CN111118030A

CN111118030A - 调控玉米叶夹角的dna序列及其突变体、分子标记、检测引物和应用

Info

Publication number: CN111118030A
Application number: CN202010075654.6A
Authority: CN
Inventors: 王海洋; 王宝宝; 李鑫; 赵斌斌; 李全权; 赵永平
Original assignee: South China Agricultural University; Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: South China Agricultural University; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: US20220396805A1; WO2021147401A1; CN111118030B

Abstract

本发明公开了调控玉米叶夹角的DNA序列及其突变体、分子标记、检测引物和应用。本发明首先提供了调控玉米叶夹角的关键DNA序列及其突变体，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，本发明所提供的调控玉米叶夹角的DNA序列及其突变体能够调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达，进而应用于改良玉米叶夹角和株型，也可进一步应用于培育玉米新品种。本发明还进一步提供了DNA关键序列及其突变体变异情况的特异性检测引物以及检测玉米中ZmNAC16基因表达量的检测引物，这些检测引物能应用于定向改良玉米的叶夹角，对于玉米耐密植和高产量育种也具有应用潜力。

Description

调控玉米叶夹角的DNA序列及其突变体、分子标记、检测引物和应用

技术领域

本发明涉及调控玉米叶夹角的DNA序列及其突变体，尤其涉及调控ZmNAC16基因表达的内含子和3’-UTR区的突变体和检测引物，本发明进一步涉及它们在调控玉米叶夹角中的应用，属于玉米的分子育种领域。

背景技术

玉米是中国的第一大农作物，对中国的粮食安全和农业发展有着举足轻重的作用。然而，耕地面积的制约(中国的可耕耕地面积仅占世界耕地面积的7％，却面临着要养活～20％的世界总人口)，不得不把提高单位面积的产量作为提高中国玉米产出的主要手段；并且，相较而言，中国玉米的平均产量仅仅为美国的60％，提升的潜力和空间巨大。

研究表明，提高品种耐密性和种植密度是提高玉米单产的关键。在过去80年里，美国玉米的种植密度从20世纪30年代的～30000株/公顷提高到了现在的～70000株/公顷(62000-104000株/公顷)；同时，玉米单产也从20世纪30年代的1287公斤/公顷提高到2010年的9595公斤/公顷(USDA-NASS,2012)；而这个过程中玉米的单株产量和杂种优势的增加并不明显，单产的提升更多的是由于品种耐密性和种植密度的持续增长。而对中国不同年代玉米品种的研究也显示，近现代的品种相较于早期品种，在光合效率、抗倒性、空秆率和产量等方面都在向着更加耐密的方向发展。因此，提高品种耐密性和种植密度是现代玉米育种和生产中的重要目标和趋势。

降低植株的茎叶夹角是提高玉米耐密性的关键。较小的茎叶夹角可以最大程度上减少玉米植株之间的相互遮荫，改善田间整体的冠层结构，增强植株间的通风透光性，更利于玉米功能叶(穗位叶、穗上第一叶和穗下第一叶)捕获阳光和进行光合作用，利于玉米高产；同时良好的通风透光还将大大增加植株下层的红光/远红光(R/FR)的比例，减少密植避荫反应造成的茎秆徒长、根系变弱、茎秆强度降低等不利影响，利于玉米稳产；此外，研究表明，紧凑的叶夹角还有利于叶片对氮素的同化促进灌浆，直接影响玉米产量。并且，不同单位的研究都表明现代玉米育种过程中叶夹角都向着越来越紧凑的方法改良，而这种趋势和玉米耐密性的提升是高度相关的，这也从另一个侧面反映叶夹角对玉米耐密育种的重要性。

研究发现，玉米中已报道的调控叶夹角变化的基因主要包括SPL、LOB、MYB、bZIP、Homeodomain-like等基因家族的基因，如LG1、LG2、LG3、LG4、LGN1、DWIL1、DRL1、DRL2、ZmRAVL1、qLA1、ZmCLA4、ZmTAC1、BRD1、ZmBRL2、ZmBRL3、ZmBRI1b、ZmBRL1、ZmBRI1a等。但目前为止，还没有NAC家族基因(NAC domain containing protein)调控玉米叶夹角表型的报道。此外，以上调控叶夹角变化的基因的移码、提前终止或其他造成蛋白功能改变的突变体往往造成叶夹角的剧烈改变，并且经常附带有诸如花序发育受阻、叶器官发育异常、产量急剧降低等不利影响，无法直接应用到玉米育种实践中去。相比之下，一些非基因编码区的自然变异，往往只是改变基因的表达量，较少带来不利效应。尤其是一些经过漫长的育种选择而保留下来的自然变异，在育种中具有广阔的应用前景。因此，如果能够准确鉴定到非基因编码区的这些自然变异对于玉米的分子育种将具有重要的应用潜力。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种调控玉米叶夹角的关键DNA序列；

本发明的目的之二是提供所述调控玉米叶夹角的DNA序列的突变体；

本发明的目的之三是提供调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中表达的分子标记；

本发明的目的之四是提供检测所述玉米叶夹角的关键DNA序列或其突变体的变异情况的特异性检测引物；

本发明的目的之五是提供检测玉米中ZmNAC16基因表达量的检测引物；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了一种调控玉米叶夹角的关键DNA序列，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列，或

(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；

(c)与SEQ ID No.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(d)在SEQ ID No.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入所得到的突变体，且该突变体仍具有调控玉米叶夹角的功能或活性。

本发明所提供的调控玉米叶夹角的关键DNA序列能够调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达量变化。

作为所述突变体的一种优选的实施方案，该突变体是在SNP_3_6945310_C/T处造成从T到C的改变，在Indel_3_6945248_C/CT处缺少1bp的碱基插入和在Indel_3_6945836_T/TTGCA处缺少4bp的碱基插入，该突变体的多核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；该突变体能够调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达，表现出叶夹角变小，但不带来其余不利的表型；由此，SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA能够作为调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中表达的分子标记。

本发明进一步提供了用于检测SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA变异情况的检测引物；作为一种优选的实施方案，所述的检测引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

采用所述特异性检测引物可对玉米品种中的SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA的变异情况进行检测，从而应用于玉米的分子辅助育种。此外，本领域技术人员能够根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2设计特异性检测引物，或通过本领域常规的方法设计用于检测SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA变异情况的引物也自然属于本发明的保护范围。

本发明还进一步提供了用于检测ZmNAC16基因表达量的特异性扩增引物，该特异性检测引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，应用该特异性检测引物可对玉米品种的ZmNAC16基因表达量进行检测，进而为玉米育种提供参考。

本发明中所述ZmNAC16基因的编码区的多核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。

进一步的，本发明提供了一种培育高产或耐密植的玉米新品种的方法，包括：通过提高ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达量进而实现减小玉米叶夹角、提高玉米耐密性；因此，通过提高ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达量来达到减小玉米叶夹角，提高玉米耐密性的方法都属于本发明的保护范围；包括利用其它的组成型或组织特异的启动子和ZmNAC16构建的表达盒驱动ZmNAC16基因在玉米叶枕中高表达，或利用其它的自然变异来实现ZmNAC16基因在玉米叶枕中高表达的方法。

更进一步的，本发明预示了含有所述SEQ ID No.1所述的DNA序列或SEQ ID No.2所示的DNA序列的突变体的表达盒、含有该表达盒的重组植物表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

所述的重组植物表达载体是将所述表达盒与质粒或表达载体所构建得到的重组植物表达载体并且能够将所述表达盒转入植物宿主细胞、组织或器官中。

本发明的DNA序列或其突变体可以用于制备转基因植物。譬如，通过农杆菌介导、基因枪法等方法将含有所述DNA序列或其突变体的重组植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中，再将该转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植物；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等。

为了实施本发明，制备和使用植物表达载体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知，具体方法可以参考例如Sambrook等。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。所述的标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

总之，可将本发明提供的调控玉米叶夹角的关键DNA序列、该序列的突变体、分子标记以及检测该分子标记变异情况的特异性检测引物以及检测ZmNAC16基因表达量的特异性检测引物等应用于培育高产或耐密植的玉米新品种，尤其是应用在改良叶夹角和株型、提高玉米产量等方面。

作为参考，本发明提供了一种调控玉米的叶夹角的方法，包括：用SEQ ID No.1所示的DNA序列或SEQ ID No.2所示的DNA序列的突变体调控ZmNAC16基因在玉米中的表达。

本发明中所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的表达盒提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant CellReports.1986.5:81-84)。

本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选是玉米。

本发明所提供的调控玉米叶夹角的DNA序列或其突变体能够调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达，其对改良玉米叶夹角和株型具有重要意义，还可将其进一步应用于玉米新品种的选育。本发明还进一步提供了用作调控ZmNAC16基因表达的分子标记SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA、检测所述分子标记变异情况的特异性检测引物以及检测玉米中ZmNAC16基因表达量的特异性检测引物，这些均能直接应用于定向改良玉米的叶夹角，对于玉米耐密植和高产新品种选育也具有重要的应用潜力。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

在本发明的上下文中，术语“突变体”是含有变化的DNA序列，在所述DNA序列中，优选在基本保持DNA序列的同时缺失、添加和/或替代原始序列的一个或多个核苷酸。例如，可以从DNA序列5’或3’末端缺失一个或多个碱基对以产生“截短的”DNA序列；也可以在DNA序列内部插入、缺失或替代一个或多个碱基对。可以通过例如标准DNA诱变技术或通过化学合成变体DNA序列或其部分而产生变体DNA序列。突变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的突变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)所得到的突变体，或者是通过自然选择所得到的突变体。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“同源性”指多核苷酸序列之间在百分比核苷酸位置同一性(即序列相似性或同一性)方面的相似性或百分同一性的水平。此处所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似的功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可能具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严谨杂交条件)一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或非天然启动子。组成型植物启动子在植物发育始终的大部分或所有组织中发挥功能。可以将任何植物启动子用作5’调节元件以用于调节与其可操作地连接的一种或多种特定基因的表达。当与可转录的多核苷酸分子可操作地连接时，启动子一般引起该可转录的多核苷酸分子的转录，其转录方式与该启动子通常连接的可转录的多核苷酸分子的转录方式类似。植物启动子可以包括通过操作已知启动子以产生人工、嵌合或杂合启动子而产生的启动子。这类启动子也可以通过例如向具有其自身部分或全部调节元件的活性启动子加入异源调节元件而组合了来自一个或多个启动子的顺式元件。

术语“顺式元件”指赋予基因表达全面控制的一方面的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以起到结合调节转录的转录因子，反式作用蛋白质因子的作用。一些顺式元件结合超过一种转录因子，而且转录因子可以与超过一种顺式元件以不同的亲和力相互作用。

术语“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选地，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。

术语“可转录的多核苷酸分子”指能够被转录为RNA分子的任何多核苷酸分子。已知以使可转录的多核苷酸分子被转录为功能mRNA分子的方式将构建体引入细胞的方法，所述功能mRNA分子得到翻译并从而表达为蛋白质产物。为了抑制特定的目的RNA分子的翻译，也可以构建能够表达反义RNA分子的构建体。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

附图说明

图1A为通过GWAS方法得到ZmNAC16内含子和3’-UTR区的三个变异位点与玉米开花期和叶片数表型显著关联；其中，三个变异位点分别为SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA；图中与X-轴平行的红色的箭头代表ZmNAC16；图1B为ZmNAC16的基因结构及SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA三个变异位点的位置信息。

图2为16个不同类群的自交系在三个变异位点(SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA)处的变异情况；整体上，SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA三个位点连锁在一起，形成两种单倍型：Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4。

图3A和B为ZmNAC16内含子和3’-UTR区的三个变异位点处不同变异类型自交系的叶夹角表型比较；其中Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4分别代表图2中两种基因型；C为Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4两种类型自交系V7时期展开叶和未展开叶叶枕中ZmNAC16基因的表达分析；ZmNAC16基因在已展开叶片的叶枕中显著高表达。

图4A为Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4的两种等位变异对应表型的统计分析；图4B为Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4在玉米育种过程中的受选择分析；不同等位变异对应的颜色同图4A；其中，Hap1_0/C/0在玉米育种过程中受到明显人工选择。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的自交系可从“中国作物种质信息网”得到相关信息和申请获取对应的种子。

实施例1ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点通过控制ZmNAC16的基因表达量调控玉米叶夹角

1、ZmNAC16内含子和3’-UTR区变异位点的发掘

利用350份玉米自交系的深度(>10×)重测序的数据结合已公布的玉米B73 V3基因组，挖掘出了25,320,664单核苷酸多态性分子标记(SNPs)和4,319,510个插入缺失多态性分子标记(Indel)。利用这些挖掘到的分子标记估算出350份玉米自交系的群体结构和亲缘关系，然后结合收集到的4个环境的叶夹角表型进行全基因组关联分析(GWAS)。其中发现3号染色体上的一个SNP SNP_3_6945310_C/T和两个Indel标记Indel_3_6945248_C/CT、Indel_3_6945836_T/TTGCA与玉米的叶夹角性状显著关联(图1)。进一步研究发现这三变异位点位于ZmNAC16的内含子和3’-UTR(SEQ ID No.2)区域。

2、ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点所在基因组区域核苷酸序列的获得

根据SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT、Indel_3_6945836_T/TTGCA所在区域的B73 V3基因组序列设计特异的扩增引物，对6个不同类型玉米自交系进行扩增，获得了该区域的核苷酸序列和该变异的准确信息(图2)。

3、ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点调控ZmNAC16基因的表达

根据三个变异位点SNP_3_6945310_C/T、Indel_3_6945248_C/CT、Indel_3_6945836_T/TTGCA处的基因型可将所测序自交系分为Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4两类(图2和图3)。将这两种类型的代表性自交系(图2)分别种在田间，在其有7片完全展开叶时(V7期)，对完全展开叶(V7叶)和未展开叶片(V5叶)的叶枕(叶片和叶鞘连接的部位)进行取样和液氮速冻。每5个单株的叶枕混合成一个样品，每种自交系取3个生物学重复之后用TRIzol法提取RNA，利用特异引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)检测ZmNAC16基因的表达量，发现Hap2_1/T/4类型的自交系叶片中ZmNAC16基因显著高表达(图3)，这表明ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点可调控ZmNAC16基因在玉米叶片中的表达。

实施例2ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点在现代玉米育种过程中受到了强的人工选择

本试验前期收集了来自于中国和美国不同的育种时期的350份玉米自交系材料，包括美国早期(Public-US)和近现代(Ex-PVP)育种材料163份，中国早期(CN1960&70s)、中期(CN1980&90s)和当前(CN2000&10s)主栽玉米育种材料187份，对ZmNAC16的Hap1_0/C/0和Hap2_1/T/4两类基因型在这些材料中的频率分布进行分析发现，随着育种时期的推进，Hap1_0/C/0的频率在中国和美国玉米育种过程中都在显著的提升，表明Hap1_0/C/0这种基因型在现代玉米育种过程中受到了强的人工选择，表型分析发现Hap1_0/C/0有显著降低玉米叶夹角的效应，这也与紧凑株型是玉米耐密育种的关键靶标是一致的，进一步印证了ZmNAC16内含子和3’-UTR区的变异位点在现代玉米育种过程中受到了强的人工选择。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学中国农业科学院生物技术研究所

<120> 调控玉米叶夹角的DNA序列及其突变体、分子标记、检测引物和应用

<130> BJ-2002-191209A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1003

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 1

aacagttaga aaatacacta ctgctaggct catgccgatc ttgatcatta catgtacata 60

tgttgcatta tattattcac tgcgagctat atatatgtct cctgctctct ctttcaaacg 120

atatacacct tttgcacttg ttcaaccgtt gcactccact gaaaccgtac tagaagtttc 180

tttttgaccg cccttttttc cctattctat tgcaggatgc ttccattgct cacccccaag 240

agacagaatg gccttacacg tactggccac ctgacaacca agatcatcat gggtagtagc 300

aacagggacc tggtaaatag tggcgatgtg aatgctgaag gaacactaac cgcaaccact 360

ttcactggaa tggtttttgt ctgcttgaat atgcagcgtt gctttcttgg agaatgtaca 420

cctacaatag tggggaaaga acagagaaaa aaaacgtatc tctgtagatc tccctcaata 480

aagaaatgag gataaaacta gttaacagtg tgagctctcc aagacagaag agacaaaatg 540

gccaacgaaa agagaagggg gaaagaccga tgggaggaaa ggtactgtgt gtgctgacat 600

tgaagggatc atgtgtggac agtttagatg tattagaaca ccttaatcaa gtataactat 660

aatcagttta cggtttatca cagtttttta ttcgtgctac ctgttagtgg cattgtttgc 720

atgtacatta acccttttaa tttcttttag tttctaaatt gatgctgatt ttcctttggt 780

tagttcatgc taatatgcat cacgaagaaa taaagttagt aagaagctca taattccttc 840

ctttttttag cacaaacatt gtttatttat tgttttattg ttattgttga tgtaggtttt 900

ttgcaagtag aatacaagat atactgttca aggaataagt tgattcatat gatcattgtt 960

aaacacatag agatatttaa agaaataata tcataacata agt 1003

<210> 2

<211> 1027

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 2

aacagttaga aaatacacta ctgctaggct catgccgatc ttgatcatta catgtatata 60

tgttgcatta tattattcac tgcgagctat atatatgtct cctgctctct ctttcaaacg 120

atatatacct ttttgcactt gttcaaccgt tgcactccac tgaaaccgta ctagaagttt 180

ctttttgacc gtcctttttt ccctattcta ttgcaggatg cttccattgc tcacccccaa 240

gagacagaat ggccttaccc gtactggcca cctgacaacc aagatcatca tgggtagtag 300

caacagggac ctggtaaata gtggcgatga tgtgaatgct gaaggaacac taaccgcaac 360

cactttcact ggaatggttt ttgtctgctt gaatatgcag cgttgctttc ttggagaatg 420

tacacctaca atagtgggga aagaacagag aaaaaaaaca tatctctgta gatctccctc 480

aataaagaaa tgaggataaa actagttaac agtgtgagct ctccaagaca gaagagacaa 540

aatggccaac gaaaagagaa ggggggaaag accgatggga ggaaaggtac tgtgtgtgct 600

gacattgaag gggtcatgtg tggaccgtta gatgtattag agcaccttaa tcaagtataa 660

ctataatcag tttacagttt atcacagttt ttttattcgt actacctgtt ttccaaatgt 720

aaaaactagt ggcattgttt gcatgcatgt gcattaaccc ttttaatttc tttcagtttc 780

taaattgatg ctgattttct tttggttagt tcatgctaat atgcatcacg aagaaataaa 840

catagtaaga agctcgtaat tccttccttt ttagcacaaa cattttttat ttattatttt 900

attgttatta ttgatgtagg ttttttgcaa gtagaattca agctatactg ttcaaggaat 960

aagttgattc atatgatcat tgtcaatcac atagagatat ttaaacagat aatatcataa 1020

cataagt 1027

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

ggctttaagc aaggccaacg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

gctcactagc aaggcttctc a 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gccggcttgg aagaactgat aat 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

ccctgttgct actacccatg atgat 25

<210> 7

<211> 1527

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 7

atggccgttc tcgtcttcct ggcgatcgcc ctggttagcg cagcaagacg gagaaacaag 60

aaccatccct ccccctaccg ctgctactca tgcacgcgcg cactgcctcc tggtgccgcc 120

gcgtatgatc cagacatgaa tagggcgcac agcagcagct ccaagctcat caacgagaag 180

ctcgtggaac accggatctc cactgcgaag cactgccccc actgcggcga gaaaatcgac 240

agcaaaccgt tatgcacctc ctcagccagc atgagacctg gtggtggtgc aacttgtttt 300

gatgggatta attgctgtaa ctgcaagaag gattgggtgg ggctgccggc aggcgtcaag 360

ttcgatccaa ctgaccagga gctgatcgag cacctcgagg cgaaagtgaa ggatgaaggc 420

tcgagatctc accctctcat cgacgagttc atacccacaa tagatgggga ggacggcata 480

tgttacaccc accccgagaa acttccaggt gtgacgaggg atggcctaag caagcacttc 540

ttccaccggc cgtccaaggc ctacacgacg ggcacgagga agaggaggaa gatacagacg 600

gagtgcgacg tccacaaggg ggagacgagg tggcacaaga ccggcaagac gcggccggtg 660

atggtgaacg gccggcagaa ggggtgcaag aagatattgg tgctgtacac caacttcggc 720

aagcaccgca agccggagaa gacgaactgg gtcatgcacc agtaccacct cggcgaccta 780

gaagaggaga aggaggggga gctggtggtg tgcaagatct tctaccagac gcaacccagg 840

cagtgcagct ggtcctccga ccggggcgcc gccgccactg ccttggcagc aacggcggca 900

gcggcggcgg cgcaggagca gcataggagg gatagtggca gtggcagctg ctcgtctagg 960

gaccacgagg tgtcagccac atcgttccca gccggataca cagtcaccac ggccgtcgag 1020

atgcagcagc atatgaagca gcctgcggac catttcagct tcgcgccttt caggaaaacc 1080

ttcgaccagg aggttggtat aggtggtgat caggtgccat ctaatcagct tggacgttca 1140

gagccgcatc atgccggcct ggggcagcag ccacacggcc cggtgctcgc gacgaagacg 1200

gctgtgcctg ctacagcttt cctgatcagt aggccatcga accctgtctc gactatagtg 1260

ccacctgcaa tgcagcacgc atcagttgtt ctcgatcatg atcagttcca tgtgccagca 1320

atccttctcc atcaccatga caaatttcag aacatgcacc aacagccaca acaaaagctt 1380

gaccgcagat ctgccggctt ggaagaactg ataatgggct gcacgtcgtc cacaagcaca 1440

aaaggagatg cttccattgc tcacccccaa gagacagaat ggccttacac gtactggcca 1500

cctgacaacc aagatcatca tgggtag 1527

<210> 8

<211> 508

<212> PRT

<213> Zea mays L

<400> 8

Met Ala Val Leu Val Phe Leu Ala Ile Ala Leu Val Ser Ala Ala Arg

1 5 10 15

Arg Arg Asn Lys Asn His Pro Ser Pro Tyr Arg Cys Tyr Ser Cys Thr

20 25 30

Arg Ala Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ala Tyr Asp Pro Asp Met Asn Arg

35 40 45

Ala His Ser Ser Ser Ser Lys Leu Ile Asn Glu Lys Leu Val Glu His

50 55 60

Arg Ile Ser Thr Ala Lys His Cys Pro His Cys Gly Glu Lys Ile Asp

65 70 75 80

Ser Lys Pro Leu Cys Thr Ser Ser Ala Ser Met Arg Pro Gly Gly Gly

85 90 95

Ala Thr Cys Phe Asp Gly Ile Asn Cys Cys Asn Cys Lys Lys Asp Trp

100 105 110

Val Gly Leu Pro Ala Gly Val Lys Phe Asp Pro Thr Asp Gln Glu Leu

115 120 125

Ile Glu His Leu Glu Ala Lys Val Lys Asp Glu Gly Ser Arg Ser His

130 135 140

Pro Leu Ile Asp Glu Phe Ile Pro Thr Ile Asp Gly Glu Asp Gly Ile

145 150 155 160

Cys Tyr Thr His Pro Glu Lys Leu Pro Gly Val Thr Arg Asp Gly Leu

165 170 175

Ser Lys His Phe Phe His Arg Pro Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Gly Thr

180 185 190

Arg Lys Arg Arg Lys Ile Gln Thr Glu Cys Asp Val His Lys Gly Glu

195 200 205

Thr Arg Trp His Lys Thr Gly Lys Thr Arg Pro Val Met Val Asn Gly

210 215 220

Arg Gln Lys Gly Cys Lys Lys Ile Leu Val Leu Tyr Thr Asn Phe Gly

225 230 235 240

Lys His Arg Lys Pro Glu Lys Thr Asn Trp Val Met His Gln Tyr His

245 250 255

Leu Gly Asp Leu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu Leu Val Val Cys Lys

260 265 270

Ile Phe Tyr Gln Thr Gln Pro Arg Gln Cys Ser Trp Ser Ser Asp Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Gln Glu Gln His Arg Arg Asp Ser Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ser Arg

305 310 315 320

Asp His Glu Val Ser Ala Thr Ser Phe Pro Ala Gly Tyr Thr Val Thr

325 330 335

Thr Ala Val Glu Met Gln Gln His Met Lys Gln Pro Ala Asp His Phe

340 345 350

Ser Phe Ala Pro Phe Arg Lys Thr Phe Asp Gln Glu Val Gly Ile Gly

355 360 365

Gly Asp Gln Val Pro Ser Asn Gln Leu Gly Arg Ser Glu Pro His His

370 375 380

Ala Gly Leu Gly Gln Gln Pro His Gly Pro Val Leu Ala Thr Lys Thr

385 390 395 400

Ala Val Pro Ala Thr Ala Phe Leu Ile Ser Arg Pro Ser Asn Pro Val

405 410 415

Ser Thr Ile Val Pro Pro Ala Met Gln His Ala Ser Val Val Leu Asp

420 425 430

His Asp Gln Phe His Val Pro Ala Ile Leu Leu His His His Asp Lys

435 440 445

Phe Gln Asn Met His Gln Gln Pro Gln Gln Lys Leu Asp Arg Arg Ser

450 455 460

Ala Gly Leu Glu Glu Leu Ile Met Gly Cys Thr Ser Ser Thr Ser Thr

465 470 475 480

Lys Gly Asp Ala Ser Ile Ala His Pro Gln Glu Thr Glu Trp Pro Tyr

485 490 495

Thr Tyr Trp Pro Pro Asp Asn Gln Asp His His Gly

500 505

Claims

1.一种调控玉米叶夹角的关键DNA序列，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸；或

(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有调控玉米叶夹角的功能；

(d)在SEQ ID No.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到的多核苷酸突变体，且该多核苷酸突变体所编码的蛋白仍具有调控玉米叶夹角的功能或活性。

2.权利要求1所述调控玉米叶夹角的关键DNA序列的突变体，其特征在于，该突变体的多核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述的关键DNA序列的重组表达载体、或含有权利要求2所述突变体的重组表达载体。

4.调控ZmNAC16基因在玉米叶枕中表达的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SNP_3_6945310_C/T，Indel_3_6945248_C/CT和Indel_3_6945836_T/TTGCA。

5.用于检测权利要求4所述分子标记的变异情况的特异性检测引物，其特征在于，该特异性检测引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

6.权利要求1所述的关键DNA序列在调控玉米叶夹角方面上的应用、或在培育高产玉米新品种或耐密植玉米新品种中的应用；优选的，所述的调控玉米叶夹角包括使玉米叶夹角变得紧凑。

7.权利要求2所述的突变体在调控玉米叶夹角方面上的应用、或在培育高产玉米新品种或耐密植玉米新品种中的应用；优选的，所述的调控玉米叶夹角包括使玉米叶夹角变得紧凑。

8.权利要求4所述的分子标记在调控ZmNAC16基因在玉米中的表达中的应用。

9.用于检测ZmNAC16基因的特异性引物对，其特征在于，其多核苷酸为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

10.一种培育高产或耐密植的玉米新品种的方法，包括：应用权利要求1所述的关键DNA序列或权利要求2所述的突变体提高ZmNAC16基因在玉米叶枕中的表达量。