BR112020018644A2 - Uso de fatores morfogênicos para o aprimoramento de edição de genes - Google Patents

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Keith S. Lowe
David J. Peterson
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Abstract

são fornecidos métodos e composições para o aprimoramento da atividade de agente indutor de quebra de fita dupla em células eucarióticas, através do uso de um ou mais fatores morfogênicos ou genes de desenvolvimento. o fator morfogênico pode ser fornecido para a mesma célula ou para uma célula diferente daquela que compreende ou recebe o agente indutor de quebra de fita dupla. o fator morfogênico pode ser fornecido para uma célula como uma composição de polinucleotídeo em um vetor recombinante, e pode ser colocado no vetor fora de uma borda de t-dna. o fator morfogênico pode ser fornecido por meio de uma regulação crescente de um gene endógeno. o fator morfogênico, ou o agente indutor de quebra de fita dupla, pode compreender adicionalmente um peptídeo de penetração celular. o fator morfogênico pode ser cointroduzido com um vetor que compreende repa.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "USO DE
FATORES MORFOGÊNICOS PARA O APRIMORAMENTO DE EDIÇÃO DE GENES" REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório nº de série U.S. 62/641.733, depositado em 12 de março de 2018 e do pedido de patente provisório nº de série U.S. 62/641.725, depositado em 12 de março de 2018, cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo chamado 7495WOPCT_SequenceListing_ST25.txt criado em 05 de março de 2019 e que tem um tamanho de 276.803 bytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências compreendida neste documento em formato ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente revelação se refere geralmente ao campo de biologia molecular de plantas, especificamente à modificação alvejada de polinucleotídeos em plantas.
ANTECEDENTES
[0004] Os métodos padrão para modificação de genoma de um organismo têm múltiplas etapas e podem limitar a velocidade e eficiência, e causar um impacto negativo nas linhas de tempo de desenvolvimento de produtos. Em plantas, existem as limitações de estação de crescimento que podem atrasar adicionalmente a criação e o teste de plantas que compreendem polinucleotídeos modificados. Por exemplo, muitos métodos de transformação e regeneração padrão exigem o uso de altos níveis de auxina ou citoquinina e exigem etapas que envolvem formação de calo embriogênica ou organogênese, levando a procedimentos que podem levar semanas antes de produzir plantas para crescimento em uma definição de estufa seguindo a transformação.
[0005] Atualmente, os protocolos de modificação de genoma e transformação genética de plantas exigem a entrega de vários vetores de DNA que codificam componentes diferentes, incluindo, por exemplo, reagentes de quebra de fita dupla (nuclease Cas9 e RNA guia (gRNA)), um marcador selecionável, fatores morfogênicos (por exemplo, ODP2, BBM e WUS) e DNA doador (no caso de uma inserção de polinucleotídeo ou uma troca).
[0006] Múltiplas moléculas de DNA codistribuídas tendem a se cointegrar em um sítio de DSB através de uma via de reparo de junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que reduz significativamente a eficiência da edição de genoma baseada em reparo dirigido por homologia (HDR). A modificação de protocolos para a entrega de alguns componentes, tal como um fator morfogênico, e a minimização da entrega de DNA podem ser benéficas e levar a frequências mais altas de eventos HDR de qualidade.
[0007] Ainda há uma necessidade de um sistema mais rápido e mais eficiente para produzir organismos que compreendem modificações de polinucleotídeo desejadas de forma rápida e eficiente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos e composições para editar um polinucleotídeo no genoma de uma célula, por meio da introdução de um agente indutor de quebra de fita dupla e um fator morfogênico.
[0009] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido para a mesma célula que a recebe ou que compreende o agente indutor de quebra de fita dupla. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido para uma célula diferente da célula que recebe ou que compreende o agente indutor de quebra de fita dupla. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido no mesmo construto que aquele que compreende um agente indutor de quebra de fita dupla. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido em um construto diferente daquele que compreende um agente indutor de quebra de fita dupla. Em alguns aspectos, é fornecido um construto que compreende um polinucleotídeo heterólogo para introdução em uma célula alvo, em que o dito construto pode compreender adicionalmente um fator morfogênico, um agente indutor de quebra de fita dupla, ou ambos.
[0010] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido no mesmo vetor de DNA recombinante como um polinucleotídeo heterólogo, em que o fator morfogênico se situa fora das bordas de TDNA do vetor.
[0011] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é endógeno à célula que recebe ou que compreende o agente indutor de quebra de fita dupla, e a expressão ou atividade do fator morfogênico endógeno é alterada. Em alguns aspectos, a alteração é a regulação crescente. Em alguns aspectos, a alteração é a regulação decrescente.
[0012] Em alguns aspectos, um peptídeo de penetração celular é ligado ao fator morfogênico, permitindo seu movimento entre as células.
[0013] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é cointroduzido com RepA.
[0014] Em alguns aspectos, a combinações de outros aspectos são utilizadas para aprimorar a modificação de polinucleotídeo. Por exemplo, em uma modalidade não limitante, um peptídeo de penetração celular é ligado a um fator morfogênico que é fornecido para uma célula adjacente àquela que recebe ou que compreende o agente indutor de quebra de fita dupla. Por exemplo, em uma modalidade não limitante, um fator morfogênico endógeno é crescentemente regulado em uma célula adjacente à que recebe ou que compreende o agente indutor de quebra de fita dupla. Qualquer combinação de qualquer aspecto descrito no presente documento pode ser utilizada para aprimorar a modificação de polinucleotídeo por meio de um agente indutor de quebra de fita dupla fornecido para uma célula.
[0015] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido como uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo. Em alguns aspectos, o fator morfogênico compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, ou mais de 99,5% de identidade com uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs: 6-10, 17-21 e 48-73. Em alguns aspectos, o fator morfogênico compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, ou mais de 99,5% de identidade com uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs: 1-5, 11-16, 22 e 23-
47. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: Wuschel, Proteína de Desenvolvimento de Óvulo e Babyboom. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5, WOX9, BBM2, BMN2, BMN3 e ODP2.
[0016] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.
[0017] Em qualquer aspecto, a edição de um polinucleotídeo pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em: inserção de pelo menos um polinucleotídeo, deleção de pelo menos um polinucleotídeo, modificação de pelo menos um polinucleotídeo, substituição de pelo menos um polinucleotídeo, e uma combinação de pelo menos dois dos anteriores.
[0018] Em alguns aspectos, o agente indutor de quebra de fita dupla compreende uma endonuclease Cas, uma TALEN, uma endonuclease de dedo de zinco, uma meganuclease ou uma endonuclease de restrição.
[0019] Em alguns aspectos, a endonuclease Cas tem uma ou mais mutações, que eliminam a atividade de quebra de fita dupla e/ou atividade de incisão de fita simples.
[0020] Em alguns aspectos, o agente indutor de quebra de fita dupla é fornecido como um complexo de ribonucleoproteína que compreende uma proteína endonuclease Cas e um RNA guia.
[0021] Em alguns aspectos, o método ou composição pode compreender adicionalmente uma molécula de DNA doador de polinucleotídeo heterólogo introduzida na dita célula alvo.
[0022] Em alguns aspectos, a modificação de um polinucleotídeo confere um benefício a um organismo que compreende ou é derivado da dita célula alvo. Em alguns aspectos, o dito benefício é selecionado dentre o grupo que consiste em: saúde aprimorada, crescimento aprimorado, fertilidade aprimorada, fecundidade aprimorada, tolerância ambiental aprimorada, vigor aprimorado, resistência a doenças aprimorada, tolerância a doenças aprimorada, tolerância aprimorada a uma molécula heteróloga, condição física aprimorada, característica física aprimorada, massa maior,
produção aumentada de uma molécula bioquímica, produção diminuída de uma molécula bioquímica, regulação crescente de um gene, regulação decrescente de um gene, regulação crescente de uma via bioquímica, regulação decrescente de uma via bioquímica, estimulação de reprodução celular e supressão de reprodução celular.
[0023] Em alguns aspectos, a célula é uma célula eucariótica. Em alguns aspectos, a célula é uma célula vegetal. Em alguns aspectos, a célula vegetal. Em alguns aspectos, a célula vegetal é obtida a partir de ou derivada de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea . Em alguns aspectos, a célula vegetal é obtida a partir de ou derivada de uma monocotiledônea selecionada dentre o grupo que consiste em: Zea mays, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Triticum aestivum, Medicago sativa, Oryza sativa, Setaria italica e Saccharum spp. Em alguns aspectos, a célula vegetal é obtida a partir de ou derivada de uma dicotiledônea selecionada dentre o grupo que consiste em: Helianthus annuus, Glycine max, Nicotiana tabacum, Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Manihot esculenta, Beta vulgaris, Brassica spp. e Arabidposis thaliana.
[0024] Em alguns aspectos, a edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula vegetal através de qualquer uma das composições ou métodos descritos no presente documento resulta na modulação de um traço de importância agronômica em uma planta, selecionado dentre o grupo que consiste em: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aprimoramento de rendimento, melhoria da saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento,
aprimoramento da capacidade fotossintética, melhoria nutricional, composição de proteína alterada, composição de óleo alterada, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, composição de proteína de semente alterada e composição de nutriente de semente alterada; em comparação com uma planta de isolinhagem que não compreende ou é derivada de uma célula cujo genoma foi editado com o dito agente indutor de quebra de fita dupla.
[0025] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos e composições para editar um polinucleotídeo no genoma de uma célula, por meio da introdução de um agente indutor de quebra de fita dupla e um fator morfogênico, em que a dita célula não tem o fator morfogênico integrado de modo estável em seu genoma.
[0026] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos e composições para editar um polinucleotídeo no genoma de uma célula, por meio da introdução de um agente indutor de quebra de fita dupla e um fator morfogênico, em que o fator morfogênico é cointroduzido com REPA.
[0027] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos e composições para editar um polinucleotídeo no genoma de uma célula, por meio da introdução de um agente indutor de quebra de fita dupla e um fator morfogênico, em que o fator morfogênico é cointroduzido com um polinucleotídeo que codifica a molécula Cas9 desativada fundida a um repressor, em que o dito polinucleotídeo se situa fora das bordas de T-DNA.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0028] A revelação pode ser mais completamente entendida a partir da seguinte descrição detalhada e dos desenhos anexos e da Listagem de Sequências, que formam uma parte deste pedido. As descrições de sequência e a listagem de sequências anexada aqui estão em conformidade com as regras que regem as revelações de sequência de nucleotídeos e aminoácidos nos pedidos de patente apresentados no título 37 C.F.R. §§1.821 e 1.825. As descrições de sequência compreendem os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido no título 37 C.F.R. §§ 1.821 e 1.825, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência.
[0029] A Figura 1A representa um vetor de DNA que codifica WUS (polinucleotídeo SEQID NO: 23 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:48) operacionalmente ligado a um promotor PLTP (SEQID NO:74).
[0030] A Figura 1B representa uma proteína Cas9 de S. pyogenes otimizada para maís (polinucleotídeo SEQID NOs: 103-104 que codifica o polipeptídeo SEQID NOs: 108-109) e um gRNA adequado (SEQID NO: 82).
[0031] A Figura 1C representa um vetor de DNA que compreende um gene marcador selecionável (NPTII, polinucleotídeo SEQID NO: 77 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:100) flanqueado com braços de homologia (SEQID NOs: 78 e 79) como o DNA doador.
[0032] A Figura 2A representa a localização geral dos guias projetados (UTRs e estruturas de éxon/íntron com base na versão B73 de maís do gene), com o uso de sequências contig. genômicas de maís Variedade 1.
[0033] A Figura 2B representa o mapa de um vetor dCas9- GRA-CBF1A.
[0034] A Figura 2C mostra a acentuação de transformação em embriões bombardeados com os RNAs guia de sentido.
[0035] A Figura 2D mostra as plantas após 5 a 7 semanas de crescimento.
[0036] A Figura 2E mostra as diferenças de sequência de proteínas entre o WUS2 de um vetor recombinante (polinucleotídeo SEQID NOs: 73 (éxon 1) e 24 (éxon 2) que codifica o polipeptídeo SEQID NO:49), a partir de uma planta de maís B73 nativa (polinucleotídeo SEQID NO:25 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:50), e a partir de uma planta de maís nativa Variedade 1 (polinucleotídeo SEQID NO:26 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:51). A sequência de consenso é fornecida como SEQID NO:106.
[0037] A Figura 3 representa um exemplo de um vetor recombinante que compreende os polinucleotídeos de fator morfogênico fora da borda esquerda.
[0038] A Tabela 1 representa algumas das composições úteis para os métodos descritos no presente documento, fornecidas como SEQID NOs: 1-110. Tabela 1: Descrições de Sequências
SEQID NO Descrição Tipo Gênero Espécies 1 sequência de codificação BBM2 de Z. mays DNA Zea mays 2 sequência de codificação BBM1 de Oryza sativa DNA Oryza sativa 3 sequência de codificação BBM2 de Oryza sativa DNA Oryza sativa 4 sequência de codificação BBM3 de Oryza sativa DNA Oryza sativa sequência de codificação BBM2 de Sorghum 5 bicolor DNA Sorghum bicolor 6 sequência de proteína BBM2 de Z. mays PRT Zea mays 7 sequência de proteína BBM1 de Oryza sativa PRT Oryza sativa 8 sequência de proteína BBM2 de Oryza sativa PRT Oryza sativa
9 sequência de proteína BBM3 de Oryza sativa PRT Oryza sativa 10 sequência de proteína BBM2 de Sorghum bicolor PRT Sorghum bicolor 11 sequência de codificação ODP2 de Z. mays DNA Zea mays sequência de codificação (sintética) ODP2 de Z. 12 mays DNA Zea mays sequência de codificação ODP2 de Sorghum 13 bicolor DNA Sorghum bicolor 14 sequência de codificação ODP2 de Setaria italica DNA Setaria italica sequência de codificação ODP2 de 15 Brachypodium distachyum DNA Brachypodium distachyum 16 sequência genômica ODP2 de Sorghum bicolor DNA Sorghum bicolor 17 ODP2 (ALT3) PRT Zea mays 18 sequência de proteína ODP2 de Z. mays PRT Zea mays 19 sequência de proteína ODP2 de Sorghum bicolor PRT Sorghum bicolor 20 sequência de proteína ODP2 de Setaria italica PRT Setaria italica sequência de proteína ODP2 de Brachypodium 21 distachyum PRT Brachypodium distachyum 22 odp2 (ALT3) DNA Zea mays 23 wus DNA Zea mays 24 Vetor artificial wus2 éxon 2 DNA Zea mays 25 wus2 B73 DNA Zea mays 26 wus2 Variedade 1 DNA Zea mays 27 wus2 (ALT1) DNA Zea mays sequência de codificação WUS de Arabidopsis 28 thaliana DNA Arabidopsis thaliana sequência de codificação WUS de Lotus 29 japonicus DNA Lotus japonicus 30 sequência de codificação WUS de Glycine max DNA Glycine max sequência de codificação WUS de Camelina 31 sativa DNA Camelina sativa sequência de codificação WUS de Capsella 32 rubella DNA Capsella rubella 33 sequência de codificação WUS de Arabis alpina DNA Arabis alpina sequência de codificação WUS de Raphanus 34 sativus DNA Raphanus sativus sequência de codificação WUS de Brassica 35 napus DNA Brassica napus sequência de codificação WUS de Brassica 36 oleracea var. oleracea DNA Brassica oleracea sequência de codificação WUS de Helianthus 37 annuus DNA Helianthus annuus sequência de codificação WUS de Populus 38 trichocarpa DNA Populus trichocarpa 39 sequência de codificação WUS de Vitus vinifera DNA Vitus vinifera sequência de codificação WUS de Arabidopsis 40 thaliana (otimizada para soja) DNA Arabidopsis thaliana sequência de codificação WUS de Lotus 41 japonicus (otimizada para soja) DNA Lotus japonicus sequência de codificação WUS de Medicago 42 trunculata (otimizada para soja) DNA Medicago trunculata sequência de codificação WUS de Petunia 43 hybrida (otimizada para soja) DNA Petunia hybrida sequência de codificação WUS de Phaseolus 44 vulgaris (otimizada para soja) DNA Phaseolus vulgaris sequência de codificação WUS1 de 3-ZM-WUS1- 45 Z. mays DNA Zea mays sequência de codificação WUS2 de 5-ZM-WUS2- 46 Z. mays DNA Zea mays sequência de codificação WUS3 de 7-ZM-WUS3- 47 Z. mays DNA Zea mays 48 WUS PRT Zea mays 49 Vetor artificial WUS PRT Zea mays 50 WUS2 B73 PRT Zea mays 51 WUS2 Variedade 1 PRT Zea mays 52 WUS2 (ALT1) PRT Zea mays sequência de proteínas WUS de Arabidopsis 53 thaliana PRT Arabidopsis thaliana
54 sequência de proteínas WUS de Lotus japonicus PRT Lotus japonicus 55 sequência de proteínas WUS de Glycine max PRT Glycine max 56 sequência de proteínas WUS de Camelina sativa PRT Camelina sativa 57 sequência de proteínas WUS de Capsella rubella PRT Capsella rubella 58 sequência de proteínas WUS de Arabis alpina PRT Arabis alpina sequência de proteínas WUS de Raphanus 59 sativus PRT Raphanus sativus 60 sequência de proteínas WUS de Brassica napus PRT Brassica napus sequência de proteínas WUS de Brassica 61 oleracea var. oleracea PRT Brassica oleracea sequência de proteínas WUS de Helianthus 62 annuus PRT Helianthus annuus sequência de proteínas WUS de Populus 63 trichocarpa PRT Populus trichocarpa 64 sequência de proteínas WUS de Vitus vinifera PRT Vitus vinifera sequência de proteínas WUS de Arabidopsis 65 thaliana PRT Arabidopsis thaliana 66 sequência de proteínas WUS de Lotus japonicus PRT Lotus japonicus sequência de proteínas WUS de Medicago 67 trunculata PRT Medicago trunculata 68 sequência de proteínas WUS de Petunia hybrida PRT Petunia hybrida sequência de proteínas WUS de Phaseolus 69 vulgaris PRT Phaseolus vulgaris sequências de proteínas WUS1 de 4-ZM-WUS1- 70 Z. mays PRT Zea mays sequências de proteínas WUS2 de 6-ZM-WUS2- 71 Z. mays PRT Zea mays sequências de proteínas WUS3 de 8-ZM-WUS3- 72 Z. mays PRT Zea mays 73 vetor artificial wus2 éxon 1 DNA Zea mays 74 promotor PLTP DNA Zea mays 75 promotor UBI DNA Zea mays 76 LS1 de batata íntron 2 DNA Solanum tuberosum
GOI de DNA doador (marcador selecionável 77 NPTII) DNA Escherichia coli 78 braço de homologia 1 de DNA doador DNA Artificial 79 braço de homologia 2 de DNA doador DNA Artificial 80 gRNA (sítio de deleção de gene 1) DNA Artificial 81 gRNA (sítio de deleção de gene 2) DNA Artificial gRNA (Exemplo 3 inserção de gene sítio- 82 específica) DNA Artificial 83 At-cbf1a DNA Arabidopsis thaliana 84 promotor polIII DNA Zea mays 85 gRNA DNA Artificial 86 gRNA C5 (Exemplo 4) DNA Artificial 87 gRNA C3 (Exemplo 4) DNA Artificial 88 gRNA C9 (Exemplo 4) DNA Artificial 89 gRNA A9 (Exemplo 4) DNA Artificial 90 gRNA A4 (Exemplo 4) DNA Artificial 91 promotor PLTP DNA Zea mays 92 PLTP 5'UTR DNA Zea mays 93 Promotor UBI3 DNA Setarica italica 94 UBI3 íntron 1 DNA Setarica italica 95 terminador PINII DNA Solanum tuberosum 96 promotor ALS DNA Sorghum bicolor 97 ALS (HRA) DNA Zea mays 98 terminador PEPC1 DNA Sorghum bicolor 99 terminador T28 DNA Oryza sativa 100 marcador selecionável NPTII PRT Escherichia coli 101 At-CBF1A PRT Arabidopsis thaliana Cas9 (com íntron ST-L1S, SV40 NLS, VIRD2 102 NLS) DNA Streptococcus pyogenes 103 Cas9 éxon 1 DNA Streptococcus pyogenes 104 Cas9 éxon 2 DNA Streptococcus pyogenes 105 cas9 (D10A + H840A) DNA Streptococcus pyogenes Sequência consenso para WUS (n=qualquer ou 106 nenhum aminoácido) – Figura 2E PRT Artificial
107 Cas9 PRT Streptococcus pyogenes 108 Cas9 éxon 1 PRT Streptococcus pyogenes 109 Cas9 éxon 2 PRT Streptococcus pyogenes 110 dCas9 (D10A + H840A) PRT Streptococcus pyogenes
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0039] Várias composições e métodos para modificar um sítio de polinucleotídeo alvo em uma célula, por exemplo uma célula vegetal, são fornecidos. A modificação pode incluir uma inserção, deleção, mutação, substituição ou alteração molecular de uma sequência de nucleotídeos. O sítio alvo é modificado através da atividade de um agente indutor de quebra de fita dupla que reconhece uma sequência de reconhecimento dentro do sítio alvo.
[0040] As quebras de fita dupla induzidas por agentes indutores de fita dupla podem resultar na indução de mecanismos de reparo de DNA, incluindo a via de junção de extremidade não homóloga e a recombinação homóloga. Mecanismos de reparo de DNA propensos a erro podem produzir mutações em sítios de quebra de fita dupla. As vias de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) são o mecanismo de reparo mais comum que serve para unir as extremidades de polinucleotídeo quebradas (Bleuyard et al. (2006) DNA Repair 5:1-12). A integridade estrutural dos cromossomos é tipicamente preservada pelo reparo, porém deleções, inserções e outras reorganizações são possíveis. As duas extremidades de uma quebra de fita dupla são os substratos mais prevalentes de NHEJ (Kirik et al. (2000) EMBO J 19:5562-6). Se duas quebras de fita dupla diferentes ocorrerem, entretanto, as extremidades livres de quebras diferentes podem ser ligadas entre si, resultando em deleções cromossômicas (Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31), ou translocações cromossômicas entre cromossomos diferentes (Pacher et al. (2007) Genetics 175:21-9).
[0041] As moléculas de DNA epissomal, por exemplo T- DNAs, também podem ser ligadas à quebra de fita dupla, resultando em integração da molécula de DNA epissomal ao genoma hospedeiro (Chilton and Que (2003) Plant Physiol 133:956-65; Salomon and Puchta (1998) EMBO J 17:6086-95). Uma vez que a sequência ao redor das quebras de fita dupla é alterada, por exemplo, por atividades de exonuclease envolvidas na maturação de quebras de fita dupla, as vias de conversão de genes pode restaurar a estrutura original se uma sequência homóloga estiver disponível, tal como um cromossomo homólogo em células somáticas não divisoras, ou uma cromátide irmã após a replicação de DNA (fases S, G2, M de um ciclo celular) (Molinier et al. (2004) Plant Cell 16:342-52). As sequências de DNA heterólogas, ectópicas e/ou epigênicas também podem servir como um modelo de reparo de DNA para recombinação homóloga (Puchta (1999) Genetics 152:1173-81).
[0042] As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) parecem ser um fator eficaz para estimular as vias de recombinação homóloga em todos os organismos testados até a presente data (Puchta et al. (1995) Plant Mol Biol 28:281-92; Tzfira and White (2005) Trends Biotechnol 23:567-9; Puchta (2005) J Exp Bot 56:1-14). Por exemplo, com o uso de uma indução de quebra de DNA, um aumento de recombinação homóloga de duas a nove vezes foi observado entre as repetições de DNA homólogo artificialmente construídas em plantas (Puchta et al. (1995) Plant Mol Biol 28:281-92). Desse modo, os agentes indutores de quebra de fita dupla podem ser usados para modificação de polinucleotídeos alvejada em organismos e o fornecimento de uma ou mais proteínas morfogênicas acentua a frequência da modificação alvejada.
[0043] As proteínas morfogênicas podem acentuar a taxa de modificação alvejada de a sítio alvo em uma célula de um organismo, tal como uma planta, que foi induzida por um agente indutor de quebra de fita dupla. Em alguns métodos, pelo menos uma proteína morfonênica e um agente indutor de quebra de fita dupla são introduzidos em uma célula que tem um sítio alvo com pelo menos uma sequência de reconhecimento. O agente indutor de quebra de fita dupla reconhece a sequência de reconhecimento e introduz uma quebra de fita dupla na ou próximo à sequência de reconhecimento para produzir um sítio alvo modificado. As modificações no sítio alvo podem incluir uma deleção, mutação, substituição, modificação química ou molecular, recombinação homóloga, ou inserção de uma sequência de nucleotídeos. Em certas modalidades, o sítio alvo é estavelmente integrado ao genoma da planta. Em algumas dessas modalidades, o sítio alvo genômico é um sítio alvo genômico nativo. Esses métodos podem ser usados para estimular a recombinação em um sítio alvo, integrar polinucleotídeos em um sítio alvo, inverter ou excisar um polinucleotídeo, selecionar diretamente organismos transformados, minimizar ou eliminar a expressão resultante da integração aleatória no genoma de um organismo, combinar múltiplos cassetes de transferência, silenciar genes, e caracterizar regiões reguladoras transcricionais.
[0044] Os métodos revelados no presente documento envolvem o uso de um fator morfogênico, tal como babyboom (BBM)/proteína de desenvolvimento de óvulo (ODP) e/ou Wuschel (WUS), que serve para acentuar e promover a modificação de polinucleotídeo efetuada pelo agente indutor de quebra de fita dupla. O fator morfogênico pode ser fornecido para uma célula como uma proteína ou como um polinucleotídeo que codifica uma proteína. Em um aspecto, um fator morfogênico heterólogo é fornecido para a célula alvo. Em um aspecto, um fator morfogênico endógeno na célula alvo célula adjacente é ativado ou crescentemente regulado. Em um aspecto, um fator morfogênico é fornecido para uma célula adjacente em vez de para a célula alvo, de modo que a célula alvo se beneficie da presença do fator morfogênico na célula adjacente. Em um aspecto, o fator morfogênico é fornecido para a célula alvo como parte de um cassete de transformação, com o polinucleotídeo que codifica o fator morfogênico situado fora das bordas de transformação de modo que sua integração no genoma da célula alvo seja transiente.
[0045] Aqui, descreve-se abordagens diferentes para edição de genoma celular para alavancar os benefícios dos fatores morfogênicos, sem integrar estavelmente o fator morfogênico na célula alvo que recebe os componentes de agente de quebra de fita dupla para modificação de polinucleotídeo alvejada. Tais abordagens incluem: alavancar a expressão de um fator morfogênico endógeno na célula alvo ou célula adjacente, entrega de um fator morfogênico para uma célula diferente da célula alvo e/ou fornecer o fator morfogênico para a célula alvo como parte de um vetor recombinante, em que o dito fator morfogênico se situa fora das bordas do T-DNA.
[0046] Esses métodos inovadores fornecem eficiência aprimorada de edição de genoma, porcentagem aprimorada de plantas transformadas regeneradas, menor taxa de atrito das células alvo/organismos, e integração reduzida de DNA indesejado. Definições
[0047] Os termos usados nas reivindicações e no relatório descritivo são definidos conforme apresentado abaixo, a menos que especificado de outro modo. Deve-se observar que, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”,“uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.
[0048] O termo “genoma” refere-se a todo complemento de material genético (genes e sequências não codificantes) que está presente em cada célula de um organismo, vírus ou organela; e/ou um conjunto completo de cromossomos herdados como uma unidade (haploide) de um genitor. O termo “genoma” conforme se aplica a uma célula procariótica e eucariótica ou células de organismo abrange não apenas o DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, mas o DNA de organela encontrado dentro dos componentes subcelulares (por exemplo, mitocôndria ou plastídeo) da célula.
[0049] Os termos “fornecido (para)” e “introduzido (no)” são usados de forma intercambiável no presente documento. Em outro aspecto, isso significa que uma composição particular se torna funcionalmente associada a uma célula ou outra molécula. Em um aspecto, isso significa que uma composição particular é absorvida pela célula em seu interior.
[0050] O termo “endógeno” significa uma sequência ou outra molécula que ocorre naturalmente em uma célula ou organismo. Em um aspecto, um polinucleotídeo endógeno é normalmente encontrado no genoma de uma célula; ou seja, não heterólogo.
[0051] O termo “heterólogo” se refere à diferença entre o ambiente, localização ou composição original de um polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeos particular e seu ambiente , localização ou composição atual. Exemplos não limitantes incluem diferenças na derivação taxonômica (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos obtida a partir de Zea mays seria heteróloga se inserida no genoma de uma planta Oryza sativa, ou uma variedade ou cultivar diferente de Zea mays; ou um polinucleotídeo obtido a partir de uma bactéria foi introduzido em uma célula de uma planta), ou sequência (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos obtida a partir de Zea mays, isolada, modificada e reintroduzida em uma planta de maís). Conforme usado no presente documento, “heterólogo” em referência a uma sequência pode se referir a uma sequência que se origina de uma espécie diferente, variedade, espécie estranha, ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa na composição e/ou locus genômico por meio de intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo se origina de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se a partir da mesma espécie/análoga, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original e/ou locus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado. Alternativamente, uma ou mais composições, tais como aquelas fornecidas no presente documento, podem ser totalmente sintéticas.
[0052] Conforme usado no presente documento, “ácido nucleico” significa um polinucleotídeo e inclui um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo. Os ácidos nucleicos também podem incluir fragmentos e nucleotídeos modificados. Desse modo, os termos “polinucleotídeo”, “sequência de ácidos nucleicos”, “sequência de nucleotídeos” e “fragmento de ácido nucleico” são usados de forma intercambiável para denotar um polímero de RNA e/ou DNA e/ou RNA-DNA que é de fita simples ou dupla fita, que compreende opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Os nucleotídeos (geralmente encontrados em sua forma de 5'-monofosfato) são denominados por sua designação de única letra da seguinte forma: “A” para adenosina ou desoxidenosina (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citosina ou desoxicitosina, “G” para guanosina ou desoxiguanosina, “U” para uridina, “T” para desoxitimidina, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A ou C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.
[0053] A relação entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada. As sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos, fragmentos dos mesmos, variantes dos mesmos e relações estruturais dessas sequências podem ser descritas pelos termos “homologia”, “homólogas”, “substancialmente idênticas”, “substancialmente similares” e “substancialmente correspondentes” que são usados de forma intercambiável no presente documento. Esses se referem às sequências de polipeptídeos ou ácidos nucleicos em que alterações em uma ou mais bases de aminoácidos ou nucleotídeos não afetam a função da molécula, tal como a capacidade de mediar a expressão de genes ou produzir um determinado fenótipo. Esses termos também se referem à modificação (ou modificações) de sequências de ácidos nucleicos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do ácido nucleico resultante em relação ao ácido nucleico não modificado inicial. Essas modificações incluem a deleção, substituição e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos no fragmento de ácido nucleico.
[0054] As relações de sequência podem ser definidas por suas comparações de composição, ou sua capacidade de hibridizar, ou por sua capacidade de se envolver na recombinação homóloga.
[0055] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desse modo, a determinação de identidade de sequência percentual entre quaisquer duas sequências pode ser alcançada com o uso de um algoritmo matemático. Os alinhamentos de sequências e identidade percentual ou cálculos de similaridade podem ser determinados com o uso de uma variedade de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas que incluem, porém sem limitação, o programa MegAlign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Dentro do contexto deste pedido,
será entendido que, quando o software para análise de sequências é usado para a análise, os resultados da análise terão como base os "valores padrão" do programa referido, a não ser que especificado de outro modo. Conforme usado no presente documento, "valores padrão" significarão qualquer conjunto de valores ou parâmetros que carrega originalmente com o software quando inicializado primeiro.
[0056] "Identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos se refere às bases de ácido nucleico ou resíduos de aminoácido em duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. O termo "porcentagem de identidade de sequência" se refere ao valor determinado comparando-se duas sequências idealmente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que a base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando os resultados por 100 para gerar a porcentagem de identidade de sequência. Exemplos úteis de identidades de sequência percentuais incluem, porém sem limitação, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou qualquer porcentagem de número inteiro de 50% a 100%. Essas identidades podem ser determinadas com o uso de qualquer um dos programas descritos no presente documento.
[0057] O “método de alinhamento Clustal V” corresponde ao método de alinhamento identificado Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) e encontrado no programa MegAlign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para múltiplos alinhamentos, os valores padrão correspondem a PENALIDADE PARA LACUNAS=10 e PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DE LACUNA=10 Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo da porcentagem de identidade de sequências proteicas com o uso do método Clustal são K- TUPLA=1, PENALIDADE PARA LACUNAS=3, JANELA=5 e DIAGONAIS SALVAS=5. Para ácidos nucleicos esses parâmetros são K-TUPLA=2, PENALIDADE PARA LACUNAS=5, JANELA=4 e DIAGONAIS SALVAS=4. Após o alinhamento das sequências com o uso do programa Clustal V, é possível obter uma "identidade percentual" visualizando-se a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.
O “método de alinhamento Clustal W” corresponde ao método de alinhamento identificado Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) e encontrado no programa MegAlign v6.1 do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os parâmetros padrão para múltiplos alinhamentos (PENALIDADE PARA LACUNAS=10, PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DE LACUNA=0,2, Seqs.
De Divergência de Atraso (%)=30, Peso de Transição de DNA=0,5, Matriz de Peso de Proteína=Série Gonnet, Matriz de Peso de DNA=IUB). Após o alinhamento das sequências com o uso do programa Clustal W, é possível obter uma "identidade percentual" visualizando-se a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.
A não ser que seja determinado de outro modo, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento se referem ao valor obtido com o uso de GAP Versão 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) com o uso dos seguintes parâmetros: Identidade % e similaridade % para uma sequência de nucleotídeos que usa um peso de penalidade por criação de lacuna de 50 e um peso de penalidade por extensão de comprimento de lacuna de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; identidade % e similaridade % para uma sequência de aminoácidos que usa um peso de penalidade por criação de GAP de 8 e uma penalidade de extensão por comprimento de lacuna de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, (1989) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
EUA 89:10915). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J Mol Biol 48:443-53, para encontrar um alinhamento de duas sequências completas que maximize o número correspondências e minimize o número de lacunas.
GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases correspondentes e menos lacunas, com o uso de uma penalidade para criação de lacunas e uma penalidade para extensão de lacunas em unidades de bases correspondentes. "BLAST" é um algoritmo de pesquisa fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) usado para encontrar regiões de similaridade entre sequências biológicas.
O programa compara sequências proteicas ou nucleotídicas com bancos de dados de sequências e calcula a significância estatística de correspondências para identificar sequências que têm similaridade suficiente a uma sequência de consulta, de modo que a similaridade não seria prevista por ter ocorrido de maneira aleatória.
BLAST relata as sequências identificadas e seu alinhamento local à sequência de consulta.
Conforme usado no presente documento, “identidade de sequência percentual” significa o valor determinado comparando-se as sequências alinhadas com uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácidos ocorre em ambas as sequências para render o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando-se o resultado por 100 para render a identidade de sequência percentual.
[0058] É bem entendido por um indivíduo versado na técnica que muitos níveis de identidade de sequência são úteis na identificação de polipeptídeos de outras espécies ou natural ou sinteticamente modificados em que tais polipeptídeos têm função ou atividade igual ou similar. Exemplos úteis de identidades de sequência percentuais incluem, porém sem limitação, , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou qualquer porcentagem de número inteiro de 50% a 100%. De fato, qualquer identidade de aminoácidos de número inteiro de 50% a 100% pode ser útil na descrição da presente revelação, tal como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[0059] As sequências de ácido nucleico substancialmente similares abrangidas podem ser definidas por sua capacidade para se hibridizarem (sob condições moderadamente estringentes, por exemplo, SSC 0,5X, SDS a 0,1%, 60 °C) com as sequências exemplificadas no presente documento, ou qualquer porção das sequências nucleotídicas reveladas no presente documento e que são funcionalmente equivalentes a quaisquer sequências de ácido nucleico reveladas no presente documento. As condições de estringência podem ser ajustadas para o rastreamento de fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos estreitamente relacionados. As lavagens pós-hibridização determinam as condições de estringência.
[0060] O termo ‘hibridiza seletivamente” inclui a referência à hibridização, sob condições de hibridização estringentes, de uma sequência de ácidos nucleicos com uma sequência-alvo de ácidos nucleicos especificada até grau detectável maior (por exemplo, pelo menos 2 vezes o antecedente) do que sua hibridização com sequência de ácidos nucleicos não alvo e até a exclusão substancial de ácidos nucleicos não alvo. As sequências de hibridização seletiva têm, tipicamente, cerca de pelo menos 80% de identidade de sequência ou 90% de identidade de sequência, até e incluindo 100% de identidade de sequência (isto é, totalmente complementar) entre si.
[0061] O termo “condições estringentes” ou “condições de hibridização estringentes” inclui a referência às condições sob as quais uma sonda irá hibridizar seletivamente com sua sequência alvo em um ensaio de hibridização in vitro. As condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, podem ser identificadas as sequências alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma disparidade nas sequências de modo que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos que cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento, opcionalmente, menos que 500 nucleotídeos de comprimento. Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon de Na, tipicamente, cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na (ou outro sal (ou sais)) em pH 7,0 a 8,3, e pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. As condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a 35%, 1 M de NaCl, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C, e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X de SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trisódico) a 50 a 55 °C. As condições de estringência moderada incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,5X a 1X de SSC a 55 a 60 °C. As condições de alta estringência exemplificativas incluem hibridização em formamida a 50%, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,1X de SSC a 60 a 65 °C
[0062] Por “homologia” entende-se sequências de DNA que são similares. Por exemplo, uma “região de homologia com uma região genômica” que é encontrada no DNA doador é uma região de DNA que tem uma sequência similar a uma dada “região genômica” no genoma da célula ou organismo. Uma região de homologia pode ser de qualquer comprimento que seja suficiente para promover a recombinação homóloga no sítio alvo clivado. Por exemplo, a região de homologia pode compreender pelo menos 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5- 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5- 70, 5-75, 5-80, 5- 85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5-1000, 5-1100, 5-1200, 5-1300, 5-1400, 5-1500, 5-1600, 5-1700, 5-1800, 5- 1900, 5-2000, 5-2100, 5-2200, 5-2300, 5-2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-2800,
5-2900, 5-3000, 5-3100 ou mais bases de comprimento, de modo que a região de homologia tenha homologia suficiente para sofrer recombinação homóloga com a região genômica correspondente. “Homologia suficiente” indica que duas sequências de polinucleotídeos têm similaridade estrutural suficiente para atuar como substratos para uma reação de recombinação homóloga. A similaridade estrutural inclui o comprimento total de cada fragmento polinucleotídico, assim como a similaridade entre sequências dos polinucleotídeos. A similaridade de sequência pode ser descrita pela identidade de sequência percentual ao longo de todo o comprimento das sequências, e/ou por regiões conservadas que compreendem similaridades localizadas, tais como nucleotídeos contíguos que têm 100% de identidade de sequência, e identidade de sequência percentual ao longo de uma porção do comprimento das sequências.
[0063] Conforme usado no presente documento, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “isolado”, ou porção biologicamente ativa do mesmo, é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo conforme encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Desse modo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou purificado é substancialmente isento de outros componentes de material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outras moléculas quando quimicamente sintetizado. De modo ideal, um polinucleotídeo “isolado” é isento de sequências (de modo ideal, sequências de codificação de proteína) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (isto é sequências situadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, o polinucleotídeo isolado pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de polipeptídeos tendo menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) da proteína contaminante. Quando o polipeptídeo da invenção ou porção biologicamente ativa do mesmo é recombinantemente produzido, o meio de cultura ideal representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) dos precursores químicos ou moléculas não proteicas de interesse.
[0064] Conforme usado no presente documento, o polinucleotídeo ou polipeptídeo é “recombinante” quando o mesmo é artificial ou geneticamente modificado, ou derivado de uma proteína ou ácido nucleico artificial ou geneticamente modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que é inserido em um vetor ou qualquer outra localização heteróloga, por exemplo, em um genoma de outro organismo, de modo que ele não seja associado às sequências de nucleotídeos que flanqueiam normalmente o polinucleotídeo conforme é encontrado na natureza é um polinucleotídeo recombinante. Um polipeptídeo expresso in vitro ou in vivo a partir de um polinucleotídeo recombinante é um exemplo de um polipeptídeo recombinante. Igualmente, uma sequência de polinucleotídeos que não aparece na natureza, por exemplo, uma variante de um gene de ocorrência natural, é recombinante.
[0065] Os termos “polinucleotídeo recombinante”, “nucleotídeo recombinante”, “DNA recombinante” e “construto de DNA recombinante” são usados de forma intercambiável no presente documento. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial ou heteróloga de sequências de ácidos nucleicos, por exemplo, sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas na natureza. Por exemplo, um cassete de transferência pode compreender sítios de restrição e um polinucleotídeo heterólogo de interesse. Em outras modalidades, um construto recombinante pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser propriamente usado ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, um vetor plasmidial pode ser usado. O versado na técnica está bem ciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar de maneira bem-sucedida as células hospedeiras que compreendem qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolados fornecidos no presente documento. O especialista também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., EMBO J. 4:2411 a 2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78 a 86 (1989)) e, dessa forma, que múltiplos eventos devem ser rastreados a fim de obter linhagens que exibem o padrão e nível de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada por análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de mRNA, análise de immunoblotting de expressão de proteína ou análise fenotípica, entre outras.
[0066] Um “centimorgan” (cM) ou “unidade de mapa” é a distância entre duas sequências de polinucleotídeos, genes ligados, marcadores, sítios alvo, loci ou qualquer par dos mesmos, em que 1% dos produtos de meiose é recombinante. Dessa forma, um centimorgan é equivalente a uma distância igual a uma frequência de recombinação média de
1% entre os dois genes, marcadores, sítios alvo, loci ligados, ou qualquer par dos mesmos.
[0067] “Quadro de leitura aberto” é abreviado para ORF.
[0068] “Gene” inclui um fragmento de ácido nucleico que expressa uma molécula funcional tal como, mas sem limitação, uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras que precedem (sequências não codificantes 5’) e que seguem (sequências não codificantes 3’) a sequência codificante. “Gene nativo” se refere a um gene conforme encontrado em sua localização endógena natural com suas próprias sequências reguladoras.
[0069] Um "alelo" é uma das várias formas alternativas de um gene que ocupa um determinado locus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes num determinado locus num cromossomo forem iguais, essa planta é homozigota naquele locus. Se os alelos presentes num determinado locus num cromossomo se diferirem, essa planta é heterozigota naquele locus.
[0070] "Sequência de codificação" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos específica. “Sequências reguladoras” se referem a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências não codificantes 5’), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3’) de uma sequência codificante e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras incluem, porém sem limitação: promotores, sequências em escada de tradução, sequências não traduzidas 5', sequências não traduzidas 3', íntrons, sequências-alvo de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de haste-laço.
[0071] Um “gene mutado” é um gene que foi alterado através de intervenção humana. Tal “gene mutado” tem uma sequência que se difere da sequência do gene não mutado correspondente por pelo menos uma adição,
deleção ou substituição nucleotídica. Em determinadas modalidades da divulgação, o gene mutado compreende uma alteração que resulta de um sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas conforme revelado no presente documento. Uma planta mutada é uma planta que compreende um gene mutado.
[0072] Conforme usado no presente documento, o termo “gene morfogênico” significa um gene que quando ectopicamente expresso estimula a formação de uma estrutura somaticamente derivada que pode produzir uma planta. Mais precisamente, a expressão ectópica do gene morfogênico estimula a formação de novo de um embrião somático ou uma estrutura organogênica, como um meristema de broto, que pode produzir uma planta. Essa formação de novo estimulada ocorre na célula em que o gene morfogênico é expresso, ou em uma célula vizinha. Um gene morfogênico pode ser um fator de transcrição que regula a expressão de outros genes, ou um gene que influencia níveis de hormônio em um tecido vegetal, ambos os quais podem estimular alterações morfogênicas. Conforme usado no presente documento, o termo “fator morfogênico” significa um gene morfogênico e/ou a proteína expressa por um gene morfogênico.
[0073] Um "promotor" é uma região de DNA envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. A sequência promotora consiste em elementos a montante proximais e mais distais, os últimos elementos sendo frequentemente chamados de intensificadores. Um "acentuador" é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza e/ou podem compreender segmentos sintéticos de DNA. É entendido pelos especialistas na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. É adicionalmente reconhecido que, já que, na maioria dos casos, os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA com alguma variação podem ter atividade de promotor idêntica.
[0074] Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são comumente denominados de "promotores constitutivos". O termo “promotor induzível” refere-se a um promotor que expressa seletivamente uma sequência codificante ou RNA funcional em resposta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, por exemplo, por compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento. Os promotores induzíveis ou regulados incluem, por exemplo, promotores induzidos ou regulados pela luz, calor, estresse, inundação ou seca, estresse salino, estresse osmótico, fito-hormônios, ferimento ou produtos químicos, como etanol, ácido abscísico (ABA), jasmonato, ácido salicílico ou agentes fitoprotetores.
[0075] "Sequência-líder de translação" se refere a uma sequência de polinucleotídeos situada entre a sequência promotora de um gene e a sequência de codificação. A sequência líder de tradução está presente no mRNA a montante da sequência de iniciação de tradução. A sequência líder de tradução pode afetar o processamento do transcrito primário em mRNA, a estabilidade do mRNA ou a eficiência de tradução. Exemplos de sequências líder de tradução foram descritas (por exemplo, Turner and Foster, (1995) Mol Biotechnol 3:225-236).
[0076] "Sequências de não codificação 3'", "terminador de transcrição" ou "sequências de terminação" se referem a sequências de DNA situadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou expressão de genes. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de traços de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de mRNA. O uso de 3' sequências não codificadoras diferentes é exemplificado por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680.
[0077] "Transcrito de RNA" se refere ao produto que resulta da transcrição catalisada por RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA for uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, é chamado de transcrito primário ou pré-mRNA. Um transcrito de RNA é chamado de RNA maduro ou mRNA quando é uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do pré-mRNA de transcrito primário. "RNA mensageiro" ou "mRNA" se refere ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido na proteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar a um modelo de mRNA e sintetizado do mesmo com o uso de uma enzima transcriptase reversa. O cDNA pode ser de fita simples ou convertido na forma de fita dupla com o uso do fragmento de Klenow de DNA polimerase I. RNA “senso” se refere a uma transcrição de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzida na proteína dentro de uma célula ou in vitro. “RNA antissenso" se refere a uma transcrição de RNA que é complementar a toda ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA, e que bloqueia a expressão de um gene-alvo (consulte, por exemplo, patente nº US 5.107.065). A complementaridade de um RNA antissenso pode ser com qualquer parte do transcrito de gene específico, isto é, na sequência de não codificação 5', sequência de não codificação 3', íntrons ou a sequência de codificação. “RNA funcional” se refere ao RNA antissenso, RNA de ribozima, ou outro RNA que pode não ser traduzido, mas ainda tenha um efeito sobre os processos celulares. Os termos "complemento" e "complemento reverso" são usados de forma intercambiável no presente documento em relação a transcritos de mRNA e se destinam a definir o RNA antissenso da mensagem.
[0078] Os termos “5'-cap” e “7-metilguanilato (m7G) cap” são usados de forma intercambiável no presente documento. Um resíduo de 7- metilguanilato é localizado no terminal 5′ do RNA mensageiro (mRNA) em eucariotas. RNA polimerase II (Pol II) transcreve mRNA em eucariotas. O capping de RNA mensageiro ocorre geralmente da seguinte forma: O grupo fosfato mais terminal 5' do transcrito de mRNA é removido pela RNA fosfatase terminal, deixando dois fosfatos terminais. Um monofosfato de guanosina (GMP) é adicionado ao fosfato terminal do transcrito por uma guanilil transferase, deixando uma guanina ligada a 5′-5′ trifosfato no terminal de transcrito. Finalmente, o 7-nitrogênio dessa guanina terminal é metilado por uma metil transferase.
[0079] A terminologia "que não tem um cap 5'" no presente documento é usada para se referir ao RNA que tem, por exemplo, um grupo 5'- hidroxila em vez de um cap 5'. Tal RNA pode ser denominado "RNA sem cap", por exemplo. O RNA sem cap pode se acumular melhor no núcleo após a transcrição, já que o RNA com cap 5’ é submetido à exportação nuclear. Um ou mais componentes de RNA no presente documento não têm cap.
[0080] O termo "operacionalmente ligado" se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando o mesmo é capaz de regular a expressão dessa sequência codificante (isto é, a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras numa orientação senso ou antissenso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares podem ser operacionalmente ligadas, direta ou indiretamente, 5' ao mRNA-alvo, 3' ao mRNA-alvo ou dentro do mRNA-alvo, ou uma primeira região complementar é 5' e seu complemento é 3' ao mRNA- alvo.
[0081] O termo "expressão", conforme usado no presente documento, se refere à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA, RNA-guia ou uma proteína) na forma precursora ou madura.
[0082] “Domínio” significa uma extensão contígua de nucleotídeos (que pode ser a sequência de RNA, DNA e/ou de combinação de RNA-DNA) ou aminoácidos.
[0083] O termo “domínio conservado” ou “motivo” significa um conjunto de polinucleotídeos ou aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma sequência alinhada de proteínas evolutivamente relacionadas. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre proteínas homólogas, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam os aminoácidos que são essenciais para a estrutura, a estabilidade ou a atividade de uma proteína. Devido ao fato de que os mesmos são identificados por seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, os mesmos podem ser usados como identificadores, ou “assinaturas”, para determinar se uma proteína com uma sequência recentemente determinada pertence a uma família de proteínas previamente identificada.
[0084] O termo “fragmento” se refere a um conjunto contíguo de polinucleotídeos ou polipeptídeos. Em uma modalidade, um fragmento tem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais de 20 polinucleotídeos contíguos. Em uma modalidade, um fragmento tem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais de 20 polipeptídeos contíguos. Um fragmento pode ou não exibir a função de uma sequência que compartilha alguma identidade percentual ao longo do comprimento do dito fragmento.
[0085] Os termos “fragmento que é funcionalmente equivalente”, “fragmento funcional” e “fragmento funcionalmente equivalente” são usados de forma intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma porção ou subsequência de um fragmento de ácido nucleico ou polipeptídeo que exibe a mesma atividade ou função que a sequência mais longa a partir da qual o mesmo é derivado. Em um exemplo, o fragmento retém a capacidade de alterar a expressão de genes, criar uma incisão ou quebra de fita dupla, ou produzir um certo fenótipo que o fragmento codifique toda a proteína conforme encontrada na natureza ou não. Em alguns aspectos, parte da atividade é retida. Em alguns aspectos, toda a atividade é retida.
[0086] Os termos “variante que é funcionalmente equivalente”, “variante funcional” e “variante funcionalmente equivalente” são usados de forma intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a um fragmento de ácido nucleico ou polipeptídeo que exibe a mesma atividade ou função que a sequência de fonte a partir da qual o mesmo é derivado, porém difere da sequência de fonte em pelo menos um nucleotídeo ou aminoácido. Em um exemplo, a variante retém a capacidade de alterar a expressão de genes, criar uma incisão ou quebra de fita dupla, ou produzir um certo fenótipo. Em alguns aspectos, parte da atividade é retida. Em alguns aspectos, toda a atividade é retida.
[0087] Um fragmento funcional ou variante funcional compartilha pelo menos 50%, entre 50% e 55%, pelo menos 55%, entre 55% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 65%, pelo menos 65%, entre 65% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 85%, pelo menos 85%, entre 85% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95%, entre 95% e 96%, pelo menos 96%, entre 96% e 97%, pelo menos 97%, entre 97% e 98%, pelo menos 98%, entre 98% e 99%, pelo menos 99%, entre 99% e 100%, ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 150, pelo menos 150, entre 150 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 250, pelo menos 250, entre 250 e 300, pelo menos 300, entre 300 e 350, pelo menos 350, entre 350 e 400, pelo menos 400, entre 400 e 450, pelo menos 500, ou mais de 500 aminoácidos contíguos de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de fonte nativa, e retém pelo menos a atividade parcial.
[0088] “Modificada”, “editada” ou “alterada”, em relação a uma sequência de polinucleotídeos ou alvo, se refere a uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma alteração quando comparada à sua sequência de nucleotídeos não modificada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, (iv) associação de outra molécula ou átomo por meio de ligação covalente, iônica ou de hidrogênio, ou (v) qualquer combinação de (i) a (iv).
[0089] As proteínas podem ser alteradas de vários modos incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos.
Os métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos. Por exemplo, as variantes de sequências de aminoácidos da(s) proteína(s) podem ser preparadas por mutações no DNA. Os métodos para mutagênese e alterações de sequência nucleotídica incluem, por exemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A 82:488 a 492; Kunkel et al., (1987) Meth Enzymol 154:367 a 382; patente dos E.U.A. N.º 4.873.192; Walker e Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque) e as referências citadas nos mesmos. Orientação a respeito de substituições de aminoácido que provavelmente não afetam a atividade biológica da proteína é encontrada, por exemplo, no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Podem ser preferenciais substituições conservativas, como troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes. Não é esperado que as deleções, inserções e substituições conservativas de aminoácidos produzam alterações radicais nas características da proteína, e o efeito de qualquer substituição, deleção, inserção ou combinação das mesmas pode ser avaliado por ensaios de rastreamento habituais. Os ensaios para atividade indutora de quebra de fita dupla são conhecidos e geralmente medem a atividade e especificidade total do agente nos substratos de DNA que compreendem sítios alvo.
[0090] Uma proteína “madura” se refere a um polipeptídeo pós-traducionalmente processado (isto é, uma a partir do qual quaisquer pré ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos).
[0091] Proteína "precursora" se refere ao produto primário da translação de mRNA (isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes). Os pré- e pró-peptídeos podem ser, mas sem limitação, sinais de localização intracelulares.
[0092] Um polinucleotídeo “otimizado” é uma sequência que foi otimizada para expressão aprimorada em uma célula hospedeira heteróloga particular.
[0093] Um "gene modificado por códon" ou "gene preferido por códon" ou "gene otimizado por códon" é um gene que tem sua frequência de uso de códon projetada para imitar a frequência do uso de códon preferencial da célula hospedeira.
[0094] Uma “sequência de nucleotídeos otimizada para planta” é uma sequência de nucleotídeos que foi otimizada para expressão em plantas, particularmente para expressão aumentada em plantas. Uma sequência de nucleotídeos otimizada para planta inclui um gene com códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeos otimizada para plantas pode ser sintetizada modificando-se uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína tal como, por exemplo, uma endonuclease Cas conforme revelado no presente documento, com o uso de um ou mais códons preferenciais para planta para expressão aprimorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro.
[0095] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" referem-se a um elemento extracromossômico linear ou circular que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fago ou nucleotídicas, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas numa construção exclusiva que é capaz de introduzir um polinucleotídeo de interesse numa célula. “Cassete de transformação” se refere a um vetor específico que compreende um gene e que tem elementos além do gene que facilitam a transformação de uma célula hospedeira particular. “Cassete de expressão” se refere a um vetor específico que compreende um gene e que tem elementos além do gene que permitem a expressão daquele gene em um hospedeiro.
[0096] Um “polinucleotídeo de interesse” inclui qualquer sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou polipeptídeo que aprimora a desejabilidade de um organismo, por exemplo, animais ou plantas. Polinucleotídeos de interesse: incluem, porém sem limitação, polinucleotídeos que codificam traços importantes para agronomia, resistência a herbicidas, resistência a inseticidas, resistência a doenças, resistência a nemátodos, resistência a herbicidas, resistência microbiana, resistência fúngica, resistência viral, fertilidade ou esterilidade, características de grão, produtos comerciais, marcador fenotípico, ou qualquer outro traço de importância agronômica ou comercial. Um polinucleotídeo de interesse pode ser adicionalmente utilizado na orientação de senso ou anstissenso. Ademais, mais de um polinucleotídeo de interesse pode ser utilizado em conjunto, ou “empilhado”, para fornecer benefício adicional.
[0097] Conforme usado no presente documento, uma “região genômica de interesse” é um segmento de um cromossomo no genoma de uma planta que é desejável para introduzir uma quebra de fita dupla, um polinucleotídeo de interesse ou um traço de interesse. A região genômica de interesse pode incluir, por exemplo, um ou mais polinucleotídeos de interesse. Geralmente, uma região genômica de interesse da presente invenção compreende um segmento de cromossomo que tem 0 a 15 centimorgan (cM).
[0098] Os termos “knockout”, “knockout de gene” e “knockout genético” são usados de forma intercambiável no presente documento. Um knockout representa uma sequência de DNA de uma célula que se tornou parcial ou completamente inoperante por direcionamento com agente DSB; por exemplo, uma DNA sequência antes do knockout poderia ter codificado uma sequência de aminoácidos, ou poderia ter uma função reguladora (por exemplo, promotor).
[0099] Os termos “knockin”, “knockin de gene”, “inserção de gene” e “knockin genético” são usados de forma intercambiável no presente documento. Um knockin representa a substituição ou inserção de uma sequência de DNA em uma sequência de DNA específica na célula por direcionamento com um agente DSB (por exemplo, por recombinação homóloga (HR), em que um polinucleotídeo de DNA doador adequado também é usado). Exemplos de knockins são uma inserção específica de uma sequência de codificação de aminoácido heteróloga em uma região de codificação de um gene, ou uma inserção específica de um elemento regulador transcricional em um locus genético.
[0100] “Introdução” se destina a significar apresentar para um alvo, tal como uma célula ou organismo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo ou complexo de polinucleotídeo-proteína, de tal modo que o componente(s) obtenha acesso ao interior de uma célula do organismo ou à própria célula.
[0101] Geralmente, “hospedeiro” se refere a um organismo ou célula dentro do qual um componente heterólogo (polinucleotídeo, polipeptídeo, outra molécula, célula) foi introduzido. Conforme usado no presente documento, uma “célula hospedeira” se refere a uma célula eucariótica in vivo ou in vitro, célula procariótica (por exemplo, célula bacteriana ou arqueal), ou célula a partir de um organismo multicelular (por exemplo, uma linhagem celular) cultivado como uma entidade unicelular, dentro da qual um polinucleotídeo heterólogo ou polipeptídeo foi introduzido. Em algumas modalidades, a célula é selecionada dentre o grupo que consiste em: uma célula arqueal, uma célula bacteriana, uma célula eucariótica, um organismo de célula única eucariótica, uma célula somática, uma célula germinativa, uma célula-tronco, uma célula vegetal, uma célula algácea, uma célula animal, uma célula de invertebrado, uma célula de vertebrado, uma célula de peixe, uma célula de rã, uma célula de pássaro, uma célula de inseto, uma célula de mamífero, uma célula de porco, uma célula de vaca, uma célula de cabra, uma célula de ovelha , uma célula de roedor, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de primata não humano e uma célula humana. Em alguns casos, a célula é in vitro. Em alguns casos, a célula é in vivo.
[0102] Conforme usado no presente documento, os termos “sítio alvo”, “sequência alvo” e “polinucleotídeo alvo” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência de polinucleotídeos no genoma de uma célula vegetal ou célula de levedura que compreende um sítio de reconhecimento para um agente indutor de quebra de fita dupla.
[0103] Uma “célula alvo” é uma célula que compreende uma sequência alvo e é o objeto para recebimento de um agente indutor de quebra de fita dupla particular.
[0104] Um “agente indutor de quebra” é uma composição que cria uma clivagem em pelo menos uma fita de um polinucleotídeo. Em algum aspecto, um agente indutor de quebra pode ter capacidade de, ou ter sua atividade alterada de modo que tenha capacidade de criar uma quebra em apenas uma fita de um polinucleotídeo. A produção de uma quebra de fita simples em uma sequência alvo de fita dupla pode ser denominada no presente documento como “incisão” da sequência alvo.
[0105] O termo “agente indutor de quebra de fita dupla”, ou equivalentemente “agente de quebra de fita dupla” ou “agente DSB”, conforme usado no presente documento se refere a qualquer composição que produza uma quebra de fita dupla em uma sequência de polinucleotídeos alvo; ou seja, cria uma quebra em ambas as fitas de um polinucleotídeo de fita dupla.
Exemplos de um agente DSB incluem, porém sem limitação: meganucleases, nucleases efetoras TAL, Argonautas, nucleases de dedo de zinco e endonucleases Cas (individualmente ou como parte de um complexo de ribonucleoproteína). A produção da quebra de fita dupla em uma sequência alvo pode ser denominada no presente documento como “corte” ou “clivagem” da sequência alvo.
Em alguns aspectos, o agente DSB é uma nuclease.
Em alguns aspectos, o agente DSB é uma endonuclease.
Uma “endonuclease” se refere a uma enzima que cliva a ligação de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeos.
Em algumas modalidades, a quebra de fita dupla resulta em uma extremidade “cega” de um polinucleotídeo de fita dupla, em que ambas as fitas são cortadas diretamente ao uma da outra sem nenhuma saliência de nucleotídeo gerada.
Um corte de extremidade “cega” de um polinucleotídeo de fita dupla é criado quando uma primeira clivagem da cadeia principal de polinucleotídeo de primeira fita ocorre entre um primeiro conjunto de dois nucleotídeos em uma fita, e uma segunda clivagem da cadeia principal de polinucleotídeo de segunda fita ocorre entre um segundo conjunto de dois nucleotídeos na fita oposta, em que cada um dos dois nucleotídeos do primeiro conjunto é ligado por hidrogênio a um dos dois nucleotídeos do segundo conjunto, resultando em fitas cortadas sem nenhum nucleotídeo na extremidade clivada que não está ligada por hidrogênio a outro nucleotídeo na fita oposta.
Em algumas modalidades, a quebra de fita dupla resulta em uma extremidade “pegajosa” de um polinucleotídeo de fita dupla, em que cortes são feitos entre nucleotídeos de posições relativas diferentes em cada uma das duas fitas, resultando em uma saliência de polinucleotídeo de uma fita em comparação com a outra. Um corte de extremidade “pegajoso” de um polinucleotídeo de fita dupla é criado quando uma primeira clivagem da cadeia principal de polinucleotídeo de primeira fita ocorre entre um primeiro conjunto de dois nucleotídeos em uma fita, e uma segunda clivagem da cadeia principal de polinucleotídeo de segunda fita ocorre entre um segundo conjunto de dois nucleotídeos na fita oposta, em que não mais que um nucleotídeo do primeiro conjunto é ligado por hidrogênio a um dos nucleotídeos do segundo conjunto na fita oposta, resultando em uma “saliência” de pelo menos um polinucleotídeo em uma das duas fitas em que os comprimentos das duas fitas de corte resultantes não são idênticos. Em algumas modalidades, o agente DSB compreende mais de um tipo de molécula. Em um exemplo não limitante, o agente DSB compreende uma proteína endonuclease e um polinucleotídeo, por exemplo uma endonuclease Cas e um RNA guia. Em alguns aspectos, o agente DSB é uma proteína de fusão que compreende uma pluralidade de polipeptídeos. Em um exemplo não limitante, o agente DSB é uma endonuclease Cas com um domínio de nuclease desativado, e outro polipeptídeo com atividade de nuclease.
[0106] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de reconhecimento” se refere a uma sequência de polinucleotídeos à qual um agente indutor de quebra de fita dupla tem capacidade de se alinhar, e pode opcionalmente entrar em contato com, ligar e/ou efetuar uma quebra de fita dupla. Os termos “sítio de reconhecimento” e “sequência de reconhecimento” são usados de forma intercambiável no presente documento. O sítio de reconhecimento pode ser um sítio endógeno em um genoma hospedeiro (tal como uma levedura, animal ou planta), ou alternativamente, o sítio de reconhecimento pode ser heterólogo ao hospedeiro (levedura, animal ou planta) e, desse modo, não ser de ocorrência natural no genoma, ou o sítio de reconhecimento pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação com onde o mesmo ocorre na natureza. O comprimento e a composição de um sítio de reconhecimento podem ser característicos de, e podem ser específicos para um agente indutor de quebra de fita dupla particular. O sítio de clivagem de um agente DSB pode ser igual ou diferente do sítio de reconhecimento, e pode ser igual ou diferente do sítio de ligação.
[0107] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de reconhecimento endógeno (ou ligação ou clivagem)” se refere a um sítio de reconhecimento de agente indutor de quebra de fita dupla (ou ligação ou clivagem) que é endógeno ou nativo ao genoma de um hospedeiro (tal como uma planta, animal ou levedura) e se situa na posição endógena ou nativa daquele sítio de reconhecimento (ou ligação ou clivagem) no genoma do hospedeiro (tal como uma planta, animal ou levedura). O comprimento do sítio de reconhecimento (ou ligação ou clivagem) pode variar, e inclui, por exemplo, sítios de reconhecimento (ou ligação ou clivagem) que têm pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, ou mais de 70 nucleotídeos de comprimento. O composição do sítio de reconhecimento (ou ligação ou clivagem) pode variar, e inclui, por exemplo, uma pluralidade de nucleotídeos específicos cujas composições são reconhecidas pelo agente DSB. Em alguns aspectos, a pluralidade de nucleotídeos específicos é contígua na sequência primária. Em alguns aspectos, a pluralidade de nucleotídeos específicos é não contígua na sequência primária. É adicionalmente possível que o sítio de reconhecimento possa ser palindrômico, ou seja, a sequência em uma fita lê o mesmo na direção oposta à fita complementar. O sítio de ligação e/ou incisão/clivagem poderia estar dentro da sequência de reconhecimento ou do sítio de ligação e/ou incisão/clivagem poderia estar fora da sequência de reconhecimento. Em outra variação, a clivagem DSB poderia ocorrer nas posições de nucleotídeo imediatamente opostas umas às outras para produzir um corte de extremidade cega ou, em outros casos, as incisões poderiam ser desalinhadas para produzir saliências de fita simples, também chamada de “extremidades pegajosas”, que podem ser saliências 5' ou saliências 3'.
[0108] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de reconhecimento alvo” se refere à sequência de polinucleotídeos à qual um agente indutor de quebra de fita dupla tem capacidade de se alinhar perfeitamente (isto é, zero disparidades, lacunas ou inserções de nucleotídeos) e, em alguns aspectos, induz uma quebra de fita dupla.
[0109] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de ligação alvo” se refere à sequência de polinucleotídeos na qual o agente indutor de quebra de fita dupla tem capacidade formar uma associação funcional, e na qual o mesmo forma ligações com nucleotídeos complementares da fita de polinucleotídeo alvo, com alinhamento perfeito (isto é, zero disparidades, lacunas ou inserções de nucleotídeo).
[0110] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de clivagem alvo” se refere à sequência de polinucleotídeos na qual um agente indutor de quebra de fita dupla tem capacidade de produzir uma quebra de fita dupla, com alinhamento perfeito (isto é, zero disparidades, lacunas ou inserções de nucleotídeo).
[0111] Loci “CRISPR” (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) se refere a determinados loci genéticos que codificam componentes de sistemas de clivagem de DNA, por exemplo, usados por células bacterianas e arqueais para destruir o DNA estranho (Horvath and Barrangou, 2010, Science 327:167-170; WO2007025097, publicado em 01 de março de 2007). Um locus CRISPR pode consistir em uma matriz CRISPR, que compreende repetições diretas curtas (repetições CRISPR) separadas por sequências de DNA variáveis curtas (chamadas espaçadores), que podem ser flanqueadas por genes Cas diversos (associados à CRISPR).
[0112] Conforme usado no presente documento, um “efetor” ou “proteína efetora” é uma proteína que abrange uma atividade que inclui o reconhecimento, ligação e/ou clivagem ou incisão de um alvo de polinucleotídeo. O “complexo efetor” de um sistema CRISPR inclui proteínas Cas envolvidas em crRNA e reconhecimento e ligação alvo. Algumas das proteínas Cas de componente podem compreender adicionalmente domínios envolvidos na clivagem de polinucleotídeo alvo.
[0113] O termo “proteína Cas” se refere a um polipeptídeo codificado por um gene Cas (associado à CRISPR). Uma proteína Cas inclui, porém sem limitação: a proteína Cas-delta inovadora revelada no presente documento, uma proteína Cas9, uma proteína Cpf1 (Cas12), uma proteína C2c1, uma proteína C2c2, uma proteína C2c3, Cas3, Cas3-HD, Cas 5, Cas7, Cas8, Cas10, ou combinações ou complexos das mesmas. Uma proteína Cas pode ser uma “endonuclease Cas” ou “proteína efetora Cas”, que quando no complexo com um componente de polinucleotídeo adequado, é capaz de reconhecer, se ligar a e, opcionalmente cortar ou clivar toda ou parte de uma sequência alvo de polinucleotídeo específica. Uma endonuclease Cas descrita no presente documento compreende um ou mais domínios de nuclease. As endonucleases Cas-delta da revelação podem incluir aquelas que têm domínios de nuclease do tipo RuvC ou RuvC. Uma proteína Cas é adicionalmente definida como um fragmento funcional ou variante funcional de uma proteína Cas nativa, ou uma proteína que partilha pelo menos 50%, entre 50% e 55%, pelo menos 55%, entre 55% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 65%, pelo menos 65%, entre 65% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 85%, pelo menos 85%, entre 85% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95%, entre 95% e 96%, pelo menos 96%, entre 96% e 97%, pelo menos 97%, entre 97% e 98%, pelo menos 98%, entre 98% e 99%, pelo menos 99%, entre 99% e 100%, ou 100% de identidade de sequência com pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 150, pelo menos 150, entre 150 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 250, pelo menos 250, entre 250 e 300, pelo menos 300, entre 300 e 350, pelo menos 350, entre 350 e 400, pelo menos 400, entre 400 e 450, pelo menos 500, ou mais do que 500 aminoácidos contíguos de uma proteína Cas nativa, e retém pelo menos atividade parcial.
[0114] Os termos “cascata” e “complexo em cascata” são usados de forma intercambiável no presente documento e incluem a referência a um complexo de proteínas de múltiplas subunidades que pode ser montado com um polinucleotídeo que forma um complexo de polinucleotídeo-proteína (PNP). A cascata é um PNP que depende do polinucleotídeo para montagem e estabilidade de complexo, e para a identificação das sequências de ácidos nucleicos alvo. As funções de cascata como um complexo de vigilância que encontra e opcionalmente se liga aos ácidos nucleicos que são complementares a um domínio de alvejamento variável do polinucleotídeo guia.
[0115] Os termos "Cascata pronta para clivagem", "crCascade", "complexo de Cascata pronta para clivagem", "complexo de crCascade", "sistema de cascata pronta para clivagem", "CRC" e "sistema de crCascade", são usados de forma intercambiável no presente documento e incluem a referência a um complexo de proteínas de múltiplas subunidades que pode ser montado com um polinucleotídeo que forma um complexo de polinucleotídeo-proteína (PNP), em que uma das proteínas em cascata é uma endonuclease Cas com capacidade de reconhecer, se ligar a, e opcionalmente desenrolar, cortar ou clivar toda ou parte de uma sequência alvo.
[0116] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo guia”, se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas, incluindo a endonuclease Cas descrita no presente documento, e permitir que a endonuclease Cas reconheça, se ligue opcionalmente a e, clive opcionalmente um sítio alvo de DNA. A sequência polinucleotídica-guia pode ser uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma combinação das mesmas (uma sequência de combinação de RNA-DNA).
[0117] Os termos “RNA-guia único” e “sgRNA” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma fusão sintética de duas moléculas de RNA, um crRNA (RNA CRISPR) que compreende um domínio de alvejamento variável (ligado a uma sequência tracr correspondente que hibridiza com um tracrRNA), fundido a um tracrRNA (RNA de CRISPR transativador). O RNA guia único pode compreender um fragmento de crRNA ou crRNA e um fragmento de tracrRNA ou tracrRNA do sistema CRISPR/Cas tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o dito complexo de RNA guia/endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio alvo de DNA, permitindo que a endonuclease Cas reconheça, se ligue opcionalmente a e, corte ou clive opcionalmente (introduza uma quebra de fita simples ou dupla) o sítio alvo de DNA.
[0118] O termo "domínio de alvejamento variável" ou "domínio VT” é usado de forma intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos que pode hibridizar (é complementar) a uma fita (sequência de nucleotídeos) de um sítio alvo de DNA de fita dupla. A complementação percentual entre o primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (domínio VT) e a sequência alvo pode ser de pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O domínio de alvejamento variável pode ser de pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de alvejamento variável compreende uma extensão contígua de 12 a 30 nucleotídeos. O domínio de alvejamento variável pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0119] O termo “domínio de reconhecimento de endonuclease Cas” ou “domínio de CER” (de um polinucleotídeo-guia) é usado de forma intercambiável no presente documento e inclui uma sequência nucleotídica que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. Um domínio CER compreende uma sequência de pares tracrNucleotide (trans-atuação) seguido de uma sequência de tracrNucleotide. O domínio CER pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consulte, por exemplo US20150059010A1, publicado em 26 de fevereiro de 2015), ou qualquer combinação dos mesmos.
[0120] Conforme usado no presente documento, os termos "complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas", "sistema de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas", "complexo de polinucleotídeo guia/Cas", "sistema de polinucleotídeo guia/Cas" e "sistema Cas guiado" "endonuclease por polinucleotídeo" , "PGEN" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a pelo menos um polinucleotídeo guia e pelo menos uma endonuclease Cas, que são capazes de formar um complexo, em que o dito complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio alvo de DNA, permitindo que a endonuclease Cas reconheça, se ligue a, e opcionalmente corte ou clive (introduza uma quebra de fita simples ou dupla) o sítio alvo de DNA. Um complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas no presente documento pode compreender proteína Cas(s) e componente(s) de polinucleotídeo adequado de qualquer um dos sistemas CRISPR conhecidos (Horvath and Barrangou, 2010, Science 327:167-170; Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13:1-15; Zetsche et al., 2015, Cell 163, 1-13; Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 1-13).
[0121] Os termos "complexo de RNA guia/endonuclease Cas", "sistema de RNA guia/endonuclease Cas", "complexo de RNA guia/Cas", "sistema de RNA guia/Cas", "complexo de gRNA/Cas", "sistema de gRNA/Cas", "endonuclease guiada por RNA" , "RGEN" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a pelo menos um componente de RNA e pelo menos uma endonuclease Cas que são capazes de formar um complexo, em que o dito complexo de RNA guia/endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio alvo de DNA, permitindo que a endonuclease Cas reconheça, se ligue a, e opcionalmente corte ou clive (introduza uma quebra de fita simples ou dupla) o sítio alvo de DNA.
[0122] Um "motivo adjacente ao protoespaçador" (PAM) no presente documento se refere a uma sequência de nucleotídeos curta adjacente a uma sequência alvo (protoespaçador) que é reconhecida (alvejada) por um sistema de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas descrito no presente documento. A endonuclease Cas pode não reconhecer com sucesso uma sequência de DNA-alvo se a sequência de DNA-alvo não for seguida por uma sequência de PAM. A sequência e o comprimento de um PAM no presente documento podem diferir dependendo da proteína Cas ou do complexo de proteína Cas usado. A sequência PAM podem ter qualquer comprimento, porém tem tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento.
[0123] Conforme usado no presente documento, "DNA doador” é um construto de DNA que compreende um polinucleotídeo de interesse a ser inserido no sítio alvo de uma endonuclease Cas.
[0124] O termo “molde polinucleotídico de modificação” inclui um polinucleotídeo que compreende pelo menos uma modificação nucleotídica em comparação à sequência nucleotídica a ser editada. Uma modificação nucleotídica pode ser pelo menos uma substituição, adição ou deleção nucleotídica. Opcionalmente, o modelo de modificação de polinucleotídeo pode compreender adicionalmente sequências de nucleotídeos homólogas que flanqueiam a pelo menos uma modificação de nucleotídeo, em que as sequências de nucleotídeos homólogas de flanqueamento fornecem homologia suficiente para a sequência de nucleotídeos desejada a ser editada.
[0125] Conforme usado no presente documento, "recombinação homóloga" (HR) inclui a troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA nos sítios de homologia. A frequência de recombinação homóloga é influenciada por vários fatores. Organismos diferentes variam em relação à quantidade de recombinação homóloga e à proporção relativa entre recombinação homóloga e não homóloga. Em geral, o comprimento da região de homologia afeta a frequência de eventos de recombinação homóloga: quanto mais longa a região de homologia, maior a frequência. O comprimento da região de homologia necessário para se observar recombinação homóloga também é variável entre espécies. Em muitos casos, pelo menos 5 kb de homologia foram utilizados, mas recombinação homóloga tem sido observada com apenas 25 a 50 pb de homologia. Consulte, por exemplo, Singer et al., (1982) Cell 31:25 a 33; Shen e Huang, (1986) Genetics 112:441 a 457; Watt et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A 82:4768 a 4772, Sugawara e Haber, (1992) Mol Cell Biol 12:563 a 575, Rubnitz e Subramani, (1984) Mol Cell Biol 4:2253 a 2258; Ayares et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5199 a 5203; Liskay et al., (1987) Genetics 115:161 a 167.
[0126] O termo "planta" inclui genericamente plantas inteiras, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células vegetais, sementes e progênie das mesmas. As células vegetais incluem, mas sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Um “elemento de planta" pretende se referir a uma planta inteira ou um componente de planta, que pode compreender tecidos diferenciados e/ou não diferenciados, por exemplo porém sem limitação, tecidos de plantas, partes e tipos de célula. Em uma modalidade, um elemento de planta é um dentre o seguinte: planta inteira, muda, tecido meristemático, tecido do solo, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, broto, caule, flor, fruta, estolho, bulbo, tubérculo, cormo, keiki, broto, botão, tecido tumoral e várias formas de células e cultura (por exemplo, células únicas, protoplastos, embriões, tecido caloso). O termo “órgão de planta” refere-se ao tecido de planta ou um grupo de tecidos que constitui uma parte morfológica e funcionalidade distinta de uma planta. Conforme usado no presente documento, um "elemento de planta” é sinônimo de uma “porção” de uma planta, e se refere a qualquer parte da planta, e pode incluir tecidos e/ou órgãos distintos, pode ser usado de forma intercambiável com o termo "tecido" ao longo do documento. De modo similar, um "elemento reprodutor de planta” pretende se referir genericamente a qualquer parte de uma planta que tem capacidade de iniciar outras plantas por meio de reprodução sexuada ou assexuada dessa planta, por exemplo porém sem limitação: semente, muda, raiz, broto, corte, rebento, enxerto, estolho, bulbo, tubérculo, cormo, keiki ou broto. O elemento de planta pode se situar na planta ou em um órgão de planta, cultura de tecido ou cultura celular.
[0127] "Progênie" compreende qualquer geração subsequente de um organismo, produzidos por meio de reprodução sexuada ou assexuada.
[0128] Conforme usado no presente documento, o termo “parte de planta” refere-se a células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido de célula vegetal das quais as plantas podem ser regeneradas, calos da planta, tufos de planta e células vegetais que são intactas em plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutas, caroços, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras e similares, assim como as próprias partes. Grão pretende significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes do crescimento ou reprodução das espécies. A progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas estão também incluídos dentro do escopo da invenção, contanto que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.
[0129] O termo "monocotiledônea" ou "monocot" se refere à subclasse de plantas de angiosperma também conhecidas como “monocotyledoneae", cujas sementes compreendem tipicamente apenas uma folha embrionária, ou cotilédone. O termo inclui referências a plantas inteiras, elementos de planta, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, e progênie das mesmas.
[0130] O termo "dicotiledônea" ou "dicot" se refere às subclasse de plantas de angiosperma também conhecidas como "dicotyledoneae", cujas sementes compreendem tipicamente duas folhas embrionárias, ou cotilédones. O termo inclui referências a plantas inteiras, elementos de planta, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, e progênie das mesmas.
[0131] O termo "cruzado" ou "cruzar" ou "cruzamento" no contexto desta revelação significa a fusão de gametas através de polinização para produzir progênie (isto é, células, sementes ou plantas). O termo abrange tanto cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) e autocruzamento (autopolinização, isto é, quando o pólen e óvulo (ou microesporos e megaesporos) são da mesma planta ou plantas geneticamente idênticas).
[0132] O termo "introgressão" se refere à transmissão de um alelo desejado de um locus genético a partir de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgressão de um alelo desejado em um locus especificado pode ser transmitida para pelo menos uma planta de progênie através de um cruzamento sexual entre duas plantas genitoras, em que pelo menos uma das plantas genitoras tem o alelo desejado dentro do seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por recombinação entre dois genomas doadores, por exemplo, em um protoplasto fundido, em que pelo menos um dentre os protoplastos doadores tem o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um transgene, um alelo nativo modificado (com mutação ou editado) ou um alelo selecionado de um marcador ou QTL.
[0133] O termo “isolinhagem” é um termo comparativo, e organismos de referência que são genericamente idênticos, porém diferem no tratamento. Em um exemplo, dois embriões de planta de maís geneticamente idênticos podem ser separados em dois grupos diferentes, um que recebe um tratamento (tal como a introdução de uma endonuclease efetora CRISPR-Cas) e um controle que não recebe tal tratamento. Quaisquer diferenças fenotípicas entre os dois grupos podem, desse modo, ser exclusivamente atribuídas ao tratamento e não a qualquer inerência da composição genética endógena da planta.
[0134] As composições e métodos no presente documento podem fornecer um “traço agronômico aprimorado” ou “traço de importância agronômica” ou “traço de interesse agronômico” para uma planta, que pode incluir, porém sem limitação, o seguinte: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aprimoramento de rendimento, melhoria da saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento da capacidade fotossintética, melhoria nutricional, teor de proteína alterado, teor de óleo alterado, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada,
composição de óleo de semente alterada, composição de proteína de semente alterada, composição de nutriente de semente alterada, em comparação com uma planta de isolinhagem que compreende uma modificação derivada dos métodos ou composições no presente documento.
[0135] “Potencial de traço agronômico" pretende significar uma capacidade de um elemento de planta de exibir um fenótipo, de preferência um traço agronômico aprimorado, em algum ponto durante seu ciclo de vida, ou transmitir o dito fenótipo para outro elemento de planta com o qual o mesmo é associado na mesma planta.
[0136] Os termos "diminuído", "menos", "mais lento" e "aumentado", "mais rápido", "acentuado", "maior", conforme usado no presente documento, se referem a uma diminuição ou aumento em uma característica do elemento de planta modificado ou planta resultante em comparação com um elemento de planta não modificado ou planta resultante. Por exemplo, uma diminuição em uma característica pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos cerca de 60%, entre 60% e 70%, entre 70% e 80%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, entre 80% e 90%, pelo menos cerca de 90%, entre 90% e 100%, pelo menos 100%, entre 100% e 200%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400%, ou mais baixo que o controle não tratado e um aumento pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 35%,
pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos cerca de 60%, entre 60% e 70%, entre 70% e 80%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, entre 80% e 90%, pelo menos cerca de 90%, entre 90% e 100%, pelo menos 100%, entre 100% e 200%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais alto que o controle.
[0137] O significado das abreviações é da seguinte forma: “s" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "µl" significa microlitro(s), "ml" significa mililitro(s), "l" significa litro(s), "µm" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(s), "µmol" ou "umol" significa micromol(s), "g" significa grama(s), "µg" ou "ug" significa micrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp" significa par(es) de base e "kb" significa quilobase(s). Composições para Modificar o Genoma de uma Célula Alvo Fatores Morfogênicos
[0138] A presente revelação compreende métodos e composições para produzir modificações genômicas em um organismo com o uso de um agente de quebra de fita dupla e um fator morfogênico. Os fatores morfogênicos podem acentuar a taxa, eficiência e eficácia da modificação de polinucleotídeo alvejada por vários mecanismos, alguns dos quais estão relacionados à capacidade de estimular o crescimento de uma célula ou tecido, incluindo, porém sem limitação, promover a progressão através do ciclo celular, inibir a morte celular, tal como apoptose, estimular divisão celular e/ou estimular embriogênese. Os polinucleotídeos pode se situar em várias categorias, incluindo porém sem limitação, polinucleotídeos estimuladores de ciclo celular, polinucleotídeos de desenvolvimento, polinucleotídeos antiapoptose, polinucleotídeos hormonais, fatores de transcrição, ou construtos de silenciamento alvejados contra os repressores de ciclo celular ou fatores pró- apoptóticos. Os métodos e composições para transformação rápida e eficiente de plantas transformando-se as células de explantes de planta com um construto de expressão que compreende um nucleotídeo heterólogo que codifica um fator morfogênico são descritos na publicação de pedido de patente nº U.S, US2017/0121722 (publicada em 04 de maio de 2017).
[0139] Um fator morfogênico (gene ou proteína) pode estar envolvido no metabolismo de planta, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula-tronco, estimulação de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, maturação de embriões somática acelerada, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, ou uma combinação dos mesmos.
[0140] Em alguns aspectos, o fator morfogênico é uma molécula selecionada dentre uma ou mais das seguintes categorias: 1) polinucleotídeos estimuladores de ciclo celular incluindo genes replicase viral de planta, tais como RepA, ciclinas, E2F, prolifera, cdc2 e cdc25; 2) polinucleotídeos de desenvolvimento, tal como Lec1, família Kn1, WUSCHEL, Zwille, BBM, Aintegumenta (ANT), FUS3, e membros da família Knotted, tal como Kn1, STM, OSH1 e SbH1; 3) polinucleotídeos antiapoptose, tais como CED9, Bcl2, Bcl-X(L), Bcl-W, A1, McL-1, Mac1, Boo, e inibidores Bax; 4) polinucleotídeos hormonais, tais como IPT, TZS, e CKI-1; e 5) construtos de silenciamento alvejados contra repressores de ciclo celular, tais como Rb, CKl, proibitina, e wee1, ou estimuladores de apoptose, tais como APAF-1, bad, bax, CED-4, e caspase-3, e repressores de transições de desenvolvimento de planta, tais como os genes polycomb Pickle e WD incluindo FIE e Medea. Os polinucleotídeos podem ser silenciados por qualquer método conhecido, tal como antissenso, interferência de RNA, cossupressão, quimeroplastia ou inserção de transposon.
[0141] Em alguns aspectos, o gene morfogênico é um membro da família do gene WUS/WOX (WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5, ou WOX9) consulte as patentes U.S. 7.348.468 e 7.256.322 e as publicações de pedido de patente U.S. 20170121722 e 20070271628; Laux et al. (1996) Development 122:87-96; e Mayer et al. (1998) Cell 95:805-815; van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248; Dolzblasz et al., 2016, Mol. Plant 19:1028-39. A proteína Wuschel, projetada doravante como WUS, desempenha um papel importante na iniciação e na manutenção do maristema apical, que contém um agrupamento de células-tronco pluripotentes (Endrizzi, et al., (1996) Plant Journal 10:967 a 979; Laux, et al., (1996) Development 122:87 a 96; e Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). Espera-se que a modulação de WUS/WOX module a planta e/ou fenótipo de tecido de planta incluindo metabolismo de planta, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula-tronco, estimulação de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, maturação de embriões somática acelerada, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, ou uma combinação dos mesmos. WUS codifica uma proteína de homeodomínio nova que funciona, presumidamente, como um regulador de transcrição (Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). Acredita-se que a população de célula-tronco de maristemas de broto de Arabidopsis seja mantida por um ciclo regulatório entre os genes CLAVATA (CLV) que promovem a iniciação de órgãos e o gene WUS que é necessário para a identidade de célula-tronco, com os genes CLV que reprimem WUS no nível de transcrição, e sendo que a expressão de WUS é suficiente para induzir a identidade celular de maristema e a expressão do marcador de célula-tronco CLV3 (Brand, et al., (2000) Science 289:617 a 619; Schoof, et al., (2000) Cell 100:635 a 644). Expressão de WUS de Arabidopsis pode induzir células tronco em tecidos vegetativos, que podem se diferenciar em embriões somáticos (Zuo et al. (2002) Plant J 30:349 a 359). Também seria de interesse nesse sentido um gene MYB118 (consultar a Patente no U.S. 7.148.402), gene MYB115 (consultar Wang et al. (2008) Cell Research 224 a 235), um gene BABYBOOM (BBM; consultar Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14:1737 a 1749), ou um gene CLAVATA (consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 7.179.963).
[0142] Em algumas modalidades, o gene ou proteína morfogênica é um membro da família de proteínas AP2/ERF. A família de proteínas AP2/ERF é uma classe específica da planta de fatores de transcrição putativos que regulam uma ampla variedade de processos de desenvolvimento e são caracterizados pela presença de um domínio de ligação AP2 DNA que é previsto para formar uma alfa-hélice anfipática que se liga ao DNA (PFAM Accession PF00847). O domínio AP2 foi identificado primeiro em APETALA2, uma proteína Arabidopsis que regula a identidade de meristema, especificação do órgão floral, desenvolvimento de revestimento das sementes e expressão de gene homeótico floral. As proteínas AP2/ERF foram subdivididas em subfamílias distintas com base na presença de domínios conservados. inicialmente, a família foi dividida em duas subfamílias com base no número de domínios de ligação de DNA, com a subfamília ERF tendo um domínio de ligação de DNA, e a subfamília AP2 tendo 2 domínio de ligação de DNA. Visto que mais sequências foram identificadas, a família foi subsequentemente subdividida em cinco subfamílias: AP2, DREB, ERF, RAV e outras. (Sakuma et al. (2002) Biochem Biophys Res Comm 290:998-1009).
[0143] Membros da família de proteínas APETALA2 (AP2) funcionam em uma variedade de eventos biológicos, incluindo porém sem limitação, desenvolvimento, regeneração de planta, divisão celular, embriogênese, e morfogênico (consulte, por exemplo, Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol Chem 379:633-646; Saleh and Pagés (2003) Genetika 35:37-50 e Database of Arabidopsis Transciption Factors at daft.cbi.pku.edu.cn). A família AP2 inclui, porém sem limitação, AP2, ANT, Glossy15, AtBBM, BnBBM, e ODP2/BBM de maís.
[0144] Outros genes morfogênicos úteis na presente revelação incluem, porém sem limitação, polipeptídeos de Proteína de Desenvolvimento de Óvulo 2 (ODP2), e polipeptídeos relacionados, por exemplo, proteínas da família de proteínas Babyboom (BBM). Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Os polipeptídeos ODP2 da revelação contém dois domínios APETALA2 (AP2) preditos e são membros da família da proteína AP2 (Acesso PFAM PF00847). A família AP2 de fatores de transcrição putativa foi mostrada para regular uma ampla gama de processos de desenvolvimento e os membros da família são caracterizados pela presença de um domínio de ligação de AP2-DNA. Esse núcleo conservado é predito para formar uma hélice alfa anfipática que se liga ao DNA. O domínio AP2 foi identificado primeiro em APETALA2, uma proteína Arabidopsis que regula a identidade de meristema, especificação do órgão floral, desenvolvimento de revestimento das sementes e expressão de gene homeótico floral. O domínio AP2 foi encontrado, agora, em uma variedade de proteínas. Os polipeptídeos ODP2 compartilham homologia com vários polipeptídeos dentro da família AP2, por exemplo, consulte a Figura 1 do documento U.S. 8.420.893, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, fornece um alinhamento dos polipeptídeos ODP2 de maís e arroz com oito outras proteínas tendo dois domínios AP2. Uma sequência de consenso de todas as proteínas que aparecem no alinhamento do documento US 8420893 também é fornecida na Figura 1 no mesmo.
[0145] Em algumas modalidades, o fator morfogênico é um polipeptídeo babyboom (BBM), que é um membro da família AP2 de fatores de transcrição. A proteína BBM a partir de Arabidopsis (AtBBM) é preferencialmente expressa no embrião e sementes em desenvolvimento e foi mostrada para desempenhar uma função central na regulação de vias específicas do embrião. A superexpressão de AtBBM foi mostrada para induzir a formação espontânea de embriões somáticios e estruturas tipo cotilédone nas mudas. Consulte, Boutiler et al. (2002) The Plant Cell 14:1737-1749. A proteína BBM de maís também induz a embriogênese e promove transformação (Consulte, patente U.S. nº 7.579.529, que é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade). Desse modo, os polipeptídeos BBM estimulam a proliferação, induzem a embriogênese, acentuam a capacidade regenerativa de uma planta, acentuam a transformação e, conforme demonstrado no presente documento, aumentam as taxas de modificação de polinucleotídeo alvejadas, Conforme usado no presente documento "regeneração" se refere a uma resposta morfogênica que resulta na produção de novos tecidos, órgãos, embriões, plantas inteiras ou partes de plantas inteiras que são derivadas de uma única célula ou um grupo de células. A regeneração pode prosseguir indiretamente por meio de uma fase de calo ou diretamente, sem uma fase de calo interveniente. "Capacidade regenerativa" se refere à capacidade de uma célula vegetal sofrer regeneração.
[0146] Outros genes morfogênicos úteis na presente revelação incluem, porém, sem limitações, LEC1 (Lotan et al., 1998, Cell 93:1195 a 1205), LEC2 (Stone et al., 2008, PNAS 105:3151 a 3156; Belide et al., 2013, Plant Cell Tiss. Organ Cult 113:543 a 553), KN1/STM (Sinha et al.,
1993. Genes Dev 7:787 a 795), o gene IPT de Agrobacterium (Ebinuma e Komamine, 2001, In vitro Cell. Dev Biol – Plant 37:103 a 113), MONOPTEROS- DELTA (Ckurshumova et al., 2014, New Phytol. 204:556-566), o gene AV-6b de Agrobacterium (Wabiko and Minemura 1996, Plant Physiol. 112:939-951), a combinação dos genes IAA-h e IAA-m de Agrobacterium (Endo et al., 2002, Plant Cell Rep., 20:923-928), o gene SERK de Arabidopsis (Hecht et al., 2001, Plant Physiol. 127:803-816), o gene AGL15 de Arabidopsis (Harding et al., 2003, Plant Physiol. 133:653-663), e o gene FUSCA (Castle and Meinke, Plant Cell 6:25-41), e o gene PICKLE (Ogas et al., 1999, PNAS 96:13839-13844).
[0147] O fator morfogênico pode ser derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, o fator morfogênico é derivado de cevada, maís, painço, aveia, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana-de-açúcar, grama de crescimento rápido (switchgrass), triticale, gramado ou trigo.
[0148] O fator morfogênico pode ser derivado de uma dicotiledônea. O fator morfogênico pode ser derivado de couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, trevo, alfafa, fava, tomate, mandioca, soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.
[0149] A presente revelação abrange composições de fator morfogênico de polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou substancialmente purificado.
[0150] O fator morfogênico pode ser alterado de várias maneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes de sequência de aminoácidos das proteínas morfogênicas podem ser preparadas por mutações no DNA. Métodos de mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente nº U.S. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências citadas na mesma. A orientação quanto às substituições de aminoácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado ao presente documento a título de referência. As substituições conservativas, tal como a troca de um aminoácido por outro que tem propriedades similares, podem ser ideais.
[0151] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos ou polipeptídeos que têm homologia para um fator morfogênico conhecido e/ou que compartilham domínios funcionais conservados podem ser identificados por meio de triagem de bancos de dados de sequência com o uso de programas, tal como BLAST, ou com o uso de técnicas de hibridização de ácido nucleico padrão conhecidas na técnica, por exemplo conforme descrito em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, NY); Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY); e, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY).
[0152] Em alguns aspectos, o gene morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs:1-5, 11-16, 22, e 23-
47. Em alguns aspectos, a proteína morfogênica é selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs: 6-10, 17-21 e 48-73.
[0153] Em alguns aspectos, uma pluralidade de fatores morfogênicos é selecionada. Quando múltiplos fatores morfogênicos são usados, os polinucleotídeos que codificam cada um dos fatores podem estar presentes no mesmo cassete de expressão ou em cassetes de expressão separados. Igualmente, o polinucleotídeo(s) que codifica o fator(s) morfogênico e o polinucleotídeo que codifica o agente indutor de quebra de fita dupla podem se situar nos mesmos cassetes de expressão ou em cassetes de expressão diferentes. Quando dois ou mais fatores são codificados por cassetes de expressão separados, os cassetes de expressão podem ser fornecidos para o organismo de maneira simultânea ou sequencial.
[0154] Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é transiente. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é constitutiva. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é específica para um tipo de tecido ou célula particular. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é temporalmente regulada. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é regulada por uma condição ambiental, tal como temperatura, hora do dia, ou outro fator. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é estável. Em alguns aspectos, a expressão do fator morfogênico é controlada. A expressão controlada pode ser uma expressão pulsada do fator morfogênico para um período de tempo particular. Alternativamente, o fator morfogênico pode ser expresso em apenas algumas células transformadas e não expressa em outras. O controle da expressão do fator morfogênico pode ser obtido por uma variedade de métodos conforme revelado no presente documento. Agentes de Quebra de Fita Dupla
[0155] Um agente indutor de quebra de fita dupla (equivalentemente, "agente de quebra de fita dupla" ou "agente DSB") descrito no presente documento pode ser introduzido em um polinucleotídeo alvo para criar uma "associação funcional". Uma "associação funcional" significa que o agente DSB é introduzido em uma molécula de polinucleotídeo alvo, pode se ligar opcionalmente à mesma, e tem capacidade para produzir uma quebra de fita dupla na cadeia principal do polinucleotídeo alvo no qual é introduzido. A posição (localização em relação à sequência de polinucleotídeos) e natureza (extremidade cega, extremidade pegajosa, ou mista) da quebra de fita dupla é dependente do agente DSB exato usado.
[0156] O termo "agente indutor de quebra de fita dupla" conforme usado no presente documento se refere a qualquer composição que produza uma quebra de fita dupla em uma sequência alvo no genoma de um organismo. Os agentes indutores de quebra de fita dupla podem ser proteínas que incluem, porém sem limitação: endonucleases de restrição (consulte por exemplo Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 1:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, e Belfort et al., (2002) em Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC)), meganucleases (consulte por exemplo, WO 2009/114321; Gao et al. (2010) Plant Journal 1:176- 187), TAL nucleases efetoras ou TALENs (consulte, por exemplo, US20110145940, Christian, M., T. Cermak, et al. 2010, Quebra de fita dupla de DNA de alvejamento com nucleases efetoras TAL. Genetics 186(2): 757-61 e Boch et al., (2009), Science 326(5959): 1509-12), nucleases de dedo de zinco (consulte por exemplo Kim, Y. G., J. Cha, et al. (1996) "Hybrid restriction enzymes: dedo de zinco fusions to FokI cleavage"), e endonucleases CRISPR- Cas (consulte, por exemplo o pedido WO2007/025097, publicado em 1 de março de 2007).
[0157] Um “agente indutor de quebra de fita dupla geneticamente modificado” se refere a qualquer agente indutor de quebra de fita dupla que seja geneticamente modificado (modificado ou derivado) de sia forma nativa para reconhecer e induzir especificamente uma quebra de fita dupla no sítio de reconhecimento desejado. Desse modo, um agente indutor de quebra de fita dupla geneticamente modificado pode ser derivado de uma nuclease de ocorrência natural nativa ou pode ser artificialmente criado ou sintetizado. A modificação da nuclease pode ser tão pequena quanto um nucleotídeo. Em algumas modalidades, o agente indutor de quebra de fita dupla geneticamente modificado induz uma quebra de fita dupla em um sítio de reconhecimento, em que o sítio de reconhecimento não era uma sequência que seria reconhecida por um agente indutor de quebra de fita dupla nativo (não geneticamente modificado ou não modificado) . A produção de uma quebra de fita dupla em um sítio de reconhecimento ou outro DNA pode ser chamada no presente documento de “corte” ou “clivagem” do sítio de reconhecimento ou outro DNA.
[0158] Em alguns aspectos, o agente DSB pode ser fornecido como um polipeptídeo, que pode ser purificado e substancialmente isento de outras moléculas, ou pode estar em associação com um ou mais componentes heterólogos. Em uma modalidade, o agente DSB é um polipeptídeo e um polinucleotídeo. Em uma modalidade, o agente DSB é uma proteína de fusão, que compreende dois ou mais domínios, em que um domínio pode efetuar a clivagem de um polinucleotídeo alvo. Em uma modalidade, o agente DSB é uma pluralidade de polipeptídeos.
[0159] Em alguns aspectos, o agente DSB pode ser fornecido por meio de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de agente DSB. Tal codificação de polinucleotídeo pode ser opcionalmente modificada para substituir códons que têm uma frequência de uso mais alta em uma célula hospedeira ou organismo particular, em comparação com a sequência de polinucleotídeos de ocorrência natural. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o agente DSB pode ser modificado para substituir códons que têm uma frequência de uso mais alta em uma planta de maís ou soja, em comparação com a sequência de polinucleotídeos de ocorrência natural. Endonucleases de Restrição
[0160] As endonucleases incluem endonucleases de restrição que clivam o DNA em sítios específicos sem danificar as bases. As endonucleases de restrição incluem endonucleases do Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV, que incluem, ainda, subtipos. Nos sistemas do Tipo I e Tipo III, tanto as atividades de metilase como de restrição estão contidas em um único complexo.
[0161] As endonucleases de restrição do Tipo I e Tipo III reconhecem sítios de reconhecimento específicos, porém clivam tipicamente em uma posição variável do sítio de reconhecimento, que pode ser centenas de pares de bases para longe do sítio de reconhecimento. No sistemas do Tipo II a atividade de restrição é independente de qualquer atividade de metilase, e a clivagem ocorrer tipicamente em sítios específicos dentro ou próximo ao sítio de reconhecimento. A maioria das enzimas do Tipo II corta as sequências palindrômicas, entretanto as enzimas do Tipo IIa reconhecem os sítios de reconhecimento não palindrômicos e cliva fora do sítio de reconhecimento, as enzimas do Tipo IIb cortam as sequências duas vezes com ambos os sítios fora do sítio de reconhecimento, e as enzimas do Tipo IIs reconhecem um sítio de reconhecimento assimétrico e clivam em um lado e a uma distância definida de cerca de 1 a 20 nucleotídeos do sítio de reconhecimento. As enzimas de restrição do Tipo IV alvejam o DNA metilado. As enzimas de restrição são adicionalmente descritas e classificadas, por exemplo no banco de dados REBASE (Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 1:418-20, Roberts et al.,
(2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, e Belfort et al., (2002) em Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC)). Meganucleases
[0162] A "meganuclease" se refere a uma endonuclease de homing, que como as endonucleases de restrição, se ligam e cortam em um sítio de reconhecimento específico, entretanto os sítios de reconhecimento para meganucleases são tipicamente mais longos, cerca de 18 bp ou mais. Em algumas modalidades da invenção, a meganuclease foi geneticamente modificada (ou modificada) para cortar uma sequência de reconhecimento endógena específica, em que a sequência alvo endógena antes de ser cortada pelo agente indutor de quebra de fita dupla geneticamente modificado não era uma sequência que poderia ter sido reconhecida por uma endonuclease nativa (não geneticamente modificada ou não modificada).
[0163] Um “polipeptídeo meganuclease" se refere a um polipeptídeo que tem atividade de meganuclease e, desse modo é capaz de produzir uma quebra de fita dupla na sequência de reconhecimento.
[0164] As meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base nos motivos de sequência conservados, as famílias são LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys box. Esses motivos participam na coordenação de íons metálicos e hidrólise de ligações fosfodiéster. As HEases são notáveis por seus longos sítios de reconhecimento e por tolerar alguns polimorfismos de sequência nos seus substratos de DNA. A convenção de nomenclatura para meganucleases é similar à convenção para outras endonucleases de restrição. Meganucleases também são caracterizadas pelo prefixo F-, I- ou PI- para enzimas codificadas por fases de leitura aberta independentes, íntrons e inteínas, respectivamente. Por exemplo, a meganuclease codificada por gene intron-, inteina- e independente de
Saccharomyces cerevisiae é indicada como I-SceI, PI-SceI, e F-SceII, respectivamente. Os domínios, estrutura e função de meganuclease são conhecidos, consulte por exemplo, Guhan e Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; e Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764. Em alguns exemplos, uma variante de ocorrência natural e/ou meganuclease derivada geneticamente modificada é usada. Os métodos para modificar a cinética, interações de cofator, expressão, condições ideais, e/ou especificidade de sítio de reconhecimento, e triagem para atividade são conhecidos, consulte por exemplo, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; e WO2004031346.
[0165] Exemplos de meganucleases incluem, porém sem limitação: I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I- CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I- PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I- CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I- HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I- NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I- PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-
SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I- UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI- ThyI, PI-TliI, PI-TliII, ou quaisquer variantes funcionais ou fragmentos dos mesmos. Argonautas
[0166] Os RNAs não codificantes pequenos são um tipo de contribuinte para a regulação de genes, e exigem uma classe de exclusiva de proteínas chamadas Argonautas. As proteínas Argonauta são módulos de ligação altamente especializados que podem ligar pequenos RNAs não codificantes e controlar a síntese de proteínas, afetar a estabilidade de RNA mensageiro e ainda participar da produção de uma nova classe de RNAs, RNAs de interação com Piwi. Argonautas coordenam eventos de silenciamento de gene a jusante interagindo-se com outros fatores de proteína.
[0167] Primeiro identificadas em plantas e subsequentemente descobertas como ubíquas em muitos organismos, as proteínas Argonauta são definidas pela presença de domínios PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) e PIWI. Elas são evolutivamente conservadas e podem ser filogeneticamente subdivididas na subfamília Ago e na subfamília Piwi. As proteínas Ago são expressas de modo ubíquo e se ligam ao siRNAs ou miRNAs para orientar o silenciamento de gene pós-transcricional por desestabilização do mRNA ou por repressão traducional. A expressão de proteínas Piwi é principalmente restrita à linhagem germinativa e as proteínas Piwi se associam a piRNAs para facilitar o silenciamento de elementos genéticos móveis.
[0168] Muitas proteínas Argonauta se ligam aos guias de RNA para clivar o RNA estranho, enquanto outras são capazes de clivar o plasmídeo e o DNA genômico. Argonauta Natronobacterium gregoryi usa guias de DNA fosforilados 5' (em vez dos guias de RNA empregados por Cas9 ou Cpf1), sem exigir uma sequência PAM, para remover aleatoriamente 1 a 20 nucleotídeos do sítio de clivagem especificado pelo gDNA. Nucleases Efetoras TAL (TALENs)
[0169] As nucleases efetoras TAL são uma classe de nucleases específicas da sequência que podem ser usadas para efetuar quebras de fita dupla em sequências alvo específicas no genoma de uma planta ou outros organismo. As nucleases efetoras TAL são criadas fundindo-se o efetor (TAL) do tipo ativador transcricional nativo ou geneticamente modificado, ou a parte funcional do mesmo, ao domínio catalítico de uma endonuclease, tal como, por exemplo, FokI. O domínio de ligação de DNA efetor TAL modular exclusivo permite o projeto de proteínas potencialmente com qualquer especificidade de reconhecimento de DNA. Desse modo, os domínios de ligação de DNA das nucleases efetoras TAL podem ser geneticamente modificados para reconhecer sítios alvo de DNA específico e desse modo, usados para efetuar quebras de fita dupla nas sequências alvo desejadas. Consulte, o documento WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS
10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; e Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143–148; todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Endonucleases de Dedo de Zinco
[0170] Os dedos de zinco são domínios estruturais encontrados nas proteínas eucarióticas que controlam a transcrição de gene. O domínio de dedos de zinco da classe Cys2His2 de ZFPs é um motivo de polipeptídeo estrutural dobrado ao redor de um íon de zinco ligado, e tem uma sequência da forma —X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-5-His-X4- (em que X é qualquer aminoácido). O dedo de zinco é um domínio de enovelamento diferente que usa um íon de zinco para estabilizar o empacotamento de uma β- folha antiparalela contra uma α-hélice. Há uma grande variação de sequência nos aminoácidos designados como X, entretanto, os dois resíduos de histidina e cisteína de consenso são invariáveis. Embora a maioria das ZFPs tenha uma estrutura tridimensional similar, elas se ligam aos polinucleotídeos que têm uma ampla faixa de sequências de nucleotídeos. A ligação do domínio de dedos de zinco é dependente da sequência dos polinucleotídeos diferentes daqueles que entram diretamente em contato com aminoácidos dentro do domínio de dedos de zinco.
[0171] As nuclease de dedo de zinco (ZFNs) são enzimas de restrição artificiais geradas por meio da fusão de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. Os domínios de dedo de zinco podem ser geneticamente modificados para alvejar as sequências DNA desejadas específicas e isso permite que as nucleases de dedo de zinco alvejem sequências exclusivas dentro dos genomas complexos. Aproveitando- se da vantagem do maquinário de reparo de DNA endógeno, esses reagentes podem ser usados para alterar precisamente os genomas de organismos superiores.
[0172] As nucleases de dedo de zinco são endonucleases sítio-específicas que compreendem dois domínios de proteína: um domínio de ligação de DNA, que compreende uma pluralidade de repetições de dedo de zinco individuais que reconhecem, cada uma, entre 9 e 18 pares de base, e um domínio de clivagem de DNA que compreende um domínio de nuclease (tipicamente Fok1). O domínio de clivagem se dimeriza a fim de clivar o DNA;
portanto, um par de ZFNs é necessário para alvejar polinucleotídeos alvo não palindrômicos.
[0173] Endonucleases Cas
[0174] Conforme usado no presente documento, o termo "gene Cas" se refere a um gene que é geralmente acoplado, associado ou próximo ou na vizinhança dos loci CRISPR de flanqueamento.
[0175] Loci "CRISPR" (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) se refere a determinados loci genéticos que codificam componentes de sistemas de clivagem de DNA, por exemplo, usados por células bacterianas e arqueais para destruir o DNA estranho (Horvath and Barrangou, 2010, Science 327:167-170; WO2007025097, publicado em 01 de março de 2007). Um locus CRISPR pode consistir em uma matriz CRISPR, que compreende repetições diretas curtas (repetições CRISPR) separadas por sequências de DNA variáveis curtas (chamadas espaçadores), que podem ser flanqueadas por genes Cas diversos (associados à CRISPR).
[0176] Endonucleases Cas, como proteínas efetoras únicas ou e um complexo efetor com outros componentes, desenrolam o dúplex de DNA na sequência alvo e opcionalmente clivam pelo menos uma fita de DNA, conforme mediado pelo reconhecimento da sequência alvo por um polinucleotídeo (tal como, porém sem limitação, um crRNA ou RNA guia) que está em complexo com a proteína efetora Cas. Tal reconhecimento e corte de uma sequência-alvo por uma endonuclease Cas ocorre tipicamente se o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM, do inglês “protospacer-adjacent motif”) correto estiver localizado na ou adjacente à extremidade 3’ da sequência-alvo de DNA.
[0177] Muitas endonucleases Cas que foram descritas até a presente podem reconhecer sequências PAM específicas (WO2016186953, publicado em 24 de novembro de 2016, WO2016186946, publicado em 24 de novembro de 2016, e Zetsche B et al. 2015. Cell 163, 1013) e clivar o DNA alvo em uma posição específica.
[0178] As endonucleases Cas podem ser capazes de formar um complexo com um polinucleotídeo guia (por exemplo, RNA guia ou gRNA) que tem capacidade para reconhecer, se ligar a, e opcionalmente cortar, desenrolar ou clivar toda ou parte de uma sequência alvo. Em alguns aspectos, o complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas é capaz de introduzir uma quebra de fita dupla em um polinucleotídeo alvo. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo guia compreende exclusivamente RNA, exclusivamente DNA, uma molécula quimérica que compreende tanto DNA como RNA, e/ou compreende um nucleotídeo quimicamente modificado. O polinucleotídeo guia (por exemplo, RNA guia) pode ser um único RNA guia (sgRNA) que tem capacidade para se ligar a uma sequência no polinucleotídeo alvo.
[0179] Alternativamente, uma endonuclease Cas no presente documento pode carecer de atividade de clivagem ou incisão de DNA , porém ainda pode ser ligar especificamente a uma sequência alvo de DNA quando complexada com um componente de RNA adequado. (Consulte também o pedido de patente U.S. US20150082478, publicado em 19 de março de 2015 e US20150059010 publicado em 26 de fevereiro de 2015).
[0180] As endonucleases Cas podem ocorrer efetores individuais (sistemas CRISPR Classe 2 ) ou como parte de complexos efetores maiores (sistemas CRISPR Classe I ).
[0181] As endonucleases Cas incluem, porém sem limitação, endonucleases Cas identificadas a partir dos seguintes sistemas: Classe 1,
Classe 2, Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV, Tipo V e Tipo VI. Em alguns aspectos, a endonuclease Cas é Cas3 (um recurso de sistemas de Classe 1 tipo I), Cas9 (um recurso de sistemas de Classe 2 tipo II) ou Cas12 (Cpf1) (um recurso de sistemas de Classe 2 tipo V).
[0182] Endonucleases Cas e proteínas efetoras podem ser usadas para edição de genoma alvejado (por meio de quebras e incisões de fita dupla simplex e multiplex) e regulação de genoma alvejada (por meio do ancoramento de domínios efetores epigenéticos à proteína Cas ou sgRNA). Uma endonuclease Cas também pode ser geneticamente modificada para funcionar como uma recombinase orientada por RNA, e através de ancoramentos de RNA poderia servir como um arcabouço para a montagem de complexos de multiproteína e ácido nucleico (Mali et al., 2013, Nature Methods Vol. 10: 957 a 963).
[0183] Uma endonuclease Cas, proteína efetora, variante funcional , ou um fragmento da mesma, para uso nos métodos revelados, pode ser isolada de uma fonte nativa, ou de uma fonte recombinante onde a célula hospedeira geneticamente modificada é modificada para expressar a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína. Alternativamente, a proteína Cas pode ser produzida com o uso de sistemas de expressão de proteína sem célula, ou ser sinteticamente produzida. As nucleases Cas efetoras podem ser isoladas e introduzidas em uma célula heteróloga, ou podem ser modificadas de sua forma nativa para exibir um tipo diferente de magnitude de atividade do que seria exibido em sua fonte nativa. Tais modificações incluem, porém sem limitação: fragmentos, variantes, substituições, deleções e inserções.
[0184] Os fragmentos e variantes de endonucleases Cas e proteínas efetoras Cas podem ser obtidos por meio de métodos, tal como a mutagênese sítio-dirigida e construção sintética. Os métodos para medir a atividade de endonuclease são bem conhecidos na técnica, tal como, porém sem limitação, o documento WO2013166113, publicado em 07 de novembro 2013, WO2016186953, publicado em 24 de novembro de 2016, e WO2016186946, publicado em 24 de novembro de 2016.
[0185] Alguns usos para os sistemas de RNA guia/endonuclease Cas foram descritos (consulte por exemplo: o documento US20150082478 A1, publicado em 19 de março de 2015, WO2015026886 publicado em 26 de fevereiro de 2015, e US20150059010, publicado em 26 de fevereiro de 2015) e incluem, porém sem limitação modificar ou substituir as sequências de nucleotídeos de interesse (tal como um elemento regulador), inserção de polinucleotídeos de interesse, knockout de gene, knockin de gene, modificação de sítios de splicing e/ou introdução de sítios de splicing alternados, modificações das sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de interesse, fusões de aminoácidos e/ou proteínas, e silenciamento de gene por expressão de uma repetição invertida em um gene de interesse. Polinucleotídeos de Interesse
[0186] Polinucleotídeos de interesse são descritos adicionalmente no presente documento e incluem polinucleotídeos que refletem os mercados comerciais e interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento da cultura. As culturas e mercados de interesse mudam, e à medida que nações em desenvolvimento abrem os mercados mundiais, novas culturas e tecnologias surgirão também. Além disso, à medida que a compreensão de traços e características agrônomas, tais como rendimento e heterose, aumenta, a escolha de genes para engenharia genética mudará em conformidade.
[0187] Categorias gerais de polinucleotídeos de interesse incluem, por exemplo, genes de interesse envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como as quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, tais como proteínas de choque térmico. Os polinucleotídeos de interesse mais específicos incluem, porém sem limitação, genes envolvidos em rendimento de cultura, qualidade de grão, teor de nutriente de cultura, qualidade e quantidade de amido e carboidrato assim como aqueles que afetar o tamanho de miolo, carregamento de sacarose, qualidade e quantidade de proteína, fixação e/ou utilização de nitrogênio, composição de ácido graxo e óleo, genes que codificam proteínas que conferem resistência a estresse abiótico (tal como seca, nitrogênio, temperatura, salinidade, metais tóxicos ou elementos-traço ou aqueles que conferem resistência a toxinas, tais como pesticidas e herbicidas), genes que codificam proteínas que conferem resistência a estresse biótico (tal como ataques por fungos, vírus, bactérias, insetos e nematoides e desenvolvimento de doenças associadas a esses organismos).
[0188] Traços importantes no campo de agronomia, tais como teor de óleo, amido e proteína podem ser geneticamente alterados além do uso de métodos tradicionais de melhoramento. As modificações incluem aumentar o teor de ácido oleico, óleos saturados e insaturados, aumentar níveis de lisina e enxofre, fornecer aminoácidos essenciais e também a modificação e amido. As modificações de proteína Hordotionina são descritas nas patentes nº U.S.
5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389.
[0189] As sequências de polinucleotídeos de interesse podem codificar as proteínas envolvidas no fornecimento de resistência à doença ou praga. Por “resistência a doença” ou “resistência a praga” entende-se que as plantas evitam os sintomas nocivos que resultam das interações planta- patógeno. Os genes de resistência a praga podem codificar resistência a pragas que têm grande perda de rendimento, tais como lagarta da raiz, lagarta-rosca, broca europeia do milho e semelhantes. Os genes de resistência a doença e resistência a inseto, tais como lisozimas ou cecropinas, para proteção antibacteriana, ou proteínas, tais como defensinas, glucanases ou quitinases, para proteção antifúngica, ou endotoxinas de Bacillus thuringiensis, inibidores de protease, colagenases, lectinas ou glicosidases para controlar nematódeos ou insetos são todos exemplos de produtos gênicos úteis. Os genes que codificam traços de resistência a doenças incluem genes de desintoxicação, tal como contra fumonisina (patente U.S. nº 5,792,931); genes de avirulência (avr) e resistência a doenças (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); e similares. Os genes de resistência a inseto podem codificar resistência a pragas que têm grande perda de rendimento, tais como lagarta da raiz, lagarta-rosca, broca europeia do milho e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensis (Patentes nº U.S. 5.366.892; 5.747.450;
5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109); e semelhantes.
[0190] Uma “proteína de resistência a herbicida” ou uma proteína que resulta da expressão de uma “molécula de ácido nucleico que codifica resistência a herbicida” inclui proteínas que conferem numa célula a capacidade para tolerar uma concentração mais alta de um herbicida do que células que não expressam a proteína, ou para tolerar uma determinada concentração de um herbicida durante um período de tempo mais longo do que células que não expressam a proteína. Os traços de resistência a herbicida podem ser introduzidos nas plantas por codificação de genes para resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS, também chamada de aceto-hidroxiácido sintase, AHAS), em particular os herbicidas do tipo sulfonilureia (UK: sulphonylurea), codificação de genes para resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tal como fosfofinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar), glifosato (por exemplo, o gene EPSP sintase e o gene GAT), inibidores de HPPD (por exemplo, o gene HPPD) ou outros tais genes conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes nº U.S. 7.626.077, 5.310.667, 5.866.775, 6.225.114, 6.248.876,
7.169.970, 6.867.293 e 9.187.762. O gene bar codifica a resistência ao basta herbicida, o gene nptII codifica a resistência aos antibióticos canamicina e geneticina, e os mutantes de gene ALS codificam a resistência ao herbicida clorsulfurona.
[0191] Além disso, reconhece-se que o polinucleotídeo de interesse também pode compreender sequências antissenso complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (mRNA) para uma sequência gênica alvo de interesse. Os nucleotídeos antissenso são construídos para se hibridizarem com o mRNA correspondente. As modificações das sequências antissenso podem ser feitas desde que as sequências se hibridizem e interfiram com a expressão do mRNA correspondente. Dessa maneira, as construções antissenso que têm 70%, 80% ou 85% de identidade de sequência, em relação às sequências antissenso correspondentes, podem ser usadas. Além disso, as porções dos nucleotídeos antissenso podem ser usadas para desorganizar a expressão do gene alvo. Em geral, sequências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais podem ser usadas.
[0192] Além disso, o polinucleotídeo de interesse também pode ser usado na orientação senso para suprimir a expressão de genes endógenos em plantas. Os métodos para suprimir a expressão gênica em plantas com o uso de polinucleotídeos na orientação senso são conhecidos na técnica. Os métodos envolvem geralmente transformar plantas com um construto de DNA que compreende um promotor que direciona a expressão em uma planta operacionalmente ligada a pelo menos uma porção de uma sequência de nucleotídeos que corresponde à transcrição do gene endógeno. Tipicamente, tal sequência de nucleotídeos tem identidade de sequência substancial com a sequência da transcrição do gene endógeno, geralmente maior que cerca de 65% de identidade de sequência, cerca de 85% de identidade de sequência, ou maior que cerca de 95% de identidade de sequência. Consulte as patentes nº U.S.5.283.184 e 5.034.323.
[0193] O polinucleotídeo de interesse também pode ser um marcador fenotípico. Um marcador fenotípico é triável ou é um marcador selecionável que inclui marcadores visuais e marcadores selecionáveis quer seja um marcador positivo ou negativo selecionável. Qualquer marcador fenotípico pode ser usado. Especificamente, um marcador selecionável ou rastreável compreende um segmento de DNA que permite que alguém identifique, ou selecione uma molécula ou uma célula que compreende o mesmo, frequentemente sob condições particulares. Esses marcadores podem codificar uma atividade, tal como, mas sem limitação, a produção de RNA, peptídeo ou proteína, ou podem fornecer um sítio de ligação a RNA, peptídeos, proteínas, composições ou compostos inorgânicos e orgânicos e semelhantes.
[0194] Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém sem limitação, segmentos de DNA que compreendem sítios de enzima de restrição; segmentos de DNA que codificam produtos que fornecem resistência, de outro modo, contra compostos tóxicos que incluem antibióticos, tais como, espectinomicina, ampicillina, canamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT)); segmentos de DNA que codificam produtos que, de outro modo, carecem da célula receptora (por exemplo, genes tRNA, marcadores auxotróficos); segmentos de DNA que codificam produtos que podem ser prontamente identificados (por exemplo, marcadores fenotípicos, tal como β-galactosidase,
GUS; proteínas fluorescentes (tal como proteína verde fluorescente (GFP), ciano (CFP), amarelo (YFP), vermelho (RFP), e azul (BFP), (Shaner et al., 2005, Nature Methods 2:905-909)), e proteínas de superfície celular); a geração de novos sítios iniciadores para PCR (por exemplo, a justaposição de duas sequências de DNA não anteriormente justapostas), a inclusão de sequências de DNA não atuadas ou atuadas por uma endonuclease de restrição ou outro agente de modificação de DNA, produto químico, etc.; e, a inclusão de uma sequência de DNA necessária para uma modificação específica (por exemplo, metilação) que permite sua identificação.
[0195] Marcadores de seleção adicionais incluem genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como sulfonilureias, glufosinato de amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Consulte por exemplo, Acetolactase sintase (ALS) para resistência a sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidina sulfonamidas, pirimidinilsalicilatos e sulfonilaminocarbonil-triazolinonas (Shaner and Singh, 1997, Herbicide Activity: Toxicol Biochem Mol Biol 69-110); 5- enolpiruvilxiquimato-3-fosfato resistente a glifosato (EPSPS) (Saroha et al. 1998, J. Plant Biochemistry & Biotechnology Vol 7:65-72);
[0196] Os polinucleotídeos de interesse incluem genes que podem ser empilhados ou usados em combinação com outros traços, tais como, porém sem limitação, resistência a herbicida ou qualquer outro traço descrito no presente documento. Os polinucleotídeo de interesse e/ou traços podem ser empilhados em conjunto em um locus de traço complexo conforme descrito no documento US20130263324, publicado em 03 de outubro de 2013 e no documento WO/2013/112686, publicado em 01 de agosto de 2013.
[0197] Um polipeptídeo de interesse inclui qualquer proteína ou polipeptídeo que seja codificado por um polinucleotídeo de interesse descrito no presente documento.
[0198] São proporcionados adicionalmente métodos para identificar pelo menos uma célula vegetal que compreende em seu genoma um polinucleotídeo de interesse integrado no sítio alvo. Uma variedade de métodos está disponível para identificar aquelas células vegetais com inserção no genoma no ou próximo ao sítio alvo. Tais métodos podem ser vistos como análise direta de uma sequência alvo para detectar qualquer mudança na sequência alvo, incluindo, mas sem limitação, métodos de PCR, métodos de sequenciamento, digestão com nuclease, Southern blots e qualquer combinação dos mesmos. Consulte, por exemplo, o documento US20090133152, publicado em 21 de maio de 2009. O método também compreende recuperar uma planta da célula vegetal que compreende um polinucleotídeo de interesse integrado ao seu genoma. A planta pode ser estéril ou fértil. Reconhece-se que qualquer polinucleotídeo de interesse pode ser fornecido, integrado no genoma da planta no sítio alvo e expresso numa planta. Sítios Alvo
[0199] O sítio alvo pode fazer parte do genoma nativo do organismo ou integrado no mesmo ou pode estar presente em um polinucleotídeo epissomal. A sequência alvo genômica pode ser qualquer região de um cromossomo, e pode se situar ou não em uma região que codifica uma proteína ou RNA. O sítio alvo pode ser nativo à célula ou heterólogo. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode ter sido transgenicamente inserida no genoma do organismo, e pode se situar em qualquer região de qualquer cromossomo, incluindo um cromossomo artificial ou satélite, e pode ou não se situar em uma região que codifica uma proteína ou RNA. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo de sítio alvo é de origem nuclear (genômico), e pode ser endógeno à célula ou pode ser heterólogo (por exemplo, um transgene introduzido). Em alguns aspectos, o polinucleotídeo de sítio alvo é um plasmídeo ou vetor que existe dentro da célula ou foi introduzido. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo de sítio alvo existe no citoplasma da célula (extranuclear). Em alguns aspectos, o polinucleotídeo de sítio alvo existe em outra organela da célula (por exemplo, plastídeo ou mitocôndria). É reconhecido que a célula ou o organismo pode compreender múltiplos sítios alvo, que podem se situar em um múltiplos loci dentro ou ao longo dos cromossomos. Múltiplas manipulações independentes de cada sítio alvo no organismo podem ser realizadas com o uso dos métodos atualmente revelados.
[0200] O sítio alvo compreende pelo menos uma sequência de reconhecimento. O comprimento da sequência de sítio de reconhecimento pode variar, e inclui, por exemplo, sequências que têm pelo menos cerca de 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 80, 90, 100, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o sítio de reconhecimento é de um comprimento suficiente para estar presente em um genoma de um organismo apenas uma vez. Em algumas modalidades, o sítio de reconhecimento é palindrômico, ou seja, a sequência em uma fita lê o mesmo na direção oposta à fita complementar. O agente indutor de quebra de fita dupla reconhece a sequência de reconhecimento e introduz uma quebra de fita dupla na ou próximo à sequência de reconhecimento. O sítio de incisão/clivagem pode se situar dentro da sequência que é especificamente reconhecida pelo agente ou o sítio de incisão/clivagem pode se situar fora da sequência que é especificamente reconhecida pelo agente. Em algumas modalidades, a quebra de fita dupla é introduzida cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, ou mais nucleotídeos para longe da sequência de reconhecimento.
[0201] Em algumas modalidades, a clivagem ocorre nas posições de nucleotídeo imediatamente opostas umas às outras para produzir um corte de extremidade cega ou, em modalidades alternativas, os cortes são desalinhados para produzir saliências de fita simples, também chamadas de “extremidades pegajosas” que podem ser saliências 5’ ou saliências 3'. A sequência de reconhecimento pode ser endógena (nativa) ou heteróloga à célula vegetal. Quando o sítio de reconhecimento é uma sequência endógena, ele pode ser reconhecido por um agente indutor de quebra de fita dupla de ocorrência natural ou nativo. Alternativamente, uma sequência de reconhecimento endógena pode ser reconhecida e/ou ligada por um agente indutor de quebra de fita dupla modificado ou geneticamente modificado projetado ou selecionado para reconhecer especificamente a sequência de reconhecimento endógena para produzir uma quebra de fita dupla. Elementos de Expressão
[0202] Qualquer polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas ou outro componente de sistema CRISPR revelado no presente documento pode ser funcionalmente vinculado a um elemento de expressão heterólogo, para facilitar a transcrição ou regulação em uma célula hospedeira. Tais elementos de expressão incluem, porém sem limitação: promotor, líder, íntron e terminador. Os elementos de expressão podem ser "mínimos" – significando uma sequência mais curta derivada de uma fonte nativa, que ainda funciona como um regulador ou modificador de expressão. Alternativamente, um elemento de expressão pode ser "otimizado" – o que significa que sua sequência de polinucleotídeos foi alterada de seu estado nativo a fim de funcionar com uma característica mais desejável em uma célula hospedeira particular (por exemplo, porém sem limitação, um promotor bacteriano pode ser "otimizado para mais" para aprimorar sua expressão em plantas de milho). Alternativamente, um elemento de expressão pode ser “sintético” – o que significa que ele é projetado in silico e sintetizado para uso em uma célula hospedeira. Os elementos de expressão sintéticos podem ser totalmente sintéticos, ou parcialmente sintéticos (compreendendo um fragmento de uma sequência de polinucleotídeos de ocorrência natural).
[0203] Foi mostrado que certos promotores podem direcionar a síntese de RNA a uma taxa maior que outros. Esses são chamados de "promotores fortes". Certos outros promotores foram mostrados como direcionando a síntese de RNA em níveis maiores apenas em tipos de células ou tecidos particulares e são muitas vezes denominados de "promotores específicos quanto a tecido" ou "promotores preferenciais para tecido", se os promotores direcionarem a síntese de RNA, de preferência, em certos tecidos, mas também em outros tecidos em níveis reduzidos.
[0204] Um promotor vegetal inclui um promotor que pode iniciar a transcrição em uma célula vegetal. Para uma análise de promotores de plantas, consulte, Potenza et al., 2004, In vitro Cell Dev Biol 40:1-22; Porto et al., 2014, Molecular Biotechnology (2014), 56(1), 38-49.
[0205] Os promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S de núcleo (Odell et al., (1985) Nature 313:810-2); actina de arroz (McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163-71); ubiquitina (Christensen et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-32); promotor ALS (patente U.S. nº 5.659.026) e similares.
[0206] Os promotores preferenciais para tecido podem ser utilizados para direcionar maior expressão dentro de um tecido vegetal particular.
Os promotores preferenciais para tecido incluem, por exemplo, o documento WO2013103367 publicado em 11 de julho de 2013, Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen et al., (1997) Mol Gen Genet 254:337-43; Russell et al., (1997) Transgenic Res 6:157-68; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol 112:1331-41; Van Camp et al., (1996) Plant Physiol 112:525-35; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol 112:513-524; Lam, (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-96; e Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J 4:495-505. Os promotores preferenciais para folha incluem, por exemplo, Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65; Kwon et al., (1994) Plant Physiol 105:357-67; Yamamoto et al., (1994) Plant Cell Physiol 35:773-8; Gotor et al., (1993) Plant J 3:509-18; Orozco et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1129-38; Matsuoka et al., (1993) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
EUA 90:9586-90; Simpson et al., (1958) EMBO J 4:2723-9; Timko et al., (1988) Nature 318:57-8. Os promotores preferenciais para raiz incluem, por exemplo, Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18 (gene de glutamina sintase específico da raiz de soja); Miao et al., (1991) Plant Cell 3:11-22 (glutamina sintase citosólica (GS)); Keller and Baumgartner, (1991) Plant Cell 3:1051-61 (elemento de controle específico da raiz no gene GRP 1.8 gene da vagem francesa); Sanger et al., (1990) Plant Mol Biol 14:433-43 (promotor específico da raiz de manopina sintase de A. tumefaciens (MAS)); Bogusz et al., (1990) Plant Cell 2:633-41 (promotores específicos da raiz isolados de Parasponia andersonii e Trema tomentosa); Leach and Aoyagi, (1991) Plant Sci 79:69-76 (genes indutores da raiz rolC e rolD de A. rhizogenes); Teeri et al., (1989) EMBO J 8:343-50 (genes TR1' e TR2' induzidos por ferimento de Agrobacterium); promotor de gene VfENOD-GRP3 (Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72); e promotor rolB (Capana et al.,
(1994) Plant Mol Biol 25:681-91; gene faseolina (Murai et al., (1983) Science 23:476-82; Sengopta-Gopalen et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:3320- 4). Consulte também, as patentes nº U.S. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363;
5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179.
[0207] Os promotores preferenciais para semente incluem tanto promotores específicos para semente ativos durante o desenvolvimento de semente, bem como promotores de germinação de semente ativos durante a germinação de semente. Consulte, Thompson et al., (1989) BioEssays 10:108. Os promotores preferenciais para sementes incluem, porém sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maís); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase); e, por exemplo, aqueles revelados no documento WO2000011177, publicado em 02 de março de 2000 e na patente nº U.S. 6.225.529. Para dicotiledôneas, os promotores preferenciais para semente incluem, mas não são limitados a, β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina e semelhantes. Para monocotiledôneas, os promotores preferenciais para semente incluem, porém sem limitação, zeína de 15 kDa de maís, zeína de 22 kDa, zeína gama de 27 kDa, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, oleosina e nuc1. Consulte também, o documento WO2000012733, publicado em 09 de março de 2000, onde os promotores preferenciais para semente dos genes END1 e END2 são revelados.
[0208] Os promotores (regulados) induzíveis por produto químico podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma célula procariótica e eucariótica ou organismo através da aplicação de um regulador químico exógeno. O promotor pode ser um promotor induzível por produto químico, em que a aplicação do produto químico induz a expressão de gene, ou um promotor repressível por produto químico, em que a aplicação do produto químico reprime a expressão de gene. Os promotores induzíveis por produto químico incluem, porém sem limitação, o promotor In2-2 de maís, ativado por protetores de herbicida de benzeno sulfonamida (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), o promotor GST de maís (GST-II-27, WO1993001294, publicado em 21 de janeiro de 1993), ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a de tabaco (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7) ativado por ácido salicílico. Outros promotores regulados por produto químico incluem promotores responsivos a esteroides (consulte, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide (Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88:10421-5; McNellis et al., (1998) Plant J 14:247-257); promotores induzíveis por tetraciclina e promotores repressíveis à tetraciclina (Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; patentes nº U.S. 5.814.618 e 5.789.156).
[0209] Os promotores induzíveis por patógeno induzidos após a infecção por um patógeno incluem, porém sem limitação àqueles que regulam a expressão de proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc.
[0210] Um promotor induzível por estresse inclui o promotor RD29A (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91). Um indivíduo com habilidade comum na técnica está familiarizado com os protocolos para simular condições de estresse, como estresse osmótico por seca, estresse salino e estresse de temperatura e para avaliar a tolerância ao estresse de plantas que foram submetidas a condições de estresse de ocorrência natural ou simuladas.
[0211] Outro exemplo de um promotor induzível útil nas células vegetais no promotor ZmCAS1, é descrito no documento US20130312137, publicado em 21 de novembro de 2013.
[0212] Novos promotores de vários tipos úteis em células vegetais estão sendo constantemente descobertos; vários exemplos podem ser encontrados na compilação por Okamuro e Goldberg, (1989) In The Biochemistry of Plants, Vol. 115, Stumpf and Conn, eds (New York, NY: Academic Press), páginas 1 a 82.
[0213] Exemplos de promotores úteis para a expressão de fatores morfogênicos nas células incluem, porém sem limitação: promotor de vírus do mosaico da escrofulária (FMV), promotor FMV melhorado, promotor MMV melhorado, promotor de vírus do mosaico da couve flor (CaMV), promotor CaMV melhorado, promotor 35S, promotor 35S melhorado, promotores mínimos, promotor PLTP de planta, promotor de Ubiquitina de planta, promotor de proteína de choque térmico da planta, promotor de Nopalina Sintase (nos), promotor de Fator de Alongamento de planta (EF), aqueles descritos na publicação de pedido de patente U.S2017/0121722 (publicado em 04 de maio de 2017), aqueles descritos na patente U.S. nº 8.710.206. Construtos de Polinucleotídeo
[0214] Uma ou mais das composições de polinucleotídeo no presente documento podem ser fornecida para uma célula como parte de um construto, plasmídeo ou vetor de expressão. O dito construto pode compreender um ou mais cassetes de expressão para transcrição na célula.
[0215] O cassete de transcrição incluirá na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação de transcrição e tradução, uma sequência de DNA de interesse, e uma região de terminação de transcrição e tradução funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de uma outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do gene inibidor de proteinase da batata
(PinII) ou sequências a partir do Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação da nopalina sintetase, octopina sintase e opalina sintase. Consulte também, Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141- 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
[0216] Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter sequências líder 5' na construção do cassete de expressão. Tais sequências líder podem atuar para acentuar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5’ de encefalomiocardite) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., e Moss, B. (1989) PNAS EUA, 86: 6126-6130); líderes de picornavírus, por exemplo, Líder TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Allison et al. (1986); líder MDMV (Vírus do Mosaico Anão do Milho); Virology, 154: 9 a 20), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., e P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90 a 94; líder não traduzido de MARNA de proteína de revestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., e Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622-625; líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273; líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lornmel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382 a 385). Consulte também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965 a 968; e sequências não traduzidas 5ʹ de maís endógenas. Outros métodos conhecidos para intensificar a tradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, e semelhantes.
[0217] Os cassetes de expressão podem conter um ou mais de um gene ou sequência de ácidos nucleicos a ser transferido ou expresso na planta transformada. Desse modo, cada sequência de ácidos nucleicos será operacionalmente ligada a sequências reguladoras 5' e 3'. Alternativamente, múltiplos cassetes de expressão podem ser fornecidos. Modificações de um Polinucleotídeo Alvo em uma Célula
[0218] De acordo com os métodos atualmente revelados, fatores morfogênicos são usados para acentuar a modificação de um polinucleotídeo de sítio alvo dentro de uma célula que é efetuada pela atividade de agente DSB. Em alguns aspectos, o fator morfogênico e o agente DSB podem ser introduzidos na mesma célula. Em alguns aspectos, o fator morfogênico e o agente DSB podem ser, cada um, introduzidos em uma célula diferente. Em alguns aspectos, o fator morfogênico pode ser endógeno à célula recebe o agente DSB. Em alguns aspectos, o fator morfogênico pode ser endógeno a uma célula diferente daquela que recebe o agente DSB. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é uma molécula heteróloga à célula dentro da qual a mesma é introduzida. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido em uma partícula. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido como parte de um vetor de transformação. Em alguns aspectos, o fator morfogênico é fornecido como uma sequência fora das bordas de T-DNA em um vetor de transformação. Em alguns aspectos, a introdução do fator morfogênico na célula resulta na associação transiente do fator morfogênico com a célula. Em alguns aspectos, a introdução do fator morfogênico na célula resulta no fator morfogênico que se torna estavelmente integrado no genoma da célula receptora.
[0219] Os polinucleotídeos guias, endonucleases Cas, modelos de modificação de polinucleotídeo, DNAs doadores, sistemas de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas revelados no presente documento, e qualquer combinação dos mesmos, que compreendem adicionalmente um ou mais fatores morfogênicos, compreendem adicionalmente um ou mais polinucleotídeo(s) de interesse, podem ser introduzidos em uma célula. As células incluem, porém sem limitação, células humanas, não humanas, de animais, bacterianas, fúngicas, de inseto, levedura, levedura não convencional e vegetais, assim como plantas e sementes produzidas pelos métodos descritos no presente documento.
[0220] As técnicas de clonagem molecular e DNA recombinante padrão usadas no presente documento são bem conhecidas na técnica e são descritas em mais detalhes em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Os métodos de transformação são bem conhecidos pelos versados na técnica e são descritos infra.
[0221] Vetores e construções incluem plasmídeos circulares e polinucleotídeos lineares que compreendem um polinucleotídeo de interesse e, opcionalmente, outros componentes que incluem ligantes, adaptadores, reguladores ou análise. Em alguns exemplos, um sítio de reconhecimento e/ou sítio alvo pode ser compreendido dentro de um íntron, sequência de codificação, 5' UTRs, 3' UTRs e/ou regiões reguladoras.
[0222] A introdução de um fator morfogênico em uma célula pode acentuar a taxa de integração alvejada de um polinucleotídeo de interesse. Nesses métodos, pelo menos um fator morfogênico é introduzido em uma célula e um agente indutor de quebra de fita dupla é introduzido, juntamente com um cassete de transferência que compreende o polinucleotídeo de interesse. Conforme usado no presente documento, um "cassete de transferência" se refere a um polinucleotídeo que pode ser introduzido em uma célula, em que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de interesse que deve ser inserido em um sítio alvo de uma célula. A introdução de uma quebra de fita dupla pode resultar na integração do polinucleotídeo de interesse através da junção de extremidade não homóloga ou se o cassete de transferência compreender pelo menos uma região de homologia para o sítio alvo, o polinucleotídeo de interesse pode ser integrado através da recombinação homóloga.
[0223] Um agente indutor de quebra de fita dupla polinucleotídeo pode ser fornecido em cassetes de expressão para expressão em uma célula de interesse. O cassete pode incluir sequências reguladoras 5' e 3' operacionalmente ligadas a um polinucleotídeo de endonuclease ou variante funcional ou fragmento funcional do mesmo. “Operacionalmente ligado" se destina a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (isto é, um promotor) é um enlace funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usados para se referir à união de duas regiões de codificação de proteína, por ligado de modo operável entende-se que as regiões de codificação estão no mesmo quadro de leitura. O cassete pode compreender adicionalmente pelo menos um gene adicional para ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o gene (ou genes) adicional pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo de endonuclease ou variante funcional ou fragmento funcional do mesmo para se situar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode compreender adicionalmente um ou mais genes marcadores selecionáveis.
[0224] Em alguns aspectos, o agente DSB compreende uma endonuclease Cas que se situa em uma combinação funcional com um polinucleotídeo guia, que é capaz de reconhecer, se ligar a, e clivar ou cortar um polinucleotídeo alvo. Em alguns aspectos, a combinação funcional é um complexo de ribonucleoproteína.
[0225] Em uma modalidade, os construtos de expressão da revelação compreendem um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um gene Cas (ou planta otimizada, incluindo um gene endonuclease Cas descrito no presente documento) e um promotor operacionalmente ligado a uma RNA guia da presente revelação. O promotor tem capacidade de acionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada em uma célula/organismo procariótica ou eucariótica. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos que codificam o gene Cas e o RNA guia se situam no mesmo vetor de transformação. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos que codificam o gene Cas e o RNA guia são fornecidos em vetores diferentes. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos que codificam o gene Cas e o RNA guia são fornecidos para a célula alvo simultaneamente. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos que codificam o gene Cas e o RNA guia são fornecido para a célula alvo sequencialmente.
[0226] A modificação de sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo guia, domínio VT e/ou domínio CER pode ser selecionada dentre, porém sem limitação, o grupo que consiste em um cap 5', uma cauda poliadenilada 3', uma sequência riboswitch, uma sequência de controle de estabilidade, uma sequência que forma um duplex de dsRNA, uma modificação ou sequência que alveja o polinucleotídeo guia para uma localização subcelular, uma modificação ou sequência que fornece rastreamento, uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas, um Ácido Nucleico
Bloqueado (LNA), um nucleotídeo 5-metil dC, um nucleotídeo 2,6- Diaminopurina, um nucleotídeo 2'-Fluoro A, um nucleotídeo 2'-Fluoro U; um nucleotídeo 2'-O-Metil RNA, uma ligação de fosforotioato, ligação a uma molécula de colesterol, ligação a uma molécula de polietilenoglicol, ligação a uma molécula espaçadora 18, uma ligação covalente 5' a 3', ou qualquer combinação dos mesmos. Essas modificações podem resultar em pelo menos um recurso benéfico adicional, em que o recurso benéfico adicional é selecionado dentre o grupo de uma estabilidade modificada ou regulada, um alvejamento subcelular, rastreamento, um marcador fluorescente, um sítio de ligação para uma proteína ou complexo de proteínas, afinidade de ligação modificada para sequência alvo de complementaridade, resistência modificada para degradação celular e permeabilidade celular aumentada.
[0227] Um método de expressão de componentes de RNA, tal como gRNA em células eucarióticas para realizar o alvejamento de DNA mediado por Cas9 tem sido usar os promotores de RNA polimerase III (Pol III), que permitem a transcrição de RNA com as extremidades 5’ e 3’ precisamente definidas não modificadas (DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343; Ma et al., Mol. Ther. Nucleic Acids 3:e161). Essa estratégia foi aplicada de maneira bem-sucedida em células de várias espécies diferentes incluindo maís e soja (US20150082478, publicado em 19 de março de 2015). Os métodos para expressão de componentes de RNA que não têm um cap 5' foram descritos (WO2016/025131, publicado em 18 de fevereiro de 2016).
[0228] Em alguns aspectos, o complexo de endonuclease Cas e polinucleotídeo guia efetua uma quebra de fita dupla em um polinucleotídeo alvo, que resulta em uma inserção, deleção ou modificação de base única (SDN1). Em alguns aspectos, o complexo efetua uma quebra de fita dupla em um polinucleotídeo alvo, e um polinucleotídeo doador pode alterar a sequência do alvo (SDN2). Em alguns aspectos, o complexo efetua uma quebra de fita dupla em um polinucleotídeo alvo, e novo material genético pode ser adicionado no sítio de quebra (SDN3).
[0229] As quebras de fita dupla de DNA parecem ser um fator eficaz para estimular as vias de recombinação homóloga (Puchta et al. (1995) Plant Mol Biol 28:281-92; Tzfira and White (2005) Trends Biotechnol 23:567-9; Puchta (2005) J Exp Bot 56:1-14). Com o uso de uma indução de quebra de DNA, um aumento de recombinação homóloga de duas a nove vezes foi observado entre as repetições de DNA homólogo artificialmente construídas em plantas (Puchta et al. (1995) Plant Mol Biol 28:281-92). Em protoplastos de maís, experimentos com moléculas de DNA lineares demonstraram recombinação homóloga acentuada entre plasmídeos (Lyznik et al., (1991) Mol Gen Genet 230:209-18).
[0230] O reparo dirigido por homologia (HDR) é um mecanismo nas células para reparar quebras de DNA de fita dupla e de fita simples. O reparo dirigido por homologia inclui recombinação homóloga (HR) e hibridização de fita simples (SSA) (Lieber. 2010 Annu. Rev. Biochem. 79:181 a 211). A forma mais comum de HDR é chamada de recombinação homóloga (HR), que tem os requisitos de homologia de sequência mais longa entre o DNA doador e receptor. Outras formas de HDR incluem anelamento de fita simples (SSA) e replicação induzida por quebra, e essas exigem homologia de sequência mais curta em relação à HR. O reparo dirigido por homologia nas incisões (quebras de fita simples) pode ocorrer por meio de um mecanismo distinto de HDR nas quebras de fita dupla (Davis and Maizels, PNAS (0027- 8424), 111 (10), páginas E924 a E932).
[0231] A alteração do genoma de uma célula procariótica ou eucariótica ou célula de organismo, por exemplo, através da recombinação homóloga (HR), é uma ferramenta poderosa para a engenharia genética. A recombinação homóloga foi demonstrada em plantas (Halfter et al., (1992) Mol Gen Genet 231:186-93) e insetos (Dray and Gloor, 1997, Genetics 147:689-99). A recombinação homóloga também foi realizada em outros organismos. Por exemplo, pelo menos 150 a 200 bp de homologia foram necessários para recombinação homóloga no protozoário parasita Leishmania (Papadopoulou and Dumas, (1997) Nucleic Acids Res 25:4278-86). Nos fungos filamentosos Aspergillus nidulans, a substituição de gene foi realizada com tão pouco quanto 50 bp de homologia de flanqueamento (Chaveroche et al., (2000) Nucleic Acids Res 28:e97). A substituição de gene alvejada também demonstrou a Tetrahymena thermophila ciliada (Gaertig et al., (1994) Nucleic Acids Res 22:5391-8). Em mamíferos, a recombinação homóloga foi mais bem-sucedida no camundongo usando as linhagens de célula-tronco embrionária pluripotentes (ES) que podem ser cultivadas em cultura, transformadas, selecionadas e introduzidas em um embrião de camundongo (Watson et al., 1992, Recombinant DNA, 2ª Ed., Scientific American Books distribuído junto à WH Freeman & Co.).
[0232] Vários métodos e composições podem ser empregados para obter uma célula ou organismo que tem um polinucleotídeo de interesse inserido em um sítio alvo para uma Cas endonuclease. Tais métodos podem empregar recombinação homóloga (HR) para fornecer a integração do polinucleotídeo de interesse no sítio alvo. Em um método descrito no presente documento, um polinucleotídeo de interesse é introduzido na célula de organismo através de um construto de DNA doador.
[0233] O construto de DNA doador compreende adicionalmente uma primeira e uma segunda regiões de homologia que flanqueiam o polinucleotídeo de interesse. A primeira e a segunda regiões de homologia do DNA doador compartilham homologia com uma primeira e uma segunda região genômica, respectivamente, presente ou flanqueando o sítio alvo do genoma de célula ou organismo.
[0234] Em alguns aspectos, o DNA doador é fornecido para célula alvo no mesmo construto de transformação que o polinucleotídeo que codifica a Cas9 e o RNA guia, ou no mesmo construto que os polinucleotídeos que codificam tanto a Cas9 como o RNA guia. Em alguns aspectos, o DNA doador é fornecido para a célula alvo em um construto de transformação diferente do polinucleotídeo que codifica a Cas9 e o RNA guia.
[0235] O DNA doador pode ser ligado ao polinucleotídeo guia. Os DNAs doadores ancorados podem permitir a colocalização de DNA alvo e doador, útil na edição de genoma, inserção de gene, e regulação de genoma alvejado, e também pode ser útil no alvejamento de células pós-mitóticas onde espera-se que a função do maquinário HR endógeno sejam altamente diminuída (Mali et al., 2013, Nature Methods Vol. 10: 957 a 963).
[0236] A quantidade de homologia ou identidade de sequência compartilhada por um alvo e um polinucleotídeo doador pode variar e inclui comprimentos e/ou regiões totais tendo valores de número inteiro integral unitário nas faixas de cerca de 1a 20 bp, 20 a 50 bp, 50 a 100 bp, 75 a 150 bp, 100 a 250 bp, 150 a 300 bp, 200 a 400 bp, 250 a 500 bp, 300 a 600 bp, 350 a 750 bp, 400 a 800 bp, 450 a 900 bp, 500 a 1.000 bp, 600 a 1.250 bp, 700 a 1.500 bp, 800 a 1.750 bp, 900 a 2.000 bp, 1 a 2,5 kb, 1,5 a 3 kb, 2 a 4 kb, 2,5 a 5 kb, 3 a 6 kb, 3,5 a 7 kb, 4 a 8 kb, 5 a 10 kb, até e incluindo o comprimento total do sítio alvo. Essas faixas incluem cada número inteiro dentro da faixa, por exemplo, a faixa de 1 a 20 bp inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 bp. A quantidade de homologia também pode ser descrita como percentual de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento alinhado dos dois polinucleotídeos que inclui identidade de sequência percentual de cerca de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% e 99%, 99%, entre 99% e 100%, ou 100%. A homologia suficiente inclui qualquer combinação de comprimento de polinucleotídeo, percentual de identidade de sequência global, e regiões opcionalmente conservadas de nucleotídeos contíguos ou percentual de identidade de sequência local, por exemplo a homologia suficiente pode ser descrita como uma região de 75 a 150 bp e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma região do locus alvo. Homologia suficiente também pode ser descrita pela capacidade prevista de dois polinucleotídeos sofrerem hibridização específica sob condições de alta estringência, consulte, por exemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds (1994) Current Protocols, (Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.); e, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Acid Probes, (Elsevier, New York).
[0237] A similaridade estrutural entre uma dada região genômica e a região de homologia correspondente encontrada no DNA doador pode ser qualquer grau de identidade de sequência que permita que a recombinação homóloga ocorra. Por exemplo, a quantidade de homologia ou identidade de sequência compartilhada pela "região de homologia" do DNA doador e a "região genômica" do genoma de organismo pode ser de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, de modo que as sequências sofram recombinação homóloga
[0238] A região de homologia no DNA doador pode ter homologia para qualquer sequência que flanqueia o sítio alvo. Embora, em alguns casos, as regiões de homologia compartilhem homologia de sequência significativa à sequência genômica que flanqueia imediatamente o sítio-alvo, é reconhecido que as regiões de homologia podem ser projetadas para ter homologia suficiente a regiões que podem estar mais 5' ou 3' ao sítio-alvo. As regiões de homologia podem também ter homologia com um fragmento do sítio- alvo juntamente com regiões genômicas a jusante.
[0239] Em uma modalidade, a primeira região de homologia compreende adicionalmente um primeiro fragmento do sítio alvo e a segunda região de homologia compreende um segundo fragmento do sítio alvo, em que o primeiro e o segundo fragmentos são diferentes.
[0240] O processo para editar uma sequência genômica que combina modelos de DSB e modificação compreende geralmente: introduzir em uma célula hospedeira um agente indutor de DSB, ou um ácido nucleico que codifica um agente indutor de DSB, que reconhece uma sequência alvo na sequência cromossômica e é capaz de induzir um DSB na sequência genômica, e pelo menos um modelo de modificação de polinucleotídeo que compreende pelo menos uma alteração de nucleotídeo quando comparado com a sequência de nucleotídeos a ser editada. O molde polinucleotídico de modificação pode compreender adicionalmente sequências nucleotídicas que flanqueiam a pelo menos uma alteração nucleotídica, em que as sequências flanqueadoras são substancialmente homólogas à região cromossômica que flanqueia a DSB. A edição de genoma com o uso de agentes indutores de DSB, tais como complexos de Cas-gRNA, foi descrita, por exemplo no documento nº US20150082478, publicado em 19 de março de 2015, WO2015026886 publicado em 26 de fevereiro de 2015, WO2016007347, publicado em 14 de janeiro de 2016, e WO/2016/025131 publicado no dia 18 de fevereiro de 2016.
[0241] Em alguns aspectos, a endonuclease Cas faz parte de Complexos de Cascata Pronta para Clivagem (Cleavage Ready Cascade (crCascade)). Após a caracterização do RNA guia e sequência PAM, os componentes do complexo de Cascata pronta para clivagem (crCascade) e RNA CRISPR associado (crRNA) podem ser utilizados para modificar o DNA cromossômico em outros organismos incluindo plantas. Para facilitar a expressão e a localização nuclear (para células eucarióticas), os genes que compreendem crCascade podem ser otimizados conforme descrito no documento WO2016186953, publicado em 24 de novembro de 2016 e, então entregues para as células como cassetes de expressão de DNA por métodos conhecidos na técnica. Os componentes necessários para compreender um complexo crCascade ativo também podem ser entregues como RNA com ou sem modificações que protegem o RNA contra degradação ou como mRNA com cap ou sem cap (Zhang, Y. et al., 2016, Nat. Commun. 7:12617) ou complexos de proteína Cas - polinucleotídeo guia (WO2017070032, publicado em 27 de abril de 2017), ou qualquer combinação dos mesmos. Adicionalmente, uma parte ou partes do complexo crCascade e crRNA podem ser expressa a partir de um construto de DNA enquanto outros componentes são entregues como RNA com ou sem modificações que protegem o RNA contra degradação ou como mRNA com cap ou sem cap (Zhang et al., 2016, Nat. Commun. 7:12617) ou complexos de proteína Cas - polinucleotídeo guia (WO2017070032, publicado em 27 de abril de 2017) ou qualquer combinação dos mesmos. Para produzir crRNAs in-vivo, elementos derivados de tRNA também podem ser usados para recrutar RNAses endógenos para clivar as transcrições de crRNA em formas maduras capazes de guiar o complexo crCascade até seu sítio alvo de DNA, conforme descrito, por exemplo, no documento WO2017105991, publicado em 22 de junho de 2017. Os complexos crCascade nickase podem ser utilizados separadamente ou em conjunto para gerar múltiplas incisões de DNA em uma ou ambas as fitas de DNA. Além disso, a atividade de clivagem da endonuclease Cas pode ser desativada alterando-se os resíduos catalíticos chave em seu domínio de clivagem (Sinkunas, T. et al., 2013, EMBO J. 32:385- 394) que resulta em uma helicase guiada por RNA que pode ser usada para acentuar o reparo dirigido por homologia, induzir a ativação transcricional ou remodelar as estruturas de DNA locais. Além disso, a atividade dos domínios de clivagem Cas e helicase podem ser knockedout e usados em combinação com outro corte de DNA, incisão de DNA, ligação de DNA, ativação transcricional, repressão transcricional, remodelagem de DNA, desaminação de DNA, desenrolamento de DNA, acentuação de recombinação de DNA, integração de DNA, inversão de DNA e agentes de reparo de DNA.
[0242] A direção transcricional do tracrRNA para o sistema CRISPR-Cas (se estiver presente) e outros componentes do sistema CRISPR- Cas (tal como um domínio de alvejamento variável, repetição crRNA, alça, antirrepetição) pode ser deduzida conforme descrito no documento WO2016186946, publicado em 24 de novembro de 2016, e no documento WO2016186953, publicado em 24 de novembro de 2016.
[0243] Conforme descrito no presente documento, uma vez que o requisito de RNA guia adequado é estabelecido, as preferências PAM para cada novo sistema revelado no presente documento podem ser examinadas. Se o complexo de Cascata pronta para clivagem (crCascade) resulta na degradação da biblioteca PAM randomizada, o complexo crCascade pode ser convertido em uma nickase desabilitando-se a atividade helicase dependente de ATPase através da mutagênese de resíduos críticos ou através da montagem da reação na ausência de ATP conforme anteriormente descrito (Sinkunas, T. et al., 2013, EMBO J. 32:385-394). Duas regiões de randomização PAM separadas por dois alvos protoespaçadores podem ser utilizadas para gerar uma quebra de DNA de fita dupla que pode ser capturada e sequenciada para examinar as sequências PAM que suportam a clivagem pelo respectivo complexo crCascade.
[0244] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para modificar um sítio alvo no genoma de uma célula, sendo que o método compreende introduzir em uma célula pelo menos um PGEN descrito no presente documento e identificar pelo menos uma célula que tem uma modificação no dito alvo, em que a modificação no dito sítio alvo é selecionada dentre o grupo que consiste em (i) uma substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, e (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0245] O nucleotídeo a ser editado pode estar localizado dentro ou fora de um sítio alvo reconhecido e clivado por uma endonuclease Cas. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação nucleotídica não é uma modificação num sítio alvo reconhecido e clivado por uma endonuclease Cas. Em outra modalidade, existem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 900 ou 1000 nucleotídeos entre o pelo menos um nucleotídeo a ser editado e o sítio alvo genômico.
[0246] Um knockout pode ser produzido por um indel (inserção ou deleção de bases de nucleotídeo em uma sequência de DNA alvo através de NHEJ), ou por remoção específica da sequência que reduz ou destrói completamente a função da sequência no ou próximo ao sítio de alvejamento.
[0247] Uma mutação alvejada induzida por polinucleotídeo guia/endonuclease Cas pode ocorrer em uma sequência de nucleotídeos que se situa dentro ou fora de um sítio alvo genômico que é reconhecido e clivado pela endonuclease Cas.
[0248] O método para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula pode ser um método sem o uso de um marcador selecionável exógeno restaurando-se a função para um produto de gene não funcional.
[0249] Em uma modalidade, a invenção descreve um método para modificar um sítio alvo no genoma de uma célula, sendo que o método compreende introduzir em uma célula pelo menos um PGEN descrito no presente documento e pelo menos um DNA doador, em que o dito DNA doador compreende um polinucleotídeo de interesse, e opcionalmente, compreende adicionalmente identificar pelo menos uma célula que o dito polinucleotídeo de interesse integrou no ou próximo ao dito sítio alvo.
[0250] Em um aspecto, os métodos revelados no presente documento podem empregar recombinação homóloga (HR) para fornecer a integração do polinucleotídeo de interesse no sítio alvo.
[0251] Vários métodos e composições podem ser empregados para produzir uma célula ou organismo que tem um polinucleotídeo de interesse inserido em um sítio alvo através da atividade de um componente de sistema CRISPR-Cas descrito no presente documento. Em um método descrito no presente documento, um polinucleotídeo de interesse é introduzido na célula de organismo através de um construto de DNA doador. Conforme usado no presente documento, "DNA doador” é um construto de DNA que compreende um polinucleotídeo de interesse a ser inserido no sítio alvo de uma endonuclease Cas. O construto de DNA doador compreende adicionalmente uma primeira e uma segunda regiões de homologia que flanqueiam o polinucleotídeo de interesse. A primeira e a segunda regiões de homologia do DNA doador compartilham homologia com uma primeira e uma segunda região genômica, respectivamente, presente ou flanqueando o sítio alvo do genoma de célula ou organismo.
[0252] O DNA doador pode ser ligado ao polinucleotídeo guia. Os DNAs doadores ancorados podem permitir a colocalização de DNA alvo e doador, útil na edição de genoma, inserção de gene, e regulação de genoma alvejado, e também pode ser útil no alvejamento de células pós-mitóticas onde espera-se que a função do maquinário HR endógeno sejam altamente diminuída (Mali et al., 2013, Nature Methods Vol. 10: 957 a 963).
[0253] A quantidade de homologia ou identidade de sequência compartilhada por um alvo e um polinucleotídeo doador pode variar e inclui comprimentos e/ou regiões totais tendo valores de número inteiro integral unitário nas faixas de cerca de 1a 20 bp, 20 a 50 bp, 50 a 100 bp, 75 a 150 bp, 100 a 250 bp, 150 a 300 bp, 200 a 400 bp, 250 a 500 bp, 300 a 600 bp, 350 a 750 bp, 400 a 800 bp, 450 a 900 bp, 500 a 1.000 bp, 600 a 1.250 bp, 700 a 1.500 bp, 800 a 1.750 bp, 900 a 2.000 bp, 1 a 2,5 kb, 1,5 a 3 kb, 2 a 4 kb, 2,5 a 5 kb, 3 a 6 kb, 3,5 a 7 kb, 4 a 8 kb, 5 a 10 kb, até e incluindo o comprimento total do sítio alvo. Essas faixas incluem cada número inteiro dentro da faixa, por exemplo, a faixa de 1 a 20 bp inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 bp. A quantidade de homologia também pode ser descrita como percentual de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento alinhado dos dois polinucleotídeos que inclui identidade de sequência percentual de cerca de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou
100%. A homologia suficiente inclui qualquer combinação de comprimento de polinucleotídeo, percentual de identidade de sequência global, e regiões opcionalmente conservadas de nucleotídeos contíguos ou percentual de identidade de sequência local, por exemplo a homologia suficiente pode ser descrita como uma região de 75 a 150 bp e tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma região do locus alvo. Homologia suficiente também pode ser descrita pela capacidade prevista de dois polinucleotídeos sofrerem hibridização específica sob condições de alta estringência, consulte, por exemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds (1994) Current Protocols, (Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.); e, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, (Elsevier, New York).
[0254] As moléculas de DNA epissomal também podem ser ligadas à quebra de fita dupla, por exemplo, integração de T-DNAs nas quebra cromossômicas de fita dupla (Chilton and Que (2003) Plant Physiol 133:956-65; Salomon and Puchta (1998) EMBO J. 17:6086-95). Uma vez que a sequência ao redor das quebras de fita dupla é alterada, por exemplo, por atividades de exonuclease envolvidas na maturação de quebras de fita dupla, as vias de conversão de genes pode restaurar a estrutura original se uma sequência homóloga estiver disponível, tal como um cromossomo homólogo em células somáticas não divisoras, ou uma cromátide irmã após a replicação de DNA (Molinier et al. (2004) Plant Cell 16:342-52). As sequências de DNA ectópicas e/ou epigênicas também podem servir como um modelo de reparo de DNA para recombinação homóloga (Puchta, (1999) Genetics 152:1173 a 1181).
[0255] Em uma modalidade, a revelação compreende um método para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula, sendo que o método compreende introduzir em pelo menos uma PGEN descrita no presente documento, e um modelo de modificação de polinucleotídeo, em que o dito modelo de modificação de polinucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo modificação da dita sequência de nucleotídeos, e opcionalmente compreende adicionalmente selecionar pelo menos uma célula que compreende a sequência de nucleotídeos editada.
[0256] O sistema de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas pode ser usado em combinação com pelo menos um modelo de modificação de polinucleotídeo para permitir a edição (modificação) de uma sequência de nucleotídeos genômica de interesse. (Consulte também US20150082478, publicado em 19 de março de 2015 e WO2015026886, publicado em 26 fevereiro de 2015).
[0257] Os polinucleotídeo de interesse e/ou traços podem ser empilhados em conjunto em um locus de traço complexo conforme descrito no documento WO2012129373, publicado em 27 de setembro de 2012, e no documento WO2013112686, publicado em 01 de agosto de 2013. O sistema de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas descrito no presente documento fornece um sistema eficiente para gerar quebras de fita dupla e permitir que traços sejam empilhados em um locus de traço complexo.
[0258] Um sistema de polinucleotídeo guia/Cas conforme descrito no presente documento, que medeia o alvejamento de gene, pode ser usado nos métodos para direcionar a inserção de gene heteróloga e/ou para produzir loci de traço complexo que compreendem múltiplos genes heterólogos de uma forma similar, conforme revelado no documento WO2012129373, publicado em 27 de setembro de 2012, em que em vez de usar um agente indutor de quebra de fita dupla para introduzir um gene de interesse, um sistema de polinucleotídeo guia/Cas conforme revelado no presente documento é usado. Por meio da inserção de transgenes independentes dentro de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 2, ou ainda 5 centimorgans (cM) uns dois outros, os transgenes podem ser melhorados como um locus genético único (consulte, por exemplo, o documento US20130263324, publicado em 03 de outubro de 2013 ou WO2012129373, publicado em 14 de março de 2013). Após selecionar uma planta que compreende um transgene, as plantas que compreendem (pelo menos) um transgene podem ser cruzadas para formar um F1 que compreende ambos os transgenes. Na progênie desses F1 (F2 ou BC1), 1/500 da progênie teria os dois transgenes diferentes recombinados no mesmo cromossomo. O locus complexo pode ser, então, cultivado como locus genético único com ambos os traços transgênicos. Esse processo pode ser repetido para empilhar o número de traços desejado.
[0259] Os usos adicionais para os sistemas de RNA guia/endonuclease Cas foram descritos (consulte por exemplo: o documento US20150082478, publicado em 19 de março de 2015, WO2015026886, publicado em 26 de fevereiro de 2015, US20150059010, publicado em 26 de fevereiro de 2015, WO2016007347 publicado em 14 de janeiro de 2016, e pedido PCT WO2016025131, publicado em 18 de fevereiro de 2016) e incluem, porém sem limitação modificar ou substituir as sequências de nucleotídeos de interesse (tal como um elemento regulador), inserção de polinucleotídeos de interesse, knockout de gene, knockin de gene, modificação de sítios de splicing e/ou introdução de sítios de splicing alternados, modificações das sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de interesse, fusões de aminoácidos e/ou proteínas, e silenciamento de gene por expressão de uma repetição invertida em um gene de interesse.
[0260] As características resultantes das composições de edição de gene e métodos descritos no presente documento podem ser avaliadas.
Os intervalos cromossômicos que se correlacionam com um fenótipo ou traço de interesse podem ser identificados.
A variedade dos métodos bem conhecidos na técnica está disponível para identificar intervalos cromossômicos.
Os limites de tais intervalos cromossômicos são traçados para abranger marcadores que serão ligados ao gene que controla o traço de interesse.
Em outras palavras, o intervalo cromossômico é traçado de modo que qualquer marcador que se situe dentro desse intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem os limites do intervalo) possa ser usado como um marcador para um traço particular.
Em uma modalidade, o intervalo cromossômico compreende pelo menos um QTL e, adicionalmente, pode compreender, de fato, mais de um QTL.
A estreita proximidade de múltiplos QTLs no mesmo intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador particular com um QTL particular, já que um marcador pode demonstrar ligação a mais de um QTL.
Por outro lado, por exemplo, se dois marcadores em estreita proximidade mostrarem cossegregação com o traço fenotípico desejado, algumas vezes não está claro de cada um desses marcadores identifica o mesmo QTL ou dois QTL diferentes.
O termo "locus de traços quantitativos" ou "QTL" se refere a uma região de DNA que é associada à expressão diferencial de um traço fenotípico em pelo menos um fundo genético, por exemplo, em pelo menos uma população de melhoramento.
A região do QTL abrange ou é estritamente ligada ao gene ou genes que afetam o traço em questão.
Um "alelo de um QTL" pode compreender múltiplos genes ou outros fatores genéticos dentro de uma região genômica contígua ou grupo de ligação, tal como um haplótipo.
Um alelo de um QTL pode denotar um haplótipo dentro de uma janela especificada em que a dita janela é uma região genômica contígua que pode ser definida, e rastreada, com um conjunto de um ou mais marcadores polimórficos. Um haplótipo pode ser definido pela impressão digital exclusiva de alelos em cada marcador dentro da janela especificada.
[0261] Desse modo, fornecem-se os métodos e composições revelados podem compreender adicionalmente composições e métodos para a integração alvejada em relação à direção de nucleotídeos exógenos para uma planta transformada. Em um aspecto, os métodos revelados usam sítios de recombinação novos em um sistema de direcionamento de gene que facilita o direcionamento direcional de genes e sequências de nucleotídeos desejados para os sítios de recombinação correspondentes introduzidos anteriormente no genoma-alvo de planta.
[0262] Em um aspecto, uma sequência de nucleotídeos flanqueada por dois sítios de recombinação não idênticos é introduzida em uma ou mais células de um explante derivadas do genoma-alvo do organismo que estabelece um sítio-alvo para inserção de sequências de nucleotídeos de interesse. Uma vez que uma planta estável ou tecido cultivado é estabelecido, um segundo construto ou sequência de nucleotídeos de interesse, flanqueado por sítios de recombinação correspondentes como aqueles que flanqueiam o sítio-alvo, é introduzido na planta estavelmente transformada ou tecidos na presença de uma proteína recombinase. Esse processo resulta em troca das sequências de nucleotídeos entre os sítios de recombinação não idênticos do sítio-alvo e do cassete de transferência.
[0263] É reconhecido que a planta transformada preparada dessa maneira pode compreender múltiplos sítios-alvo; isto é, conjuntos de sítios de recombinação não idênticos. Dessa maneira, múltiplas manipulações do sítio-alvo na planta transformada estão disponíveis. Por sítio-alvo na planta transformada é pretendida uma sequência de DNA que foi inserida no genoma da planta transformada e compreende sítios de recombinação não idênticos. Células e Organismos
[0264] Os métodos e a composição da presente revelação podem ser usados para aprimorar modificação de polinucleotídeo genômica de uma célula ou organismo.
[0265] Em alguns aspectos, a célula ou organismo é um procariote, por exemplo porém sem limitação E. coli.
[0266] Em alguns aspectos, a célula ou organismo é proveniente do reino Animal, por exemplo uma célula de mamífero, por exemplo uma célula humana. Em alguns aspectos, a célula é selecionada dentre o grupo que consiste em: : célula de tecido conjuntivo de camundongo, fibroblasto de camundongo, célula-tronco embrionária de camundongo, monócito de camundongo, macrófago de camundongo, célula de baço de camundongo, célula 3T3 NIH de camundongo, célula L de camundongo, fibroblasto de rato, hepatoma de rato, célula de linfoma humano, queratinócito humano, célula de câncer de pulmão de células pequenas, EBV de linfócito humano transformado, célula renal embrionária humana, célula HEK293, célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim felino, célula de rim de macaco verde africano, célula transformada SV 40, célula de rim de macaco africano, hepatócito primário canino, célula de fibroblasto embrionário de pinto, célula HeLa, célula de mieloma, célula de coração fetal bovino, óvulo humano, óvulo de camundongo, ovo de Xenopus, óvulo bovino, óvulo porcino, óvulo de ovelha ou célula epitelial de úbere bovino, célula epidérmica embrionária de ovelha, blastocisto de camundongo, células-tronco, células BHK-1 de fibroblastos de rim de hamster sírio, BSC de célula epitelial de rim de macaco, MPC de célula linfoide de mieloma de camundongo, células de ovo de rã RHP e célula KB de tumor nasofaríngeo humano.
[0267] Em alguns aspectos, a célula ou organismo é proveniente do Reino Vegetal. Em alguns aspectos, a planta é uma monocotiledônea. Em alguns aspectos, a planta é uma dicotiledônea. Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, porém sem limitação, Arabidposis, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies Brassica úteis como óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, painço pérola (Pennisetum glaucum), painço proso (Panicum miliaceum), painço de rabo-de- raposa (Setaria italica), painço de dedo (Eleusine coracana)), teff (Eragrostis tef), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha de cajú (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas. Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilha
(Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis, tal como pepino (C. sativus), melão cantalupo (C. cantalupensis), e melão almiscarado (C. melo).
[0268] Os métodos e composições descritos no presente documento não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em um organismo ou célula, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeo obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula do organismo. A introdução inclui referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula, e inclui referência ao fornecimento transiente (direto) de um ácido nucleico, proteína ou complexo de polinucleotídeo-proteína (PGEN, RGEN) para a célula.
[0269] Os métodos para introduzir polinucleotídeos ou polipeptídeos ou um complexo de polinucleotídeo-proteína nas células ou organismos são conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitação, microinjeção, eletroporação, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes, aceleração de partícula balística (bombardeamento de partículas), transformação mediada por whiskers, transformação mediada por Agrobacterium, transferência de gene direta, introdução mediada por vírus, transfecção, transdução, peptídeos de penetração celular, entrega de proteína direta mediada por nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN), aplicações tópicas, cruzamento sexual, reprodução sexual e qualquer combinação dos mesmos.
[0270] Por exemplo, o polinucleotídeo guia (RNA guia, crNucleotide + tracrNucleotide, DNA guia e/ou molécula de DNA-RNA guia) pode ser introduzido em uma célula diretamente (transitoriamente) como uma molécula de polinucleotídeo de fita simples ou fita dupla. O RNA guia (ou crRNA + tracrRNA) também pode ser introduzido em uma célula indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que compreende um fragmento de ácido nucleico heterólogo que codifica o RNA guia (ou crRNA + tracrRNA), operacionalmente ligado a um promotor específico que é capaz de transcrever o RNA guia (moléculas de crRNA+tracrRNA) na dita célula. O promotor específico pode ser, porém sem limitação, um promotor de RNA polimerase III, que permite a transcrição de RNA com s extremidades 5’ e - 3’ precisamente definidas não modificadas (Ma et al., 2014, Mol. Ther. Nucleic Acids 3:e161; DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343; WO2015026887, publicado em 26 de fevereiro de 2015). Qualquer promotor com capacidade para transcrever o RNA guia em uma célula pode ser usado e inclui um promotor induzível por choque térmico/calor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia.
[0271] A endonuclease Cas, tal como a endonuclease Cas descrita no presente documento, pode ser introduzida em uma célula introduzindo-se diretamente o próprio polipeptídeo Cas (chamado de entrega direta de endonuclease Cas), o mRNA que codifica a proteína Cas, e/ou o próprio complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas, com o uso de qualquer método conhecido na técnica. A endonuclease Cas também pode ser introduzida em uma célula indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que codifica a endonuclease Cas. A endonuclease pode ser introduzida em uma célula de maneira transiente ou pode ser incorporada no genoma da célula hospedeira com o uso de qualquer método conhecido na técnica. A absorção da endonuclease e/ou do polinucleotídeo guiado dentro da célula pode ser facilitada com um Peptídeo de penetração celular (CPP) conforme descrito no documento WO2016073433, publicado em 12 de maio de
2016. Qualquer promotor capaz de expressar a endonuclease Cas em uma célula pode ser usado e inclui um promotor induzível por choque térmico/calor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica a endonuclease Cas.
[0272] A entrega direta de um modelo de modificação de polinucleotídeo para as células vegetais pode ser obtida através da entrega mediada por partícula, e qualquer outro método de entrega direta, tal como porém sem limitação, transfecção mediada por polietilenoglicol (PEG) para protoplastos, transformação mediada por whiskers, eletroporação, bombardeamento de partículas, peptídeos de penetração celular, ou entrega de proteína direta mediada por nanopartículas de sílica mesoporosas (MSN) pode ser usado de maneira bem-sucedida para entregar um modelo de modificação de polinucleotídeo em células eucarióticas, tais como células vegetais.
[0273] O DNA doador pode ser introduzido por quaisquer meios conhecidos na técnica. O DNA doador pode ser fornecido por qualquer método de transformação conhecido na técnica incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas biolísticas. O DNA doador pode estar presente de modo transiente na célula ou pode ser introduzido por meio de um réplicon viral. Na presença da endonuclease Cas e do sítio-alvo, o DNA doador é inserido no genoma da planta transformado.
[0274] A entrega direta de qualquer um dos componentes de sistema Cas guiados pode ser acompanhada por entrega direta (coentrega) de outros mRNAs que podem promover o enriquecimento e/ou visualização de células que recebem os componentes de complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas. Por exemplo, a coentrega direta dos componentes de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas (e/ou próprio complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas) em conjunto com os marcadores fenotípicos de codificação de mRNA (tal como, porém sem limitação, ativadores transcricionais, tal como CRC (Bruce et al. 2000 The Plant Cell 12:65-79)) podem permitir a seleção e o enriquecimento de células sem o uso de um marcador selecionável exógeno restaurando-se a função para um produto de gene não funcional conforme descrito no documento WO2017070032, publicado em 27 de abril de 2017.
[0275] A introdução de um complexo de RNA guia/endonuclease Cas descrito no presente documento, em uma célula inclui introduzir os componentes individuais do dito complexo separadamente ou combinados com a célula, e diretamente (entrega direta de um complexo de ribonucleoproteína, ou RNP, como RNA para o guia e proteína para as subunidades de endonuclease Cas e proteína Cas, ou fragmentos funcionais das mesmas) ou através de construtos de recombinação que expressam os componentes (subunidades de RNA guia, endonuclease Cas, proteína Cas, ou fragmentos funcionais das mesmas). A introdução de um complexo de RNA guia/endonuclease Cas (RNP) em uma célula inclui o complexo de RNA guia/endonuclease Cas como um ribonucleotídeo-proteína na célula. O ribonucleotídeo-proteína pode ser montado antes de ser introduzido na célula conforme descrito no presente documento. Os componentes que compreendem a proteína de ribonucleotídeo de RNA guia/endonuclease Cas (pelo menos uma endonuclease Cas, pelo menos um RNA guia, pelo menos uma subunidade de proteína Cas) podem ser montados in vitro ou montados por quaisquer meios conhecidos na técnica antes de serem introduzidos em uma célula (alvejada para modificação de genoma conforme descrito no presente documento).
[0276] As células vegetais diferes das células humanas e animais pelo fato de que as células vegetais compreendem uma parede celular vegetal que pode atuar como uma barreira para a entrega direta da RNP e/ou da entrega direta dos componentes RNP.
[0277] Em alguns aspectos, a entrega direta da RNP para as células vegetais pode ser obtida através de entrega mediada por partícula (bombardeamento de partículas). Com base nos experimentos descritos no presente documento, uma pessoa versada na técnica pode prever que qualquer outro método de entrega direta, tal como, porém sem limitação, transfecção mediada por polietilenoglicol (PEG) para protoplastos, eletroporação, peptídeos de penetração celular, ou entrega de proteína direta mediada por nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN), pode ser usado de maneira bem-sucedida para entregar RNP para células vegetais.
[0278] A entrega direta da RNP, permite a edição de genoma em um sítio alvo no genoma de uma célula que pode ser seguida de degradação rápida do complexo, e apenas uma presença transiente do complexo na célula. Essa presença transiente do complexo RNP pode levar a efeitos fora do alvo reduzidos. Em contrapartida, a entrega de componentes RNP (RNA guia, endonuclease Cas) através de sequências de DNA de plasmídeo pode resultar na expressão constante de RNPs a partir desses plasmídeos que podem intensificar os efeitos fora do alvo (Cradick, T. J. et al. (2013) Nucleic Acids Res 41:9584-9592; Fu, Y et al. (2014) Nat. Biotechnol. 31:822-826).
[0279] A entrega direta pode ser obtida combinando-se qualquer componente do complexo de RNA guia/endonuclease Cas (RNP) (tal como, pelo menos um RNA guia, pelo menos uma proteína Cas, e pelo menos uma proteína Cas), com uma matriz de entrega de partícula que compreende uma micropartícula (tal como, porém sem limitação de uma partícula de ouro, partícula de tungstênio e partícula whisker de carbeto de silício) (consulte também WO2017070032 publicado em 27 de abril de 2017).
[0280] Em um aspecto, o complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas é um complexo em que o RNA guia e a proteína endonuclease Cas que forma o complexo de RNA guia/endonuclease Cas é introduzida na célula como RNA e proteína, respectivamente.
[0281] Em um aspecto, o complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas é um complexo em que o RNA guia e a proteína endonuclease Cas e a pelo menos uma subunidade de proteína de uma proteína Cas que forma o complexo de RNA guia/endonuclease Cas são introduzidas na célula como RNA e proteínas, respectivamente.
[0282] Em um aspecto, o complexo de polinucleotídeo guia/endonuclease Cas é um complexo em que o RNA guia e a proteína endonuclease Cas e a pelo menos uma subunidade de proteína de uma Cascata formando o complexo de RNA guia/endonuclease Cas (cascata pronta para clivagem) são pré-montados in vitro e introduzidos na célula como um complexo de ribonucleotídeo-proteína.
[0283] Os protocolos para introduzir polinucleotídeos, polipeptídeos ou complexos de polinucleotídeo-proteína em células eucarióticas, tais como plantas ou células vegetais são conhecidos e incluem microinjeção (Crossway et al., (1986) Biotechniques 4:320-34 e a patente U.S. nº 6.300.543), transformação de meristema (patente U.S. nº 5.736.369), eletroporação (Riggs et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5602-6, transformação mediada por Agrobacterium (patentes nº U.S. 5.563.055 e
5.981.840), transformação mediada por whiskers (Ainley et al. 2013, Plant Biotechnology Journal 11:1126-1134; Shaheen A. and M. Arshad 2011 Properties and Applications of Silicon Carbide (2011), 345-358 Editor(s): Gerhardt, Rosario. Publicação: InTech, Rijeka, Croácia. CODEN: 69PQBP; ISBN: 978-953-307-201-2) transferência gênica direta (Paszkowski et al., (1984) EMBO J 3:2.717 a 2.722), e aceleração de partícula balística (Patentes no U.S.
4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al., (1995) "Direct DNA
Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg & Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al., (1988) Biotechnology 6:923-6; Weissinger et al., (1988) Ann Rev Genet 22:421-77; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al., (1988) Plant Physiol 87:671-4 (soja); Finer and McMullen, (1991) In vitro Cell Dev Biol 27P:175-82 (soja); Singh et al., (1998) Theor Appl Genet 96:319-24 (soja); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-40 (arroz); Klein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4305-9 (maís); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-63 (maís); Patentes nº U.S. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al., (1988) Plant Physiol 91:440-4 (maís); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-9 (maís); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature 311:763-4; U.S. Patent No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5345-9 (Liliaceae); De Wet et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al., (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Rep 9:415-8) e Kaeppler et al., (1992) Theor Appl Genet 84:560-6 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505 (eletroporação); Li et al., (1993) Plant Cell Rep 12:250-5; Christou and Ford (1995) Annals Botany 75:407-13 (arroz) e Osjoda et al., (1996) Nat Biotechnol 14:745-50 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens)).
[0284] Alternativamente, polinucleotídeos podem ser introduzidos em planta ou células vegetais através do contato de células ou organismos com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, tais métodos envolvem a incorporação de um polinucleotídeo em uma molécula de RNA ou DNA viral. Em alguns exemplos, um polipeptídeo de interesse pode ser inicialmente sintetizado como parte de uma poliproteína viral, que é posteriormente processada por meio de proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nas mesmas, que envolvem moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos, consulte, por exemplo, as patentes U.S. nº 5.889.191, 5,889.190, 5.866.785, 5.589.367 e
5.316.931.
[0285] O construto de DNA de polinucleotídeo ou recombinante pode ser fornecido ou introduzido em uma célula procariórica e eucariótica ou organismo com o uso de métodos de transformação transientes. Tais métodos de transformação transiente incluem, porém sem limitação, a introdução do construto de polinucleotídeo diretamente na planta.
[0286] Os ácidos nucleicos e proteínas podem ser fornecidos para uma célula por qualquer método que inclua métodos que usam moléculas para facilitar a absorção de qualquer um ou todos os componentes de um sistema Cas guiado (proteína e/ou ácidos nucleicos), tais como peptídeos de penetração celular e nanocarreadores. Consulte também US20110035836, publicado em 10 de fevereiro de 2011 e EP2821486A1, publicado em 07 de janeiro de 2015.
[0287] Outros métodos de introdução de polinucleotídeos em uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo ou parte da planta podem ser usados, incluindo métodos de transformação de plastídeo, e os métodos para introduzir polinucleotídeos nos tecidos a partir de mudas ou sementes maduras.
[0288] Transformação estável destina-se a significar que o construto de nucleotídeo introduzido em um organismo interage em um genoma do organismo e pode ser herdado pela progênie do mesmo. Transformação transiente destina-se a significar que um polinucleotídeo é introduzido no organismo e não se integra em um genoma do organismo ou um polipeptídeo é introduzido em um organismo. A transformação transiente indica que a composição introduzida é apenas temporariamente expressa ou presente no organismo.
[0289] Uma variedade de métodos está disponível para identificar aquelas células que têm um genoma alterado no ou próximo a um sítio alvo sem usar um fenótipo marcador rastreável. Tais métodos podem ser vistos como análise direta de uma sequência alvo para detectar qualquer mudança na sequência alvo, incluindo, mas sem limitação, métodos de PCR, métodos de sequenciamento, digestão com nuclease, Southern blots e qualquer combinação dos mesmos.
[0290] Os métodos e a composição da revelação podem utilizar uma variedade de métodos de transformação conforme adequado. Ou seja, os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeo em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionado para transformação. Métodos adequados para introduzir sequências de nucleotídeo em células vegetais e a inserção subsequente no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., patente nº U.S. 5.563.055; Zhao et al., patente nº U.S. 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partícula balística (consulte, por exemplo, Sanford et al., patente nº U.S.
4.945.050; Tomes et al., patente nº U.S. 5.879.918; Tomes et al., patente nº U.S. 5.886.244; Bidney et al., patente nº U.S. 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment”,
em Plant Cell, Tissue, e Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Consulte também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421- 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4305-4309 (maís); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maís); Tomes, patente nº U.S. 5.240.855; Buising et al., patentes nº U.S. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer- Verlag, Berlin) (maís); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maís); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maize); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., patente nº U.S.
5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5345- 5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão incorporados no presente documento a título de referência.
[0291] Os polinucleotídeos introduzidos em um explante por meio dos métodos e composições revelados podem ser operacionalmente ligados a um promotor adequado. “Promotor" significa uma região de DNA que está a montante do início da transcrição e está envolvido no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição, seja incluindo ou não o 5' UTR.
Um "promotor de planta" é um promotor com capacidade de iniciar a transcrição em células de planta independentemente de ser ou não de sua origem ser uma célula vegetal.
Promotores de planta exemplificativos incluem, mas sem limitação, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de planta e bactérias que compreendem genes expressos em células de planta como de Agrobacterium ou Rhizobium.
Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição, de preferência, em determinados tecidos, como folhas, raízes ou sementes.
Tais promotores são denominados como "preferenciais para tecido". Os promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos são denominados como "específicos a tecido". Um promotor específico de “tipo de célula” aciona principalmente a expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou folhas.
Um promotor "induzível" ou "reprimível" pode ser um promotor que está sob controle ambiental ou exógeno.
Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, ou certos produtos químicos, ou a presença de luz.
Alternativamente, o controle exógeno de um promotor induzível ou reprimível pode ser afetado fornecendo-se um produto químico adequado ou outro agente que, por meio de interação com polipeptídeos-alvo, resulta em indução ou repressão do promotor.
Promotores específicos a tecido, preferenciais para tecido, específicos a tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores “não constitutivos”. Um promotor
"constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições. Os promotores úteis na presente revelação incluem aqueles revelados no documento WO2017/112006 e aqueles revelados no pedido de patente provisório nº U.S. 62/562.663.
[0292] Os métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para planta. Consulte, por exemplo, as patentes nº U.S. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Modificações de sequência adicionais são conhecidas para aprimorar a expressão gênica num hospedeiro vegetal. Essas incluem, por exemplo, a eliminação de: uma ou mais sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, um ou mais sinais de sítios de splicing de éxon-íntron, uma ou mais repetições do tipo transpóson e outras tais sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão gênica. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado a níveis médios para um determinado hospedeiro vegetal, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula vegetal hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar uma ou mais estruturas secundárias de mRNA em forma de grampo previstas. Desse modo, "uma sequência de nucleotídeos otimizada para plantas" da presente revelação compreende uma ou mais tais modificações de sequência.
[0293] Conforme usado no presente documento, "orientação antissenso" inclui referência a uma sequência de polinucleotídeos que é operacionalmente ligada a um promotor em uma orientação em que o padrão antissenso é transcrito. A fita antissenso é suficientemente complementar a um produto de transcrição endógeno de modo que a tradução do produto de transcrição endógeno seja frequentemente inibido. “Operacionalmente ligado" se refere à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico para que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência codificante (isto é, que a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.
[0294] O cassete de expressão pode incluir na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo endonuclease ou variante funcional do mesmo ou fragmento funcional do mesmo, e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, região de terminação) funcional no organismo receptor. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais, e regiões de terminação traducional) e/ou o polinucleotídeo de endonuclease ou variante funcional ou fragmento funcional do mesmo podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo de endonuclease ou variante funcional ou fragmento funcional do mesmo podem ser heterólogas à célula hospedeira ou entre si.
[0295] Embora possa ser desejado, em algumas modalidades, expressar as sequências com o uso de promotores heterólogos, as sequências de promotor nativo para o polinucleotídeo que codifica o agente indutor de quebra de fita dupla podem ser alternativamente usadas. Tais construtos podem alterar os níveis de expressão do polinucleotídeo na célula. Desse modo, o fenótipo da célula receptora pode ser alterado.
[0296] Quando adequado, os polinucleotídeos podem ser otimizados para expressão aumentada na célula ou organismo receptor. Ou seja, os polinucleotídeos podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais para organismo para expressão aprimorada. Consulte, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferencial para hospedeiro em plantas.
[0297] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por acentuar a expressão de gene em um hospedeiro celular. Essas incluem eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de locais de encadeamento éxon-íntron, repetições do tipo transpósons e outras sequências similares bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão genética. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, tal como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em formato de grampo.
[0298] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Com essa finalidade, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, hibridização, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.
[0299] O cassete de expressão também compreende um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como glifosato, glufosinato de amônio, bromoxinil, sulfonilureias, dicamba e 2 , 4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos, tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes, tal como a proteína verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína ciano florescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J.
Cell Science 117:943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913- 42), e proteína amarela florescente (PhiYFP disponível junto à Evrogen, consulte, Bolte et al. (2004) J.
Cell Science 117:943-54). Para marcadores selecionáveis adicionais, consultar, de modo geral, Yarranton (1992) Curr.
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[0300] Em alguns aspectos, o agente DSB pode ser introduzido em uma célula alvo e o fator morfogênico pode ser introduzido na mesma célula alvo.
[0301] Em alguns aspectos, o agente DSB pode ser introduzido em uma célula alvo e o fator morfogênico pode ser introduzido em uma célula diferente. Em alguns aspectos, a célula alvo e a célula diferente compreendem, cada uma, o mesmo polinucleotídeo alvo. Em alguns aspectos, a célula diferente é uma célula "adjacente". Conforme usado no presente documento, o termo "célula adjacente" (ou o plural "células adjacentes") é usado para descrever uma célula que faz parte do mesmo organismo, do mesmo tecido, da mesma cultura celular, ou da mesma camada de célula que a célula alvo, porém não da mesma célula que a célula alvo. Em alguns aspectos, a célula adjacente fica em contato físico com a célula alvo. Em alguns aspectos, a célula adjacente é separada da outra célula alvo, por exemplo por uma outra célula. Traços de Importância Agronômica
[0302] Os métodos e composições fornecidos no presente documento, que fornecem eficácia aprimorada da atividade de agente DSB em um polinucleotídeo alvo em uma célula com o uso de um fator morfogênico, são úteis para a produção de organismos, incluindo plantas, com características desejáveis incluindo traços de importância.
[0303] Conforme usado no presente documento, "traço" se refere a uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou material de planta específico ou célula. Em alguns casos, essa característica é visível ao olho humano, como a semente ou o tamanho da planta, ou pode ser medida por meio de técnicas bioquímicas, como detecção da proteína, amido ou teor de óleo de semente ou folhas, ou por meio da observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, medindo- se a admissão de dióxido de carbono, ou por meio da observação do nível de expressão de um gene ou genes, por exemplo, empregando-se a análise Northern, RT-PCR, ensaios de expressão de gene em microarranjo ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por meio de observações agrícolas como tolerância à tensão, rendimento ou tolerância ao patógeno. Um "traço intensificado" conforme usado na descrição dos aspectos da presente revelação inclui eficiência de uso da água ou tolerância à seca aprimorada ou intensificada, tolerância à tensão osmótica, tolerância à tensão em alta salinidade, tolerância à tensão em calor, tolerância ao frio intensificada, incluindo tolerância à germinação em frio, rendimento aumentado, eficiência de uso de nitrogênio intensificado, crescimento e desenvolvimento da planta precoce, crescimento e desenvolvimento da planta tardio, proteína da semente intensificada e produção de óleo de semente intensificada.
[0304] Os genes de interesse refletem os mercados comerciais e interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento da cultura. As culturas e mercados de interesse mudam, e à medida que nações em desenvolvimento abrem os mercados mundiais, novas culturas e tecnologias surgirão também. Além disso, à medida que a compreensão de traços e características agrônomas, tais como rendimento e heterose, aumenta, a escolha de genes para transformação mudará consequentemente. Categorias gerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como as quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, tais como proteínas de choque térmico. As categorias específicas de transgenes, por exemplo, incluem traços importantes de codificação de genes para a agronomia, resistência a inseto, resistência à doença, resistência à herbicida, esterilidade, características de grão e produtos comerciais. Os genes de interesse incluem, em geral, aqueles envolvidos em óleo, amido, carboidrato ou metabolismo de nutriente assim como aqueles que afetam o tamanho de núcleo, carregamento de sacarose e semelhantes.
[0305] As composições e métodos no presente documento podem fornecer um “traço agronômico aprimorado” ou “traço de importância agronômica” ou “traço de interesse agronômico” para uma planta, que pode incluir, porém sem limitação, o seguinte: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aprimoramento de rendimento, melhoria da saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento da capacidade fotossintética, melhoria nutricional, teor de proteína alterado, teor de óleo alterado, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, composição de proteína de semente alterada, composição de nutriente de semente alterada, em comparação com uma planta de isolinhagem que compreende uma modificação derivada dos métodos ou composições no presente documento.
[0306] Muitos traços agronômicos podem afetar o "rendimento", incluindo, mas sem limitação, altura da planta, quantidade de vagens, posição da vagem na planta, quantidade de internódios, incidência de pedaços da vagem, tamanho de grão, eficiência da nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de nutriente, resistência à tensão biótica e abiótica, assimilação de carbono, arquitetura da planta, resistência ao acamamento, germinação de semente em percentual, vigor da semente e traços juvenis. Outros traços que podem afetar o rendimento incluem, eficiência da germinação (incluindo germinação em condições de tensão), taxa de crescimento (incluindo taxa de crescimento em condições de tensão), quantidade de espigas, quantidade de semente por espiga, tamanho da semente, composição da semente (amido, óleo, proteína) e características do enchimento da semente. Também é de interesse a geração de plantas transgênicas que demonstram propriedades fenotípicas desejáveis que podem ou não conferir um aumento no rendimento da planta geral. Tais propriedades incluem morfologia de planta aumenta, fisiologia de planta ou componentes aprimorados da semente madura colhida da planta transgênica.
[0307] O “rendimento aumentado” de uma planta transgênica da presente revelação pode ser evidenciado e medido de várias formas, incluindo peso de teste, número de sementes por planta, peso de semente, número de sementes por unidade de área (isto é, sementes, ou peso de sementes, por acre), bushels por acre, toneladas por acre, quilo por hectare. Por exemplo, o rendimento de maís pode ser medido como produção de grãos de milho com casca por unidade de área de produção, por exemplo em bushels por acre ou toneladas métricas por hectare, frequentemente relado em uma base ajustada para umidade, por exemplo, a 15,5% de umidade. O rendimento aumentado pode resultar da utilização aprimorada de compostos bioquímicos chave, como nitrogênio, fósforo e carboidrato, ou de tolerância aprimorada às tensões ambientais, como frio, calor, seca, sal e ataque de pragas ou patógenos. O DNA recombinante de intensificação de traço também pode ser usado para fornecer plantas transgênicas que têm crescimento e desenvolvimento aprimorado e, por fim, rendimento aumentado, como resultado da expressão modificada de reguladores de crescimento da planta ou modificação de ciclo da célula ou trajetórias de fotossíntese. Aspectos
[0308] Aspecto 1: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer um agente indutor de quebra de fita dupla para a célula alvo, e (b) fornecer um fator morfogênico para uma célula adjacente.
[0309] Aspecto 2: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer um agente indutor de quebra de fita dupla para a célula alvo , e (b) regular crescentemente a transcrição de um gene de fator morfogênico endógeno no genoma da dita célula alvo ou no genoma de uma célula adjacente.
[0310] Aspecto 3: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer um agente indutor de quebra de fita dupla para a célula alvo, (b) fornecer para a célula alvo ou para uma célula adjacente um vetor de T-DNA que compreende um gene para um fator morfogênico fora da dita borda esquerda e da dita borda direita.
[0311] Aspecto 4: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer para a célula alvo um agente indutor de quebra de fita dupla, e (b) fornecer um fator morfogênico para a célula alvo ou para uma célula adjacente; em que o agente indutor de quebra de fita dupla de (a) ou o fator morfogênico de (b) ou ambos compreende(m) adicionalmente um motivo de peptídeo de penetração celular em sua extremidade 3', sua extremidade 5', ou ambas as extremidades.
[0312] Aspecto 5: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer para uma célula um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um agente indutor de quebra de fita dupla, e (b) fornecer um fator morfogênico para a célula alvo ou para uma célula adjacente; em que o primeiro vetor compreende adicionalmente foras das bordas de T-DNA um repressor fundido a um gene que codifica uma endonuclease Cas que carece de atividade de nuclease, em que o dito repressor tem capacidade de se ligar a um elemento regulador operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica o agente indutor de quebra de fita dupla de (a).
[0313] Aspecto 6: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer para a célula alvo um agente indutor de quebra de fita dupla, (b) fornecer para uma célula uma composição selecionada dentre o grupo que consiste em: i. uma molécula que estimula a expressão de um fator morfogênico endógeno na célula, e ii. um vetor de T-DNA que compreende um gene para um fator morfogênico fora da dita borda esquerda e da dita borda direita, em que a célula de (a) é a mesma célula que a célula de (b), e em que o agente indutor de quebra de fita dupla de (a) ou a composição de (b) ou ambos compreende(m) adicionalmente um motivo de peptídeo de penetração celular em sua extremidade 3', sua extremidade 5', ou ambas as extremidades.
[0314] Aspecto 7: Um método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo que compreende: (a) fornecer para a célula alvo um agente indutor de quebra de fita dupla, (b) fornecer para uma célula uma composição selecionada dentre o grupo que consiste em: i. um fator morfogênico, ii. uma molécula que estimula a expressão de um fator morfogênico endógeno, e iii. um vetor de T-DNA que compreende um polinucleotídeo de interesse entre a borda esquerda e a borda direita, que compreende adicionalmente um gene para um fator morfogênico fora da dita borda esquerda e da dita borda direita; em que a célula de (a) é diferente da célula de (b), e em que o agente indutor de quebra de fita dupla de (a) ou a composição de (b) ou ambos compreende(m) adicionalmente um motivo de peptídeo de penetração celular em sua extremidade 3', sua extremidade 5', ou ambas as extremidades.
[0315] Aspecto 8: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: Wuschel, Proteína de Desenvolvimento de Óvulo e Babyboom.
[0316] Aspecto 9: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a composição de (a) é fornecida em um construto diferente da composição de (b).
[0317] Aspecto 10: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a composição de (a) é fornecida no mesmo construto que a composição de (b).
[0318] Aspecto 11: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é fornecido como uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo.
[0319] Aspecto 12: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico compartilha pelo menos 80%
de identidade com uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs: 6-10, 17-21 e 48-73.
[0320] Aspecto 13: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é fornecido como um polipeptídeo.
[0321] Aspecto 14: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é codificado por um polinucleotídeo que compartilha pelo menos 80% de identidade com uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQID NOs:1-5, 11- 16, 22 e 23-47.
[0322] Aspecto 15: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5, WOX9, BBM2, BMN2, BMN3 e ODP2.
[0323] Aspecto 16: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a dita edição é selecionada dentre o grupo que consiste em: inserção de pelo menos um polinucleotídeo, deleção de pelo menos um polinucleotídeo, modificação de pelo menos um polinucleotídeo, substituição de pelo menos um polinucleotídeo, e uma combinação de pelo menos dois dos anteriores.
[0324] Aspecto 17: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o dito agente indutor de quebra de fita dupla compreende uma endonuclease Cas, uma TALEN, uma meganuclease, uma endonuclease de dedo de zinco ou uma endonuclease de restrição.
[0325] Aspecto 18: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o dito agente indutor de quebra de fita dupla é fornecido como um complexo de ribonucleoproteína que compreende uma proteína endonuclease Cas e um RNA guia.
[0326] Aspecto 19: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, que compreende adicionalmente introduzir uma molécula de DNA doador de polinucleotídeo heterólogo na dita célula alvo.
[0327] Aspecto 20: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o fator morfogênico é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.
[0328] Aspecto 21: O método, de acordo com o aspecto 19, em que o dito promotor é selecionado dentre o grupo que consiste em: um promotor ZM-PLTP, um promotor ZM-PLTP1, um promotor ZM-PLTP2, um promotor SB-PLTP1, um promotor SB-PLTP2, um promotor SB-PLTP3, um promotor OS-PLTP1, um promotor OS-PLTP2, um promotor SI-PLTP1, um promotor ZM-FBP1, um promotor ZM-RFP, um promotor ZM-APMP, um promotor ZM-RfeSP, um promotor ZM-CRR6, um promotor ZM-G3K, um promotor ZM-CAB7, um promotor ZM-UBR, um promotor ZM-HBP, um promotor ZM-PS1-N, um promotor ZM-SDR, um promotor OS-SDR, um promotor SB- SDR, um promotor ZM-SDR (longo), um promotor ZM-LGL, um promotor ZM- LEA14-A, um promotorZM-LEA34-D, um promotor GM-LTP3, um promotor GM- EF1A, um promotor GM-HBSTART3, um promotor GM-HBSTART3 (TRUNCADO), um promotor AT-ML1, um promotor tipo GM-ML1, um promotor tipo GM-ML1 (TRUNCADO), um promotor ZM-HBSTART3, um promotor OS- HBSTART3, um promotor AT-PDF1 P2, um promotor GM-PDF1, um promotor GM-PDF1 (TRUNCADO), um promotor SB-PDF1, um promotor OS-PDF1, um promotor OS-PDF1 (TRUNCADO), um promotor PT-PDF1, um promotor PT- PDF1 (TRUNCADO), um promotor SI-PDF1, um promotor SI-PDF1 (TRUNCADO), um promotor AT-PDF2, um promotor GM-PDF2, um promotor
GM-PDF2 (TRUNCADO), um promotor ZM-GL1, um promotor AT-PDF2a, um promotor AT-PDF2a (TRUNCADO), um promotor GM-PDF2a, um promotor GM- PDF2a (TRUNCADO), um promotor OS-PDF2, um promotor OS-PDF2 (TRUNCADO), um promotor PT-PDF2, um promotor PT-PDF2 (TRUNCADO), um promotor VV-PDF2, um promotor VV-PDF2 (TRUNCADO), um promotor aZM-PDF2, um promotor SI-PDF2, um promotor SI-PDF2 (TRUNCADO), um promotor VV-PDF2a, um promotor PT-PDF2a, um promotor PT-PDF2a (TRUNCADO), um promotor MT-PDF2, um promotor MT-PDF2 (TRUNCADO), um promotor AT-HDG2, um promotor GM-HDG2, um promotor GM-HDG2 (TRUNCADO), um promotor SB-HDG2, um promotor SB-HDG2 (TRUNCADO), um promotor AT-CER6, um promotor AT-CER60, um promotor AT-CER60 (TRUNCADO), um promotor GM-CER6, um promotor GM-CER6 (TRUNCADO), um promotor PT-CER6, um promotor PT-CER6 (TRUNCADO), um promotor VV-CER6, um promotor VV-CER6 (TRUNCADO), um promotor SB-CER6, um promotor ZM-CER6, um promotor SI-CER6, um promotor SI-CER6 (TRUNCADO), um promotor OS-CER6, um promotor OS-CER6 (TRUNCADO), um promotor GM-HBSTART2, um promotor GM-MATE1, um promotor GM- NED1; um promotor SB-GL1, um promotor OS-GL1, um promotor AT-GL1, um promotor GM-GL1, um promotor AT-ANL1, um promotor ZM-OCL1, e um promotor OS-OCL1.
[0329] Aspecto 22: O método, de acordo com o aspecto 18, em que a dita molécula de DNA doador compreende um polinucleotídeo que confere um benefício a um organismo que compreende ou é derivado da dita célula alvo.
[0330] Aspecto 23: O método, de acordo com o aspecto 21, em que o dito benefício é selecionado dentre o grupo que consiste em: saúde aprimorada, crescimento aprimorado, fertilidade aprimorada, fecundidade aprimorada, tolerância ambiental aprimorada, vigor aprimorado, resistência a doenças aprimorada, tolerância a doenças aprimorada, tolerância aprimorada a uma molécula heteróloga, condição física aprimorada, característica física aprimorada, massa maior, produção aumentada de uma molécula bioquímica, produção diminuída de uma molécula bioquímica, regulação crescente de um gene, regulação decrescente de um gene, regulação crescente de uma via bioquímica, regulação decrescente de uma via bioquímica, estimulação de reprodução celular e supressão de reprodução celular.
[0331] Aspecto 24: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a dita célula é uma célula vegetal.
[0332] Aspecto 25: O método, de acordo com o aspecto 23, em que a dita célula vegetal é obtida a partir de ou derivada de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.
[0333] Aspecto 26: O método, de acordo com o aspecto 24, em que a monocotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: Zea mays, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Triticum aestivum, Medicago sativa, Oryza sativa, Setaria italica e Saccharum spp.
[0334] Aspecto 27: O método, de acordo com o aspecto 24, em que a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: Helianthus annuus, Glycine max, Nicotiana tabacum, Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Manihot esculenta, Beta vulgaris, Brassica spp. e Arabidposis thaliana.
[0335] Aspecto 28: O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a dita edição de um polinucleotídeo no genoma da célula modula um traço de importância agronômicas em uma planta, selecionado dentre o grupo que consiste em: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aprimoramento de rendimento, melhoria da saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento da capacidade fotossintética, melhoria nutricional, composição de proteína alterada, composição de óleo alterada, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, composição de proteína de semente alterada, e composição de nutriente de semente alterada; em comparação com uma planta de isolinhagem que não compreende ou é derivada de uma célula cujo genoma foi editado com o dito agente indutor de quebra de fita dupla.
[0336] Aspecto 29: Uma planta derivada de uma célula vegetal produzida pelo método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que a dita planta não tem fator morfogênico heterólogo estavelmente integrado em seu genoma.
[0337] Aspecto 30: Qualquer um dos aspectos anteriores, em que o fator morfogênico é geneticamente modificado ou sintético, em que o fator morfogênico geneticamente modificado ou sintético tem um tipo ou nível alterado de atividade em comparação com um fator morfogênico não geneticamente modificado ou não sintético.
[0338] Aspecto 31: Qualquer um dos aspectos anteriores, em que a endonuclease Cas é fornecida como um polipeptídeo, ou em que a endonuclease Cas é fornecida como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de endonuclease Cas, ou em que a endonuclease Cas é fornecida como um complexo de ribonucleoproteína com um polinucleotídeo guia.
[0339] Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a uma modalidade preferencial e várias modalidades alternativas, será entendido pelas pessoas versadas na técnica relevante que várias alterações na forma de detalhes podem ser realizadas sem que se afaste do espírito e escopo da invenção da invenção. Por exemplo, embora os exemplos particulares abaixo possam ilustrar os métodos e modalidades descritos no presente documento com o uso de uma planta específica, os princípios nesses exemplos podem ser aplicados a qualquer planta. Portanto, será observado que o escopo desta invenção é abrangido pelas modalidades das invenções mencionadas no presente documento e no relatório descritivo em vez de nos exemplos específicos que são exemplificados abaixo. Todas as patentes e publicações citadas neste pedido estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade, para todos os propósitos, na mesma extensão como se cada uma fosse individual e especificamente incorporada a título de referência.
EXEMPLOS
[0340] A seguir são apresentados exemplos de modalidades específicas de alguns aspecto da invenção. Os exemplos são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas, e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo alguma. Esforços foram realizados para assegurar a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), porém algum erro e desvio experimental, certamente, deve ser permitido.
Exemplo 1: Transformação por bombardeamento de partículas de plantas de milho
[0341] Nesse exemplo, a transformação de embriões de maís imaturos por meio de bombardeamento de partículas é descrita. Entende-se que um protocolo similar pode ser usado para a transformação de outras plantas, tais como (porém sem limitação): soja, algodão, canola, trigo, arroz, sorgo, ou girassol.
[0342] Antes do bombardeamento, 10 a 12 embriões imaturos DAP são isolados das espigas de uma planta de milho e colocados em meio de cultura mais 16% de sacarose por três horas para plasmolisar as células escutelárias.
[0343] Plasmídeos únicos ou múltiplos plasmídeos podem ser usados para cada bombardeamento de partículas. Em um exemplo, uma pluralidade de plasmídeos inclui: 1) um plasmídeo que compreende um cassete doador, 2) um plasmídeo que compreende um cassete de expressão para o agente indutor de quebra de fita dupla, e 3) um plasmídeo que compreende um cassete de expressão para o fator morfogênico.
[0344] Para fixar o DNA às partículas de ouro de 0,6 µm, os plasmídeos são misturados adicionando-se 10 µl de cada plasmídeo em conjunto em um tubo microfuge de baixa ligação (Sorenson Bioscience 39640T). A essa suspensão, são adicionados 50 µl de 0,6 µm de partículas de ouro (30 µg/µl) e 1,0 µl de Transit 20/20 (Cat nº MIR5404, Mirus Bio LLC), e a suspensão é colocada em um agitador giratório por 10 minutos. A suspensão é centrifugada a 10.000 RPM (~9400 x g) e o sobrenadante é descartado. As partículas de ouro são ressuspensas em 120 µl de etanol a 100%, brevemente sonicadas a baixa potência e 10 µl são projetados sobre cada disco de suporte. Os discos de suporte são então secos a ar para remover todo o etanol restante.
O bombardeamento de partículas é realizado com o uso de um Biolistics PDF- 1000, a 28 polegadas de mercúrio com o uso de um disco de ruptura de 200 PSI.
[0345] Após o bombardeamento de partículas, os embriões imaturos são selecionados em meio modificado 506J para conter 12,5 g/l de manose e 5 g/l de maltose e nenhuma sacarose. Após 10 a 12 semanas de seleção, as plântulas são regeneradas e analisadas com o uso de qPCR. Exemplo 2: Transformação de plantas de milho mediada por Agrobacterium
[0346] Nesse exemplo, a transformação de embriões de maís imaturos por meio de mediação de Agrobacterium é descrito. Entende-se que um protocolo similar pode ser usado para a transformação de outras plantas, tais como (porém sem limitação): soja, algodão, canola, trigo, arroz, sorgo, ou girassol. Preparação de Placa Principal de Agrobacterium.
[0347] Agrobacterium tumefaciens que abriga um vetor doador binário é semeada a partir de uma alíquota congelada a -80 oC em meio 12V sólido e cultivada a 28 oC no escuro por 2 a 3 dias para produzir uma placa principal. Cultivo de Agrobacterium em meio sólido.
[0348] Uma única colônia ou múltiplas colônias de Agrobacterium são coletadas a partir da placa principal e semeadas em uma segunda placa contendo meio 810I e incubadas a 28 °C no escuro de um dia para o outro.
[0349] Meio de infecção por Agrobacterium (meio 700 A; 5 ml) e 100 mM 3'-5'-Dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona (acetoseringona; 5 µl) são adicionados a um tubo cônico de 14 ml em uma capela. Cerca de 3 alças completas de Agrobacterium a partir da segunda placa são suspensas no tubo e o tubo foi, então, submetido a vórtice para produzir uma suspensão uniforme. Um ml é transferido para um tubo de espectrofotômetro e a densidade óptica (550 nm) da suspensão é ajustada a uma leitura de cerca de 0,35 a 1,0. A concentração de Agrobacterium é de aproximadamente 0,5 a 2,0 × 109 cfu/ml. A suspensão de Agrobacteriumfinal é dividida em alíquotas em tubos de microcentrífuga de 2 ml, cada um contendo cerca de 1 ml da suspensão. As suspensões são, então usadas o mais rápido possível. Cultivo de Agrobacterium em meio líquido.
[0350] Alternativamente, Agrobacterium pode ser preparada para transformação por meio de crescimento em meio líquido. Um dia antes da infecção, um frasco de 125 ml é preparado com 30 ml de meio 557A (10,5 g/l de fosfato de potássio dibásico, 4,5 g/l de fosfato de potássio monobásico anidro, 1 g/l de sulfato de amônio, 0,5 g/l de citrato de sódio desidratado, 10 g/l de sacarose, sulfato de magnésio 1 mM) e 30 µl de espectinomicina (50 mg/ml) e 30 µl de acetoseringona (20 mg/ml). Meia alçada de Agrobacterium a partir de uma segunda placa é suspensa nos frascos e colocada em um agitador orbital ajustado a 200 rpm e incubada a 28 oC de um dia para o outro. A cultura de Agrobacterium é centrifugada a 5.000 rpm por 10 min. O sobrenadante é removido e o meio de infecção por Agrobacterium com com solução de acetoseringona foi adicionado. As bactérias são suspensas por vórtice e a densidade óptica (550 nm) de suspensão de Agrobacterium é ajustada a uma leitura de cerca de 0,35 a 2,0. Transformação de Maís.
[0351] As espigas de um cultivar de maís (Zea mays L.) são esterilizadas em superfície por 15 a 20 min em 20% (v/v) de alvejante (5,25% de hipoclorito de sódio) mais 1 gota de Tween 20 seguido de 3 lavagens em água estéril. Os embriões imaturos (IEs) são isolados das espigas e são colocados em 2 ml do meio de infecção por Agrobacterium com solução de acetoseringona. O tamanho ideal dos embriões varia com base no consanguíneo, mas para transformação com WUS2 e ODP2 uma ampla faixa de tamanho de tamanhos de embrião imaturo poderia ser usada. A solução é drenada e 1 ml de suspensão de Agrobacterium foi adicionado aos embriões e o tubo submetido a vórtice por 5 a 10 s. O tubo microfuge é deixado em repouso por 5 min na capela. A suspensão de Agrobacterium e os embriões são despejados em meio de cocultivo 710I (ou 562V) (consulte a Tabela 2). Quaisquer embriões deixados no tubo são transferidos para a placa com o uso de uma espátula estéril. A suspensão de Agrobacterium é drenada e os embriões colocados com o eixo geométrico voltado para baixo no meio. A placa é vedada com filme Parafilm M® (plástico flexível resistente à umidade, disponível junto à Bemis Company, Inc., 1 Neenah Center 4º andar, Caixa Postal 669, Neenah, WI 54957) e incubada no escuro a 21 oC por 1 a 3 dias de cocultivo.
[0352] Os embriões são transferidos para meio de repouso (meio 605T) sem seleção. Três a 7 dias depois, eles são transferidos para o meio de maturação (meio 289Q) suplementado com um agente seletivo Exemplo 3: Entrega de um fator morfogênico para uma célula adjacente aprimora modificação de polinucleotídeo mediada por CRISPR- Cas de células alvo
[0353] Esse exemplo demonstra a entrega de vetor de DNA que codifica a proteína WUS em um conjunto de partículas de ouro para as células embrionárias imaturas de maís é suficiente para suportar a embriogênese e a regeneração da planta com mutações/deleções alvejadas ou inserções sítio-específicas e nenhuma integração de gene WUS com frequências práticas.
[0354] Anteriormente, as abordagens de transformação de planta e edição de genoma exigiam a entrega de vários vetores de DNA que codificam diferentes componentes "auxiliares", incluindo reagentes de quebra de fita dupla (por exemplo, meganucleases, ZFNs, TALENs, ou nuclease Cas9 e RNA guia (gRNA)), um marcador selecionável, fatores morfogênicos (por exemplo, ODP2 e WUS), além dos oligonucleotídeos de fita simples e fita dipla de DNA “doador” - em experimentos de edição de gene ou partes contendo DNA de plasmídeo ou genes inteiros com elementos reguladores (promotores e terminadores) para inserções como o resultado da quebra de fita dupla (DSB) através de via de reparo dirigido por homologia (HDR).
[0355] Múltiplas moléculas de DNA codistribuídas tendem a se cointegrar em um sítio de DSB através de uma via de reparo de junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que reduz significativamente a eficiência de eventos utilizáveis. Além disso, a integração estável de componentes CRISPR pode levar ao quimerismo da planta e aumentar as chances de mutagênese fora do sítio. A minimização da introdução das moléculas de DNA “auxiliares” descritas acima na célula alvo, e a limitação de entrega ao DNA doador, podem ser benéficas e levar a frequências mais altas de eventos de qualidade (QEs).
[0356] Anteriormente, foi descrito um método para entrega de Cas9-gRNA sob a forma de ribonucleoproteínas (RNPs) com o uso de micropartículas de ouro. Também foi descrito um método para ativação de gene marcador selecionável pré-integrado quebrado através de mecanismo de junção de extremidade não homólogo (NHEJ) após a entrega de Cas9-gRNA como vetores de DNA ou complexo RNP (WO 2017/070029 A1).
[0357] Os genes de fator morfogênico (também denominados "genes de desenvolvimento", por exemplo porém sem limitação: ODP2 e WUS) são componentes desejados do processo de transformação: sua entrega para células vegetais facilita a divisão celular e aumenta significativamente as sequências de transformação. Além disso, esses genes permitem a transformação bem-sucedida de muitos genótipos de elite, cuja transformação, de outro modo, não pode ser eficazmente realizada. Entretanto, a integração estável de genes de fator morfogênico (por exemplo, ODP2 e WUS) no genoma de célula alvo pode ter efeito prejudicial sobre a capacidade de regeneração e fertilidade da planta.
[0358] Aqui, foi descrita uma abordagem que permite a prevenção da integração de fator morfogênico (genes de desenvolvimento, ou “genes dev") nos genomas de plantas regeneradas. Primeiro, foi demostrado que a entrega de apenas um dos dois genes de fator morfogênico (WUS) sob um promotor forte (por exemplo, PLTP) foi suficiente para estimular a embriogênese na maioria dos genótipos testados. Segundo, a proteína WUS tem um peptídeo de penetração celular (CPP) e, portanto tem capacidade de penetrar nas paredes celulares. Desse modo, a entrega do DNA vetor que codifica WUS em uma célula levou à expressão de proteína e sua migração para as células vizinhas que estimulam sua divisão. Além disso, a superexpressão da proteína na célula alvejada é geralmente tóxica, impedindo a divisão celular, embriogênese e regeneração da planta. Com base nessas observações, foi conduzida a entrega biolística de RNP e DNA doador no primeiro conjunto de partículas de ouro (primeiro disparo) seguido da entrega de DNA vetor contendo o cassete de expressão WUS em um conjunto de partículas de ouro separado (segundo disparo). Isso permitiu a regeneração da planta a partir das células que recebem a DSB e a edição de componentes e estimulou a divisão e embriogênese por moléculas de proteína WUS provenientes das células adjacentes. Deleção de Genes
[0359] Uma deleção de genes de aproximadamente 21 kb de tamanho foi gerada. Embriões imaturos de maís foram bombardeados com o uso de partículas de ouro revestidas com 2 complexos RNP que alvejam dois sítios: sítio 1 SEQID NO:80 GGATTCCGCGGAAATGGGTG (PAM: CGG) sítio 2 SEQID NO:81 GTCAAGGACATACGAGACC (PAM: AGG) para gerar a deleção e, então, imediatamente bombardeou os embriões com o segundo conjunto de partículas de ouro revestidas com um vetor de DNA que codifica WUS (polinucleotídeo SEQID NO: 23 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:48) operacionalmente ligado a um promotor PLTP (SEQID NO:74) (Figura 1A). As plantas foram regeneradas sem seleção e analisadas por PCR e sequenciamento, e qPCR para a presença de deleções e integração WUS, respectivamente. Os resultados desse experimento são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Frequência de deleção de gene RecQ4 Plantas com Plantas Plantas deleção Embriões Plantas com com Sem bombardeados amostradas integração deleção integração
WUS
WUS 385 1128 54 (5%) 34 (3%) 51
[0360] Esses resultados demonstram a deleção de gene “isenta de DNA” eficiente com alta eficiência.
Inserção de gene sítio-específica
[0361] A entrega WUS separada foi usada para gerar uma inserção de gene de aproximadamente 3,5 kb de tamanho em um sítio alvo genômico específico. Os embriões imaturos de maís foram bombardeados com o uso de partículas de ouro correvestidas com um vetor de DNA que compreende polinucleotídeos que codificam uma proteína Cas9 de S. pyogenes otimizada (éxons 1 e 2 fornecidos como polinucleotídeo SEQID NOs: 103-104 que codifica o polipeptídeo SEQID NOs: 108-109, com um íntron LS1 de batata inserido entre os dois éxons, e que compreende adicionalmente sequências NLS SV40 e VIRD2) e um gRNA adequado (SEQID NO: 82) (Figura 1B), e um vetor de DNA que compreende um gene marcador selecionável (NPTII, polinucleotídeo SEQID NO: 77 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:100) flanqueado com braços de homologia (SEQID NOs: 78 e 79) como o DNA doador (Figura 1C). O DNA doador compreendido de um gene de interesse flanqueado com sequências homólogas às sequências genômicas em ambos os lados da DSB (braços de homologia). Os mesmos embriões foram, então bombardeados uma segunda vez, entregando um vetor de DNA que codifica WUS sob o promotor PLTP (Figura 1A). As plantas foram regeneradas em meio contendo um agente seletivo (G418), que é tóxico para células que não foram integradas e expressam o gene NPTII. As plantas foram analisadas por PCR de junção para integração do gene de interesse no sítio genômico alvejado. Regenerantes também foram testados por qPCR quanto à presença de WUS. Os resultados desse experimento são apresentados na Tabela 3. Tabela 3: Frequência de integração de gene alvejada por NPTII gerada
Plantas com Plantas com Plantas inserção inserção Embriões Plantas com NPTII, NPTII, bombardeados amostradas integração Sem Integração alvejada integração
WUS
WUS 305 115 10 (8,7%) 6 (60%) 4 (40%)
[0362] A entrega separada de WUS foi suficiente para promover a regeneração da planta de células com mutações/deleções alvejadas, edições de gene ou inserções de gene e, portanto, substituiu a coentrega de genes de fator morfogênico (ODP2 e/ou WUS) juntamente com outros componentes. Desse modo, as plantas regeneradas nesses experimentos não continham genes de fator morfogênico aleatoriamente integrados no genoma aprimorando, desse modo a capacidade de regeneração e fertilidade das plantas.
[0363] Esse método de entrega separada de um gene de fator morfogênico facilitou uma abordagem "isenta de DNA" para knockout de gene, edição de gene alvejada, e inserção de gene em células vegetais de plantas de cultura agronomicamente importantes incluindo, porém sem limitação maís, soja, trigo, arroz, painço, sorgo, algodão e canola. Exemplo 4: Ativação de fatores morfogênicos endógeno aprimora a modificação de polinucleotídeo mediada por CRISPR-Cas de células alvo
[0364] Nesse exemplo, é fornecido um método para permitir a transformação de planta com o uso da superexpressão alvejada de um gene de desenvolvimento com o uso de um complexo ativador transcricional de endonuclease de homing programável para RNA. A plataforma básica que é construída é o sistema CRISPR/Cas9 (especificamente S. pyogenes, abreviado Spy Cas9) que é capaz de ser direcionado para qualquer sequência alvo com as modificações de remoção de sua atividade de endonuclease e combinando as mesmas com um motivo ativador transcricional conhecido. Nesse caso, as mutações D10A e H840A em Spy Cas9 foram feitas (polinucleotídeo SEQID NO:105 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:110) e o componente ativador transcricional de proteína CBF1 de Arabidopsis (denominado AT-CBF1A, polinucleotídeo SEQID NO:83 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:101) foi fundido. Esse método é um avanço inovador para o método de transformação de planta e criação de modificações de polinucleotídeo nos genomas de célula por meio de um agente indutor de quebra de fita dupla, em que a manipulação da expressão do gene endógeno é acentuada.
[0365] Para testar a capacidade de uma dSpy-Cas9 e guias expressos a partir dos plasmídeos bombardeados, cassetes de expressão pol III (polinucleotídeo promotor SEQID NO:84) com guias que alvejam a região promotora Variedade 1 de WUS2 foram desenvolvidos. A Figura 2A mostra a localização geral dos 5 guias eficazes (UTRs e estruturas de éxon/íntron com base na versão B73 de maís do gene), com o uso de sequências contig. genômicas de maís Variedade 1, com marcações que representam as diferenças de alelo.
[0366] sequências guia usadas na construção de cassete de expressão: C5 GCCTTTGCAGTTTGCACC (SEQID NO: 86) C3 GTTGCCACAAGGGGAGCC (SEQID NO: 87) C9 GCAAATGACTTCTGTCTCTA (SEQID NO: 88) A9 GACTCTTCCAAATTTCGAAG (SEQID NO: 89)
A4 GTCGTATCACCCATGGGCAA (SEQID NO: 90)
[0367] O mapa do vetor dCas9-GRA-CBF1A é mostrado na Figura 2B. A sequência GRA foi: GGCAGGGCT.
[0368] Diferentes combinações de guias foram entregues para a Variedade 1 juntamente com o marcador de seleção NPT II e dCas9- GRA-CBF1A e foram monitoradas para os crescimentos de células-tronco embrionárias. 4 semanas após o bombardeamento os embriões foram analisados. Notavelmente, os 3 guias senso C e todos os 5 guias senso A e C forneceram respostas fortes. Os guias antissenso não forneceram acentuação de transformação (Figura 2C).
[0369] O experimento foi repetido com crescimento total com seleção NPTII até as plantas se desenvolverem usando apenas os 3 guias senso C e os 5 guias senso A+C. A Figura 2D mostra plantas após 5 a 7 semanas de crescimento.
[0370] A Figura 2E mostra as diferenças de sequência de proteínas entre o WUS2 de um vetor recombinante (polinucleotídeo SEQID NOs: 73 (éxon 1) e 24 (éxon 2) que codifica o polipeptídeo SEQID NO:49), a partir de uma planta de maís B73 nativa (polinucleotídeo SEQID NO:25 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:50), e a partir de uma planta de maís nativa Variedade 1 (polinucleotídeo SEQID NO:26 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:51).
[0371] Conforme mostrado na Tabela 4, plantas férteis T0 foram recuperadas das plantas. “Total recuperado" foi o número de plântulas geradas de maneira bem-sucedida no laboratório de transformação através de seleções NPTII e enviadas para a estufa. "Número descartado” se refere àquelas que foram observadas a partir da estufa como fora de fenótipo,
raquíticas, estéreis ou mortas. "Polinizado" se refere ao número de plantas que por meio da entrada ou saída geraram número >10 sementes. Tabela 4: Recuperação de T0s fértil a partir da ativação de fator morfogênico endógeno 3 guias 5 guias PLTP:wus sem DevGenes total recuperado 30 31 48 12 Número descartado 8 11 24 6 polinizado 22 20 24 6 % 73,3% 64,5% 50% 50% polinizado/recuperado Exemplo 5: Colocação de gene de fator morfogênico fora das bordas do cassete de transformação aprimora a modificação de polinucleotídeos mediada por CRISPR-Cas de células alvo
[0372] Três plasmídeos são preparados para transformação mediada por Agrobacterium conforme descrito acima, cada um compreendem o mesmo T-DNA: RB + Promoter::SelectableMarker::Terminator + Promoter::DSBagent::Terminator + LB porém diferem na colocação dos cassetes de expressão de fator morfogênico além da borda esquerda.
[0373] Plasmídeo A compreende dois cassetes de expressão imediatamente fora da Borda Esquerda: Promoter::MorphogenicFactor1::Terminator Promoter::MorphogenicFactor2::Terminator
[0374] Plasmídeo B compreende um único cassete de expressão: Promoter::MorphogenicFactor::Terminator
[0375] Plasmídeo C compreende um único cassete de expressão fora da Borda Esquerda Promoter::MorphogenicFactor1+MorphogenicFactor2::Terminator
[0376] Um exemplo de um vetor que compreende dois genes de fator morfogênico (WUS2 fornecido como polinucleotídeo SEQID NO:27 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:52, e ODP2 fornecido como polinucleotídeo SEQID NO:22 que codifica o polipeptídeo SEQID NO:17) fora da borda de T- DNA esquerda é mostrado na Figura 3.
[0377] Após a transformação mediada por Agrobacterium com esses respectivos T-DNAs e seleção durante a maturação e regeneração embrionária somática, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Com base na análise qPCR, o uso do Plasmídeo A resulta em 10,2% das plantas T0 recuperadas sendo a única cópia para o gene de agente DSB dentro do T-DNA, enquanto os valores para o Plasmídeo B e Plasmídeo C foram 12,2% e 12,3%, respectivamente, embora sem gene de fator morfogênico integrado, sem indicações adicionais de contaminação de cadeia principal de plasmídeo.
[0378] Uma célula transformada com qualquer um desses plasmídeos exibe modificações de sua sequência de polinucleotídeos genômica como resultado da presença do agente DSB introduzido, sem o gene de fator morfogênico heterólogo integrado ao DNA genômico.
[0379] Esses resultados demonstram que o posicionamento dos cassetes de expressão de fator morfogênico fora da Borda Esquerda de T- DNA fornece a estimulação necessária de transformações sem a integração concomitante desses fatores morfogênicos no genoma da célula alvo.
Exemplo 6: Permissão de mobilidade de fator morfogênico aprimora modificação de polinucleotídeo mediada por CRISPR-Cas de células alvo
[0380] Para esse experimento, o gene WUS2 de maís é modificado através da substituição do motivo de Peptídeo de Penetração Celular WUS (CPP) com um motivo CPP KN1, ou deixando o CPP WUS inalterado e adicionando um CPP KN1 ao terminal amino da proteína. Em ambos os casos, quando é usado um cassete de expressão que expressa a proteína WUS do tipo selvagem (por exemplo PLTP PRO::WUS2::IN2-1 TERM) juntamente com cassete UBI::CAS9::PINII TERM + U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM onde o gRNA é projetado para guiar a proteína dCAS9 para se ligar e cortar o gene ALS de maís endógeno, edições do gene ALS para conferir resistência a clorsulfuron às células são prontamente recuperadas. Entretanto, quando o KN1-CPP é substituído pelo WUS-CPP ou o KN1-CPP é adicionado à proteína WUS, mais difusão das proteínas WUS modificadas resulta no crescimento aumentado e uma taxa de recuperação de plantas resistentes a clorsulfuron. Exemplo 7: Uso de uma combinação de WUS e REPA resulta em taxas mais altas de divisão celular e modificação de polinucleotídeo mediada por CRISPR-Cas concomitante de células alvo
[0381] Para esses experimentos, dois tratamentos são comparados. No primeiro tratamento, uma Agrobacterium contendo um T-DNA com os seguintes componentes é usada; No primeiro tratamento, uma única Agrobacterium é usada contendo um único T-DNA que compreende os seguintes componentes: cassete RB + U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM em que o gRNA é projetado para guiar a proteína dCAS9 para se ligar e cortar o gene ALS de maís endógeno, ii) um UBI PRO::CAS9::PINII TERM, iii) um cassete de expressão contendo um cassete de expressão PLTP PRO::ZM-WUS2:: IN2-1 TERM (o Plasmídeo de Controle). No segundo tratamento, uma mistura de duas Agrobacteria é usada; na primeira Agrobacterium, um plasmídeo contém um vetor binário com os seguintes componentes dentro do T-DNA; i) a) um cassete U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM em que o gRNA é projetado para guiar a proteína dCAS9 para se ligar e cortar o gene ALS de maís endógeno, ii) um cassete de expressão contendo um cassete de expressão PLTP PRO::ZM- WUS2:: IN2-1 TERM e um cassete de expressão PLTP PRO::CAMV- REPA::IN2-1 TERM. A segunda Agrobacterium contém um T-DNA com uma sequência (não em um cassete de expressão) que será usado como o modelo de edição para modificar o gene ALS (o Plasmídeo de Teste). A primeira e a segunda Agrobacteria são misturadas em uma razão de 9:1 e usada para transformação.
[0382] Após a transformação mediada por Agrobacterium com cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- contendo o plasmídeo de controle, durante a maturação e regeneração embrionária somática, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Com o uso do plasmídeo de controle na Agrobacterium, espera-se que a frequência de recuperação de plantas T0 (em relação ao número de embriões imaturos infectados com Agrobacterium) que contêm um locus ALS endógeno modificado além do T-DNA integrado (com cassetes de expressão CAS9, WUS e gRNA a uma frequência de 5 a 10%). Quando o segundo tratamento com a Agrobacterium é testado, espera-se que as frequências de transformação sejam mais altas que o controle, o crescimento dos embriões somáticos transgênicos seja acelerado e a frequência de recuperação de plantas T0 cujas plantas T0 contendo o gene ALS modificado sem integrações adicionais do segundo T-DNA serão recuperadas a uma frequência mais alta. Espera-se que o posicionamento dos cassetes de expressão dCAS9, REPA e WUS2 no segundo T-DNA (dentro da Agrobacterium de titulação inferior) forneça um estímulo aprimorado de edição de genes ALs sem a integração concomitante dos cassetes de expressão de gene morfogênico. Exemplo 8: Uso de um cassete de expressão de fator morfogênico e um cassete de fusão dCas~repressor expresso de modo constitutivo fora das bordas de T-DNA estimula transformação e seleções de plantas de maís T0 de cópia única que não contém fator morfogênico ou cassetes de expressão RepA
[0383] Um "Dead-CAS9" (dCAS9) conforme usado no presente documento, é usada para fornecer um domínio repressor traducional. A dCAS9 foi mutada de modo que não possa mais cortar o DNA. A dCAS0 ainda pode se ligar quando guiada para uma sequência pelo gRNA e também pode ser fundida aos elementos repressores (consulte Gilbert et al., Cell julho de 2013 18; 154(2): 442-451, Kiani et al., novembro de 2015 Nature Methods Vol.12 No.11: 1051 a 1054). A dCAS9 fundida ao elemento repressor, conforme descrito no presente documento, é abreviada como dCAS9~REP, em que o elemento repressor (REP) pode ser qualquer um dos motivos repressores conhecidos que foram caracterizados em plantas (consulte Kagale and Rozwadowski, 20010 Plant Signaling & Behavior5:6, 691-694 para análise). Um RNA guia expresso (gRNA) se liga à proteína dCAS9~REP e alveja a ligação da proteína de fusão dCAS9-REP para uma sequência de nucleotídeos predeterminada específica dentro de um promotor (um promotor dentro do T- DNA). Por exemplo, se isso for expresso Beyond-the Border usando um cassete ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::PINII TERM juntamente com um cassete U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM e o gRNA for projetado para guiar a proteína dCAS9- REP para se ligar ao promotor SB-UBI no cassete de expressão SB-UBI
PRO::moPAT::PINII TERM dentro do T-DNA, qualquer evento que tem sequência Beyond-the-Border integrada será sensível a bialafos. Os eventos transgênicos que integram apenas o T-DNA podem expressar moPAT e ser resistentes a bialafos. A vantagem de usar uma proteína dCAS9 fundida a um repressor (em oposição a TETR ou ESR) é a capacidade de alvejar esses repressores para qualquer promotor dentro do T-DNA. TETR e ESR são restritas a sequências de ligação de operador cognatas. Alternativamente, uma Nuclease de Dedo de Zinco sintética fundida a um domínio repressor pode ser usada no lugar do gRNA e dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4:231) conforme descrito acima.
[0384] Para esses experimentos, dois plasmídeos são comparados. o primeiro contém um T-DNA que compreende os seguintes componentes: RB + SI-UBI3 PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM + SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM + LB (o Plasmídeo de Controle). O segundo plasmídeo contém os mesmos componentes dentro do T-DNA (RB + SI-UBI3 PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM + SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM + LB) mais três cassetes de expressão adicionais imediatamente além da borda esquerda: i) um cassete de expressão contendo ZM-U6 PRO::gRNA::ZM-U6 TERM; ii) cassete de expressão ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::PINII TERM; e iii) um cassete de expressão PLTP PRO::ZM-WUS2:: IN2-1 TERM (o Plasmídeo de Teste). O gRNA dentro do primeiro cassete de expressão foi projetado para alvejar a sequência dCAS9~REP à SB-ALS PRO que silencia transcricionalmente a expressão de HRA e torna a célula sensível a imazapir.
[0385] Após a transformação mediada por Agrobacterium com cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- contendo o plasmídeo de controle, durante a maturação e regeneração embrionária somática, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Com o uso do plasmídeo de controle na Agrobacterium,
espera-se que a frequência de recuperação de plantas T0 (em relação ao número de embriões imaturos infectados com Agrobacterium) que são cópias únicas para os genes de traço dentro do T-DNA sem cadeia principal de vetor (plasmídeo) seja de aproximadamente 5%. Quando o plasmídeo de teste é usado na Agrobacterium, espera-se que as frequências de transformação sejam mais altas que o controle, o crescimento de embriões somáticos transgênicos seja acelerado e a frequência de recuperação de plantas T0 que são cópias únicas para os genes de traço dentro do T-DNA, embora sem WUS e dCAS9~REP integradas e sem cadeia principal de vetor (plasmídeo) sejam aumentadas em relação ao tratamento de controle. Espera-se que o posicionamento dos cassetes expressão dCAS9~REP e WUS2 fora da borda esquerda do T-DNA forneça um estímulo aprimorado de transformação sem a integração concomitante desses cassetes de expressão de gene morfogênico.
[0386] Alternativamente, uma Nuclease de Dedo de Zinco sintética fundida a um domínio repressor pode ser usada no lugar do gRNA e dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4:231) no exemplo acima.

Claims (21)

Reivindicações
1. Método de edição de um polinucleotídeo alvo no genoma de uma célula alvo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma endonuclease Cas para a célula alvo, (b) fornecer pelo menos um fator morfogênico heterólogo para uma célula não alvo, em que o fator morfogênico heterólogo não é fornecido para a célula alvo, e (c) incubar a célula alvo para permitir que a endonuclease Cas e um RNA guia formem um complexo que reconheça, se ligue a, e corte ou clive o polinucleotídeo alvo; em que a edição é selecionada dentre o grupo que consiste em: inserção de pelo menos um polinucleotídeo, deleção de pelo menos um polinucleotídeo, alteração molecular de pelo menos um polinucleotídeo, substituição de pelo menos um polinucleotídeo, e uma combinação de pelo menos dois dos anteriores.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de (a) é fornecida como um polinucleotídeo em um construto diferente da composição de (b).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de (a) é fornecida como um polinucleotídeo no mesmo construto que a composição de (b).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator morfogênico é fornecido como um polipeptídeo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator morfogênico é fornecido por meio da regulação crescente de um gene de fator morfogênico endógeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma sequência de polinucleotídeos que codifica a endonuclease Cas ou o RNA guia ou ambos é fornecida como um construto recombinante em um vetor de T-DNA entre as bordas esquerda e direita, em que o vetor de T-DNA compreende adicionalmente o pelo menos um fator morfogênico fora das bordas esquerda e direita.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endonuclease Cas de (a) ou o fator morfogênico de (b) ou ambos compreendem adicionalmente um motivo de peptídeo de penetração celular na extremidade 3', na extremidade 5', ou em ambas as extremidades.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endonuclease Cas de (a) é fornecida como uma molécula de polinucleotídeo em um primeiro vetor que compreende adicionalmente, fora das bordas de T-DNA, um repressor fundido a um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease Cas que carece de atividade de nuclease, em que o dito repressor tem capacidade de se ligar a um elemento regulador operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a endonuclease Cas de (a).
9. Método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma endonuclease Cas para uma célula, e (b) fornecer pelo menos um fator morfogênico para a célula, em que o fator morfogênico é fornecido como um construto recombinante como parte de um vetor de T-DNA, em que a sequência de polinucleotídeos que codifica o fator morfogênico se situa fora das bordas de T-DNA esquerda e direita; e (c) incubar a célula alvo para permitir que a endonuclease Cas e um RNA guia formem um complexo que reconheça, se ligue a, e corte ou clive o polinucleotídeo alvo; em que a edição é selecionada dentre o grupo que consiste em: inserção de pelo menos um polinucleotídeo, deleção de pelo menos um polinucleotídeo, alteração molecular de pelo menos um polinucleotídeo, substituição de pelo menos um polinucleotídeo, e uma combinação de pelo menos dois dos anteriores.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição de (a) é fornecida como um polinucleotídeo em um construto diferente da composição de (b).
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição de (a) é fornecida como um polinucleotídeo no mesmo construto que a composição de (b).
12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o fator morfogênico é fornecido como um polipeptídeo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a endonuclease Cas de (a) ou o fator morfogênico de (b) ou ambos compreendem adicionalmente um motivo de peptídeo de penetração celular na extremidade 3', na extremidade 5', ou em ambas as extremidades.
14. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a endonuclease Cas de (a) é fornecida como uma molécula de polinucleotídeo em um primeiro vetor que compreende adicionalmente, fora das bordas de T-DNA, um repressor fundido a um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease Cas que carece de atividade de nuclease, em que o dito repressor tem capacidade de se ligar a um elemento regulador operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a endonuclease Cas de (a).
15. Método de edição de um polinucleotídeo no genoma de uma célula alvo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma endonuclease Cas para uma célula, (b) fornecer pelo menos um fator morfogênico para a célula, em que o fator morfogênico é fornecido por meio da estimulação ou regulação crescente de um gene de fator morfogênico endógeno, e (c) incubar a célula alvo para permitir que a endonuclease Cas e um RNA guia formem um complexo que reconheça, se ligue a, e corte ou clive o polinucleotídeo alvo;
em que a edição é selecionada dentre o grupo que consiste em: inserção de pelo menos um polinucleotídeo, deleção de pelo menos um polinucleotídeo, alteração molecular de pelo menos um polinucleotídeo, substituição de pelo menos um polinucleotídeo, e uma combinação de pelo menos dois dos anteriores.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que o fator morfogênico é selecionado dentre o grupo que consiste em: Wuschel, Proteína de Desenvolvimento de Óvulo e Babyboom.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introduzir um modelo de modificação de polinucleotídeo na célula alvo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introduzir uma molécula de DNA doador de polinucleotídeo heterólogo na dita célula alvo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula vegetal, e um benefício é conferido à célula vegetal ou a um tecido ou organismo que compreende a célula vegetal; em que o dito benefício é selecionado dentre o grupo que consiste em: saúde aprimorada, crescimento aprimorado, fertilidade aprimorada, fecundidade aprimorada, tolerância ambiental aprimorada, vigor aprimorado, resistência a doenças aprimorada, tolerância a doenças aprimorada, tolerância aprimorada a uma molécula heteróloga, condição física aprimorada, característica física aprimorada, massa maior, produção aumentada de uma molécula bioquímica, produção diminuída de uma molécula bioquímica, regulação crescente de um gene, regulação decrescente de um gene, regulação crescente de uma via bioquímica, regulação decrescente de uma via bioquímica, estimulação de reprodução celular e supressão de reprodução celular.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente regenerar um organismo ou tecido a partir da célula.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 15, caracterizado pelo fato de que a edição de um polinucleotídeo no genoma da célula modula um traço de importância agronômica em uma planta obtida ou derivada da célula, em que o traço de importância agronômica é selecionado dentre o grupo que consiste em: resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aprimoramento de rendimento, melhoria da saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento de capacidade fotossintética, melhoria nutricional, composição de proteína alterada, composição de óleo alterada, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, composição de proteína de semente alterada e composição de nutriente de semente alterada; em comparação com uma planta de isolinhagem que não compreende ou é derivada de uma célula cujo genoma foi editado com a dita endonuclease Cas guiada por RNA.
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