CZ302698A3 - Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility, inbrední a hybridní rostliny Brassica, homozygotní v Rf genu, jednotlivé části zmíněných rostlin, použití zmíněných rostlin, olejnatá semena těchto rostlin a jejich použití a olej a beztuková mouka, získané ze zmíněných semen - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Rostliny rodu Brassica s /Brassica napus, Brassica juncea, Brassica caprestrius/ homozygotním genem pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmické sterility tvoří po plylení semena s obsahem glukosinolátů do 30 .mi.mol/g a obsahem kyseliny erukové do 2 % hmotn. celkového obsahu mastných kyselin. Olejnatá semena produkovaná zmíněnými rostlinami lze použít pro výrobu oleje a/nebo mouky. Výše uvedené rostliny lze dále použít pro šlechtění inbredních a hybridních linií Brassica požadovaných vlastnostní.

• 4 · 4

4 4 4

4 4 4 • 444 4 4

4 4

4 • · ··

ROSTLINA RODU BRASSICA OBSAHUJÍCÍ HOMOZYGOTNÍ GEN PRO OBNOVU PLODNOSTI U OGURA SAMČÍ CYTOPLAZMATICKÉ STERILITY, INBREDNÍ A HYBRIDNÍ ROSTLINY BRASSICA, HOMOZYGOTNÍ V Rf GENU, JEDNITLIVÉ ČÁSTI ZMÍNĚNÝCH ROSTLIN, POUŽITÍ ZMÍNĚNÝCH ROSTLIN, OLEJNATÁ SEMENA TĚCHTO ROSTLIN A JEJICH POUŽITÍ A OLEJ A BEZTUKOVÁ MOUKA, ZÍSKANÉ ZE ZMÍNĚNÝCH SEMEN.

Oblast techniky

Olejnatá semena brukvovitýeh rostlin jsou stále důležitějším zemědělským produktem. Svým komerčním významem se brukev coby zdroj rostlinného oleje v součastné době řadí těsně za sóju a palmu a je srovnatelná se slunečnicí. Olej ze semen brukvovitýeh je používán jak ve studené, tak i v teplé kuchyni.

Ve své prvotní formě byl brukvový olej, známý též jako řepkový olej, pro člověka škodlivý díky relativně vysokému obsahu kyseliny erukové. Obsah kyseliny erukové se v přirozených kultivarech obvykle pohybuje okolo 30 až 50 % hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin. Tento problém byl překonán když vědci objevili zdroj řepkového oleje s nízkým obsahem kyseliny erukové (Stefansson, 1983).

Vědci se dále pokoušeli zdokonalit poměry v zastoupení mastných kyselin v řepkovém oleji (Robbelen 1984; Ratledge a kol., 1984; Robbelen a kol., 1975; Rakow a kol., 1973).

Zvláště zajímavé byly pro vědce tzv. dvounulové odrůdy, tj. takové, vyznačující se nízkým podílem kyseliny erukové v oleji a nízkým podílem glukosinolátů v sušině vzniklé po extrakci oleje (tj. obsahující méně než 2 procenta své hmotnosti kyseliny erukové (v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin), a obsahující • ♦ ··* · · ·»

9 9 9 9 · 9 9 9 9 · · ···· · · · · ·· ·· ··· ··· 9 · méně než 30 pmol glukosinolátů v jednom gramu beztukově sušiny). Tyto kvalitnější typy řepky, poprvé vyšlechtěné v Kanadě, jsou známé také jako „canola“.

Dosavadní stav techniky

V poslední době vědci namířili své úsilí směrem k další redukci obsahu glukosinolátů, a to až na úroveň nižší než 20 pmol glukosinolátů na jeden gram beztukové sušiny u jarních odrůd (měřeno pomocí stanovení trimethylsilylových derivátů - TMS) (Sosulski a Dabrowski, 1984) a nižší než 20 pmol/g celkové hmoty semen u zimních odrůd (stanoveno HPLC) (International Organization for Standardization, č. ISO 9167-1:1992).

Glukosinoláty jsou sloučeniny síry, které zůstávají v beztukové sušině získané ze semen poté co byla tato rozmělněna a olej byl vyextrahován. Jsou to sloučeniny glukózy s alifatickými uhlovodíky (3-butenyl glukosinolát, 4-pentenyl glukosinolát, 2hydroxy-3-butenyl glukosinolát a 2-hydroxy-4-pentenyl glukosinolát). Alifatické glukosinoláty se někdy nazývají také alkenyl glukosinoláty. Aromatické glukosinoláty jsou známé i pod názvem indoly. Vysoké hladiny glukosinolátů jsou nežádoucí, neboť při jejich zpracování enzymem myrosinázou dochází ke vzniku toxického vedlejšího produktu.

Myrosináza je enzym přirozeně se vyskytující u Brassicaceae. Při rozrušení semen Brassicaceae je myrosináza uvolňována a katalyzuje štěpení glukosinolátů na glukózu, isothiokyanáty, thiokyanáty a nitrily. Po odštěpení od glukózy jsou tyto další produkty pro některé savce toxické.

4· • 4 4 • 4 444 • · 4 • · · *

4· • 4 44 44

4 4 4 4 44 4

4 4 4 44

44 444 4 4 ♦ · 4 4 4 • 44 444 44 44

Isothiokyanát například inhibuje syntézu tyroxinu ve štítné žláze a má i další antimetabolické účinky (Paul a kol, 1986). Byly činěny pokusy o inaktivaci enzymu mirozinázy (například s použitím páry), nebyly však zcela úspěšné.

Řepka se vyznačuje vysokými hladinami glukosinolátů (100 pmol/gram - 200 pmol/gram beztukové sušiny), zatímco canola obsahuje glukosinoláty v mnohem menších koncentracích (méně než 30 μηιοΐ/gram beztukové sušiny). Mnoho zemí hladiny glukosinolátů v canole redukuje. V Evropě například musí zimní canola obsahovat méně než 25 μιηοΐ glukosinolátů na gram semen při 8,5% vlhkosti (měřeno HPLC). V Kanadě musí jarní canola obsahovat méně než 30 pmol glukosinolátů na gram semen při 0% vlhkostí (měřeno TMS). Mnoho zemí vyžaduje dokonce ještě nižší hladiny glukosinolátů, aby povolily registraci dvounulové odrůdy na svém území.

Při šlechtění nových, zdokonalených odrůd Brassicaceae používají pěstitelé selfinkompatibilní* (SI), samčí cytoplazmaticky sterilní (CMS) a samčí jaderně sterilní (NMS) rostliny jako samičího rodiče. Tímto způsobem se pěstitelé pokoušejí zvýšit produkci semen a kvalitu Fl hybridů a snížit náklady na šlechtění nových odrůd. Pokud je hybridizace prováděna bez použití SI, CMS a NMS rostlin, je mnohem obtížnější získat a izolovat požadované znaky ve filiální (Fl) generaci, neboť rodiče mohou opylovat jak sami sebe, tak sebe navzájem. Jestliže je jeden z rodičů SI, CMS nebo NMS rostlina, je neschopen produkovat pyl a tudíž dochází pouze ke zkříženému opylování. Odstraněním pylu u jednoho rodiče v křížení je zajištěno získání hybridních semen jednotné * tj. neschopné oplodnit vlastním pylem vlastní vajíčka «4 9 4

4 4 4 · 44

4 4 4

4 4

44

44 ·

4 4 4 4 · • · 444 * • · 4 ·♦ ·

4 4 4 4

44 4444 kvality a pěstitel si může být jist, že došlo pouze k jednoduchému křížení.

F1 hybridní rostliny mohou být například výsledkem křížení CMS samičí rostliny Brassica a s pyl produkující samčí rostlinou Brassica. Ovšem aby mohlo dojít k účinné reprodukci, musí nést samčí rodič F1 hybrida gen pro obnovení plodnosti (Rf gen). Přítomnost Rf genu znamená, že F1 generace není úplně nebo částečně sterilní, a tak může dále docházet k samoopylení nebo ke křížovému opylení. Samoopylení u F1 generace, vedoucí ke vzniku následných generací, je nezbytné pro zajištění dědičnosti a stability požadovaného znaku u nové odrůdy a umožňuje novou odrůdu izolovat.

Jednou ze samčích cytoplazmaticky sterilních rostlin, používaných pro šlechtění Brassicaceae je samčí cytoplazmaticky sterilní ogura (OGU) (R. Pellan-Delourme a kol., 1987). Rf gen pro OGU rostliny byl získán z ředkve Raphanus sativus a vnesen do rostliny brukve v Institute National de Recherche Agricole (INRA) v Rennes ve Francii (Pelletier a kol·., 1987). Tento Rfl gen, pocházející z ředkve je popsán v WO 92/05251 a v Delourme a kol., (1991).

Tento Rf gen je ovšem pro komerční využití nevhodný, neboť potomci křížení a hybridní rostliny nesoucí tento Rf gen vykazují zvýšené hladiny glukosinolátů a přítomnost genu je úzce spjata s poklesem počtu semen v šešuli (Pellan-Delourme a kol., 1988; Delourme a kol, 1994). V případě hybridních rostlin jsou hladiny glukosinolátů zvýšeny dokonce i když samičí rodič vykazoval jejich snížený obsah. Tyto koncentrace, typicky vyšší než 30 gmol glukosinolátů na gram beztukové sušiny, přesahují koncentrace přípustné pro registraci semen ve většině zemí světa. Tudíž tento gen může být použit pro výzkumné účely, ovšem nikoliv pro přímý vývoj komerčně využitelných hybridních odrůd canola kvality. Dosud není dostupný žádný další zdroj Rf genu pro ogura samčí cytoplazmatický sterilní rostliny.

INRA poukázal na obtíže spojené se získáváním linií s obnovenou plodností a zároveň nízkými koncentracemi glukosinolátů (Delourme a kol·., 1994; Delourme a kol., 1995). Podle INRA jsou tyto obtíže zapříčiněny spojením mezi obnovou samčí plodnosti a obsahem glukosinolátů v použitém materiálu. Podle INRA musí být v nových liniích eliminována větší část genetické informace ředkve (Delourme a kol., 1995). Ačkoliv byly během několika posledních let v této oblasti učiněny jisté pokroky, izozymové studie dokazují že Rf gen stále s sebou nese část genetického materiálu ředkve (Delourme a kol., 1994). <·

INRA se pokoušel vyvinout gen pro obnovu plodnosti asociovaný se sníženou hladinou glukosinolátů. Byl popsán heterozygot nesoucí zmíněný gen, vykazující obsah glukosinolátů asi 15 pmol/g (Delourme a kol., 1995). Ovšem (i) organizmus byl pro zmíněný gen heterozygotní (Rfrf), nikoliv homozygotní (RfRf), (ii) popsána byla jediná hybridní rostlina a nikoliv inbrední linie, (iii) nebyl uveden dostatečný počet důkazů prokazujících nízkou hladinu glukosinolátů u zmíněného hybrida, (iv) nebyly uvedeny žádné údaje o tom, zda byla nízká koncentrace glukosinolátů přenesena i na potomky zmíněného hybrida a (v) hybrid byl vyselektován a dále hodnocen jen v jediném prostředí - v polních pokusech nebylo prokázáno, zda snížený obsah glukosinolátů zůstává stabilní i v následných generacích. INRA na komerční trh nezavedl ani jediný homozygotní hybrid se sníženým obsahem glukosinolátů. Popsaný organizmus (slouží-li jako samčí inbrední rodič) (Delourme a kol., 1995) nemůže být použit pro vyšlechtění inbrední linie nebo jednoduše křížených hybridů se sníženým obsahem glukosinolátů pro komerční využití.

Kanadská patentová přihláška 2,143,781 Yamashita a kol., publikovaná 11. září 1995 popisuje způsob hybridního křížení zemědělských plodin čeledi Brassicaceae kdy F1 generace je produktem křížení samičího rodiče SI samčí sterilní linie se samčím rodičem. V jednom z modelů nese samčí rodič gen pro obnovu plodnosti. Gen pro obnovu plodnosti (1M-B) je určen pro MS-NI-odvozenou cytoplazmu a byl odvozen od zimní odrůdy (IMlinie). Dále byl zmíněný samčí rodič křížen s jarní dvounulovou odrůdou (62We). Ačkoliv autoři považují tento gen za odpovědný za snížení hladiny glukosinolátů, není vhodný pro použiti u ogura cytoplazmatické samčí sterility.

Genetici se dále pokoušeli vnést Rf geny z ředkve do rostlin řepky pomocí mezirodového křížení. Ovšem tyto pokusy nebyly uvedeny do praxe. V kanadské patentové žádosti 2,108,230, Sakai a kol., publikované 12. října 1993 je předmětem nároku gen pro obnovu plodnosti z ředkve, který byl vnesen do rostliny brukve buď buněčnou fůzí, nebo mezirodovým křížením. Tato patentová přihláška ovšem neobsahuje 1) gen pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility zajišťující sníženou hladinu glukosinolátů v olejnatých semenech F1 generace, ani 2) výhodné použití genu pro obnovu plodnosti při vývoji inbredních linií a jednoduše křížených hybridů pro komerční použití (když φφ φφ • φ φ • φφφφ • φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφ • φ φ · φ φ φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ organizmus nesoucí gen pro obnovu plodnosti je použit jako samčí inbrední rodič).

Dalším pokusem INRA jak se vyhnout vysokému obsahu glukosinolátů v OGU rostlinách nesoucích gen pro obnovu plodnosti bylo vyšlechtění odrůdy Brassica napus nazvané SYNERGY® ve spolupráci se Serasem (UNCAG). SYNERGY® je křížencem OGU SAMOURAI® (vyšlechtěné v INRA) a samčí fertilní odrůdy FALCON® (vyšlechtěné v NPZ). FALCON nenese gen pro obnovu plodnosti OGU cytoplazmatické samčí sterility a tudíž je F1 hybridní generace sterilní. SYNERGY je na trhu prodávána jako sdružená odrůda (CUL - composite hybrid line), která se skládá ze směsi zhruba 80 % F1 hybridů SYNERGY vykazujících samčí sterilitu a 20 % fertilních rostlin (FALCON), které zajišťují pyl pro tvorbu semen na samčích sterilních F1 rostlinách po vysetí na poli.

Ovšem i používání sdružené odrůdy přináší mnohé potíže. Mezi nej důležitější z nich patří: 1) fakt, že Brassica napus patří mezi samosprašné druhy, a tudíž za špatných podmínek pro opylování (dlouhotrvající zima, vlhké počasí) může být omezen přenos pylu ze samčích fertilních rostlin na F1 hybridní rostliny, což má za následek špatnou tvorbu semen a nízké výtěžky, a 2) fakt, že F1 hybridní rostliny jsou vitálnější, než rostliny odrůdy FALCON, a tudíž mohou rostliny FALCON vytlačit, což může způsobit nedostatek pylu pro optimální tvorbu semen a tím i nízké výtěžky. Až dosud se nikomu nepodařilo vyšlechtit rostlinu homozygotně dominantní v genu pro obnovu plodnosti (RfRf) u ogura cytoplazmatické samčí sterility, jejíž semena by vykazovala nízké hladiny glukosinolátů. Požadovaná rostlina musí být v genu pro «4 44

4 4

Φ ΦΦΦΦ

Φ Φ Φ

4 4

44

ΦΦ Φ Φ Φ Φ

Φ Φ ΦΦ

Φ ΦΦΦ Φ 4

Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ obnovu plodnosti homozygotně dominantní (RfRf), aby mohla být použita pro šlechtění inbrední linie s obsahem tohoto genu nebo pro výrobu jednoduše křížených hybridů pro komerční použití. V ideálním případě by měla být koncentrace glukosinolátů hluboko pod limity stanovenými v mnoha zemích pro canolu. Jedině tak by mohli pěstitelé využít tuto zdokonalenou rostlinu k produkci inbredních brukví a hybridů s nízkým obsahem glukosinolátů v olejnatých semenech. To by bylo velmi výhodné pro farmáře, kteří by mohli pěstovat hybridní brukve, které by po opylení tvořily semena s nízkým obsahem glukosinolátů a i s dalšími požadovanými vlastnostmi.

V mnoha zemích nejsou olejnatá semena produkovaná na farmách pro lisování oleje nebo na export vůbec testována na obsah glukosinolátů. Někdy může i jistá část eanoly vykazovat vysoký obsah glukosinolátů, což je způsobeno kontaminací velké části zrna, do kterého je přidávána canola velmi špatné kvality. Bylo by s výhodou snížit obsah glukosinolátů v semenech pod standardní úroveň stanovenou v mnoha zemích, neboť by se tím zabránilo možné kontaminaci zrna.

Je tedy zřejmé, že existuje potřeba vyšlechtit zdokonalenou brukev, homozygotní v genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility, která produkuje olejnatá semena s nízkým obsahem glukosinolátů. Dosud byly rostliny brukve, nesoucí gen pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility (i) převážně heterozygotní v Rf znaku, nebo (ii) neprodukovaly olejnatá semena s nízkým obsahem glukosinolátů. Obsah glukosinolátů v lakových semenech byl ve skutečnosti vyšší než 30 pmol/gram beztukové sušiny.

ftft ·· · · ·* ·· • ftft ftft·· ftft·· • · ftftft · * · · ·· ftft··· · · · ··· · · ft··· · ♦ ftftft • ft ftft ftftft ftftft ftft tft

Předmětem navrhovaného vynálezu je zdokonalená rostlina brukve, která je homozygotně dominantní v genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility a která vykazuje obsah glukosinolátů nižší než 30 pmol/gram semen. Taková rostlina může být využita pro přípravu inbredních linií nebo hybridů s nízkým obsahem glukosinolátů. To by umožnilo produkci jednoduše křížených hybridů s plně obnovenou plodností a s geneticky nízkým obsahem glukosinolátů jak v hybridních semenech, tak v olejnatých semenech sklizených z hybridních rostlin.

Předmětem navrhovaného vynálezu jsou dále olejnatá semena Brassica nesoucí jaderný gen pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility se zlepšeným obsahem glukosinolátů.

Dále je předmětem vynálezu zdokonalená inbrední linie Brassica s obsahem genu pro obnovu plodnosti a dále použití takových rostlin coby samčích inbredních rodičů při přípravě jednoduše křížených hybridů pro komerční použití.

Dále jsou předmětem vynálezu olej a jedlá mouka se zlepšeným obsahem glukosinolátů, vzniklé rozdrcením semen a extrakcí oleje.

Tyto a další možné aspekty a výhody navrhovaného vynálezu budou odborníkům jistě zřejmé po přečtení následujícího popisu vynálezu a přiložených patentových nároků.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález se týká rostlin rodu Brassica homozygotních v genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility, které po oplylení tvoří olejnatá semena s celkovým obsahem • · • ··· φ φ · · φφ ·Φ • ·φ · φ φ φ φφ • φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ glukosinolátů nižším než 30 pmol/gram, raději pak nižším než 25 pmol/gram, nej raděj i ale nižším než 20 pmol/gram.

Olejnatá semena Brassica, homozygotní v genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility a vykazující celkový obsah glukosinolátů nižší než 30 pmol/gram, 25 pmol/gram, nebo nejlépe 20 pmol/gram mohou být použita pro přípravu oleje a/nebo mouky.

Navrhovaný vynález se dále týká rostlin rodu Brassica homozygotních v genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility, které po opylení vytváří semena vykazující (i) celkový obsah glukosinolátů ne vyšší než 30 pmol/gram a obsah kyseliny erukové ne vyšší než 2 % hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin, (ii) celkový obsah glukosinolátů ne vyšší než 25 pmol/gram a obsah kyseliny erukové ne vyšší než 2 % hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin, nebo (iii) celkový obsah glukosinolátů ne vyšší než 20 pmol/gram a obsah kyseliny erukové ne vyšší než 2 % hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin. Použitou rostlinou může být Brassica napus, Brassica campestris, nebo Brassica juncea. Může být označena jako 95SN-9369, 96FNW-1792, 96FNW-1348, 96FNW-1628, nebo jejich sub-linie. Sub-linie mohou být vybrány ze skupiny obsahující 97SN-1650 (sub-linie 95SN-9369), 97SN-1651 (sub-linie 95SN-9369),

96FNW1792-03 (sub-linie 96FNW1792), 96FNW1822-07 (sublinie 96FNW1822) a 96FNW1822-08 (sub-linie 96FNW1822).

Tato rostlina může být použita i k přípravě inbredních linií Brassica, nebo hybridních rostlin Brassica. Po opylení vytváří • · ·

• 4 44 • 4 «

4 « • 44 44

4 « · 4 • 4 4 ·· • 4 44 4 4 4» · · 4

4·· 44 44 inbrední nebo hybridní rostliny olejnatá semena s obsahem glukosinolátů (i) ne vyšším než 30 pmol/gram, (ii) ne vyšším než 25 pmol/gram, nebo (iii) ne vyšším než 20 pmol/gram.

Předmětem vynálezu jsou dále olejnatá semena inbredních nebo hybridních rostlin Brassica. Olejnatá semena mohou být přítomna jako složka převážně homogenní frakce olejnatých semen, která se vyznačuje určitým obsahem glukosinolátů. Předmětem vynálezu je také olej, získaný z těchto semen. Olejnatá semena mohou být produktem rostlin Brassica napus, Brassica campesiris, nebo Brassica juncea. Z vyzrálých olejnatých semen rostlin rodu Brassica se získává endogenní rostlinný olej s obsahem glukosinolátů (i) ne vyšším než 30 μηιοΐ/gram, (ii) ne vyšším než 25 μιηοΐ/gram, nebo (iii) ne vyšším než 20 pmol/gram.

Mouka, která je v podstatě zbavena oleje a je produktem zmíněných olejnatých semen je také předmětem vynálezu. Mouka vykazuje obsah glukosinolátů (i) ne vyšší než 30 pmol/gram, (ii) ne vyšší než 25 pmol/gram, nebo (iii) ne vyšší než 20 pmol/gram. Vynález se dále týká některých jednotlivých částí rostliny rodu Brassica. Tyto části mohou být vybrány ze skupiny obsahující sekvence nukleových kyselin (RNA, mRNA, DNA, cDNA), tkáně, buňky, pyl, vaječné buňky, kořeny, listy, olejnatá semena, mikrospóry a vegetativní části rostliny, to vše buď vyzrálé, nebo zárodečné.

Rostliny Brassica podle vynálezu mohou být použity pro šlechtění nových odrůd rodu Brassica. Šlechtění nových odrůd zahrnuje izolaci a transformaci, běžné pěstování, pěstování čistých odrůd, křížení, samoopylení, haploidii, pěstování z jediného semene a zpětné křížení.

φφφ φ· *· φ • φ φ φ · φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φ •Φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ

Přehled obrázků

Vynález bude dále popsán s ohledem na obrázky.

Obr. 1 zobrazuje příklad přípravy nového rostlinného materiálu Brassica napus 96FNW-1822 podle navrhovaného vynálezu. Celý pokus je detailně popsán v příkladu 3.

Obr. 2 zobrazuje příklad přípravy nového rostlinného materiálu Brassica napus 96FNW-1348 podle navrhovaného vynálezu. Celý pokus je detailně popsán v příkladech 3 a 4.

Obr. 3 zobrazuje příklad přípravy nového rostlinného materiálu Brassica napus 96FNW-1628 podle navrhovaného vynálezu. Celý pokus je detailně popsán v příkladu 3.

Obr. 4 zobrazuje příklad přípravy nového rostlinného materiálu Brassica napus 96FNW-1792 podle navrhovaného vynálezu. Celý pokus je detailně popsán v příkladech 1 a 2.

Obr. 5 zobrazuje příklad přípravy nového rostlinného materiálu Brassica napus 95SN-9369 podle navrhovaného vynálezu a potomky této odrůdy (97SN-1650, 97SN-1651 a další). Celý pokus je detailně popsán v příkladu 6.

POPIS PREFEROVANÝCH ASPEKTŮ VYNÁLEZU

Způsob stanovení glukosiňolátů: Koncentrace glukosinolátů, diskutované v této práci byly určovány pomocí dvou standardních metod, konkrétně (1) vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) tak, jak byla popsána v ISO 9167-1:1992(E), pro kvantitativní stanovení celkových intaktních glukosinolátů a (2) plynová kapalinová chromatografie pro kvantitativní stanovení trimethylsilylových (TMS) derivátů extrahovaných a purifikovaných desulfoglukosinolátů, tak jak to bylo popsáno v ·· ·« • · · • · ··· • * · • · · ·« ·· • · · * · · ·· ·· · · · · • · · · ·· • e · ··· · · • · · · · ··» ·· · ·· · ·

Sosulski a Dabrowski (1984). Obě metody (HPLC i TMS) používané zde pro určení obsahu glukosinolátů zahrnují analýzu pevných částí semen po rozdrcení a extrakci oleje (tj. beztuková sušina).

Metoda stanovení zastoupení mastných kyselin: Koncentrace mastných kyselin, diskutované v této práci, byly určeny standardní metodou zahrnující zbavení olejnatých semen Brassica oleje. Semena jsou nejprve rozdrcena a poté je olej extrahován ve formě methylesterů mastných kyselin. Dále následuje reakce s methanolem a methyloxidem sodným a ve výsledném esteru je pomocí plynové kapalinové chromatografie s použitím kapilární kolony, jež umožňuje separaci na základě stupně nenasycení a délky řetězce, stanoven obsah mastných kyselin. Tato metoda analýzy je popsána v práci J.K. Daun a kol., 1983 (viz. přehled literatury).

Předmět vynálezu: Nová jedlá endogenní rostlinná mouka je získávána z vylepšených olejnatých semen rostlin rodu Brassica která se vyznačuji nízkým obsahem glukosinolátů a případně i kyseliny erukové. Tato olejnatá semena jsou homozygotní v jaderném genu pro obnovu plodnosti u ogura cytoplazmatické samčí sterility. Menší množství glukosinolátů je štěpeno enzymem myrozinázou za vzniku toxických vedlejších produktů. Nová jedlá endogenní mouka podle vynálezu je připravena jednoduchým rozmělněním olejnatých semen rostlin Brassica a jednoduchou fyzickou separací pevných částí semen - mouky - od tukové fáze. Olejnatá semena rostlin rodu Brassica podle navrhovaného vynálezu vykazují obsah glukosinolátů v sušině před rozmělněním a extrakcí oleje nižší než 30 pmol/gram, raději však nižší než 20 • 9 ·· ·· « · · · • · ··· • · · · · • · · ·

99 9

99

9 9 9

9 99

999 · 9

9 9

99 99 pmol/gram. V semenech mohou být obsaženy následující glukosinoláty; alkenyl glukosinoláty (3-butenyl glukosinolát, 4pentenyl glukosinolát, 2-hydroxy-3-butenyl glukosinolát a 2hydroxy-4-pentenyl glukosinolát), MSGL (methylthiobutenyl glukosinolát a methylthiopentenyl glukosinolát) a indolové glukosinoláty (3-indolylmethyl glukosinolát a l-methyloxy-3indolylmethyl glukosinolát), nebo jejich směsi. Glukosinoláty jsou stanovovány přednostně ve vzduchem vysušené beztukové sušině pomocí plynové kapalinové chromatografie (TMS) podle Canadian Grain Commission. Požadované koncentrace glukosinolátů je běžně dosahováno pečlivým výběrem výchozího materiálu, u kterého jsou dosahované koncentrace glukosinolátů známé, a dále pečlivou selekcí, která zajistí udržení těchto koncentrací, a následným kombinováním zmíněných znaků.

Příprava inbredních rostlin s použitím genu pro obnovu plodnosti: Brassica nesoucí gen pro obnovu plodnosti podle navrhovaného vynálezu může být použita pro inbrední křížení pomocí běžných technik. Homozygotní gen pro obnovu plodnosti u Brassicaceae může být vnesen do inbredních rostlin Brassica opakovaným zpětným křížením. Olejnatá semena mohou být například produkována ve shodě s běžným způsobem pěstování Brassica a vznikají v šešuli po samoopylení. Takto vzniklá semena mohou být opět vyseta a po samoopylení vzniká další generace olejnatých semen. Nová odrůda je zprvu vyvíjena (alespoň několik prvních generací olejnatých semen) ve skleníkových podmínkách, kde může být opylení pečlivě sledováno a kontrolováno. Tak může být snadno ověřen obsah glukosinolátů v olejnatých semenech určených pro použití v polních pokusech. Olejnatá semena ··· ·· ·· · · · · ····· 4 * · · ··

-- 444444 44 44*44

IS ···· ·· ··· ·· ·· ··· 4*4 44 44

Brassica vzniklá samoopylením v první i v několika následných generacích jsou sklizena a podrobena zkouškám na požadované znaky za použití v oboru běžně známých metod.

Příprava hybridních rostlin s použitím samčího rodiče nesoucího gen pro obnovu plodnosti: Navrhovaný vynález umožňuje šlechtitelům vnést požadované vlastnosti obnovitele plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility do komerčních hybridních odrůd Brassica. Rostliny mohou být regenerovány pomocí obnovitele plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility podle vynálezu s použitím známých technik. Výsledná olejnatá semena mohou být například běžným způsobem vyseta a pěstována. Nová generace semen vzniká na samičích rodičovských rostlinách zkříženým opylením. Rostliny mohou být pěstovány jak ve skleníku, tak v polních podmínkách. Semena, vzniklá zkříženým opylením v první generaci jsou sklizena a podrobena zkouškám na požadované znaky. Podle navrhovaného vynálezu mohou být použity odrůdy Brassica napus, Brassica juncea a Brassica campesíris.

Hybridní rostlina podle vynálezu může být jednoduše křížený hybrid, dvojitě křížený hybrid, trojitě křížený hybrid, směsný hybrid, složený hybrid, plně regenerovaný hybrid a kterýkoliv další hybrid nebo umělá odrůda známá v oboru vzniklá s použitím genu pro obnovu plodnosti podle vynálezu.

Pro přípravu hybridních rostlin je nezbytné, aby vykazoval samičí rodič (Pi), který je křížen s ogura obnovitelem plodnosti (P₂) hladinu glukosinolátů dostatečně nízkou tak, aby bylo zajištěno, že semena Fi generace budou mít obsah glukosinolátů nižší než je stanovená norma. Koncentrace glukosinolátů v semenech Fi • · hybridní generace je zhruba průměrem koncentrací glukosinolátů v semenech samičího (Pi) a samčího (P₂) rodiče. Hladina glukosinolátů v hybridních semenech F₂ generace je odrazem genotypu Fj hybrida. Jestliže chceme například získat hybridní semena v F₂ generaci s obsahem glukosinolátů nižším než 20 pmol/g pak samčí rodič (OGU) musí mít hladinu glukosinolátů asi 15 pmol/g a samičí rodič musí vykazovat hladinu glukosinolátů nižší než 25 pmol/g.

Příprava rostlin z jejich jednotlivých částí: Rostliny Brassica mohou být regenerovány z částí rostliny Brassica nesoucí gen pro obnovu plodnosti podle vynálezu s použitím běžně známých technik. Výsledná olejnatá semena pak mohou být vyseta a pěstována běžným způsobem a po samoopyleni vzniká nová generace olejnatých semen. Alternativně mohou být extrahovány dvojitě haploidní rostliny pro okamžitou přípravu homozygotní rostliny.

Rostlinná mouka: Podle navrhovaného vynálezu musí jedlá endogenní rostlinná mouka ze semen Brassica obsahovat hladiny glukosinolátů nižší než 30 pmol/g semen. Samičí rodič, použitelný pro šlechtění Brassica za účelem získání semen s obsahem genetických determinant, nezbytných pro dosažení požadované hladiny glukosinolátů, je známý a obecně dostupný. V Severní Americe byla podobná odrůda dostupná už v sedmdesátých letech tohoto století.

Mezi zimní odrůdy nesoucí genetický potenciál pro expresi nízkých hladin glukosinolátů patří v Evropě komerčně dostupné odrůdy PRESTOL®, EUROL®, BRISTOL® (Všechny dostupné od firmy Semences Cargil) a TAPIDOR®, SAMOURAI® (Serasem).

·· ·· • · · · * • · · ·· • · ··· · • · · · · · • · · · » • · · · • *·· · · • · ·

Mezi jarní odrůdy nesoucí genetický potenciál pro expresi nízkých hladin glukosinolátů patří v Kanadě komerčně dostupné odrůdy BULLET®, GARRISON® a KRISTANA® (Svalof Weibull).

K dalším zimním odrůdám, nesoucím genetickou informaci pro expresi nízkých hladin glukosinolátů, které jsou komerčně dostupné v Evropě patří APEX®, GOELAND®, FALCON®, LIRAJET®, CAPITOL® a EXPRESS®.

Genetický materiál pro expresi genů zajišťujících nízké koncentrace glukosinolátů je dostupný i v American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852. Semena uložená v ATCC obsahující gen obnovitel plodnosti jsou 97SN-1650 (přístupové číslo ATCC 97838), 97SN-1Ó51 (přístupové číslo ATCC97839), 96FNW1792-03 (přístupové číslo ATCC 209001) a 96FNW1822-07 (přístupové číslo 209002). Tak nízké hladiny glukosinolátů v olejnatých semenech Brassica velmi zvyšují komerční hodnotu mouky.

Jedlý rostlinný olej získávaný z olejnatých semen Brassica obsahuje mastné kyseliny a i další složky, které jsou kontrolovány na genetické úrovni (viz. US Patent Application Improved Oilseed Brassica Bearing an Endogenous Oil Wherein the Levels of Oleic, Alpha-Linoleie and Saturated Fatty Aeids Are Simultaneously Provided In An Atypical Highly Beneficál Distribution Via Genetic Control, Pioneer Hi-Bred International, lne., WO91/15578; a US Patent 5,387,758, který je zde citovaný). Kyselina eruková je v olejnatých semenech Brassica zastoupena nejraději ne více než dvěma procenty hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin a její koncentrace je kontrolována na genetické úrovni spolu s dalšími již zmiňovanými znaky. Genetický materiál • · ·· • · · · • · · 4 · · · · ·· ·· ··· ··· ·· ·· zajišťující expresi požadovaných nízkých koncentrací kyseliny erukové může být odvozen od mnoha komerčně dostupných dvounulových odrůd vhodných agronomických vlastností jakými jsou například 46A05, 46A65, BOUNTY®, CYCLONE®, DELTA®, EBONY®, GARRISON®, IMPACT®, LEGACY®, LEGEND®, PROFIT® a QUANTUM®. Všechny tyto odrůdy jsou registrované v Kanadě a jsou v této zemi běžně komerčně dostupné.

Odolnost vůči herbicidům: Odborníkům je již jistě zřejmé, že navrhovaný vynález lze použít při vývoji nových odrůd Brassica, které budou obnoviteli plodnosti pro ogura samčí cytoplazmatickou sterilitu, které budou produkovat olejnatá semena s nízkým obsahem glukosinolátů a které mohou nést i další požadované znaky. Mezi takové komerčně požadované znaky patří například takové znaky, které snižují náklady na výrobu a nebo ty, které zvyšují kvalitu úrody. Jedním z nich je například odolnost vůči herbicidům (viz příklad 4-1 a 4-2 které popisují vyšlechtění odrůd nesoucích gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility a zároveň vykazujících různé typy rezistence k herbicidním látkám).

V některých případech může být do rostlin podle vynálezu vnesen i genetický materiál zajišťující toleranci k určité koncentraci herbicidu, která je letální pro rostliny, jež zmíněný genetický materiál postrádají (US Patent 5,387,758).

Šlechtitelské metody: Bylo zjištěno, že je-li jednou dosaženo požadované kombinace znaků, mohou být tyto přeneseny do dalších rostlin v rámci druhu {Brassica napus, Brassica campestris, nebo Brassica juncea) běžně používanými šlechtitelskými metodami, jakými jsou například zkřížené opyleni nebo selekce potomků. Překvapivě byla prokázána vysoká dědivost genu pro obnovu plodnosti v kombinaci s nízkým obsahem glukosínolátů, tj. schopnost přenosu na potomstvo, a schopnost obnovy zmíněných vlastností v izolovaném potomstvu generací následujících po křížení.

Stejně jako v rámci druhu mohou být zmíněné znaky přenášeny i mezi druhy napus, campestris a juncea a to s použitím stejných technik přenosu pylu a selekce potomstva. Přenos znaků mezi jednotlivými druhy rodu Brassica, například B. napus a B. campestris standardními technikami rostlinné genetiky je v literatuře kvalitně zdokumentován (viz. například Tsunada a kol., 1980).

Příkladem přenosu požadovaných znaků z druhu B. napus na B. campestris může být mezidruhové křížení odrůd B. campestris var. REWARD®, GOLDRUSH® a KLONDIKE® s vhodnou rostlinou B. napus, například zde již diskutovaná varieta 95SN-9369. Podobně mohou být vyšlechtěny i další nezávislé odrůdy B. napus. Po mezidruhovém křížení následuje samoopylení potomků F_t generace, které dá vzniknout F₂ olejnatým semenům. Dále následuje selekce F₂ rostlin na požadované znaky a poté zpětné křížení s rodičem druhu B. campestris. Počet generací takového zpětného křížení je určen tak, aby výsledné potomstvo druhu campestris, nesoucí požadované znaky, bylo euploidní (n = 10). Aby se zabránilo ztrátě vitality a plodnosti (inbrední deprese), která může doprovázet inbrední křížení, mohou být s výhodou vybrané, tj. BCi rostliny, vykazující podobné požadované znaky, jako ty geneticky kontrolované, sib-kříženy. Olejnatá semena, vzešlá z těchto křížení se potom označují jako BCjSIBi semena.

• · · · · * • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • s · · · ·

Podobným způsobem mohou být způsobem analogickým se samoopylením fixovány požadované alely, zatímco je zároveň minimalizována fixace jiných alel, které mohou mít potenciálně negativní vliv na vitalitu a plodnost.

Mezi zástupce druhu B. juncea s nízkým obsahem glukosinolátů a kyseliny erukové do, kterých mohou být popsaným způsobem vneseny požadované znaky, patří linie 96SJ-2690, 96SJ-2691 a 96SJ-2692.

Charakterizace rostlin: Řepky podle navrhovaného vynálezu jsou uniformní skupinou rostlin, které jsou schopné tvořit olejnatá semena, jejichž sušina vykazuje již zmiňovanou nízkou koncentraci glukosinolátů. Olejnatá semena řepky podle navrhovaného vynálezu jsou v podstatě homogenní skupinou olejnatých semen se zdokonaleným obsahem glukosinolátů. Zdokonalená řepka olejka podle navrhovaného vynálezu je schopná růstu a produkce v polních podmínkách běžných pro pěstování běžné řepky olejky a produkci semen v komerčním měřítku. Taková řepka vykazuje uspokojivé agronomické vlastnosti a po samoopylení je schopná tvořit semena s nízkou koncentrací glukosinolátů v sušině. Termín uspokojivé agronomické vlastnosti podle navrhovaného vynálezu zahrnuje schopnost zajistit ve standardních polních podmínkách úrodu semen s obsahem glukosinolátů dostatečně nízkým pro zaregistrování odrůdy canola (vhodné pro komerční použití).

Výsledek použití ogura obnovitele plodnosti podle vynálezu, projevující se sníženým obsahem glukosinolátů v sušině byl zcela neočekávaný. Jedlá endogenní mouka, tak jak zde byla popsána, je novinkou a možnost její výroby dříve vědcům zcela unikla.

• ftft ·. · ·· ft··· ftftft·· · · ft··· • ftft ftft · · · ···· ft • ftftft · · ftftft • ft ·· ftftft ftftft ftft ftft

Člověk, sběhlý v technologii pěstování olejnin, by zcela oprávněně předpokládal, že ogura obnovitel je geneticky asociován s genem, regulujícím hladinu glukosinolátů, tj. že oba geny jsou umístěny na stejném fragmentu DNA ředkve Raphanus, který byl integrován do chromozómu B. napus. Vzhledem k tomu, že uvnitř DNA fragmentu z ředkve neexistuje žádná alelická variabilita, není zde ani příležitost pro crossingover a tím i oddělení Rf genu od genu kódujícího zvýšený obsah glukosinolátů, což znemožňuje expresi obnovitele spojenou se sníženou hladinou glukosinolátů.

Zdokonalená jedlá endogenní rostlinná mouka podle vynálezu má uspokojivou chuť srovnatelnou s chutí mouky canola. Tato mouka je využitelná v krmivářském průmyslu jako krmivo pro hospodářská zvířata. Olej je určen pro použití v teplé i studené kuchyni, tj. do salátů, na smažení, vaření atd. Manipulace s produkty podle vynálezu je velmi zjednodušená, neboť endogenní rostlinná mouka i olej podle vynálezu splňují požadavky na celou řadu možných konečných použití. Všechny tyto výhody endogenních produktů jsou zřejmé, neboť už ze své podstaty jsou tyto výrobky zdravé a vykazují výtečné nutriční vlastnosti.

V následujícím textu jsou uvedeny příklady konkrétního využití navrhovaného vynálezu. Vynález ovšem není v žádném případě konkrétními údaji uvedenými v následujících příkladech limitován.

• 4 4 4

4 4

4 4 44

4 4

4 4

4 » 4 • 4

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Vývoj zdokonalené odrůdy nesoucí gen pro obnovení plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility, 96FNW-1792, způsob stanovení glukosinolátů a způsob stanovení stability Rf genu (viz. obrázek 4).

Generace

Časové období

Osivo

Sklízená semena rodiče na F!

listopad 1992 - duben 1993

R40 (původní zdroj genu obnovitele plodnosti, INRA) a BRISTOL (komerčně dostupná zimní canola, Semences Gargill, Francie)

F, = 93CWN-867 (= R40 x BRISTOL)

Metodika: Rodičovské rostliny byly pěstovány a veškeré křížení bylo prováděno v kontrolovaných podmínkách ve skleníku. R40 (zdroj genu obnovitele) byl použit jako samičí rodič a tudíž veškerý výsledný materiál je nositelem ogura cytoplazmy.

Generace FjnaF₂

Časové období květen 1993 - listopad 1993

Osivo F, - 93GWN-867 (= R40 x BRISTOL)

Sklízená semena F₂ = 94CWN-2133

Metodika: Fj rostliny byly pěstovány až do období kvetení ve skleníku. Sterilní rostliny byly odstraněny, fertilní podstoupily samoopylení a daly vzniknout F₂ semenům. Vyzrálá F₂ semena byla sklizena z každé Fi rostliny zvlášť. V každé skupině F₂ semen byl stanoven obsah glukosinolátů s použitím metody reakce s glukózou.

• · · · · «

Skupiny semen s nejnižším obsahem glukosinolátů byly vytříděny jako 94CWN-2133 osivo pro produkci F₃.

Generace

F₂ na F₃

Časové období prosinec 1993 - červen 1994

Osivo F₂ = 94CWN-2133

Sklízená semena

F₃ = 95FNW-7703 (vybraná F₃ linie)

Metodika: 500 rostlin F₂, 94CWN-2133, bylo pěstováno ve skleníku až do období květu. Sterilní rostliny byly odstraněny. Fertilní rostliny daly po samoopyleni vzniknout F₃ semenům. Vyzrálá F₃ semena byla sklizena z každé F₂ rostliny zvlášť. V každé skupině F₃ semen byl stanoven obsah glukosinolátů s použitím paladiové metody. Zároveň byla analyzována semena kontrolních rostlin, pěstovaných ve stejných podmínkách, jako F₃. V F₃ semenech linie 95FNW-7703 byla stanovená koncentrace glukosinolátů nižší než 25 pmol/g a tudíž mohla být tato semena zařazena do polních pokusů.

Generace

F₃ na F₄

Časové období srpen 1994 - červen 1995

Osivo

F₃ = 95FNW-7703

Sklízená semena F₄ - 96FNW1792 (vybraná F₄ linie)

Metodika: 95FNW-7703 semena byla vyseta ve výběrové školce ve Frouville ve Francii v srpnu 1994. Vzešlo přibližně 60 rostlin na dva řádky školky. Dále byly hustě vysety dvě výborné komerční odrůdy Bristol a Goeland jako kontrolní nebo srovnávací odrůdy.

V časné fázi kvetení bylo 10 jednotlivých rostlin 95FNW-7703 linie samoopyleno s pomocí opylovacích vaků. Plodnost všech rostlin

95FNW-7703 odrůdy hýla určena stanovením produkce pylu (samčí plodnost) a určením počtu semen ve vznikajících šešulích (samičí plodnost). Na konci období kvetení byly opylovací vaky odstraněny. Vyzrálá F₄ semena byla sklizena z každé z 10 samoopylených rostlin samostatně a v každé z deseti skupin byla stanovena kvalita semen. Seschlá nebo plesnivá semena byla odstraněna.

Ve vyzrálých a vyčištěných semenech zbylých F₄ linií byla paládiovou metodou stanovena koncentrace glukosinolátů. V semenech kontrolních odrůd Bristol a Goeland byla stanovena koncentrace glukosinolátů pomocí HPLC. Semena těchto kontrolních rostlin byla zahrnuta i do paládiového testu a byly vybrány Rf linie s nízkým obsahem glukosinolátů. Průměrná hodnota naměřená pro odrůdy Bristol a Goeland plus jedna standardní odchylka (celkový obsah glukosinolátů cca 18 μηιοΐ/g) byla stanovena jako mezní hodnota pro výběr pozitivních linií. F₄ linie 96FNW-7703 vykazovaly obsah glukosinolátů nižší než 18 pmol/g a měly celkově nejnižší obsah glukosinolátů ze všech 95FNW-7703 odvozených linií. Stanovení plodnosti u odrůdy 95FNW-7703 neprokázalo ani jednu sterilní rostlinu z cca 50 testovaných. Vzhledem k tomu, že Rf gen je jediný, dominantní gen, očekávaná frekvence sterility při segregaci Rf genu u 95FNW-7703 je 0,25. Statistická pravděpodobnost, že nebude ve vzorku 50 rostlin nalezena ani jedna sterilní rostlina je 0,000000562. S ohledem na tato fakta je možno říci, že 95FNW-7703 je v Rf genu stabilní, tj. že byla odvozena od F₂ generace, která byla v Rf genu homozygotní.

*··« · ♦ 4 4 9

94 449 444 49 49

Příklad 2: Vývoj F5 sub-linie zdokonalené odrůdy nesoucí gen pro obnovení plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility, 96FNW-1792 (pokračování z příkladu 1, viz. obrázek 4).

Generace Časové období

F4 na F5 srpen 1995 - červenec 1996

Osivo F₄ = 96FNW-1792

Sklízená semena

F₅ = 96FNW-1792-02, -03 a -04

Metodika: Odrůda 96FNW1792 byla pěstována v období 1995/96 na ploše čtyř řádků v pokusné školce ve Frouville ve Francii. Vyklíčilo a vzešlo více než 100 rostlin. Jako kontrola byly opět použity rostliny odrůd Bristol a Goeland.

Během zimy 95/96 byla testována homozygotnost u 20 pokusných rostlin variety 96FNW1792, a to metodou stanovení PGI-2 izozymového fenotypu v extraktu z listové tkáně pomocí gelové elektroforézy podle Delourme a Eber (1992). Všechny sledované rostliny byly v genu pro PGI-2 z ředkve homozygotní. Vzhledem k tomu, že sledovaný fenotyp je produktem PGI-2 alely genu z ředkve, který je velmi těsně spojen s OGURA Rf genem, dokazují tyto výsledky, že všechny sledované rostliny linie 96FNW-1792 jsou v Rf genu stabilní (RfRf).

V období kvetení bylo u zmíněných 20 rostlin zajištěno samoopylení pomoci opylovacích vaků. Samčí i samičí fertilita všech rostlin 96FNW-1792 linie v pokusu byla stanovena tak, jak to bylo popsáno v příkladu 1. Ve vzorku 100 rostlin nebyla zjištěna žádná sterilní rostlina, což znovu dokazuje, že 96FNW-1792 linie je v Rf genu • * 9 9 9 9 ·· 99 9 9 9 9 · 9 9 99 • · · ···9 9 • · 9 9 9

999 9 9 9 99 99 stabilní. Počet semen (počet vajíček v šešuli) odpovídá hodnotám běžným pro odrůdu Brassica napus. Opylovací vaky byly odstraněny na konci období kvetení.

Vyzrálá semena byla sklizena z každé z 20 rostlin zvlášť a následně byla přečištěna. Byly vybrány linie se semeny nej lepší kvality a v jejich semenech byl pomocí HPLC stanoven obsah glukosinolátů. Celkový obsah glukosinolátů (indolové + MSGL + alkenylglukosinoláty) pro tři z vybraných sub-linií je zobrazen na obrázku 4 (F₅ generace).

Vzorek 20 rostlin každé ze tří zmíněných sub-linií byl pěstován ve skleníku. Listová tkáň každé rostliny z každé sub-linie byla testována metodou stanovení PGI-2 izozymového fenotypu. Výsledky dokazují, že všechny testované rostliny a tudíž všechny tři linie jsou v genu Rf naprosto stabilní.

Všechny tři sub-linie (96FNW-1792-02, -03 a -04) jsou konečnými produkty šlechtěni - inbrední linie s obsahem genu obnovitele plodnosti. Mohou být použity i jako samčí inbrední linie při přípravě různých jednoduše křížených hybridů pro komerční použití.

Příklad 3: Vývoj zdokonalených linií s obsahem genu obnovitele plodnosti u OGURA samčí cytoplazmatické sterility, nazvaných 96FNW-1822, 96FNW-1348 a 96FNW1628 (viz obrázky 1,2 a 3).

Jednotlivé generace rostlin zobrazené na obrázcích 1-3 byly pěstovány v časových periodách a s použitím podobného výchozího materiálu a metod, jaké byly popsány v příkladu 1. Jako kontrolní odrůdy byly pro srovnání použity výjimečně kvalitní komerční odrůdy. Výsledky stanovení plodnosti opět prokázaly, množství • 4 «4 * 4 • 44 ·· 44

4 4 44 4 4

4 4 · 4 4 4 « 4 4 4 4 4

44 444 ·♦ • 4 44

4 4 4

4 44 «44 4 4 • · ♦

4« sub-linií (viz. obrázky 1-3) je v genu pro obnovení plodnosti Rf stabilní a vykazuje nízké koncentrace glukosinolátů.

Rostliny sub-linií odvozených od linií 96FNW-1822 a 96FNW1348 byly pěstovány ve Francii v zimě 1996/97. U zdravých semen těchto rostlin byla stanovena fertilita a pomocí HPLC byl analyzován obsah glukosinolátů. Stanovení fertility opět prokázalo, že sub-linie jsou v Rf genu stabilní. HPLC analýza prokázala obsah glukosinolátů nižší než 15 μΜ u všech testovaných sub-linií. Testovací křížení byla provedena za účelem stanovení přenosu Rf genu. V tabulce 1 jsou shrnuty výsledky určování fertility a měření obsahu glukosinolátů.

Tabulka 1: Stanovení fertility a obsahu glukosinolátů u sub-linií pěstovaných ve Francii během zimy 1996/97.

CVN kód (nový)	BLN kód (původní)	Celkový obsah glukosinolátů (μΜ/g, stanoveno HPLC) 96/97 Francie	Počet fertilních a sterilních rostlin ve vzorku (Francie 1997)* Inbrední Testovací křížení
fertilní	sterilní fertilní	.terilní
NW1717	96FNW-1822-2	8,73	2,000	0	321	1
	96FNW-1822-5	10,16	2,000	0	412	1
	96FNW-1822-7	8,14	2,000	0	420	0
	96FNW-1822-8	9,82	2,000	0	346	2
NW1712	96FNW-1348-6	14,71	2,000	0	375	2

T určení fertility/sterility bylo provedeno vizuálně posouzením morfologie rostliny.

·· » · * • « ··· · • · ·· • ·»· *· *« ♦ · · * « · ··· • · * · · « · · · • · * · · »· ♦

·· «

»·

Příklad 4: Vývoj zdokonalené linie 96FNW-1348, nesoucí gen pro obnovu plodnosti u OGURA samčí cytoplazmatické sterility a vyznačující se nízkým obsahem glukosinolátů a zároveň nesoucí i další žádoucí agronomické znaky včetně tolerance k chorobám.

Následující tabulka zobrazuje data získaná pro plně regenerované jedenkrát křížené hybridy odvozené od elitní samičí inbrední linie a linie 96FNW-1348. Tato data byla shromážděna z pokusů prováděných na devíti evropských lokalitách v období 1995/96. Srovnávací odrůdou byla v tomto případě SYNERGY, sdružená hybridní odrůda vyvinutá firmou SERASEM ve Francii.

Hybrid	Výnos Výška (% Chk)	Vyzrálost náchylnost k	onemocnění stonku
(1-9)*	napadení (1-9)
95-90013	107 %	163	5,0	6,5	4,2
95-90002	106 %	160	4,0	7,5	5,6
95-90004	106 %	148	3,8	5,8	4,2
95-90010	105 %	165	3,9	7,5	4,6
95-90006	104 %	155	4,0	7,2	4,8
SYNERGY - --	100 %	155	5,4	7,3	4,0

vyzrálost, náchylnost k onemocnění a onemocnění stonku jsou hodnoceny stupnicí 1-9, kde 1 = nejčasnější, nejnáchylnější k onemocněním a 9 = pozdní, nejodolnější.

Příklad 5: Vývoj zdokonalené linie nesoucí gen pro obnovu plodnosti u OGURA samčí cytoplazmatické sterility, vyznačující se nízkým obsahem glukosinolátů a zároveň nesoucí i další žádoucí agronomické znaky včetně rezistence k herbicidům.

«φ φ φ · φ φ φ «φφφ φ φ φφ φφ «φ > φ φ

I ΦΦΦΦ

I · i 1 φφ φφ φ φ φφ φ

φφ φ

φ φφ

5.1 Vývoj elitní odrůdy nesoucí OGURA gen obnovitele plodnosti a vyznačující se rezistencí k imidazolinovým herbicidům;

1. Produkce F_t generace semen křížením 96FNW1348 (zimní Rf odrůda s nízkým obsahem glukosinolátů) x 45A71 (jarní odrůda Pursuit Smart® )

2. Germinace Fi semen a postřik mladých rostlinek přípravkem PURSUIT v množství 100 g/ha. Postřikem je prováděn za účelem ověření odolnosti rostlin.

3. Produkce BCjF, křížením Fj s odrůdou 96FNW1348.

4. Germinace BCiFi semen a postřik mladých rostlinek přípravkem PURSUIT v množství 100 g/ha a výběr 25 % rostlin s nejlepší odolností.

5. Produkce BCiF₂ samoopylením vybraných rostlin.

6. Germinace BCiF₂ semen a postřik mladých rostlinek přípravkem PURSUIT v množství 400 g/ha, výběr nej odolnějších rostlin a sklizeň F₃ semen.

7. Germinace F₃ semen a postřik mladých rostlinek přípravkem PURSUIT v množství 400 g/ha, výběr linií, ve kterých byly všechny rostliny rezistentní, samoopylení, sklizeň F₄ semen a potvrzení nízkého obsahu glukosinolátů.

8. Produkce následných generací samoopylením a selekce na pokusném poli; testovací křížení inbredních linií nesoucích gen obnovitele plodnosti, rezistentních k imidazolinovým herbicidům (IR) a výběr elitních IR samičích inbredních linií. Hodnocení nízké hladiny glukosinolátů IR hybridů v polních podmínkách.

5.2 Vývoj elitní odrůdy nesoucí OGURA gen obnovitele plodnosti a vyznačující se dalšími typy rezistence k herbicidům, tj. Roundup Ready®, Liberty Link®.

·· ·* · ♦ 99 ·· • · 9 99 99 8 9 8 9 · 899 8 9 9 9 98

9 8 8 8 8 8 9 999 9 8

9 9 9 8 * · · 9

9· 9· 889 999 89 88

1. Byl použit stejný postup jako v případě šlechtění IR inhredních linií a hybridů. Výchozím materiálem pro šlechtění byly rostliny nesoucí rezistenci k herbicidům.

2. Vyšlechtěné odrůdy s nízkým obsahem glukosinolátů, rezistentní k herbicidům a nesoucí gen obnovitele plodnosti mohou být použity jako rodičovské rostliny pro křížení s jinými elitními rostlinami. Nové odrůdy rezistentní k herbicidům s nízkým obsahem glukosinolátů a nesoucí gen obnovitele plodnosti mohou být z výchozího materiálu izolovány pomocí haploidie, křížení čistých linií nebo pomocí zpětného křížení. Všechny zmíněné metody jsou odborníkům dobře známé.

Příklad 6: Vývoj zdokonalené linie nesoucí gen pro obnovu plodnosti u OGURA samčí cytoplazmatické sterility, nazvané 95SN-9369 a potomků této linie (97SN-1650 a 97SN-1-651) s nízkým obsahem glukosinolátů a s dalšími výhodnými agronomickými znaky.

Generace;

Časové období:

Použité osivo:

rodiče na Fi (dva kroky: Cl = trojcestné křížení, C2 = komplexní křížení)

Cl = leden 1994 - duben 1994; C2 = květen 1994 - srpen 1994

Cl: samičí rodič = R40 x TAPIDOR® (zimní odrůda); samčí rodič = BULLET® (jarní odrůda); C2: samičí rodič = Cl; samčí rodič KRISTINA® x GARRISON®.

Metodika: Veškerý materiál byl pěstován a křížení bylo prováděno >

44 • · ·

4 444 * 4 4 4 4 4

4 4 4 4 *4 44 444

44 44

4444

4 4 44

4 444 4 4

4 4 4

444 44 44 v kontrolovaných podmínkách ve sklenících. R40 x TAPIDOR® Fj, použitá jako samičí rodič v Cl byla získána ze šlechtitelského programu zimní dvounulové odrůdy. C2 byla získána opylením několika fertilních Cl rostlin (samičí rodič) vzorkem pylu z několika samčích rostlin. C2 je tedy jako konečný produkt výsledkem komplexního křížení Fj, ((R40 x TAPIDOR®) x BULLET®) x (KRISTINA® x GARRISON®).

Generace: Časové období: Použité osivo:

Fi na F₂ září až prosinec 1994

Fj, ((R40 x TAPIDOR®) x BULLET®) x (KRISTINA® x GARRISON®).

Sklizená semena: F₂ = 95SN-7805

Metodika: 32 Fj rostlin bylo pěstováno až do období květu ve skleníkových podmínkách. Po samoopylení daly rostliny vzniknout

F₂ generaci semen. Vyzrálá F₂ semena byla z každé Fi rostliny sklizena odděleně. V semenech byl thymolovou metodou (kolorimetrická kvantifikace) stanoven obsah glukosinolátů. Skupiny semen s nejnižším obsahem glukosinolátů (v porovnání s kontrolní odrůdou) byly vybrány pro další šlechtění.

Generace:

Časové období: Použité osivo: Sklizená semena:

F₂ na F₃ leden 1995 - duben 1995 F₂ = 95SN-7805 F₃ = 95SN-9369 (vybraná F₃)

Metodika: Několik stovek F₂ rostlin bylo pěstováno až do období květu ve skleníkových podmínkách. V období květu byly sterilní ··· φφ «φ • · · • · φφφ • · φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ φφφφ φ φφφφ φ · · φφ φ φ φφφ φ φ φ φφφ φφ φφ φφ rostliny odstraněny a samoopyleni u fertilníeh rostlin bylo zajištěno pomocí opylovacích vaků. Na konci kvetení byly vaky odstraněny a semena dozrávala obvyklým způsobem. Všechna F₃ semena (sklizená z jednotlivých F₂ rostlin) byla podrobena analýze na obsah glukosinolátů thymolovou metodou. F₃ linie 95SN-9369 byla vybrána jako jedna z linií s nejnižším obsahem glukosinolátů.

Generace:

F₃ na F₄

Časové období:

květen 1995 - srpen 1995

Použité osivo: F₃ = 95SN-9369

Sklizená semena: F₄ ^: 96SN-3077, 96SN-0853 a další (viz.

obrázek 5)

Metodika: Velký vzorek F₃ rostlin 95SN-9369 byl pěstován až do období květu ve skleníkových podmínkách. Samoopyleni, které dalo vzniknout F₄ semenům bylo zajištěno pomocí opylovacích vaků. Na konci kvetení byly vaky odstraněny; plně vyzrálá F₄ semena byla sklizena z každé F₃ rostliny odděleně. Každá jednotlivá F₄ linie (tj. semena, sklizena z jediné F₃ rostliny) byla analyzována thymolovou metodou na obsah glukosinolátů. Pro další křížení bylo vybráno pět linií (viz. obrázek 5) včetně linií 96SN-3077 a 96SN-0853.

Generace: Časové období: Použité osivo: Sklizená semena

F₄ na F₅ září 1995 - prosinec 1995

F₄ = 96SN-3077, 96SN-0853 a další

F₅ = 96SN-3424 (z 96SN-0853), 97SN-0180 (z

96SN-3077) a další (detaily viz. obr. 5) • 4 44 • 4 4

4 444

4 4 4

4 4 4

44

4 4 4

4 44

4 4 4

4 4

44

Metodika: 15 rostlin každé z vybraných F₄ linií bylo vyseto ve skleníku spolu s kontrolními odrůdami (pro selekci na nízký obsah glukosinolátů). Samoopylení bylo zajištěno pomocí opylovacích vaků; vaky byly odstraněny na konci období kvetení a plně vyzrálá semena byla sklizena opět z každé jednotlivé rostliny odděleně. Každá F₅ linie semen (soubor semen z jedné F₄ rostliny) byla analyzována thymolovou metodou na obsah glukosinolátů. Nej lepší F₅ linie z každé F₄ linie byla vybrána pro další kříženi.

Generace:

Časové období: Použité osivo: Sklizená semena:

F₅ na F₆ (v tomto pokusu nebyla zahrnuta linie 97SN-0180) leden 1996 - duben 1996

F₅ = 96SN-3424 a další

F₆ = 96SN-9142 (z 96SN-3424) a další (detaily viz. obr. 5)

Metodika: 15 rostlin každé z vybraných F₅ linií bylo vyseto ve skleníku spolu s kontrolními odrůdami (pro selekci na nízký obsah glukosinolátů). Samoopylení bylo zajištěno pomocí opylovacích vaků; vaky byly odstraněny na konci období kvetení a plně vyzrálá semena byla sklizena opět z každé jednotlivé rostliny odděleně. Každá F₆ linie semen (soubor semen z jedné F₄ rostliny) byla analyzována thymolovou metodou na obsah glukosinolátů. Nejlepší

F₆ linie z každé F₅ linie byla vybrána pro další křížení.

Generace: polní hodnocení - F₅ na F₆ pro 96SN-0180; F₆ na F₇ pro 96SN-9142 časové období: květen 1996 - srpen 1996 • ftft ·· ·· • ···· · · • · · · · ft · • ftftft * · ftft ftft ··· ftft • ft ftft ftft ft ft ·· • ftftft · • 4 · ·· ··

Použité osivo: F5 = 97SN-0180

F₆ = 96SN-9142 a další (viz. obr. 5)

Sklizená semena: F₆ = 97SN-1650

F₇ = 97SN-1651 (z 96SN-9142) a další (detaily viz. obr. 5)

Metodika: Vybrané linie byly vysety do řádků na izolovaném poli nedaleko Hillsburgh, Ontario. Vzešlo více než 100 rostlin z každé linie. V období kvetení byla u každé rostliny vybrané linie posouzena fertilita/sterilita a 20 u 20 rostlin byly aplikovány opylovací vaky za účelem produkce semen vzniklých samoopylením. Na konci období kvetení byly vaky odstraněny a po dozrání byla semena sklizena. Jednotlivé rostliny se zdravými semeny byly analyzovány TMS metodou na obsah glukosinolátů. Stanovení fertility prokázalo, že obě linie, 97SN-1651 i 97SN1650, jsou v genu pro obnovu plodnosti (Rf) stabilní, tedy homozygotní. TMS analýza prokázala u obou těchto linií obsah glukosinolátů nižší než 15 μΜ (přesná data viz obr. 5). U obou linií byla prokázána dostatečná vyzrálost, stálost a odolnost. Obě zmíněné odrůdy byly spolu s 97SN-1649 postoupeny do Chile za účelem produkce semen v období zimy 1996/97. Tam byly kříženy s několika výtečnými OGURA samčími sterilními inbrední mi liniemi (samičí rodičovská generace). Výsledné jednoduše křížené hybridy byly hodnoceny na mnohých lokalitách v západní Kanadě v létě 1997. Semena vyprodukovaná v zimě 1996/97 v Chile byla vyseta ve státě Ontario na jaře 1997. V létě 1997 byla z takto vzešlých rostlin sklizena semena, u kterých byla hodnocena plodnost a koncentrace glukosinolátů. Dále byla provedena ·· ·· • · 4

4 444 • · · · 4. 4

44

44 «4

4444 · 4 44

4 44 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 44 pokusná křížení za účelem stanovení přenosu genu obnovitele plodnosti. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2: Výsledky stanovení plodnosti a analýzy obsahu glukosinolátů u linií 97SN-1649 a 97SN-1650, pěstovaných v Chile v zimě 1996/97 a v Ontariu na jaře 1997.

CVN	BLN	Celkový obsah	Počet fertilních a sterilních
kód	kód	glukosinolátů	rostlin ve vzorku
(nový)	(původní)	(μΜ/g, stanoveno TMS)		(Ontario 1997)*
		96/97	1997	Inbrední Testovací křížení
		Francie	Ontario	fertilní sterilní fertilní sterilní
NS3059	97SN-1649	11,45	11,32	600	0	38	2
NS3060 ♦	97SN-1650	14,40	14,01	600	0	42	0

Fertilita/sterilita byla určena vizuálním zhodnocením morfologie rostlin

Šlechtitelé mohou použít rostliny Brassica podle vynálezu pro vývoj dalších odrůd Brassica nesoucích gen obnovitele plodnosti pro OGURA cytoplazmatickou samčí sterilitu, produkujících semena s nízkým obsahem glukosinolátů, rezistentních k jednomu či více herbicidům. Rezistence k herbicidům může zahrnovat například rezistenci k herbicidu glyfosátu, prodávanému firmou Monsanto pod obchodní značkou ROUNDUP. Tento herbicid patří k velmi oblíbeným přípravkům, neboť je akumulován jen v rostoucích částech rostliny a nezanechává téměř žádné stopy v půdě.

U odrůd canola jsou za rezistenci k tomuto herbicidu zodpovědné dva geny. Jeden z nich kóduje enzym, který detoxikuje herbicid: je známý pod názvem GOX, neboli glyfosát oxidoreduktáza.

44 4 4 44 44

4 4 44 44 4 4 4 4

44444 4 4 4444

444*4 * 4 4 44* 4 *

4 4 4 4 4 444 • 4 44 444 44* 44 4«

Druhý z genů je mutantní cílový gen, tj. gen pro mutantní formu EPSP syntázy. Odbornici dokáži vnést geny GOX nebo CP4 spolu s promotory do rostlin canola. V zásadě jsou geny vneseny do rostlinné buňky, jako například do rostlinně buňky podle navrhovaného vynálezu, nesoucí gen obnovitele pro ogura samčí cytoplazmatickou sterilitu, a poté je z rostlinné buňky vypěstována rostlina Brassica,

Dalším příkladem může být použití rostlin Brassica podle vynálezu pro vývoj dalších odrůd Brassica nesoucích gen obnovitele plodnosti pro OGURA cytoplazmatickou samčí sterilitu, produkujících semena s nízkým obsahem glukosinolátů, rezistentních k rodině imidazolinových herbicidů, prodávaných firmou Cyanamid pod obchodním názvem PURSUIT. Rezistence k imidazolinovým herbicidům je řízena genem AHAS neboli ALS.

Pro odborníky nebude problematické vnést mutantní gen AHAS, získaný například z jarní odrůdy canola Pioneer® var. 45A71, do rostliny Brassica, která zároveň obsahuje gen Rf pro ogura cytoplazmatickou samčí sterilitu. Alternativně je možné vnést do rostlinné buňky canola modifikovanou formu AHAS genu spolu s vhodným promotorem a to s použitím některé ze známých metod. Konkrétně jsou geny vneseny do rostlinné buňky, jako například do rostlinné buňky podle navrhovaného vynálezu, nesoucí gen obnovitele pro ogura samčí cytoplazmatickou sterilitu, a poté je z rostlinné buňky vypěstována rostlina Brassica.

·· 99

9 9

9 999 · · • 9 9 9

9 9 *

9 9

9

999 · • 9

Všechny publikace, patenty a patentové přihlášky jsou zde citovány v celém svém rozsahu a to do té míry, jako kdyby byla každá jednotlivá publikace, patent, nebo patentová přihláška citována v celém rozsahu individuálně.

Navrhovaný vynález byl popsán do detailů a s odpovídajícími odkazy na preferované aspekty vynálezu. Ovšem i člověku jen částečně se Orientujícímu v oboru je jistě zřejmé, že příklady provedení vynálezu nejsou limitující a že v rámei vynálezu existuje množství dalších možností.

Literatura

J.K. Daun a kol., J. Amer. Qil. Chem. Soc. 60, 1751-1754 (1983). Delourme R., Eber F., Renard M. Breeding Double-low Restorer Lines in Radish Cytoplazmic Male Sterility of Rapeseed {Brassica napus L.) Proč. 9^th Int. Rapeseed Conf., Cambridge, England (1995).

Delourme R., Eber F., Renard M. Radish Cytoplazmic Male Sterility in Rapeseed: Breeding Restorer Lines with a Good Female Fertility., Proč. 8^th Int. Rapeseed Gonf., Saskatoon, Canada. 1506-1510 (1991).

Delourme R., Bouchereau A., Hubert N., Renard M., Landry B.S.: Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed {Brassica napus L.}. Theor, Appl.Gener. 88: 741-748 (1994).

Delourme R., Eber F.: Linkage Between an Isozyme Markér and a Restorer Gene in Radish Cytoplazmic Male Sterility of Rapeseed {Brassica napus L.Y. Theor. Appl.Gener. 85: 222-228 (1992).

ΦΦ φ* · · ·· ΦΦ

ΦΦΦ ·· ΦΦ ···· • · ··· · · φ φ ΦΦ φ φ φ φ φ φ ΦΦ ΦΦΦ φ φ

ΦΦΦΦ φ φ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ

International Standard ISO 9167-1:1992(Ε). Rapeseed Determination of glucosinolates content - Part 1: Method using high-performance liquid chromatography.

Paul a kol., Theor. Appl. Genet. 72; 706-709, (1986).

Pellan-Delourme, Eber R., Renard M.: Male Fertility Restoration in Brassica napus with Radish Cytoplasmic Male Sterility. Proč.

7^th Int. Rapeseed Conf., Poznán. Poland, 199-203, (1987). Pellan-Delourme, Renard M.; Cytoplasmic Male Sterility in Rapeseed {Brassica napus L.): Female Fertility of Restored Rapeseed with OGURA and Cybrids Cytoplazm, Genome 30, 234-238 (1988).

Pelletier G., Primard C.: Molecular Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinaňts in Rapeseed.,

Proč, 7^th Int. Rapeseed Conf., Poznán, Poland, 113-118, (1987).

Rakow G., McGregor D.I.: Opportunities and Problems in Modification of Levels of Rapeseed Cj₈ Unsaturated Fatty Acids., J. Am. Qil. Ghem. Soc. 50(10): 400-403, (1973).

Ratledge, Colin, Dawson, Peter and Rattray, James: Biotechnology for the Oils and Fats lndustry, American Qil Chemists' Society, Champaign, pp. 328 (1984).

RÓbbelen G., Gerhard: Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapeseed., (Charpter 10) in Biotechnology for the Oils and Fats lndustry, edited by Ratledge Colin, Dawson Peter, Rattray James, American Oil Chemists' Society, (1984).

RÓbbelen G., Nitsch A.: Genetical and Physiological Investigations on Mutants for Polyenic Fatty Acids in Rapeseed, Brassica napus L., Z. Planzenzuchtg, 75:93-105, (1975).

• · · · • · · · • · ·· · · • · • · «

Sosulski F., Dabrowski K.: Determination of Glucosinolates in Canola Meal and Protein Products by Desulfation and Capillary Gas-Liquid Chromatography., J. Agric. Food, Chem. 32: 11721175 (1984).

Stefansson B. R.: The Development of Improved Rapeseed Cultivars (charpter 6) in High and Low Erucic Acid Rapeseeds Oils edited by John K.G. Kramer, John K.G., Frank D. Sauer and Wallace J. Pigden. Academie Press Canada, Toronto (1983). Tsunada S., Hinata K., Gomex Campo: Brassica Crops and Wild Alleles Biology and Breeding, Japan Scientific Press, Tokyo (1980).

• · • 4 · · ·

Semena, která jsou předmětem vynálezu byla poskytnuta do sbírky American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA.

Semena	Přístupové číslo	Datum uložení
Brassica napus oleifera 97SN-165 0	97838	23.12.96
Brassica napus oleifera 97SN-1651	97839	23.12.96
Brassica napus oleifera 97FNW-1792-03	209001	28.04.97
Brassica napus oleifera 96FNW-1822-07	209002	28.04.97

• · ··

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití olejnatých semen rostlin Brassica homozygotních v genu pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility s obsahem glukosínolátů nižším než 30 pmol/g pro přípravu oleje a/nebo mouky.
2. 2. Použití podle nároku 1 kde olejnatá semena mají obsah glukosínolátů nižší než 25 pmol/g.
3. 3. Použití podle nároku 1 a 2 kde olejnatá semena mají obsah glukosínolátů nižší než 20 gmol/g.
4. 4. Rostlina rodu Brassica obsahuj ící homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačuj ící se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosínolátů ne vyšším než 30 pmol/g.
5. 5. Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosínolátů ne vyšším než 25 pmol/g.
6. 6. Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačující se tím, ž e po opylení tvoří semena s obsahem glukosínolátů ne vyšším než 20 pmol/g.
7. 7. Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosínolátů ne vyšším než 30 pmol/g a s obsahem kyseliny erukové ne vyšším než 2 procenta hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin.

   • ·
8. 8. Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 25 pmol/g a s obsahem kyseliny erukové ne vyšším než 2 procenta hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin.
9. 9. Rostlina rodu Brassica obsahující homozygotní gen pro obnovu plodnosti u ogura samčí cytoplazmatické sterility vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 20 μηιοΐ/g a s obsahem kyseliny erukové ne vyšším než 2 procenta hmotnosti v závislosti na celkovém obsahu mastných kyselin.
10. 10. Použití rostlin rodu Brassica podle nároků 1 až 3, kde jsou zmíněnými rostlinami linie 95SN-9369, 96FNW-1792, 96FNW1822, 96FNW-1348, 96FNW-1628 a jejich sub-linie.
11. 11. Rostlina rodu Brassica podle nároku 7 v y z na č u j í c í se tím, že sub-linie jsou vyhrány ze skupiny obsahující 97SN1650 (sub-linie 95SN-9369), 97SN-1651 (sub-linie 95SN-9369), 96FNW1792-03 (sub-linie 96FNW1792), 96FNW1822-07 (sublinie 96FNW1822), a 96FNW1822-08 (sub-linie 96FNW1822).
12. 12. Rostlina rodu Brassica podle nároků 4 až 8 vyznačující se tím, že zmíněnou rostlinou je Brassica napus.
13. 13. Rostlina rodu Brassica podle nároků 4 až 8 vyznačující se tím, že zmíněnou rostlinou je Brassica campestris.
14. 14. Rostlina rodu Brassica podle nároků 4 až 8 v y z n a č u j í e í se tím, že zmíněnou rostlinou je Brassica juncea.
15. 15. Inbrední rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 30 pmol/g.
16. 16. Inbrední rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 25 pmol/g.
17. 17. Inbrední rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 20 pmol/g.
18. 18. Hybridní rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 30 pmol/g.
19. 19. Inbrední rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 25 pmol/g.
20. 20. Inbrední rostlina rodu Brassica vyšlechtěná s použitím rostlin podle nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že po opylení tvoří semena s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 20 pmol/g.
21. 21. Olejnatá semena rostlin podle nároků 1 až 17.
22. 22. Olejnaté semeno rostliny podle nároku 18 vyznačuj ící se tím, že je součástí v zásadě homogenní skupiny semen s přesně stanoveným obsahem glukosinolátů.

    44 ·· ·· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 «9 • 9 · · 9 9 9 · 9 9 9 9 • 9 9 • 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 23. Olej v y z n a č u j i < z i se tím, že je získáván Z olejnatých semen rostlin podle nároku 18. 24. Olej z olejnatých semen rostlin podle nároku 20 vyznačující se t i m , ž e semena jsou produktem rostliny Brassica napus. 25. Olej z olejnatých semen rostlin podle nároku 20 vyznačující se tím, že semena jsou produktem rostliny Brassica campestris. 26. Olej z olejnatých semen rostlin podle nároku 20 vyznačující se tím, že semena jsou produktem rostliny Brassica juncea.
23. 27. Beztuková mouka vyznačující se tím, že je připravena z olejnatých semen rostlin podle nároku 18.
24. 28. Část rostliny rodu Brassica vyznačující se tím, že zmíněnou rostlinou je rostlina podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 16, nebo 17.
25. 29. Část rostliny podle nároku 28 vyznačující se tím, ž e zmíněná část je vybrána ze skupiny obsahující sekvenci nukleové kyseliny, tkáň, buňku, pyl, vajíčka, kořeny, listy, olejnatá semena, mikrospóry a vegetativní části rostliny, to vše buď z dospělé rostliny, nebo zárodečného původu.
26. 30. Část rostliny podle nároku 29 vyznačující s e tím, ž e sekvence nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny obsahující RNA, mRNA, DNA a cDNA.
27. 31. Vyzrálá olejnatá semena rostlin rodu Brassica vyznačující se tím, že jsou zdrojem endogenního rostlinného oleje s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 30 pmol/g.

    • · • · · φφφφ φφφφ • φ φφφ · φ φφφφ

    Ar φφφφφ φ φφ φφφ φ φ *40 · · · · · · φ φ φ ·· φφ ·φ· φφφ φφ φφ
28. 32. Vyzrálá olejnatá semena rostlin rodu Brassica vyznačující se tím, že jsou zdrojem endogenního rostlinného oleje s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 25 pmol/g.
29. 33. Vyzrálá olejnatá semena rostlin rodu Brassica vyznačující se tím, že jsou zdrojem endogenního rostlinného oleje s obsahem glukosinolátů ne vyšším než 20 pmol/g.
30. 34. Mouka připravená z olejnatých semen rostlin podle nároku 18 vyznačující se tím, že obsahuje glukosinoláty v koncentraci ne vyšší než 30 pmol/g.
31. 35. Mouka připravená z olejnatých semen rostlin podle nároku 18 vyznačující se tím, že obsahuje glukosinoláty v koncentraci ne Vyšší než 25 pmol/g.
32. 36. Mouka připravená z olejnatých semen rostlin podle nároku 18 vyznačující se tím, že obsahuje glukosinoláty v koncentraci ne vyšší než 20 prnol/g.
33. 37. Rostlina rodu Brassica podle nároků 4, 5, 6, 12, 13 nebo 14 vyznačující se tím, že je použita pro šlechtění odrůd Brassica.
34. 38. Použití rostliny podle nároků 4, 5, 6, 12, 13, a 14, kde způsob šlechtění je vybrán ze skupiny obsahující izolaci a transformaci, konvenční šlechtění, šlechtění čistých linií, křížení, samoopylení, haploidii, původ linie z jediného semene a zpětné křížení.