CN111713374B

CN111713374B - 一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质及其制备方法

Info

Publication number: CN111713374B
Application number: CN202010428543.9A
Authority: CN
Inventors: 朱春原; 李京; 高克祥; 李壮; 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-05-20
Also published as: CN111713374A

Abstract

本发明涉及蔬菜培育技术领域，具体公开了一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质及其制备方法。所述蔬菜育苗基质含有由效应因子RxLR129113表达的效应蛋白。本发明通过对效应因子RxLR129113表达的效应蛋白进行深入研究，将其作为添加剂引入蔬菜育苗基质中，发现其在促进蔬菜幼苗生长方面具有积极且显著的作用。进而开发出一种含有该效应蛋白的蔬菜育苗基质，对现有蔬菜育苗基质肥力不足的问题提供解决方案，并利用林业废弃物、菌渣、畜禽粪便等原料，解决污染的同时，降低了生产成本，对资源进行了充分利用，具有良好的社会效益和经济效益。

Description

一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质及其制备方法

技术领域

本发明涉及蔬菜培育技术领域，具体地说，涉及一种蔬菜育苗基质。

背景技术

基质育苗是无土栽培的一种，它是以栽培钵、栽培床等载体，装入不同的基质，并配置适当的供液装置进行栽培。基质作为植物生长的基础和媒介，具有配制材料来源广泛、高持水透气性和良好的保肥性能、防止土传病虫害、质地轻便于运输等优点。

随着设施农业的迅速发展，基质育苗技术正在大面积的推广应用，这也极大地促进了固体栽培基质的研究、开发与应用。

就目前来说，蔬菜育苗基质在生产和应用过程中还存在以下问题：一是基质来源单一，生产成本高，蔬菜育苗基质主要采用稻壳或秸秆发酵产物作为基料，作为农业生产的主要污染源的废弃物的畜禽粪便没有得到充分利用。二是肥力不足，尚需添加专用营养剂。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质及其制备方法。

本发明的目的之二是提供效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在作为蔬菜育苗基质添加剂方面的新用途。

需要说明的是，本发明中所述的效应因子RxLR129113已在公开号为CN110878315A(公开日为2020年03月13日)的中国专利申请文本被记载，本发明不再对其核苷酸序列及所表达的效应蛋白的氨基酸序列做赘述。

本发明所提供的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质，所述效应蛋白由效应因子RxLR129113表达。

所述效应蛋白的制备方法为：构建含有效应因子RxLR129113的基因工程菌，诱导效应因子RxLR129113表达为效应蛋白。

进一步地，所述蔬菜育苗基质包括基质前料和表达所述效应蛋白的基因工程菌的菌液，或由基质前料和表达所述效应蛋白的基因工程菌的菌液组成。

所述菌液与所述基质前料的相对用量为1.0～1.5mL/kg，所述菌液的菌体浓度为1.8*10⁸～2.0*10⁹菌体/mL。

更进一步地，所述基质前料由如下重量份的组分制备：林业废弃物及菌渣发酵物30～35份、发酵鸡粪15～20份、稻壳发酵料25～30份、草炭15～20份，多元复合肥5～8份。

第二方面，本发明提供一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)构建可表达效应因子RxLR129113的基因工程菌，筛选表达量较高的菌株进行扩大培养，培养至菌体浓度达到1.8*10⁸～2.0*10⁹菌体/mL，获得表达所述效应蛋白的基因工程菌的菌液；

(2)以重量份计，将林业废弃物及菌渣发酵物30～35份、发酵鸡粪15～20份、稻壳发酵料25～30份、草炭15～20份和多元复合肥5～8份均匀混合得到基质前料；

(3)将步骤(1)获得的菌液添加至步骤(2)获得的基质前料中，所述菌液相对于基质前料的添加量为1mL/kg。

其中，本发明表达效应因子RxLR129113的基因工程菌的构建方法采用本领域常规构建重组基因工程菌的方法。所述基因工程菌为大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3)菌株)。

进一步地，构建可表达效应因子RxLR129113的基因工程菌后，将筛选到的表达量较高的菌株按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的LB液体培养基中37℃，180rpm振荡培养3～4h，使其OD₆₀₀＝0.6～0.8；再将降温至16℃，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃条件下120rpm过夜诱导16～21h。

优选地，所述菌液添加至所述基质前料的方式为：先将所述菌液稀释500～1000倍，随后边搅拌所述基质前料边将稀释后的菌液通过喷雾的方式喷入基质前料中。

进一步地，所述林业废弃物及菌渣发酵物的制备方法为：将林业废弃物和菌渣按照1:1～1:2体积比混合均匀，调节混合物的水分含量至50％～60％，且碳氮比为25:1～30:1；添加好氧发酵菌，条式堆肥发酵，温度达到65℃前不翻动，达到65℃以上后保持4～5天，然后进行翻抛加氧排湿；每隔10天翻抛一次，翻抛4～5次；然后进行大堆陈化25～30天，陈化期间10天倒垛一次；发酵物呈褐色蓬松物即得所述林业废弃物及菌渣发酵物；作为优选，好氧发酵菌是VT发酵菌、EM发酵菌等发酵菌中的一种或多种，其用量为林业废弃物及菌渣总质量的0.05～0.1％。

进一步地，所述发酵鸡粪的制备方法为：将新鲜鸡粪晾晒或者机械除水至含量50％～60％，添加好氧发酵菌剂，调节碳氮比为25:1～30:1，进行条式好氧发酵，温度达到65℃以上翻抛，期间每隔5～7天翻抛一次，发酵温度降低无臭味得到所述发酵鸡粪。

进一步地，所述稻壳发酵料的制备方法为：将稻壳与新鲜牛粪按照1:1的体积比进行混匀，调节含水量至50％～60％，添加好氧发酵菌剂，调节碳氮比为25:1～30:1，进行条式好氧发酵，温度达65℃以上翻抛，期间每隔5～7天翻抛一次，翻抛3～5次进行大堆陈化。陈化期间每隔10天翻抛一次，温度降至室温物料无异味时得到稻壳发酵料。

进一步地，所述多元复合肥采用氮、磷、钾元素之比为1:1:1的多元复合肥。

可选地，以每100Kg多元复合肥为例，钾由氯化钾提供，用量为32.73kg；磷由磷酸一铵提供，用量为30kg，磷酸一铵中提供的氮的含量为3.6kg；氮由硫酸铵与前述磷酸一铵提供，其中，硫酸铵的用量为35.12kg；其余成分为填充用膨润土。

第三方面，本发明提供了所述蔬菜育苗基质在促进蔬菜生长方面的应用，以及效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在作为蔬菜育苗基质添加剂中的应用。

所述蔬菜优选为茄科蔬菜，如辣椒、番茄等。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对效应因子RxLR129113表达的效应蛋白进行深入研究，将其作为添加剂引入蔬菜育苗基质中，欣喜地发现了其在促进蔬菜幼苗生长方面所具有的积极作用。进而开发出一种含有该效应蛋白的蔬菜育苗基质，对现有蔬菜育苗基质肥力不足的问题提供解决方案，并利用林业废弃物、菌渣、畜禽粪便等原料，解决污染的同时，降低了生产成本，对资源进行了充分利用，具有良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中的pET28a载体图谱；

图2为本发明实施例1中RxLR129113基因PCR扩增结果；其中，M：DNA Marker，1-4：RxLR129113基因的PCR扩增条带；

图3为本发明实施例1中RxLR129113试表达的SDS-PAGE胶分析；其中，M：Proteinmarker；1-2：IPTG诱导RxLR129113蛋白表达；

图4为本发明实施例1中添加效应蛋白的新型育苗基质促进番茄幼苗长势的对照图；其中，A：对照，未添加效应蛋白的蔬菜育苗基质，B：添加效应蛋白的育苗基质；

图5为本发明实施例1中添加效应蛋白的新型育苗基质促进辣椒幼苗长势的对照图；其中，A：添加效应蛋白的蔬菜育苗基质；B：对照，未添加效应蛋白的育苗基质。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)效应分子RxLR129113基因克隆测序

1.1辣椒疫霉菌株强致病辣椒疫霉菌株SD33保存于山东农业大学蔬菜病虫生物学重点实验室保存。

1.2辣椒疫霉菌株SD33的RNA提取及反转录cDNA

实验室保存的强致病菌株SD33使用V8平板在28℃恒温培养箱进行培养。

1.2.1 RNA提取步骤如下：

1)磨样：使用液氮预冷的研钵研磨辣椒疫霉SD33菌丝至粉末状；

2)匀浆：取1g菌丝研磨粉末加10mL的Trizol，电动涡旋仪充分匀浆2min后，室温静置3-5min使其充分裂解；

3)4℃下转速12000rpm离心10min，吸上清弃沉淀；

4)200μL氯仿/mL Trizol加氯仿，震荡混匀(禁用涡旋震荡仪)后，25℃静置15min，4℃下转速13000rpm离心15min；

5)吸取上层水相至新离心管中，弃下层酚相，勿吸中间界面，酚相用来提取蛋白；

6)500μL异丙醇加入1mL Trizol进行颠倒，室温放置5-10min；

7)温度4℃、12000rpm转速离心10min，舍上清；

8)按1mL 5％Ethanol/mL Trizol比例加入无水乙醇，温和颠倒，温度4℃、转速8000rpm离心5min，尽量去除上清；

9)室温静置晾干或烘干5-10min，除去乙醇，RNA样品切勿过于干燥，否则溶解困难；

10)使用50μL H₂O、TE buffer或0.5％SDS溶解，溶剂经DEPC处理并高压灭菌121℃，30min；

11)使用紫外分光光度计测OD₆₀₀，A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8～2.0，A₂₆₀/A₂₃₀1.8～2.2，说明污染可忽略，成功。

1.2.2 RNA反转录合成cDNA，说明书流程如下：

1)RNA反转录去RNase离心管配制PCR体系，配制体系见表1。

表1.RT-PCR反应体系

配好后吸打混匀，离心后放置于冰上。

2)50℃孵育15min后，85℃孵育2min，其产物立刻用于PCR反应，或在-20℃保存，半年内可继续使用；长期保存建议分装后放置于-80℃冰柜内存放，cDNA应避免反复冻融。

1.3 RxLR129113基因PCR克隆引物设计

根据辣椒疫霉全基因组https://genome.jgi.doe.gov/portal/中RxLR129113基因序列(去信号肽序列)和重组载体pET28a两个酶切位点NcoI和XhoI设计一对特异引物：

上游引物RxLR129113F：

5’-CATGCCATGGTGGTGCCAGCAAAAGCCCAAT-3’；

下游引物RxLR129113R：

5’-CCGCTCGAGACCATTTCTCGCCGCCTTGT-3’。

为了后期RxLR129113蛋白纯化，确保pET28a载体C-端his标签正常翻译，去掉RxLR129113的终止密码子。该特异引物对由青岛擎科生物有限合成。

pET28a载体图谱如图1所示。

1.4 PCR扩增目的基因RxLR129113

通过聚合酶链式反应从cDNA中扩增目的片段，PCR反应体系见表2。

表2.RxLR129113基因PCR扩增体系

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带为1200bp左右，与目的基因条带大小基本一致。PCR扩增目的基因片段利用胶回收试剂盒(DNA回收试剂盒)回收，回收产物可在-20℃下短期保存备用。目的RxLR129113基因PCR扩增结果见图2。

2.重组载体构建

2.1目的基因和载体双酶切

将RxLR129113基因PCR扩增胶回收产物和载体pET28a分别用酶1(NcoI)和酶2(XhoI)进行双酶切，37℃水浴2～3h，双酶切反应体系见表3。将酶切之后的RxLR129113和载体pET-28a用胶回收试剂盒进行回收。

表3.RxLR129113和载体pET28a双酶切反应体系

2.2目的基因RxLR129113连接至载体pET-28a

将酶切的RxLR129113基因DNA片段与载体pET-28a回收后，用Solution I在16℃下连接3h，连接体系见表4。

表4.RxLR129113连接至载体pET-28a反应体系

2.3 pET-28a重组载体转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态

1)取50μL DH5α感受态细胞冰浴融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将离心管冰浴2min；

3)在超净台，每个离心管加入500μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm振荡培养45～60min，确保宿主菌完全复苏；

4)在常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

2.4重组载体pET28a鉴定

待上述制备的感受态细胞在平板上长出菌斑后，在2mL离心管中加入1.2mL无菌LB液体培养基(含相应抗生素)，挑取已长出的单菌落置于含LB液体培养基离心管中，37℃振荡培养5～6h，作为菌液PCR模板，适时进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系见表5。

表5.重组载体pET28a菌液PCR反应体系

菌液PCR反应样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，有PCR扩增结果的视为阳性样品，取阳性样品菌液400μL送青岛擎科生物有限公司测序，测序结果用DNAman软件与基因组序列比对分析，取测序结果正确的菌液840μL，加入50％灭菌甘油160μL后，置于-20℃冰柜中保存，另取测序结果正确的菌液提取质粒，置于-20℃冰柜中保存待用，质粒提取参照CWBIO高纯度质粒小提试剂盒说明书进行。

3.RxLR129113重组蛋白表达

3.1 RxLR129113重组蛋白的试表达

1)将测序正确的pET28a重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂平板培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

2)挑取单个菌班接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)离心管中，于37℃下180rpm振荡培养6h；

3)取1mL振荡培养液接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)培养至OD600＝0.6～0.8，并取1mL菌液，作为诱导前对照；

4)诱导菌液和对照菌液分别加入不同浓度的诱导剂(IPTG)，37℃180rpm诱导3h；

5)诱导后，各取1mL菌液，与对照同时12000rpm离心1min；弃上清，分别加入40μL 2×Binding Buffer重悬混匀，然后加入40μL2×Loading Buffer混匀；

6)取样品煮沸15min后，其中间隔5min振荡1次，共振荡2次，SDS-PAGE电泳上样前12000rpm离心1min；

7)取20μL样品进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白表达情况，确定诱导剂(IPTG)适宜浓度为0.5mM；

8)取表达目的蛋白菌液840μL，加入50％灭菌甘油160μL混匀混合后，装至灭菌冻存管中，于-20℃冰柜中保存。

然后利用SDS-PAGE电泳技术检测目的蛋白表达情况，SDS-PAGE电泳结果表明，与对照相比，pET-28a-RxLR129113蛋白经适宜浓度诱导剂(IPTG)诱导处理后，诱导RxLR129113表达出分子量为50KDa条带的蛋白，其分子量大小与PcRxLR129113预测分子量大小一致，由此pET-28a-RxLR129113蛋白原核表达系统构建成功，结果见图3。

3.2 RxLR129113重组蛋白的大量表达

1)对已保存的表达量较高的菌株进行活化，按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的1L LB液体培养基中37℃180rpm振荡培养3～4h，使其OD₆₀₀＝0.6～0.8。

2)提前确保摇床降温至16℃，加入终浓度为0.5mM的诱导剂(IPTG)，16℃条件下120rpm过夜诱导16～21h，确保OD值为1.8～2.0，诱导至16h开始使用紫外分光光度计监测OD值，每隔1h监测1次。

OD值：表示被检测蛋白吸收的光密度，1OD相当于大肠杆菌浓度≈10⁸～10⁹菌体/mL。

4.新型蔬菜栽培基质

本发明所提供的蔬菜栽培基质由向基质前料中添加RxLR129113蛋白溶液后获得。

4.1基质前料

以质量百分比计，所述基质前料的组成为：林业废弃物及菌渣发酵物30％，发酵鸡粪15％，稻壳发酵料30％，草炭20％份，多元复合肥5％。

4.2新型蔬菜栽培基质的制备方法：

1)林业废弃物及菌渣发酵物：林业废弃物、菌渣按照1:1～1:2体积比混合均匀，调节混合物水分含量到50％～60％，碳氮比调整为25～30:1，添加好氧发酵菌。条式堆肥发酵，温度达到65℃前不翻动，达到65℃以上后保持4～5天，然后进行翻抛加氧排湿；每隔10天翻抛一次，翻抛4～5次；然后进行大堆陈化25～30天，陈化期间10天倒垛一次；发酵物呈褐色蓬松物得林业废弃物及菌渣发酵物。

2)发酵鸡粪：将新鲜鸡粪晾晒或者机械除水至含量50％～60％，添加好氧发酵菌剂，调节碳氮比为25～30:1，进行条式好氧发酵，温度达到65℃以上翻抛，期间每隔5～7天翻抛一次，发酵温度降低无臭味得到发酵鸡粪。

3)稻壳发酵料：将稻壳与新鲜牛粪按照1:1的体积比进行混匀，调节含水量至50％～60％，添加好氧发酵菌剂，调节碳氮比为25～30:1，进行条式好氧发酵，温度达到65℃以上翻抛，期间每隔5～7天翻抛一次，翻抛3～5次进行大堆陈化。陈化期间每隔10天翻抛一次，温度降至室温物料无异味时得稻壳发酵料。

4)将林业废弃物菌渣发酵料、发酵鸡粪、稻壳发酵料、草炭、多元复合肥，按比例混合，即得育苗基质前料。

5)按照每100kg基质前料加入100mL RxLR129113蛋白溶液的比例，根据基质前料的质量计算需加入的RxLR129113蛋白溶液量，然后，将需加入的RxLR129113蛋白溶液与水按照比例混合，混合比例为1:500至1:1000，根据基质含水量的大小选择合适的稀释比例。利用喷雾器或者喷雾设备喷雾加入基质中，喷雾过程中不停搅拌。

4.3新型蔬菜栽培基质对蔬菜生长的促进作用

为了验证本发明所提供的蔬菜育苗基质对蔬菜生长的影响，以及效应蛋白(RxLR129113蛋白)对蔬菜长势的积极促进作用，以番茄和辣椒幼苗长势比较为例，各分为两组，采用完全相同的栽培方法，在不同的蔬菜育苗基质上进行育苗，比较其差异。

处理组：使用上述添加有效应蛋白(RxLR129113蛋白)的蔬菜育苗基质；

对照组：在上述育苗基质前料中加入未导入RxLR129113效应分子的大肠杆菌菌体悬浮液(LB液体培养基)，按照同样方法制备出对照育苗基质。

实验结果如下：

1)番茄苗的长势比较如图4所示，其中，A为对照组，B为处理组。

处理组的100株番茄苗的平均高度为30～35cm，叶片平均长×宽＝5.5×2.5cm，茎粗平均为0.4～0.6cm；对照组的100株番茄苗的平均高度为20～25cm，叶片平均长×宽＝3.0×1.5cm，茎粗平均为0.15～0.3cm。由此可见，添加效应蛋白的蔬菜育苗基质可明显促进番茄幼苗的长势，可作为番茄育苗的优选基质。

2)辣椒苗的长势比较如图5所示，其中，A为处理组，B为对照组。

处理组100株辣椒苗的平均高度为18～22cm，叶片平均长×宽＝5.0×2.0cm，茎粗平均为0.25～0.3cm；对照组的100株辣椒苗的平均高度为15～18cm，叶片平均长×宽＝3.0×1.5cm，茎粗平均为0.15～0.25m。由此可见，添加效应蛋白的蔬菜育苗基质可明显促进辣椒幼苗长势，可作为辣椒育苗的优选育苗基质。

由于辣椒和番茄均属于茄科蔬菜，故而可推知本发明所述基质对茄科蔬菜具有良好的生长促进作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种含有效应蛋白的蔬菜育苗基质，其特征在于，

所述效应蛋白由效应因子RxLR129113表达，

所述效应蛋白的制备方法为：构建含有效应因子RxLR129113的基因工程菌，诱导效应因子RxLR129113表达为效应蛋白，

所述蔬菜育苗基质包括基质前料和表达所述效应蛋白的基因工程菌的菌液，

所述菌液与所述基质前料的相对用量为1.0~1.5mL/kg，所述菌液的菌体浓度为1.8×10⁸~2.0×10⁹菌体/mL，且

所述基质前料由如下重量份的组分制备：林业废弃物及菌渣发酵物30~35份、发酵鸡粪15~20份、稻壳发酵料25~30份、草炭15~20份，多元复合肥5~8份。

2.权利要求1所述蔬菜育苗基质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）构建可表达效应因子RxLR129113的基因工程菌，筛选表达量较高的菌株进行扩大培养，培养至菌体浓度达到1.8×10⁸~2.0×10⁹菌体/mL，获得表达所述效应蛋白的基因工程菌的菌液；

（2）以重量份计，将林业废弃物及菌渣发酵物30~35份、发酵鸡粪15~20份、稻壳发酵料25~30份、草炭15~20份和多元复合肥5~8份均匀混合得到基质前料；

（3）将步骤（1）获得的菌液添加至步骤（2）获得的基质前料中，所述菌液相对于基质前料的添加量为1mL/kg。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌E.coliRosetta (DE3)菌株；构建可表达效应因子RxLR129113的基因工程菌后，将筛选到的表达量较高的菌株按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的LB液体培养基中37℃，180 rpm振荡培养3~4h，使其OD₆₀₀=0.6~0.8；再降温至16℃，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃条件下120rpm过夜诱导16~21h。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述菌液添加至所述基质前料的方式为：先将所述菌液稀释500~1000倍，随后边搅拌所述基质前料边将稀释后的菌液通过喷雾的方式喷入基质前料中。

5.根据权利要求1所述的蔬菜育苗基质或权利要求2-4中任一项所述制备方法制备的蔬菜育苗基质在促进蔬菜生长方面的应用。