MXPA98006822A - Semilla de aceite de brasica que contiene un genregenerador de la fertilidad mejorado para esterilidad macho citoplasmico ogura - Google Patents

Abstract

La invención es una planta Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad citoplásmica ogura, además de la semilla de aceite, harina y aceite producidos de la planta, y el uso de la semilla de aceite de la planta para preparar aceite y/o harina. Después de la polinización, la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido total de glucosinolato de no más de 30 umol/gramo, no más de 25 umol/gramo o no más de 20 umol/gramo, lo y opcionalmente un contenido deácido erúcicode no más de dos por ciento por peso en base al contenido total deácidos grasos. La planta de Brassica puede ser Brassica napus, Brassica campestris o Brassca juncea.

Description

SEMILLA DE ACEITE DE BRASICA QUE CONTIENE UN GEN REGENERADOR DE LA FERTILIDAD MEJORADO PARA ESTERILIDAD MACHO CITOPLASMICO OGURA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La semilla de aceite de plantas de Brasica es un cultivo incrementadamente importante . Como una fuente de aceite vegetal, está clasificado actualmente atrás del frijol de soya y palma en importancia comercial y es comparable con girasol . Se usa el aceite tanto como aceite para ensalada y como aceite para cocinar. En su forma original, el aceite de Brassica, conocido como aceite de semilla de colza, es peligrosa para humanos debido a su nivel relativamente alto del ácido erúcico. El ácido erúcico está comúnmente en cultivos nativos en concentraciones del 30 a 50 por ciento en peso en base al contenido de ácidos grasos totales . Este problema se soluciona cuando los científicos de plantas identifican una fuente de germoplasma de aceite de semilla de colza de bajo de ácido erúcico (Stefanssan, 1983) . Además, los científicas de plantas han intentado mejorar el perfil de ácidos grasos para aceite de semilla de colza (Robbelen, 1984; Ratledge et al., 1984; Robbelen et al., 1975; y Rakow et al., 1973). Estas referencias son representativas de aquellos intentos. Particularmente atractivos a los científicos de vegetales son las así llamadas variedades "bajo doble" :_ aquellas bajas en ácido erúcico en el aceite y baja en glucosinolatos en la harina sólida que permanece después de la extracción de aceite (es decir, un contenido de ácido erúcico de menos de 2 por ciento por peso en base al contenido de ácido graso totales; y un contenido de glucosinolato de menos de 30 µmol/gramo de la harina libre de aceite) . Estas formas de alta calidad de colza, primero desarrolladas en Canadá, son conocidas como cañóla) . Más recientemente, los científicos de vegetales han enfocado sus esfuerzos en reducción el contenido de glucosinolato adicional, a niveles de menos 20 µmol/gramo de harna de libre de aceite, así verificado cuantificando derivados de trimetilsilil (TMS) (Sosulski y Dabro ski, 1984) para cañóla de primavera, o menos de 20 µmol/gramo de semilla entera, molida como se determina por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) (Organización Internacional para Estandarización, número de referencia ISO 9167.1:1992 (E) ) para cañóla de invierno . Los glucosinolatos son compuestos a base de azufre que permanecen en el componente sólido de la semilla- harina sólida- después de que la semilla ha sido molida y su aceite ha sido extraído. Su estructura incluye glucosa en combinación con hidrocarburos alifáticos (glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4-pentenilo, glucosinolato de 2-hidroxi-3- utenilo y glucosinolato de 2 -hidroxi-4 -pentenilo) o hidrocarburos aromáticos (glucosinolato de 3-indoilmetilo, glucosinolato de l-metoxi-3-indoilmetilo) . Los glucosinolatos alifáticos son conocidos también como glucosinolatos de alquenilo. Los glucosinolatos aromáticos son también conocidos como Índoles . No son deseables niveles altos de glucosinolatos ya que producen subproductos tóxicos cuando son actuados por la enzima mirosinasa. La mirosinasa es una enzima que se encuentra en forma natural presente en especies de Brassica. Cuando la semilla de Brassica es comprimida, se libera mirosinasa y cataliza la descomposición de glucosinolatos para producir glucosa, tiocianatos, isotiocianato y nitrilos. Cuando se separan de la glucosa, estos otros productos son tóxicos para ciertos mamíferos. El isotiocianato, por ejemplo, inhibe la síntesis de tirosina por la tiroides y tiene otros efectos antimetabólicos (Paul et al., 1986). Han sido hechos intentos para inactivar la enzima mirosinasa (usando vapor, por ejemplo) . Estos intentos no han sido totalmente exitosos. La semilla de colza posee niveles altos de glucosinolatos (de 100 µmol/gramo a 200 µmol/gramo de la harina libre de aceite) , mientras que la cañóla posee niveles menores de glucosinolatos (menos de 30 µmol/gramo de la harina libre de aceite) . Están regulados los niveles de glucosinolatos en la cañóla en muchos países. En europa, por ejemplo, la cañóla de invierno debe tener un contenido de glucosinolato de menos de 25 µmol/gramo en humedad de 8.5%, como se mide por HPLC. En cañada, la ca óla de primavera debe tener un contenido de glucosinolato de menos de 30 µmol/gramo de la harina libre de aceite a humedad de 0%, como se mide por TMS. Muchos países están requiriendo inclusive niveles menores de glucosinolatos con el fin de registrar variedades de ca óla. En el desarrollo de variedades de Brassica nuevas mejoradas, los reproductores usan plantas de Brassica autoincopatibles (AI) , estériles machos citoplásmicos (EMC) y estériles machos nucleares (EMN) como el progenitor hembra. Al usar estas plantas, los reproductores están intentando mejorar la eficiencia de producción de semilla y la calidad de los híbridos Fi y reducir los costos de reproducción. Cuando se realiza la hibridización sin usar plantas AI, EMC o EMN, es más difícil obtener y aislar las características deseadas en la progenie (generación Fi) ya que los progenitores son capaces de sufrir tanto polinización cruzada y autopolinización. Si uno de los progenitores es una planta AI, EMC, o EMN, qu es incapaz de producir polen, solo ocurrirán la polinización cruzada. Eliminado el polen de una variedad parental en una cruza, un reproductor de plantas se asegura obtener una semilla híbrida de calidad uniforme, con la condición de que los progenitores sean de calidad uniforme y el reproductor realice una sola cruza.

En un caso, la producción de híbridos Fx incluye cruzar un progenitor hembra de Brassica EMN, con un polen que produce un progenitor de Brassica macho. Para reproducir efectivamente, sin embargo, el progenitor macho del híbrido Fx debe tener un gen regenerador de fertilidad (gen Rf) . La presencia de un gen Rf significa que la generación Fx no será completa o parcialmente estéril, de tal forma que ya sea puede ocurrir la autopolinización o polinización cruzada. La autopolinización de la generación Fi para producir varias generaciones subsecuentes es importante para asegurar que una característica deseada es heredable y estable y que ha sido aislada una nueva variedad. Una planta de Brassica la cual es estéril macho citoplásmico y es usada en la reproducción es estéril macho citoplásmico ogura (OGU) (R. Pellam-Delourme et al., 1987). Ha sido transferido un regenerador de la fertilidad para plantas estériles macho citoplásmico ogura a partir de Raphanus sativus (rábano) para Brassica por Institu National de Recherche Agricole (INRA) en Rennes, Francia (Pelletier et al., 1987) . El gen regenerador, Rfl que se origina del rábano, está descrito en WO 92/05251 y en Delourme et al., (1991) . Sin embargo, este regenerador no es adecuado ya que los endogámicos e híbridos del regenerador que portan este gen Rf tienen niveles elevados de glucosinolatos y el regenerador está relacionado cercanamente a una disminución en el grupo de semillas -el número de óvulos por silique- (Pellan-Delourme et al., 1988; Delourme et al., 1994). En el caso de híbridos, los niveles de glucosinolato son elevados inclusive cuando el progenitor hembra ha reducido el contenido del glucosinolato. Estos nivles, típicamente más de 30 µmol/gramo de la harina libre de aceite, exceden los niveles de glucosinolatos permisibles para el registro de semillas por la mayoría de las autoridades regulatorias en el mundo. De esta forma, el regenerador puede ser usado para propósitos de investigación, pero no para desarrollar directamente variedades híbridas comerciales de la calidad de cañóla. A la fecha, no hay otra fuente de un regenerador de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico ogura. INRA explica las dificultades asociadas con la obtención de líneas regeneradoras con bajos niveles de glucosinolatos para esterilidad citoplásmica ogura (Delourme, et al., 1994; Delourme et al., 1995) . INRA explica que estas dificultades son debido al enlace entre la regeneración de fertilidad macho y el contenido de glucosinolato en su material para reproducción. INRA sugiere que necesita ser eliminada información genética del rábano en sus líneas regeneradoras (Delourme et al., (1995)) Aunque han sido realizadas mejoras a sus regeneradores durante unos cuantos años pasados, los estudios de isozimas realizados sobre las líneas del regenerador mejoradas indican que la información genética del rábano todavía permanece alrededor del gen regenerador (Delourme et al., 1994). INRA ha intentado desarrollar un regenerador que tiene niveles de glucosinolato disminuidos. Reporta un regenerador heterocigoto con aproximadamente 15 µmol/gramo (Delourme et al, 1995) . Sin embargo, (i) este regenerador es heterocigoto (Rfrf) no homocigoto (RfRf) para el gen regenerador, (ii) este regenerador es una sola planta híbrido más que una línea endogámica, (iii) hay solamente un punto de datos individuales que sugieren que un regenerador tiene un nivel bajo de glucosinolato más que puntos de datos múltiples para soportar un nivel bajo de glucosinolato, (iv) no hay datos para demostrar si pasa la característica de bajo contenido de glucosinolato a la progenie del regenerador, y (v) se selecciona el regenerador y se evalúa en un ambiente simple -no se demuestra la característica de bajo contenido de glucosinolato para ser estable en generaciones sucesivas en pruebas de campo. INRA no ha introducido comercialmente ningún regenerador homocigoto que tenga bajos niveles de glucosinolato. No puede ser usado su regenerador (reportado en Delourme et al., 1995) para desarrollar productos híbridos cruzados simples o endogámicos regeneradores (donde el regenerador es usado como endogámico macho) con niveles de glucosinolato disminuidos para desarrollo comercial. La solicitud de patente de Canadá 2,143,781 de Yamashita et al., publicada el 11 de Septiembre de 1995, reclama un método de reproducción híbrido para plantas de cultivo en la familia Brassicaceae en la cual se produce la semilla F cruzando el progenitor hembra de una línea macho autoincompatible con un progenitor macho. En una modalidad, el progenitor macho posee un gen regenerador de fertilidad. El gen regenerador de fertilidad (IM-B) es para citoplasma derivado de MS-N1 y se deriva de una variedad de invierno (línea IM) . Este es entonces cruzado con una línea doblemente baja de primavera (62We) . Aunque se supone que este regenerador resulta en niveles bajos de glucosinolato, no es un regenerador para esterilidad macho sitoplásmico ogura. Otros reproductores han intentado introducir genes Rf de rábano en plantas de semilla de colza por medio de cruzamiento intergenérico. Sin embargo, estas cruzas no han sido empleadas en forma práctica. La solicitud de patente de Canadá 2,108,230 de Sakai, et al, publicada el 12 de Octubre de 1993, reclama un gen regenerador de fertilidad de una planta de Raphanus el cual se introduce en una planta de Brassica por fusión celular o cruza intergenérica. Esta solicitud no describe (1) un regenerador de esterilidad macho citoplásmico ogura el cual mantenga los niveles disminuidos de glucosinolato en la semilla de aceite de una generación Fx o (2) la ventaja de usar un regenerador para desarrollar combinaciones de endogámicos del regenerador y desarrollar híbridos cruzados simples para productos comerciales (donde se usa el regenerador como un endogámico macho) . Para intentar evitar el alto contenido de glucosinolato del regenerador de INRA de esterilidad macho citoplásmico ogura, INRA y Serasem (UNCAC) han desarrollado una variedad Brassica napus llamada SINERGY®. SINERGY es una cruza de SAMOURAI® estéril macho citoplásmico ogura (reproducido por INRA) y FALCON® fértil macho (reproducido por NPZ) . FALCON no porta el gen regenerador para esterilidad macho citoplásmico ogura. Por lo tanto, el híbrido Fi es estéril macho. SINERGY es vendido como una "línea híbrida compuesta" (LHC) la cual consiste de una mezcla de aproximadamente 80% de híbrido Fi estéril macho (SINERGY) y 20% de fértil macho (FALCON) , la cual proporciona polen para semilla fija en las plantas Fi estéril macho en el campo del cultivador. Hay un número de dificultades, sin embargo, en la confianza en una línea híbrida compuesta. Las más importantes son: (1) que Brassica napus es una especie autopolinizante, por tanto bajo condiciones de polinización deficiente (tal como frío prolongado, clima húmedo) puede haber movimiento inadecuado del polen de las plantas fértiles macho a las plantas híbridas FX resultando en semilla fija y rendimiento deficiente, y (2) que las plantas híbridas Fx son más vigorosas que las plantas FALCON, por lo tanto el formador puede competir posteriormente, resultando en muy poco polen disponible para semilla fija y rendimiento óptimo en las plantas de Fi. A la fecha no ha habido nadie capaz de desarrollar un regenerador mejorado que tiene un gen regenerador homocigoto (fijo) (RfRf) para esterilidad macho citoplásmico ogura cuyas semillas de aceite tienen bajos niveles de glucosinolato. El regenerador debe ser homocigoto (RfRf) de tal forma que este puede ser usado para desarrollar endogámicos del regenerador, o como endogámicos macho, para hacer combinaciones de híbridos de cruza simple para desarrollo de producto comercial. Idealmente, los niveles de glucosinolato pueden estar bien abajo de aquellos indicados en estándares para cañóla en varios países. En esa forma, los cultivadores pueden usar el regenerador mejorado para producir endogámicos e híbridos de Brassica. que tienen semillas de aceite con bajos niveles de glucosinolato. Esto puede beneficiar a los agricultores, quienes pueden entonces plantar híbridos de Brassica los cuales, después de la polinización, pueden producir semillas de aceite que tienen bajos niveles de glucosinolato y otras características deseables . En muchos países, no son checadas para su contenido de glucosinolato las semillas de aceite producidas por agricultores para compresión o para exportación. Algunas veces un lote particular de cañóla puede tener alto contenido de glucosinolato, resultando en contaminación del grano en volumen al cual se agrega la cañóla de calidad deficiente. Pudiera ser una mejora si el contenido de glucosinolato de semillas de aceite está bien abajo de los estándares fijos para varios países con el fin de evitar contaminación del grano en volumen. De esta forma, permanece una necesidad para una planta de Brassica mejorada la cual es un regenerador homocigoto de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico ogura y el cual produce una semilla de aceite con bajo contenido de glucosinolato. A la fecha, las plantas de Brassica las cuales son regeneradoras de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico ogura (i) han sido heterocigoto, más que homocigoto (fijo) , para la característica del regenerador o (ii) no han producido semillas de aceite con bajo contenido de glucosinolato. En efecto, el contenido de glucosinolato de tales semillas de aceite ha sido mayor de 30 µmol/gramo de la harina libre de aceite. Es un objeto de la presente invención proporcionar una planta de Brassica la cual es un regenerador homocigoto para esterilidad macho citoplásmico ogura y el cual tiene un contenido de glucosinolato de menos 30 µmol/gramo de semilla. Este regenerador puede ser usado para producir endogámicos o híbridos regeneradores con bajo contenido de glucosinolato. Eso puede permitir la producción de híbridos totalmente regenerados, de cruza simple con contenido de glucosinolato genéticamente bajo en ambas semilla híbridas y en la semilla de aceite cosechada de las plantas híbridas .

Es un objeto de la presente invención proporcionar una semilla de aceite de Brassica de la planta de Brassica que contiene un regenerador nuclear para esterilidad macho citoplásmico ogura y que tiene un nivel mejorado de glucosinolato. Es otro objeto de la presente invención proporcionar líneas endogámicas de Brassica mejoradas, usando el regenerador. Otro objeto es usar el regenerador como un endogámic? macho para hacer combinaciones de híbridos de cruza simple para desarrollar productos comerciales . Es otro objeto de la presente invención proporcionar un aceite y harina vegetal comestible que tiene un nivel de glucosinolato mejorado después de la compresión simple y extracción. Estos y otros objetos y ventajas de la invención serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica. Esta invención se relaciona una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplásmico ogura, en donde después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido total de glucosinolato de no más de 30 µmol/gramo, 25 µmol/gramo o 20 µmol/gramo. La semilla de aceite de una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplásmico y que tiene un contenido de glucosinolato de menos de 30 µmol/gramo, 25 µmol/gramo o 20 µmol/gramo, puede ser usada para preparar aceite y/o harina. Esta invención se relaciona también a una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplásmico ogura, en donde después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen (i) un contenido total de glucosinolato de no más de 30 µmol/gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento por peso en base al contenido de ácidos grasos totales, (ii) un contenido de glucosinolato total de no más de µmol/gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento en peso en base al contenido total de ácido graso o (iii) un contenido total de glucosinolato de no más de 20 µmol/gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento por peso en base al contenido total de ácidos grasos. La planta de Brassica puede ser Brassica napus, Brassica campestris o Brassica júncea. Esta puede ser designada como 95SN-9369, 96FNW-1792, 96FNW-1822, 96FNW-1348, 96FNW-1628 o sus sublíneas. Las sublíneas pueden ser seleccionadas de de un grupo que consiste de 97SN-1650 (sublínea de 95SN-9369) , 97SN-1651 (sublínea de 95SN-9369) , 96FNW1792-03 (sublínea de 96FNW-1792) , 96FNW1822-07 (sublínea de 96FNW1822) y 96FNW1822-08 (sublínea de 96FNW1822) . Puede ser producida una planta de Brassica endogámica usando esta planta. Puede ser producida una planta de Brassica híbrida usando esta planta. Después de la polinización, la planta endogámica o híbrida produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de (i) no más de 30 µmol/gramo, (ii) no más de 25 µmol/gramo, o (iii) no más de 20 µmol/gramo. Esta invención incluye también una semilla de aceite de la planta de Brassica o de una planta de Brassica endogámica o híbrida. La semilla de aceite puede estar presente como un componente de una colección sustancialmente homogénea de semillas de aceite la cual posee el contenido de glucosinolato especificado. El aceite de la semilla de aceite es también parte de esta invención. La semilla de aceite puede estar formada de Brassica napus, Brassica campes tris o Brassica júncea . La semilla de aceite de Brassica madura es capaz de producir un aceite vegetal endógeno que tiene un contenido de glucosinolato de no mas de (i) 30 µmol/gramo, (ii) 25 µmol/gramo, o (iii) 20 µmol/gramo. La harina la cual esta sustancialmente libre de aceite y la cual se produce de esta semilla de aceite es parte también de esta invención. La harina tiene un contenido de glucosinolato de no mas de (i) 30 µmol/gramo, (ii) 25 µmol/gramo, o (iii) 20 µmol/gramo. Esta invención se relaciona también a una parte de la planta de Brassica de esta invención. La parte de la planta puede ser seleccionada del grupo que consiste de secuencias de ácidos nucleicos (ARN, ARNm, ADN, ADNc)), tejido, células, polen, óvulos, raíces, hojas, semillas de aceite, microsporos, partes vegetiaivas, ya sea embriónico o maduro. La planta de Brassica de esta invención puede ser usada para reproducrir una línea novedosa de Brassica . La reproducción puede ser seleccionada de un grupo que consiste de aislación y transformación, reproducción convencional, reproducción de pedigree, cruzamiento, autopolinización haploide, descendiente de semilla simple y retrocruzamiento. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención será ahora descrita en relación a las figuras en las cuales: Figura 1. Ilustra por la forma de ejemplo, la formación de nuevo material de planta Brassica napus de acuerdo con la presente invención designada 96FNW-1822 como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 3. Figura 2. Ilustra por la forma de ejemplo la formación de nuevo material de planta Brassica napus de acuerdo con la presente invención designada 96FNW-1238 como se describe con mayor detalle en los Ejemplos 3 y 4. Figura 3. Ilustra por forma de ejemplo la formación de nuevo material de planta Brassica napus de acuerdo con la presente invención designada 96FNW-1628 como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 3. Figura 4. Ilustra por forma de ejemplo la formación de nuevo material de planta Brassica napus de acuerdo con la presente invención designada 96FNW-1792 como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 1 y 2. Figura 5. Ilustra por forma de ejemplo la formación de nuevo material de planta Brassica napus de acuerdo con la presente invención designada 95SN-9369 y sus descendientes (97SN-1650, 97SN-1651 y otros) como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 6. Métodos para determinar glucosinolatos : se determinan los niveles de glucosinolato discutidos en la presente de acuerdo con dos procedimientos estándar, a decir (1) cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , como se describe en ISO 9167-1:1992 (E) , para cuantificación total, glucosinolato intacto, y (2) cromatografía gas líquido para cuantificación de derivados de trimetilsililo (TMS) de desulfoglucosinolatos extraídos y purificados, como se describe por Sosulski y Dabrowski (1984) . Tanto los métodos de HPLC y TMS para determinar los niveles de glucosinolato discutidos en la presente implica análisis del componente sólido de la semilla desués de comprimir y extracción del aceite, (es decir, la harina sin grasa o libre de aceite) . Método para determinar perfil de ácido graso se determinan las concentraciones de ácido graso discutidas en la presente de acuerdo con un procedimiento estándar en donde se elimina el aceite de las semillas de aceite de Brassica comprimiendo y es extraído como esteres de metilo de ácidos grasos después de la reacción con metanol y metóxido de sodio. Después se analiza el éster resultante para contenido de ácido graso por cromatografía gas líquido usando una columna capilar la cual permite la separación en la base del grado de insaturación y longitud de cadena. Este procedimiento de análisis se describe en el trabajo de J. . et al., 1983, el cual se incorpora en la presente para referencia. Establecimiento de la invención se obtiene una harina endógena comestible novedosa de una semilla de aceite de Brassica novedosa que posee glucosinolato y, opcionalmente ácido erúcico, en una baja concentración. La semilla de Brassica contiene el gen regenerador nuclear homocigoto para esterilidad macho citoplásmico ogura. Pocos glucosinolatos son sometidos a la enzima mirosinasa, la cual produce subproductos tóxicos. Se forma la harina endógena comestible novedosa de la presente invención por la compresión simple de las semillas de aceite de Brassica y la simple separación física del componente sólido de la semilla - la harina sólida- del componente de aceite . Las semillas de aceite de Brassica de la presente invención poseen un contenido de glucosinolato en el componente sólido antes de la compresión y extración del componente de aceite de menos de 30 µmol/gramo, y más preferiblemente, menos de 20 µmol/gramo. El contenido del glucosinolato puede ser cualquiera o una mezcla de alquenilo (glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4 -pentenilo, glucosinolato de 2-hidroxi-3-butenilo y glucosinolato de 2-hidroxi-4-pentenilo) e indol (glucosinolato de 3-indoilmetilo y glucosinolato de 1-metoxi-3-indoilmetilo) . Se hace preferiblemente la determinación de glucosinolato sobre el sólido libre de aceite secado al aire como se mide por el método de cromatografía gas líquido (en base a TMS) de la Canadian Grain Commission. Los niveles de glucosinolato son comúnmente hechos posible seleccionando materiales de partida los cuales son ya conocidos para formar el contenido de glucosinolato deseado, y haciendo selecciones las cuales retienen este valor después de la combinación con las características deseadas. Generando plantas endogámicas usando regenerador puede ser usada la planta de Brassica regeneradora de esta invención por reproducción endogámica usando técnicas conocidas. El gen regenerador homocigoto de la planta de Brassica puede ser introducido en las líneas endogámicas de Brassica por retrocruzamientos repetidos de la planta de Brassica . Por ejemplo, las semillas de aceite resultantes pueden ser plantadas de acuerdo con procedimientos de crecimiento de Brassica convencionales y después de la autoplinización se forman las semillas de aceite de Brassica en las mismas. Otra vez, las semillas de aceite resultantes pueden ser plantadas y después de la autopolinización, se forman semillas de aceite de Brassica de la siguiente generación en las mismas. Se lleva a cabo el desarrollo inicial de la línea (el primer acople de generaciones de la semilla de aceite) preferiblemente en un invernadero en el cual se controla y monitorea cuidadosamente la polinización. En esta forma, puede ser verificado el contenido de glucosinolato de la semilla de aceite de Brassica para uso subsecuente en pruebas de campo. En generaciones subsecuentes, se lleva a cabo el cultivo de la semilla de aceite de Brassica preferiblemente en pruebas de campo. Las semillas de aceite de Brassica adicionales las cuales se forman como resultado de tales autopolinizaciones en la generación presente o subsecuente son cosechadas y son sometidas a análisis para la característica deseada, usando técnicas conocidas para aquellos con experiencia en la técnica. Generando plantas híbridas usando regenerador como progenitor macho Esta invención permite a un cultivador de plantas incorporar las cualidades deseables de un regenerador de ogura de esterilidad macho citoplásmica en una variedad híbrida de Brassica comercialmente deseable. Las plantas de Brassica pueden ser regeneradas del regenerador de ogura de esta invención usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las semillas de aceite resultantes pueden ser plantadas de acuerdo con procedimientos de crecimiento de Brassica convencionales y después de la polinización cruzada se forman semillas de aceite de Brassica en el progenitor hembra. Puede ser llevado a cabo el cultivo de la semilla de aceite de Brassica en un invernadero o en pruebas de campo. Las semillas de aceite de Brassica adicionales las cuales se forman como resultado de tal polinización cruzada en la siguiente generación son cosechadas y son sometidas a análisis para la característica deseada. Brassica napus, Brassica campstris y Brassica júncea son especies de Brassica las cuales pueden ser usadas en esta invención usando técnicas conocidas . El híbrido puede ser un híbrido de una cruza, un híbrido de cruza doble, un híbrido de cruza de tres formas, un híbrido compuesto, un híbrido mezclado, un híbrido totalmente regenerado y cualquier otro híbrido o variedad sintética que es conocida para aquellos con experiencia en la técnica, usando el regenerador de esta invención. Al generar plantas híbridas, es crítico que el progenitor hembra (Pi) es decir la variedad de cruza con el regenerador ogura (P2) tenga un nivel de glucosinolato que es suficientemente bajo para asegurar que la semilla del híbrido de Fx tenga niveles de glucosinolato dentro de niveles regulatorios. El nivel del glucosinolato de la semilla cosechada del híbrido Fx es aproximadamente el promedio de los niveles de glucosinolato del progenitor hembra (Px) y del progenitor macho (P2) - El nivel de glucosinolato del grano híbrido refleja el genotipo del híbrido F± . Por ejemplo, si el objetivo es obtener grano híbrido (F2) que tenga un nivel de glucosinolato de menos de 20 µmol/gramo, y el progenitor macho (regenerador ogura) tenga un nivel de glucosinolato de 15 µmol/gramo, el progenitor hembra debe tener un nivel de glucosinolato de menos de 25 µmol/gramo. Generando plantas a partir de partes de la planta Pueden ser regeneradas las plantas de Brassica de las partes de la planta de la planta de Brassica regenerador de esta invención usando técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden ser plantadas las semillas de aceite resultantes de acuerdo con procedimientos de crecimiento de Brassica convencionales y después de la autopolinización se forman semillas de aceite de Brassica en las mismas. Alternativamente, pueden ser extraídas formas de plantas dobles para formar inmediatamente plantas homocigotas . Harina vegetal De acuerdo con la presente invención es esencial que la harina vegetal endógena comestible de tal semilla de aceite de Brassica contenga niveles de glucosinolato de no más de 30 µmol/gramo de semilla. El progenitor hembra el cual puede ser usado en el cultivo de plantas de Brassica para producir semilla de aceite de Brassica el germoplasma que contiene el determinante genético requisito para esta característica de glucosinolato, es conocido y está disponible públicamente. Por ejemplo el germoplasma de Brassica para esta característica ha estado disponible en Norte América desde nediados de 1970.

Las variedades de colza de invierno representativas que incluyen el medio genético para la expresión de bajo contenido de glucosinolato y que son comercialmente disponibles en Europa, incluye, por ejemplo, PRESTOL ®, EUROL ®, (cada uno disponible de Semences Cargill) , TAPIDOR®, SAMOURAI® (disponible de Serasem) . Variedades de colza de primavera representativas que incluyen el medio genético para la expresión de bajo contenido de glucosinolato y que son comercialmente disponibles en Canadá, incluyen, por ejemplo, BULLET®, GARRISON®, y KRISTANA® (cada uno disponible de Svalof Weibull) . Otras variedades de colza de invierno que incluyen el medio genético para la expresión de bajo contenido de glucosinolato y que son comercialmente disponibles en Europa incluyen, APEX ®, GOELAND®, FALCON®, LIRAJET®, CAPÍTOL ® y EXPRESS® . También, pueden se obtenidos medios genéticos para la expresión de una característica de bajo contenido de glucosinolato de American Type Culture Collection, MD 20852. Son depositadas semillas con ATCC, que comprende la línea regeneradora 97SN-1650 (No. de Accesión ATCC 97838), 97SN-1651 (No. de Accesión ATCC 97839), 96FNW1792-03 (No. de Accesión ATCC 209001) y 96FNW182-07 (No. de Accesión 209002), discutidos posteriormente en la presente. Tales niveles bajos de glucosinolatos en la semilla de aceite Brassica sirven para impartir valor comercial incrementado a la harina. El aceite vegetal endógeno comestible de las semillas de aceite de Brassica contiene ácidos grasos y otras características que son controladas por medio genéticos (véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos, titulada, "semilla de aceite de Brassica mejorada que tiene aceite endógeno en donde los niveles de ácidos oleico, alfalinoleico y grasos saturados son proporcionados simultáneamente en una distribución altamente benéfica atípica vía control gene 'tico", de Pioneer Hi-Bred International, Inc., W091/15578; y la Patente de los Estados Unidos No. 4,387,758, incorporada en la presente para referencia) . Se incluye preferiblemente el ácido erúcico de la semilla de aceite de Brassica en una baja concentración de no más de 2 por ciento en peso en base al contenido total de ácidos grasos esto es controlado por medios genéticos en combinación con los otros componentes indicados como se especifica. El medio genético para la expresión de tal característica de ácido erúcico puede ser derivado de numerosas variedades de cañóla comercialmente disponibles que tienen buenas características agronómicas, tal como 46A05, 46A05, BOUNTY®, CYCLONE®, DELTA®, EBONY®, GARRISON®, IMPACT®, LEGACY®, LEGEND®, PROFIT® y QUANTUM®. Cada una de estas variedades está registrada en Canadá y está comercialmente disponible en ese país . Resistencia a herbicidas Como es conocido por aquellos con experiencia en la técnica, es posible usar esta invención para desarrollar una planta de Brassica la cual es un regenerador de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico ogura, produce semillas de aceite que tienen bajo contenido de glucosinolato y tiene otras características deseables. Características adicionales las cuales son comercialmente deseables son aquellas las cuales pueden reducir el costo de producción del cultivo de Brassica o las cuales pueden incrementar la calidad del cultivo de Brassica . La resistencia a herbicidas, por ejemplo, es una característica deseable (véase Ejemplo 4-1 y 4-2 en el cual han sido desarrolladas líneas regeneradores ogura con bajo contenido de glucosinolato y tipos diferentes de resistencia a herbicida) . Si se desea, un medio genético para tolerancia a un herbicida cuando se aplica a una proporción la cual es capaz de destruir cultivos de colza los cuales carecen del medio genético, opcionalmente puede ser incorporado en los cultivos de colza de la presente invención como se describe en la Patente de los Estados Unidos comúnmente asignada No. 5,387,758, que es incorporada en la presente para referencia. Técnicas de reproducción Se ha encontrado que la combinación de características deseadas descritas en la presente, pueden ser transferidas en otras plantas dentro de las mismas especies de Brassica napus, Brassica campestris, o Brassica júncea por técnicas de reproducción de plantas convencionales que implican polinización cruzada y selección de la progenie. Ha sido demostrado sorpresivamente que el gen regenerador en combinación con bajos niveles de glucosinolato es altamente heredable, puede ser transmitido a la progenie, y puede ser recuperado en progenie segregada en generaciones subsecuentes después de la cruza. También una vez establecidas, las características pueden ser transferidas entre las especies napus, campestris y júncea usando las mismas técnicas de reproducción de plantas convencionales que implican transferencia de polen y selección.

La transferencia de características entre especies de Brassica, tales como napus , u campestris, por técnicas de reproducción de plantas estándar está ya documentado en la literatura técnica. (véase, por ejemplo, Tsunada et al., 1980) . Como un ejemplo de la transferencia de las características deseadas en la presente a partir de napus a campestris, una persona puede seleccionar una variedad de campestris comercialmente disponible tal como REWARD®, GOLDRUSH® y KLONDIKE®, y realizar una cruza interespecífica con un planta apropiada derivada de una línea de reproducción napus, tal como se discute posteriormente en la presente (es decir, 95SN-9369) . Alternativamente, pueden ser confiables otras líneas de reproducción napus y desarrolladas independientemente usando técnicas conocidas . Después de la cruza interespecífica, los miembros de la generación Fi son autopolinizados para producir una semilla de aceite F2. La selección para las características deseadas es entonces realizada sobre plantas F2 simples las cuales son entonces retrocruzadas con el progenitor campestris a través del número de generaciones requeridas para obtener una línea de campestris euploide (n=10) que exhibe la combinación deseada de características . Con el fin de evitar depresión endogámica (por ejemplo, pérdida del vigor y fertilidad) que puede acompañar a la forma endogámica de Brassica campestris, seleccionada, es decir, plantas BCi que exhiben características deseadas similares que mientras bajo control genético puedan ser ventajosamente sib-acopladas . La semilla de aceite resultante de estos cultivos puede ser designada semilla de aceite BCi SIBi. Por consiguiente, la fijación de los alelos deseados puede ser lograda en una forma análoga a la autopolinización mientras se minimiza simultáneamente la fijación de otros alelos que exhiben potencialmente una influencia negativa en el vigor y fertilidad. Una variedad representativa de Brassica júncea de bajo contenido de glucosinolato y bajo contenido de ácido erúcico en el cual las características deseadas pueden ser transferidas similarmente, incluyen las líneas de reproducción, 9SSJ-2690, 96SJ-2691, y 96SJ-2692. Provisión de plantas Las plantas de Brassica de semilla de aceite de la presente invención son proporcionadas preferiblemente como una provisión sustancialmente uniforme de plantas que son capaces de formar semillas de aceite que proporcionan una harina la cual exhibe los niveles de glucosinolato mejorados indicados. Las semillas de aceite de Brassica de la presente invención son proporcionadas preferiblemente como una colección sustancialmente homogénea de semillas de aceite las cuales poseen los niveles de glucosinolato mejorados. La planta de Brassica de semilla de aceite mejorada de la presente invención es capaz de producción en el campo bajo condiciones de crecimiento de Brassica de semilla de aceite convencionales que son utilizadas comúnmente durante la producción de semilla de aceite en una escala comercial. Tal Brassica de semilla de aceite exhibe características agronómicas satisfactorias y es capaz después de la autopolinización de formar semillas de aceite que poseen los niveles de glucosinolato dentro de la harina presente en la misma, para propósitos de la presente invención, se define "características agronómicas satisfactorias" como la capacidad de producir una cosecha de semilla de aceite bajo condiciones de crecimiento en campo estándares que tienen niveles de glucosinolato que son suficientemente bajos para registro de variedades de cañóla (adecuados para uso comercial) . La capacidad para proporcionar en una harina vegetal endógena comestible simple los niveles de glucosinolato mejorados de la presente invención usando el regenerador de ogura de la presente invención, es considerada totalmente inesperada. Una harina endógena comestible como se reclama actualmente es novedosa y su producción escapa previamente de todos los otros investigadores. Un experto en tecnología de Brassica de semilla de aceite puede haber concluido razonablemente que el regenerador ogura está enlazado genéticamente al gen que regula los niveles de glucosinolato, es decir que ambos genes están en un fragmento de ADN de Raphanus que ha sido integrado en un cromosoma de B . Napus . Mientras no hay variación alélica dentro del fragmento de ADN de Raphanus, no hay oportunidad para un evento de sobre cruzamiento para separar el gen Rf del gen que codifica para contenido elevado de glucosinolato, descartando de esta forma la expresión simultánea del regenerador y bajos niveles de glucosinolato . La harina vegetal endógena comestible mejorada de la presente invención, en una modalidad preferida, exhibe un sabor satisfactorio que puede ser descrito como que es generalmente comparable con aquel de la harina de cañóla. Usos representativos de la harina incluye alimentación para animales de cría. Usos representativos del aceite incluyen aplicaciones de producto alimenticios viscosos, para ensalada, para freír, cocinar, y rociar. Las consideraciones de manejo y de invención son simplificadas grandemente ya que la harina y aceite vegetal endógeno de la presente invención llena los requerimientos para una amplia variedad usos finales. Se logra cada uno de estos beneficios en una forma directa en un producto endógeno que posee inherentemente propiedades de salud y nutricionales superiores . Se presentan los siguientes Ejemplos como ilustraciones específicas de la presente invención. Debe entenderse, sin embargo, que no se limita la invención para los detalles específicos indicados en los Ejemplos. EJEMPLO 1: desarrollo de la línea regeneradora OGURA mejorado, 96FNW-1792, incluyendo metodología para determinación de glucosinolato y evaluación de la fijación del gen Rf (véase figura 4) . Generación: Progenitor a Fl Tiempo del periodo: Noviembre de 1992 a Abril de 1993. Semilla plantada: R40 (fuente original del regenerador de INRA) y BRISTOL (cañóla de invierno comercial de Semences Cargill, Francia) . Semilla cosechada: Fl = 93CWN-867 (=R40 xBRISTOL) Métodos: Se hacen crecer los progenitores, y toda la cruza se lleva a cabo en un ambiente controlado en el invernadero. Se usa R40 (fuente regeneradora) como el progenitor hembra de tal forma que todos los materiales resultantes pueden portar el citoplasma OGURA.

Generación: Fl a F2 Tiempo del periodo: Mayo de 1993 a Noviembre de 1993. Semilla plantada: Fl =93CWN-867 (=R40 x BRISTOL) . Semilla cosechada: F2 = 94CWN-2133 Métodos: Se hacen crecer las plantas Fl para florecer en el invernadero. Se descartan plantas estériles; se autopolinizan plantas fértiles para producir la semilla F2. En la madurez se cosecha F2 de cada planta Fl por separado. Cada lote de semilla F2 es analizada para glucosinolatos usando el método de reacción de glucosa. Los lotes de semillas con el contenido más bajo de glucosinolato son engrosados para producir la semilla F2 de 94CWN-2133 la cual puede ser muestreada para producción de F3. Generación: F2 a F3 Tiempo del periodo: Diciembre de 1993 a Junio de 1994. Semilla plantada: F2 =94CWN-2133 Semilla cosechada: F3 = 95FNW-7703 (línea F3 seleccionada) Métodos : Se hacen crecer quinientas plantas F2 del lote de semillas, 94CWN-2133, en el invernadero. Se descartan plantas estériles en florecimiento; y se autopolinizan plantas fértiles. En la madurez se cosecha F3 a partir de cada planta F2 individualmente . Cada línea de semilla F3 es analizada para contenido de glucosinolato usando el método de Paladio. Se incluye en este análisis la semilla de chequeo, crecida en el mismo ambiente de invernadero como F3s. La línea de semilla F3 , 95FNW-7703, es identificada como que tiene menos de 25 umol/g del contenido de glucosinolatos totates, por tanto se lleva al programa de semillero de campo. Generación: F3 a F4 Tiempo del periodo: Agosto de 1994 a Julio de 1995. Semilla plantada: F3 = 95FNW-7703 Semilla cosechada: F4 = 96FNW1792 (línea F4 seleccionada) Métodos: Se cultiva 95FNW-7703 en el semillero de selección del regenerador en Frouville, Francia en Agosto de 1994. Después de la emergencia, hay 60 ca de plantas en una parcela de semillero de dos líneas. Dos chequeos comerciales élite, Bristol y Goeland, son incluidos a intervalos frecuentes en el semillero como chequeos para comparación. En el florecimiento temprano, se autopolinizan 10 plantas simples dentro de 95FNW-7703 en bolsas. Se evalúa la fertilidad de todas las plantas clasificando la producción de polen (fertilidad macho) y semilla fija dentro de vainas de desarrollo (fertilidad hembra) . Al final del florecimiento, se eliminan las bolsas de polinización. En la madurez se cosecha semilla F4 de cada una de las plantas autopolinizadas individualmente. Se evalúa la calidad de semilla en cada lote de semillas de F4 , las líneas con resequedad y/o semilla con moho se desechan. Se analiza la semilla madura, limpia de las líneas F4 restantes para contenido de glucosinolato por el método de Paladio. Se cosecha semilla de chequeo de Bristol y Goeland, y se determinan glucosinolatos por HPLC. Se incluyen semillas de estos chequeos en el análisis de Paladio para permitir la selección de líneas RF bajas en glucosinolato. Se usa el promedio de Bristol y Goeland más desviación estándar (ca. 18 umol/g de glucosinolatos totales) como el nivel de selección. La línea de semilla F4, 96FNW-1792 tiene menos de 18 umol/g del contenido de glucosinolato y tiene el contenido más bajo de glucosinolato de cualquiera de las líneas derivadas de 95FNW-7703. La evaluación de fertilidad de 95FNW-7703 identifica plantas no estériles en una muestra de ca. 50 individuales. Como el gen Rf es un gen individual, dominante, si se segrega 95FNW-7703 para el gen Rf, pueden ser esperados estériles en una frecuencia de 0.25 con muestreo perfecto. Estadísticamente, la probabilidad de encontrar no estériles en una muestra de 50 si se segrega la línea es 0.000000562 en base a esto, se puede concluir en la presente que 95FNW-7703 es fijo para el gen Rf, significando que este se deriva de una planta F2 la cual es Rf homocigoto . EJEMPLO 2: Desarrollo de sublíneas F5 del regenerador OGURA mejorado, 96FNW-1792 (continúa del Ejemplo 1, véase Figura 4) . Generación: F4 a F5 Tiempo del periodo: Agosto de 1995 a Julio de 1996. Semilla plantada: F4 = 96FNW-1792 Semilla cosechada: F5 = 96FNW-1792-02 , -03 y -04 Métodos: Se cultiva 96FNW-1792 en una parcela de cuatro líneas en el semillero regenerador 1995/96 en Frouville, Francia en Agosto de 1994. Después de la emergencia, hay >100 plantas en la parcela de semillero. Se cultivan Bristol y Goeland como chequeos de corrida en el semillero. Durante el invierno de 95/96, se evalúa la forma homocigota de 20 plantas individuales dentro de 96FNW-1792 determinando el fenotipo de isozima PGI-2 sobre extracto de tejido de hoja sometido a electroforesis en gel de almidón, como se describe por Delourme y Eber (1992) . Se encuentra que todas las plantas son homocigotas para el fenotipo PGl-2 de rábano. Ya que este fenotipo es el producto de un alelo PGI-2 de rábano, el cual está fuertemente ligado al gen Rf OGURA, estos resultados indican que 96FNW-1792 y las 20 plantas específicas muestreadas, son fijas para el gen Rf (RfRf) . En el florecimiento, las 20 plantas seleccionadas son autopolinizadas en bolsas. Se evalúa la fertilidad macho y hembra de todas las plantas dentro de la parcela de 96FNW-1792 como se describe en el Ejemplo 1. Se encuentran plantas no estériles en la muestra de 100 plantas, indicando otra vez que 96FNW-1792 es fija para el gen Rf . La semilla fija (número de óvulos por silique) está dentro del rango normal para Brassica napus . Se eliminan las bolsas de polinización al final del florecimiento . En la madurez, se cosechan semillas de las 20 plantas individualmente, se trillan y se limpian. Se seleccionan las líneas con la mejor calidad de semilla, y se determina el contenido total de glucosinolato de estos materiales por HPLC.

Se da el contenido total de glucosinolato (indol+MSGL+alquenilo) para tres de las sublíneas subdividas en la Figura 4 (generación F5) . Se hace crecer una muestra de 20 plantas de cada una de estas tres sublíneas en el invernadero. Se muestrea el tejido de hoja de cada planta dentro de cada sublínea, y se lleva a cabo el análisis de isozima PGI-2. Los resultados indican que las tres líneas, y todas las plantas dentro de las mismas, son fijas para el gen Rf. Las tres sublíneas (96FNW-1792-02 , -03 y -04) están actualmente siendo terminadas como endogámicas del regenerador.

También están siendo usadas como endogámicas macho en la formación de numerosas combinaciones híbridas de una cruza para desarrollo comercial. EJEMPLO 3 : Desarrollo de las líneas del regenerador OGURA mejoradas 96FNW-1822, 96FNW-1348, 96FNW-1628 (véase Figuras 1, 2 y 3) . Se hacen crecer generaciones de plantas mostradas en la Figuras 1, 2 y 3 en los periodos de tiempo y usando material de origen similar y métodos indicados en el Ejemplo 1. Se realizan las evaluaciones de glucosinolato y fertilidad como se indica en el Ejemplo 1. Se incluyen los chequeos comerciales élite a intervalos frecuentes como chequeos para comparación. Otra vez, los resultados de evaluaciones de fertilidad indican que un número de sublíneas (como se muestra en las Figuras 1, 2 y 3) son fijas para el gen Rf y tienen niveles bajos de glucosinolato . Se hacen crecer plantas de sublíneas de las líneas del regenerador 96FNW-1822 y 96FNW-1348 en Francia durante el invierno de 1996-96. Se evalúa la semilla sana de estas plantas para fertilidad y se analiza para contenido de glucosinolato por HPLC. Las observaciones de fertilidad muestran que las sublíneas son fijas para el gen Rf . El análisis de HPLC revela menos de 15 uM de contenido de glucosinolato en cada una de estas sublíneas. Se realizan cruzas de prueba para evaluar la transmisión del gen regenerador. La Tabla 1 a continuación ilustra los resultados de las evaluaciones de fertilidad y contenido de glucosinolato. Tabla 1. Observaciones de fertilidad y contenido de glucosinolato de sublíneas crecidas en Francia durante el invierno de 1996/97. * clasificación Fértil/estéril por inspección visual de morfología de la flor. EJEMPLO 4: Desarrollo de la línea regeneradora OGURA mejorada, 96FNW-1348, la cual combina el bajo contenido de glucosinolato con características agronómicas deseadas y tolerancia a enfermedad. La siguiente tabla muestra datos de funcionamiento de cuatro híbridos totalmente regenerados, de una cruza que implica endogámicos hembra y 96FNW-1348. Estos datos son recolectados de pruebas de campo en nueve ubicaciones Europeas en la estación de prueba 1995/96. Se hacen comparaciones para SINERGY, una línea híbrida compuesta desarrollada por Serasem, Francia. Híbrido : Rendimiento altura Madurez Implante Enfermedad (%Chk) (1-9) * (1-9) del tallo 95-90013 107% 163 5.0 6.5 4.2 95-90002 106% 160 4.0 7.5 5.6 95-90004 106% 148 3.8 5.8 4.2 95-90010 105% 165 3.9 7.5 4.6 95-90006 104% 155 4.0 7.2 4.8 SINERGY 100% 155 5.4 7.3 4.0 * las clasificaciones de madurez, implante y enfermedad del tallo están en una escala 1-9, donde 1= más temprano, más susceptible al implante, más susceptible a la enfermedad y 9=tardío, más resistente al implante, más resistente a la enfermedad. EJEMPLO 5: Desarrollo de líneas regeneradoras OGURA mejorado con bajo contenido de glucosinolato, características deseables agronómicas, y resistencia a herbicida. 5.1: Desarrollo de líneas regeneradoras OGURA élite con resistencia a herbicidas de imidazolinona: 1. Producir Fx de 96FNW1348 (línea Rf de bajo contenido de glucosinolato de invierno) x 45A71 (variedad Pursuit Smart ® de primavera) . 2. Germinar Fx rociar las siembras con 100 g/ha de PURSUIT para confirmar resistencia. 3. Producir BCX Fx cruzando Fx a 96FNW1348 4. Germinar BCX, Fx, aspersar las siembras con 100 g/ha de PUSUIT, seleccionar 25% de las plantas con nivel más alto de resisitencia. 5. Producir BCX, F2, autopolinizando plantas selecionadas . 6. Germinar BCX F2, rociar las siembras con 400 g/ha de PURSUIT, autopolinizando plantas más resistentes, se cosecha F3s . 7. Germinar las líneeas F32, rociar con 400 g/ha de PURSUIT; seleccionar líneas en las cuales todas las plantas sean resistentes, autopolinizando se cosecha la semilla F4, confirmar bajo contenido de glucosinolato. 8. Continuar la autopolinización con selección en el semillero: la cruza de prueba selecciona endogámicos regeneradores resistentes a imidazolina (Rl) , para endogámicos hembra Rl élite, luego se evalúa híbirdos Rl de bajo contenido de glucosinolato en características de prueba. 5-2: Desarrollo de líneas regeneradoras OGURA élite con otras formas de resistencia a herbicida, es decir Roundup9 Ready ®, Liberty Link®: 1. Seguir los procedimientos indicados para desarrrollo de endogámicos Rl e híbridos, iniciando con una reserva resistente a herbicida fija. 2. Una vez que se ha identificado líneas regeneradoras resistentes a herbicida, élite, de bajo contenido de glucosinolato, estas deben ser usadas como progenitores en ciclos subsecuentes, para cruzamiento con otros materiales de origen élite. Pueden ser aisladas líneas regeneradoras, nuevas resistentes a herbicida, de bajo contenido de glucosinolato de estos materiales de reserva por reproducción haploide, reproducción de pedigree o retrocruzamiento, todos los cuales son métodos familiares para aquellos con experiencia en la técnica de reproducción de semilla de colza. EJEMPLO 6: Desarrollo de línea regeneradora OGURA mejorada, designada 95SN-9369 y descendientes (97SN-1650, 97SN- 1651 y otros) con bajo contenido de glucosinolato y características agronómicas deseadas. Generación: Progenitor a Fl (dos etapas: Cl= cruza tres formas, C2= cruza compleja) Tiempo del periodo: Cl= Enero de 1994 a Abril de 1994; C2 = Mayo de 1994 a Agosto de 1994. Semilla plantada: Cl : hembra=R40 x TAPIDOR® (de invierno); macho=BULLET® (de primavera) C2 : hembra=Cl; macho=KRISTINA® x GARRISON® Métodos: Se hacen crecer todos los materiales y se realiza cruza en invernaderos de ambiente controlado. R40 x TAPIDOR® Fl usado como el progenitor hembra en Cl es del programa de reproducción de cañóla de invierno. Se hace C2 usando varias plantas Cl fértiles como las plantas hembra, y una muestra de polen en grueso de varias plantas macho. El producto final de C2 es la cruza Fl compleja, ( (R40 xTAPIDOR®) x BULLET®) X (KRISTINA® X GARRÍSON®) . Generación: Fl a F2 Tiempo del periodo: Septiembre a Diciembre de 1994. Semilla plantada: Fl =((R40 x TAPID0R®)X BULLET®) X (KRISTINA® X GARRISON®) . Semilla cosechada: F2 = 95SN-7805 Métodos: Se hacen crecer las plantas 32 Fl en el invernadero y se autopolinizan para producir la semilla F2. En 2 a madurez se cosecha la semilla F2 de cada planta Fl por separado y se analiza para contenido de glucosinolatos por el método de timol (cuantificación colorimétrica) . Se seleccionan lotes de semilla de F2 con el contenido más bajo de glucosinolato en comparación a una variedad de chequeo, para reproducción adicional . Generación: F2 a F3 Tiempo del periodo: Enero de 1995 a Abril de 1995. Semilla plantada: F2 =95SN-7805 Semilla cosechada: F3 = 95SN-9369 (F3 seleccionada) Métodos: Se hacen crecer varios cientos de plantas F2 en el invernadero. En el florecimiento, se descartan plantas estériles y se autopolinizan plantas fértiles en bolsa. Se eliminan las bolsas al final del florecimiento, y se permite que la semilla madure sobre las plantas antes de cosechar. Se analizan todas las líneas de semilla F3 (cosechada de plantas F2 individuales) para contenido de glucosinolato por el método de timol. Se selecciona la línea de semilla F3 , 95SN-9369 como la que está entre el contenido de glucosinolato más bajo. Generación: F3 a F4 Tiempo del periodo: Mayo de 1995 a Agosto de 1995. Semilla plantada: F3 = 95SN-9369 Semilla cosechada: F4 = 96SN-3077, 96SN-0853 y otros (véase la Figura 5) Métodos: Se hace crecer una gran muestra de plantas F3 de 95SN-9369 para florecer en el invernadero, y se poliniza por bolsa para producir semilla F4. Se eliminan las bolsas al final del florecimiento; se cosecha la semilla F4 de cada planta F3 individualmente en madurez total. Cada línea de semilla F4 (semilla cosechada de una planta F3 simple) se analiza para contenido de glucosinolato por el método del timol. Se seleccionan cinco F4s para reproducción adicional (véase Figura 5), incluyendo 96SN-3077 y 96SN-0853. Generación: F4 a F5 Tiempo del periodo: Septiembre de 1995 a Diciembre de 1995. Semilla plantada: F4 = 96SN-3077, 96SN-0853 y otras (véase Figura 5) Semilla cosechada: F5 = 96SN-3424, (de 96SN-0853), 97SN-0180 (de 96SN-3077) y otros (véase la Figura 5 para detalles) Métodos: Se cultivan quince plantas de cada una de las líneas F4 seleccionadas en el invernadero, junto con variedades de chequeo (para selección de glucosinolato) . Se poliniza por bolsa cada planta en el florecimiento; se eliminan las bolsas al final del florecimiento y se cosecha la semilla de plantas individuales en madurez total . Cada línea de semilla F5 (semilla de planta F4 simple) se analiza para contenido de glucosinolato por el método del timol. Se selecciona la mejor F5 de cada F4 para reproducción adicional. Generación: F5 a F6 (97SN-0180 no es incluida en este cultivo) Tiempo del periodo: Enero de 1996 a Abril de 1996. Semilla plantada: F5 = 96SN-3424, y otras (véase Figura 5) Semilla cosechada: F6 = 96SN-9142, (de 96SN-3424) , y otros (véase para detalles la Figura 5) Métodos: Se cultivan quince plantas de cada una de las líneas F5 seleccionadas en el invernadero, junto con variedades de chequeo (para selección de glucosinolato) . Se poliniza por bolsa cada planta en el florecimiento; se eliminan las bolsas al final del florecimiento y se cosecha la semilla de plantas individuales en madurez total. Cada línea de semilla F6 (semilla de planta F5 simple) se analiza para contenido de glucosinolato por el método del timol. Se selecciona la mejor F6 de cada F5 para reproducción adicional . Generación: Campo de evaluación - F5 a F6 para 97SN- 0180; F6 a F7 para 96SN-9142 Tiempo del periodo: Mayo de 1996 a Agosto de 1996. Semilla plantada: F5 = 97SN-0180 F6=96SN-9142 y otras (véase Figura 5) Semilla cosechada: F6 = 97SN-1650 F7=97SN-1651 (de 96SN-9142) , y otros (véase para detalles la Figura 5) Iflétodos: Se cultivan líneas seleccionadas en parcelas de dos líneas en una aislamiento cercano Hillsburgh, Ontario. Después de la emergencia, hay más de 100 plantas por línea. Después de florecer, cada planta en una línea seleccionada es clasificada para fertilidad/esterilidad, y se polinizan 20 plantas para producir semilla autopolinizada. Se eliminan las bolsas al final del florecimiento y se cosecha la semilla en madurez total se analizan plantas simples con semilla sana para contenido de glucosinolato por TMS. Las observaciones de fertilidad muestran que ambas 97SN-1651 y 97SN-1650 son fijos (homocigoto) para el gen Rf. El análisis TMS revela menos de 15 uM de contenido de glucosinolato de estas líneas (véase Figura 5 para datos precisos) . Se observa que ambas líneas tienen madurez, permanencia (resistencia al alojamiento) y tipo de planta aceptables en el semillero. Estas líneasy la línea 97SN-1649, han sido llevados a la producción de semillas durante el invierno 1996/97 en Chile, donde son cruzados para varios endogámicos estériles macho ogura élite (hembra) para producir híbridos de cruza simple. Se evalúan los híbridos resultantes en pruebas en múltiples ubicaciones en invierno en Canadá en verano, 1997. Se cultiva la semilla de Las plantas crecidas en Chile durante el invierno de 1996/97 en Ontario en 1997. Se cosechan las semillas de las plantas resultantes en el verano de 1997 y se evalúan para fertilidad y contenido de glucosinolato. Se realizan las cruzas de prueba para evaluar la transmisión del gen regenerador. Se muestran los resultados en la Tabla 2 posterior. Tabla 2. Observaciones de resultados de fertilidad y análisis de glucosinolato de las líneas 97SN-1649 y 97SN-1650 crecidas en Chile durante 1996/97 y Ontario durante la primavera de 1997. * clasificación Fértil/estéril por inspección visual de morfología de la flor. Una persona con experiencia en la técnica puede usar la planta Brassica de esta invención para desarrollar una planta Brassica la cual es un regenerador de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico orgura, produce semillas de aceite que tienen contenido bajo de glucosinolato y la cual es resistente a uno o más herbicidas. La resistencia a herbicida puede incluir, por ejemplo, resistencia a herbicida glifosato, vendido por Monsanto bajo la marca ROUNDUP. El glifosato es un herbicida extremadamente popular en cuanto se acumula solamente en partes en crecimiento de plantas y tiene poco o ningún residuo en la tierra. Hay dos genes implicados en la resistencia a glifosato en ca óla. Uno es para una enzima la cual destoxifica el herbicida: este es llamado GOX, glifosato oxidorreductasa . El otro es un gen objetivo mutante, para una forma mutante de EPSP sintasa. Una persona con experiencia en la técnica puede usar GOX o CP4 con promotores en cañóla. Básicamente, se introducen los genes en una célula vegetal, tal como una célula vegetal de esta invención que porta el gen regenerador para esterilidad macho citoplásmico, y entonces se hace la célula vegetal en una planta Brassica . Como otro ejemplo, una persona con experiencia en la técnica puede usar la planta Brassica de esta invención para desarrollar una planta Brassica la cual es un regenerador de fertilidad para esterilidad macho citoplásmico ogura, produce semillas de aceite que tiene bajo contenido de glucosinolato y la cual es resistente a la familia de herbicidas de imidazolina, vendidos por Cyanamid bajo marcas tales como PURSUIT. Resistencia a las imidazolinas de Cyanamid bajo marcas tales como PURSUIT se confiere resistencia a las imidazolinas por el gen AHAS o ALS . Una persona con experiencia en la técnica puede introducir la forma mutante de AHAS presente en variedades tales como la variedad de cañóla de primavera Pioneer®, 45A71, en una planta Brassica la cual también porta el gen Rf para el citoplasma ogura. Alternativamente, una persona puede introducir una forma modificada del gen AHAS con un promotor adecuado en una célula vegetal de planta de cañóla. A través de cualquiera de los varios métodos. Básicamente, se introducen los genees en una celia vegetal, tal como una célula vegetal de esta invención que porta el gen regenerador para esterilidad macho citoplásmico ogura, y después haciendo crecer la célula vegetal en una planta Brassica . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad al mismo grado como si cada publicación patente o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada para referencia en su totalidad. La presente invención ha sido descrita en detalle y con referencia particular a modalidades preferidas, sin embargo, una persona con experiencia ordinaria en la técnica entenderá que pueden hacerse cambios a la misma sin alejarse del espíritu y alcance de la misma. Referencias - J. K. Daun et al. J. Amer. Oil Chem. Soc . , 60:1751-1754 (1983) . - Delourme R. , F. Eber, M.Renard, "Breeding Double Low Restorer lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed (Brassica Napus L.)." Proc. 9th Int. Rapessed Conf . Cambridge, England (1995). - Delourme R. , F. Eber, M. Renard, "Radish Cytoplasmic Male Sterility in Rapeseed: Breeding restorer Lines with a Good Female Fertility" . Proc 8 th Int . Rapeseed Conf . Saskatoon Canadá 1506-1510 (1991) . Delourme R. , A. Bouchereau, N. Hubert, M. Renard, B.S. Landry. "Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed (Brassica napus L.)". Theor. Appl. Gener. 88:741-748 (1994). - Delourme, R. And F. Eber. "Linkage Between an Isozyme Marker and a Restorer Gene in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed (Brassica napus L.)". Theor. Appl. Genet. 85:222- 228 (1992) . International Estándar ISO 9167-1 : 1992 (E) . "Rapeseed Determination of glucosinolates - Part 1 : Method using high-performance liquid chromatography" . - Paul, et al., Theor Appl . Genet . 72: 706-709, (1986). Pellan-Delourme, R., Eber, F., Renard, M. 1987. Male fertility restoration in Brassica napus with radish cytoplasmic male sterility. Proc. 7th Int. Rapeseed Conf., Poznan, Poland: 199-203. Pellan-Delourme, R. And Renard, M. 1988. Cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.): Female fertility of restored rapeseed with "ogura" and cybrids cytoplaßmas. Genome 30:234-238. - Pelletier G. , C. Primard. "Molecular, Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed" . Proc. 7th Int. Rapeseed Conf. Poznau. Poland 113-118 (1987) - Rakow, G. And D.I. McGregor. "Opportunities and Problems in Modification of Levéis of Rapeseed Cx8 Unsaturated Fatty Acids". J. Am. Oil Chem. Soc. 50(10): 400-403, (1973).

Ratledge, Colin, dawson, Peter and Rattray, james, 1984.

Biotechnmology for the Oils and Fats Industry. Americam Oil Chemists''Society, Champaign, pág. 328. - Robbelen, Gerhard. "Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapeseed." (Capítulo 10) in "Biotechnology for the oils and Fats Industry" editado por Colin ratledge, Peter Dawson and James Rattray, American Oil Chemists ''Society, (1984) . Robbelen, G. And A. Nitsch. Genetical and Physsiological Investigations on Mutants for polyenic Fatty Acids in Rapeseed, Brassica napus L. Z. Planzenzuchtg. , 75:93-105, (1975) . Sosulski, F., and K. Dabrowski . "Determination of Glucosinolates in Cañóla Meal and protein Products by Desulfation and Capillary Gas-Liquid Chromatograph . " . J.

Agrie. Food Chem. 32: 1172-1175 (1984). Stefansson, B.R. "The Development of Improved Rapeseed Cultivars" . (Capítulo 6) in "High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils" editado por John K. G. Kramer, John. •- K.G., Frank D. Sauer. And Wallace J. Pigden. Academic Press Canadá. Toronto (1983) . Tsunada, S, K. Hinata, and Gomex Campo. "Brassica Crops and Wild Alíeles Biology and Breeding". Japan Cientific Press, Tokyo (1980) . Las semillas de la invención objeto son depositads en American Type Culture Collection (ATCC) , 12301 Parkiawn Drive, Rockville, Maryland, 20952, E.U.A. Semilla No. de Accesión Fecha del depósito Brassica napus sleifera 97SN-1650 97838 23-DÍC.-1996 Brassica napus oleifera 97SN-1651 97839 23-DÍ.C-1996 Brassica napus oleifera 97FN -1792-03 209001 28 -Abril -1997 Brassica napus oleifera 96FNW-1822-07 209002 28-AbrÍl-1997

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de semilla de aceite de una planta Brassica caracterizada porque comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esteriliadad macho citoplásmico ogura y que tiene un contenido de glucosinolato de menos de 30 µmol por gramo, para preparar aceite y/o harina.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la semilla de aceite tiene un contenido de glucosinolato de menos de 25 µmol por gramo.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, caracterizado porque la semilla de aceite tiene un contenido de glucosinolato de menos de 20 µmol por gramo .
4. 4. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 30 µmol por gramo .
5. 5. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 25 µmol por gramo .
6. 6. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 20 µmol por gramo .
7. 7. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 30 µmol por gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento en peso en base al contenido total de ácidos grasos .
8. 8. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 25 µmol por gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento en peso en base al contenido total de ácidos grasos .
9. 9. Una planta de Brassica que comprende un gen regenerador de fertilidad homocigoto para esterilidad macho citoplasmico ogura, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semillas de aceite que tienen un contenido de glucosinolato total de no más de 20 µmol por gramo y un contenido de ácido erúcico de no más de 2 por ciento en peso en base al contenido total de ácidos grasos .
10. 10. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, ó 3, designada por 95SN-9369, 96FNW-1792, 96FNW-1822, 96FNW-1348, 96FNW-1628 o sus sublíneas.
11. 11. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque las sublíneas son seleccionadas de un grupo que consiste de 97SN-1650 (sublínea de 95SN-9369) , 97SN-1651 (sublínea de 95SN-9369) , 96FNW1792-03 (sublínea de 96FNW-1651) , 96FNW1822-07 (sublínea de 96FNW1822) y 96FNW1822-08 (sublínea de 96FNW1822) .
12. 12. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8 caracterizada porque la planta es Brassica napus .
13. 13. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Ó 8 caracterizada porque la planta es Brassica campestris .
14. 14. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Ó 8 caracterizada porque la planta es Brassica júncea .
15. 15. Una planta de Brassica endogámica producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 30 µmol por gramo .
16. 16. Una planta de Brassica endogámica producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 25 µmol por gramo .
17. 17. Una planta de Brassica endogámica producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 20 µmol por gramo .
18. 18. Una planta de Brassica híbrida producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 30 µmol por gramo.
19. 19. Una planta de Brassica híbrida producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 25 µmol por gramo.
20. 20. Una planta de Brassica híbrida producida usando la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8, caracterizada porque después de la polinización la planta produce semilla de aceite que tiene un contenido total de glucosinolato de no más de 20 µmol por gramo.
21. 21. La semilla de aceite de la planta de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17.
22. 22. La semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18 la cual está presente como un componente de una colección sustancialmente homogénea de semillas de aceite las cuales poseen el contenido de glucosinolato especificado.
23. 23. El aceite de la semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18. 2 . El aceite de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la semilla de aceite se forma de Brassica napus. 25. El aceite de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la semilla de aceite se forma de Brassic acampes tris . 26. El aceite de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la semilla de aceite se forma de Brassica júncea . 27. Una harina la cual está sustancialmente libre de aceite y la cual se produce usando la semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18. 28. Una parte de una planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 16, ó 17. 29. La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la parte se selecciona de un grupo que consiste de secuencias de ácidos nucleicos, tejido, células, polen, óvulos, raíces, hojas, semillas de aceite, microsporos, partes vegetales, ya sea maduros o embriónicos . 30. La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque las secuencias de ácidos nucleicos son seleccionadas de un grupo que consiste de ARN, ARNm, ADN, ADNc. 31. Una semilla de aceite de Brassica madura capaz de producir un aceite vegetal endógeno que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 30 µmol por gramo. 32. Una semilla de aceite de Brassica madura capaz de producir un aceite vegetal endógeno que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 25 µmol por gramo. 33. Una semilla de aceite de Brassica madura capaz de producir un aceite vegetal endógeno que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 20 µmol por gramo. 34. Una harina producida de la semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18, que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 30 µmol por gramo. 35. Una harina producida de la semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18, que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 25 µmol por gramo. 36. Una harina producida de. la semilla de aceite de conformidad con la reivindicación 18, que tiene un contenido de glucosinolato de no más de 20 µmol por gramo. 37. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, ó 14 para el uso de reproducción de línea de Brassica . 38. El uso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque se selecciona la reproducción de un grupo que consiste de aislamiento y transformación, reproducción convencional, reproducción de pedigree, cruzamiento, autopolinización, reproducción haploide, descendiente de una semilla y retrocruzamiento.