CN117821499A - 调控TaWRKY24蛋白编码基因表达的生物材料及其应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本申请公开了调控TaWRKY24蛋白编码基因表达的生物材料及其应用，属于遗传工程技术领域。本申请所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性。为此本申请提供调控TaWRKY24蛋白编码基因表达的生物材料在调控植物抗病性中的应用，所述TaWRKY24蛋白可为氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质。本申请挖掘了在假禾谷镰孢菌侵染条件下能够调控植物抗病性的目的基因及其编码蛋白质，可用于培育植物的抗病新品种、提高植物的抗病性。
Description
技术领域
本申请涉及遗传工程技术领域，具体涉及调控TaWRKY24蛋白编码基因表达的生物材料及其应用。
背景技术
小麦是一种重要的粮食作物，在人类饮食结构中占据重要的地位。土传真菌病害是小麦上一类重要的病害，主要危害小麦的根部和茎基部，造成养分、水分吸收传导受阻，影响小麦正常生长，给小麦的产量造成了严重的损失。由于田间管理措施不当，如有机肥投入减少、偏施氮肥、管理粗放等加重了小麦茎基腐病的发生。小麦茎基腐病从小麦分蘖期至黄熟期均可发病。病变的组织尤其是根茎交界处变褐腐烂，植株矮小，生活力下降，过早倒伏和籽粒灌浆受损。发病严重的植株出现枯白穗现象。小麦茎基腐病菌侵染后还会产生真菌毒素，如Deoxynivalenol（DON），影响粮食品质，严重危害人畜的健康。
小麦茎基腐病属于土传真菌病害，假禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）为主要致病菌。致病病原菌可以长期在土壤中病残体上存活，防治难度很大。由于小麦品种抗性普遍较差，水肥条件改善，加上秸秆还田病原菌不断积累，导致小麦茎基腐病发生呈现不断加重趋势，如何有效控制小麦茎基腐病的危害成为广大研究人员和小麦种植者重点关注的问题。创制和使用抗病品种是防治病害最为有效和环保的方式。但到目前为止，并未发现对茎基腐病免疫或者表现高抗（HR）的种质。优良抗性品种的稀缺导致鉴定和选育优良的抗性种质材料成为国内外学者重点关注的研究方向。因此加大抗源鉴选范围，挖掘优良抗源和抗病基因，培育具有稳定抗性的品种是当前攻克小麦茎基腐病难关的迫切需求。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性。更具体地，本申请要解决的技术问题是：如何调控植物对假禾谷镰孢菌的抗性。
为解决上述技术问题，本申请提供生物材料的应用，所述生物材料可为蛋白质或调控蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质，所述蛋白质可为TaWRKY24蛋白，所述应用可为下述任一种：
A1）、所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；
A2）、所述生物材料在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
A3）、所述生物材料在调控植物对茎基腐病抗性中的应用；
A4）、所述生物材料在制备调控植物对茎基腐病抗性的产品中的应用；
A5）、所述生物材料在调控植物对假禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）抗性中的应用；
A6）、所述生物材料在制备调控植物对假禾谷镰孢菌抗性的产品中的应用；
A7）、所述生物材料在植物育种或辅助植物育种中应用；
所述TaWRKY24蛋白可为下述任一种蛋白质：
a1）、氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；
a2）、将a1）所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且与植物抗逆性相关的蛋白质；
a3）、在a1）或a2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
本申请中，SEQ ID No.1由194个氨基酸残基组成。
上述TaWRKY24蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
进一步地，所述应用中，a3）中所述的连接可为肽键链接。
所述蛋白标签（protein-tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
进一步地，本申请中，所述植物育种的指标可为植物对假禾谷镰孢菌或/和茎基腐病的抗性。
进一步地，本申请中，所述植物育种的目的包括培育抗假禾谷镰孢菌或/和茎基腐病的植物。
进一步地，本申请中，所述调控可为上调或提高。
进一步地，本申请中，所述调控也可为下调或降低。
上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为下调或降低或敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或下调或降低所述蛋白质的编码基因表达的物质。所述调控植物抗病性/茎基腐病抗性/对假禾谷镰孢菌抗性可为降低植物抗病性/茎基腐病抗性/对假禾谷镰孢菌抗性。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1）在所述基因转录水平上进行的调控；2）在所述基因转录后进行的调控（也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控）；3）对所述基因的RNA转运进行的调控（也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控）；4）对所述基因的翻译进行的调控；5）对所述基因的mRNA降解进行的调控；6）对所述基因的翻译后的调控（也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控）。
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除（gene knock out）是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制（co-suppression）、基因压抑（quelling）、RNA干扰（RNAi）和微小RNA（miRNA）介导的翻译抑制等。
进一步地，所述的应用中，所述TaWRKY24蛋白可来源于小麦（Triticum aestivumL.）。
进一步地，所述的应用中，所述调控蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
B1）、抑制或降低上述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或抑制或降低上述TaWRKY24蛋白的含量或活性的核酸分子；
B2）、含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）、含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）、含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织或含有B3）所述重组载体的转基因植物组织；
B7）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官或含有B3）所述重组载体的转基因植物器官；
B8）、编码上述TaWRKY24蛋白的核酸分子；
B9）、含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
进一步地，所述的应用中，B1）所述核酸分子可为靶向上述TaWRKY24蛋白的编码基因的RNA或编码所述RNA的DNA。
进一步地，所述的应用中，所述RNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.2第184-483位。
进一步地，所述的应用中，B8）所述核酸分子可为如下g1）或g2）所述的DNA分子：
g1）、编码链的编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
g2）、与g1）所述DNA分子具有80%以上的同一性，且调控植物抗病性的DNA分子。
B2）所述表达盒可为在BSMV:γ（BSMV：GFP）载体的自有表达盒上插入包含所述靶标序列的DNA分子。
B3）所述重组表达载体可为重组BSMV:γ载体。在本申请的一些实施方式中，所述重组BSMV:γ载体的结构为：在载体BSMV:γ（BSMV：GFP）的NheⅠ酶切位点反向插入SEQ IDNo.2第184-483位所示的DNA分子。
B4）所述重组微生物可为重组大麦条纹花叶病毒 （Barley stripe mosaicvirus, BSMV）。所述重组大麦条纹花叶病毒可通过体外转录获得。所述重组大麦条纹花叶病毒可导致TaWRKY24蛋白的编码基因转录后发生基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活。
上述相关生物材料中，B6）所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，B7）所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
进一步地，所述的应用中，所述植物可选自单子叶植物。
进一步地，所述的应用中，所述单子叶植物可选自禾本科植物。
进一步地，所述的应用中，所述禾本科植物可选自小麦属植物。
进一步地，所述的应用中，所述小麦属植物可选自小麦（Triticum aestivumL.）。
本申请中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列（或核苷酸序列）的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
上述80％或80％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述85%以上的同一性可为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述90%以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。所述95%以上的同一性可为至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本申请还提供一种调控植物抗病性的方法，所述方法可包括通过调控受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或调控所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，来调控植物的抗病性。
进一步地，所述方法可包括通过下调或抑制受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或下调或抑制所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，来降低植物的抗病性，所述受体植物含有TaWRKY24蛋白的编码基因。
进一步地，所述的方法中，所述植物的抗病性可为植物的茎基腐病抗性。
进一步地，所述的方法中，所述植物的抗病性可为植物对假禾谷镰孢菌的抗性。
进一步地，所述方法包括下调或降低受体植物中所述TaWRKY24蛋白的表达或下调或降低所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，来降低受体植物小麦对茎基腐病抗性。
进一步地，所述的方法中，所述下调或降低受体植物中所述TaWRKY24蛋白的表达或下调或降低所述TaWRKY24蛋白的活性或含量可通过沉默受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码基因（TaWRKY24基因转录后）实现。
进一步地，所述的方法中，所述沉默受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码序列可通过病毒诱导的基因沉默实现。
进一步地，上述的方法中，所述病毒诱导的基因沉默包括将靶向靶标序列的重组病毒导入所述受体植物的步骤，所述靶标序列可为SEQ ID No. 2第184-483位。
进一步地，所述的方法中，所述植物可为单子叶植物。
进一步地，所述的方法中，所述单子叶植物可为禾本科植物。
进一步地，所述的方法中，所述禾本科植物可为小麦属植物。
进一步地，所述的方法中，所述小麦属植物可为小麦（Triticum aestivumL.）。
本申请还提供一种制备抗病性降低的小麦的方法，所述方法可包括通过下调受体小麦中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或下调所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，获得抗病性降低的目的小麦，所述受体小麦含有所述TaWRKY24蛋白的编码基因。
进一步地，所述方法中，所述下调受体小麦中所述TaWRKY24蛋白的表达或下调所述TaWRKY24蛋白的活性或含量可通过沉默受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码基因（TaWRKY24基因转录后）实现。
进一步地，所述方法中，所述病毒诱导的基因沉默包括将靶向靶标序列的重组病毒导入所述受体植物的步骤，所述靶标序列可为SEQ ID No. 2第184-483位。
进一步地，所述的方法中，所述抗病性可为小麦的茎基腐病抗性和/或小麦对假禾谷镰孢菌的抗性。
在本申请的一些实施方式中所述TaWRKY24蛋白的编码基因可为如下g1）或g2）所述的DNA分子：
g1）、编码链的编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
g2）、与g1）所述DNA分子具有80%以上的同一性，且调控植物抗病性的DNA分子。在本申请的一些实施方式中，所述病毒诱导的基因沉默包括将所述沉默载体BSMV：α、BSMV：β和BSMVγ-TaWRKY24体外转录获得可沉默TaWRKY24基因的重组BSMV，并将所述重组BSMV导入受体小麦。
在本申请的一些实施方式中，所述病毒诱导的基因沉默包括将所述沉默载体BSMV：α、BSMV：β和BSMVγ-TaWRKY24分别体外转录获得转录产物，将转录产物混合获得混合液并将所述混合液通过摩擦接触的方式导入受体小麦。
在本申请的一些实施方式中，通过下调或降低小麦中TaWRKY24基因的表达，从而降低了小麦的小麦对茎基腐病抗性。证明了TaWRKY24基因或其编码的TaWRKY24蛋白在小麦对茎基腐病抗性调控中的作用。
本申请获得的抗病性降低的目的小麦可用于药物筛选、例如筛选防治茎基腐病的药物。
本申请获得的抗病性降低的目的小麦也可用于致病机理研究，例如研究茎基腐病的发病机理、假禾谷镰孢菌的侵染机理。
具体地，在本申请的一些实施方式中，所述受体小麦可为普冰资300。
本申请中，所述小麦茎基腐病可为假禾谷镰孢菌所引起的真菌病害。
本申请中所述的抗病性或小麦对茎基腐病抗性可为抗假禾谷镰孢菌引起的病害。
在本申请的一些实施方式中，小麦对茎基腐病抗性实验中所述的假禾谷镰孢菌具体可为假禾谷镰孢菌CS3096。
本申请中，所述抗病性的评价指标包括：
（1）受试小麦的小麦茎基腐病的病情指数；
（2）受试小麦中的脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）毒素含量。
与现有技术相比，本申请具有以下有益技术效果：
本申请挖掘了在假禾谷镰孢菌侵染条件下能够调控植物抗病性的目的基因及其编码蛋白质，对于培育植物的抗病新品种、提高植物的抗病性具有重要的意义和应用价值。
本申请通过基因沉默验证了TaWRKY24基因及其编码蛋白质在调控植物抗病性中的用途。
附图说明
图1为TaWRKY24在BSMV:γ和BSMV:TaWRKY24沉默的小麦植株中的转录水平。
图2为受试小麦接种假禾谷镰孢菌14 天时的抗病情况。A为受试小麦接种假禾谷镰孢菌14 天时叶片外观，B为受试小麦接种假禾谷镰孢菌14 天时茎基部的病害表型。
图3为受试小麦对假禾谷镰孢菌的抗性。A为受试小麦在接种假禾谷镰孢菌后TaWRKY24基因的相对表达量，柱形图从左至右分别为受试小麦（BSMV:γ小麦或BSMV:TaWRKY24小麦）在接种假禾谷镰孢菌后0、12、24、48和72小时TaWRKY24基因的相对表达量；B为BSMV:γ组小麦和BSMV:TaWRKY24组小麦的病情指数统计结果；C为BSMV:γ组小麦和BSMV:TaWRKY24组小麦的脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的产量分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本申请，而不是为了限制本申请的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本申请的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
下述实施例中的小麦品种普冰资300由中国农业科学院作物科学研究所育成（https://baike.baidu.com/item/%E6%99%AE%E5%86%B0%E8%B5%84300/62934276）。公众可从申请人处申请获得上述生物材料，所得生物材料只为重复本申请的实验所用，不可作为其它用途使用。
BSMV-VIGS基因沉默载体为BSMV:α、BSMV:β、BSMV:γ（BSMV：GFP）由中国农业科学院作物科学研究所张增艳课题组惠赠，在文献“The somatic embryogenesis receptorkinase TaSERK1 participates in the immune response to Rhizoctonia cerealisinfection by interacting and phosphorylating the receptor-like cytoplasmickinase TaRLCK1B in wheat”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本申请的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的假禾谷镰孢菌（拉丁学名：Fusarium pseudograminearum，简称Fp菌株）CS3096，由四川农业大学小麦研究所蒋云峰老师惠赠，在文献“Jiang Y, Habib A ,et al.Development of tightly linked markers and identification of candidategenes for Fusarium crown rot resistance in barley by exploiting a near-isogenic line-derived population. Theor Appl Genet. 2019 Jan;132（1）:217-225.doi: 10.1007/s00122-018-3209-0. Epub 2018 Oct 16. PMID: 30327844.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本申请的实验所用，不可作为其它用途使用。
pEASY-Blunt平末端克隆载体为TransGen Biotech产品，货号为CB101-01。Trans1-T1大肠杆菌感受态为TransGen Biotech产品，货号为CD501-02）。
下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05（*）表示具有显著性差异，P＜0.01（**）。
实施例1、TaWRKY24蛋白及其编码基因的获得
普通小麦普冰资300的cDNA的获得：正常条件下生长7d左右的小麦幼苗，取叶片用液氮速冻，-80℃保存备用。采用植物总RNA快速提取试剂盒（ZOMANBIO，ZP405-1）提取小麦叶片总RNA，用试剂盒（全式金，AT311-02）一步去除gDNA、合成cDNA。
特异性扩增引物的获得：以Ensembl网站（https://asia.ensembl.org/index.html）公布的中国春TaWRKY24基因序列（Gene ID：TraesCS1D02G122400）为参考，使用SGN VIGS Tool网站（https://vigs.solgenomics.net/）设计最优沉默片段，通过软件Primer Premier 5设计引物，并用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和WheatOmics网站验证引物的特异性。
以普通小麦普冰资300的cDNA为模板、使用特异性扩增引物进行基因克隆，再将克隆片段连接到中间克隆载体pEASYBlunt上，并通过测序验证TaWRKY24基因序列。TaWRKY24基因的编码序列是SEQ ID No.2，其编码的TaWRKY24蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.1。
实施例2、VIGS沉默TaWRKY24小麦的获得
一、重组VIGS载体的构建
1、扩增沉默片段
以小麦普冰资300的cDNA作为模板，在TaWRKY24基因最优沉默片段两端设计特异性的引物对该基因进行扩增，并回收PCR产物。TaWRKY24基因最优沉默片段为核苷酸序列是SEQ ID No.2第184-483位的DNA。扩增引物为BSMV-TaWRKY24-F（核苷酸序列是SEQ IDNo.3）和BSMV-TaWRKY24-F（核苷酸序列是SEQ ID No.4）。
将上述扩增并回收的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接（全式金，北京），并转化大肠杆菌感受态细胞，并涂于含有50 μg/L卡那霉素的固体LB培养基平板上，37℃过夜培养。对大肠杆菌的克隆菌落进行菌液PCR检测，将阳性的克隆送入公司进行测序，将测序正确的菌液进行保存，并得到pEASY-Blunt-TaWRKY24质粒。
2、以步骤1得到的pEASY-Blunt-TaWRKY24质粒为模板，采用γ-TaWRKY24-F（核苷酸序列是SEQ ID No.5）和γ-TaWRKY24-R（核苷酸序列是SEQ ID No.6）组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。
3、用限制性内切酶NheⅠ酶切载体BSMV:γ（BSMV:GFP），回收载体骨架。
4、将步骤2的PCR产物和步骤3的载体骨架利用Takara公司的In-Fusion技术进行连接，得到重组质粒BSMVγ-TaWRKY24。根据测序结果，对重组质粒BSMVγ-TaWRKY24进行结构描述如下：在载体BSMV:γ（BSMV:GFP）的NheⅠ酶切位点反向插入了SEQ ID No.2第184-483位所示的DNA分子。
二、TaWRKY24沉默小麦的获得
1、VIGS各载体线性化：
用限制性内切酶MluⅠ酶切载体BSMV:α，回收载体骨架。
用限制性内切酶SpeⅠ酶切载体BSMV:β，回收载体骨架。
用限制性内切酶NheⅠ酶切载体BSMV:γ（BSMV:GFP），回收载体骨架。
用限制性内切酶MluⅠ酶切载体BSMVγ-TaWRKY24，回收载体骨架。
2、体外转录产物制备
完成步骤1后，按照Promega公司的RiboMAX™ Large Scale RNA ProductionSystems-T7试剂盒的操作说明将回收的各载体进行体外转录。获得体外转录的产物BSMVα、BSMVβ、BSMVγ和BSMVγ-TaWRKY24。
3、实验分组及摩擦液制备
根据实验目的进行分为三组：完全空白对照组、病毒空白对照组（BSMV:γ）、基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）。其中基因沉默组摩擦液的制备如下：取体外转录的产物BSMVα、BSMVβ、BSMVγ-TaWRKY24各2.5 μL，按照1：1：1的比例进行均匀混合；用RNase-Free ddH2O等体积稀释，吸取5 μL稀释后的混合液，与90 μL FES摩擦缓冲液吸打混匀后获得的混合液即为基因沉默组摩擦液。
其余两组摩擦液参照基因沉默组摩擦液制备，其区别仅在于：完全空白对照组摩擦液将体外转录组产物替换为等体积的RNase-Free ddH2O，病毒空白对照组摩擦液将BSMVγ-TaWRKY24替换为BSMVγ。
其中，FES摩擦缓冲液的制备方法如下：
配制FES摩擦缓冲液（100 ml）：磷酸氢二钾5.226 g，甘氨酸3.754 g，焦磷酸钠1.0g，硅藻土1.0 g，斑脱土1.0 g，RNase-free ddH2O定容到100 ml，高温高压灭菌20 min。
4、病毒侵染
以小麦普冰资300作为待侵染小麦，在小麦三叶时期进行侵染。根据摩擦液的分组将待侵染小麦分为三组，每组设置小麦20株。
基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）小麦的侵染步骤为：在要侵染的小麦叶片表面先喷上少量RNase-Free ddH2O，取8-10 μL基因沉默组摩擦液点于干净手套上，对幼苗第二叶叶片进行3次摩擦，摩擦时控制好力度，摩擦完后从上往下喷少许RNase-Free ddH2O保持湿度，每个处理均需换干净手套操作。病毒接种完后置于23±2℃培养箱中保温保湿避光培养24 h，后调为16h/8h光暗周期培养，定期观察并记录表型变化。
其余两组小麦的侵染步骤参照基因沉默组，其区别仅在于：完全空白对照组用完全空白对照摩擦液进行侵染、病毒空白对照组（BSMV:γ）用病毒空白对照组摩擦液进行侵染。
5、TaWRKY24基因的相对表达量测定
完成步骤4后，待病毒空白对照组小麦叶片出现轻度褪绿花叶症状出现后，对小麦植株进行基因沉默效率测定。取完全空白对照组、病毒空白对照组（BSMV:γ）和基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）小麦的小麦叶片，提取小麦叶片总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，采用β-actin作为内参基因，检测TaWRKY24基因的相对表达量。用于检测TaWRKY24基因的引物为RT-TaWRKY24-F（核苷酸序列是SEQ ID No.7）和RT-TaWRKY24-R（核苷酸序列是SEQ ID No.8）。用于检测Actin基因的引物为RT-Actin-F（核苷酸序列是SEQ IDNo.9）和RT-Actin-R（核苷酸序列是SEQ ID No.10）。
结果如图1所示。通过qPCR检测TaWRKY24基因相对表达量。每个数据点为三次技术重复的平均值（±SD）。与病毒空白对照组小麦相比，基因沉默组小麦中TaWRKY24基因的转录水平显著降低，说明TaWRKY24成功沉默（BatchⅠ和BatchⅡ为两个独立批次）。
实施例3、小麦对假禾谷镰孢菌的敏感性分析
1、病原菌制备
将假禾谷镰孢菌CS3096菌种接种到PDA固体培养基上培养，待长成2-4 cm环状菌落时从菌落边缘挑取健康旺盛带菌丝的菌块，接入灭菌的小米中于25℃的温度培养7天，每天摇晃2次使病原菌分布均匀，带菌丝布满小米表面即可用于受试小麦的病原菌接种。
2、小麦植株接种假禾谷镰孢菌
根据受试小麦的不同试验分为两组进行，分别为病毒空白对照组（BSMV:γ）和基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）。其中基因沉默组的处理步骤如下：以实施例2中基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）侵染获得的小麦为受试小麦，在种植小麦的7 cm × 7 cm小方盒中接入0.4 g带菌小米，均匀铺满小盒，并确保每株麦苗基部有一粒小米菌，接种当天记为0天。培养条件为23±2℃培养箱中按照16h光照/8h黑暗周期培养，每3天浇水一次。
病毒空白对照组处理步骤参照基因沉默组，其区别仅在于：病毒空白对照组的受试小麦为实施例中病毒空白对照组侵染获得的小麦。
3、结果分析
（1）沉默效率的检测
在受试小麦接种假禾谷镰孢菌后在0、12、24、48和72小时取样进行组织学观察和RNA分离，参照实施例2中步骤5的方法采用实时逆转录PCR （qRT-PCR）测定TaWRKY24基因的相对表达量。结果表明：基因沉默组（BSMV:TaWRKY24）中重组BMSV病毒诱导的小麦叶片中TaWRKY24基因的相对表达量在接种假禾谷镰孢菌后在0、12、24、48和72小时减少了37%-72%（图3中A）。
（2）病菌侵染状况
在接种假禾谷镰孢菌14 天时拍摄受试小麦的感染状况并统计病情指数；同时在接种假禾谷镰孢菌25天时对茎基部进行采样用于脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的产量分析。
病情指数按照发病程度进行统计。其中0级为外层叶鞘无明显症状、1级为第一叶鞘褐枯小于叶鞘1/4长度以下、2级为第一叶鞘褐枯占叶鞘长度叶鞘1/4-1/2、3级为第一叶鞘褐枯占叶鞘长度1/2-3/4、4级为第一叶鞘完全脱落腐烂，第二叶鞘有明显褐枯、5级为第三叶鞘有明显褐枯或全株枯死。
病情指数（DI disease index）=100 ×（∑调查单株数×各株代表值）/（调查总株数×最高级代表值）。
受试小麦接种假禾谷镰孢菌14天时的感染状况如图2所示，图2中A表明接种BSMV或重组BMSV病毒后，小麦叶片出现轻度褪绿花叶症状。图2中B为假禾谷镰孢菌侵染茎部的病害表型，相比于BSMV:γ组的小麦，BSMV:TaWRKY24组的小麦病斑面积更大，感染症状更明显。病情指数的统计结果如图3中B所示，结果表明相比于BSMV:γ组小麦，BSMV:TaWRKY24组小麦的病情指数显著提高。以上结果表明沉默TaWRKY24基因的小麦植株对茎基腐病的抗性更低。TaWRKY24基因及其编码的TaWRKY24蛋白可调控受体对小麦茎基腐病或假禾谷镰孢菌的抗性，即TaWRKY24基因的表达量降低（或TaWRKY24蛋白的含量降低），受体小麦对小麦茎基腐病或假禾谷镰孢菌的抗性降低。
脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的产量分析的方法如下：使用DON定量试剂盒Wis008（Wise Science, Zhenjiang, China）进行定量分析。在假禾谷镰孢菌侵染小麦第25天（25dpi），收集感染的小麦茎基部组织，迅速冷冻于液氮中，并储存在-80°C。随后，在液氮环境下将冷冻样品研磨成细粉末，每个样品称取1 g重新悬浮于2 mL水中，并通过涡流搅拌器彻底混合30秒。然后将混合物在30°C水浴中孵育30分钟。通过离心除去所有固体，使用DON定量试剂盒分析上清液的DON含量。脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的产量分析结果见图3中C，结果表明：相比于BSMV:γ组小麦，BSMV:TaWRKY24组小麦植株茎基部真菌毒素DON含量显著提高。
上述结果表明TaWRKY24基因的沉默可以减弱小麦对假禾谷镰孢菌的抗性。即TaWRKY24基因及其编码的蛋白质正调控小麦对假禾谷镰孢菌的抗性。
以上对本申请进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本申请。虽然本申请给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本申请作进一步的改进。总之，按本申请的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本申请的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.生物材料的应用，其特征在于：所述生物材料为蛋白质或调控蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质，所述蛋白质为TaWRKY24蛋白，所述应用为下述任一项：
A1）、所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；
A2）、所述生物材料在制备调控植物抗病性的产品中的应用；
A3）、所述生物材料在调控植物对茎基腐病抗性中的应用；
A4）、所述生物材料在制备调控植物对茎基腐病抗性的产品中的应用；
A5）、所述生物材料在调控植物对假禾谷镰孢菌抗性中的应用；
A6）、所述生物材料在制备调控植物对假禾谷镰孢菌抗性的产品中的应用；
A7）、所述生物材料在植物育种或辅助植物育种中应用；
所述TaWRKY24蛋白是下述任一种蛋白质：
a1）、氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；
a2）、将a1）所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且与植物抗逆性相关的蛋白质；
a3）、在a1）或a2）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生物材料为下述任一种：
B1）、抑制或降低权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的含量或活性的核酸分子；
B2）、含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）、含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）、含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织或含有B3）所述重组载体的转基因植物组织；
B7）、含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官或含有B3）所述重组载体的转基因植物器官；
B8）、编码权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的核酸分子；
B9）、含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为靶向权利要求1中所述的TaWRKY24蛋白的编码基因的RNA或编码所述RNA的DNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述RNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQID No.2的第184-483位。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B8）所述核酸分子为如下g1）或g2）所述的DNA分子：
g1）、编码链的编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
g2）、与g1）所述DNA分子具有80%以上的同一性，且调控植物抗病性的DNA分子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物。
7.一种调控植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括通过调控受体植物的权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或调控所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，来调控植物的抗病性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括通过下调或抑制受体植物的权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或下调或抑制所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，来降低植物的抗病性，所述受体植物含有所述TaWRKY24蛋白的编码基因。
9.一种制备茎基腐病抗性降低的小麦的方法，其特征在于：所述方法包括通过下调受体小麦中权利要求1中所述TaWRKY24蛋白的编码基因的表达或下调所述TaWRKY24蛋白的活性或含量，获得茎基腐病抗性降低的目的小麦，所述受体小麦含有所述TaWRKY24蛋白的编码基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述下调受体小麦中所述TaWRKY24蛋白的表达或下调所述TaWRKY24蛋白的活性或含量通过沉默受体植物中所述TaWRKY24蛋白的编码基因实现。
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