪涡旋混匀(保证样品裂解完全)。(2)吸附柱gDNA Filter Columu提前装入2mL收集管中，并将裂解液全部转移至gDNA Filter Columu中。室温14000g离心5min(若未全部离下，可将柱中剩余的裂解液转移到新的吸附柱中，再次离心直至全部离下)。(3)将收集管中的裂解液定量(400～450μL)加入到新的1.5mL离心管中，注意不要吸到底部沉淀。(4)加入与裂解液等体积的Absolute ethanol，涡旋震荡20s。此时可能形成沉淀，这不会干扰DNA的形成。上下颠倒10～15次可能会破坏沉淀。将HiBind RNA Mini Columu放入2mL的收集管中，并将700μL的样品吸入到HiBind RNA Mini Columu中(吸取的样品中可能会有沉淀)。12000g室温离心1min。弃废液，并重复该步骤，直至样品全部过柱。(5)加入400μL的RWF WashBuffer，10000g离心30s，弃废液，并将HiBind RNA Mini Columu放入新的2mL收集管中。(6)加入500μL RNA Wash Buffer II(已加入无水乙醇)，10000g离心30s，弃废液。(7)重复一遍步骤(6)，再14000rpm空离2min，来干燥收集管。(8)将HiBind RNA Mini Columu放入新的1.5mL离心管中，加入50～100μL DEPC水(DEPC提前于65℃预热，并确保DEPC水加到膜上)。14000rpm离心2min，洗脱下来的RNA测浓度后保存于-80℃冰箱。

1.2.5辣椒疫霉RNA反转录成cDNA

(1)根据所测的RNA浓度，将RNA样品加入到PCR管中(1pg≤RNA≤1μg)。(2)加RNase-free water补足至12μL，4×DNA wiper Mix 4μL，混匀。(3)42℃孵育2min。(4)再加入5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ，轻轻混匀。(5)50℃孵育15min，85℃加热5s失活5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ和4×DNA wiper Mix。(6)测反转录后cDNA浓度。OD260/OD280需在1.8～2.0之间(若用于qRT-PCR，需将浓度稀释至0.1左右)，于-20℃保存备用。

1.2.6辣椒疫霉菌株SD33中RxLR效应因子的克隆及载体构建

以Phytophthora capsici全基因为模板，按照PCR反应体系进行克隆：25μL10×PCR Mix，2μL上游引物，2μL下游引物，2μL DNA，19μL ddH₂O，共体系50μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58～62℃退火60s，72℃延伸90s(1min扩增1000bp)，72℃总延伸5～10min。

PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收目的条带，将回收的PCR产物连接到测序载体pEASY-T3载体上，送样测序。目的条带回收步骤如下(BioTeke Corporation多功能DNA纯化回收试剂盒)：

(1)在紫外灯下将所需目的DNA条带切下。(2)将含有目的条带的凝胶放入1.5mL离心管中，加400μL Binding Solution。(3)65℃金属浴放置直至凝胶溶解完全，每2min上下轻轻摇晃以加速溶解。(4)将产物加入到带有收集管的吸附柱中，6000rpm离心60s，去掉收集管的废液。(5)加入500μL WA，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。(6)加入500μL Washing Solution，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复两次。(7)12000rpm空离2min，把吸附柱放置在新的1.5mL离心管。(8)65℃烘干10min，烘干后向吸附柱中加入35μL灭菌水，静置2min，12000rpm离心2min，离心管中的液体即为目的基因，使用分光光度计测其浓度，-20℃中保存。

目的基因克隆到pEASY-T3载体的步骤如下：(1)在离心管中加入PCR产物5μL，pEASY-T3 Cloning Vector 1μL，混匀，25℃反应15min。(2)加入在冰上解冻的Trans5αChemically Competent Cell 50μL，冰浴半小时。(3)将离心管放入42℃恒温水浴锅中热激60s，然后冰上放置2min。(4)加入500μL不含抗生素的液体LB培养基，37℃，200rpm震荡培养45～60min。(5)8000rpm离心60s，留约100μL上清液重悬沉淀，均匀的涂布于加有Amp(50μg/μL)的固体LB平板上，于37℃倒置培养16h。(6)挑取单个菌斑于加有Amp(50μg/μL)的液体LB培养基中，37℃200rpm培养12h，以菌液作为反应体系的模板，用基因引物进行PCR扩增，并在琼脂糖凝胶中跑电泳，若有条带且条带大小正确，吸500μL菌液送往青岛派森诺公司测序。(7)测序结果与基因序列进行比对，结果比对正确即目的基因已成功克隆到pEASY-T3载体上。

以效应因子克隆到pEASY-T3载体上的质粒为模板，用去掉信号肽的效应因子片段设计引物，设计引物时，根据载体图1分析植物表达载体pBIN-GFP上的酶切位点和效应因子本身的酶切位点将其构建到载体上。

重组质粒的构建步骤如下所示：(1)以pEASY-T3载体上的质粒为模板，效应因子带酶切位点的引物来克隆效应因子片段。(2)将克隆的效应因子片段和载体pBIN-GFP的质粒进行双酶切，酶切位点要一致。片段酶切体系为：DNA 0.2μg、10×buffer 4μL、内切酶各1μL，ddH2O补足30μL；载体酶切体系为：DNA 2μg、10×buffer 4μL、内切酶各1μL，ddH2O补足40μL。将酶切产物进行回收。(3)将酶切产物进行连接，16℃恒温连接4～6h。连接体系为：基因片段8μL、载体2μL、Solution I 10μL。

将连接产物转化到Trans5α中：(1)将50μL Trans5α感受态细胞加入到连接产物中，轻轻的混匀，冰浴30min。(2)42℃的水浴锅热激45s，然后于冰上放置2min。(3)加入500μL没有抗性的液体LB培养基，37℃，200rpm震荡培养1h。(4)25℃7000rpm离心60s，弃部分上清，用剩余100μL上清重悬沉淀，均匀涂布于固体LB平板上(Kana抗性)，37℃培养箱培养12h。(5)挑取单个菌斑于含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养10h，PCR验证，验证正确的送往青岛派森诺公司测序。

1.2.7农杆菌介导的瞬时表达技术

(1)用含有抗生素(Kana，Rif)的液体LB培养基50mL诱导已转化重组质粒的农杆菌，28℃过夜培养到OD₆₀₀＝1.0左右。(2)室温，3800rpm，离心5min，收集菌体，用MgCl₂(10mM)溶液重悬沉淀，洗涤3次。(3)配制促进农杆菌侵染的诱导液，100mL的MgCl₂加入200μl的AS和2ml的MES(pH＝5.6)，用适量的诱导液悬浮菌体，使菌体悬浮液的OD₆₀₀达到0.5，28℃培养箱中黑暗放置3h以上。(4)挑选生长35d左右的本氏烟叶片，用1mL的注射器从叶片背面轻轻按压将菌液渗透进入叶片。重复多次，直至接种叶片数量达15片。(5)一周后观察症状，并拍照记录。

1.2.8 VIGS实验

选取NbALDH中特异性的两段序列，构建到pTRV﹕RNA2沉默载体。按照农杆菌介导的瞬时表达技术收集菌液，使农杆菌菌体悬浮液的OD₆₀₀值为1.0左右，将等体积的pTRV1农杆菌悬浮液和pTRV2携带目的基因的农杆菌悬浮液混合均匀后，开始注射本氏烟草叶片(以pTRV1和pTRV2为对照)。所注射本氏烟草为萌发25天左右幼苗，具有5片真叶的茁壮生长的植株。在本氏烟接种TRV病毒后10d，提取叶片的RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测目的基因是否被沉默。若被沉默，在沉默目的基因的本氏烟上验证效应因子的功能。

1.2.9辣椒疫霉游动孢子侵染实验

在本氏烟接种效应因子，24h后在接种点滴加辣椒疫霉游动孢子悬浮液(以pBIN-GFP作为对照)，三天后进行照相，用台盼蓝染色观察其侵染面积。

1.2.10台盼蓝染色

(1)首先将配制好的台盼蓝原液与95％无水乙醇按照1:2的体积稀释混匀备用。(2)待水煮沸后，放入盛有适量的台盼蓝液体(根据叶片的多少而定)的烧杯，预热1min。(3)将接种的叶片在烧杯煮沸1～2min(注意一次不要煮太多叶片，防止染色不均匀)。(4)煮完后，将叶片和台盼蓝液体转移至大培养皿中，过夜浸泡(大约12h左右)。(5)第二天用水合氯醛脱色液对叶片进行脱色，一天更换两次，直到叶片脱色完全。(6)最后置于95％酒精浸泡，等到叶片变结实拍照。

1.2.11Western Blot

(1)将瞬时表达效应因子两天后的本氏烟叶片液氮研磨，加650μL LoadingBuffer，混匀，冰上放置。煮沸5min，振荡均匀，再煮沸5min。(2)室温，10000rpm，离心10min。(3)吸上清，转移到2mL离心管中备用。(4)SDS-PAGE电泳，上样量为30μL，marker 8μL。(5)跑电泳后，恒流转膜，根据蛋白的大小调整转膜时间，约1.5h。(6)转完膜后，将膜置于25mL5％的脱脂奶粉封闭液中封闭(水平摇床中)，1.5h以上。(7)加入单克隆抗体一抗(鼠抗)(3000：1)，孵育1h；TBST洗膜液洗膜3次，每次5min。(8)用封闭液稀释兔抗鼠二抗(5000：1)，膜在二抗中室温反应55～60min；TBST洗膜3次，每次5min。(9)ECL显影拍照(显色液按1：1比例配)。

1.2.12亚细胞定位观察

本实验中用到的植物表达载体pBIN-GFP和N-RFP分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，接种48h后可以用激光共聚焦显微镜观察荧光表达情况，确定目的基因表达后，照其亚细胞定位。

2.实验结果与分析

2.1辣椒疫霉效应因子RxLR129113的克隆

以辣椒疫霉菌株SD33的DNA作为模板，利用特异性引物对其进行PCR扩增。

扩增产物经电泳检测有特异性扩增的条带，且与预测目的条带大小一致，将上述目的条带回收，构建到pEASY-T3载体中，送样测序，比对正确后，摇菌提质粒，置于-20℃保存。得到的基因序列分析结果如下：辣椒疫霉效应因子RxLR129113序列全长为1437bp，编码478个氨基酸，预测的分子量为54.6kDa。通过软件生物信息学分析结果显示，RxLR129113信号肽1～60bp，没有跨膜区。

2.2 RxLR效应因子pBIN-GFP植物载体构建

根据pBIN-GFP的载体图谱，设计合适的酶切位点，将已经去掉信号肽的目的基因构建到载体上，并转大肠杆菌Trans5α感受态，对重组质粒进行菌液PCR验证，送样测序，比对正确后，摇菌提质粒，置于-20℃保存。

2.3辣椒疫霉效应因子RxLR129113表达模式分析

以辣椒疫霉菌株SD33的游动孢子侵染不同时期的辣椒叶片的cDNA为模板，SD33菌丝体时期的cDNA为对照，辣椒疫霉菌的Actin为内参，qRT-PCR检测不同时期RxLR129113的表达量。qRT-PCR如图2所示。

对RxLR129113的转录水平的分析可以得出RxLR129113在侵染早期上调表达，1.5h时表达量最高，然后急剧下降。

2.4辣椒疫霉效应因子RxLR129113的功能分析

2.4.1辣椒疫霉效应因子RxLR129113的致病性分析

以pBIN-GFP、Buffer缓冲液为阴性对照，致死基因INF1为阳性对照，接种效应因子RxLR129113一周后，观察本氏烟叶片接种位置的坏死情况，并进行台盼蓝染色实验(图3)。可以发现RxLR129113能在本氏烟上引起HR反应。为了保证实验结果的可靠性，每次接种同一批叶片10片左右，重复3次。Western Blot检测见图4A。

2.4.2 RxLR129113抑制Bax引起的细胞死亡

以pBIN-GFP、Buffer缓冲液为阴性对照，验证RxLR效应因子是否能够抑制致死基因引起本氏烟细胞坏死。瞬时表达RxLR129113，24h后接种致死基因Bax，一周后观察RxLR129113能抑制Bax引起的PCD(图5)。Western Blot检测见图4B。

2.4.3 RxLR129113抑制INF1引起的细胞死亡

瞬时表达RxLR129113，24h后接种致死基因INF1，以pBIN-GFP、Buffer缓冲液为阴性对照，一周后验证了RxLR129113能够抑制INF1引起本氏烟细胞坏死(图6)。Western Blot检测见图4C。

2.5 RxLR129113的四个截短体载体构建

辣椒疫霉效应因子RxLR129113能够在本氏烟上引起HR，而且能抑制Bax和INF1引起的细胞坏死。为了进一步确定关键功能域，根据RxLR129113已解出的结构对其进行了截短，得到四个截短体(图7)。

2.6辣椒疫霉效应因子RxLR129113的四个截短体功能分析

2.6.1 RxLR129113的四个截短体致病性分析

已知RxLR129113能引起本氏烟坏死，为了筛选其关键功能域，以RxLR129113和INF1为阳性对照，pBIN-GFP和Buffer为阴性对照，对截短体的自身功能进行验证(图8)，重复3～4次保证实验结果的可靠性。

2.6.2 RxLR129113的四个截短体抑制Bax引起的细胞死亡

以pBIN-GFP、Buffer缓冲液为阴性对照，RxLR129113为阳性对照，瞬时表达RxLRW1、RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4，24h后接种致死基因Bax，一周后观察抑制Bax情况(图9)。

从结果可以得出，RxLRW1、RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4能抑制Bax诱导的PCD，而且RxLRW1-3抑制效果比RxLR129113抑制效果强。说明RxLRW1-3是抑制Bax诱导的PCD的关键功能域。

2.6.3 RxLR129113的四个截短体抑制INF1引起的细胞死亡

以pBIN-GFP、Buffer缓冲液为阴性对照，RxLR129113为阳性对照，瞬时表达RxLRW1、RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4，24h后接种INF1，一周后观察抑制INF1情况(图10)。

从结果可以得出，RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4能抑制INF1引起的细胞死亡，RxLRW1不能抑制INF1引起的细胞死亡。RxLRW1-3抑制效果比RxLR129113抑制效果强，即RxLRW1-3是抑制INF1引起的细胞死亡的关键功能域。所以把RxLRW1-3作为后续研究RxLR129113的关键功能域。

2.6.4RxLR129113及四个截短体的Western Blot检测

在本氏烟上瞬时表达RxLR129113及四个截短体，48h后对表达量高的叶片收样，进行Western Blot检测。实验结果证明，RxLR129113及四个截短体均能在蛋白水平稳定表达(图11)。

2.6.5 RxLR129113及四个截短体的亚细胞定位

为了验证效应因子侵染植物细胞具体亚细胞结构，RxLR129113及四个截短体接种本氏烟48h后，利用双分子荧光共聚焦显微镜观察亚细胞定位(图12)，可以发现RxLRW1定位在细胞核，RxLR129113、RxLRW1-2、RxLRW1-3和RxLRW1-4均定位在细胞质和细胞核。

2.7核输出与核定位信号对RxLR129113及RxLRW1-3功能的影响

通过之前的实验结果可以看出，RxLR129113、RxLRW1-3均定位在细胞质和细胞核中，为了验证它们的功能是在细胞质或者细胞核起作用，RxLR129113、RxLRW1-3的C末端分别加入一个核输出(NES)或核输入(NLS)信号，构建到pBIN-GFP载体上成为RxLR129113/RxLRW1-3的核输出与核输入融合蛋白。

2.7.1 RxLR129113/RxLRW1-3核输出与核定位信号对亚细胞定位的改变

在本氏烟瞬时表达RxLR129113(RxLRW1-3)NES、RxLR129113(RxLRW1-3)NLS，48h后用双分子荧光共聚焦显微镜观察融合基因的定位情况(图13、图14)。结果说明，NES成功的将RxLR129113(RxLRW1-3)定位到细胞质中；NLS成功将RxLR129113(RxLRW1-3)定位到细胞核中。

2.7.2 RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS致病性分析

在本氏烟上瞬时表达RxLR129113NES、RxLR129113NLS，以RxLR129113、pBIN-GFP、INF1、Buffer为对照，验证RxLR129113NES、RxLR129113NLS功能是否发生变化。同理，对RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS也进行了功能验证(图15)。实验结果说明RxLR129113NES可以引起本氏烟细胞坏死，RxLR129113NLS不能引起本氏烟坏死；RxLRW1-3NES比RxLRW1-3NLS明显引起本氏烟细胞坏死。由此得出RxLR129113的致病性是在细胞质发挥功能。

2.7.3 RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS抑制Bax、INF1引起的细胞死亡

瞬时表达RxLR129113NES、RxLR129113NLS，以RxLR129113、pBIN-GFP、Buffer为对照，24h后接种致死基因Bax、INF1，验证RxLR129113NES、RxLR129113NLS是否抑制Bax、INF1引起的细胞死亡。同理，对RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS也进行了抑制Bax、INF1实验(图16，图17)。

实验结果为RxLR129113NES抑制Bax、INF1坏死的效果强于RxLR129113NLS；RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS能抑制Bax、INF1引起的细胞坏死。RxLR129113抑制Bax、INF1引起的坏死主要在细胞质发挥功能。

2.7.4 RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS的WesternBlot检测

在本氏烟上瞬时表达RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS，两天后收样，进行Western Blot检测。实验结果证明，RxLR129113NES、RxLR129113NLS、RxLRW1-3NES、RxLRW1-3NLS均能在本氏烟上稳定表达(图18)。

2.8同源基因分析

RxLR129113在烟草疫霉和致病疫霉中查找其同源基因为P.i-RxLR129113、P.p-RxLR129113。P.i-RxLR129113、P.p-RxLR129113在DNAMAN上与辣椒疫霉效应因子RxLR129113进行序列比对，发现其氨基酸相似率为55.30％。

2.8.1RxLR129113同源基因的致病性分析

瞬时表达P.p-RxLR129113、P.i-RxLR129113，以RxLR129113、INF1、pBIN-GFP、Buffer为对照，一周后观察症状(图19)。Western Blot检测见图20。

由实验结果可以看出，P.p-RxLR129113不能引起本氏烟细胞死亡，P.i-RxLR1129113能够引起本氏烟细胞死亡。P.p-RxLR129113对RxLR129113寻找关键氨基酸有一定的作用。

2.8.2 RxLR129113同源基因抑制Bax引起的细胞坏死

瞬时表达P.p-RxLR129113、P.i-RxLR129113，以RxLR129113、pBIN-GFP、Buffer为对照，24h后接种致死基因Bax，一周后观察症状(图21)。

由实验结果可以看出，P.p-RxLR129113和P.i-RxLR129113能抑制Bax引起本氏烟细胞死亡，且抑制效果没有RxLR129113的抑制效果强。

2.8.3 RxLR129113同源基因抑制INF1引起的细胞坏死

瞬时表达P.p-RxLR129113、P.i-RxLR129113，以RxLR129113、pBIN-GFP、Buffer为对照，24h后接种INF1，一周后观察症状(图22)。

由实验结果可以看出，P.p-RxLR129113和P.i-RxLR129113能不同程度抑制INF1引起本氏烟细胞死亡，且抑制效果没有RxLR129113的抑制效果强。

2.9辣椒疫霉效应因子RxLR129113/RxLRW1-3与筛选的互作蛋白乙醛脱氢酶(ALDH)的共定位

已知实验室通过酵母双杂系统、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验从辣椒cDNA库筛选出RxLR129113/RxLRW1-3的互作蛋白ALDH。为了验证RxLR129113/RxLRW1-3与互作蛋白互作后是否会影响互作蛋白的定位，在本氏烟瞬时共表达RxLR129113/RxLRW1-3与ALDH在烟草中共表达，观察互作后ALDH的定位变化(图23、图24)。从共定位结果得出RxLR129113/RxLRW1-3与ALDH共定位在细胞质，即RxLR129113/RxLRW1-3与ALDH在细胞质互作。

实施例2

本实施例通过沉默乙醛脱氢酶(NbALDH)后验证RxLR129113的功能。

1.本氏烟NbALDH基因的瞬时沉默

为了验证ALDH是否影响RxLR129113的功能，将辣椒ALDH基因与本氏烟基因组DNA进行比对，本氏烟中同源率最高的ALDH为NbALDH(核苷酸序列如SEQ ID No.45所示)。

从NbALDH的N端和C端筛选出两段300bp左右特异性序列NbALDH-1(核苷酸序列如SEQ ID No.46所示)、NbALDH-2(核苷酸序列如SEQ ID No.47所示)，并构建至pTRV2病毒沉默载体中，测序验证正确后，转至农杆菌GV3101中。

2.沉默乙醛脱氢酶(NbALDH)后验证RxLR129113的功能变化

2.1NbALDH基因沉默的荧光定量PCR结果

以接种pTRV1和pTRV2的本氏烟作为对照，本氏烟Actin为内参，检测NbALDH-1，NbALDH-2的表达量。从图25的荧光定量PCR结果可以得出本氏烟的NbALDH-1，NbALDH-2基因沉默效率达70～80％，即沉默成功。

2.2沉默NbALDH后验证RxLR129113的致病性变化

以pBIN-GFP、Buffer、INF1作为对照在沉默乙醛脱氢酶本氏烟上瞬时表达RxLR129113，以接种TRV1和TRV2的本氏烟作为沉默对照。接种一周后，对接种叶片进行拍照，台盼蓝染色(图26)。实验结果说明在沉默NbALDH的本氏烟上，RxLR129113仍然能引起细胞死亡。RxLR129113与NbALDH互作并不能引起RxLR129113的致病性变化。

2.3沉默NbALDH后验证RxLR129113对抑制Bax引起的细胞死亡分析

以pBIN-GFP、Buffer作为对照在沉默乙醛脱氢酶本氏烟上瞬时表达RxLR129113，24h后接种致死基因Bax，以接种TRV1和TRV2的本氏烟作为沉默对照。接种一周后发现RxLR129113能够抑制Bax引起的细胞死亡(图27)。由此说明RxLR129113与NbALDH互作并不影响对Bax引起细胞死亡的抑制。

2.4沉默NbALDH后验证RxLR129113对抑制INF1引起的细胞死亡分析

以Avr3a、pBIN-GFP、Buffer作为对照在沉默乙醛脱氢酶本氏烟上瞬时表达RxLR129113，24h后接种致死基因INF1，以接种TRV1和TRV2的本氏烟作为沉默对照。Bos等证明了在本氏烟上瞬时表达Avr3a时可以抑制由INF1引起的细胞死亡。接种一周后发现RxLR129113能够抑制INF1引起的细胞死亡(图28)。由此说明RxLR129113与NbALDH互作并不影响对INF1引起细胞死亡的抑制。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种菌类效应因子及其编码基因与应用

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)

<400> 1

atgcatctcc aaatcgcgct gtttctggtt gtagtctccc ttctcgtcaa tgttgaagcg 60

gtgccagcaa aagcccaatc cgattatgtt gtctcttttc gacacatcgg acggctacta 120

cgagacgaga gggaggagag aggagtcagt gcaaatgccg tggaaacaat caccgacgct 180

gtggagtcta aaatcaacac tgcacaactc aaaagctggc tggagagtgg agaatccgcc 240

gacgacgtgt ttaaactgct gaaactcgac agcgcagcgg ataaagtcct gggccatgcg 300

aaactggacg aatggatcga atacatgaag cttttcaacg gtcaaaaagg cagcaagaaa 360

acgactttga tcaagacttt gacggctcac tttgaagacg atggtgtggc gaggatgatc 420

cagaaggcct tgcaggtcga ttcaactgct aaaatggcaa aacgattgca attcgagcag 480

attcaacggt ggttggggca ggagaagacc ccagaggaag ttttaaccct gctgaaactg 540

gatatcaatc ggtatgatct ctttgaaaaa ccggaactgc tcacctgggt caagtacttg 600

gacgactgga acaagatgta tccagacaga cagacgactc tttttgccag aatttcccct 660

cttctggagg aaggaattct agcaaatatg ctgataaaag ccaaaagtgt ggctagtacc 720

gagaaaatcg ccttacggat tcaagccgag cagactgcgt catggcttaa agcggagaag 780

acaccggacg atttattcac tttattgaga ctcaacagag ctgaagactc gcccctgcta 840

gagaacccaa tcttcgacgc ttgggtgaaa tacgccgacg attttcgaga aatgtacccc 900

aaagttagtt ttgaccccat tgccacgatc tcggagcatt acactgctgc gcaagtggcg 960

acgatgatcg ttgaagcttc caagtctcct agcacatcca gtatcgccca ccggttgaat 1020

actgaacagt tccgggactg gctcaacact cgtcagtccc ctgtacgcgt tttcaaactg 1080

ctcaaattgg acgaagcggg cgataaattg ttccagagtc ctgtgatcac cacgtggctg 1140

aattacgcga ctttttacag cacgaaaagg gaaaaagtga gtatcacgac gttgctcagg 1200

aaacgctttg gcgatgaggt tctcgctgga attttaacag acgcccagca agttccagcg 1260

acaaaagaag aagccacgaa actattaact tcactggttg gtcgatggcc caagagtcga 1320

gtacatccgg ataatgtgta caaatggctc agagttgaag gaagagagaa aaccgatggg 1380

tttcgcttgt tttacgagcg atacgcagca gcctacaagg cggcgagaaa tggttaa 1437

<210> 3

<211> 478

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)

<400> 3

Met His Leu Gln Ile Ala Leu Phe Leu Val Val Val Ser Leu Leu Val

1 5 10 15

Asn Val Glu Ala Val Pro Ala Lys Ala Gln Ser Asp Tyr Val Val Ser

20 25 30

Phe Arg His Ile Gly Arg Leu Leu Arg Asp Glu Arg Glu Glu Arg Gly

35 40 45

Val Ser Ala Asn Ala Val Glu Thr Ile Thr Asp Ala Val Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Asn Thr Ala Gln Leu Lys Ser Trp Leu Glu Ser Gly Glu Ser Ala

65 70 75 80

Asp Asp Val Phe Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ala Ala Asp Lys Val

85 90 95

Leu Gly His Ala Lys Leu Asp Glu Trp Ile Glu Tyr Met Lys Leu Phe

100 105 110

Asn Gly Gln Lys Gly Ser Lys Lys Thr Thr Leu Ile Lys Thr Leu Thr

115 120 125

Ala His Phe Glu Asp Asp Gly Val Ala Arg Met Ile Gln Lys Ala Leu

130 135 140

Gln Val Asp Ser Thr Ala Lys Met Ala Lys Arg Leu Gln Phe Glu Gln

145 150 155 160

Ile Gln Arg Trp Leu Gly Gln Glu Lys Thr Pro Glu Glu Val Leu Thr

165 170 175

Leu Leu Lys Leu Asp Ile Asn Arg Tyr Asp Leu Phe Glu Lys Pro Glu

180 185 190

Leu Leu Thr Trp Val Lys Tyr Leu Asp Asp Trp Asn Lys Met Tyr Pro

195 200 205

Asp Arg Gln Thr Thr Leu Phe Ala Arg Ile Ser Pro Leu Leu Glu Glu

210 215 220

Gly Ile Leu Ala Asn Met Leu Ile Lys Ala Lys Ser Val Ala Ser Thr

225 230 235 240

Glu Lys Ile Ala Leu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Thr Ala Ser Trp Leu

245 250 255

Lys Ala Glu Lys Thr Pro Asp Asp Leu Phe Thr Leu Leu Arg Leu Asn

260 265 270

Arg Ala Glu Asp Ser Pro Leu Leu Glu Asn Pro Ile Phe Asp Ala Trp

275 280 285

Val Lys Tyr Ala Asp Asp Phe Arg Glu Met Tyr Pro Lys Val Ser Phe

290 295 300

Asp Pro Ile Ala Thr Ile Ser Glu His Tyr Thr Ala Ala Gln Val Ala

305 310 315 320

Thr Met Ile Val Glu Ala Ser Lys Ser Pro Ser Thr Ser Ser Ile Ala

325 330 335

His Arg Leu Asn Thr Glu Gln Phe Arg Asp Trp Leu Asn Thr Arg Gln

340 345 350

Ser Pro Val Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Leu Asp Glu Ala Gly Asp

355 360 365

Lys Leu Phe Gln Ser Pro Val Ile Thr Thr Trp Leu Asn Tyr Ala Thr

370 375 380

Phe Tyr Ser Thr Lys Arg Glu Lys Val Ser Ile Thr Thr Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Arg Phe Gly Asp Glu Val Leu Ala Gly Ile Leu Thr Asp Ala Gln

405 410 415

Gln Val Pro Ala Thr Lys Glu Glu Ala Thr Lys Leu Leu Thr Ser Leu

420 425 430

Val Gly Arg Trp Pro Lys Ser Arg Val His Pro Asp Asn Val Tyr Lys

435 440 445

Trp Leu Arg Val Glu Gly Arg Glu Lys Thr Asp Gly Phe Arg Leu Phe

450 455 460

Tyr Glu Arg Tyr Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Arg Asn Gly

465 470 475

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgccagcaa aagcccaatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaaccattt ctcgccgcct 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctagatt aaccatttct cgccgcct 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctctagatt caaagtgagc cgtcaaag 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctctagaca gaagagggga aattctggc 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctctagaag tgtaatgctc cgagatcgtg 30

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctctagaaa agcgtttcct gagcaacg 28

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 16

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctctagact acttgttaat atcaagtcca gccaacttaa gagcaagctc gttaccattt 60

ctcgccgcct 70

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctctagact atcctccacc tttctcttct tcttaggctg accatttctc gccgcct 57

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 20

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctctagact acttgttata tcaagtccag ccaacttaag agcaagctcg ttagtgtaat 60

gctccga 67

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggggtaccg tgccagcaaa agcccaatc 29

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctctagact atcctccacc tttctcttct tcttaggctg accatttctc gccgcct 57

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agtccgccct gagcaaaga 19

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggaattgtga gcggataa 18

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggggtaccg tcgaacatca tgacagatac tctg 34

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctctagact atttcgccga acggtgat 28

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cggggtaccg tgttgaaggc gactgtactc cc 32

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gctctagatt acttaggcga agtttttctt cttt 34

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgagtttt gcaaagaaag agt 53

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc accaaaattg attccttgtg 50

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gctctagatg tggcaattgt gtagtctgga a 31

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tcccccggga cagcgctgac cagccgtac 29

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctctagaaa catgtcggag actgcttgtt c 31

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcccccgggg ggacagagtt gttaatttca accg 34

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgaagcggg cgataaat 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ctgagcaacg tcgtgatact 20

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aggagatggc caagttagc 19

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccgactcatc atactcgg 18

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

accatcaatg atcggaatgg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gctcatccta tcagcaatgc 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttggagaggt tcaagaagtc at 22

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

atcatatggt tagggcgttc ag 22

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gcggcatcgt caatgtaaac 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aagaatcact tcctgcctca c 21

<210> 45

<211> 1527

<212> DNA

<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)

<400> 45

atgagtttcg caaagaaaga gtacgaattt ctcaaggaga tcggaattgg ccctaaaaat 60

ctaggaggtt atgttaatgg cacctggaaa gctagtggct ccgtcatctc cactattaat 120

cccgccaaca atcagactat tgctgaagtt gtagaagctt ctgctcaaga ttatgaggaa 180

ggcatgcaag cttgctccga agcagcaaaa atttgggtgc aggttcctgc accaaaaaga 240

ggtgagattg ttaggcagat tggtgatgca ctccgagcaa accttcagga atttggtcgg 300

cttgtttcac tggaaatggg aaagatactc cccgaaggaa ttggagaggt tcaagaagtc 360

attgatatgt gtgattttgc cgtgggattg agtcggcaac tgaatggatc cattattcct 420

tctgaacgcc ctaaccatat gatgttggag atgtggaatc ctcttgggat agttggtgtg 480

atcacggctt tcaatttccc atgtgctgta cttggatgga atgcgtgtat tgcgctggtc 540

tgcggcaatt gtgttgtctg gaaaggtgct ccaacaacac cattggttac catagcgatg 600

acaaaaattg tggctagcgt attggagaaa aataatttac ctggttcaat ttttactgcc 660

ttctgtggtg gagctgaaat tggtgaagca atagcaaagg acactcgaat tcctctagtt 720

tctttcactg ggagctcaaa ggttggtctt gcagttcagc aaacagtaaa ccagagattt 780

ggaaaatgcc tactagaact aagcggaaat aatgcgataa tagtaatgga tgatgcagac 840

attgaacttg ctgttcgttc tgttttattt gctgctgttg gtacagctgg tcagcgctgt 900

acaacgtgcc ggagactgct tgttcacgag acagtttatg agaaggtact tgaaccgcta 960

gttgatgtgt acaagcaagt aaagataggg gaccctttag aaaaaggtat cttacttggg 1020

ccactgcata ctcgcacttc tagggaaaac tttcagaagg gaatccaaaa tatcaagtcc 1080

cagggtggaa agatccttac aggtggttca atcatagaat ctgagggtaa ctttgtgcat 1140

ccaacaattg ttgaaatatc ttcaaaagct gaagttgtga aggaagaatt gtttgctcca 1200

gttctttatg taatgaagtt taagagtttc gaagaagcag ttgaaattaa caactctgtc 1260

cctcaaggtt taagtagttc catcttcacc cgaaatccac aagtgatgtt taagtggatt 1320

ggagctcaag gaagtgactg cggcatcgtc aatgtaaaca taccaacaaa tggagctgaa 1380

attggtggtg cttttggagg tgaaaaaggt accggtggtg gccgtgaggc aggaagtgat 1440

tcttggaaac aatatatgag gcgctcaact tgtacaatca attatgggaa tgaactacca 1500

ttggcgcaag gaatcaattt tggctaa 1527

<210> 46

<211> 300

<212> DNA

<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)

<400> 46

ggtgagattg ttaggcagat tggtgatgca ctccgagcaa accttcagga atttggtcgg 60

cttgtttcac tggaaatggg aaagatactc cccgaaggaa ttggagaggt tcaagaagtc 120

attgatatgt gtgattttgc cgtgggattg agtcggcaac tgaatggatc cattattcct 180

tctgaacgcc ctaaccatat gatgttggag atgtggaatc ctcttgggat agttggtgtg 240

atcacggctt tcaatttccc atgtgctgta cttggatgga atgcgtgtat tgcgctggtc 300

<210> 47

<211> 310

<212> DNA

<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)

<400> 47

gttctttatg taatgaagtt taagagtttc gaagaagcag ttgaaattaa caactctgtc 60

cctcaaggtt taagtagttc catcttcacc cgaaatccac aagtgatgtt taagtggatt 120

ggagctcaag gaagtgactg cggcatcgtc aatgtaaaca taccaacaaa tggagctgaa 180

attggtggtg cttttggagg tgaaaaaggt accggtggtg gccgtgaggc aggaagtgat 240

tcttggaaac aatatatgag gcgctcaact tgtacaatca attatgggaa tgaactacca 300

ttggcgcaag 310

Claims (9)

1.一种菌类效应因子的编码基因，其特征在于，是来自于辣椒疫霉菌的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子。

2.一种DNA分子，其特征在于，是如下（1）~（3）中的任一种：

（1）核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1~1209bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1~1209bp互补的DNA分子；

（2）核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1~945bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1~945bp互补的DNA分子；

（3）核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1~666bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1~666bp互补的DNA分子。

3.一种DNA分子，其特征在于，其是核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列的1~396bp，或与SEQ ID No.2所示序列的1~396bp互补的DNA分子。

4.一种菌类效应因子，其特征在于，其由权利要求1所述的编码基因编码表达。

5.一种菌类效应因子，其特征在于，其由权利要求2所述的DNA分子编码表达。

6.一种菌类效应因子，其特征在于，其由权利要求3所述的DNA分子编码表达。

7.含有权利要求1所述的编码基因或含有权利要求2或3所述的DNA分子的重组表达载体、表达盒或重组菌。

8.权利要求1所述的编码基因或权利要求2所述的DNA分子或权利要求4或5所述的菌类效应因子在如下方面的应用：

（1）诱导寄主产生过敏性坏死反应；

（2）抑制Bax引起的细胞死亡；

（3）抑制INF1引起的细胞死亡；

（4）与乙醛脱氢酶在细胞质互作。

9.权利要求3所述的DNA分子或权利要求6所述的菌类效应因子在如下方面的应用：

（1）诱导寄主产生过敏性坏死反应；

（2）抑制Bax引起的细胞死亡；

（3）与乙醛脱氢酶在细胞核互作。

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