CN102206656A - 水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用。具体包括基因OsFAD6的克隆、含有该基因的表达载体构建、基因OsFAD6表达模式分析，低温、高盐、氧化处理后OsFAD6的表达量的变化分析。半定量PCR检测结果显示：OsFAD6在植物的各个器官中均有表达，其中在叶中表达量最高。在氧化处理后，OsFAD6在根和叶这两个器官中的表达量均有上升；在低温和高盐胁迫处理后，OsFAD6在叶中的表达量下降而在根中的表达量上升。本发明还公开基因OsFAD6在转入酵母INVScI后，可以改变酵母的亚油酸含量并提高对高盐、乙醇、氧化及低温胁迫的抗性。该基因OsFAD6可用于植物品种改良。

Description

水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，重组表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，高盐、氧化、低温胁迫处理后的表达模式变化进行分析鉴定所使用的方法，以及转化此基因于酵母INVScI细胞内，进行活细胞实验，分子模拟油酸氧化脱氢的过程及抗性改变研究。

背景技术

不饱和脂肪酸作为构成植物膜脂的主要结构成分之一（Shah et a1., 1997），对生物体生长发育至关重要。不饱和脂肪酸的含量在大多数植物组织中占总脂肪酸含量的75％以上（戴晓峰，2007）。并且具有影响植物生长发育、应答各种环境信号等多种作用(Klaus et al., 2002；代玉华等，2004)。

不饱和脂肪酸脱氢酶的活性是影响各种不饱和脂肪酸合成的主要因素，在亚油酸和亚麻酸的合成过程中尤其重要。在拟南芥中研究成果较完整，目前，已经分别克隆到了7个编码脂肪酸脱氢酶的基因（FAD2, FAD3, FAD4, FAD5, FAD6, FAD7,FAD8）(Arondel et al., 1992; Iba et al., 1993; Yadav et al., 1993; McConn et al., 1994; Okuley et al., 1994)。 FAD6是定位于叶绿体的ω-6不饱和脂肪酸脱氢酶基因，这个酶在单不饱和脂肪酸油酸的12碳和13碳之间引入1个双键变成多不饱和脂肪酸亚油酸，以此控制着植物细胞中大多数多不饱和脂肪的合成。不饱和脂肪酸含量越高，那么植物的抗寒性就越强。

FAD6基因目前已在多个物种中有报道，在高等植物中，这些物种分别是：拟南芥(Falcone, Gibson et al. 1994)，大豆(Hitz, Carlson et al. 1994)，甘蓝型油菜(Scheffler, Sharpe et al. 1997)，播娘蒿(Sanyuan, Ji et al. 2007)，油橄榄(Banilas, Moressis et al. 2005)，马齿苋(Teixeira, Coelho et al. 2009)和菠菜(Schmidt, Dresselhaus et al. 1994)。此外，在衣藻Chlamydomonasreinhardtii中也有FAD6基因的报道(Chi, Zhang et al. 2008)。

本发明通过克隆水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，并且对其脱氢功能进行验证，结果显示基因在各个器官中组成型表达在接受高盐和低温处理后，该基因在叶中的表达量下降而在根中的表达量上升；在接受氧化胁迫后，该基因在叶和根中表达量均上升。将OsFAD6转入酵母INVScI细胞后，检测酵母细胞内亚油酸与油酸含量变化。结果显示该基因的转入能够导致酵母细胞内产生亚油酸的生成，揭示该基因具有油酸去饱和酶的作用，从而为可控地改变水稻脂肪酸组成及最终为提高水稻耐冷以及其他胁迫抗性提高的分子育种提供基因来源与技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用。

本发明从水稻中克隆出一种新的水稻基因，命名为OsFAD6。为具有特定序列的DNA分子，全长1365bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，并将其与其他物种中脂肪酸去饱和酶基因家族中的成员进行同源性比对。

本发明还提供这种水稻OsFAD6蛋白编码序列，有454个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供用于调取获得水稻样品中基因OsFAD6的一对核苷酸引物。该引物根据基因OsFAD6开放阅读框设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长1365bp的基因片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明从水稻中克隆出的基因OsFAD6是脂肪酸去饱和酶基因，该酶对体内生成的甘油脂其脂肪酸基团进一步脱氢去饱和，是油酸到亚油酸转变的限速酶。

本发明还提供一种检测水稻基因OsFAD6在不同器官表达模式的方法，即利所述基因OsFAD6的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，对水稻cDNA样品进行Real-timePCR, 然后检测该基因在根、种子、茎和叶中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻器官的总RNA(Trizol，市售)；

（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6设计引物，利用SEQ ID NO.1的保守区段84bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明还提供一种检测水稻基因OsFAD6在高盐、低温、氧化胁迫下的表达模式变化的方法，即将水稻进行高盐、氧化及低温胁迫处理后，提取水稻叶和根的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，进行定量PCR检测。具体操作步骤如下：

（1）将两周大的水稻苗置于0.25M氯化钠溶液中，28oC培养24h以进行高盐胁迫处理；置于水中，10oC培养24h以进行低温处理；置于6mM过氧化氢溶液中，28oC培养6h以进行氧化胁迫处理；置于水中，28oC培养6h及24h作为对照。

（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售)。

（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6设计引物，利用SEQ ID NO.1的保守区段84bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明还提供一种将OsFAD6转入酵母INVScI并检测生成亚油酸的方法，其步骤如下：

（1）使用SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8作为引物，从反转录得到的水稻cDNA中PCR得到两端带有XbaI/XhoI酶切位点及完整编码阅读框（SEQ ID NO.1）的OsFAD6基因序列，并操作的连接酵母表达载体pYES NT（C）（XbaI /XhoI），形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；

（2）将转入pYES-NT(C)-OsFAD6载体与转pYES-NT(C)空载体的两个酵母菌株分别在含有gal的YPD培养基中培养16h，各取10ml菌液5000rpm离心得到酵母细胞；

（3）向离心得到的酵母细胞中加入2.5%硫酸/甲醇溶液1ml，震荡混匀后在80oC水浴中反应1.5h。加入1.5ml 0.9%NaCl溶液和1ml正己烷，震荡混匀后5000rpm离心10min取上清备用；

（4）运用气相色谱仪器(HP6890 Plus Hewlett–Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亚油酸的含量。程序为：起始温度150 oC 3 min后按照15oC/min的温度上升速率升温直至210oC，当气相色谱仪程序进行完毕后机器保持12min后分析结果。

结果显示：转入基因OsFAD6后，与转空载体对照组相比，可以在酵母中检测到亚油酸形成。

本发明还提供一种检测转OsFAD6基因与转空载体的酵母INScI对数种胁迫的抗性改变的方法，其步骤为：

（1）将转化后酵母在液体筛选培养基中培养2d，调整菌液浓度使二者的起始OD₆₀₀在1.5左右。取20μl菌液在等量液体乳糖诱导培养基中培养16h，测量两者的OD₆₀₀，并按比例取出保证细胞数相等的菌液各约1ml左右，3000rpm离心5min，弃掉培养基，用1ml无菌水悬浮细胞。并以10倍逐级稀释6个浓度梯度。

（2）将各梯度菌液分别取10μl，滴于相应YPD培养基上。除低温外均在28oC培养2d后照相观察。低温处理组在4oC暗处存放6周后置于28oC恢复培养2d照相观察。

结果显示：转入基因OsFAD6后，与空载体对照组相比，酵母对胁迫的抗性有显著提高。

以上结果表明，基因OsFAD6为可控地改变水稻脂肪酸组成及最终为提高水稻耐冷以及其他胁迫抗性的分子育种提供基因来源与技术基础。即该基因OsFAD6可用于改良水稻品种，以提高水稻耐冷性及其他胁迫抗性。

本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。

附图说明

图1（A）为对OsFAD6推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析的结果图示。图1（B）为图1（A）的续。

图2为最小进化法对FAD6成员进行系统进化分析图示。

图3为水稻OsFAD6基因器官表达模式分析图示。

图4为水稻基因OsFAD6在低温、高盐、氧化胁迫下的表达模式分析结果图示。其中，A、B为叶中；C、D为根中。

图5为转入OsFAD6基因的酵母INVScI中亚油酸含量变化检测结果图示。

图6为转入基因OsFAD6的酵母INVScI对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性改变图示。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York: Cold Spring Harbor  Laboratory  Press, 1989）中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1水稻基因OsFAD6的克隆。

1.水稻品种Nipponbare（Oryza sativa Japonica）在培养箱(SPX-250-GB,Shanghai,China) 中培养：生长条件为光周期16h /8h (L/D)，28oC。

2.RNA提取。取100毫克左右新鲜的水稻植物组织材料，液氮充分研磨。加1 ml Trizol试剂，涡旋15 s后室温放置5 min。加0.2 ml氯仿，去蛋白，12000rpm离心10min后上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10 min，12k rpm离心10min，弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇1 ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5-10 min，溶于20μl DEPC水中，测OD值，电泳检测。

3.基因的克隆。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

实施例 2水稻基因OsFAD6的同源性以及进化树分析。

利用Clustal.X程序对OsFAD6推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析；结果显示，在OsFAD6中具有三个组氨酸簇，分别位于其氨基酸序列的78-82位，208-218位和374-378位（图1）。同源性比对的结果显示，本基因存在三个保守的组氨酸簇结构域:HDC*H；E*****H**HH；H**HH。

以衣藻Chlamydomonasreinhardtii中的FAD6基因为外类群，利用Mega4软件，最小进化法进行FAD6成员的系统进化分析（图2）；所挑选的序列均系根据已发表的成果或通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）在线搜索获得。结果显示，各物种中的FAD6，双子叶植物、单子叶植物分别聚类在了一起。这说明OsFAD6基因既有FAD6基因在序列上的共同性，亦存在着进化亲缘关系上的独立性。

实施例3水稻OsFAD6基因器官表达模式分析。

分别提取水稻种子、根、茎、叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，，进行实时荧光定量PCR检测（图3）。结果显示，OsFAD6在上述四个器官均有表达，其中在叶中表达最高。

实施例4水稻基因OsFAD6在低温、高盐、氧化胁迫下的表达模式分析。

对两周大的水稻幼苗分别进行10oC低温(24h)、0.25M氯化钠(24h)、6mM(6h)过氧化氢的处理，并同无处理的对照组一起，分别提取根和叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，在经过氧化处理后，根和叶中OsFAD6的表达量均有上升。在高盐和低温处理后，根中OsFAD6的表达量上升而叶中OsFAD6的表达量下降（图4）。

实施例5  转入OsFAD6基因的酵母INVScI中亚油酸含量变化检测。

（1）使用SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8作为引物，从反转录得到的水稻cDNA中PCR得到两端带有XbaI/XhoI酶切位点及完整编码阅读框（SEQ ID NO.1）的OsFAD6基因序列。并连接至酵母表达载体pYES-NT(C)中。并通过测序验证，转化酵母。

（2）将转入pYES-NT(C)-OsFAD6载体与pYES-NT(C)空载体的两个酵母菌株分别在含有gal的YPD培养基中培养16h，各取10ml菌液5000rpm离心得到酵母细胞。

（3）向离心得到的酵母细胞中加入2.5%硫酸/甲醇溶液1ml，震荡混匀后在80oC水浴中反应1.5h。加入1.5ml 0.9%NaCl溶液和1ml正己烷，震荡混匀后5000rpm离心10min取上清备用。

（4）运用气相色谱仪器(HP6890 Plus Hewlett–Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亚油酸的含量。程序为：起始温度150 oC 3 min后按照15oC/min的温度上升速率升温直至210oC，当气相色谱仪程序进行完毕后，机器保持12min后分析结果。

结果显示，与转入空载体组相比，转入OsFAD6基因的酵母细胞中能够检出亚油酸存在（图5），证明表达的OsFAD6能够将酵母中油酸催化形成亚油酸。

实施例6  转入基因OsFAD6的酵母INVScI对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性改变。

（1）分别将转入pYES-NT(C)空载体及转入pYES-NT(C)-OsFAD6的INVScI酵母在YPD培养基中28oC培养至OD₆₀₀达到1.5左右。

（2）取20μl菌液加至10ml含有gal的Sc U^-培养基中，培养16h。

（3）测量两者的OD₆₀₀，并按比例取出保证细胞数相等的菌液各约1ml左右，3000rpm离心5min，弃掉培养基，用1ml无菌水悬浮细胞。并以10倍逐级稀释6个浓度梯度。

（4）将各梯度菌液分别取10μl，滴于相应YPD培养基上。除低温外在28oC培养2d后照相观察。低温处理组在4oC暗处存放6周后置于28oC培养2d照相观察。

结果显示，转OsFAD6基因的酵母细胞与转空载体的酵母相比，其对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性均有提高（图6）。

 参考文献

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                         SEQUENCE LISTING

<110>  复旦大学

<120>  水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用

<130>  001

<160>  8    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1365

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

atggcgacgg cgagcggcgt ctccactccc ctgcagctcc cctccacgcg gcgggtgggc     60

 

ggctgctgct cccgccccgg cagcccggcc ccgggcaaga acgcgttccc gcggagagca    120

 

gccggtggtg ccccggcagg tacatttttt ttgaagagag attctgtata taaaggacag    180

 

agttgtcatc aatttttacc attgaaacaa agcggaaggt tgcaagcagc agttctgcct    240

 

gttactccac ctttgttaga tgatgaagaa aaacggaagc aaatgtgtga agattatgga    300

 

ttcaaacaaa ttggagaaca gttgccagat aatgttactc ttaaagatgt aatggatagt    360

 

ctgcctaaag aggtatttga aatcgatgat ctaaaatctt ggacttctgt tttaatatca    420

 

gttacttctt atgctcttgg tattttcttg atatcaaaag ctccctggta tcttcttccc    480

 

ttagcctggg catggactgg tacagcagtt acggggttct ttgtcatagg tcatgattgt    540

 

gcccacaaat cattttcgag gaataagctg gtggaagata ttgttggaac tctagctttc    600

 

ttgccattga tataccccta tgaaccttgg agatttaagc atgacagaca tcatgccaag    660

 

acaaacatgt tgatagaaga tactgcatgg caacccgttt tttcaaagga gttcagaaca    720

 

aattccttac tgaggaaagc aatgatattt gcttatggtc ctatcaggcc atggatgtct    780

 

attgctcact ggttaatttg gcactttgat ctaaaaaaat tcagaccaaa tgagctccca    840

 

agggtgaaaa taagcttagc atctgtgcta gcgttcatgg caattggatg gccactgatt    900

 

attctcaaat caggaatagc tggatggttc aagttctggt tcatgccatg gatggtttat    960

 

cacttttgga tgagcacctt tacgatggta catcacactg ctcctcatat accattcaag   1020

 

acatcagaag agtggaatgc tgcacaggca caattaaacg gcacagttca ctgtgactat   1080

 

cctcggtgga tagagatact ttgtcatgac ataaatgtac atgttccaca ccatatttct   1140

 

ccaagaattc caagttataa ccttcgtgct gcctatgatt ccataaaaca gaactggggc   1200

 

aagtacatca atgaagccag ctggaactgg cgcttgatga agacaatact gactaaatgc   1260

 

catgtttacg acaaggatag atactatgtt ccctttgatg aggttgcgcc tgaggaatcc   1320

 

caaccaatta aattcctcaa gaaggtcatg ccagattatg catga                   1365

 

<210>  2

<211>  454

<212>  PRT

<213>  

<400>  2

Met Ala Thr Ala Ser Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Leu Pro Ser Thr

1               5                   10                  15     

 

Arg Arg Val Gly Gly Cys Cys Ser Arg Pro Gly Ser Pro Ala Pro Gly

            20                  25                  30         

 

Lys Asn Ala Phe Pro Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ala Pro Ala Gly Thr

        35                  40                  45             

 

Phe Phe Leu Lys Arg Asp Ser Val Tyr Lys Gly Gln Ser Cys His Gln

    50                  55                  60                 

 

Phe Leu Pro Leu Lys Gln Ser Gly Arg Leu Gln Ala Ala Val Leu Pro

65                  70                  75                  80 

 

Val Thr Pro Pro Leu Leu Asp Asp Glu Glu Lys Arg Lys Gln Met Cys

                85                  90                  95     

 

Glu Asp Tyr Gly Phe Lys Gln Ile Gly Glu Gln Leu Pro Asp Asn Val

            100                 105                 110        

 

Thr Leu Lys Asp Val Met Asp Ser Leu Pro Lys Glu Val Phe Glu Ile

        115                 120                 125            

 

Asp Asp Leu Lys Ser Trp Thr Ser Val Leu Ile Ser Val Thr Ser Tyr

    130                 135                 140                

 

Ala Leu Gly Ile Phe Leu Ile Ser Lys Ala Pro Trp Tyr Leu Leu Pro

145                 150                 155                 160

 

Leu Ala Trp Ala Trp Thr Gly Thr Ala Val Thr Gly Phe Phe Val Ile

                165                 170                 175    

 

Gly His Asp Cys Ala His Lys Ser Phe Ser Arg Asn Lys Leu Val Glu

            180                 185                 190        

 

Asp Ile Val Gly Thr Leu Ala Phe Leu Pro Leu Ile Tyr Pro Tyr Glu

        195                 200                 205            

 

Pro Trp Arg Phe Lys His Asp Arg His His Ala Lys Thr Asn Met Leu

    210                 215                 220                

 

Ile Glu Asp Thr Ala Trp Gln Pro Val Phe Ser Lys Glu Phe Arg Thr

225                 230                 235                 240

 

Asn Ser Leu Leu Arg Lys Ala Met Ile Phe Ala Tyr Gly Pro Ile Arg

                245                 250                 255    

 

Pro Trp Met Ser Ile Ala His Trp Leu Ile Trp His Phe Asp Leu Lys

            260                 265                 270        

 

Lys Phe Arg Pro Asn Glu Leu Pro Arg Val Lys Ile Ser Leu Ala Ser

        275                 280                 285            

 

Val Leu Ala Phe Met Ala Ile Gly Trp Pro Leu Ile Ile Leu Lys Ser

    290                 295                 300                

 

Gly Ile Ala Gly Trp Phe Lys Phe Trp Phe Met Pro Trp Met Val Tyr

305                 310                 315                 320

 

His Phe Trp Met Ser Thr Phe Thr Met Val His His Thr Ala Pro His

                325                 330                 335    

 

Ile Pro Phe Lys Thr Ser Glu Glu Trp Asn Ala Ala Gln Ala Gln Leu

            340                 345                 350        

 

Asn Gly Thr Val His Cys Asp Tyr Pro Arg Trp Ile Glu Ile Leu Cys

        355                 360                 365            

 

His Asp Ile Asn Val His Val Pro His His Ile Ser Pro Arg Ile Pro

    370                 375                 380                

 

Ser Tyr Asn Leu Arg Ala Ala Tyr Asp Ser Ile Lys Gln Asn Trp Gly

385                 390                 395                 400

 

Lys Tyr Ile Asn Glu Ala Ser Trp Asn Trp Arg Leu Met Lys Thr Ile

                405                 410                 415    

 

Leu Thr Lys Cys His Val Tyr Asp Lys Asp Arg Tyr Tyr Val Pro Phe

            420                 425                 430        

 

Asp Glu Val Ala Pro Glu Glu Ser Gln Pro Ile Lys Phe Leu Lys Lys

        435                 440                 445             

 

Val Met Pro Asp Tyr Ala

    450                

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

gcagatctat ggcgacggcg agc                                             23

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  

<400>  4

gcactagttg cataatctgg catgac                                          26

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

<400>  5

atggttcaag ttctggttca                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  18

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

tgaggagcag tgtgatgt                                                   18

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  

<400>  7

gcctcgagat ggcgacggcg agc                                             23

 

 

<210>  8

<211>  26

<212>  DNA

<213>  

<400>  8

gctctagatg cataatctgg catgac                                          26

 

 

Claims (6)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因OsFAD6，全长1365bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种如权利要求1所述的基因OsFAD6编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码454个氨基酸残基，分子量44.35kDa，等电点为9.24，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一对用于调取获得水稻样品中基因OsFAD6的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsFAD6开放阅读框设计，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.一种检测水稻基因OsFAD6mRNA表达模式的方法，其特征在于利用权利要求1所述基因OsFAD6的的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，对水稻cDNA样品进行Real-timePCR, 然后检测该基因在根、种子、茎和叶中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

提取水稻不同器官的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行定量PCR检测。

5.一种检测水稻在高盐、氧化、低温胁迫处理后，基因OsFAD6表达含量变化的方法，其特征在于具体步骤为：将水稻进行高盐、氧化及低温胁迫处理后，提取水稻叶和根的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行定量PCR检测。

6.如权利要求1所述的基因OsFAD6在改良水稻品种中的应用。

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