CN113564179A

CN113564179A - 水稻nat8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用

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Publication number: CN113564179A
Application number: CN202110835887.6A
Authority: CN
Inventors: 储成才; 唐九友; 梁燕; 张志华; 张从合; 严志; 方玉; 王慧; 申广勒; 李潜龙
Original assignee: Shanghai Zhongke Quanyin Molecular Breeding Technology Co Ltd; Anhui Win All Hi Tech Seed Co ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Shanghai Zhongke Quanyin Molecular Breeding Technology Co Ltd; Anhui Win All Hi Tech Seed Co ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-07-23
Also published as: CN113564179B

Abstract

本发明公开了水稻NAT8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用。本发明用氯酸盐处理水稻品种Kasalath与日本晴(Nip)构建的单片段代换系，结合图位克隆技术鉴定到一个新的氮利用效率调控基因NAT8，该基因编码一个质膜定位的碱基/抗坏血酸转运蛋白。通过对该基因进行生理生化及遗传学研究，为水稻中NAT家族的研究提供切入点，有助于阐明水稻中碱基代谢物的转运和再利用调控机制；也有助于更深入解析植物体内不同类型氮源在吸收转运上的协同机制，此外，新的氮肥高效利用位点的发掘也为培育氮高效利用品种提供更多遗传资源和理论依据。

Description

水稻NAT8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种水稻NAT8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用。

背景技术

氮是植物需求量最大的矿质元素，也是农业生产的主要决定因素之一。氮肥的施用极大地增加了作物产量，但也带来了诸如高耗能、高投入、重污染等负面影响。水稻(Oryza sativa L.)是全球主要粮食作物之一，水稻不同亚种间在氮肥利用效率上存在很大差异，克隆并利用控制亚种间氮肥利用效率差异的主效基因，改良水稻氮肥利用效率是解决上述问题的有效途径。

氯酸盐是硝酸盐的结构类似物，植物可以利用硝酸盐系统转运和同化氯酸盐，且当氯酸盐被还原为亚氯酸盐后，会对植物产生毒害作用。因而氯酸盐敏感性可作为鉴定硝酸盐吸收同化能力的指示剂。Aus是亚洲栽培稻中具有多种耐逆性的一个亚群。Kasalath是Aus亚群的一个代表品种，对氯酸盐有极强的敏感性。

在长期进化过程中，植物形成了利用多种氮的能力。土壤中供植物利用的氮可以分为无机氮和有机氮两种。铵盐和硝酸盐是土壤中主要的无机氮源，蛋白质、氨基酸、小肽、核酸碱基及其衍生物是主要的有机氮源。因为土壤性质(如质地、pH值、水分、微生物种类等)的差异，土壤中的氮在不同时间不同位置上有很大差异。为应对外界环境中不同氮源含量的变化以及植物自身不同发育阶段对各种氮需求量的不同，植物进化出多种调节氮吸收利用的机制。

目前对植物无机氮源(硝酸盐、铵盐)的研究取得很大进展，尤其是硝酸盐，对有机氮的代谢转运也有较大进展，尤其对氨基酸代谢转运研究。然而，植物如何调节碱基或核苷类氮源的利用的研究报道相对较少。水稻中，针对5个核苷碱基转运蛋白家族的功能研究开展极少，其中NAT家族目前尚未有功能的水稻基因报道。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供了一种水稻NAT8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种水稻NAT8基因，所述水稻NAT8基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQID NO：4所示，水稻NAT8基因的CDS核苷酸序列如 SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

进一步改进在于，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种上述基因的敲除载体，所述敲除载体为包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的NAT8基因的gDNA片段的CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供了一种如上述基因在提高植物产量育种中的应用。

进一步改进在于，所述提高植物产量的方法为：将含有SEQ ID NO：3 或SEQ IDNO：5所示的NAT8基因的植株进行NAT8基因敲除，获得缺失体植株。

进一步改进在于，所述植物为水稻。

进一步改进在于，所述应用为通过提高植物的氮利用效率来提高植物产量育种。

进一步改进在于，所述氮利用效率提高体现在如下方面中的至少一种：氯酸盐敏感性、硝酸盐吸收转运能力、有效分蘖数、单株产量、小区产量。

本发明的有益效果在于：用氯酸盐处理Kasalath与氯酸盐不敏感材料日本晴(Nip)构建的单片段代换系，结合图位克隆技术我们鉴定到一个新的氮利用效率调控基因NAT8，该基因编码一个质膜定位的碱基/抗坏血酸转运蛋白。通过对该基因进行生理生化及遗传学研究，为水稻中NAT家族的研究提供切入点，有助于阐明水稻中碱基代谢物的转运和再利用调控机制；也有助于更深入解析植物体内不同类型氮源在吸收转运上的协同机制，此外，新的氮肥高效利用位点的发掘也为培育氮高效利用品种提供更多遗传资源和理论依据。

附图说明

图1为不同亚种及日本晴(Nip)与CSSSL^NAT8间氯酸盐敏感性差异表型结果图；

图2为NAT8基因的图位克隆结果图；图中，图2A和图2B是利用BC7F2 进行QTL分析和定位图，图2A黑线上方的字母和数字代表筛选标记，图 2B是91kb范围内预测的基因，黑色方块代表编码表达蛋白的基因，其它箭头代表的基因如下方标注名称，箭头指示基因表达的方向，图2C是本发明克隆的NAT8基因的结构示意图，灰色方块代表外显子，白色方块和白色箭头分别代表5'UTR和3'UTR，黑色箭头指示单核苷酸多态性(SNP)的位置及差异类型。

图3为NAT8敲除突变体和近等基因系对氯酸盐的敏感性分析结果图； (A)和(B)是野生型(Nip)与NAT8突变体对氯酸盐敏感性的表型差异，(B)是 (A)图中方框的放大图片，(C)是3个NAT8s突变体基因组的突变类型，(D) 和(E)是NAT8近等基因系的姊妹系N8^N和N8^K对氯酸盐敏感性差异表型， (D)是(E)图中方框的放大图片，(F)是鉴定N8^N和N8^K的筛选标记，M1至 NK8是筛选标记的位置，“N”指含Nip型基因片段，“K”指含Kasalath型基因片段；

图4为NAT8敲除突变体和近等基因系对¹⁵NO₃ ^-吸收的差异分析结果图；

图5为不同氮浓度条件下野生型和NAT8s田间农艺性状统计结果图；

图6为近等基因系N8^N和N8^K田间农艺性状结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻品种日本晴和Kasalath：记载于“S.Y.Lin，T.Sasaki，M.Yano (1998).Mapping quantitative trait loci controlling seed dormancy and heading datein rice，Oryza sativa L.，using backcross inbred lines.Theor Appl Genet 96:997-1003.”一文的“Nipponbare”和“Kasalath”，公开可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)：记载于“Suhong Xu，Feng Cheng，Juan Liang，et al.Maternal xNorrin，a Canonical Wnt Signaling Agonist and TGF-βAntagonist，Controls Early Neuroectoderm Specification in Xenopus.PloSBiology，2012.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

pGEMHE载体：记载于Kun Liu and Sheng Luan(2001)Internal Aluminum Blockof Plant Inward K⁺Channels.Plant Cell，13:1453–1465”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系AGL1、GV3101记载于文献： Wang W，HuB，Yuan D，LiuY，Che R，Hu Y，Ou S，Zhang Z， Wang H，Li H，Jiang Z，Zhang Z，Gao X，QiuY，Meng X，Liu Y， Bai Y，Liang Y，Wang Y，Zhang L，Li L，Mergen S，Jing H，Li J， andChu C(2018)Expression of the nitrate transporter OsNRT1.1A/OsNPF6.3 confershigh yield and early maturation in rice.Plant Cell，30(3):638-651中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该载体只可重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中水稻是按照如下方法栽培得到的：

(1)短期水培苗：用自来水浸泡水稻种子，在37℃培养箱中避光催芽 3天左右，播种于去底的96孔PCR板，置于水稻培养箱培养，培养水稻幼苗用改良的Kimura B营养液，基础配方是0.365mM(NH₄)₂SO₄，0.18mM KH₂PO₄，0.183mM KNO₃，0.0914mM K₂SO₄，0.363mM Ca(NO₃)₂·4H₂O， 0.548mM MgSO₄·7H₂O，1.2mM Na₂SiO₃·9H₂O，20μΜFeSO₄-EDTA (FeSO₄·7H₂O 5.56g/L，Na₂-EDTA·2H₂O 7.445g/L))，0.079μΜ(NH₄)₆ Mo₇O₂₄·4H₂O，46.2μΜH₃BO₃，0.32μΜCuSO₄·5H₂O，9.15μΜMnCl₂·4H₂O， 0.765μΜZnSO₄·7H₂O)，在不同的实验中，略有改变，主要是铵盐和硝酸盐的使用浓度有所改变，其中Ca(NO₃)₂·4H₂O用等浓度的CaCl₂替代，将 (NH₄)₂SO₄替换为NH₄Cl，其它成分没有变化。为使说明书相对简单明了，在相关的实验操作中会备注有改变的成分，而省略其它的成分。

(2)水稻材料的田间栽培：用自来水浸泡水稻种子，在37℃培养箱中避光催芽3天左右，然后将露白的种子播在苗床上进行育秧，到4叶期时将水稻秧苗移栽入水田。

实施例1：基因的发现

Aus亚种对氯酸盐的敏感性显著高于粳稻亚种，也高于籼稻亚种，Aus 亚种中OsNRT1.1B SNP1位点的碱基与粳稻的一样(图1A，B，C)，这意味着，在Aus亚种中还有其他氯酸盐敏感的基因。用氯酸盐处理粳稻品种日本晴(Nip)与Aus品种Kasalath构建的染色体单片段代换系，发现了除 OsNRT1.1B所在位置外的对氯酸盐的敏感性强于轮回亲本日本晴的染色体单片段代换系CSSSL^NAT8(图1D)。

1、NAT8基因的初步定位

为了分离NAT8基因，本发明首先利用单片段代换系和日本晴构建定位群体。进而，利用该分离群体的BC₇F₂个体进行QTL分析和定位。定位结果表明，NAT8初步定位在第8染色体上，处于NK1和NK8两个标记之间，物理距离约1.3Mb(图2A)。

2、NAT8基因的精细定位

为了进一步缩小目的基因的界定区域，从BC₇F₂分离群体中，选取了 1240个株型近于Kasalath的单株进行了精细定位。同时，利用已经公布的 93-11和日本晴在定位区间内籼粳稻亚种间基因组序列，寻找差异位点，开发新的STS和SSR标记。然后用新的分子标记对这些交换单株继续进行筛选，最终，目的基因被精确定位在分子标记NK10和NK12之间约91kb的范围之内(图2B)。

3、候选基因的鉴定和序列分析

序列表中，序列SEQ ID NO：1为NAT8-日本晴型蛋白序列，序列SEQ ID NO：2为NAT8-Kasalath型蛋白序列，序列SEQ ID NO：3为NAT8-日本晴型基因组序列，序列SEQ IDNO：4为NAT8-kasalath型基因组序列，序列SEQ ID NO：5为NAT8-日本晴型CDS序列，序列SEQ ID NO：6为 NAT8-kasalath型CDS序列。

对该91kb区域进行候选基因预测并在日本晴和Kasalath间进行测序比对。结果发现，在Kasalath材料中，基因NAT8(LOC_Os08g32500)在日本晴和Kasalath的编码区有5个SNPs(图2C)。蛋白序列比对发现，164位氨基酸发生错义突变，p.164位日本晴是亮氨酸(Leu，L)，Kasalath是苯丙氨酸(Phe，F)，即这5个SNPs只有第1个外显子490位碱基的改变(c.490C>T) 使两种基因编码的氨基酸发生改变。

综合以上信息，将该基因确定为候选基因。在MSU数据库 (http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search)中注释该候选基因编码一个NAT家族的碱基/抗坏血酸转运蛋白。将该基因与已有研究的 NAT类转运蛋白的氨基酸序列比对，确认该基因含有NAT家族典型的基序即Q-H基序和[Q/E/P]-N-X-G-X-X-X-X-T-[R/K/G]基序。

实施例2、NAT8功能缺失突变体的获得及其检测

一、水稻NAT8功能缺失突变体的获得

1、gRNA的设计

利用序列SEQ ID NO：3作为参考序列，在NAT8编码区设计gRNA靶点序列即：5’-GGATTTGGCCTCTATGAGCT-3’，该序列为序列3第 2144-2163位核苷酸序列，其反向互补序列为 5’-AGCTCATAGAGGCCAAATCC-3’，根据杭州百格生物技术公司的试剂盒 ((Cat#BGK03)说明书要求在gRNA靶点序和反向互补序列的5’端或5’端和 3’端加相应的接头，最终获得的引物序列分别为NAT8-F/NAT8-R，具体引物序列如下：

NAT8-F：5’-tgtgtgGGATTTGGCCTCTATGAGCT-3’；

NAT8-R：5’-aaacAGCTCATAGAGGCCAAATCCca-3’；

上面引物序列小写字母即为添加的接头序列。

2、敲除载体的构建

(1)将引物对NAT8-F/NAT8-R变性、退火得到NAT8-F/R的二聚体产物，具体操作是：将合成的引物序列加水溶解至10μM，用10μL反应体系：NAT8-F 0.5μL，NAT8-R 0.5μL，BufferAneal 9μL，混匀，在PCR仪中采用梯度降温的方法：95℃5min；90℃1min；85℃1min；然后以5℃/min 降到25℃；

(2)将NAT8-F/R二聚体产物构建到CRISPR/Cas载体中，具体操作是： 5μL反应体系：CRISPR/Cas 1μL，NAT8-F/R二聚体0.5μL，Enzyme Mix 0.5 μL，H₂O 3μL，混匀，室温反应1小时，即得到NAT8 CRISPR/Cas9敲除载体。构建过程中用的载体和试剂均来自杭州百格生物技术公司的试剂盒 (Cat#BGK03)。

3、水稻NAT8突变体的获得

将步骤2获得的NAT8 CRISPR/Cas9敲除载体通过热击法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1，筛选获得含有NAT8 CRISPR/Cas9 的重组农杆菌菌株，通过农杆菌介导法用含有NAT8 CRISPR/Cas9的重组农杆菌侵染日本晴愈伤组织，最终获得T0代转基因水稻，具体转化和筛选方法参见文献“易自立，曹守云，王力，何锶洁，储成才，唐祚舜，周朴华，田文忠。提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报，2001，28(4):3552-358” 一文。

二、水稻NAT8突变体的鉴定

通过PCR和测序检测步骤3获得的T0代转基因水稻。具体步骤如下：提取步骤3获得的T0代转基因水稻基因组DNA。在设计的gRNA靶点序列前后约300bp范围内设计PCR扩增引物sNAT8-F/sNAT8-R，用 sNAT8-F/sNAT8-R对检测序列进行扩增，用sNAT8-F对获得的产物进行测序。sNAT8-F/sNAT8-R的具体序列如下：

sNAT8-F：CCGCACTAGCTGTATCTAAGCA(序列3第2948-2969位核苷酸序列)

sNAT8-R：TGACTTTCAGCAACCACAGC(序列3第3556-3575位核苷酸序列的反向互补序列)

通过转基因后代阳性鉴定和基因测序检测，鉴定到多种类型的突变体植株，选择来源独立且突变类型不同的敲除株系，通过连续自交，鉴定选择纯合后代，选择其中的三个突变株系nat8-2、nat8-3、nat8-4做后续的研究。与野生型水稻日本晴的基因组DNA相比，NAT8突变株系nat8-2在NAT8 基因的第5个外显子发生2个碱基的缺失突变，该缺失突变位于序列3第 3352-3353位，导致NAT8翻译提前终止，使NAT8功能丧失或减弱。

NAT8突变株系nat8-3在NAT8基因的第5个外显子发生21个碱基的缺失突变，该缺失突变位于序列3第3338-3358位，导致NAT8蛋白序列发生7个氨基酸的缺失，使NAT8功能丧失或减弱。

NAT8突变株系nat8-4在NAT8基因的第5个外显子发生1个碱基的缺失突变，该缺失突变位于序列3第3351位，导致NAT8翻译提前终止，使 NAT8功能丧失或减弱。

三、NAT8敲除突变体对氯酸盐敏感性检测

因为NAT8是利用氯酸盐毒性筛选法克隆到的基因，为验证该基因的正确性，本发明的发明人用氯酸盐处理NAT8敲除突变体株系nat8-2、nat8-3、 nat8-4。具体操作是：首先将野生型日本晴(Nip)和NAT8敲除突变体株系幼苗在改良的KimuraB营养液(0.25mM(NH₄)₂SO₄，0.12mM KNO₃，0.25mM Ca(NO₃)₂)中培养至水稻苗高10cm左右，在原有木村营养液中加入终浓度为0.1mM的氯酸钾处理液(具体浓度根据水稻苗的长势略作调整)培养处理水稻苗，每天更换含氯酸钾的营养液，直到出现氯酸盐毒害表型(前期叶片上出现锈色斑点，后期叶片会干枯)，一般3天左右出现锈色斑点。

处理结果显示敲除突变体NAT8s对氯酸盐的敏感性均强于野生型日本晴，表现为敲除突变体叶片上锈色斑点显著多于日本晴(图3A，B，C)，敲除突变体与野生型间有差异，暗示克隆到的基因正确。

四、水稻NAT8敲除突变体对硝酸盐吸收转运能力的检测

NAT8敲除突变体与野生型日本晴间对氯酸盐敏感性有差异，氯酸盐是硝酸的结构类似物，为验证NAT8对硝酸盐的吸收转运有何影响，本发明的发明人进行了¹⁵N示踪的硝酸盐吸收转运实验。首先将野生型日本晴和NAT8 敲除突变体在改良的KimuraB营养液(0.5mM NH₄Cl，0.5mM KNO₃)中培养 4天，接着用低氮Kimura B营养液(0.1mM(NH₄)₂SO₄，0.1mM KNO₃)培养1 天，然后做¹⁵N吸收，在吸收前，先在低氮KimuraB营养液培养2小时，之后用0.1mM CaSO₄清洗根部1分钟；用去离子水清洗根部1分钟，接着将水稻苗转入含2mMK¹⁵NO₃的低氮KimuraB营养液中培养6小时，之后用0.1mM CaSO₄清洗根部1分钟；用去离子水清洗根部1分钟，分地上部分和地下部分取材，将材料放在5mL离心管中，开盖置于65℃烘箱中3天左右烘干样品，用细胞破碎仪振荡破碎(转速约900stroke/min)，直至样品呈粉末状，用稳定同位素质谱分析仪(Thermo Finnigal DELTA^plus XP Bremen Germany，植物所，植200301196)测定样品的¹⁵N含量量(具体方法参见“Kun-Hsiang Liu， Chi-Ying Huang，Yi-Fang Tsay，et al.CHL1 Is a Dual-Affinity Nitrate Transporter of ArabidopsisInvolved in Multiple Phases of Nitrate Uptake.The Plant Cell，1999”一文)。实验设4次重复，测定结果取均值。通过计算NAT8 敲除突变体地上部和根中¹⁵N的含量均显著高于野生型日本晴，说明敲除突变体中硝酸盐的吸收量高于日本晴(图4A)。

五、水稻NAT8突变体的分蘖检测

在高氮和低氮条件下(低氮：不施用氮肥，高氮：施用氮肥量为2kg/100 m²)，对NAT8突变体和野生型日本晴进行分蘖数统计，每个材料设置3个重复小区，每个小区统计20个单株。不同年份田间统计结果如图5所示， NAT8突变体分蘖数都高于野生型日本晴，尤其在高氮田中，2018年在高氮条件下，与日本晴相比，NAT8-2平均分蘖数从12个增到14.9个，NAT8-3 平均分蘖数从12个增到14个；低氮条件下与日本晴相比，NAT8-2平均分蘖数从5.4个增到5.9个，NAT8-3平均分蘖数从5.4个增到6.1个(图5A)。 2019年在高氮条件下，与日本晴相比，NAT8-2平均分蘖数从9.7个增到10.7 个，NAT8-3平均分蘖数从9.7个增到10.4；低氮条件下与日本晴相比，NAT8-2 平均分蘖数从4.8个增到5.5个，NAT8-3平均分蘖数从4.8个增到5.2个(图 5B)。

实施例3、NAT8近等基因系的获得与鉴定

一、NAT8近等基因系的获得

在用分子标记鉴定与日本晴回交的染色体单片段代换系过程中，选择来自于同一个株系，在NK10和NK12两个分子标记之间含有不同基因片段的材料定为NAT8近等基因系姊妹系，其中在NK10和NK12两个分子标记之间是Kasalath型基因片段(含Kasalath单倍型的NAT8)的株系命名为N8^K，在NK10和NK12两个分子标记之间是日本晴型基因片段(含日本晴单倍型的NAT8)的株系命名为N8^N，N8^N和N8^K即为NAT8近等基因系材料。

二、NAT8近等基因系对氯酸盐敏感性检测

为验证该基因的正确性，本发明的发明人用氯酸盐处理NAT8近等基因系，具体操作同实施例2中氯酸盐处理NAT8敲除突变体株系的方法。

观察到NAT8近等基因系姊妹系对氯酸盐的敏感性也有差异，表现为 N8^K(含Kasalath单倍型的NAT8)对氯酸盐的敏感性强于N8^N(含日本晴单倍型的NAT8^N)(图3D，E，F)。敲除株系与野生型间以及近等基因系间对氯酸盐敏感性都有差异，暗示该图位克隆的基因正确。

三、水稻NAT8近等基因系对硝酸盐吸收转运能力的检测

NAT8近等基因系对氯酸盐敏感性有差异，为明确NAT8两种基因型水稻对硝酸盐的吸收转运有何影响，本发明的发明人进行了¹⁵N示踪的硝酸盐吸收转运实验。具体操作同实施例2中NAT8敲除突变体株系¹⁵N示踪的硝酸盐吸收转运实验的方法。

通过计算NAT8近等基因系姊妹系N8^K地上部和根中¹⁵N的含量均显著高于N8^N，说明两种单倍型的NAT8对硝酸盐吸收有差异，且含Kasalath单倍型的NAT8^K中硝酸盐的吸收量高于含日本晴单倍型的NAT8^N(图4B)。

四、水稻NAT8近等基因系田间农艺性状检测

在高氮和低氮条件下(低氮：不施用氮肥，高氮：施用氮肥量为2kg/100 m²)，对NAT8近等基因系的一些农艺性状，包括有效分蘖数、单株产量、小区产量进行统计，田间统计结果显示，在高氮试验小区，近等基因系N8^K的分蘖数和产量都显著高于N8^N，在高氮条件下，平均分蘖数N8^N有10.3 个，N8^K有11.3个；单株产量N8^N是25.6g，N8^K是27.8g；小区产量N8^N是1.28kg，N8^K是1.39kg(图6A，B)；而在低氮试验小区，N8^K分蘖数和产量略高于N8^N，低氮条件下，平均分蘖数N8^N有4.6个，N8^K有4.9个，单株产量N8^N是14.46g，N8^K是14.51g，小区产量N8^N是0.723kg，N8^K是0.726kg(图6C，D)。每个材料设置3个重复小区，有效分蘖数每个小区统计29个以上的单株，单株产量每个小区统计14个以上的单株，小区产量是3个小区的平均值。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽荃银高科种业股份有限公司，中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 水稻NAT8基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用

<141> 2021-07-23

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 533

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa Linn)

<400> 1

Met Ala Gly Gly Gly Ala Ala Pro Pro Pro Lys Gln Glu Glu Leu Gln

1 5 10 15

Pro His Gln Val Lys Asp Gln Leu Pro Ser Val Ser Tyr Cys Ile Thr

20 25 30

Ser Pro Pro Pro Trp Pro Glu Ala Val Ile Leu Gly Phe Gln His Tyr

35 40 45

Ile Val Met Leu Gly Thr Ser Val Ile Ile Pro Ser Ala Leu Val Pro

50 55 60

Gln Met Gly Gly Gly Asn Glu Glu Lys Ala Arg Val Ile Gln Thr Leu

65 70 75 80

Leu Phe Val Ala Gly Ile Asn Thr Leu Cys Gln Ser Phe Phe Gly Thr

85 90 95

Arg Leu Pro Ala Val Met Gly Gly Ser Tyr Thr Ile Val Ala Pro Thr

100 105 110

Ile Ser Ile Ile Leu Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Glu Ala Asp Pro His

115 120 125

Glu Lys Phe Leu Arg Thr Met Arg Gly Thr Gln Gly Ala Leu Ile Ile

130 135 140

Ala Ser Thr Ile Gln Ile Ile Leu Gly Phe Ser Gly Leu Trp Arg Asn

145 150 155 160

Val Val Arg Leu Leu Ser Pro Leu Ser Ala Val Pro Leu Ile Ser Leu

165 170 175

Ala Gly Phe Gly Leu Tyr Glu Leu Gly Phe Pro Gly Val Ala Lys Cys

180 185 190

Val Glu Ile Gly Leu Pro Glu Ile Ile Leu Leu Leu Val Phe Ser Gln

195 200 205

Tyr Leu Pro His Val Ile His Val Ala Lys Pro Val Phe Asp Arg Phe

210 215 220

Ala Val Ile Phe Thr Ile Ala Ile Val Trp Leu Tyr Ala Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Thr Ala Ser Gly Ala Tyr Lys Asn Ala Arg Pro Lys Thr Gln Val His

245 250 255

Cys Arg Val Asp Arg Ser Gly Ile Ile Ser Gly Ala Pro Trp Ile Arg

260 265 270

Val Pro Phe Pro Phe Gln Trp Gly Ala Pro Thr Phe Asp Ala Gly Glu

275 280 285

Ser Phe Ala Met Met Met Ala Ser Phe Val Ala Leu Val Glu Ser Thr

290 295 300

Gly Thr Phe Ile Ala Val Ser Arg Tyr Ala Ser Ala Thr Met Ile Pro

305 310 315 320

Pro Ser Val Leu Gly Arg Gly Ile Gly Trp Gln Gly Ile Gly Thr Leu

325 330 335

Ile Gly Ala Phe Phe Gly Thr Ala Asn Gly Thr Ala Val Ser Val Glu

340 345 350

Asn Ala Gly Leu Leu Ala Leu Thr His Val Gly Ser Arg Arg Val Val

355 360 365

Gln Ile Ser Ala Gly Phe Met Ile Phe Phe Ser Ile Leu Gly Lys Phe

370 375 380

Gly Ala Ile Phe Ala Ser Ile Pro Leu Pro Ile Phe Ala Ala Leu Tyr

385 390 395 400

Cys Ile Phe Phe Ala Tyr Ile Gly Ala Cys Gly Leu Ser Phe Leu Gln

405 410 415

Phe Cys Asn Leu Asn Ser Phe Arg Thr Lys Phe Ile Val Gly Phe Ser

420 425 430

Phe Phe Met Gly Leu Ser Val Pro Gln Tyr Phe Asn Glu Tyr Thr Ser

435 440 445

Val Ala Gly Tyr Gly Pro Val His Thr Gly Ala Arg Trp Phe Asn Asp

450 455 460

Met Ile Asn Val Pro Phe Ala Ser Lys Pro Phe Val Ala Gly Leu Ile

465 470 475 480

Ala Tyr Phe Leu Asp Asn Thr Ile Gln Arg Arg Asp Asn Gly Val Arg

485 490 495

Arg Asp Arg Gly Tyr His Trp Trp Asp Lys Phe Arg Ser Phe Lys Thr

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Asp Thr Arg Ser Glu Glu Phe Tyr Ser Leu Pro Phe Asn Leu Asn Lys

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Phe Phe Pro Ser Val

530

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa Linn)

<400> 2

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Pro His Gln Val Lys Asp Gln Leu Pro Ser Val Ser Tyr Cys Ile Thr

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Ser Pro Pro Pro Trp Pro Glu Ala Val Ile Leu Gly Phe Gln His Tyr

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Ile Val Met Leu Gly Thr Ser Val Ile Ile Pro Ser Ala Leu Val Pro

50 55 60

Gln Met Gly Gly Gly Asn Glu Glu Lys Ala Arg Val Ile Gln Thr Leu

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Leu Phe Val Ala Gly Ile Asn Thr Leu Cys Gln Ser Phe Phe Gly Thr

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Ile Ser Ile Ile Leu Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Glu Ala Asp Pro His

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Ala Ser Thr Ile Gln Ile Ile Leu Gly Phe Ser Gly Leu Trp Arg Asn

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Val Val Arg Phe Leu Ser Pro Leu Ser Ala Val Pro Leu Ile Ser Leu

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Ala Gly Phe Gly Leu Tyr Glu Leu Gly Phe Pro Gly Val Ala Lys Cys

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Val Glu Ile Gly Leu Pro Glu Ile Ile Leu Leu Leu Val Phe Ser Gln

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Ala Val Ile Phe Thr Ile Ala Ile Val Trp Leu Tyr Ala Tyr Ile Leu

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Thr Ala Ser Gly Ala Tyr Lys Asn Ala Arg Pro Lys Thr Gln Val His

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Cys Arg Val Asp Arg Ser Gly Ile Ile Ser Gly Ala Pro Trp Ile Arg

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Pro Ser Val Leu Gly Arg Gly Ile Gly Trp Gln Gly Ile Gly Thr Leu

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Ile Gly Ala Phe Phe Gly Thr Ala Asn Gly Thr Ala Val Ser Val Glu

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Gln Ile Ser Ala Gly Phe Met Ile Phe Phe Ser Ile Leu Gly Lys Phe

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Cys Ile Phe Phe Ala Tyr Ile Gly Ala Cys Gly Leu Ser Phe Leu Gln

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435 440 445

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450 455 460

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Ala Tyr Phe Leu Asp Asn Thr Ile Gln Arg Arg Asp Asn Gly Val Arg

485 490 495

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gctcttgttc cccagatggg aggtggaaat gaggagaagg ctcgggtgat tcagacgctg 240

ctgttcgttg ccgggataaa caccctctgc caatcgttct tcgggactcg tcttccagct 300

gtgatgggag gatcgtacac cattgttgcg ccgacaattt ccatcatatt ggctggccgc 360

tatagcaatg aagcagatcc tcatgagaaa ttcttgcgga caatgcgagg aacacaaggt 420

gctctcatca ttgcatcgac aatccagatc atacttggtt tcagtggtct ctggcgcaat 480

gtagttagac ttcttagtcc attgtctgct gttcctttga tctcacttgc tggatttggc 540

ctctatgagc ttggttttcc aggggttgca aagtgcgtgg aaattgggct cccagaaatc 600

attctactgc ttgtattttc tcagtattta ccccatgtca tacatgtggc aaagcccgtg 660

ttcgaccggt ttgctgtgat tttcaccatt gctattgtgt ggctgtatgc atacattcta 720

actgctagtg gcgcatacaa gaatgcccgg ccgaagacac aagtgcactg tcgtgttgat 780

cgctctggaa ttatcagtgg agctccatgg ataagagttc ctttcccttt tcaatggggg 840

gctccaacat ttgatgctgg tgaatctttt gccatgatga tggcctcatt tgttgctctt 900

gtagagtcaa ctgggacctt cattgctgtg tcaagatatg caagtgcgac tatgatacct 960

ccatcagtgc ttggtcgtgg aattggttgg cagggtattg gtactttaat aggtgcattt 1020

ttcgggacag ccaatggaac tgctgtatca gtggaaaatg ccggtttgct agctttgaca 1080

catgttggca gccggagagt agtgcaaata tctgctggct tcatgatctt cttttctatc 1140

cttgggaaat tcggagcaat ctttgcgtca attcccttac caatattcgc tgcactgtat 1200

tgcatcttct ttgcatatat tggtgcctgt ggtctgagct tccttcagtt ctgcaatctc 1260

aacagcttca ggaccaagtt cattgtgggg ttctcgttct tcatgggctt atcggttcct 1320

cagtacttca acgagtatac atcggttgcc ggttatggtc cagtgcacac cggcgctcga 1380

tggttcaatg acatgataaa tgtacccttc gcgtcaaagc cgttcgtcgc agggctcatt 1440

gcgtacttcc tagacaacac tatccagagg cgcgacaatg gggtgaggag agacagggga 1500

taccactggt gggacaagtt caggagcttc aagacggaca cccggagcga ggagttctac 1560

tctctgccgt tcaacttgaa caagttcttc ccttccgtgt ga 1602

<210> 6

<211> 1602

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa Linn)

<400> 6

atggccggag gaggggcggc gccgccgccg aagcaggagg agttgcagcc tcaccaggtg 60

aaggaccagc tgcccagcgt gtcctactgc atcaccagcc caccgccatg gcctgaggcc 120

gtcatacttg gattccagca ctacattgtg atgctgggca catcagtgat tattcccagt 180

gctcttgttc cccagatggg aggtggaaat gaggagaagg ctcgggtgat tcagacgctg 240

ctgttcgttg ccgggataaa caccctctgc caatcgttct tcgggactcg tcttccagct 300

gtgatgggag gatcgtacac cattgttgcg ccgacaattt ccatcatatt ggctggccgc 360

tatagcaatg aagcagatcc tcatgagaaa ttcttgcgga caatgcgagg aacacaaggt 420

gctctcatca ttgcatcgac aatccagatc atacttggtt tcagtggtct ctggcgcaat 480

gtagttagat ttcttagtcc attgtctgct gttcctttga tctcacttgc tggatttggc 540

ctctatgagc ttggttttcc aggggttgca aagtgcgtgg aaattgggct cccagaaatc 600

attctactgc ttgtattttc tcagtattta ccccatgtca tacatgtggc aaagcccgtg 660

ttcgaccggt ttgctgtgat tttcaccatt gctattgtgt ggctgtatgc atacattcta 720

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cgctctggaa ttatcagtgg agctccatgg ataagagttc ctttcccttt tcaatggggg 840

gctccaacat ttgatgctgg tgaatctttt gccatgatga tggcctcatt tgttgctctt 900

gtagagtcaa ctgggacctt cattgctgtg tcaagatatg caagtgcgac tatgatacct 960

ccatcagttc ttggtcgtgg aattggttgg cagggtattg gtactttaat aggtgcattt 1020

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catgttggca gccggagagt agtgcaaata tctgctggct tcatgatctt cttttctatc 1140

cttgggaaat tcggagcaat ctttgcgtca attcccttac caatattcgc tgcgctgtat 1200

tgcatcttct ttgcatatat tggtgcctgt ggtctgagct tccttcagtt ctgcaatctc 1260

aacagcttca ggaccaagtt cattgtgggg ttctcgttct tcatgggctt atcggttcct 1320

cagtacttca acgagtatac atcggttgcc ggttatggtc cagtgcacac cggcgctcga 1380

tggttcaatg acatgataaa tgtacccttc gcgtcaaagc cgttcgtcgc agggctcatt 1440

gcgtacttcc tagacaacac catccagagg cgcgacaatg gggtgaggag agacagggga 1500

taccactggt gggacaagtt caggagcttc aagacggaca cccggagcga ggagttctac 1560

tctctgccgt tcaacttgaa caagttcttc ccttccgtgt ga 1602

Claims

1.一种水稻NAT8基因，其特征在于：所述水稻NAT8基因的基因组核苷酸序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示，水稻NAT8基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的一种水稻NAT8基因，其特征在于：该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1-2任一所述基因的敲除载体，其特征在于：所述敲除载体为包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的NAT8基因的gDNA片段的CRISPR/Cas9载体。

4.一种如权利要求1-2任一所述基因在提高植物产量育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述提高植物产量的方法为：将含有SEQID NO：3或SEQ ID NO：5所示的NAT8基因的植株进行NAT8基因敲除，获得缺失体植株。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用为通过提高植物的氮利用效率来提高植物产量育种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氮利用效率提高体现在如下方面中的至少一种：氯酸盐敏感性、硝酸盐吸收转运能力、有效分蘖数、单株产量、小区产量。