UA116975C2 - Спосіб боротьби із комахами-шкідниками та стійка до комах-шкідників рослина сої - Google Patents

Спосіб боротьби із комахами-шкідниками та стійка до комах-шкідників рослина сої Download PDF

Info

Publication number
UA116975C2
UA116975C2 UAA201401914A UAA201401914A UA116975C2 UA 116975 C2 UA116975 C2 UA 116975C2 UA A201401914 A UAA201401914 A UA A201401914A UA A201401914 A UAA201401914 A UA A201401914A UA 116975 C2 UA116975 C2 UA 116975C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
soybean
dna
sequence
plant
transformation event
Prior art date
Application number
UAA201401914A
Other languages
English (en)
Inventor
Юнсінь Корі Цуй
Томас ХОФФМАН
Дон М. ПАРКХЕРСТ
Нін Чжоу
Баррі Уіггінз
Даякар Паредді
Грегорі А. Бредфіш
Джеймс Е. Дріппс
Сандра Грейс ТОЛЕДО
Натан БАРД
Майкл ВЕРКАУТЕРЕН
Нанді Нагарадж
Брендон Бдж Бішоп
Грегорі Джеймс Джиллз
Террі Р. Райт
Джулісса Колон
Рікардо А. Барнз
Натан Джоел ВАНОПДОРП
Юнхе Бай
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA116975C2 publication Critical patent/UA116975C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/36—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a singly bound oxygen or sulfur atom attached to the same carbon skeleton, this oxygen or sulfur atom not being a member of a carboxylic group or of a thio analogue, or of a derivative thereof, e.g. hydroxy-carboxylic acids
    • A01N37/38—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a singly bound oxygen or sulfur atom attached to the same carbon skeleton, this oxygen or sulfur atom not being a member of a carboxylic group or of a thio analogue, or of a derivative thereof, e.g. hydroxy-carboxylic acids having at least one oxygen or sulfur atom attached to an aromatic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу боротьби із комахами-шкідниками, який включає надання вказаним комахам їжі, яка містить стійкі до комах-шкідників рослини сої, які містять SEQ ID NO:14 і SEQ ID NO:15, де SEQ ID NO:14 кодує cry1F, cry1Ac і pat, і SEQ ID NO:15 кодує aad-12 і pat, таким чином здійснюючи боротьбу із комахами-шкідниками, де вказані комахи вибрані з групи, яка складається з Pseudoplusia includes (соєва совка), Anticarsia gemmatalis (гусениця оксамитових бобів), Spodoptera frugiperda (трав'яна совка), а також стійкої до комах-шкідників рослини сої, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:14 і нуклеотидну послідовність SEQ ID NО:15, що дозволяє здійснити боротьбу із комахами-шкідниками.

Description

чином здійснюючи боротьбу із комахами-шкідниками, де вказані комахи вибрані з групи, яка складається з Рзецйдоріивіа іпсішдез (соєва совка), Апіісагзіа деттаїйаїї5 (гусениця оксамитових бобів), Зродорієга їгидірегаа (трав'яна совка), а також стійкої до комах-шкідників рослини сої, яка містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14 і нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:15, що дозволяє здійснити боротьбу із комахами-шкідниками.
Попередній рівень техніки
Гени, які кодують СтуїЕ і Стут Ас зупрго (Стуї Ас), здатні забезпечувати стійкість трансгенних рослин до комах-шкідників, наприклад, стійкість до лускокрилих комах, і ген, який кодує РАТ (фосфінотрицинацетилтрансферазу), здатний забезпечувати стійкість трансгенних рослин до гербіциду фосфінотрицину (глуфосинату). РАТ успішно експресували в сої для використання як селектованого маркера при отриманні стійких до комах-шкідників трансгенних культур і для забезпечення комерційних рівнів толерантності трансгенних культур до гербіциду глуфосинату.
При експресії в трансгенних рослинах ген, який кодує аай-12 (арилоксіалканоатдіоксигеназу-12), здатний забезпечувати комерційні рівні толерантності до гербіцидів на основі феноксіоцтової кислоти, 2,4-Ю0 і МСРА і гербіцидів на основі піридилоксіоцтової кислоти, триклопіру і флуроксипіру.
Відомо, що на експресію сторонніх генів у рослинах впливає їх локалізація в геномі рослини, можливо, внаслідок структури хроматину (наприклад, гетерохроматину) або близькості регуляторних елементів транскрипції (наприклад, енхансерів) поруч із ділянкою інтеграції (М/єїзіпа єї аїЇ., Апп. Вем. Сепеї., 22:421-477, 1988). У той час наявність трансгена при різних локалізаціях в геномі впливає на весь фенотип рослини різними способами. Тому часто є необхідним проведення скринінгу великої кількості трансформаційних подій для ідентифікації трансформаційної події, яка характеризується оптимальною експресією гена, який вводиться, що представляє інтерес. Наприклад, спостерігали, що у рослин і у інших організмів може існувати широка варіація рівнів експресії гена, що вводиться, серед трансформаційних подій.
Також можуть існувати відмінності в просторових або часових патернах експресії, наприклад, відмінності відносної експресії трансгена в різних тканинах рослини, які можуть не відповідати патернам, що прогнозуються на основі регуляторних елементів транскрипції, які містяться у генній конструкції, яка вводиться. Тому загальноприйнято отримують від сотень до декількох тисяч різних трансформаційних подій і проводять скринінг таких трансформаційних подій для пошуку однієї трансформаційної події, яка має бажані рівні і патерни експресії трансгена для комерційних цілей. Трансформаційна подія, яка має бажані рівні або патерни експресії трансгена, є придатною для інтрогресії трансгена в інші генетичні середовища, за допомогою статевого ауткросингу загальноприйнятими способами схрещування. Потомство таких
Зо схрещувань зберігає характеристики експресії трансгена вихідної трансформаційної події. Таку стратегію використовують для забезпечення надійної експресії гена в ряді сортів, які добре адаптуються до умов росту в певній місцевості.
Для визначення чи може потомство статевого схрещування містити трансген або групу трансгенів, які представляють інтерес, бажано мати можливість детектувати наявність конкретної трансформаційної події або багатьох трансформаційних подій. Крім того, спосіб детекції конкретної трансформаційної події або багатьох трансформаційних подій може виявитися корисним для дотримання правил, необхідних для передпродажного схвалення і маркірування харчових продуктів, які отримуються, наприклад, із рекомбінантних сільськогосподарських культур, або для застосування в моніторингу навколишнього середовища, моніторингу слідів культур у полі або моніторингу продуктів, які отримуються із урожаю культури, а також для застосування в забезпеченні дотримання сторін встановлених нормативних умов або умов договору.
Наявність однієї або декількох трансгенних трансформаційних подій можна детектувати за допомогою детекції будь-якої нуклеїнової кислоти відомим в даній галузі способом, включаючи, але, не обмежуючись ними, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) або гібридизацію ДНК із використанням зондів для нуклеїнових кислот. Такі способи детекції, як правило, направлені на часто використовувані генетичні елементи, такі, як промотори, термінатори, маркерні гени і т. д., так як для багатьох ДНК-конструкцій кодуюча область є взаємозамінною. У результаті такі способи можуть бути непридатними для ідентифікації різних трансформаційних подій, зокрема трансформаційних подій, які отримуються із використанням аналогічної ДНК-конструкції або дуже схожих конструкцій, за винятком тих випадків, коли послідовність ДНК, фланкувальна ДНК, суміжна із вбудовуваною гетерологічною ДНК, є відомою. Наприклад, у патентній заявці 2006/0070139 описаний специфічний відносно трансформаційної події ПЛР аналіз для трансформаційної події кукурудзи ОА5З-59122-7. Бажано мати простий і диференційний спосіб ідентифікації селекційних гібридів трансформантів сої рОАВУ9582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1..
Короткий опис суті винаходу
Даний винахід стосується нового стійкого до комах-шкідників і толерантного до гербіцидів трансгенного селекційного гібриду трансформанту сої, який позначається як трансформант сої ррАВО582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1. Цей селекційний гібрид містить сгуїЕ, сгутАс і РАТ, як 60 описано в даному описі, і аад-12 і РАТ, як описано в даному описі і в міжнародній патентній заявці Мо ММО/2012/075426, введені в конкретні ділянки в геном клітини сої. Репрезентативне насіння сої депонували в Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп (АТСС) із Мо доступу, який указано нижче. ДНК рослин сої, які містять таку трансформаційну подію, включають з'єднувальні/фланкувальні послідовності, які описуються в даному описі, які характеризують локалізацію вбудовуваної ДНК в геном сої. ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЗЕО ІЮ МО:2 і ЗЕО ІЮО МО:15 є діагностичними для трансформаційної події сої ррАвВе9582.814.19.1:ррдв4468.04.16.1.. Більш конкретно, послідовності, які оточують ділянки сполуки при 1400/1401 п. н., 1536/1537 п. н. ЗЕО
ІО МО:1, 152/153 п. н. БЕО ІО МО:2, 2730/2731 п. н. ЗЕО ІЮ МО:15 ії 9121/9122 п. н. ЗЕО ІЮ
МО:15, є діагностичними для трансформаційної події ррАВеО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1. В абзаці нижче описані приклади послідовностей, які містять ці ділянки сполуки, які являють собою характерну ознаку ДНК сої, що містить трансформаційну подію сої ррАВОБ582.814.19.1:ррдвВ4468.04.16.1.
У одному із варіантів здійснення винахід стосується рослини сої або її частини, яка є стійкою до Рхецпйдорісивіа іпсіцдепз5 (соєвої совки), і геном якої містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮ МО/-1, п. н. 1350-1450 5ЕО І МО, п. н. 1300-1500 5ЕО ІО МО-1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО-:1, п. н. 137-168 5ЕО ІЮ МО:2, п. н. 103- 203 5ЕО ІЮ МОС2, і п. н. 3-303 5ЕО ІЮО МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІО МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІО МО:15, п. н. 9021-9221 5БЕО ІЮО МО 15 іп. н. 8921-9321 5ЕО ІЮ МО:15, і їх комплементів. У іншому варіанті здійснення винахід стосується насіння таких рослин.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби із комахами-шкідниками, який включає піддавання впливу комахами-шкідниками стійких до комах-шкідників рослин сої, де рослини сої мають геном, який містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮО МО:1, п. н. 1350-1450 5ЕО ІО МО:1, п. н. 1300-1500
ЗЕО ІЮ МО-1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103-203 5ЕО ІЮ
МО:2 і п. н. 3-303 5ЕО ІО МО:2, і одну або декілька послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІО МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮ МО: 15, п. н. 2530-2930 5ЕО
ІО МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 9021-9221 5ЗЕО ІО МО'15 і п. н. 8921-9321 5ЕО Ір
Зо МО:15, і їх комплементи, які характеризуються вмістом трансформаційної події сої рорАВОБ582.814.19.1:ррдв4468.04.16.1, щоб таким чином боротися із комахами-шкідниками.
Наявність генів сгуїб мЗ (стуїб) і сгутАс 5упроо (стуїАс) у трансформаційній події сої рорАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 забезпечує стійкість, наприклад, до Рзтецйдорісивіа іпсічдеп5 (соєвої совки), Апіісагзіа деттаїйаїї5 (гусениці оксамитових бобів), Еріпоїйа арогета,
Отоїідев іпаісаше, Васпіріизіа пи, Зродорієга Пиадірегда, бЗродорієгта созтоїіде5, бродорієга егідапіа, Неїйоївпі5 мігезсеп5, Неїїосомегра 72еа, Зріозота мігдіпіса і ЕІазтораїриз ІдпозеПШв5.
У одному із варіантів здійснення винахід стосується рослини сої або її частини, яка є толерантною до гербіцидів на основі феноксіоцтової кислоти, таких, як 2,4-О0 і МСРА. У іншому варіанті здійснення винахід стосується рослини сої або її частини, яка є толерантною до гербіцидів на основі піридилоксіоцтової кислоти, таких, як триклопір і флуроксипір. У цих варіантах здійснення рослина сої має геном, який містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮ МО':1, п. н. 1350-1450 5ЕО І МО, п. н. 1300-1500 5ЕО ІО МО:1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО-1, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103- 203 5ЕО ІЮ МО:2, п. н. 3-303 5ЕО ІО МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2530-2930
ЗЕО ІО МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 9021-9221 5ЕО ІО МО:15 і, п. н. 8921-9321
ЗЕО ІО МО:15, і їх комплементів. У іншому варіанті здійснення винахід стосується насіння таких рослин.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби із бур'янами соєвої культури, який включає застосування гербіцидів на основі феноксіоцтової кислоти, таких, як 2,4-
Ор ї МОРА. У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби із бур'янами соєвої культури, який включає застосування гербіцидів на основі піридилоксіоцтової кислоти, таких, як триклопір і флуроксипір, соєвої культури, де соєва культура містить рослини сої, які мають геном, який містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 БЕО ІО МО:1, п. н. 1350-1450 5ЕО ІО МО-:1, п. н. 1300-1500 5ЕО ІЮ МО/1, п. н. 1200-1600 5ЕО І МО/1, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103-203 5ЕО ІО МО:2, п. н. 3-303 5ЕО
ІО МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780
ЗЕО ІЮ МО':15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 9071-9171
ЗЕО ІЮ МО:15, п. н. 9021-9221 5БЕО ІЮО МО:15 і п. н. 8921-9321 БЕО ІЮО МО:15, і їх комплементів. бо Наявність гена ааа-12 у селекційному гібриді трансформанту сої рорАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 забезпечує толерантність до гербіцидів на основі феноксіоцтової кислоти і гербіцидів на основі піридилоксіоцтової кислоти.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби із бур'янами соєвої культури, який включає застосування гербіциду глуфосинату до соєвої культури, де вказана соєва культура містить рослини сої, які мають геном, який містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІО МО/:1, п. н. 1350- 1450 5ЕО ІО МО-1, п. н. 1300-1500 5ЕО ІО МО-1, п. н. 1200-1600 5ЕО І МО'-1, п. н. 137-168 5ЕО
ІО МО:2, п. н. 103-203 5БЕО ІЮ МО:2, п. н. 3-303 5ЕО ІЮ МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО І
МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІО МО:15, п. н. 9021-9221 5ЕО І0
МО:15 і п. н. 8921-9321 5ЕО ІО МО:15, і їх комплементів, які є діагностичними для вмісту трансформаційної події сої рОАВО582.814.19.1:ррАВА4468.04.16.1. Наявність гена РАТ мб (РАТ) у трансформаційній події сої рРОАВУ582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 забезпечує толерантність до гербіциду глуфосинату.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу детекції трансформаційної події сої рорАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 у зразку, який містить ДНК сої, де вказаний спосіб включає: а) контактування вказаного зразка із першим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із фланкувальною послідовністю в п. н. 1-1400 5ЕО ІЮО МО:1 або її комплементі, і другим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із вбудовуваною послідовністю в п. н. 1401-1836 5ЕО ІЮ МО:1 або її комплементом, і аналіз амплікону, який утворюється між вказаними праймерами, або р) контактування вказаного зразка із першим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із вбудовуваною послідовністю в п. н. 1-152 5ЕО ІЮ МО:2 або її комплементі, і другим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із рланкувальною послідовністю в п. н. 153-1550 5ЕО ІО МО:2 або її комплементі, або с) контактування вказаного зразка із першим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із вбудовуваною послідовністю в п. н. 2731-9121 5ЕО ІЮ МО:15 або її комплементі, і другим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно
Зо зв'язується із рланкувальною послідовністю в п. н. 1-2730 5ЕО ІЮ МО:15 або її комплементі, або а) контактування вказаного зразка із першим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із вбудовуваною послідовністю в п. н. 2731-9121 5ЕО ІЮ МО:15 або її комплементі, і другим праймером довжиною щонайменше 10 п. н., який селективно зв'язується із фланкувальною послідовністю в п. н. 9122-10198 5ЕО ІЮО МО:15 або її комплементі, і с) аналіз амплікону, який утворюється між вказаними праймерами.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу детекції трансформаційної події сої ррАВО582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1, який включає: а) контактування вказаного зразка із першим праймером, який селективно зв'язується із фланкувальною послідовністю, вибраною із групи, яка складається із п. н. 1-1400 5ЕО ІЮО МО1 і п. н. 153-1550 5БЕО ІЮО МО:2 і їх комплементом, і другим праймером, який селективно зв'язується із ЗЕО ІЮ МО:3 або її комплементом, і третім праймером, який селективно зв'язується із фланкувальною послідовністю п. н. 1-2730 5ЕО ІЮ МО:15 і п. н. 9122-10198 БЕО ІО МО:15, і їх комплементом; і четвертим праймером, який селективно зв'язується із вбудовуваною послідовністю 2731-9121 5ЕО ІЮО МО 15 і її комплементом;
Юр) піддавання вказаного зразка полімеразній ланцюговій реакції; с) аналіз амплікону, який утворюється між вказаними праймерами.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу селекції рослини сої, який включає: схрещування першої рослини із другою рослиною сої із отриманням третьої рослини сої, де
БО вказана перша рослина містить ДНК, яка містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5БЕО ІЮО МО/-1, п. н. 1350-1450 5ЕО ІЮО МО:1, п. н. 1300- 1500 5ЕО ІО МО:1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО-:1, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103-203 5БЕО І
МО:2 і п. н. 3-303 5ЕО ІЮО МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІО МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮ МО: 15, п. н. 2530-2930 5ЕО
ІО МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 9021-9221 5ЗЕО ІО МО'15 і п. н. 8921-9321 5ЕО Ір
МО:15 і їх комплементів, і аналіз вказаної третьої рослини сої на вміст ДНК, яка містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮ МОЇ, п. н. 1350-1450 5ЕО ІЮО МО:1, п. н. 1300-1500 5ЕО ІО МО-1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО/1, п. н. 137-168 5ЕО ІЮ МО:2, п. н. 103-203 5ЕО ІЮО МО:2, п. н. 3-303 5ЕО ІО МО:2, п. н. 2680-2780 5ЕО
ІО МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІО
МО:15, п. н. 9021-9221 5ЕО ІО МО:15 і п. н. 8921-9321 5ЕО ІО МО:15 і їх комплементів.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується виділеної молекули ДНК, яка є діагностичною для трансформаційної події сої рорАВео582.814.19.1:ррОАВ4468.04.16.1. Такі молекули поряд із 5ЕО ІЮ МО-1, 2 і 15 включають молекули довжиною щонайменше 25 п. н., які містять п. н. 1400-1401 5ЕО ІЮ МО:1 і щонайменше 10 п. н. БХЕО ІЮ МО:1 в кожному напрямі від п. н. 1400/1401 ділянки сполуки; амплікони довжиною щонайменше 25 п. н., які містять 152-153
ЗЕО ІЮО МО:2 і щонайменше 10 п. н. БЕО І МО:2 у кожному напрямі від п. н. 152/153 ділянки сполуки; амплікони довжиною щонайменше 25 п. н., що містять п. н. 2730-2731 БЕО ІЮ МО:15 і щонайменше 10 п. н. 5БЕО ІЮ МО:15 в кожному напрямі від п. н. 2730/2731 ділянки сполуки; амплікони довжиною щонайменше 25 п. н., які містять п. н. 9121-9122 5ЕБЕО ІЮ МО:15 і щонайменше 10 п. н. 5БЕО ІЮ МО:15 в кожному напрямі від п. н. 9121/9122 ділянки сполуки.
Приклади являють собою п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮО МО/-1, п. н. 1350-1450 5ЕО ІЮО МО-1, п. н. 1300- 1500 5ЕО ІО МО:1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІО МО-:1, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103-203 5БЕО І
МО:2 і п. н. 3-303 5ЕО ІЮ МО:2, п. н. 2680-2780 5ЕО ІО МО:15, п. н. 2630-2830 5ЕО ІО МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІО МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 9021-9221 5ЕО ІЮ МО 15 іп. н. 8921-9321 5ЕО ІЮО МО:15, і їх комплементи.
У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу боротьби із шкідниками зерна сої, насіння або макухи, який включає введення трансформаційної події сої ррАВО582.814.19.1:!ррАВ4468.04.16.1 у вказане зерно, насіння або макуху, як продемонстровано вказаним зерном, насінням або макухою, що містить ДНК, яка містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 1385-1415 5ЕО ІЮ МОЇ, п. н. 1350-1450 5ЕО ІЮ МО:1, п. н. 1300-1500 5ЕО ІЮ МО-1, п. н. 1200-1600 5ЕО ІЮ МО-:1, п. н. 137-168 5ЕО ІО МО:2, п. н. 103-203 5ЕО ІОЮО МО/:2 і п. н. 3-303 5ЕО ІЮ МО:2, і одну або більше послідовностей, вибраних із групи, яка складається із п. н. 2680-2780 5ЕО ІО МО:15, п. н. 2630- 2830 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 2530-2930 5ЕО ІЮ МО:15, п. н. 9071-9171 5ЕО ІЮО МО:15, п. н. 9021- 9221 5ЕО ІО МО:15 і п. н. 8921-9321 5ЕО ІЮО МО:15 і їх комплементів.
Винахід також включає клітини рослини і частини рослини сої, включаючи, але, не обмежуючись ними, пилок, насінний зачаток, квіти, пагони, коріння і листя, і ядра вегетативних
Зо клітин, клітин пилку, насіння і макухи і яйцеклітини, які містять трансформаційну подію сої ррАВО582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 селекційного гібриду.
У деяких варіантах здійснення трансформаційну подію сої рорАВОБ582.814.19.1:ррадвВ4468.04.16.1 селекційного гібриду можна комбінувати із іншими ознаками, включаючи, наприклад, інший ген(и) толерантності до гербіцидів і/або пригнічуючих ріст комах білків і регуляторні послідовності транскрипції (тобто РНК-інтерференцію, доиРНК, фактори транскрипції і т. д-). Можна здійснювати стекінг додаткових ознак у геномі рослини шляхом селекції рослин, повторної трансформації трансгенної рослини, яка містить трансформаційну подію сої рраВе582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 селекційного гібриду, або додавання нових ознак шляхом направленої інтеграції.
Інші варіанти здійснення включають ексцизію полінуклеотидних послідовностей, які містять трансформаційну подію сої рраАвВе582.814.19.1:ррОАВ4468.04.16.1 селекційного гібриду, включаючи, наприклад, експресійну касету гена РАТ. В результаті ексцизії полінуклеотидної послідовності модифіковану трансформаційну подію можна перенаправляти на конкретну ділянку хромосоми, де проходить стекінг додаткових полінуклеотидних послідовностей спільно із трансформаційною подією сої ррАВУ582.814.19.1:ррдівВ4468.04.16.1 селекційного гібриду.
У одному із варіантів здійснення даний винахід стосується ділянки-мішені хромосоми сої, локалізованої у хромосомі 02 між фланкувальними послідовностями, вказаними в ЗЕО ІЮО МО: їі 2.
У одному із варіантів здійснення даний винахід стосується ділянки-мішені хромосоми сої, локалізованої у хромосомі 04 між фланкувальними послідовностями, вказаними в 5ЕО ІЮ
МО:15.
У одному із варіантів здійснення даний винахід стосується способу отримання трансгенної рослини сої, яка включає введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в положення у хромосомі 02 між геномними послідовностями, вказаними в 5ЕО ІЮ МО:1 і 2, тобто між п. н. 1-1400 5ЕО ІЮ
МОГ-1 і п. н. 153-1550 5ЕО ІЮ МО 2.
У одному із варіантів здійснення даний винахід стосується способу отримання трансгенної рослини сої, яка включає введення гетерологічної нуклеїнової кислоти у положення в хромосомі 04 між геномними послідовностями, вказаними в 5ЕО ІЮ МО:15, тобто між п. н. 1-2730 5ЕО І
МО:15 і п. н. 9122-10198 5ЕО ІЮ МО:15.
Крім того, даний винахід стосується аналізів детекції наявності трансформаційної події, яка розглядається у зразку (наприклад, сої). Аналізи можуть бути засновані на послідовності ДНК рекомбінантної конструкції, яка вбудовується в геном сої, і на геномних послідовностях, які фланкують ділянку вставки. Також надані набори і умови, придатні для проведення аналізів.
Даний винахід частково стосується клонування і аналізу послідовностей ДНК граничних областей, отримуваних в результаті введення Т-ДНК із ррАВеО582 і ррАВ4468 в трансгенні лінії сої. Ці послідовності є унікальними. На основі вбудовуваної і з'єднувальної послідовностей можуть існувати специфічні для трансформаційної події праймери і їх отримували. ПЛР аналіз демонстрував, що ці трансформаційні події можна ідентифікувати аналізом ПЛР-ампліконів, отримуваних із використанням таких наборів специфічних для трансформаційної події праймерів. Таким чином, ці і інші зв'язані способи можна використовувати для унікальної ідентифікації ліній сої, які містять трансформаційну подію за даним винаходом.
Депонування насіння
Як частини даного винаходу депонували щонайменше 2500 насінин лінії сої, яка містить трансформаційну подію сої рОрАВУ582.814.19.1, ії 2500 насінин лінії сої, яка містить трансформаційну подію сої ррАВ4468.04.16.1, і робили доступними для громадськості без обмеження (але за умови патентних прав) в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 Опімег5йу Вошемага, Мапабхза5, МА, 20110. Депозити, які позначаються як Мо АТСС депозиту РТА-10442 (рОАВ4468.04.16 1) і Мо АТСС депозиту (рОАВО582.814.19.1), реєстрували від імені Юом/ Адгозсіепсе5 Г/С 22 жовтня 2009 року і відповідно. Ці депозити вносили, і їх будуть підтримувати відповідно і за умовами Будапештського договору відносно депозитів насіння для цілей патентної процедури.
Короткий опис послідовностей
ЗБО ОО МО: 1 являє собою 5'-фланкувальну граничну послідовність ДНК для трансформаційної події сої ррдавВе9582.814.19.1. Нуклеотиди 1-1400 являють собою геномну послідовність. Нуклеотиди 1401-1535 являють собою реаранжовану послідовність із РОАВО582.
Нуклеотиди 1536-1836 являють собою вбудовувану послідовність.
ЗБО ОО МО:2 являє собою 3'-фланкувальну граничну послідовність ДНК для трансформаційної події сої рРОАВУ582.814.19.1. Нуклеотиди 1-152 являють собою вбудовувану послідовність. Нуклеотиди 153-1550 являють собою геномну послідовність.
ЗЕО ІЮ МО:З являє собою послідовність ДНК ррАвВеО582, яка анотована нижче в таблиці 1.
ЗЕО ІЮ МО:4 являє собою олігонуклеотидний праймер 81419 ЕМ/З для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:5 являє собою олігонуклеотидний праймер 81419 КМІ1 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:6б являє собою олігонуклеотидний праймер 81419 КМУ2 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:7 являє собою олігонуклеотидний праймер 81419 КУЗ для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:8 являє собою олігонуклеотидний праймер 5'КЕпа-0І для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮО МО:9 являє собою олігонуклеотидний праймер 5'КЕпа-02 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:10 являє собою олігонуклеотидний праймер АШБІТОБМ1 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:11 являє собою олігонуклеотидний праймер АШБІТОБМ2 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:12 являє собою олігонуклеотидний праймер З'РАТЕпаб05 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:13 являє собою олігонуклеотидний праймер З'РАТЕпабб для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗБО ІО МО:14 являє собою підтверджену послідовність трансформаційної події сої ррАВУО582.814.19.1. Включаючи 5'-фланкувальну геномну послідовність, ррАВе9582Т-вставку ланцюга і 3і-фланкувальну геномну послідовність.
ЗБО ІО МО:15 являє собою підтверджену послідовність трансформаційної події сої рорАВ4468.04.16.1. Включаючи 5'-рланкувальну геномну послідовність, ррдАвВ4468Т-вставку ланцюга і 3і-фланкувальну геномну послідовність.
Короткий опис креслень
Фіг. 1 являє собою карту плазміди ррАВО582, яка містить експресійні касети сгуїЕ, сгу1Ас і (510) РАТ.
На фіг. 2 проілюстровані локалізації праймерів для підтвердження 5- і 3-граничної послідовності трансформаційної події сої рРОАВО582.814.19.1.
На фіг. З проілюстроване розташування геномної послідовності в трансформаційній події сої ррАВО582.814.19.1.
Докладний опис винаходу
Секвенували і характеризували фланкувальні послідовності вбудовування трансформаційної події сої рорАВе582.814.19.1:ррдівВ4468.04.16.1. Розробляли специфічні відносно трансформаційної події аналізи. Також їх картували в геномі сої (хромосома сої 02 і 04). Трансформаційні події можна спільно інтрогресувати в додаткові елітні лінії.
Як указано вище в розділі попередній рівень техніки введення і інтеграція трансгена в геном рослини включає деякі випадкові трансформаційні події (таким чином, використовують назву "грансформаційна подія" для даної вставки). Таким чином, багатьма способами трансформації, такими, як опосередкована Адгобасіегішт трансформація, біолістична трансформація (тобто генна гармата) і опосередкована карбідом кремнію трансформація (тобто М/НІЗКЕКЗ "М), неможливо прогнозувати, де в геномі вбудується трансген. Таким чином, визначення фланкувальної геномної ДНК рослини на обох сторонах вставки може бути важливим для ідентифікації рослини, яка містить дану трансформаційну подію вставки. Наприклад, можна конструювати праймери для ПЛР, які утворять ПЛР-амплікон між з'єднувальною областю вставки і геному-хазяїна. Такий ПЛР-амплікон можна використовувати для ідентифікації унікального або окремого типу трансформаційної події вбудовування.
У даному описі надані визначення і приклади із метою полегшення опису даного винаходу і для керівництва для фахівців в даній галузі для практичного здійснення винаходу. Якщо не вказано інше, терміни потрібно розуміти відповідно до їх загальноприйнятого використання фахівцями у відповідній галузі. Використовують таку номенклатуру для основ ДНК, як вказана в 37 СЕК 51.822.
Як використовують в даному описі, термін "потомство" означає потомство будь-якої генерації батьківської рослини, яка містить трансформаційну подію сої ррАВО582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 селекційного гібриду.
Трансгенну "трансформаційну подію" отримують трансформацією рослинних клітин
Зо гетерологічної ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка містить представляючі інтерес трансгени, відновленням популяції рослин, отримуваних в результаті вбудовування трансгена в геном рослини, і відбором конкретної рослини, яка характеризується конкретною локалізацією в геномі. Термін "трансформаційна подія" стосується вихідного трансформанту і потомства трансформанту, які містять гетерологічну ДНК. Термін "трансформаційна подія" також стосується потомства, яке отримується статевим ауткросингом трансформанту і іншого сорту, який містить геномну/трансгенну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування із рекурентним батьком, вбудовувана трансгенна ДНК і фланкувальна геномна ДНК (геномна/грансгенна ДНК) від трансформованого батька міститься у потомства схрещування в аналогічній локалізації в хромосомі. Термін ""трансформаційна подія" також стосується ДНК від вихідного трансформанту і його потомства, яке містить вбудовувану ДНК і фланкувальну геномну послідовність, яка безпосередньо прилягає до вбудовуваної ДНК, для якої передбачають, що вона передасться потомству, яке отримує вбудовувану ДНК, яка містить представляючий інтерес трансген, в результаті статевого схрещування однієї батьківської лінії, яка містить вбудовувану ДНК (наприклад, вихідний трансформант і потомство, яке отримується в результаті самозапилення) і батьківської лінії, яка не містить вбудовувану ДНК. "З'єднувальна послідовність" або "гранична послідовність" включає точку, в якій вбудовувана в геном ДНК є з'єднаною із ДНК нативного геному сої, що фланкує точку вбудовування, де ідентифікація або детекція однієї або інших з'єднувальних послідовностей в генетичному матеріалі рослини є достатньою для діагностики трансформаційної події. Також включені послідовності ДНК, які включають вставки в описуваних в даному описі трансформаційних подіях сої і аналогічні довжини фланкувальної ДНК. У даному описі надані конкретні приклади таких діагностичних послідовностей, однак, інші послідовності, які перекривають ділянки сполуки вставок або сполуки вставок і геномної послідовності, також є діагностичними, і їх можна використовувати за даним винаходом.
Даний винахід частково стосується ідентифікації трансформаційної події із використанням таких фланкувальних, з'єднувальних і вбудовуваних послідовностей. Відповідні праймери для
ПЛР її амплікони також входять у винахід. Відповідно 3 даним винаходом можна використовувати способи ПЛР аналізу із використанням ампліконів, які охоплюють вбудовувану
ДНК і її межі, для детекції або ідентифікації трансгенних сортів або ліній сої, що знаходяться в бо продажу, які отримуються із трансгенних ліній сої об'єкта власності.
Фланкувальні/з'єднувальні послідовності є діагностичними для трансформаційної події сої рорАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 селекційного гібриду. На основі цих послідовностей отримували специфічні до трансформаційної події праймери. ПЛР аналіз демонстрував, що ці лінії сої можна ідентифікувати в різних генотипах сої за допомогою аналізу ПЛР-ампліконів, отримуваних із використанням таких наборів специфічних до трансформаційної події праймерів.
Таким чином, ці і інші пов'язані способи можна використовувати для унікальної ідентифікації цих лінії сої. Послідовності, які визначаються в даному описі, є унікальними.
Способи детекції за даним винаходом є особливо придатними в поєднанні із селекцією рослин для визначення, які рослини потомства містять дану трансформаційну подію після того, як батьківську рослину, яка містить представляючу інтерес трансформаційну подію, схрещують із іншою лінією рослин із метою внесення однієї або більше додаткових представляючих інтерес ознак в потомство. Такі способи ПЛР аналізу є корисними для програм селекції сої, а також для контролю якості, зокрема для трансгенного насіння сої, яке знаходиться в продажу. У даний час також можна отримувати і використовувати набори для детекції ПЛР для таких трансгенних ліній сої. Це також може бути корисним для реєстрації продуктів і керування якістю продукту.
Крім того, фланкувальні/геномні послідовності сої можна використовувати для конкретної ідентифікації локалізації в геномі кожної вставки. Цю інформацію можна використовувати для отримання системи молекулярних маркерів, специфічних для кожної трансформаційної події. їх можна використовувати для способів прискореної селекції і для встановлення даних зчеплення.
Крім того, інформацію про фланкувальну послідовність можна використовувати для дослідження і характеристики способів інтеграції трансгена, характеристики ділянок геномної інтеграції, сортування трансформаційних подій, стабільності трансгенів і їх фланкувальних послідовностей і експресії гена (зокрема, зв'язаної із виключенням генів, патернами метилування трансгенів, ефектів положення і потенційних зв'язаних із експресією елементів, таких, як МАКЗ Іділянки прикріплення до матриксу) і т. п.).
У описі предмета винаходу потрібно розуміти, що даний винахід включає насіння, доступне за Мо АТСС депозиту. Даний винахід також включає толерантну до гербіцидів рослину сої, вирощену із насіння, депонованого із Мо АТСС депозиту. Даний винахід додатково включає частини вказаної рослини, такі, як листя, зразки тканини, насіння, продуковане вказаною рослиною, пилок і т. п. (де вони містять сгуїЕ, сгутАс, РАТ, і 5БЕО ІО МО-1 і 2 поряд із аад-12,
РАТ ї БЕО ІО МО:15).
Крім того, даний винахід включає рослини потомків і/або потомства рослин, вирощених із депонованого насіння, переважно стійкої до гербіцидів рослини сої, де вказана рослина має геном, який містить детектовану з'єднувальну послідовність дикого типу, як описано в даному описі. Як використовують в даному описі, термін "соя" означає Сіусіпе тах і включає всі його сорти, які можна виводити із рослини сої.
Даний винахід додатково включає способи проведення схрещувань із використанням рослини за даним винаходом як щонайменше одного батька. Наприклад, даний винахід включає гібридну рослину Еї, яка має як одного або обох батьків будь-яку із рослин, що ілюструються в даному описі, включаючи, але, не обмежуючись тим, що вона має одного батька, який містить трансформаційну подію сої ррАВеУ582.814.19.1, і іншого батька, який містить ррАВ4468.04.16.1. Також даний винахід стосується насіння, продукованого такими гібридами Е: за даним винаходом. Даний винахід включає спосіб отримання насіння гібриду Е: шляхом схрещування ілюстративної рослини із відмінною (наприклад, інбредним батьком) рослиною і збору отримуваного насіння гібриду. Даний винахід включає ілюстративну рослину, яка являє собою материнську форму або батьківську форму. Характеристики отримуваних рослин можна поліпшувати шляхом ретельного розгляду батьківських рослин.
Стійку до комах-шкідників/толерантну до 2,4-О0/ толерантну до глуфосинату рослину сої за даним винаходом можна розмножувати спочатку статевим схрещуванням першої батьківської рослини сої, яка складається із рослини сої, вирощеної із насіння будь-якої із ліній, вказаних в даному описі, і другої батьківської рослини сої, таким чином отримуючи ряд рослин першого потомства; потім відбираючи рослину першого потомства, яка є стійкою до глуфосинату і/або 2,4-О0; проводячи самозапилення рослини першого потомства, таким чином, отримуючи ряд рослин другого потомства, а потім відбираючи із рослин другого потомства рослину, яка є стійкою до глуфосинату і/або 2,4-О. Ці етапи можуть додатково включати зворотне схрещування рослини першого потомства або рослини другого потомства із другою батьківською рослиною сої або третьою батьківською рослиною сої. Потім можна культивувати культуру сої, яка містить насіння сої за даним винаходом або їх потомство.
Також потрібно розуміти, що дві різні трансгенні рослини також можна зв'язувати (таїеад) із 60 отриманням потомства, яке містить два незалежно сегреговані, додані екзогенні гени.
Самозапиленням відповідного потомства можна отримувати рослину, яка є гомозиготною за обома доданими екзогенними генами. Також передбачені зворотне схрещування із батьківською рослиною і ауткросинг із нетрансгенною рослиною у вигляді вегетативного розмноження. Інші способи селекції, які широко використовуються для різних ознак і культур, є відомими в даній галузі Розмноження зворотним схрещуванням використовують для перенесення генів для просто успадкованої, високонаслідуваної ознаки в бажаний гомозиготний культивар або інбредну лінію, яка являє собою рекурентного батька. Джерело ознаки, яку необхідно перенести, називають донорною рослиною. Очікують, що отримувана рослина має характеристики рекурентного батька (наприклад, культивара) і бажану ознаку, перенесену від донорного батька. Після первинного схрещування відбирають індивідуумів, які мають фенотип донорного батька, і повторно схрещують (проводять зворотне схрещування) із рекурентним батьком. Чекають, що отримуваний батько має характеристики рекурентного батька (наприклад, культивара) і бажану ознаку, перенесену від донорного батька.
Аналогічно, стійку до комах-шкідників/голерантну до 2,4-О/толерантну до глуфосинату рослину сої за даним винаходом можна трансформувати додатковими трансгенами способами, відомими в даній галузі. Способи трансформації, такі, як опосередкована Аадгобасіегійт трансформація, біолістична трансформація (тобто генна гармата) і опосередкована карбідом кремнію трансформація (тобто М/ІНІЗКЕК5), можна використовувати для введення додаткового трансгенац(ів) у геном селекційного гібриду трансформанту сої ррАВО582.814.19.1:!ррАВ4468.04.16.1. Для ідентифікації рослин, які містять стабільний інтегрант нового трансгена в доповнення до генів аай-12, сту1Р, стутїАс, РАТ за даним винаходом, можна виконувати відбір і характеристику трансгенної рослини, яка містить знову введені трансгени.
Молекули ДНК за даним винаходом можна використовувати як молекулярні маркери в способі схрещування із використанням маркера (МАВ). Молекули ДНК за даним винаходом можна використовувати в способах (таких, як маркери АРІ Р, маркери КЕРГР, маркери КАРОЮ,
ЗМР, ії ЗБК), якими ідентифікують генетично зчеплені господарсько-цінні ознаки, як відомо в даній галузі. Ознаки стійкості до комах-шкідників і толерантності до гербіцидів можна відстежувати у потомства схрещування із рослиною сої за даним винаходом (або у їх потомства
Зо і у будь-якого іншого культивара або сорту сої) способами МАВ. Молекули ДНК являють собою маркери для такої ознаки, і можна використовувати способи МАВ, які добре відомі в даній галузі, для відстеження ознаки (ознак) стійкості до гербіцидів у рослини сої, де щонайменше одна лінія сої за даним винаходом або її потомство була батьком або предком. Способи за даним винаходом можна використовувати для ідентифікації будь-якого сорту сої, який містить трансформаційну подію, що розглядається.
Способи за даним винаходом включають спосіб отримання стійкої до комах- шкідників/толерантної до гербіцидів рослини сої, де вказаний спосіб включає схрещування із рослиною за даним винаходом. Більш конкретно, вказані способи можуть включати схрещування двох рослин за даним винаходом або однієї рослини за даним винаходом і будь- якої іншої рослини. Переважні способи додатково включають відбір потомства вказаного схрещування шляхом аналізу вказаного потомства відносно детектованої трансформаційної події за даним винаходом і сприятливої сортової продуктивності (наприклад, врожайність).
Наприклад, даний винахід можна використовувати для відстеження трансформаційної події, що розглядається, за допомогою циклів схрещування із рослинами, які містять інші бажані ознаки, такі, як господарсько-цінні ознаки, толерантність або стійкість до захворювань, толерантність або стійкість до нематод і термін дозрівання. Рослини, які містять трансформаційну подію, що розглядається, і бажану ознаку, можна детектувати, ідентифікувати, відбирати і швидко використовувати, наприклад, на подальших етапах розмноження. Трансформаційну подію/ознаку, яка розглядається, також можна комбінувати із додатковою ознакою(ами) стійкості до комах-шкідників і/або додатковими ознаками толерантності до гербіцидів за допомогою схрещування і відстежувати згідно із даним винаходом. Варіанти здійснення останнього являють собою рослини, які містять трансформаційну подію, що розглядається, комбіновану із геном толерантності до гліфосату, який забезпечує толерантність до гербіциду гліфосату.
Таким чином, даний винахід можна комбінувати, наприклад, із ознаками, які кодують стійкість до гліфосату (наприклад, стійкої рослини або бактеріальних ЕРБР5, СОХ, АТ), стійкість до глуфосинату (наприклад, РАТ, баг), стійкість до гербіцидів, які інгібують ацетолактатсинтазу (АГ 5) (наприклад, імідазолінонів |гаких, як імазетапір|, сульфонілсечовин, триазолопіримідинсульфонаніліду, піримідинілтіобензоатів і інших хімічних сполук (С5г1, ЗМ,гГА і т. д.Ї), стійкість до бромоксинілу (наприклад, Вхп), фермент стійкості до інгібіторів НРРО (4- бо гідроксифенілпіруватдіоксигенази), стійкість до інгібіторів фітоендесатурази (РОБ), стійкість до інгібуючих фотосистему І! гербіцидів (наприклад, р5БА), стійкість до інгібуючих фотосистему гербіцидів, стійкість до інгібуючих протопорфіриногеноксидазу ІХ (РРО) гербіцидів (наприклад,
РРО-1), стійкість до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, СУР76ЄВІ1), ферментів (див., наприклад, ОЗ 20030135879), які руйнують дикамбу, і інших, для яких можна провести стекінг окремо або в багатьох комбінаціях для забезпечення здатності ефективно боротися або запобігати чергуванню бур'янів і/або стійкості до будь-якого гербіциду вказаних вище класів.
Крім того, трансформаційну подію сої ррдАВ9582.814.19.1:ррАВА468.04.16.1 селекційного гібриду можна комбінувати із однією або більше додатковими агрономічними (наприклад, стійкість до комах-шкідників, стійкість до патогенів або толерантність до стресових факторів і т. д.) або споживчими (наприклад, підвищеної врожайності, поліпшеного олійного профілю, поліпшеної якості волокна і т. д.) властивостями. Таким чином, даний винахід можна використовувати для забезпечення повного агрономічного комплексу поліпшеної якості культури нарівні із можливістю універсально і економічно ефективно боротися із будь-якою кількістю сільськогосподарських шкідників.
У даній галузі описані способи інтеграції полінуклеотидної послідовності в конкретну ділянку хромосоми рослинної клітини шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, сайт-специфічна інтеграція, як описано в публікації патентної заявки США Мо 2009/0111188 АТ, включеної в даний опис за допомогою посилання, в якій описане використання рекомбінази або інтегрази для опосередкування введення донорної полінуклеотидної послідовності в хромосому-мішень.
Крім того, в міжнародній патентній заявці Мо МО 2008/021207, включеній в даний опис за допомогою посилання, описана опосередкована цинковим пальцем гомологічна рекомбінація для інтеграції однієї або більше донорних полінуклеотидних послідовностей у конкретні локалізації в геномі. Застосування рекомбіназ, таких, як РІ Р/ЕКТ, як описано в патенті США Мо 6720475, включеному в даний опис за допомогою посилання, або СКЕЛОХ, як описано в патенті США Мо 5658772, включеному в даний опис за допомогою посилання, можна використовувати для інтеграції полінуклеотидної послідовності в конкретну ділянку хромосоми.
Крім того, використання мегануклеаз для направленої доставки донорних полінуклеотидів у конкретну локалізацію хромосоми описано у Риспа еї аІ., РМАБ ОА 93 (1996) рр. 5055-5060.
Інші способи сайт-специфічної інтеграції в рослинні клітини, як правило, відомі і
Зо застосовуються (Китаг еї аї., Тгепаз іп Ріапі зсі., 6(4) (2001) рр. 155-159). Крім того, системи сайт-специфічної рекомбінації, які ідентифікували у декількох прокаріотичних і нижчих еукаріотичних організмів, можна застосовувати для використання у рослин. Приклади таких систем включають, але не обмежуються ними, систему рекомбіназ К/К5 із плазміди рок1 дріжджів гудозасспаготусез гоихії (Агакі еї а!., (1985) 9. Мої. Віої., 182: 191-203) і систему Зіп/діх мю-фага (Маєзег апа Капітапп, (1991) Мої. сеп. Сепеї., 230: 170-176).
У деяких варіантах здійснення даного винаходу бажаною може бути інтеграція або стекінг нового трансгена(ів) у близькості із існуючою трансгенною трансформаційною подією.
Трансгенну трансформаційну подію можна розглядати як переважний геномний локус, який вибирали на основі унікальних характеристик, таких, як одна ділянка вставки, звичайне менделєєвське розщеплення і стабільна експресія, і переважна комбінація ефективності, включаючи толерантність до гербіцидів і сільськогосподарську продуктивність у багатьох кліматичних зонах. Знову інтегровані трансгени повинні підтримувати характеристики експресії трансгена існуючих трансформантів. Крім того, буде усунена проблема розвитку аналізів детекції і підтвердження знову інтегрованої трансформаційної події, так як геномні фланкувальні послідовності і локалізація у хромосомі знову інтегрованої трансформаційної події вже є ідентифікованими. Нарешті, інтеграція нового трансгена в конкретну локалізацію в хромосомі, яка з'єднана з існуючим трансгеном, буде сприяти інтрогресії трансгенів в інші генетичні середовища за допомогою статевого ауткросингу загальноприйнятими способами селекції.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу бажаним може бути видалення полінуклеотидних послідовностей із трансгенної трансформаційної події. Наприклад, видалення трансгена, як описано в попередній патентній заявці США Мо 61/297628, включеній в даний опис за допомогою посилання, в якій описано використання цинкового пальця нуклеази для видалення полінуклеотидної послідовності, яка складається із генної експресійної касети, із хромосомно-інтегрованої трансгенної трансформаційної події. Полінуклеотидна послідовність, яку видаляють, може являти собою селектований маркер. Після ексцизії і видалення полінуклеотидної послідовності модифіковану трансгенну трансформаційну подію можна перенаправляти за допомогою вставки полінуклеотидної послідовності. Вставка полінуклеотидної послідовності і подальше перенаправлення модифікованої трансгенної бо трансформаційної події забезпечує переваги, такі, як повторне використання селектованого маркера або можливість усунення непередбачених змін у транскриптомі рослини, які є результатом експресії конкретних генів.
У даному винаході в даному описі розкрита конкретна ділянка в хромосомі 02 в геномі сої, яка є переважною для вбудовування гетерологічних нуклеїнових кислот. Таким чином, даний винахід стосується способів введення представляючих інтерес гетерологічних нуклеїнових кислот в цю заздалегідь встановлену ділянку-мішень або поблизу такої ділянки-мішені. Даний винахід також включає насіння сої і/або рослину сої, яка містить будь-яку гетерологічну нуклеотидну послідовність, що вбудовується в описувану ділянку-мішень або в безпосередній близькості від такої ділянки. Одним із варіантів проведення такої направленої інтеграції є видалення і/або заміна відмінної вставки замість експресуючої касети РАТ, проілюстрованої в даному описі. У цьому відношенні можна використовувати, наприклад, і без обмеження, направлену гомологічну рекомбінацію згідно із даним винаходом.
Як використовують в даному описі, ген, трансформаційна подія або "стекінг" ознак являє собою комбінацію бажаних ознак в одній трансгенній лінії. Рослинники-селекціонери отримують стекінг трансгенних ознак, проводячи схрещування між батьками, кожний із яких має бажану ознаку, а потім, ідентифікуючи потомство, яке має ці бажані ознаки. Інший спосіб стекінгу генів проводять перенесенням двох або більше генів у ядро клітини рослини одночасно під час трансформації. Інший спосіб стекінгу генів проводять, повторно трансформуючи трансгенну рослину іншим представляючим інтерес геном. Наприклад, стекінг генів можна використовувати для комбінації двох або більше різних ознак, включаючи, наприклад, дві або більше різних ознак комахи, ознаки стійкості до комах-шкідників і ознаки стійкості до захворювання, дві або більше ознак стійкості до гербіцидів і/або ознаку (ознаки) стійкості до комах-шкідників і ознаку (ознаки) стійкості до гербіцидів. Використання селектованого маркера в доповнення до представляючого інтерес гена також можна розглядати як стекінг генів. "Гомологічна рекомбінація" стосується взаємодії між будь-якою парою нуклеотидних послідовностей, які містять відповідні ділянки, що містять аналогічну нуклеотидну послідовність, у якій можуть взаємодіяти (рекомбінувати) дві нуклеотидні послідовності із утворенням нової рекомбінантної послідовності ДНК. Кожні ділянки аналогічної нуклеотидної послідовності позначені в даному описі як "гомологічна послідовність". Як правило, частота гомологічної
Зо рекомбінації підвищується внаслідок того, що довжина гомологічної послідовності збільшується.
Таким чином, хоч гомологічна рекомбінація може виникати між двома нуклеотидними послідовностями, які є в меншій мірі ідентичними, частота рекомбінації (або ефективність) знижується, так як збільшується дивергенція між двома послідовностями. Рекомбінацію можна проводити із використанням однієї гомологічної послідовності на кожній із донорних молекул і молекул-мішеней, таким чином отримуючи продукт рекомбінації "одиничного кросинговеру".
Альтернативно, дві гомологічні послідовності можуть розташовуватися на кожній із нуклеотидних послідовностей-мішеней і донорних нуклеотидних послідовностей. Рекомбінація між двома гомологічними послідовностями в донорові із двома гомологічними послідовностями в мішені утворить продукт рекомбінації "подвійного кросинговеру". Якщо гомологічні послідовності на донорній молекулі фланкують послідовність, над якою необхідно провести маніпуляцію (наприклад, представляюча інтерес послідовність), рекомбінація подвійного кросинговеру із молекулою-мішенню приводить до продукту рекомбінації, де представляюча інтерес послідовність замінює послідовністю ДНК, яка спочатку знаходилася між гомологічними послідовностями в молекулі-мішені. Обмін послідовностями ДНК між мішенню і донором за допомогою трансформаційної події рекомбінації подвійного кросинговеру називається "заміною послідовності".
Переважна рослина або насіння за даним винаходом містять в своєму геномі функціонуючі нуклеотидні послідовності аад-12, стуїЕ м3, стутАс зупрго і РАТ мб, як визначено в даному описі, спільно щонайменше із 20-500 або більше суміжними фланкувальними нуклеотидами на обох сторонах вставки, як визначено в даному описі. Якщо не вказано інше, посилання на фланкувальні послідовності стосуються таких, як ідентифікованих відносно 5ЕО ІЮ МО:1, 2 і 15.
Можна чекати, що всі або частина цих фланкувальних послідовностей передається потомству, яке отримує вбудовувану ДНК у результаті статевого схрещування батьківської лінії, яка містить трансформаційну подію.
Даний винахід включає тканинні культури регенерувальних клітин рослини за даним винаходом. Також включені рослини, регенеровані із таких тканинних культур, зокрема, коли вказана рослина здатна виявляти всі морфологічні і фізіологічні властивості ілюстративного сорту. Переважні рослини за даним винаходом мають всі фізіологічні і морфологічні характеристики рослини, вирощеної із депонованого насіння. Даний винахід додатково включає 60 потомство такого насіння і насіння, яке має представляючі інтерес якісні ознаки.
Як використовують в даному описі, "лінія" являє собою групу рослин, для яких демонструють незначну генетичну варіацію або не демонструють її між індивідуумами щонайменше для однієї ознаки. Такі лінії можна отримувати шляхом декількох генерацій самозапилення і відбору або вегетативного розмноження одного батька способами культивування тканин або клітин.
Як використовують в даному описі, терміни "культивар" і "сорт" є синонімічними і стосуються лінії, яку використовують для комерційної продукції. "Стабільність" або "стабільний" означає, що відносно даного компонента компонент зберігається від генерації до генерації і переважно щонайменше три генерації. "Комерційну придатність" визначають як наявність хорошої потужності рослини і високої плодючості, такої що, культуру можуть вирощувати фермери із використанням загальноприйнятого сільськогосподарського обладнання, і із насіння можна екстрагувати олію із бажаними компонентами з використанням загальноприйнятого обладнання для подрібнення і екстракції. "Агрономічно елітний" означає, що лінія має бажані агрономічні характеристики, такі, як врожайність, зрілість, стійкість до захворювань і т. п., в доповнення до стійкості до інсектицидів і толерантності до гербіцидів, внаслідок трансформаційної події(й), що розглядається. Будь-які і всі ці агрономічні характеристики і вимірювані параметри можна використовувати для ідентифікації таких рослин як точки або кінця або обох кінців діапазону характеристик, використовуваних для визначення таких рослин.
Як фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло в контексті даного опису, переважні варіанти здійснення наборів для детекції, наприклад, можуть містити зонди і/або праймери, направлені іабо такі, які містять, "з'єднувальні послідовності" або "перехідні послідовності" (де геномна фланкувальна послідовність сої знаходиться поруч із послідовністю вставки). Наприклад, вони включають полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, сконструйовані для ідентифікації однієї або обох з'єднувальних послідовностей (де вставка знаходиться поруч із фланкувальною послідовністю), як указано в таблиці вище. Одна із загальноприйнятих конструкцій вміщується в наявність одного праймера, який гібридизується у фланкувальній області, і одного праймера, який гібридизується у вставці. Довжина кожного такого праймера часто складає приблизно
Зо щонайменше «15 залишків. При такій конфігурації праймери можна використовувати для отримання/ампліфікації детектованого амплікону, який вказує на наявність трансформаційної події за даним винаходом. Такі праймери можна використовувати для отримання амплікону, який охоплює (і включає) з'єднувальну послідовність, як вказано вище.
Праймерци), "які сідають" у фланкувальній послідовності, як правило, не конструюють для гібридизації далі приблизно 1200 основ або далі області сполуки. Таким чином, ілюстративні фланкувальні праймери конструюють так, щоб вони містили щонайменше 15 залишків ланцюга в межах 1200 основ у фланкувальних послідовностях від початку вставки. Таким чином, праймери, які містять послідовність придатного розміру від (або які гібридизуються 3) від 800 до 1400 пар основ 5ЕО ІЮО МО:1 і/або від 153 до 753 пар основ 5ЕО ІЮО МО:2, і/або від 2130 до 2730 пар основ 5ЕО ІЮ МО:15, і/або від 9122 до 9722 пар основ 5ЕО ІЮ МО:15 входять в обсяг даного винаходу. Аналогічно можна конструювати праймери для вставки для будь-якої ділянки вставки
ЗЕО ІЮ МО:З3 або будь-якої ділянки між парами основ 2731 і 9121 5ЕО ІО МО:15, і можна використовувати, наприклад, невиключно для конструювання таких праймерів.
Фахівцеві в даній галузі також відомо, що праймери і зонди можна конструювати для гібридизації в діапазоні стандартних умов гібридизації і/або ПЛР, де праймер або зонд не є абсолютно комплементарним ілюстративній послідовності. Таким чином, може бути допустимий деякий ступінь невідповідності. Для праймера приблизно 20 нуклеотидів, наприклад, як правило, один або два або т. д. нуклеотидів не повинні зв'язуватися із протилежним ланцюгом, якщо непридатна основа розташовується всередині або на кінцях праймера, який є протилежним відносно амплікону. Різні придатні умови гібридизації наведені нижче. Синтетичні аналоги нуклеотидів, такі, як інозин, також можна використовувати в зондах. Також можна використовувати зонди на основі пептидних нуклеїнових кислот (ПНК), а також ДНК- і РНК- зонди. Важливим є те, що такі зонди і праймери є діагностичними (здатні унікально ідентифікувати і визначати) для наявності трансформаційної події за даним винаходом.
Потрібно зазначити, що можуть виникати помилки ампліфікації ПЛР, які можуть призводити, наприклад, до незначних помилок секвенування. Таким чином, якщо не вказано інше, перераховані в даному описі послідовності визначали, отримуючи довгі амплікони із геномних
ДНК сої, а потім клонуючи і секвенуючи амплікони. Виявлення невеликих відмінностей і незначних невідповідностей послідовностей, які отримуються і визначаються, таким чином, бо проводячи багато етапів ампліфікації, яка є необхідною для достатнього утворення амплікону для секвенування із геномних ДНК, не є незвичайним. Фахівцеві в даній галузі потрібно розуміти і враховувати, що будь-які коректування, необхідні, внаслідок цих типів загальних помилок секвенування або невідповідностей, входять в обсяг даного винаходу.
Також потрібно зазначити, що не є незвичайним видалення деякої геномної послідовності, наприклад, коли вбудовують послідовність при створенні трансформаційної події. Таким чином, також можуть виникати деякі відмінності між фланкувальними послідовностями, які розглядаються, і геномними послідовностями, перерахованими, наприклад, в ЗЕМВАМК.
Компоненти "вставки" послідовності ДНК проілюстровані на фігурах і більш детально описані нижче в прикладах. У способах за даним винаходом можна використовувати полінуклеотидні послідовності ДНК цих компонентів або їх фрагменти як ДНК-праймерів або
ДНЕК-зондів.
Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються композицій і способів детекції наявності трансгенної/геномної ділянки вставки в рослинах і насінні і т. п. від рослини сої. Надані послідовності ДНК, які містять з'єднувальну послідовність 5'-трансгенної/геномної ділянки вставки, яка розглядається, надану в даному описі (між від 800 до 1400 пар основ 5ЕО ІЮ МО-1 їі
ЗЕО ІО МО:3), її сегменти і комплементи ілюстративних послідовностей, і будь-які їх сегменти.
Надані послідовності ДНК, які містять з'єднувальну послідовність 3'-трансгенної/геномної ділянки вставки, яка розглядається, надану в даному описі (між від 153 до 753 пар основ 5ЕО ІЮ
МО:2 і 5ЕО ІЮ МО:3), її сегменти і комплементи ілюстративних послідовностей і будь-які їх сегменти. Надані послідовності ДНК, які містять з'єднувальну послідовність /3'- трансгенної/геномної ділянки вставки, яка розглядається, надану в даному описі (між від 1 до 2730 пар основ 5ЕО ІЮ МО:15 їі 2731 до 9121 5ЕБЕО ІЮО МО':15), її сегменти і комплементи ілюстративних послідовностей і будь-які їх сегменти. Надані послідовності ДНК, які містять з'єднувальну послідовність, за умови з'єднувальну послідовність 3'-трансгенної/геномної ділянки вставки, яка розглядається, надану в даному описі (між від 9122 до 10198 пар основ
ЗБЕО ІО МО:15 ї від 2731 до 9121 5ЕО ІО МО:15), її сегменти і комплементи ілюстративних послідовностей і будь-які їх сегменти. З'єднувальна послідовність ділянки вставки охоплює сполуку між гетерологічною ДНК, яка вбудовується в геном, і ДНК із клітини сої, яка фланкує ділянку вставки. Такі послідовності можна діагностувати для даної трансформаційної події.
Зо Залежно від цих вбудовуваних і граничних послідовностей можна отримувати специфічні відносно трансформаційної події праймери. Аналіз ПЛР продемонстрував, що лінії сої за даним винаходом можна ідентифікувати в різних генотипах сої аналізом ампліконів ПЛР, які отримуються із використанням наборів таких специфічних відносно трансформаційної події праймерів. Ці і інші зв'язані способи можна використовувати для унікальної ідентифікації таких ліній сої. Таким чином, амплікони ПЛР, які отримуються із такими парами праймерів, є унікальними, і їх можна використовувати для ідентифікації таких ліній сої.
У деяких варіантах здійснення послідовності ДНК, які містять суміжний фрагмент нової трансгенної/ееномної ділянки, являють собою один із аспектів даного винаходу. Включені послідовності ДНК, які мають достатню довжину полінуклеотидів трансгенної послідовності вставки і достатню довжину полінуклеотидів геномної послідовності сої від одного або більше із трьох вказаних вище рослин сої, і/або послідовності, які є придатними як послідовності праймера для отримання продукту-амплікону, діагностичного для однієї або більше таких рослин сої.
Споріднені варіанти здійснення стосуються послідовності ДНК, яка містить щонайменше 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжним нуклеотидів трансгенної ділянки послідовності ДНК, яка визначається в даному описі (такої, як ЗЕО ІЮ МО-1, і її сегменти) або їх комплементів, і має аналогічну довжину фланкувальної послідовності ДНК сої із таких послідовностей або їх комплементів. Такі послідовності є придатними як ДНК- праймери в способах ампліфікації ДНК. Амплікони, які отримуються із використанням таких праймерів є діагностичними для будь-якої із трансформаційних подій сої, вказаних в даному описі. Таким чином, винахід також включає амплікони, які утворюються такими ДНК-праймерами і гомологічними праймерами.
Цей винахід також включає способи детекції наявності ДНК в зразку, яка відповідає трансформаційній події сої, вказаній в даному описі. Такі способи можуть включати: а) контактування зразка, який містить ДНК, із набором праймерів, який при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти із ДНК щонайменше від однієї із цих трансформаційних подій сої утворить амплікон, який є діагностичним для вказаної трансформаційної події(й); б) проведення реакції ампліфікації нуклеїнових кислот, таким чином отримуючи амплікон і с) детекцію амплікону.
Додаткові способи детекції за даним винаходом включають спосіб детекції наявності ДНК в зразку, яка відповідає вказаній трансформаційній події, де вказаний спосіб включає: а) контактування зразка, який містить ДНК, із зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації із ДНК щонайменше із однієї із вказаних трансформаційних подій сої і який не гібридизується в жорстких умовах гібридизації із контрольною рослиною сої (не трансформаційна подія, яка представляє інтерес ДНК), Б) піддавання зразка і зонда жорстким умовам гібридизації і с) детекція гібридизації зонда із ДНК.
У додаткових варіантах здійснення даний винахід включає способи отримання рослини сої, яка містить трансформаційну подію сої ррАВУ582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 за даним винаходом, де вказаний спосіб включає етапи: а) статевого схрещування першої батьківської лінії сої (яка містить експресуючу касету за даним винаходом, що забезпечує толерантність рослин вказаної лінії до глуфосинату) і другої батьківської лінії сої (у якої відсутня така ознака толерантності до гербіциду), таким чином отримуючи ряд рослин потомства, і Б) відбір рослини потомства із використанням молекулярних маркерів. Такі способи можуть необов'язково включати додатковий етап зворотного схрещування рослини потомства із другою батьківською лінією сої із отриманням чистосортної рослини сої, яка містить ознаку стійкості до комах- шкідників 2,4-О і толерантності до глуфосинату.
У іншому аспекті винахід стосується способів визначення зиготності потомства від схрещування із вказаною трансформаційною подією. Вказані способи можуть включати контактування зразка, який містить ДНК сої, із набором праймерів за даним винаходом. Вказані праймери при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК щонайменше із однієї із вказаних трансформаційних подій сої утворять перший амплікон, який є діагностичним щонайменше для однієї із вказаних трансформаційних подій сої. Такі способи додатково включають проведення реакції ампліфікації нуклетнових кислот, таким чином отримуючи перший амплікон; детекцію першого амплікону їі контактування зразка, який містить
ДНК сої, із другим набором праймерів (вказаний другий набір праймерів при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК із рослини сої утворить другий амплікон, який містить нативну геномну ДНК сої, гомологічну геномній ділянці сої) і проведення реакції ампліфікації нуклеїнових кислот, таким чином отримуючи другий амплікон. Способи
Зо додатково включають детекцію другого амплікону і порівняння першого і другого ампліконів у зразку, де наявність обох ампліконів свідчить про те, що зразок є гетерозиготним за трансгенною вставкою.
Набори для детекції ДНК можна розробляти із використанням композицій, які описуються в даному винаході, і способи є відомими в галузі детекції ДНК. Набори є придатними для ідентифікації ДНК трансформаційної події сої, яка розглядається, у зразку, і їх можна застосовувати в способах селекції рослини сої, яка містить таку ДНК. Набори містять послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ампліконам, наприклад, таким, які описуються в даному описі, або послідовностям ДНК, гомологічним або комплементарним ДНК, яка міститься в трансгенних генетичних елементах трансформаційних подій, які розглядаються.
Ці послідовності ДНК можна використовувати в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК. Набори також можуть містити реагенти і речовини, необхідні для проведення способу детекції. "Зонд" являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднують загальноприйняту детектовану мітку або репортерну молекулу (таку, як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний засіб або фермент). Такий зонд є комплементарним ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені, у випадку за даним винаходом -- ланцюгу геномної ДНК з однієї із вказаних трансформаційних подій сої, неважливо із рослини сої або із зразка, який містить ДНК із трансформаційної події Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, а також поліаміди й інші речовини для зонда, які специфічно зв'язуються із послідовністю ДНК-мішені, і їх можна використовувати для детекції наявності послідовності ДНК-мішені. "Праймери" являють собою виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які випалюються на комплементарному ланцюгу ДНК-мішені при гібридизації нуклеїнової кислоти із утворенням гібриду між праймером і ланцюгом ДНК-мішені, потім подовжуються вздовж ланцюга ДНК- мішені полімеразою, наприклад, ДНК-полімеразою. Пари праймерів за даним винаходом стосуються їх застосування для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або іншими загальноприйнятими способами ампліфікації нуклеїнової кислоти.
Довжина зондів і праймерів, як правило, становить 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 60 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, З18, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, А16, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, ААб, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, А74, АТ5, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 467, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, або 1000, або 2000, або 5000 полінуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються із послідовністю-мішенню у високо жорстких умовах гібридизації.
Переважно зонди і праймери за даним винаходом мають повну схожість послідовності із послідовністю-мішенню, хоч можна конструювати зонди, відмінні від послідовності-мішені, і такі, які зберігають здатність гібридизуватися із послідовностями-мішенями загальноприйнятими способами.
Способи отримання і застосування зондів і праймерів описані, наприклад, в МоїіІесшаг
СіІопіпд: А І арогаїогу Мапчиаї, 2па ей., мої. 1-3, ед. Затьгоок еї аї!., Соїд Зргіпа Натог І абогаюгу
Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, М.У., 1989. Пари праймерів для ПЛР можна отримувати на основі відомої послідовності, наприклад, із використанням комп'ютерних програм, призначених для таких цілей.
Праймери і зонди на основі фланкувальних послідовностей ДНК і послідовностей. ДНК вставки, які описуються в даному описі, можна використовувати для підтвердження (і при необхідності для корекції) описуваних послідовностей загальноприйнятими способами, наприклад, за допомогою повторного клонування і секвенування таких послідовностей.
Зонди і праймери на основі нуклеїнових кислот за даним винаходом гібридизуються в жорстких умовах із послідовністю ДНК-мішені. Будь-який загальноприйнятий спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот можна використовувати для ідентифікації наявності ДНК із трансгенної трансформаційної події в зразку. Молекули нуклеїнової кислоти або їх фрагменти здатні специфічно гібридизуватися із іншими молекулами нуклеїнової кислоти за певних обставин. Як використовують в даному описі, вважається, що дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо дві молекули здатні утворювати антипаралельну дволанцюгову структуру нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти являє собою "комплемент" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вони мають повну комплементарність. Як використовують в даному описі, вважається, що молекули мають "повну комплементарність", коли кожний нуклеотид однієї із молекул є комплементарним нуклеотиду іншої молекули. Вважається, що дві молекули є "мінімально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною із достатньою стабільністю, яка дозволяє їм зберігати здатність відпалюватися одна з одною щонайменше в загальноприйнятих умовах "пониженої жорсткості". Аналогічно, вважається, що молекули є "комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною із достатньою стабільністю, яка дозволяє їм зберігати здатність відпалюватися одна з одною в загальноприйнятих умовах "пониженої жорсткості". Загальноприйняті умови жорсткості описані ЗатюогоокК еї а!., 1989. Таким чином, відхилення від повної комплементарності є допустимими за умови, що такі відхилення не перешкоджають повністю здатності молекули утворювати дволанцюгову структуру. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти слугувала як праймер або зонд, їй тільки необхідно бути достатньо комплементарною по послідовності, щоб бути здатною утворювати стабільну 60 дволанцюгову структуру при конкретних застосовуваних концентраціях розчинника і солей.
Як використовують в даному описі, по суті, гомологічна послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується із комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, до якої вона належить, при порівнянні в умовах із високою жорсткістю. Межу "жорстких умов" функціонально визначають відносно гібридизації зонда на основі нуклеїнової кислоти із нуклетовою кислотою-мішенню (тобто із конкретною представляючою інтерес послідовністю нуклеїнової кислоти) способом специфічної гібридизації, описаним у затьгоок еї а!., 1989, в 9.52-9.55. Див. також Затьгоок еї а!., 1989 в 9.47-9.52 і 9.56- 9.58. Таким чином, нуклеотидні послідовності за винаходом можна використовувати на основі їх здатності вибірково утворювати дуплексні молекули із комплементарними ділянками фрагментів ДНК.
Залежно від передбачуваного застосування можна використовувати різні умови гібридизації для отримання різних мір селективності зонда відносно послідовності-мішені. Для застосувань, де необхідна висока селективність, як правило, застосовують відносно жорсткі умови для утворення гібридів, наприклад, вибирають умови відносно низького вмісту солі і/або високої температури, такі, як, отримувані приблизно від 0,02М приблизно до 0,15М Масі при температурах приблизно від 50 "С приблизно до 70 "С. Жорсткі умови, наприклад, можуть включати промивання гібридизаційного фільтра щонайменше двічі буфером для промивання у високо жорстких умовах (0,2Х 55С, 0,1 95 505, 65 "С). Фахівцям в даній галузі відомі придатні умови жорсткості, які сприяють гібридизації ДНК, наприклад, 6,0Х хлорид натрію/цитрат натрію (5502) приблизно при 45"С із подальшим промиванням 2,0Х 55С при 50 "С. Наприклад, концентрацію солей на етапі промивання можна вибирати від низької жорсткості приблизно 2,0Х 5ЗС при 50 "С до високої жорсткості приблизно 0,2Х 55Хс при 50 "С. Крім того, температуру на етапі промивання можна підвищувати від умов низької жорсткості при кімнатній температурі приблизно 22 "С до умов із високою жорсткістю приблизно при 65 "С. Температуру і вміст солі можна змінювати, або можна підтримувати постійною температуру або концентрацію солей при зміні іншої змінної. Такі вибіркові умови мало допустимі, якщо існує будь-яка невідповідність між пробою і матрицею або ланцюгом-мішенню. Детекція послідовностей ДНК за допомогою гібридизації добре відома фахівцям в даній галузі, і вказівки в патентах США МоМо 4965188 і 5176995 являють собою ілюстративні способи гібридизаційних аналізів.
Зо У особливо переважаючому варіанті здійснення нуклеїнова кислота за даним винаходом специфічно гібридизується із одним або більше праймерів (або ампліконів або інших послідовностей), які ілюструються або розглядаються в даному описі, включаючи їх комплементи і фрагменти, в умовах із високою жорсткістю. У одному із аспектів даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом містить послідовність нуклеїнової кислоти, як указано в даному описі в одній із ілюстративних послідовностей або їх комплементів і/або фрагментів.
У іншому аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом має від 8095 до 10095 або 9095 і 100 95 ідентичності послідовності з такими послідовностями нуклеїнових кислот. У додатковому аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом має від 9595 до 10095 ідентичності послідовності із такою послідовністю. Такі послідовності можна використовувати як маркери в способах селекції рослин для ідентифікації потомства генетичних схрещувань. Гібридизацію проби із молекулою ДНК-мішенню можна детектувати будь-яким із ряду способів, відомих фахівцям в даній галузі, вони можуть включати, але не обмежуватися ними, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіла і хемілюмінесцентні мітки.
Відносно ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені (наприклад, ПЛР) із використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації "жорсткі умови" являють собою умови, які забезпечують можливість гібридизуватися парі праймерів тільки із послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, із якою зв'язується праймер, який містить відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), і переважно із отриманням унікального продукту ампліфікації, амплікону.
Термін "специфічний відносно (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизується в найбільш жорстких умовах гібридизації тільки із послідовністю-мішенню в зразку, який містить послідовність-мішень.
Як використовують в даному описі, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" стосується продукту ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, яка являє собою частину нуклеїнової кислоти-матриці. Наприклад, для визначення, чи містить рослина сої, отримувана внаслідок статевого схрещування, геномну ДНК із трансгенною трансформаційною подією із рослини сої за даним винаходом, ДНК, яку виділяють зі зразка тканини рослини сої, можна піддавати бо способу ампліфікації нуклеїнової кислоти із використанням пари праймерів, яка містить праймер, який отримується із фланкувальної послідовності в геномі рослини, яка прилягає до ділянки вставки вбудовуваної гетерологічної ДНК, і другий праймер, який отримується із вбудовуваної гетерологічної ДНК, із отриманням амплікону, який є діагностичним для наявності
ДНК із трансформаційною подією. Амплікон має довжину і містить послідовність, яка також є діагностичною для трансформаційної події. Довжина амплікону може знаходитися у діапазоні від об'єднаної довжини пари праймерів плюс одна пара основ нуклеотидів і/або об'єднаної довжини пари праймерів плюс приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 216, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, А14, 415, 416, 417, А18, 419, 420, 421, 422, А23, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, А75, А76, 477, 478, 479,
Зо 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 4687, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар основ нуклеотидів (плюс або мінус будь-який із інкрементів, перерахованих вище). Альтернативно, пару праймерів можна отримувати із фланкувальної послідовності на обох сторонах вбудовуваної ДНК таким чином, щоб утворювався амплікон, який містить повну нуклеотидну послідовність вставки. Член пари праймерів, які отримуються із геномної послідовності рослини, можна розташовувати на відстані від вбудовуваної послідовності ДНК. Ця відстань може знаходитися у діапазоні від однієї пари основ нуклеотидів приблизно до двадцяти тисяч пар основ нуклеотидів.
Використання терміну "амплікон" конкретно виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в термічній реакції ампліфікації ДНК.
Ампліфікацію нуклеїнової кислоти можна проводити будь-яким із ряду відомих в даній галузі способів ампліфікації нуклеїнової кислоти, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР).
Ряд способів ампліфікації відомий в даній галузі і описаний серед іншого в патенті США Мо 4683195 і патенті США Мо 4683202. ПЛР способи ампліфікації були розроблені для ампліфікації до 22 т. п. н. геномної ДНК. Ці способи, а також інші відомі в даній галузі способи ампліфікації
ДНК, можна використовувати в практичному здійсненні даного винаходу. Послідовність вставки гетерологічної трансгенної ДНК або фланкувальну геномну послідовність із трансформаційної події сої, яка розглядається, можна підтверджувати (і коректувати за необхідності) за допомогою ампліфікації таких послідовностей із трансформаційної події із використанням праймерів, отримуваних із послідовностей, наданих в даному описі, із подальшим стандартним секвенуванням ДНК ПЛР-амплікону або клонованої ДНК.
Амплікон, отримуваний такими способами, можна детектувати багатьма способами.
Електрофорез в агарозному гелі і забарвлювання бромистим етидієм являє собою добре відомий спосіб детекції ампліконів ДНК. Інший такий спосіб являє собою аналіз генетичних бітів (Сепеїйс Вії Апаїузії), де конструюють олігонуклеотид ДНК, який перекриває прилеглу фланкувальну послідовність геномної ДНК і послідовність вбудовуваної ДНК. Олігонуклеотид імобілізують у лунках планшета із мікролунками. Після ПЛР представляючої інтерес ділянки (із використанням одного праймера у вбудовуваній послідовності і одного в прилеглій фланкувальній геномній послідовності) одноланцюговий продукт ПЛР можна піддавати гібридизації із імобілізованим олігонуклеотидом, і він слугує як матриця для реакції подовження бо ланцюга на одну основу із використанням ДНК-полімерази і мічених ЗамМТР, специфічних для подовжуваної наступної основи. Зчитування показань може бути засноване на флуоресценції або ЕГІЗА. Сигнал означає наявність послідовності вставки/фланкувальної послідовності в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження ланцюга на одну основу.
Інший спосіб являє собою спосіб піросеквенування, як описано М/іпде (Іппом. Рпапта. Тесн., 00:18-24, 2000). У цьому способі конструюють олігонуклеотид, який перекриває область сполуки прилеглої геномної і вбудовуваної ДНК. Олігонуклеотид гібридизують із одноланцюговим продуктом ПЛР від ділянки вставки (один праймер у вбудовуваній послідовності і один у фланкувальній геномній послідовності) і інкубують у присутності ДНК-полімерази, АТФ, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'-фосфосульфату і люциферину. Окремо додають аМТР, і вбудовування приводить до світлового сигналу, який вимірюють. Світловий сигнал свідчить про наявність трансгенної вставки/фланкувальної послідовності в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження ланцюга на одну або багато основ.
Флуоресцентна поляризація являє собою інший спосіб, який можна використовувати для детекції амплікону за даним винаходом. Відповідно до цього способу конструюють олігонуклеотид, який перекриває область сполуки геномної фланкувальної і вбудовуваної ДНК.
Олігонуклеотид гібридизують із одноланцюговим продуктом ПЛР із представляючої інтерес ділянки (один праймер у вбудовуваній ДНК і один у фланкувальній геномній послідовності ДНК) і інкубують у присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно міченого ЗамМмТР. Подовження ланцюга на одну основу приводить до вбудовування дамТР. Вбудовування можна вимірювати як зміну поляризації із використанням флуорометра. Зміна поляризації свідчить про наявність трансгенної вставки/фланкувальної послідовності в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження ланцюга на одну основу.
ТАОМАМЕ (РЕ Арріїеїй Віозувзіет5, Еов5ієг Сйу, Саїйї) являє собою спосіб детекції і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, який перекриває область сполуки геномної фланкувальної ДНК і області вставки. Зонд ЕКЕТ і праймери для ПЛР (один праймер в послідовності ДНК вставки і один у фланкувальній геномній послідовності) піддають циклам гібридизації у присутності термостабільної полімерази і аМТР. Під час специфічної ампліфікації ДНК-полімераза Тад відщеплюється, і в зонді ЕКЕТ флуоресцентна група відділяється від гасильної групи.
Зо Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкувальної/трансгенної послідовності вставки в результаті успішної ампліфікації і гібридизації.
Описані молекулярні маяки для застосування при детекції послідовності. У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, який перекриває область сполуки фланкувальної геномної і вбудовуваної ДНК. Унікальна структура зонда ЕКЕТ приводить до того, що він містить повторну структуру, яка втримує флуоресцентну і гасильну групи в безпосередній близькості. Зонд ЕКЕТ і праймери для ПЛР (один праймер у вбудовуваній послідовності ДНК і один у фланкувальній геномній послідовності) піддають циклам гібридизації у присутності термостабільної полімерази і аМТР. Після успішної ПЛР ампліфікації гібридизація зонда ЕКЕТ із послідовністю-мішенню приводить до видалення повторної структури зонда і до просторового розділення флуоресцентної і гасильної групи. В результаті цього виникає флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкувальної геномної/грансгенної послідовності вставки в результаті успішної ампліфікації і гібридизації.
Нарівні із описом локалізації в геномі сої, яка є переважною для вбудовування, даний винахід також стосується насіння сої і/або рослини сої, яка містить щонайменше одну вставку, яка не є трансформаційною подією сої ррдАВ9582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1, в безпосередній близькості до такої локалізації в геномі. Один із варіантів полягає в заміні відмінної вставки замість вставок із трансформаційної події сої ррАаАвВе582.814.19.1:ррдв4468.04.16.1, проілюстрованої в даному описі. Відносно цього згідно із даним винаходом можна використовувати, наприклад, направлену гомологічну рекомбінацію. Цей тип технології являє
БО собою об'єкт, наприклад, МО 03/080809 А2 і відповідної опублікованої заявки США (05 20030232410). Таким чином, даний винахід включає рослини і рослинні клітини, які містять гетерологічну вставку (замість або спільно із багатокопійними генами ааа-12, сгтуіР, стуїАс або
РАТ), фланковану повними або розпізнаваною частиною фланкувальних послідовностей, які визначаються в даному описі (1-1400 п. н. БЕО ІЮ МО:1 і 153-1550 п. н. ЕО ІЮ МО:2 і 1-2730 п. н. ЗЕО ІЮ МО:15 їі 9122-10198 п. н. БЕО ІЮО МО:15). Додаткова копія (або додаткові копії) аад-12, сту! Е, сту! Ас або РАТ також можна направляти для вбудовування таким/такими способом(ами).
Всі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, на які посилаються або які цитують в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій мірі, в якій вони не суперечать явно вказаним відомостям даного опису.
Приклади, які йдуть нижче, включені для ілюстрації способів практичного здійснення винаходу і для демонстрації певних переважних варіантів здійснення винаходу. Ці приклади не треба інтерпретувати як такі, що обмежують. Фахівцям в даній галузі потрібно розуміти, що способи, які описуються в прикладах, наведених нижче, являють собою конкретні підходи, які використовуються для ілюстрації переважних способів їх практичного здійснення. Однак у контексті даного опису фахівцям в даній галузі потрібно розуміти, що в цих конкретних варіантах здійснення можна провести багато змін, при цьому все ще отримуючи подібні або аналогічні результати, не виходячи за межі суті і обсягу винаходу. Якщо не вказано інше, всі проценти є масовими, і всі пропорції суміші розчинників є об'ємними, якщо не вказано інше.
Використовують скорочені позначення, які йдуть нижче, якщо не вказано інше. п. Н. пара основ "с градусів Цельсія днк дезоксирибонуклеїнова кислота
ЕДТА етилендіамінтетраоцтова кислота т.п. нн. тисяча пар нуклеотидів
МКГ Мікрограм мкл Мікролітр мл Мілілітр
М молярна маса
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція
РТ одиниця транскрипції рослини зО5 додецилсульфат натрію зо розчин буфера, який містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0
ТВЕ розчин буфера, який містить суміш основи Тгі5, борної кислоти і ЕДТА, рН 8,3
Варіанти здійснення даного винаходу додатково описані в прикладах, які йдуть нижче.
Потрібно розуміти, що ці приклади наведені тільки як ілюстрація. Із вказаного вище обговорення і цих прикладів фахівець в даній галузі може встановити основні ознаки даного винаходу і, не виходячи за межі його суті і обсягу, може провести різні зміни і модифікації варіантів здійснення винаходу для його адаптації до різного використання і умов. Таким чином, різні модифікації варіантів здійснення винаходу в доповнення до проілюстрованих і описуваних в даному описі стануть зрозумілі фахівцям в даній галузі із вказаного вище опису. Мається на увазі, що такі модифікації також входять в обсяг прикладеної формули винаходу.
Опис кожного посилання, вказаного в даному описі, повністю включений в даний опис за допомогою посилання.
Приклади
Приклад 1: Трансформація і відбір трансформаційної події сої ррАВУ582.814.19.1 СТУТЕ і
Су Ас
Трансгенну сою (Сіусіпе тах), яка містить трансформаційну подію сої ррАВО582.814.19.1, отримували за допомогою опосередкованої Адгорасієегішт трансформації експлантатів сім'ядольного вузла сої. Для ініціації трансформації використовували знешкоджений штам
Адгобрасієгішт ЕНАТОТ1 (Нооос еї аї., 1993), який несе бінарний вектор ррАВе582 (фіг. 1), який містить селектований маркер, РАТ мб і представляючі інтерес гени сгуїЕ м3 і сту1Ас зупрго, в області Т-ланцюга ДНК. Послідовність ДНК для ррАВеУО582 наведена в 5ЕО ІЮ МО:3, яка
Зо анотована нижче в таблиці 1.
Таблиця 1
Елементи генів, локалізовані в рОАВО582 конструкції
Опосередковану Адгорасіегічт трансформацію проводили модифікованим способом 7епа еї а. (2004). У короткому викладі, насіння сої (см Мамегіск)у пророщували на базальному середовищі і виділяли сім'ядольні вузли, і інфікували Адгобрасіегішт. У середовище для закладення пагона, росту пагона в довжину і вкорінення додавали цефотаксим, тиментин і ванкоміцин для видалення Адгобасіегішт. Для інгібування росту нетрансформованих пагонів застосовували відбір із використанням глуфосинату. Відібрані пагони переносили в середовище для вкорінення для розвитку коріння, а потім переносили в грунтову суміш для акліматизації розсади.
Верхівкові листочки відібраних рослин являли собою лист із нанесеним глуфосинатом для скринінгу передбачуваних трансформантів. Розсади, які пройшли скринінг, переносили в теплицю, залишали для акліматизації, а потім наносили на листя із глуфосинатом для повторного підтвердження толерантності і вважали їх передбачуваними трансформантуми. У рослин, які пройшли скринінг, відбирали зразок і проводили молекулярні аналізи для підтвердження гена селективного маркера і/або представляючого інтерес гена. Рослинам забезпечували можливість самозапилення у теплиці для збільшення насіння ТТ.
Цю трансформаційну подію, трансформаційну подію сої РОАВУ582.814.19.1, отримували із незалежно трансформованого ізоляту. Рослини Ті піддавали зворотному схрещуванню і проводили інтрогресію в елітні сорти протягом подальших поколінь. Трансформаційну подію вибирали на основі її унікальних характеристик, таких, як одна ділянка вставки, нормальне менделєєвське розщеплення, стабільна експресія і чудова комбінація ефективності, включаючи толерантність до гербіциду і агрономічну продуктивність. Приклади, які йдуть нижче, містять дані, які використовували для характеристики трансформаційної події сої рОАВО582.814.19.1.
Приклад 2: Характеристика експресії білка в трансформанті сої рОАВО582.814.19.1
Характеризували біохімічні властивості рекомбінантних білків Стуїбї, СтуїАс і РАТ, експресованих в трансформанті сої ррАВУ582.814.19.1. Кількісний твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) являє собою відомий в даній галузі біохімічний аналіз, який можна використовувати для характеристики біохімічних властивостей білків і підтверджувати експресію цих білків в трансформанті сої РОАВО582.814.19.1.
Приклад 2.1: Експресія білка РАТ, СтуїЕ і Сту! Ас З тканинах рослин
Зо Зразки тканин сої виділяли із тестованих рослин і готували для аналізу експресії. Білок РАТ екстрагували із тканин рослини сої розчином фосфатно-сольового буфера, який містить детергент Тмееп-20 (РВ5Т), що містить 0,595 бичачого сироваткового альбуміну (В5А).
Рослинну тканину центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували із використанням набору ЕГІ5А для визначення РАТ в форматі "сендвіч". Набір використовували згідно із протоколом, який рекомендується виробником (ЕпмігоЇодіх, Ропапа, МЕ). У цьому аналізі вимірювали експресований білок РАТ.
Білок СтуїЕ екстрагували із тканин рослини сої розчином фосфатно-сольового буфера, який містить детергент Тмееп-20 (РВ5Т). Рослинну тканину центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували (із використанням набору ЕГІЗА для визначення Стгу! Е в форматі "сендвіч". Набір використовували згідно із протоколом, який рекомендується виробником (5ігагедіс Оіадповіїсв5 Іпс., Межагк, ОЕ). У цьому аналізі вимірювали експресований білок Сту! Е.
Білок СтутАс екстрагували із тканин рослини сої розчином фосфатно-сольового буфера, який містить детергент Тмееп-20 (РВ5Т), який містить 0,5 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА). Рослинну тканину центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували із використанням набору ЕГІЗА для визначення
СтутАс в форматі "сендвіч". Набір використовували згідно із протоколом, який рекомендується виробником (5ігагедіс Оіадповіїс5 Іпс., МемжагКк, ОЕ). У цьому аналізі вимірювали експресований білок Стут Ас.
Аналіз детекції проводили для дослідження стабільності експресії і наслідуваності як вертикально (між поколіннями), так і горизонтально (між лініями в поколінні) в трансформанті сої РОАВУ582.814.19.1.
Приклад 2.2: Експресія білка РАТ, СтуїЕ і Сту! Ас в тканинах рослин
Визначали рівні білків Стуїб, СтуїАс і РАТ в трансформанті сої ррдВ9582.814.19.1.
Розчинні, екстраговані білки із тканини листя сої вимірювали способом кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Від Т2 до Тє поколінь трансформантів сої ррАВО582.814.19.1 експресія була стабільною (не розщепленою) і однорідною для всіх ліній. У таблиці 2 наведений середній рівень експресії трансгенних білків в трансформанті сої ррАВО582.814.19.1. (510)
Таблиця 2
Середній рівень експресії різних трансгенних білків в трансформанті сої рОАВО582.814.19.1
Приклад 3: Клонування і характеристика послідовності ДНК у вставці і фланкувальних граничних ділянках трансформаційної події сої рОАВО582.814.19.1
Для характеристики і опису геномної ділянки вставки визначали послідовність фланкувальних геномних граничних ділянок Т-ДНК трансформаційної події сої ррАВО582.814.19.1. Підтверджували геномну послідовність трансформаційної події сої ррАВО582.814.19.1, яка містить 1400 п. н. 5'-рланкувальної граничної послідовності (ЗЕО І
МО':1) і 1398 п. н. 3'-рланкувальної граничної послідовності (ЗЕО ІЮ МО:2). ПЛР ампліфікація на основі граничних послідовностей трансформаційної події сої рРОАВУ582.814.19.1 підтвердила, що граничні ділянки були соєвої природи, і що ділянки сполуки являють собою унікальні послідовності для трансформаційної події сої рраАвВ9582.814.19.1. Ділянки сполуки можна використовувати для специфічної відносно трансформаційної події ідентифікації трансформаційної події сої рРОАВО582.814.19.1. Крім того, характеризували ділянку вставки Т- ланцюга шляхом ампліфікації геномного фрагмента, який відповідає ділянці ідентифікуючих фланкувальних граничних послідовностей із геному нетрансформованої сої. Порівнянням трансформаційної події сої рРОАВО582.814.19.1 із нетрансформованою геномною послідовністю виявляли, що під час інтеграції Т-ланцюга відбувалася делеція приблизно 57 п. н. із вихідного локуса. Загалом характеристика вставки і граничної послідовності трансформаційної події сої ррАВУО582.814.19.1 вказувала на те, що в геномі сої містилася інтактна копія Т-ланцюга із ррАВОБ82.
Таблиця З
Список праймерів і їх послідовності, які використовуються для підтвердження геномної ДНК сої в трансформаційній події сої РОАВО582.814.19.1 підтвердження 5'- граничної
ФЕО геномної ДНК,
Ю 81419 РМ/3| 30 | ТТТСТОСТАТОСОТСАААТАААТСТОСТОС | спгпнистовували
Мо АШБЬІТОРМІ1 або
ЕМ2; їз УА! Епа-01 або 5ІКЕпа-о02 підтвердження 3'- граничної
ЗЕО геномної ДНК,
ІО 81419 ВМ 27 саезтаАттаатТассСААААатТТАТИатТтТ використовували
МО:5 спільно із
З'РАТЕпа 05 або
З'РАТЕпа 06 підтвердження 3'- граничної
ЗЕО геномної ДНК,
ІО 81419 ВМ2 24 тасАдаааТСАТАТСИСААДААСАСТ використовували
МО:6 спільно із
З'РАТЕпа 05 або
З'РАТЕпа 06
Продовження таблиці З підтвердження 3'- граничної
ЗЕО геномної ДНК,
ІО 81419 ВУЗ 24 стстаса,атсатапсАааатСАТАТ використовували
МО:7 спільно із
З'РАТЕпа 05 або
З'РАТЕпа 06 підтвердження 5'- 5ЕО граничної
ІЗ 0 БІВЕпа-01 0029 | ССАОСТТТСТААТТТСАААСТАТТооСОоС | Геномної ДНК,
МО 8 використовували спільно із 81419 ЕМ/З підтвердження 5'- 5ЕО граничної
ІЗ 0 БІВЕпа-02 30 | ТССТАСАТСАТСАСТТСАТАСАААССТОСА | /еНОМНОЇ ДНК,
МО 9 використовували спільно із 81419 ЕМ/З підтвердження 5'- 5ЕО граничної
ІЮ АШЬИОВМІ 029 | СОСТОСТАСАТСАТСАСТТСАТАСАААСС | ГеНоМмНої ДНК,
МО використовували спільно із 81419 ЕМ/З підтвердження 5'- 5ЕО граничної
ІЮ АШЬИОВМ2 028 | САСТОСТОТТСАСТОСААТОАССААтТАА | ГеНоМНОЇ ДНК,
МО використовували спільно із 81419
ЕМІЗ підтвердження 3'- граничної
ЗЕО , геномної ДНК, юю З я 20 | ОСТОСТССААССССАСТТАС використовували
МО: 12 спільно із 81419 ВМ1, ВМ2 або ЕМЗ підтвердження 3'- граничної
ЗЕО , геномної ДНК, юю З Ми 20 | ССАСТТАССССАСТТАСССА використовували
МО: 13 спільно із 81419 ВМ1, ВМ2 або ЕМЗ
Таблиця 4
Умови стандартної ПЛР ампліфікації граничних ділянок і специфічних відносно трансформаційної події послідовностей у трансформаційній події сої РОАВО582.814.19.1
Послідов- Набір праймерів ПЛР | Передде- Денату- | Елон-гація / Кінцева ність-мішень суміш / натурація рація |(С/хв.:сек.)| елонгація (оС/хв. (С/сек. (оС/хв. се звлюквюв в ВДЕ паса ііі НН с пашжше
Продовження таблиці 4 теє ретновтинеГ вн ГЕ ТВ стен ретнотня в/в ГЕ ВИСяЮ- стен ретновняни в/в СЕТ ВИСяЮ- зе реженовнивя вве ВЕТО Си зад аненння воски ряютууєти- вставки
ПЛР суміш для стандартної ПЛР ампліфікації граничних ділянок і специфічних відносно (мкл) (мкл)
ШЕ: Ко ОП НН Я: ЗОНИ КО Ро ПОН НИЄ РК: 11111111 пмосьсямМму 7777 | 06 11111111 памтРО5МКМУ 7 | 716 11111111 111111 ІАТАО(бОдімклу///:/ | 01 (мкл) (мкл) оМоСід5мММ 77777771 17111050 МоСьр5мМм| 77777 | 706 оамтРІД5мММІ| 77777771 17111181 амтРІДОММ| 7 | 32
Приклад 3.1: Підтвердження геномних послідовностей сої 5- і З-фланкувальні межі вирівнювали за послідовністю, яка отримується при повногеномному секвенуванні способом дробовика хромосоми 02 Сіусіпе тах, підтверджуючи, що трансген трансформаційної події сої рОАВУ582.814.19.1 вбудовувався в геном хромосоми 02 сої. Для підтвердження ділянки вставки трансформаційної події сої рОАВУО582.814.19.1 із геному сої проводили ПЛР із різними парами праймерів (фіг. 2, таблиця 3, таблиця 4 і таблиця 5). Як матрицю використовували геномну ДНК із трансформаційної події сої РОАВУ582.814.19.1 інші трансгенні або нетрансгенні лінії сої. Для підтвердження, що 5'-граничні послідовності є правильними, використовували праймер, сконструйований для зв'язування із промоторним елементом гена АШБІ1Т0О, наприклад, АЮБІіТОКМТ, і праймер, сконструйований для зв'язування із клонованою 5'-кінцем межі хромосоми 02 геному сої, праймер, який позначається 81419 ЕМ/З, для ампліфікації сегмента ДНК, який перекриває промоторний елемент гена АШБІ1О в 5'-кінці граничної послідовності. Аналогічно, для підтвердження клонованої 3'-граничної послідовності використовували специфічний відносно РАТ праймер, наприклад, З'РАТЕпаб5, і три праймери, сконструйовані відповідно до клонованих 3'-кінцем граничної послідовності, які позначаються 81419 КМ1, 81419 КМ2 і 81419 КУЗ, для ампліфікації сегментів ДНК, які перекриває ген РАТ до
З3'-граничної послідовності. Фрагменти ДНК із очікуваними розмірами ампліфікували тільки із геномної ДНК трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1 із кожною парою праймерів, але не зі зразків ДНК від інших трансгенних ліній сої або нетрансгенного контролю. Результати свідчать, що клоновані 5'- і 3і--граничні послідовності являють собою фланкувальні граничні послідовності вставки Т-ланцюга із трансформаційної події сої рОАВУ582.814.19.1.
Для додаткового підтвердження вбудовування ДНК в геном сої проводили ПЛР ампліфікацію, яка перекриває граничні послідовності сої, на геномній ДНК, яка не містила вставку Т-ланцюга із трансформаційної події сої ррдАвВ9582.814.19.1. Праймер 81419 ЕМУЗ, сконструйований відповідно з 5'-кінцем граничної послідовності, і один праймер 81419 КУЗ, сконструйований для 3'-кінця граничної послідовності, використовували для ампліфікації сегментів ДНК, які містили локуси, в які інтегрували Т-ланцюг ррАВе582. Як і очікувалося, ПЛР ампліфікацією, яка проводиться із парою праймерів 81419 ЕМУЗ і 81419 КМУЗ, отримували фрагмент ДНК приблизно 1,5 т. п. н. від всіх інших контрольних ліній сої, але не ррАВО582.814.19.1. Вирівнюванням ідентифікованих (5- і 3-граничних послідовностей трансформаційної події сої ррАВеО582.814.19.1 із послідовністю, яка отримується при повногеномному секвенуванні способом дробовика, із хромосоми 02 Сіусіпе тах виявляли делецію приблизно 57 п. н. у вихідному локусі (фіг. 3). Ці результати демонстрували, що трансген трансформаційної події сої рРОАВ8294 вбудовувався в ділянку хромосоми 02 геному сої.
Приклад 4: Характеристика за допомогою саузерн-блотингу трансформаційної події сої ррАВО582.814.19.1
Аналіз саузерн-блотинг використовували для встановлення патерна інтеграції трансформаційної події сої ррАвВе9582.814.19.1. Цими експериментами отримували дані, які демонстрували, що інтеграція і цілісність трансгенів СтуїАс і Стуїб в геномі сої.
Трансформаційну подію сої ррАаАВе582.814.19.1 характеризували як первинну просту трансформаційну подію інтеграції, яка містить одну копію одиниці транскрипції (РТ) рослини
Стут Ас і СтуїтЕ із плазміди рОАВО582.
Дані саузерн-блотингу підтверджували, що фрагмент Т-ланцюга вбудовувався в геном трансформанту сої ррАВО582.814.19.1. Докладний аналіз саузерн-блотинг проводили із використанням зондів, специфічних до гена СтутАс і Стуїї, що містяться в ділянки вбудовування Т-ланцюга рравВе582.814.19.1, і ілюстративні ферменти рестрикції, які містять ділянки розщеплення, локалізовані в плазміді, і утворять гібридизаційні фрагменти, внутрішні відносно плазміни, або фрагменти, які перекривають область сполуки плазміди із геномною
ДНК сої (граничні фрагменти). Молекулярна маса, отримана саузерн-гібридизацію для комбінації рестрикційного ферменту і зонда, була унікальною для трансформаційної події, і встановлювала їх ідентифікаційні патерни. Ці аналізи також демонстрували, що фрагмент плазміди вбудовувався в геномну ДНК сої без перебудови РТ СтутАс і СтуїР.
Приклад 4.1: Збір зразків листя сої і виділення геномної ДНК (гДНК)
Геномну ДНК екстрагували із тканини листя, зібраного від індивідуальної рослини сої, яка містить трансформаційну подію сої ррАВУ582.814.19.1. Крім того, гДНК виділяли із загальноприйнятої рослини сої Мамегіск, яка містить генетичне середовище, яке є репрезентативним для конкретної лінії, в якій відсутні гени СтуїАс ії Стуіг. Індивідуальну геномну ДНК екстрагували із ліофілізованої тканини листка стандартним способом СТАВ (ЗатюогоокК еї аї., (1989)). Після екстракції спектрофотометрично кількісно визначали ДНК із використанням реагенту РІСО СОКЕЕМ (Іпмігодеп, Сагізрад, СА). Потім ДНК візуалізували в агарозному гелі для підтвердження значень аналізу РІСО СКЕЕЙМ і для визначення якості ДНК.
Приклад 4.2: Розщеплення і виділення ДНК
Для молекулярної характеристики саузерн-блотингом трансформаційної події сої ррАВУО582.814.19.1 розщеплювали десять мікрограм (10 мкг) геномної ДНК. Геномну ДНК від трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1 і нетрансгенної лінії сої Мамегіск розщеплювали, додаючи приблизно п'ять одиниць вибраного ферменту рестрикції на мкг ДНК і відповідний реакційний буфер до кожного зразка ДНК. Кожний зразок інкубували приблизно при 37 "С протягом ночі. Ферменти рестрикції Азеї, НіпапІ, М5іїЇ, ї Має! використовували індивідуально для окремих розщеплень (Мем/ Епдіапа Віоїар5, Ірзу/сп, МА). Ферменти рестрикції Мої! ї АраГ І використовували спільно для подвійного розщеплення (Мем Епдіапа Віоїабз, Ірзм/ісп, МА). Крім того, отримували контрольні зразки позитивної гібридизації, комбінуючи плазміду ДНК, рОрАВУО582 із геномною ДНК із нетрансгенного сорту сої Мамегіск. Суміш плазмідної
ДНК/геномної ДНК розщеплювали аналогічними способами і із використанням аналогічного ферменту рестрикції, як у тестованих зразках.
Потім реакційну суміш розщеплення інкубували протягом ночі, додавали 25 мкл розчину
ОШІСК-РКЕСІР РІ ОЗ (Едде Віозуєієт5, «зайпегхриго, МО) і зразки розщепленої ДНК осаджували ізопропанолом. Преципітований осад ДНК ресуспендували в 15 мкл 1Х буфера для нанесення (0,01 95 бромфенолового синього, 10,0 мМ ЕДТА, 10,0 95 гліцерину, 1,0 мМ Ттгі5 рн 7,5). Потім зразки ДНК і маркери молекулярного розміру піддавали електрофорезу в 0,85 95 агарозних гелях із 0,4 Х буфером ТАЕ (Ріхпег Зсіепійіс, РІНбригой, РА) при 35 вольт приблизно протягом 18-22 годин до отримання розділення фрагментів. Гелі забарвлювали бромистим етидієм (Іпмігодеп, Сагізрай, СА) і візуалізували ДНК в ультрафіолетовому (УФ) світлі.
Приклад 4.3: Перенесення за Саузерном і обробка мембрани
Аналіз саузерн-блотинг проводили по суті, як описано МетеїїйпК еї аї., (1994). У короткому викладі, після електрофоретичного розділення і візуалізації фрагментів ДНК, гелі піддавали депуринації 0,25М НСІ приблизно протягом 20 хвилин, а потім піддавали дії денатуруючого розчину (0,4 М Маон, 1,5 М Масі) протягом приблизно 30 хвилин із подальшою обробкою нейтралізуючим розчином (1,5 М Масі, 0,5 М Тті5 рН 7,5) протягом щонайменше 30 хвилин.
Перенесення за Саузерном проводили протягом ночі на нейлонових мембранах і із використанням капілярної системи із 10Х 5552. Після перенесення ДНК піддавали зв'язуванню із мембраною шляхом утворення поперечних зв'язків під дією УФ із подальшим швидким промиванням мембрани розчином 2Х 550. Цим способом отримували мембрани для саузерн- блотингу, готові для гібридизації.
Приклад 4.4: Мічення і гібридизація ДНК-зонда
Фрагменти ДНК, зв'язані із нейлоновою мембраною, детектували із використанням міченого зонда (таблиця 6). Зонди отримували вбудовуванням на основі ПЛР міченого дигоксигеніном (БІС) нуклеотиду, ІБІС-11|- 4ОТР, у фрагмент ДНК, ампліфікований із плазміди ррАВУО582 із використанням праймерів, специфічних для елементів генів. Отримання ДНК-зондів за допомогою синтезу ПЛР проводили із використанням набору РСК ІС Ргоре Зупіпезі5 (Коспе
Ріадповійсв5, Іпаіапароїї5, ІМ) способами, рекомендованими виробником.
Мічені зонди аналізували електрофорезом в агарозному гелі для визначення їх якості і кількості. Потім бажану кількість міченого зонда використовували для гібридизації із ДНК- мішенню на нейлонових мембранах для детекції специфічних фрагментів із використанням
Зо способів по суті, як описано для розчину ІС ЕАЗУ НУВ (Коспе Ріадповійсв5, Іпаіапароїїв, ІМ). У короткому викладі, нейлонові мембранні блоти, які містять фіксовану ДНК, швидко промивали 2Х 55: і піддавали попередній гібридизації із 20-25 мл заздалегідь підігрітого розчину ІС
ЕАБУ НУВ у гібридизаційних пробірках при приблизно 45-55 "С протягом приблизно 2 годин у гібридизаційній камері. Потім розчин для попередньої гібридизації зливали і замінювали «15 мл заздалегідь підігрітого розчину БІС ЕАБМ НУВ, який містить бажану кількість специфічних зондів, денатурованих кип'ятінням на водяній бані протягом приблизно п'яти хвилин. Потім проводили етап гібридизації при приблизно 45-55 "С протягом ночі у гібридизаційній камері.
У кінці гібридизації зонда розчини БІС ЕАБЗУ НУВ, які містять зонди, зливали в чисті пробірки і зберігали при приблизно -20 "С. Ці зонди можна повторно використовувати до двох разів способом, рекомендованим виробником. Мембранні блоти швидко ополіскували і двічі промивали в чистих пластикових контейнерах буфером для промивання із низькою жорсткістю (2хХ 550, 0,1 95 505) протягом приблизно п'яти хвилин при кімнатній температурі із подальшим дворазовим промиванням буфером для промивання із високою жорсткістю (0,1 Х 55С, 0,1 95 5О5) протягом 15 хвилин кожний при приблизно 65 "С. Мембранні блоти швидко промивали 1Х буфером на основі малеїнової кислоти із набору БІС УМАБН АМО ВОСК ВИОРРЕК (Коспе
Ріадповійсв, Іпаіапароїї5, ІМ) протягом приблизно 5 хвилин. Після цього проводили блокування в
ТХ блокуючому буфері протягом 2 годин і інкубацію із кон'югованим із АР (лужною фосфатазою) антитілом проти БІС (Коспе Оіадпобвіїс5, Іпаіапароїїх, ІМ) в 1Х блокуючому буфері також протягом не менше 30 хвилин. Після 2-3 промивань 1Х буфером для промивання специфічні
ДНК-зонди залишалися зв'язаними із мембранними блотами і стандарти міченої СІ ДНК візуалізували із використанням системи СОР-5ТАВ СНЕМІ ОМІМЕЗСЕМТ МИСІ БІС АСІЮ
РЕТЕСТІОМ (Коспе Оіадповіїсв5, Іпаіапароїї5, ІМ) відповідно до рекомендацій виробника. Блоти піддавали дії хемілюмінесцентної плівки протягом одного або більше моментів часу для детекції гібридизаційних Фрагментів і візуалізації стандартів молекулярного розміру. Плівки проявляли із використанням пристрою для проявлення плівок АГ -РАО 100 РІ 05 (Копіса Міпона, ОзакКа,
Уарап) і аналізували зображення. Для кожного зонда проби документували число і розмір. Для визначення розміру гібридизаційних фрагментів у саузерн-блотингах використовували мічений ріс маркер молекулярної маси ДНК ПІ (БІС МУУМ Ії) ії мічений БІС маркер молекулярної маси
ДНК МІ (БІС МУУМ МІЇ), видимі після детекції ОІС, як описано. (510)
Таблиця 6
Локалізація і довжина зондів, використовуваних в аналізі саузерн-блотинг 1720 1746 білок початку реплікації ІА 1119
Приклад 4.5: Результати саузерн-блотингу
Очікувані і спостережувані розміри фрагментів із конкретним розщепленням і зондом, засновані на відомих ділянках розпізнавання рестрикційних ферментів РТ СтутАс і Стук, наведені в таблиці 7. На основі цих розщеплень і гібридизацій ідентифікували два типи фрагментів: внутрішні фрагменти, де відомі ділянки ферменту фланкують ділянку зонда і повністю містяться в області вбудовування СтуїАс і СтуТЕ РТ), і граничні фрагменти, де відома ділянка ферменту локалізована на одному кінці ділянки зонда, і передбачають, що друга ділянка знаходиться в геномі сої. Розміри граничних фрагментів змінюються залежно від трансформаційної події, так як в більшості випадків ділянки інтеграції фрагментів ДНК є унікальними для кожної трансформаційної події. Крайові фрагменти забезпечують спосіб локалізації ділянки розпізнавання рестрикційного ферменту відносно інтегрованої ДНК ії оцінки кількості вставок ДНК. Аналізом саузерн-блотинг, який проводиться на багатьох генераціях сої, яка містить трансформаційну подію сої ррАВе582.814.19.1, були отримані дані, які підтверджували, що низькокопійна інтактна РТО СтуїАс і Стуїб із плазміди ррАВе582 інтегрувалася в геном сої трансформанту сої рОАВО582.814.19.1.
Таблиця 7
Теоретично розраховані і спостережувані гібридизаційні фрагменти в аналізі саузерн-блотинг. 1. Очікувані розміри фрагментів розраховані на основі карти плазміди ррАВУ9582. 2.
Спостережувані розміри фрагментів приблизно розраховували на основі цих аналізів, і вони засновані на указаних розмірах фрагментів міченого СІСї маркера молекулярної маси ДНКІЇ ї маркера МІЇ
ДНК- | Ферменти Очікувані разміри Спостережуваний м Зразки фрагментів (п. розмір фрагментів (п. зонд рестрикції ну но? ррАвоб5в2 13476 »14000
Аве Трансформаційна подія сої РОАВО582.814.19.1 »1286 71400 ррАвоб5в2 15326 215000
СТАС Мі сої РОАВО582.814.19.1 73873 710000 ррАвоб5в2 4550 -4500
Мой Араї!
Трансформаційна подія 4550 -АБОО сої РОАВУ582.814.19.1 ррАвоб5в2 8071 -8000 має! -- -
Трансформаційна подія 5ББб9 -7500
СРЛЕ сої РОАВУ582.814.19.1 у орАВОБВ2 11044 11000
Мві Трансформаційна подія сої РОАВО582.814.19.1 73873 710000
Продовження таблиці 7 стутв |. ніпо пі сої РОАВУ582.814.19.1 вресв Мі сої РОАВУ582.814.19.1
ІА Мі сої РОАВУ582.814.19.1 оіВЕР Мові сої РОАВУ582.814.19.1
Ферменти рестрикції Авеї ї М5іїЇ зв'язуються і розщеплюють унікальні ділянки рестрикції в плазміді рРОАВУО582. Внаслідок ці ферменти вибирали для характеристики вставки гена Стуї Ас в трансформаційній події сої РОАВО582.814.19.1. Граничні фрагменти »7286 п. н. або »9479 п. н. теоретично розраховували для гібридизації із зондом після розщеплень Азеї і М5іїЇ відповідно (таблиця 7). Спостерігали окремі гібридизаційні смуги СтуїАс приблизно 7400 і »10000 п. н., коли використовували розщеплення АФвеї і М5іЇ відповідно. Гібридизація зонда зі смугами такого розміру підтверджує наявність однієї ділянки вставки для гена СтуіїАс в геномі сої трансформанту сої ррАВе582.814.19.1. Ферменти рестрикції Мої і АраЇ! вибирали для проведення подвійного розщеплення і для виділення фрагмента, який містить одиницю транскрипції рослини (РТ, промотор/ген/термінатор) СтуїАс (таблиця 7). Теоретично розраховані фрагменти 4550 п. н. спостерігали із зондом після подвійного розщеплення Мої! і
Араї!!І. Результати, які отримуються із ферментативним розщепленням зразків рорАВО582.814.19.1 із подальшою гібридизацією із зондом, свідчили про те, що інтактна ТОР
СтутАс їз плазміди ррАВУО582 вбудовувалася в геном сої трансформанту сої ррАВО582.814.19.1.
Ферменти рестрикції мае! ї М5іЇ зв'язуються і розщеплюють ділянки рестрикції в плазміді ррАВУО582. Внаслідок ці ферменти вибирали для характеристики вставки гена Стуїї в трансформаційній події сої ррАВУ9582.814.19.1. Граничні фрагменти 25569 п. н. і »9479 теоретично розраховували для гібридизації із зондом після розщеплень Маеї ї М5іїЇ відповідно (таблиця 7). Спостерігали окремі гібридизаційні смуги Стуїб -7500 п. н. і 210000 п. н., коли використовували Маеї! і Мей відповідно. Гібридизація зонда із смугами такого розміру підтверджувала наявність однієї ділянки вбудовування гена Стуї1Е в геном сої трансформанту сої ррдівВе9582.814.19.1. Фермент рестрикції Ніпа!!! вибирали для виділення фрагмента, який містить одиницю транскрипції рослини Стуїб (РТ, промотор/ген/термінатор) (таблиця 7).
Теоретично розрахований Фрагмент 7732 п. н. спостерігали із зондом після розщеплень НіпаІ.
Результати, які отримуються із ферментативним розщепленням зразків ррАВУ582.814.19.1 із подальшою гібридизацією із зондом, свідчать про те, що інтактна РТ сгуїб із плазміди рорАВУО582 вбудовувалася в геном сої трансформанту сої ррАВео582.814.19.1.
Приклад 4.6: Відсутність послідовностей основного ланцюга
Проводили також аналіз саузерн-блотинг для підтвердження відсутності гена стійкості до спектиноміцину (5рескК), елемента Огі Кер і білка початку реплікації ТА (елемент її А) в трансформаційній події сої РОАВО582.814.19.1. Не чекають специфічної гібридизації із геном стійкості до спектиноміцину, елементом Огі Кер або елементом ІпПА, коли включають відповідні позитивні (із РОАВУ582, доданим в геномну ДНК МамегіскК) і негативні (геномна ДНК Мамегіск) контролі в аналіз за Саузерном. Після розщеплення Мбвії і гібридизації із специфічним зондом зреск спостерігали одну смугу очікуваного розміру 15320 п. н. у зразку позитивного контролю (із ррАВУО582, доданим в геномну ДНК Мамегіск). Зонд 5рескК не гібридизувався із зразками негативного контролю і трансформаційною подією сої ррАВУ582.814.19.1. Аналогічно, детектували одну смугу очікуваного розміру 15320 п. н. у зразку позитивного контролю (ррАВУ582 плюс МамегісК), але відсутню у зразках негативного контролю і трансформаційної події сої РОАВО582.814.19.1 після розщеплення М5біїЇ і гібридизації зондом ІА. Детектували смугу із іншим очікуваним розміром 5329 п. н. у зразку позитивного контролю (із ррАВео582, доданим в геномну ДНК Мамегіск), але відсутню у зразках негативного контролю і трансформаційної події сої ррАВе582.814.19.1 після розщеплення Маеї! і гібридизації із специфічним зондом ОГгіКер. Ці дані вказують на відсутність гена стійкості до спектиноміцину, елемента Огі Кер і білка початку реплікація їТА в трансформаційній події сої ррАВО582.814.19.1.
Приклад 5: Агрономічне і польове випробування врожайності і толерантності до гербіцидів
Для тестування агрономічних характеристик і ефективності трансформаційної події сої рорАВОБ582.814.19.1 трансформант культивували у випробуванні ефективності в Санта Ісабель,
Пуерто-Ріко у жовтні 2010 року і лютому 2011 року. Культивар МамегіскК, який початково трансформували із отриманням трансформанту ррАвВ9582.814.19.1, висаджували в кожному розсаднику і включали як контроль в експериментах. Насіння із дослідної ділянки ТЗ отримували із індивідуальних відборів рослин на стадії Т2 і насіння для дослідної ділянки Т4 отримували із індивідуальних відборів рослин на стадії Т3. Тестували кожну генерацію чотирьох ліній трансформанту. Кожну лінію висаджували на ділянці, яка складала завширшки 4 грядки і завдовжки 7,5 футів. Відстань між грядками становила 30 дюймів. Ділянки вирощували під світлом протягом приблизно 2,5 тижнів для компенсації короткої довжини світлового дня в
Пуерто-Ріко. Кожний розсадник обприскували глуфосинатом зі швидкістю 411 г екв. кисл./га.
Одну ділянку контрольних рослин Мамегіск обприскували із аналогічною швидкістю глуфосинатом, а другу ділянку не обприскували і використовували як контрольне порівняння для трансформанту.
Дані збирали відносно проростання, загального зовнішнього вигляду, потужності, висоти, вилягання і дозрівання. Толерантність до гербіциду оцінювали, візуально переглядаючи хлороз, некроз листя і загибель рослин (таблиця 8).
Для порівнянь трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1 із Мамегіск використовували дані тільки із необприскуваного блока Мамегіск. Для порівняння обробок із обприскуванням і без нього порівнювали дані із блока трансформанту сої ррАВео582.814.19.1, який обприскується даним типом обробки, із даними із блока контрольного необприскуваного Мамегіск.
Трансформант сої ррАВОеО582.814.19.1 виявляв толерантність до застосування гербіциду
Зо глуфосинату. На противагу цьому, жодна із рослин МамегісК не була толерантною до обробок гербіцидом.
Таблиця 8
Порівняння трансформанту сої ррАВО582.814.19.1 із Маметіск. Значення являють собою середні значення із розсадників Із і Та. Кажний розсадник трансформанту сої рорАВО582.814.19.1 обприскували глуфосинатом на стадії МЗ3 при швидкості 411 г екв. кисл./га.
Зовнішній / Міцність (ві т Схожість вигляд (від ще д Висота | Виляган | Дозрівання рансформант о Ш в 1Т1слабка до о (У) 1Т1-слабкий до 9- (см) ня (У) (доба) й. й хороша) 9-хороший) ороАвоб82814191| 90 | 8 | 8 | 69 | 1 | 9 о Махейск.////// | 82 | 8 5 Ющ | 8 | 64/| 1 | м
Приклад 6: Характеристика інсектицидної активності трансформанту сої ррАВО582.814.19.1
Проводили вирощування в полі і теплиці для характеристики активності СтуїАс і СтуїЕ в трансформанті сої РОАВО582.814.19.1 проти вирощених в лабораторії паразитів сої, включаючи
Апіісагзіа детітаїйа|йх (гусеницю оксамитових бобів), Рзечаоріизіа іпсішде5 (соєву совку) і зродоріега їидірегда (трав'яну совку). Трансформант сої ррдавВ9582.814.19.1 порівнювали із нетрансформованим сортом сої Мамегіск для визначення рівня захисту рослини, який забезпечується білками СтуїЕ і Сту1Ас.
Випробування в теплиці проводили на рослинах приблизно у віці чотирьох тижнів. Для оцінки трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1 і контролю МамегісКк використовували п'ятнадцять рослин. Для кожного тестованого виду комах (Апіїсагзіа деттагїгаїї5, Рзецаоріивіа іпсійдез і зродорієега їидірегда) отримували З шматочки листка, які отримуються компостуванням, від кожної рослини всього 45 листових дисків/рослин/видів комах. Шматочки листка діаметром 1,4 см (або 1,54 см") вміщували в тестовану область на вершині 2 95 водного агару, інфікували однією новонародженою личинкою і щільно закривали перфорованою пластиковою кришкою.
Через 4 доби після зараження оцінювали смертність і споживання листка. Личинку, яка не реагувала на акуратне промацування, вважали загиблою. Пошкодження листка оцінювали за допомогою візуальної оцінки процента з'їденого комахою шматочка листка.
Польові оцінки проводили, збираючи зразки листя від насіння, вирощеного в розсадниках в
Санта Ісабелі (Запіа Ізабеї), Пуерто-Ріко і висилаючи це листя в Індіанаполіс, ІМ для тестування. Розсадник для трансформанту сої ррАВеУ582.814.19.1 висаджували в лютому 2011 року, і він складався приблизно із 180 рослин, розподілених по чотирьох грядках. Кожна грядка становила 2,3 м в довжину і на відстані один від одного 76,2 см; відстань між індивідуальними рослинами становила 5,1 см на кожній грядці. У березні 2011 року вирізали один трилопатевий листок головного стебла, який повністю розпустився, розташований приблизно на чотири вузли нижче, ніж меристема, у 10 рослин із трансформаційною подією сої рОАВУ582.814.19.1 ї у 10 рослин "Мамегіск". Листя вміщували в помічені пластикові пакети (один листок на пакет) і запечатували. Вміщене в мішки листя упаковували і передавали в лабораторію. У лабораторії один або два диски листка діаметром 3,33 см (1,31 дюйми) отримували перфоруванням із кожного трилопатевого листка, отримуючи загалом 16 листкових дисків. Кожний листковий диск вміщували в тестовану область на вершині 2 95 агару, інфікували однією новонародженою личинкою 5. Ігидірегаа і щільно закривали перфорованою пластиковою кришкою. Листкові диски тримали в кімнаті із контрольованими умовами протягом 7 діб, під час яких оцінювали смертність і споживання листка. Личинку, яка не реагувала на акуратне промацування, вважали загиблою. Пошкодження листка оцінювали візуально за допомогою оцінки процента з'їденого комахою шматочка листка.
Результати, які отримуються із цих повторюваних експериментів, вказували на те, що трансформант сої рраіАВе582.814.19.1 був значно менше пошкоджений порівняно з контрольними рослинами МамегісК від всіх тестованих комах. Таким чином, трансформаційна подія сої ррАВУ582.814.19.1 має інсектицидну активність відносно цього широкого кола хазяїнів.
Приклад 7: Послідовність трансформанту сої рОАВУО582.814.19.1
ЗБЕО ІЮ МО:14 являє собою послідовність трансформанту сої ррАВе582.814.19.1.. Ця послідовність містить 5'--еномну фланкувальну послідовність, вставку Т-ланцюга ррАВеО582 і 3- геномні фланкувальні послідовності. Відносно 5ЕО ІЮ МО:14 залишки 1-1400 являють собою 5'-
Зо геномну фланкувальну послідовність, залишки 1401-1536 являють собою залишки реаранжування із плазміди рРОАВО582, і 1537-13896 являють собою залишки вставки Т-ланцюга рорАВО582, і залишки 13897-15294 являють собою 3'-фланкувальну послідовність. З'єднувальна послідовність або перехід відносно 5'-кінця вставки, таким чином, виникає при залишках 1400- 1401 5ЕО ІО МО:14. З'єднувальна послідовність або перехід відносно 3'-кінця вставки, таким чином, виникає при залишках 13896-13897 БЕ ІЮ МО:14.
Потрібно зазначити, що потомство трансформанту сої ррАВе582.814.19.1 може містити послідовності, які трохи відрізняються від 5ЕО ІЮ МО:14. Під час інтрогресії і процесу селекції трансформаційної події сої ррАВе9582.814.19.1, яка вводиться в геном рослинної клітини, нерідко виникають делеції або інші зміни вставки. Крім того, можуть виникати помилки ПЛР ампліфікації які можуть приводити до незначних помилок секвенування. Наприклад, фланкувальні послідовності, перераховані в даному описі, визначали за допомогою отримання ампліконів із геномних ДНК сої, а потім клонували і секвенували амплікони. Часто виявляють невеликі відмінності і незначні невідповідності послідовностей, які отримують і визначають таким чином, обумовлені багатьма етапами ампліфікації, яка є необхідною для отримання достатнього амплікону із геномних ДНК для секвенування. Фахівцеві в даній галузі потрібно розуміти і враховувати, що будь-які поправки, необхідні внаслідок цього типу загальних помилок секвенування або невідповідностей, входять в обсяг даного винаходу. Таким чином, відповідний сегмент послідовності плазміди, наданий в даному описі, може містити деякі незначні зміни.
Таким чином, рослина, яка містить полінуклеотид, який має деякий діапазон ідентичності із послідовністю вставки, яка розглядається, входить в обсяг даного винаходу. Ідентичність послідовності 5ЕО ІЮ МО:14 може являти собою полінуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 9096, 9195, 9295, 9396, 9495, 9595, 96, 91 95, 9895, 99 95 або 100 95 ідентичності послідовності із послідовністю, яка ілюструється або описується в даному описі.
Таким чином, можна ідентифікувати деякі відмінності між ЗЕО ІО МО:14 і рослинами потомства трансформанту сої ррАВе582.814.19.1, і вони входять в обсяг даного винаходу.
Приклад 8: Селекційний гібрид трансформанту сої ррАВ4468.04.16.1 і трансформанту сої ррАВО582.814.19.1
Приклад 8.1: Статеве схрещування трансформанту сої ррАВ4468.04.16.1 і трансформанту сої РОАВУ582.814.19.1
Трансформант сої рОрАВ4468.04.16.1, як описано в міжнародній патентній заявці Мо
УМО/2012/075426, схрещували статевим шляхом із трансформантом сої ррадАвВе9582.814.19.1.
Пиляки трансформанту сої ррАВ4468.04.16.1 вручну терли по приймочці трансформанту сої ррАВУО582.814.19.1, таким чином проводячи запилення трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1.
Отримуване потомство Ні, яке містило інтеграцію трансформаційних подій від трансформанту сої рРрАВО582.814.19.1 і трансформанту сої ррдАВ4468.04.16.1, піддавали скринінгу відносно толерантності до 2,4-О і гербіцидів на основі глуфосинату для ідентифікації рослин потомства, які містили обидві трансформаційні події інтеграції.
Приклад 8.2: Характеристика експресії білка в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВОБ582.814.19.1:ррдавВ4468.04.16.1
Проводили характеристику біохімічних властивостей рекомбінантних білків Стуїб, Стуї Ас,
ААО-12 | РАТ, які експресуються в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВУО582.814.19.1:рОАВ8264.44.06.1. Підтверджували, що в цілому 51 рослина КЕ: містить обидві трансформаційні події сої РОАВО582.814.19.1 і рРОАВ4468.04.16.1, специфічного відносно трансформаційної події аналізом ТЛОМАМФ), аналізом на основі такого, як описано в попередній патентній заявці США Мо 61/511658 і міжнародній патентній заявці Мо УУО/2011/066360 відповідно. Потім використовували твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5А) для кількісного визначення експресії білків РАТ і ААО12, при цьому білки СтуїАс ії СтуїЕ кількісно визначали мультиплексними імунологічними аналізами із використанням технології електрохемілюмінесценції від Мезо-Зсаїе Оівсомегу (М50О). У сукупності ці аналізи використовували для характеристики біохімічних властивостей білків і підтвердження експресії цих білків в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВеО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1.
Експресія білка РАТ в тканинах рослин
У селекційному гібриді трансформанту сої ррдіВе9582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 визначали рівні білюка РАТ. Розчинний екстрагований білок РАТ вимірювали кількісним твердофазним імуноферментним аналізом (ЕпмігоЇодіх, Ропапа, МЕ) для тестованої тканини листка сої.
Специфічними відносно трансформаційної події аналізами ТАОМАМФ підтверджували, що в цілому 51 рослина її містить обидві трансформаційні події сої ррАВе582.814.1941 і ррАВ4468.04.16.1. У таких вирощених в теплицях тестованих рослин виділяли зразки тканини
Зо листка сої на стадії росту М3-М4 і готували для аналізу експресії генів. Із тканин рослини сої екстрагували білок РАТ розчином фосфатно-сольового буфера, який містить детергент Тмееп- 20 (РВ5Т) ії 1 95 полівінілпіролідон 40 (РМР-40). Потім зразки екстрагували із використанням
СЕМОСКІМОЕМК"М при 1500 об./хв. протягом 5 хвилин. Екстракт рослин центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували із використанням набору ЕГІ5ЗА для РАТ в форматі "сендвіч". Набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробником. Цим аналізом вимірювали експресований білок
РАТ в тканині листя.
Для дослідження успадкування експресії в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВУО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 проводили аналіз детекції. У генерації Еї рослини селекційного гібриду трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1:ррдвВ4468.04.16.1 експресували
РАТ (таблиця 9).
Таблиця 9
Середня експресія РАТ у селекційному гібриді трансформанту сої ррАВУБ582.814.19.1:ррдва468.04.16.1
Експресія білків Стуї Е і Сту1ї Ас в тканинах рослин
У селекційному гібриді трансформанту сої ррАВе582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 визначали рівні білків Стуїтб і СтутїАс. Розчинні екстраговані білки Стуїб і СтуїАс вимірювали мультиплексним аналізом М5О (Мезо-зсаїе Ррізсомегу, сайпегериго, МО) для тканини листка сої.
Специфічними відносно трансформаційної події аналізами ТАОМАМФ підтверджували, що в цілому 51 рослина її містить обидві трансформаційні події сої ррАВе582.814.1941 і рорАВ4468.04.16.1. У таких вирощених в теплицях тестованих рослин виділяли зразки тканини листка сої на стадії росту М3-У4 і готували для аналізу експресії генів. Білки СтуїЕ і Сту1Ас екстрагували із тканини рослини сої РВБТ і 195 РМРА0. Потім зразки екстрагували із використанням СЕМОСКІМОЄК"М при 1500 об./хв. протягом 5 хвилин. Екстракт рослини центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували мультиплексним аналізом М5О Сту1Р/СтуїАс від Мезо-5саїє рібзсомегу. У цьому аналізі вимірювали білок СтуїЕ і Сту1 Ас в тканині листка.
Для дослідження успадкування експресії в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВОБ582.814.19.1:ррдвВ4468.04.16.1 проводили аналіз детекції. У генерації Еї рослини селекційного гібриду трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 експресували
СтутЕ і СтутАс (таблиця 10).
Таблиця 10
Середня експресія СтуїЕ і Сту1їАс у селекційному гібриді трансформанту сої РОАВУО582.814.19.1:ррдв4468.04.16.1
Експресія білків ААО12 в тканинах рослин
У селекційному гібриді трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 визначали рівні білка ААО12. Розчинний екстрагований білок ААО12 вимірювали кількісним твердофазним імуноферментним аналізом (Асадіа Віозсіепсе, РогНапа, МЕ) для тестованої тканини листка сої.
Специфічними відносно трансформаційної події аналізами ТАОМАМФ підтверджували, що в цілому 51 рослина її містить обидві трансформаційні події сої ррАВе582.814.1941 і ррАВ4468.04.16.1. У таких вирощених в теплицях тестованих рослин виділяли зразки тканини листка сої на стадії росту М3-М4 і готували для аналізу експресії генів. Білок ААО12 екстрагували із тканин рослини сої розчином фосфатно-сольового буфера, який містить детергент Тмееп-20 (РВ5Т) і 0,595 бичачий сироватковий альбумін (ВБА). Потім зразки екстрагували із використанням ЗЕМОСКІМОЕР М при 1500 об./хв. протягом 5 хвилин. Екстракт рослини центрифугували, збирали водний супернатант, розбавляли придатним буфером в міру необхідності і аналізували із використанням набору ЕГІЗА для ААО1Т2 в форматі "сендвіч".
Набір використовували відповідно до протоколу виробника (Асадіа, Ропапа, МЕ). У цьому аналізі вимірювали експресований білок ААО12 в тканині листка.
Для дослідження успадкування експресії в селекційному гібриді трансформанту сої ррАВУО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 проводили аналіз детекції. У генерації РЕ: рослини селекційного гібриду трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 експресували
ААОІ12 (таблиця 11).
Таблиця 11
Середня експресія ААО12 у селекційному гібриді трансформанту сої ррАВУ9582.814.19.1:ррАВа4468.04.16.1
Коо)
Приклад 8.3: Толерантність до гербіцидів селекційного гібриду трансформанту сої ррАВОБ582.814.19.1:ррдавВ4468.04.16.1
Толерантність до гербіцидів селекційного гібриду трансформанту сої ррАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 аналізували у дослідженні в теплиці. Насіння трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 висаджували в горщики і вирощували до зрілості. П'ятдесят три (53) зрілих рослини Еї обприскували при одному застосуванні гербіциду, яке складалося із 840 г екв. кисл./га 2,4-О, при стадії росту М3-М4 (відмінної тим, що однолопатеві і перші три-чотири трилопатевих листи повністю розвинулися). Отримувану толерантність до цих гербіцидів вимірювали, підраховуючи кількість рослин, які вижили. Було виявлено, що всі п'ятдесят три рослини є стійкими до застосування гербіциду. Для порівняння у дослідження включали контрольні рослини, які не містили генів ААО-12, і для яких очікувалося, що вони є чутливими до застосування гербіцидів на основі 2,4-0.
У результаті, ген ААО-12, який міститься в батьківській лінії трансформанту сої рорАВ4468.04.16.1, забезпечував толерантність до гербіциду 2,4-О0. Ця ознака передавалася і
Зо успадковувалася в сої рорАВе582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1, таким чином, забезпечуючи толерантність до гербіцидів трансформанту сої ррАВе582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1. При порівнянні контрольні рослини, які не містили генів ААО-12, були чутливими до застосування гербіциду 2,4-0.
Приклад 8.4: Характеристика інсектицидної активності трансформанту (сої ррАВОБ582.814.19.1:ррдавВ4468.04.16.1
Оцінки в теплиці проводили для характеристики активність Сту1Ас і Сту1Е у селекційному гібриді трансформанту сої ррдвВе582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 проти вирощених у лабораторії паразитів сої, включаючи Апіїсагзіа деттаїйаїї5 (гусеницю оксамитових бобів) і
Роепидоріизіа іпсіндеп5 (соєву совку). Селекційний гібрид трансформанту сої ррАВО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1 порівнювали із трансформантом сої ррдавВе9582.814.19.1, трансформантом сої рорАВ4468.04.16.1 і нетрансформованим сортом сої МамегіскК для визначення, чи змінюється рівень захисту рослини, який забезпечується змінами білків СтуїЕ і
СтутАс, при стекінгу. Крім того, селекційний гібрид трансформанту сої рорАВОБ582.814.19.1:ррадВ4468.04.16.1 і трансформанту сої ррАВ4468.04.16.1 обприскували одним застосуванням гербіциду, який містить 840 г екв. кисл./га 2,4-О0, перед біоаналізом для підтвердження відсутності негативного біологічного впливу гербіцидів на комахах.
Досліди в теплиці проводили на рослинах приблизно у віці трьох тижнів. Кожну від п'яти до десяти рослин використовували для оцінки селекційного гібриду трансформанту сої рорАВУО582.814.19.1:рОАВ4468.04.16.1, трансформанту сої ррАВУ582.814.19.1 і негативних контролів: обприскуваних трансформанту сої ррАВ4468.04.16.1 і Мамегіск. Для кожного виду тестованої комахи (Апіісагзіа деттагаїї5 і Рхецдоріивзіа іпсічде5) отримували З шматочки листка, отриманих компостуванням, від кожної рослини на один вид комахи. Шматочки листка діаметром 1,4 см (або 1,54 смг) вміщували в тестовану область на вершині 1,5 95 водного агару, інфікували однією новонародженою личинкою і щільно закривали перфорованою пластиковою кришкою. Через 4 доби після зараження оцінювали смертність і споживання листка. Личинку, яка не реагувала на акуратне промацування, вважали загиблою. Пошкодження листка оцінювали за допомогою візуальної оцінки процента площі листка, з'їденої комахою.
Результати отримувані із таких повторюваних експериментів (таблиця 12) вказують на те,
Зо що селекційний гібрид трансформаційної події сої рраАвВе582.814.19.1:ррАВ4468.04.16.1 відповідав трансформанту сої ррАВе9582.814.19.1 і зазнавав значно меншого пошкодження тканини листка (0,6-0,8 95) у порівнянні із контролями трансформанту ррАВ4468.04.16.1 (94- 99 95) і Мамегіск (96-97 95) з боку соєвої совки і гусениці оксамитових бобів. Високу смертність (100 Ов) реєстрували для селекційного гібриду трансформанту сої ррАВО582.814.19.1:!ррАВ4468.04.16.1 і трансформанту сої ррАВО582.814.19.1, при цьому рослини ррАВ4468.04.16.1 і Мамегіск приводили до низької смертності (0 905), і всі комахи, які поміщаються на ці контрольні рослини, виживали. Таким чином, селекційний гібрид трансформанту сої ррАВео582.814.19.1:ррАВ4А468.04.16.1 має порівняну інсектицидну активність із трансформантом сої ррАВУ582.814.19.1.
Таблиця 12
Середній процент пожкодження листя і смертності Рзейдорісизіа іпсійдепв5, соєвої совки, (ЗВІ) і
Апіїсагзіа деттаїаїв5, гусениці оксамитових бобів, (МВС), яких годували різними трансформантуми сої, (п-15-24)
Середній 9о 5 о листка на 4 ОА!" й ороОАВА468.0416.1.7777777777777гг1 11 БВ | 7 992. | ..:.:УХУО І ороОАВА468.0416.1.77777777771 11 | 77937... | ...Ь(:КЮЮ ороАВоб82.814.1941 77777771 БВ | 7 06 | юю |у ороАВоб82.8141941 77777777 11 МВС | 77 06 | тло о рОАвВоб82.814191сррАВА468.0416.1, | УВС | (08 7 7-| .ЮЦрГМЬЛО0 оМамейск/////77777777777777777777771711 177115 796 17711101
І Мамейск//////7777777777777777771771711 177117 УВС | 968... | щЩщ0 2 " "РАЇ - діб після зараження
Проілюстровані і описані принципи даного винаходу, фахівцям в даній галузі потрібно розуміти, що винахід можна модифікувати в розстановці і деталях, не виходячи за межі таких принципів. Автори заявляють всі модифікації, які входять в суть і обсяг прикладеної формули винаходу.
Всі публікації і опубліковані патентні документи, які цитуються в цьому описі, включені в даний опис за допомогою посилання в тій же мірі, як якби кожну окрему публікацію або патентну заявку конкретно і індивідуально вказували як включену за допомогою посилання.
Список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ох бой Дехковсієпвсев Є 1902 СТІЙКИЙ ДО КОМАХ-ШКІДНИКІВ Її ТОПЕРАНТНИЙ ДО ГЕВБИЦИДІВ
СЕНЕКЦІЙНИ ГІБРИД ТРАНСТОРМАНТУ. СОХ рордво5ва. ята.19,.1 водналев.ог. 16, «УуЗМоз лова «1605 35 «ВТО БакепстчІв уєквіст 3.5 «Во 41 «241їз і835 «То» ДНК «в13» З1іусіпе тах «айй» 1 стсвасавсча ссавсчавеса бассагагау аадчассвззча чодессваєт стаєувеава 6
Ггтасодасса баба вббсосасва біссдазада гсадаєсває саїбсчекоо 120 касавсоаччва азсвавадаєсч собесакствЕ бссаєсстає сдававачає ссавсваєсо: 180 тавсасссоз асваїсаса ссодавазчац аааавсссова адаскесова сссасдацає 4 восасачесч вісаазасео авааавассях астчасзста сптовкассава саачаєсосає 300 звраїєсрсст аївосостаєс асасааувзає кбсасауєса зоосвосева ассбодасба зб «ссасчазає зсвасцпассьї ткадавкває бассоссека чагкассата гдаваарайлд 450 аваєсзатєвмає: ваапасасак вавзвавасазо авевсксрасва чассавссств зсаствоскає 480 сзассвавсс сбяоатьебу ссабссасса сгравтасасра зоабсасаває пававаєаєа зо песавсчься сабсаанава ссзаааєцсас пассассрроа азасааасса сЕхассвЕка во сассвсваєс асватадаал Коссачазса зааавазавсс чазаатссає аззасасаха БО аагакгаєтса ссексесав сосзссвавста вабссоєсся абаасрсбаєс бавосаєсоє 750 бектсевуєє сацастаасва вавссЕсазс австассаао садсасачає асаєссавад во ззаксваєсвнив сЕссазсвас сазевуцкеся гадаваасес сквававсасва ззасхтсатяє пай й5ааассвач гайавсвача бечасоєсос аечравосвЕ басасааста ессозсеса. з00 асассавсса айвасексевЕ ссвашсасьс згасавасві. паиставсьсва Свт асдаася За вкасецсавс азавассстє асаваєсава сскблоавася ачсвкоста асасесекее 1070
ЕСсбасадчака СЕ Ксоваво асзебечясЄє явора сассссвасе срусвасао 1959
ВЕКЕЕБочас стхвакЕаоа васеЕсестчата ааасєкксву реіуаєсчссвоа свое своке 116)
Есазсвасватя асссоезсвкс чаавгосасас авсссзлдазза саасваасча зовссадласа 120о
ЕзсовацачсєєЄ сачссвассва сазстассоча азЗасачсвгач абгагтасчос аазссосаєц І9250 жчавзсавадатє ссзаєссаєстіз завсвавада саавосвсве Сесстоезває сесіваєооо 1358 атсвцсассса ссочбасеба ссосааазає свавсєссао стасавсєво сасессчаїве їз гсасзаасєса ваасттеєссса сспаваєвасо чопоасососа сочасоссса соуввесодє ха830 чеаачссода ассссвачо вадссесЧєє сассаставнц гедевтачсва есе ровесе 50 тсІночЗасаа остов Ессво ссеобавсз агозасачос аодсасрвасса сасоваававею т» пазЗцеєсссчав Качсесдчава сбапазваєсе ссбсавассдаз чессбасавуе саваєсссосе 1520 сггачсесчса савтассвєсє сСасоучакеє свассоаеаЄ заксасосоЄ сосоасвала їБВО аасстсвавс асассссЗке савсехкаЗсс Еочсассуая савазсваві. ссазсцссаєс 150 чессоддсва псочссасас вазеесогас вааавазасая зстссусчик зчассчаєтав тво0 ааайсетесс сасссоасачеа сстаасодаєс зоспака. ува ай» а жатів 1550 «гій ДЕК «ВЗ бЗішсайе па «-й0й0х 2 човсвсвосес асасасасбса Богсассдчає чсесвосвітвах васрзссакв апа. во тасасасача соесассодав вссачосаву бргачасааєл бассаавсото асчкчасое ї20 звасасассва авасосссує вавБасбсасає ссассвавес батасгавев азаваачеса: 180 взедачавна вачаавсйсо зсавессссв сохкрсасве сбессавессь азааасасоа а сестасоцац псбавУссгаА дававасчаяса сузасстася стсгодчаває авгсавеЧако 300 часссстсс асаесєсвас сазсеоасоес српаосетаєо себасаєсееє совесесеви збо тгкссасзсс вабссвавос бассерУєЄсао сечаєзаєса стстеЕвЕрКОо БЕСтвевоВх а2го шесваєса: всссссостає осасгавасс: вдаосаєабь стссбозвадч соассгазчса 480
КЕссацЕсва гадЕссеса вачавосаса себЕекаЕсс сСсвасссьеєе ссаєсвасєе зай ставу ссавав азбассєсттал восадобсаста сасбасасаєс Сбаараквсв сссгааста є Оп сЕЕСазвессо сссававсса вочоктсає всвасцевава вовіаквсво ассваєваса во сЕсазачаїта кавсртаєсе сссксесаата звабсазасав авсчасачес автгабавиваєс 7 агазссвзаєсо сачазвсассв асаосстсста аасаєвсвис Єпессасеаає свачтвасад 785 сіхлівдаватсав вакгавасвоє аексЕКсЕВс зстосазаца асЕсвзЕхвак сеЕссайсдаа: пай аксессокзає сеясессввив зассастасс ачестаслсві аавсссваасс свв сЄсва Зп асзкавсої гозчедссвваа гсасоссодева Ссесавгававй сьсссеЕвасча віасаасов з60 ссасчасцев чавосасвас рагссаєтат свесассвсс зароставв боссабасає то спеессексосос саснпасвост сбсавазоссти пкассесовове ссесссвсетга вессак ста това асссаавессс асссосавовсва асаачзчвсся авоасавачах апасасссує апвсугасвоее 1.40. пікасасадча загчанавоє заастасваса сапвассаас бссуссвеЄ равасесуве 12505 сЕчаєсуз тає ссаєссабаєс бавасасста сосссчкоє Бас сс сдос: ї250 сзасесваєк ссАсахааєк дасеваачіх ачрачаєста БассесЕКес сСасасасаає тТ320 ссасствЕсев садасоусаса Єспассасра абсасадазє сегсадавчє зесвссаста 1380 зацссссащи: баассасасс сваасвадсза сассочЕаба єчаєбсзесаса абадсзайахта 1440 часавіська Сстасасуаот сеасавазоад уссавсааасі ссввсссова чаазсссдау І500 акЧавзцецчає сцацастоачЧе ассссссоасе авбсассадсоє астаабевє б їз5О «каф З «вЕїм. таз «из ЗК хиї3» Штучна послідовність «те «03» Послідовність плазміди орав «ай» З ачбсвцсассо агрсабассва пасдекаоаєс сСдвабадесь дзавстадаа взасевеосває во ззачасстас ачессвавио ссср адо субасвасає сасссвассаа ворссоваося т чссЕЧавсаЄ чЧавссосоас спаааасссс заббагасує зчсссаавев аа автає тп сгасадалазс ааасссдосоа пссабосесад Чебаасдсдасс зЗсвозазесе бкаравазай 2459 псасасрссоа сусссасеов сбовавачоє сасСецасеса сазассавса чассзачаєа кеВ) сЕСВССЕЕБа адасеевцаа єссгасзадад ско всасца асвовсваєс гвадаєссода зо зхаашеЕсево сепрсабазчо сзассбассс аавачавсЯи ЄсоБобасса СЕС СЧвВс 429 аск акса ацсаасавас вссасслакс аптртсчЗассов асаесоаоеває гдазвакестта Во ссасцессса заїладаєсе ассуагасає саассвавга асалчваєда вросзадксве зай сзаавсоевово бдсескЕва зсзасасьво Ессвссваєє бсасбвсваза чесассассс во твоІссагаєс дахвахгсага свадавівсс саагаасаст адазнаттва вададасосга ав пгаассгсвяса асасоссваєв счасасвова чссаоссЕо Савцавасс асечасрооа та баддсссвер гоасассвдає ввасбодсвав апапаавслад падсаляавуа дпабадачсас 786 дзачавсвсс воаавасасо зЗзавсвсоеску сввеЕчсачко чуассосаєчеа пссавевать 40 спосавескс вестссаєся сзсасстава аавеіавзавсос всваєцесва аазадсвнав 906 аксчсзасча ссзскадаєсс ссазсосчибоа свосссавча ссвссчссво давен Зб др одастчач ссаосваєваа асодсуєсва вукцоасоуєт Чесодевсво асчадтсаса 1570
Ів ссвасі. сазачсасаа вкасІсокес ссавсоссава васзазасзва сгацтовава дв асвассксоє чкосаавсаа сосєстабас звоцхусссе сбастаєссво стасбассто 140 зссепосстат ССссспсзтяЯ асосвесове соски поссосвев схе асвад ї12950 асеавсассса звачсспевсо сссасвастес доавовссаве сробсвазає соваввававс 123560 сЕсгсссаас кЄегссстасео дсадесаваао бававкЕсесЯа сСаксссесає ссЕсСтсВввай 1370. сосгредасеє вогткссзЄ счассссавс сгсаватаса СсссЕсяЯасо сачаєтевцє із385 свассссвча ссчавовова ЕБрсссзоаче бовссоасста часассасею сзастсосоа 1445 квасаєтсссо асавватасса сссувВскУє ссзавсаато бзесеснесов саасвасеа 1590 сессвсзаєт баба ассбачавої оба сачесе робачевсеє вопассцчаає 15650 сЕЗДЕСЧЗаєств асссдаа Є Ссессаєсаваа сасазасосо сасосавсаас вабасссача 1550 ассацсакчЧЕ сесабасавс воссесавса абсосічначе сдадаєсесе засуаацчауа, іно ччувашсассое асоасоссосє срсчасавес сосЕстессю сасвасчтцсво сеЕБЕБЯасосве їт40 ачесевасссс єазпсасасає чесусствра асестсосвуа ссогсаєссва уусеєсаєса 3800 сессаксіда Єсдуадесво Єесосутстос адаєсцуазса агісассчаєс садаочаєсоу ї85О0 асасссЕсса аасовасацуа сссасовава сасексввоч сесббосраае акесвесава 1820 ссогасаєтцза воасастосух сасссоцаау ссаассссав овавєзсеісав соссебувах 1980 асадітчаччас ссцосссвосо васасацасоч езсзсссезчає сасадосаєо васаасевеа 2580 сесссзссвя ссбтазчасс сесбсасвесе свзбесавує гссвааустьяса засскесаєє ач) сдачеккачоє гадозчаєаеє чеУусесЕсра дасавучева чодассесстас абзоссассу ІБ гсазсаакса стовсваасвоча сусассвзасе счасссассе ссвсассааа оабсчсобат ги всасоснсвза сесазоасансса адавесссва даздусассяа састєсесав Ббечасаадає 22 сбаассач:; бадазачсоаае себсасаскса срасассеца сабалосось сбобссооса 2340 астасдасає всдсасстає ссваєссаза ссадсссоса асгтасазоя уазаєскаса в4йо себсокезчс сасеЧасцаєс аосссвовеЕ ссдссвасає асоесаазуцє сесзаєссуєт 2450 сочацесссаз госсововосв спссВіскся поса Бсве пеасссеса сСсакЧас 258 сечасзесає Сассссссав восЩЧЕссяоЯ даосспсосгасое Беассавосос одцсавсасеу 2580 штсаЗсзайося савсваєсьс ссассскахов зчеасоссда сепЕЗЧКОМЕ ШеСЕСОоКоерух 4 сксбсачвосча заасссадос секссокаса чавссхоосс воасесіосо бета пована лю чзазоссстоу савсссасас басоасссссо чсссувазес ассочсото сзоасясвесу во ссассваєса сасссосаєса їссадаваса десадсассве Бовасвоссїх чзакдауаєсе 2820 свостсавов сазсадсоча пеасостеача «одчастетссе ссакусаєвс зассацчєся ана севеЕсЧцечсо ссодесіоує дадасевусу чЧессавассс сеЕобачадев ссааудесоє 2940 закучаєссв гбочссссосс асасссасва асзесагеча гссасаЗаца йпссасссаца 300
Сесессезає свзазосасає асвесесвує соуовассазо ззЄсореаца пачоссоцоє 3060 ссасбууєвня адасаєсссе адасуєвссв соацваучеаєс асесдевеве ассвЕсакса зт зсассваєча зеозасссессо сачеясвасе чЧсдесачаає ссцстабосс песвссасеа зі асеЕсчачаас ставзосаса сеБессссса аведеассио сУсрассав шбсавсавса 324 свагозасає Зоадссассса бгдасассос аудбсдЕвевс стакодссасе асевасвсго 3300 сасісассвє Єссваєсчачє сасеіссассь ссасачедоаст сопсазчарасе сссавчобсоу 3350 чевгасцазчє Чкасаєсзає сусесковає кчассссвоє часецссаса стбоавоЧе 3829 аадсесаассв сзвусасасє садвадассо сдавсаесею сбесасосоє ссвавесада 3480 ссадацсссза свсасабсоаса асссаєсасс асбабевчаєссуч Саесресозає сорасесво 3550 чесрптства счаасоссас градцасовов ачавачачсї зисвоаовва сосчвадесассч 3600 ссаавдачеасс себстсасцає асузассосує стсдадаєсос сзассосвода зсдавссавсе звев щесдаєювоцЧа ссассввкоє азчуччассва сісасаєває сасксаваса чесоводаєт 3740 їасподазуа чвастасчєс авсасссстаче зчасессвбда Єцачеастас бсаасакаєсе 3780 кЕрассацдаа дчасасасуаа адсвасесса авсовасас вадатассая ссооааавааео з830 асасссаута сосісвачас себуаватсс асессассвч агасансзссо вавасаєсувеа: зво сачісзаєеє Чосесдоадаст частсаскос суссаєстебе ацсостсавоєс сссабссоаогв 396 асвваохасеса Есзсксасве сассессеовє бусасасаса Соббочобує звсрчаєсвсой 1029 ассазачаєсть соадсасосаЯ додасессов адассвачас ссазвдаєуде сасосаваце 980 кччасавсек гузастсссоо саадачаааєс сассбостоув адаааосооо еозчаце ба ко адасусссца савоаавсоє адодасавса дасадавасе удадсооцав абаваасаєсоя 200 садазасазача ацдссааауаа ссачібдава сеЕБакссяЯє чазососсва сакосаєноце 4355 бссвачсєда сассавсаса Чсаасцаєскс акдосцсача саавадоуєе сасвосаєко 4330 дсзавосаєса сосссссова соссссачсва Ссоссодочє свасдосцов збссрсдчазо 4380 впсосссзаавчз асчсасєсткс асосчсовевтос состесвспса сосвасвнааи десвосзаца «аа асессдассо сазсавсуце сЕЕКоссчої дазаєдьсва асдусасяєя часчевсваєт 4500 засвавасла бсасоссссс чесскоеся бсссссвосУу Завачсічавй часа 45 «ав ссясаЕ стассспочо сабдчеассаса сбесесчеає чассчсе кас ааачавацчеє 4520 асазачазцч соц ссасо всссваєсчача басСачавсав гасетаєчав СЕдааеЧесе 4680 зесвастакоє совзсзавчая чессасссава вовавесое свеобБсцеває часстасвссєт та сзасксвача асачтасчат чосасссавсва сссососяа сечсооастав часова авОоп всзацаедсва сесассттсоя ссбосєдасе асоссссацо сгасдвадад ваддсяєвев ав сксасозаво дсосувсває ссесдковна чсвасачачеа спаточсчЧас тасасаєсес 2320 сесозсспо обаєзсавес заазадісоє засассссоо бозаасодає заччсвевов 4980 гкчазасаух адвавссдада Часасавсеся сачсссцассе вБасочадвете кесексасао зопаг запачслеЗзс асбсайсссра зрсасстада соссочссас сазсаєсвасс секагсеваєт 5іО00 астеадаеста сеасессаєє вевсосавес скуссссекс зучассксав сассдвавасс 16 таїспіазваз гасаєсзактав сксцесасад Чобедсгоса завссдчасев детасесвіва З229 авасбрасСсаав зааавсет бас ссосессовав сСасбссвоцча Босак оваа оЗасвоськав- в ассасесасс сооссасстас чсабсажсьс сзссдасвеаєч абсадезаса сезавсассе ззай псазчсастає суасаассса ссслаавасс сасзачайаа ссадаєчеса сасуаваєсзЗа Аа «пазасваса свавсисача гавзлиссвся сасаєстацо асзкєдосеу апассастоа Зево асагссчавчса адассвсеоцвча агеєЕсстсоаса ссадсабасс Бссвзасісва сссавзаєдас: 5вао ачсозаваєса сссздассцо сосасвоов совчсозаєсс зсссаєсесе скит чУєка Зіво сстккЕдесав саточеайчесс сдадуєтоса чесопсдедес далазсвасе стагасасва ЗАЙ зачесдссус чесуасецчас гзувасьзаас ссасавсоса ассвросазу асдесвасако УП. кацадіссав Сас тасучч зайластасо чайусаєсав сбавчессво саачаевусає 57650 дісазсасос чусєвсаєава саасссаває ссавазаєсов адвагсосаса Забасавуає ха2о сегасассас сазцвасасца асвачвнаєас драчавассч ававачавца: зосаса ува ВО чазвачавис бпрчевсасЯс зазсассчас дасвасався йдаасавачав чапвасчевся 5949 зсчассчеца пвцачасєвтса зЗаоасвсає пдсолаечосоча завсчсааає зсадаавута ОО зесссассаєсє заводзаєся єабоссссає Свссставсев бЕСабаресе сесокосах обу тЕссоСссхЄ Чачтспюссв агабадацав ссаачі сс сасссослпай азвсавовпавна війо вастєтшкас азвассассис сссецавоса ссоаоуасає васкссводва звавеЕсусав БінО чт азає севасвасоо всазасаввес савсвиісвавс зачзсасвсьос сттвсавове Бай секчсацесвааєс сетазозссу воечеоссоада садесласст ассчачасту дссасасасе взпй тассвасасєєс сабо есає ссассосаасе сесбсЕсосоз' звавесспеас пссочсасю вів айссусас: чавсссчксч ас:ассвЕсвя дчзавесеее чессососто авеуачасяс ваг сЕсссвкБвса сачаєсвчаас ачсгавхссва сбаватваїта ааавсвассса стаоснасса вав вассассосоа ачассасава адессссацесда сесерассво аскласасво вас свов: Ба зазчсцчозаа асачассояа ссвассссос сссвачЧачеаст цачасчсчса ссовасеєсая БОЇ чадвасасдавс водсусасєча суасосуєвав Бессдесессс сссчвесада аскассавах БОБ тессосЕвса вБосоатавасо бвосазчскос саасосросбас всзсесосвяо ссцсчасає БУ сЕссчсассс счасСавсучє чачачессоЗа сссасавсо асовзагачес чеЕсасавсуй БУВ тестдассачЗ сисаесазцса вссасаєсєстча ссасосоФ састзУсвса асазсааавеге анай есчааєсчцЕдшес сусучасеча вебобсасазча Євсоцссацо басавосаде кезучедаце вБапо чеЕсЗасасса ассоасостач всассуєсцо бевоборосо акшсасдви сбасасоєся 6960 стссааксссЗс ассчасетсає аабсцасесо доаваайсссас зсаавсосач ЕссЕсЧачаа тах сЕКсуЧВасУєЄ зосгсЕсзЧац чегсовстса зчдсасачає адайзсавса басссссаса така спсесчассуає агассозаса чтасеасзає стасасоває дссоассасо сдесастасва зіва осадссаоца сассачарса гоччсавсасс сзсеоуєесс шссоцассвуо аасерсасвее 7809 сзасастуссас сзчастатау чдсавсозсачс ксспсвасаа сасастасва сосавсседа 7250 сачасесчсс пасацвдаєст сасссачовс сссасвівоз ачассвесссв всассзасає узго саасаассва сдастосево Коасродасоує двсадчайвос дестаєдааа собосксада 7380 кскчссаєссо Фдоссосстаса бавасечече авсазскває азсттузаєо ваасевсвсс тав асацчавсвас засасссосат стасеасзачо чісезоассас свссетачес асуссосссає 7505 цЗеЕсссусера чУЧсессачьа агадсазчече кБадсаєсасс адчадерссда єдссогоесс 7550 сахасаєсяє ачсассааце ссвасвабас авссосассс озрассасса сосасассво 7559 застуссвас ЯчдЧеаасвксс сссссвасає Есбассаєє соводассау дасссвосоу 75 вадсуасття чксаудстЯа арусовосуд свасдасаєс садавсачау восасатком. 780 асшкчоссакс свебсесзоаб суасакепас садасассво зп сера сав свсагассго 7820 шектассеся атссвессса асоссавіс зусеавстес соесвістекс ссавгасасх тей ассзуссчаса зосасасссе кБозчЧаснасос ссавессаде чассссавсс асесецааах таго гусраасчсо ссСасссово сесгвсесав сабвосазує чссавдавасє ссросодавае т758о свссадачес асвассдчасє зестссватв сабгесссоєо асіссавссо седаоцсвуа водо зЕстлдастсо сазазчастевс асдазвоасооє свзасастесе сбсСсастусяс севассавасає 100 коадостсваз асачасосча ссзастатста сасссоесоує чеЕсссавасс ЕБечосвсаау т1і6о сссексеовах чассессо саасуачеа чааочазсеє бессовзавчцу ссвавсаєце 8220 пвасеоассе ачоовсчасє счаасееею ссвазаєссо аасосссаоб бдассавово вав чЧчеввслтачає сасочасчча чЧодесвачсас зяасассасс асссазасвач рова 8340 чсссзадсац вастасувса см скочоа пгасствсзає чазсосвсос таасабасоє чаО0о девссалавзу абвзчассває соувавсисва вачессасаса алабассяче счасваачоса 816о паксоазчає вчбсаавчасс сесадчавоса ссспассваца ЕдсаасСосовя засабучачяе 8520 ашеЕєваєуєс ссечосесує чссеассске чесассєкса дессєвзачес ссавсдоєав завО чечснсоссає сасссасасєєс асессроссв сзасетацас апиосзсеаса собасосчаа 854О саввасесс зчасчсаче саесссссав цассавочвис Свачасочсо вкусовочоє ВОЗ зчЧасвасссс зчачсссстад падасвавсо зесгссесчав давацесосся стадачедаа во чацччсєсчає азоувассуча ччодасавуає зчачавосго озасодоааа савасисеує Зоо чсасааасав счеосадачава чусасецеасує секс сосу азсссссаче всдавачуєе ваВо ссввчекзає дссвасатая скасзчаєскса гсасеоСячає ааасасвявес абадесавсеяч вза чозачсоскас сеБсосочавс ЄБачечтзає сосоучрчсс пасоастаста ссссговача зо чебачаваче сясабесвса ссосаввстс сссугсавсув: счссозоачнася ссассавацла зоба кчасзасссе засваєдосе тассстсстся свассесадла чдачсасосва аічгвувача зі асауазсааї сассосссса бесесасвав хестозувоа чайдесадалу вЕсесвезацда. 5180 ачсесосесе Бесссрдвес чесесвасає соссбсевесє абсосораса адчазвочаса за4о созчасаваачі сдсстсвсса гасасчасвс совоаодасвас ассудочавчс бдавосоесаєд З3бо саастоасоасс чазсаацуаач Бсгасссааа садсеассояба аспрчсазсту асгасасксоє З350 часссвацач зчайсваіцазчу сбасттасає вісстсосваєс счачсатаса асссачеоса заза псасвоссаас Бестсбесас ссусктоавста счуоаесазсс сасчаччача асостсасемх рив счасчовссчє воцсасааєс ссічЧедаасо саасачадос сакоасдчасс всасасесов 9540 ассацесоає басуссасса засадссвоа чевсссссса давассявса аоасесодчає ЗБ счачаєсоса чЧазасодцаву сбвасаєссво Бесісвоівов чзсодачссас єссрзасоча зво ччавсцачса Зесавссссза ссасссайзач скссоуєсасо сагсвгаваєс сасстстачааа з720 совасасвасає ксбастосач зссссстода заасеєчасов чегсассяасав звассвовай ЗНО аавакссбас сбчЧссвозає басстсоаозда ссазсассва сзасасссаа вовакссое зі чавреаскзс псавсассоцс сдассдасзач абсаоєдаса сдадасаєсєс чзгадтастає зз0 пчасваєссса сссовавнась сасаавуазав Зсаавсоцчеса сасоваєсєссав ЕбСазвасваєв. азво савзасасача павасдосвся сасаєсесаош абасгсчоссу адасстаєссца вкаседвуха 10020 азаксасаца вссЕседасв чудадсасаєо сесваєсссво сесазваєдао восоввака ї1в5вава сісвзвасечсє сссвтасиса дозасосаво асссаєссиво тес соасто соБсксчосав Тт0150 саузавоаєс сзадоаскосс чосасусчес часссачесо сессусасва ветедеисоо ї20а
Чисуссоваас сзаасеєгава беасосцошсо сссвзазсуєч дсечесезає сзачессася то9ва ссвсассааа ссбСачвазиє аапсасссев секс св сСвааззаєссов асагстасом Т935о дазаавстаї псзачтасса сссазвсвса содвоаачса зсазгсавсаса содсвсасає 103850 цесавсставц сссадвавко вазсвакевас зпавсвсавсв бсссзсасса ссасавткасо 10540 дасаасваєа сопбачазасс уадачвачаласавссазчоасов задавав стедЧазиаося ТОо569 саддсассда бдасаасває сдаваадазвта здасвайоос зчовокову вазвччацчасає то5Ей адаузасаиса сеусаваУкоч пайасосвас сосочааачеь азостставса сдлвацеавасс 10670 скагсоссса сбаствбассов ссотасасес сссчечбоеа ЕЕ Кесссо бога ї1по6щоО тасахсавопа зссайоспоч Чевсскабсв вавсавочваз яааасесацев ЄзассосвЕсо Мо ксосбоЗавах ассдазовзке савсоссаза чазассрзса азс таци ссгссацао тавпо сосчусззацчч зчассассоу асассасасс восрасатей сосчагасочє ососашеекя 105359 счасгасочсс дассвісвсв спбасасосс свсовоговає бссасуасвя адссасдаве: т10520 зссасавзач сосасговсУ асстачабвай Чдобасазсає ачасасссіс чессочевас 0850 ссацесодац чоасоасіосоо ссдадбаєстає ссасодстача осстузааче стазоудавсЯє їїбай бЕзсовесод зсазбсзасз чгасьяєсьа сесцссасає зодсабсзав оЯбсодоссе 11100 зачасссаса госчбСасасає зиссосссав ческасодчаз чсосаасаве СктаваабсвУЄ 11150 дастассачес агадассссс саввосзарсс асссоствод Сессасовоя сссрсчовдата 11220 сасвососоч Чесасассос доусачек я асасавосає дабадесчас асоавассау 11580
Ессстсєсюсва зоадсасссст ачссессачс ссобссвацча ссозуссасас сезссассса 11340 чаєссувучь ассесєдаачсь сувдєсстасу аасстасове ссєзпацесе одаєссвета. хщ400 чсевасуусса сстазсусоасс чЧевдасксосо сісоцаствоа сЄвеодечессв забсудсодо 11460 азасвостбес бассоссеасо сеосчасесав сстабевесиа сбуааасаче асо еє 115320 вадаскссст сссаддаваа саоасоусса зазаваєссся вачкозочео сдесасадеє 11580 сксачевсоє гдсодазчся ссбопесосаа чесєдсовастаса саєсаасЧеч агодвадеаха 11640 вассаїссоваєс себаасавов Бакчссчасс стасаразас всасбавацє або восве ТО сассзасаса ассачстає сесзасвсчєЄ зсгасрассє седачасехюе сассчеодцес ї1750 чеЕабсьавис чуссесасаа вабассссоос часвдасввке БЕркааєссст павечаниса ТУВ2О абабчиї:вис вгаассссяЯ саастсечос сессвевясов астовчаєчеоєс чессесоо їн чсстассаскс свакжссяса авкебасаєсу сассгсовава атгаааваасес вечесаєкеся тт94о вЕскКавасає чіасасссвс ваззвасцає абсбсовазо зазсаесазес саварацессв 128500 сЕсасавваї засавовсач звгасезрачі ссвачевава зсасдаваєьЕ акечасгосах що чквсанавсс вадазвсапов с савсвассча стасарсвакчс годтасаєто сечсадатов х32190 звасаєсучаце зобзгаїкас зу чсазгас втеадчодусоя очеЕБебачс сассечесаа 12180 чавесцеьса яасоссацис Сачессавчє зсасвЧасаєс асзевакевіс ковЕксасче 15240 ічоасвасаз бЕсусассвв ассеівсса росаєвсаса саесосзчаває саспссавово 15390 засасвавсв ссавасооат зезчассвсева сасаєсвава асобесосаа зусаскаєста 12350 ачевохстаа Зсоссавок у 3238 «210» 4 «їз 30 «ай» ДНК хаїї» Шеучна послідовність «вд «2835 ЧПраймер 81519 КЗ «зо а
ЕБосгссрах соцсовааса засне сес 30
«жщй» 5 «алі 7 «рійз ДНК «ІЗ Штучна послідовність «иа» «ах Праймер 81419 ВУ «ВОйм З часа ссодосававчи птасчее а «ФІТО» єв «їз» за «2ї3ж ДНК «213» Штучна поспідовніств «890» «да3- Праймею ВІДТУ ВУЗ «00» в гочзачоЧеса бабсосавва часе 24 «0 «ам ай «ІЙ пПНК «вІ13» Швучна послідовність «ий» «й23» Поаймер 8Ій19 ВИЗ «або 7 чегспасуре зсодчачадьо вра. 4 «вай х В хаиї1 З «від» ДНК «йР38 Шежчна ОосСлідевеа юю шЙщИх «-т23У Ппраймев З уІнЕнаОї «а - В поадосстех зассгссваво баскеооє я «МО з «віх 30 «ій» КЕ «132 Щтучна полі новВксть «кер «да3» Праймеюр 5 1ВЕВО-02 «4905 5 ссссвовсса бсаскіссата саавостсса 30 «210х 10 «е24їМ 25
«Вії» ДНК «813» ртучнва поспідовність «Ох «ваї» Проаймею ДЕШВУТОВАУХ «400 10 сууссеаца Есассвобео воасвавос жа «Мк Ії «її 8 «2 ДНК «й13» Штучна послідовність «Вей «ий Праймер АБО ОКУй «00» своезецсчїс сСвосесавко ассзаєда В «ем З «Ії» п «вій ДЕК «рі3 ручна послідовність «й» «ва3» Праймер З'РАТЕНаЯаОВ «00 І зесссросаа чдесавсква о «10» ОЗ ей «аз ДЕК «13» Штучна послідовність ший» тва пПраймев З'РАТЕВайе «пох 13 ссачруадає садчЕтасося Б) «10 та «Віз 1Т529й «й» ДНК «3» Штучна послідовність «дю» «т23з Очікувана поспудовніство трансформаційної падії сої з582,.814.19.1 «4000» 14 ссзасвасов соззпасіва састасвсва зазастточа чззасссааце ссасаасане БО спгасучаєда Бгагческсся асекасовау себоувацоава всаавьсаво сабеБУЄКо 125 басавссоди ацалазаайсе СЕК Есзесає сесвосевво ссвалазчеє ссзасваєеє 180 свасассторо асазассвса сосоззазава заздвассова своп ава чесасеовове Я;
Бокасасску згсваадасьс аказазасса кссодіасоя сбкатаєсєсза саваздасасає зп авкассксгося агацдцоссасс часасазувйає Сссасассга ачцачеостсв асісачасеа зо йспассваве дасссассстс гтавааствах бассоссєса сесоассоса совзаваквай 470 заавкізасває авагасасаї зазазвасває впвасскгасав авссавсхсс асастассах ВО кавескавес Ссазасесса ЄЄвгесабса Єгвгабаваєу адусасаває Зааазисаса 5аАу вісзассссв сассазаваай ссанаасові загсассссс авасазаєсв сесасвссса КеЗАК) пгасчасзастс адвагасада сссцулачваса ваавячвааєи саввавссає вайвсаєнея во аасгакаєскса скжетестає ссссозавстца аассвзссес асваєссевес свазсаєтаоц 720 ссоБабаде сваачіваса ааасціксвує забсассаче гГачсасасвес асавбссааваа 78О азадізатаєса гІстасавс тасвачснкта хавазавЧесє бадваседєда адестратаєх чо асчазсстає газазссаза сточасссосс зазсавеесс газсасваєссва срессагаса чав асвісавзвсоа завссусоее ЕсСтаргсасеє асасобаєве свсогакссса гссссозаса а асгагчочаскх вадавссосЕ агавассада БесЕвпдваса аеускорссса асассесвее Кого
ЕсСагоасатя скоса о абвессоЗе аксссвеаес касстезасі геаревзавх ТовО аЕвБтісазає сртасьазує яабссбоаса ааассссвав сбсакасвач баорьваско 117ло стасасвата апрбісвнтасс свасстогає ажтєдадаєсд савакалаєза всарсавоасеа т2па басвацчачі:с: стусовассза часчасєссдча ззазазсавза зсавсасцуєЯ засесессаєо т126а совадававнс ссвассаєст свасаадавва сааадесооь сспісодаві сосеваєоєсе 1320 всвасасьса гтчсобасеса тессвавнає Зазастссаєю сгагаєєтатч сасоспдасає 1580 ссвксаавсося аасссттсога бозаваівасс чезебасоса бседвасосоа ссспакссесе ї440 сдсваачссдод воссечавос авоссссосс сабссаєсраво КБесссасчеова пасЕкцассе і500 свЕсоцасва сесссЕевсс Есесгавету ассадсаасс адсассасов сассаавацчі ї580 басвсосоза Сзасссуайа ггачазвзазчев сесавссозо збсгасаоою сзваєкечеь їБ5Б30 србасосаса єсєдвтаєссдеє сабезцоассо бавссолаееє чаєсасоучоє босуаєтава ІБВО «вксссачсс агесссучос геазссрачо став ассдаз сазавасааве КозЗсасса 174 цессупасаа чечлссосас вацевЕеєсвас азаваасосау чосесодсаав зассдаскоа дво «вачсссіцьс часстосачу псавсочасс ачдосвтасеЕск сосствачає ссєчавевех но зкчсечаєтЕ чзівагоаасьз асдасстази асослдаграаа соссстесвр сасаосазвас щи срабссазваєс васеУсссвеє зсассавссуї бесСтасазві о стасказксв вааваасахка. 180
ЕсчоевЕсза часідавсає счасосостава бабсдаєсау сссссавата дааеосас и. 204о австївсасдаас єззасвасяий Чассвзавнесп аоппсассазва бсасссЯсеЕ всЕссавоЯА 21090 часбвочсссв созвасссаас асававатса ссасссосаса сазазвесваєоа ассасвсава 2160 васасссозас дзасастаавай зваксваавача аасусакває Сссасавсає чсгсасбаєсцчає вай заасадасса сесесссаво вазсссасту абсссасзау сссасєсуса Бсабебазає 2280 чоасававааз аасазавааду впаазцяавка авосасовай азабссгачава засасцаває 2380 асачесуслає човасададЧас ссасоцчссса агчаєтцєеса агевссвосю ссассогаєа, ай тргвааазадо адавсоасва сосозавлаз асабадасст савоватеяо газасессав дао пгоппссосако сгвсоейсоас соссадавдає собаче часчацісво овасааасчоу 58 сассвазвоьай счевдевуосо усасасвсояа чесусчесса сгсаасрсава Ядсвсялватсасє Ва сівосстсва ссксававаєвз васдспатсаЗ сосзазавсва ссссасасує деасдасуєс 2550 саасасасчє зксавкоесає сбассвостає касоссасся соссачевих соосесасо 270о ачречессвЕс чес сессвЕссос басавзаасзаа басосаааяаєс Свосесррсв іти савтссавчає сгсввасКес савзаасссса аваасстесесЕ сесеавессгс сстассечвца вай ксвацсдсівава піс чЧсвво соБрацЕсвс србввавосте сосасепткасо сссосерсдає 2885 сесааєєвоця бабасацьсст Єбодессаса бСхссцтвакє себдоаредчас асасцасиве 2340 сроаЗссвбов ссугсадака бсзссстваає соссдаєсаду чзаскссасва зеЕвссасесу зо зсскчЧессав асзабусчач Єсссусодав бавссасвсє Созаєссасєя абссссвосю за зчасскчзсЯ сбадтькста чспкосасоа ЕсчавсстУє совсвавесс засво 3123 чаєссваєсзвсв цассросасу Фаравозаба бесачавсса усчусуссеса савсвасвосо зІВО їсаасавааєсє Соаз«чсс дач вессісвасєвє зачазачава састччасає сстовоо 1245 асвеокссес стсостсаса адасксовккК вабесєдаЯчсе Кокс сстоеце асусасуєуа 3309 еожстоцсес сеЕспасосс асстосдпазсв ссассаєссо ассспассожт аусспертесо 3360 тЕСвесадає Єсчзасавеся аеЕсовасазча зчасезачаєс соскзааааз аабечацеса за тсвесвасвсс себгччессо дссдасаЧеос асбчавассса сассувдацчеа сесечсЗацє заво пизчвасссва спсосзаасвас зсссяассос зоспаваасчУє задовоссяс свісссваса 3540 касасзасоає ссстдассаса пдссаесваєса ассссассов сассвецюськ плачаросссе ї5ТО сросеЕсрсває ссасавісавз зскссаваєс босасссчат спас саче чок. 3660 сспссоцаса водія стецасаїтву бсевсБУуссава савссовассвс авояласкся ко ковасссуає бсассостас асоваасакєтє чессадасас сбасавссва зчайскозаєа зва всегевоаЯу сассзавасс счесвасоуа сааочіссав сезоєстачя задово ев зай сСасксавсоє доссзасаєа збсдссосев босесвасов часа озс асстасссва 33025
Ессазвассао сісссавесє асаачддача Ессасасстє сбсеваєсасв дасчасвуєєе 3950 садтЕвссає савсасасоє вахгазсєксоя ассчіЧесдча чеЕсеєчасесс всассассео 4050 авЕсссаєаса сссовсовас бссссесесву Сдассоссуа застастачя всссавассу айво сегецуадачсуа ссассрросе ассесссоса асассасева свассуєвсс вастссессає 4140 петасодсцас сттевасесе засодачеса собддЧаєстеас здабчвочас ссавоуесве щей їссасваває секоссазає сссасосссса бсазвочава сгсрочусває ссвсассаЕс ча сІсгбаЧчЕсс часпачавсоя чсессссадче ачассрдасає саассасасс сссасаєсса 4380 чавасачецдоа сассасссас водсососчасо взатсссвсо гевасасавс всоузазеве ааво ссеспазасоца ствсесссак зсастевасс акасеасеве ЕдЕЧеОСстУЄЯ ссспзЕЧаца 44
Есачечоссо авчасєссссоо аавуєассва Содєссісвся свссовсечо согоассевсяо во ссасавасас вассчатсса счазЗасавсса сеосадатссс стхоЗзссзаас зсасасасаве ава сЕсвЧескоЯ авссасачсв пссазЗадцаєс сточакссає бассодчадчаєс, век сссадас ї8в2о асасоресся надуссаєтх зссбасасса с5Зссваасвє саабсудосай сексоссвує ч580 зЕтассусоас садавсосоєс бтаїопексса ссассавесте свовассбає пяссасачеся 4743 стчосзаваз пасесссбсасі сЧгсачссса асавцаєває осдасастдзє уаврссатеоа ВОЗА стассссадес васостсогає сссассаєсяа асассозсаєь сасосрососа асчачесаое «во ссачестсас азчбссосссв засасссссв сосесуспсва ссачасовкас ассзчассоусо 930 смачЕсЧцаЄ ксслеутовсе песасассто адек Чацес єдасесодчаєт сосчсксача 458 апачсспрача сусЕсеевво ассеіссссва ассачасссоя зссбавуаса чзабоссчассу ЗО4О астассасає ваомосесово сесавксовоа стоаваовосоє стссзасовс сесоусеете зт акуачаєазчаа ачасегусов чедвазоєса апсасеассаа дазасссстоє часопвавоаєа: 5180 асоссчсссса ечассссадсе Сссадачуча ссавссасса акбачаєсяє усасочача зай
Чдаїсавссча сабзесевсої сазвоечачоаст ассодеуєтасс севасачаас басзссасає вива ссжЕксдсучає осесцасцао бчсрассови сарассесьв ссвсавсаиса чакдаладєсв: ЗАЙ адессазавче скасбасааєча сассасссса сасчуєсасає Сзаачасьсюв єсєвачассссу заа завЕсевсої сабсацвснс ааезссаває есзасвсвої саасзєчесь Збазесваве 5іво сбискободис астсссасоє ссзавоссесса соспчсавася басосаврово повсарсво ай сбссстоцю сатасасУсс сассчсассс ассоцавсса язЗасесссаас часа сев 5 сспісвачає сазазчзасстода засаосссасв сваззсссоз савісссзва осесозаац оо ачаззвссаєсєє соасвозасзваа сесосссоса часіпдпасай зассзчачаза ааасоусвасю 5700 асазпасацча савачесачач госоваасаа зсассясцаса саввсазоасо аавзуавкссва 5750 сЕЧатасссс пусесечаас соссватаса атаспсссст аодсопвовсо васаєвасав 5Зв20 хдастсасчс гбапсасасава асадусссаса чеасесасув восасаєсст сстоваєстосх 5880 састзавкос ічасуєсває човчєсавеее пксазачачеє суазоичасас абсресассо 5940 ссесерсссх чевсуаєоса водвасосся сбаваозассу боавссссавс ваасоосски о що ссецегодчав гЗзепаваачао сасаясзчатоу бсосвауачсв чЧчавсаавссвс сзуссеєассо або ткотоосеос тзацдсроцдсва сесчавосс сасваадавчє ссососстос сесочесоєу 5БІХО чесасасеоос Єсасостувдос Чеєсасазає васзстасау асавсчзетеє чосасосвесо віво зсчадзсаза чавсвасвої засозаєсча вагісацсаа сЕцсобкдач сазвавацеє що зсссавасва гасочесаєст сасваєсасе асассчсвзає ссдадавчач сасдаослчса 530 сттасвдевее сецдсвассав дастасгоався ачестатсв чассавссся бесусоюса 63850 січаєсаєос Сссасесьаї сзачезавад сасасвосда сусвайссоє часварсеве 5420 вБЕЗазазсаа свеавссехає слпоцчассаса сассссесос васкеастваЕ вецассвааа 54850 адскосдачса сессссссаа ассддасавоц Сссочпаєєда сзсаспауав ассдпазасев Бай сасгтктавачт счассскаєч часов сгоає ссесосенаца чевачсасьс воссеванвса БО сесзаассЕс сабсассавус аква вЕкра содагосвох задеьсассяс СЕсесславу вешо свахеесоє СсрісссууоВ СсСсБавсвус еавасстакс гадазасаса свасвевесвх БО крозсадеоесЕ сісузпваає счасегчсса ссвоздавас сгасадавайя спасе еое ета0 «исавіихсасє сбвззасвтет саставссвєс чсоссбазасбса осо ссзчЧас саствсдеве вва саскуезцчасо садавоааєса чезасасоза зкасесусве сассвточає айсксвссвеу 5900 завапссаса зувавалосав всосЕвсеала застчассва асазбраслаа сасачасава 596о чЧчесасосаса ЕБсаодасає содсочадчає сассодасає сазасваачає сасочаассх лаг сідасачцач сасуссстса аксседесса зассодсвуєс Чадавгасєса вассцоевсса оно габоссаччачт сучассаєто ач сеЄс спасе сос пессвдасасєт зувесссмає 7тай
ЧФЕкЧсЧоссЯу свсЧосцдаа асвастітІтт асасававоає хассасаоста астаассцяй 720 сЕдДласссазч зазссааста сосзацатує ассассвазча чссодасесе сасочованя тва зстабччаво басгасосза Четгсадовас зассаваєса асахасаваса сасабасаво 7320 ставузосва звасцавова гусасадваса саадаєссста сасіцесада агасдавцав УВО завасасчова взагбсзЗазаа ацазчаасса часчаавзааа чвоздакссса зчаозсавас за аессЗасацев зсаасузава заадаачасєв здарсочсав ссукочазазчя сасесаЗвс 500 зсасвтчсна чзесчававах піар асоя зайассваєссь сгассасавач заасесюаи тавБо сессастеасє бабососсоса Басспеєсоо бассасЕЕЕЄ ссесссоаває втросграває тва пвпоавссва чзсрозусаєс счбдазайсв ачазваанасє сосчсчсаваєс сасрсоевое 78580 чаачсассовз часасаасс срачачазио гпУсавовев задає сова свасузасав 7740 спавієсосдас агсаасавуї сеарксосга сваєтсоссска васавессств азессоаловє 7800 чессоассаца дез аки ачасьчасів сасвостаєс дчасассксує суссвосеаєс 785О ссваюссссЕ ссоссвуачії сечсосссоу васецечивсс сстоскродає сеостецчатає 7920 сасесвсодаса абсссбадіє ссресусався сзасассрес сеЕсахасача басдвоссаасЕ 7850 звабсавассза асдавсазаво аасссоствя сдвасоваєсс авеєсвазчає басавучсоє ово сачсавоств бассацаєєс ясобачавбсо сЕббсдачас сосчавосаєч всссзчаєссяй яд сесодссвса азововосача сеосасвссса ассосвасчаєс зедавасавсо соассзассає Віа сосаассссу ссосссуссяп сссвадзаєта ссазвосссог ссеЕсабеса сабасосаса 8220 дчастассаає сбосасьбаЄ содерасеосею счасосовсс звусссазаєс авсЯаозсоста ваво сЕссоасасс усвасстасса абазссояаскя сзвзасдасссоз астачассса кссасаваєтга 838 твпесчаєсстає чесусречеб сусгвсавсаве часестсуаа соссосєстас зЗассодчавос ва бачачаєсоє сссасчсаса ассачессва чсдасвоссо асассваєба бБосстадцасах 8ако сеассосссесо ссбосовасї зсдассосво чодесассов абесусвоба Багсасавох 85850 частодчосва віссасаєна ассесвуєеосе сдадоувассос дасостадчеє сосчаадассс 8580 застсазаче асадасасва чосвссастаює бсозвсвостч арочасасає содасазтає бай сассвсстас ассчасчсоє ассасаусса ссаствсьояа сосоаовдвестаєс звдассабаЧе 570 аксастесв:ї зачсгсссва зассвоавасє сасЕтесссв сссотассдоа скасаодаева 76
Басацессса свасаасоцса СЗЗ сусссв асссодесау пусасебаса даасескагто 5829 сацсастсса сабадцчаває сссрсаасає содосаєсзаєс азбссвасалє бобсрасочеє вав8о
Есасуздався озаєссасес вЕсдаасссо сесаавісто ссаксесцєсу ссбасацнав 8540 чЧадесочааса сссчаєвуєє сосдасдадає сосіссасау засвасласу гессасераєч Зо асаачеочЕсс зуссассчеє ссаассасоє чессгабевксо счскевачеє ЕБадеЕвасаа зп6о сацосдісазе абсвсзачаєч сєсгосрасУуєс сссоссгоцчаєса сапгссосаава спаде сскаа Зт5о свасасавис чсвкосовся усассасьса зассссадос чзссзазвоза асбрвосе зт8б0 кава се чесаєсссво чассадевиє састсеучачає ЧасксуУуєта чесвчЧавево за сЕссудсвас засаєсовдов яседацедта забссазоку сссасеоасї гбососавбодає по зеЕстасовова тассасасЕс зеокавоцьа восссесаєе асосетаєсо ассусавоя завд сазсїсзаоас азветссєсса вссссбссза савбассвоба соЗасвуста сабсоссеоча за? павсстссаа гесгачсцаєт седчаєбасвс сдвзачьочєв аксдосстеса себе сосе зано заосавсаса зсачесоска завассоссо сбдвасеосо заасесзасаа содасодчебе 2549 стчавсссвоб соссУуссассЯ савссчессваа чесачачось чассссчава чЧассаєсзова. зева зласустчаве черево сгссчсссав сазасочад сповзасасат асо своеаа зей ссассвсаєо чассзосзсе ссавссксоб ссазаічессс есовсдаєе бебагсбада ато сдвдазцаау дасссабссу азаачеассва всасастаза сопазсвачія вЕдаасчоава. зна сЕвасссевза давсссвесеї сесабоаозає слпасавцасаз сізаєсаєя даєчовачод з84о ззсасоудас ассассассо аадсвоУсча савпчсаесс авазачавсє асуссвевеє зо сЕбссавєасс сессасоаов чсрассосває агасссабяс садазовсау агуваєсчаа 980 асцсававуєс гасасаачає ассачзесоау вчостасаєс даздасаоєс авуаєссьсача пого закссвсссс авсачаєсаса асдосадаса сСлвчЧасваєс ватчсдеста пдасодоксс 13085 астссодшсса србссадссс савдесссас сбудспачооє посссаєсавс сасассаске 10120 стссесссас асачассся дека сасодча сосдчаасуаа часеотсУлі:ч соказччаєи ТО сЕссвасато авузотсаза агозцосастас сзасессачас васссдчачь гпостастьаца 102650 аайссвоссс чсссазцавеу сесксуссавш ачтрувадчачу песгсдалавуеа звусосавоота тО52о сзачазчачай вачссссчавк чадавасвва саєссчсоакас ааапавусса вапаазваса ТОоЗо сдасассосто сеБасуаасо сорсадсаєцча Бадусссосва десчасасса всаксауєває ва часссаєссаст чсаздасазас дсаессвсач састсоучав зессасосес сгозасстає 16500 сесзаєссст сУсабсваси сочсвасссе созачачесвя чавучоасоса сосссвассцо х0565о астссестЕта бакзакоста уодзасяхеве саваадаасову дасебсавса вгочестаєе зе» стдерддває зссвадоаче асчусачасує зоаасвасач васавссаво чесосУусее з6680
ЕчЕЕовсссв чаобзачазу свуаачевко зсеадаачьо ссбчбобабс сбодеесУєоЧ ота скасаєвосЕ сосаскассу сусасаваза ааддасвсода чаазучесасу ссассватаса хо8о0о счачаєссвас засавсаєсо асуасбсдава Ясеєсаосває сусассевсоя вудлацуееса 10860 сссааасвпає ассусавосе зЧозвасчасста састадсчуасс сдачвочаче асчпачавсає 0970 стасаєввЕсЄ сосваєсзЗач заїтасуасою аусстасчва адсавссесе свагсасссцо пово їчассасаса гсзасстаєсх ачзавозачос Єбвсасссво ссасасадаа асаабссьса їТо04в счввЕссавс азлачастаєи сочовссасаєс ассоссасса Усссаскава ссассавача ї1х:5а сЕтачачсає сЕсСссСадааа ссодасавучЄ стодастоау ассуєасчнава соззачеває ІУБЕО аспсвссеасє часалсосеая взсСсасссес Закузчадсеввй сзачсаарса дескоаавсвєо 11220 стадзвосссо Чсстасссатс зваасстяєє палчаваслсв савсозесккя ссосводов о 11280 чсегосдасави сзасссообв кгсасазадає сасвавлава сб бассткУуєс сксаакрасс 11325 пгтасчасецє бассвасувс чсткаваєкта БКЕсЧвсодаЄ сассвсочови саулекаве То часзасасса оесчвасасуав агасссосва састаєссає азкссаксвя азаасссата їіраво асввайзсва асуссвсасу заксоасувла асавсвсвва засацчцаєвай чЧобасосаєса ї520 кЕсассаєвєс сопосчадчає састсвакає Засл задає сассеваксьс ссовсадцуно 11550 сакассвЕвса ассовоосса авсчесвоєе Завасаєтся асєссусссста басоасацаае 116545 соачаєсеаєьб асеусскцєє водесусаст Єдбспасаво сдузоуєссвач Зекоссуєсоя 1700 счсцссчасо сааскссесе дкасазеачее чесосодсся сстанссаяя сртаваєсос 11765 сучас єсуз авсосУчесу ссбазесавзеу чесоцесвоас вусаваєссса чазоачсваєх її85иО асссзачаєч Ббадсавсосаво засссаасєчс Есассодоваа зассасодай зрассавота 1цявО засісвосав чаадсачаєс васагчсзос васагаєдсва сотаєсчется авайєдавов 11540 вагссасачає асаздасссі асассочссва ласасчзада вузвасаєста зазассдайа 12000 зазчвачаасс зоссчазчуаа авзоззавссссс чачасосаво сасстцчассас аасавнсааав 125060 ачавдаасає васпчзсвоса ассаславає ачасаєачач пчасавасаса аодзсоадзава 2120 гчбавозасо Чааастаасс сбавсасава созассїкає сесссоасстас СрасеовБе 218 асассЕсссо зеаксвЕссє Соасесвеоаа Ссссссваба газссчавсса воабссудсяає т15240 сЕсідазакс азааанав: сподесасава сставсебесе ссвачсаєво аччасаєсаве ї30о їссвуадаза ссБОсавосї сутловкосс сасСоаксссся задазувчас савтсававе 12350
Кадоссацесв всадсячесчЯ асасоцессоєс сдосссослаб абоцеєсавес аксасаєеса їгагО часУуєстаса зосчвасссса чадасачачес васаавовоса савцевсточа бочасчасо вав ачачвсаєьу саачасасає ассеєвозс зУскЧесуат Ес авноовава спе оУ 12550 бабецсббає чесоаасссб дсавачоаєбаз освасоссЕає чассоцасає ссчЧазачево ї2800 вЗЕСсВОУС Ксасакачеє аксадачеп Чоаасссвача Ессасаксчє асасасаєсєкх тео
Ччеєразосев агсузодсос авчусоссссва чого Чсбуссвгаз пессессада Т2720 с«чаврстасроє яєсрацоахсує асцацдесесе уучасасаса чессеуУчаса састчодеос 1278 чеасецчавсаєс васссасччса часозчсавчв сассчаскЕЕ ссзсваавочеа ас сцавЕ 12840 чесяачекссї ссаацеосву стапбссаує сасссачатс сзасасвоссоо соваасгодчає 125955 стсвасчуачесе Сабуузлоссса чаєсісодає осассачеаа ссосочссао сасоссдава 12950
Ессдсоссва асктачасаоє сосссацаєс озсоцеваса чесгсссаце Зссассссоц 13020 акечавсста соска ссоз вага сасу ппазоочсавоу сеЕсссесЕсса Чеввоасацча І3ЗОов8о соуссвааца вассозаасе часпсезчась асовстесса чесссссосе свачЧсдеко 1140 чІссзазцео сададосаск васоачодвоса авосаваааттоа косзассова асазаакато 13500
Есчасссрає чкевазсзаБає савгацевкас зЕссавсаєв авгасвастса фсасасвсса і13л6о зівасссаств совессссав СесОсБЕсаск сптодсссває: срзасодест бсасовавата 133520 вебсесоасо всЕгтсеЕсе засссаадае дааасвасак чксассввьаа шкЕЕтОоєсває 133859 спісвкЕссасс асвуствавссе вадбссастст зсчесеоспса сосаскосевЕ ссгосвтааЙеее ї13За5О гасарасасе Созвавнесав вазабссврсю васссавееє адасасчрає ассресвада 1300 автчатеветї гЧававсваає «гадсессава сапоубавсчв павдаатавив зчесачУсає 3563
Какаусосав бослававсає аевсссавев асосавассс взасссачаа зсасепеваве їзв20 аасозас св ассзуссочеЕ всассоссчї: зчасозаасда созазечеде бассабовоо їз бавсасабацч сцасозачес бобачссасєст чеуссвочасо сясссаваєт сувозскадс 13750 човсосасас адзсасасас ассасиссає говзсзесссча бавсазебас сассвовосЯ 11800 сЕсСссвЕссяа сачасосасє суазаєсадс савссегада сваасеавксаз зсоудчасаєсоа їі3869 сЕссвасаса сСсазадасо ссасавасакч асасссвсса асесптатавс зкссазцаєса їі3880
Чісазазсвзо авазаачава бабсрасваїс шсрососсорое асабсевсста асставалає із3а8О асаассстас повосограва сссасаваав завсасочакс сСацазчічьчу авасассває ІЩ4О сассавсесс Естсасассх сваєсваєсо чес ЕсоасЕє кБасевстаса Соебвекосте 14100 кКасптЕссса собстаєрса вабсстасста ббсеосуачко асбсасресев геЕСсКссває 14160 асасоссаве бгассьсіос спасосаєта аеасстасвоса бассоассссо звачсчуасес 14220 забассівсаз Ссбасасесес сссазасдас чдасасассо авпосссвась сбексєсатсся 14789 ачпсвстазвьЕ Свааасєтатс скпавксоаац сасасабаса сассгтаата соте Еза 14549 сгвсссссвза вобсссстада сс ксасасзакч баауасасає асавассаво 15409 сзсасстсава часвазаску ассвусссос авагааларав ададааочає ачссагасав, 14460 саграєваєє загпссасаве ассбасазск сссваасаєь бавтсссевс сазесвадчеа 14529 абазсібсва асазавісаз дазрассвес: ссабасісса аасзаєіває ссакссвсза 11580 савазісцьс Каса сс вассдассає гахсассства ядсасавссса адбсБсвсве 14550 їбаядсасва сіскрачеве сдавссассс часаесосаа ззадцбескс госдасаєса ї14700 шссбрссясча поасазавссв скчєсвесса ксСассассво Бтавсссу азиссеосає і37855 асгасттасссе сСстсесасцає ассрісавад себосавееє посссвсску говаассва є тан сЕвааосстаа гртсавнак всвазвсааву ваглазвосаа адосаварає гбстасувак 148850 зуЕссссада седававоцча аадоаваєса сабдачасває звачссвасо сссєсвавеє 14355 ткпсосчсовтч стасссаєса басставаєт сСкаєєссто ссеСесвЕсСте СЕКС сСсКеЄ 15109 кассеачауи:с басиссасає засгаассва всссвадснов бБесасяавссь сесссасава Зб їтвасссасст єскссоднчч сасарсцеєс аксавесяата часієсспвоа васала 15120 астазачеї с сСаессавеса Сасссавсва асоусавсоє бобассавсци Зассдасадесв і558й0 аасвазсват ссвасстаєа ссаздесасаа авцодвсасо вастесаєсї сдавцаваєсе 15240 чавсвоссвац. чавссааца ктчасвсасису пессви вас чдеспсассвас св то «2їйх 15 «2112 10217 «212з (ДНК «аІ8» ЩШРУучНна послідовнієть «ай «иа» Песлідовміств трансформаційної пенії тої рравнаєев.Оа.ї16.ї1., включаючи 5З'-геномну фланкузальну послідовність, рИАВІЯбВ-вставку ланцюга її З'-генемну
Ффланкувальну послідовність
«400 1585 спассчесца асссабасвна сасодаєссеє зас еЕсСсСасс собесасовс Суавессаєсе бо заазсссзас свессевоста пгассоссоса кекс рссаве ссазссвоіває саалаєстсве 120 заасоавасса явсвстсаєта ссагвакасо песо енгава сао кЗаа сзаєсваякає тво ссЕїздавав скзасствада ааставасава аававсвосса ссасозачаєх зассусайох зад зачасстассе акассясавс ссбабасась сстасвазає сабссесссв вБгсваєєсеє зп їваєсаагас сссавокаваа гбчайпеЕгсаквя сстасссвс авачаїхесе агачусдеся зо аксазессвое созкоасавеу асвастьсото беасаккосає ШЕ саЯикЕ подекасова 420 сечадасвав СКОсссдвч асавасісза сеЗачазосо ссосавов сесассасаве 45о стачацаасих ссахсвассч агазадссаса сесоссвас садавсвосдав сасстцавУує За аскваєстач гУусевеат сеааесаде асдостсвае сЕБасСЕстау зеЕкцасааке во как ацесо басСссстсоє сабзьодаче вососсяаеч сасааєсєсес сасвааветЕе Ба каствссаєт сасосссва сссессосвсо гссстсваяат сеасачксса вЕсбуссава Ей ксгаавдцавода. сссдсасеоч сдосресекс споеувсеве богксрбасда седескеоєе тва засвзксваавтс асссосвсоо осссеасо асабасайааї асусхавось сасасвеаое 80 реєрссеЕсов зссавсосксСа хгасавсасеє ласка ске дФазасавсає СЕС 00 тассвтасас ассакоссга агазаасссс десесогсасва все вососессза зей сви ссбас зассбасаста сстастсааза вассссааєц сассосвасваа ассавсесев 1020 зкассібоао сосссавсса батсатасас соазазчакаа базасбсавссс пасссесеєє 1980 сбасассва ссаЗзссааз авсесссстса сесеєсвосо здстазасає сваєсчачева її5а асаїссаксва ацопсацчцеасає зсчасдчассо васссстассрс сассасасає сазосссосає 1200 ч"чЧачадавс васссввассо ссоаасачева стссасссо совсссавчя срастааева 1250 сасгакасса сесесосчеча аазчсвсассс аочазссоявс сеобасусач арассосроє 1350 саксцесасс едасвассевеа това задкочесва асавесзаса завасасаєих 1380 зваставасс вссаавеос асасвосада зссваановос «аскспачкас сасасасоск їії440 астевначаза асвостес двесвезакс ватасачесс очазуєсесва сасачвавує. ї500 саазсесоца адчавуачасу стеадааскуає бвуссваєсх чогеассваса воудсасося 1559 песасосиет єсазвзаєссста асбсвавсктсас срсвацавсо аорсоасесква часрорсвсяо і67о савасцчасісе чессоогІсе сесаспсасаза зсабавасса сасвастоссе сазссавсга те саксстсзаєс зрасасрада ЗІ БСсссСаво свасіадаая сзпуаааває ровнсвагосво їТт40 аскекеЕстовтв усковсодаає авсаесвіоче ссаасессо постесассвоая с сасаса 1800 асссоасаво саадчсссає зазстсосача десошсавої асвасцачає садсасадає 1850 ассесасссе савусассаєс дсводсавадо сусоссвова савоводасо засувасває та заксрадсас сасседаво: ссазассстса песазссева асадессаєси стревадайс 19580 соссс:сача асаасечсос ссіссасссс часовосваєс сесесавсао босчкессасо 2пай зассссассз сасусачсса бадеассавс ссоапасассв Бесессстца Борсещцеоосо 290 спссабдвсса азагазуаса састадсосе сссвсхцесе ссвассуача впассасовач 21.60 зассдіасаа счассзаста асстоадессса чгссссазта ссладочссс гасасаваєсцх 2299 саваосвавеЕс аачсестоссь васавосеоує Казавсасце сксаасеореа БЕК дсавно зни сквусосаде Єссооедаєс айссссавер зосекечЕде одЕсстдссьс соспеваєвеє 2340 састосясвес сеасессссс сссаастаса Ебасзодчайа аазаваасоєс СеЕбаєсвасо 2405 зостассаза запсачачеос сс сазо вобссссосса сСвасаєсесса севозакиса 2455 ареЕЕсостЕт сасстосаза ссвеусЕсав ассадодаєа асаассочсе аолезавака 2528 сасчзсассе ссрусактаці сасуссЕЗаа апагасваєс аЕВсесаясс сопагаасаве динО ксазаєсасєс всоссбсярай ссаскачесв ЗквЕшсасі сабасссова боссосвове 2540
Чевсевчсся савоссваака вассеаасата аазававасе гававсскає сесавссава 00 спвапазасиє всгсссаваає сасссавцса ссвобовоса ссассвсасс аазацскавт 2756 сесочнаєтас сСсуевассач завусвсуса ассовецчьс зсСадуссана сСбецресссвка 2320 зесцтасваєт ассасстсвос зпсассскавс спасає асондссеса ассаайнаюс 880 їсвасбаваєс Есодссеває ссвосегасу агбцачсаза всзавссода вссавасоза вай звасасаваса сакоезчессеє асасасасез стесавзчасе ссссвсасва косо ава АНТ далавгассста дпазасассса бсрзассссес часакатаве зЕстесоЗссаа асасчавоге. зЗпвО екссвигксє вксаасоссв васвассосе Собаеастаєса совбсоставсо ааззастасе Зо вазасцеасс вас квессссвка сосагасеавс вазасстасс ваза ска зів тасСсаксестс Сезчадсссля апосчвазосс сзасвасссвз завссаавоа дсазсятавсе 3245 свастссвозб авссасактса сс сасвсе бзастаєтай аббесоссав сексоанасє БВ) згасассвас давачассяч ссдвавецаєс зазасвавів ахевосаєвє зас сазоа з35О аавксстесс всававактак срстазсвово сасгасоссса Евававадає Баасвескає заго баагасасає ахскеасстас сававарскч зсдавачсвацч зссвазагай баров сва завВо зсававназнада зассвозава Єлсксадаваєс ссоазчсвазас ссаассавесс сСааасецата 15 тачесоссвкє очЧееєцЧаєєс Єсасосазає совассвасе счузсосатес дсаєсссоєва 3600 ссзсввсвас сокаасацте сСеасасассв стаззсвас пороссваса пессогаам. завБо
Ессоусааває завссазшес гасатдоста беабакзлває сєстазаласвач ссссаєаєо 72 кдчтаавкасо свасстаесЕ часгсосавааз заайсвсссса азтбасгайсв абоосецова 3780 ззазовачеє бассгасчає ксасаосава дссаддасас вассавассає взассдвсва Зя4о зачсссцала сгахбасоаасу аасавагаєс ссгаалавва сасоаосвасов сгтодвасай 33600 авчавачеса Гага дессгевавс вадсаєесес сегаваузає додсачекеке з960 евжкцеасех аастассабоа свБоепевссцо сасайнавс Есадассасб аобзучаасє 2080 тсбрсесавза агачесосса ссУусскаасс адеачецесчес вкасссоєс влпсуцчссис «о80 асазцескУує асавадваче вайсіссоася шбсваскцчаєс даваазчоссеч годзессчса «150 сассовасоса ссаздоасасс сісасессаавт асо ссаась сізссаЧаоч Єтоасабцадо о кЗассвссса чассочаса ачсеососке сесасасвва восрасссай зозавесове 1260 чечевасзакте сопесхасву ассавскаає адвазавсає састсчеваєь соовасезчаве зло асгоазесеса ваагасосасс воддесссвез гавдасессає счахтагассв вассвавсавс 41380 авуазвсваає сочасісвсса зассасссас сосЕсраас чаЧчесесЯЕ сассвасссс 1450 акасаввазче сактаксста позсавассва бавссасавса вазаєвеоссв агавсвебаа 4500 азавазкттазав дчазассовга зБЕссзсдах зсщсвБатод всвавовває пасстекоса 538 ачзавазсссас зас ссаов вадсссасусса сассадасай асцусвадаа завасаааава 1599 йцававачала севдассвеща зуавнсстасч вазасасочав асасоасикса врасастьосе ї580 ассесасазов сзасовісше сдастсссво соссассдга сакссавзввай вгазадзецає 1740 пасцдесвава авагатявнас сдгсвасовсс зссаавсссс аасчеассаовз сосрассвез 4800 зссуссадва абссчсоачест ссовоЗацчеіс вчказсаваає сесаєсввач соч асадо 48БО сподсасвсаєс чачссоресс сассвасіса азадсасваз? асрсесссосс вассізавад 520 паздосаасе адссавазає авссссосує чрааасвася сісзатасас чсапсавь ачяО зесагсассс абсосессас сдссеєаасс гесесуєдає ссадесесос себе ве 5020 сЕссссвссу ссбасазаао аяівсссаава чЧевссівевб сасваєссвя весссвасьє 5ІОО сісававтсої саяавассБЕХ сесссваєес ссестаєссеє свбсавдата вабессптуса Іво пЕсСсскайтв бсіспазавьс сеЄсдасвЕБа впро сов ассесазссв собасакасс За2о ствптачевгта часрссассв арсессачасс чазчасчуасе стептозви чассуевача Бдва срассваєсуса асшстсовсУ азочсссосаЕ зазіаксасо ссвсеБасК палатка 54) ацеЕсЕсотса васаваєкаст ссстрасссо сдзасссссає стачасєссав состав ке год тазсеЕксасоас сдассвасєьс зссзасєтає ссеоавьсеск соозссвасз часзссссса за -чессачас саскеоссаа вассасасост ста зссай сСЕсоцеакасс всадусвогу ЗВО чкеасссвосу поссвясвзстсо Засчасаско чего чевас гпебссвасоса честоазсссс -тво авасасосасе севчассека ссковбосвас вассосадеєва сбассаасад аскассвсеоа вБЯЙ стааасзчссг соцвосааес свое Усова ссв свобоссясс вбапссаасу 5700 севачоасвча сазсасвосо сссавосасо есбосоосоча ссчцЧчасчає авсчаєчайоо з'вий тсасишсаза садсабчеєс сачдесвасосся астсавсста сабчосаєтис абяусссавя вий часте сассуусадвна ЗЕ чЧссссас Сава чча сацавеостяє сЕсОсЕваса зова тсводасаує стасчавосо сесцасшаце Ссавосочеде севсогрсовое сазацчєеса 5940 стсевсвсосе собвоасосає соссацацесва азстосдасе ззессадсову чдесчсаєсвх БапО сстасасазе сассесаса чясассавосу сайссоскс сауассаекч чесаачвеус во вісссувуво содавоцесс вадсесресеца сецубсеуєта пасссасдес асососацея БІО
Есосзбчевзас созаЄсвсва сУссбсссКа азодаєєссче сзасроуєєсе суссаччєсо 5180 сеазачессв сасгсСассав себочссяска давача себоочсавс адговчсеаси во кастссасод сУуссовассо сесдасксса вакрпоессасу гасу сасесовово 6300 севскіодаєст сссзувавеї часоцсасся ссбсочеЕсва азсаєчссавчс ссадссаєсе Біво ачуайссосаЯашо сассаєсвта астсєсасся згцсястада гтассуєссв чЕзаакаса вага астстасЕср сссучдваске саасадсбава зсссасетад ааасасасва СаАСЕБевЕвО вайо овачсвечек сувсавссца бсісстассв базвазассзс завдавав сасссчесвео Бай авсіасквса зчассубуве мевзчсасосе свавесаєєь чзсосзЗечесрас сасчсаєває 55 тусдассово аасассадст агассавака сесоЯсаотає гассдаєсаву сбакстовав Бей версаєвача авачоваася гграсасодає сСовзгбЗаваса абасавачасє асасавачео вз2й дсосасвссс зочЧасаєсад ссдазаєсвс годзасаєсца ссзадаєсає соуааєссстс тні асадсачсає чиссксааєб сдзасссвавїі садсачсссцава атасссдааас счссссавахє 5884 човочачосє чссасссвює чсссаскрча ссоасссссоєс саасвізацза чавссваччєєх 500
Чедоссасуєс дседассеви сттксусасв савазідаво ссаддссусті аассаватох БОЗБО ааасоасссуч дез звзавс децесецсе аассазовшес часстчсадче дааЙсосаоуве 70 ччбвассаєс саачуасесаз свсспасваї ссваабеЕеса сосезалавс басочдаска 7080
Сракчтаачс бсачевацав псачассави асусодсаса Сасосвасос асосьсзайа туго акуаасваєх басазасаса адассскаса скоссвцаає зсуазчазув зівсчЕвава. 7200 аскзазазац взацдавдссазу содасвайао авесесчазоа асчсавусас срасзасаво тава авсчавадав ву3дазатват чсосцовс угчавачача сатауачсчас асахчедац Та сцпазазакос аацесодав еусвасссса ссасвавоза агссракесс ссваекасеса тво
Кессессака сосссСссоусо сао своас себсчасЕсс сесбакасамх дтавсюоаве 7449 течссаЕсос ссеададсацо азвавасссоа чессавцеха сесесксвав восассапво 500 зизвсвассбс всвчаааєсє чезачесєкав зчасссосає зссссодаат аадвадосац во сзаЗасвау досачеокасв зсаооссозаба соссосеаає сгаєтаєномх чебкаассаєх ща асатсечацас десбасвуся васессадда сасадссвоя аасассаєва чвосасаєсу тео асузіссаца дпдачуєсосаа дасадасасо сбсооссоює сосечадчеаєь свое у тво сопдссадвас госесасочсї содсосгоЧа асссхачдаа сдчессасаае бддасачека тво адвстасьоє ссасчсцесв сасацусвсіс зазудссчая есовопассю асассасаса. 7859 сасаєвесчесг саацестасо сасосусава сесесвавовео Бубосевасе себагацусо 7320 ггссвавоедча гсевтсгУусс ваЧЕсасасч азповссдос вкасаєвацос садодсасає 7989 касуасацзс боуасасада сасседебеузає шесасзаває сад сазаєчовасхь Око кедасіхосс васбестссв адассозчеса ччссаастас ссадзаєстса сасасесоца. 80О ческдазесс асовасеіває своствацау сесучассса стадіваєст ссоссадчеце 1650 псгадзаєсе дсссгсаасє возгачесус ссадассуце сусвлабазеї гегсовасасо наго авосссчаасє сассстаєксх акчссовавьо аУусочссеюия чеасавоясве бопосссвава пжно азасазчецеа ссавадуаає созачукчає десчессасу чесессачеє ссссасоцав дздо зсесекУучЧЕс сазабусбсаз вастчуусазс часасчазує ззавабуєсо часьокавсва 80 ацагасєчесс акссбасаса вчсзасаєса вусаєУсєась саєсаєтаває абзассаєтся наво «вастссвасях сасассасов кеЕсосвабає сескзесаусо зсеотасува дссоседвса вза свазаєсваєс сеодзассасе сссссссаає ссацчасава асаасасосєс ассасаассє в38о сеЕЧезчасссве Зссоєкаса счапзасктазач сосчсскасч чпеЕсоссассв ссосовесе нвай ахсавсессає абосасксса завасазава сосаєузсає гозвасстаза сасчсатасе ато
КЕссазачав? забабссвав вачалаваса чсказатас сівссчцасда дввасадсвацч В'ВО садзчсвЕсає адсссвадса ааавсасава сетсассовся сааусставла гссасавата. 8820 пеЕссаасзас сиссасаєс ячссосениса скоосасаоя соззадзаєса забасузкає вяво тахзазсчсева гасабазсасч ссУучассо даспсассочоа:; савчасессц сСузаасессоца 5840 спУусстаєсс тьа сасвсесача сабзсасасрсо акссоатстда тесссадкла сзастоссає опо сазан ссведсовтач вечсастсзча звссвссав состачасав чевссвавсу збо заксасевсво свсосасаєста вавеасчЕссч свассвоєся Єрадевєссвс тайасчвова зо
Каєвстаавс себаасавсс ваесасессйа сЕсссайаст ссассаварс Євасваєава з80 сечсазовас савсксксва асгсваєза носзвововос чесссазсаз сванесаає 28 заасасаказча сасаозсаса Саасрсассв абебассо асстайееєсе ссассцчвавх 300 акаджсадеза сіссааваза ачсесрозса зазазсесва скабствЕта теусавеває 360 ксвассіово сСоасасавва ббавсасайс збстацесва сстададуава агайааваче з3429 свавсвско: скекоассасу засасвосас сусччачача Бессасосва кобсодачоє зав таЗссссчає асасвацісє чЧасоавсоасвеа сЕсгсцавца зчактсхсавсе дасоцасовоу з5ЩО сзасзсабсоу сачЕссасач чсссасачцс чововазасзя савбсассає ссссобсаве 9600 зааззаааця чсзавсатує сссясасусс зааастасоає учесдецава севабеесаи ЗБ сеогЕсваза ваасссостст абсуєсосаа гчсаааєссаз чзаасгоуаазна вабавссаве а720 серссявасс авасаїскас сасодавада ававасасста абтероссосв бвабсссаву 2780 асссасотаа СсІспЧчазоає заазсцаасье восгоссаца счавсоасаєва счзвачасаво: тав зсачозчача чазссазсоод чаЗсачаче аастаасско сус врса азаассвайи 950 ассвіасксає састасасаї ахтасасаєсвє асасагавав пасе осесвоа сспдчатьеве 3555. часасагавзаа ашптобсовзос асакссзсса ссеабасассе БСсссвчає сссзчазаво Того двеасесодат сествстсва саасеЕствав ваатсассос зассссадава атак І90БО асзсесрсї стаассуасс засваграссс аксквачсас ассссвевоє дзавессава нлао завадісасец асевдаєставй сссасовсос яссаєтасач авазасавав ааавсостає опо ассагассса ас Тозти

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб боротьби із комахами-шкідниками, який включає надання вказаним комахам їжі, яка містить стійкі до комах-шкідників рослини сої, які містять ЗЕО ІЮ МО:14 і 5ЕО ІЮ МО:15, де ЗЕО ІО МО:14 кодує сгуїЕ, сгуТАс і раї, і ЗЕО ІЮ МО:15 кодує ааа-12 і раї, таким чином здійснюючи боротьбу із комахами-шкідниками, де вказані комахи вибрані з групи, яка складається з Рзецйдоріизіа іпсішдеє (соєва совка), Апіїсагсіа детитаїйа|йх (гусениця оксамитових бобів), зроаоріега Ігидірегда (трав'яна совка).
2. Спосіб за п. 1, де вказані комахи-шкідники являють собою бродорієга Ігидірегаа (трав'яну совку).
З. Стійка до комах-шкідників рослина сої, яка містить ДНК, що має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14 і нуклеотидну послідовність БЕО ІЮ МО:15.
4. Насінина рослини за п. 3, де вказана насінина містить білки, які кодуються ДНК з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:14 і 5ЕО ІЮ МО:15, що дозволяє здійснити боротьбу із комахами- шкідниками.
5. Композиція, отримана із рослини сої за п. 3, де вказана композиція являє собою макуху соєвих бобів або зерно сої, і яка містить білки, які кодуються послідовністю ЗЕО ІЮ МО:14 і ЗЕО ІО МО:15.
6. Насінина сої, яка містить у своєму геномі БЕО ІЮО МО:14 і 5ЕО ІО МО:15, де 5ЕО ІЮО МО:14 кодує сгуїР, сгуТАс і раї, і ЗЕО ІЮО МО:15 кодує ааад-12 і раї.
7. Частина рослини сої за п. 3, де вказана частина вибрана із групи, яка складається із пилку, насінного зачатка, квітів, пагонів, коріння і листя, і вказана частина містить ДНК, що має нуклеотидну послідовність хЕО ІЮ МО:14 і 5БЕО ІЮ МО:15.
8. Композиція для застосування у боротьбі із комахами-шкідниками, отримана із рослини сої за п. 3, де вказана композиція являє собою макуху соєвих бобів і зерно, і яка містить білок аай-12, що кодується 5ЕО ІЮ МО:15, і білок, який кодується 5ЕО ІЮ МО:14, вибраний з групи, яка складається з сгуїАс і сгуїР.
Являє собою карту плазміли РОАВО582. яка містить експресійні касети СПИТЕ, стутАс и реагує Межа В ДНК Тюснлювюча послідовність Лроматор ке АЯЛНІЯ зРеКсеонви ця МПромотор хі інтроя АШЬНО да т со еко и Хо вки я 0 х пбаняр ше А ям осАВЗ5В і що ві шк Межа т-днк о ям» р. мобвкм у отв Межа АТАДНК Ос К Межа А Л-ДНК С - Кк ЙО Пеовотвха Свуму кобви рута хі щі ре ВАТ Ше віт Ши лвамогаюча СУММУ ке виж сту хутвго КБ ОКЕЗВ т ЦТК
Фіг. На діаграмі проілюстровані локалізації праймерів для підтвердження Ух 1 У» граничної послідовності трансформаційної події согрІЗАВО582,814.19.1. ЗІВЕКОВ. . СУМУ ВЕНИ т Суму : РАТ Птн демо СуТР ОНР23. Стає ОБРІЗ о ОВ пла льий І; й й 4 ї фу рнсонентнткянню пенепеворннях пон 1 ; з. с т-ж ї х 2 і жк З й ЕЛЕН г ач АВ ЗДУ? ЗРАТЧКЮЄ КУ РАТЕНЮВ Не й к-ї ї лк У Еле - зчд
Фіг. 2 5В
На діаграмі проілюстрована перестановка геномної послідовності "трансформаційної події сої РІЗАВО582.814.19.1 Ділянка вставки Т-ДНК во о 3-Фланкувальна область 5-фланкувальна область ї о бите тет ект шк Паюфрієттеектеюух певен ! Є | я ПОВ ЕЕ 0 ВОДО КЕ ж зе Я У Ще Кк ; і х , ; і що ов / 81419 ВУЗ З Л ча ву . . Ділянка вставки 1-ДИК і Делеція 37 п. н, із батьківської ЕДНК
Фіг. З
UAA201401914A 2011-07-26 2012-07-26 Спосіб боротьби із комахами-шкідниками та стійка до комах-шкідників рослина сої UA116975C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161511664P 2011-07-26 2011-07-26
US201161521798P 2011-08-10 2011-08-10
PCT/US2012/048302 WO2013016516A1 (en) 2011-07-26 2012-07-26 Insect resistant and herbicide tolerant breeding stack of soybean event pdab9582.814.19.1 and pdab4468.04.16.1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116975C2 true UA116975C2 (uk) 2018-06-11

Family

ID=47601534

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201401914A UA116975C2 (uk) 2011-07-26 2012-07-26 Спосіб боротьби із комахами-шкідниками та стійка до комах-шкідників рослина сої
UAA201401818A UA118009C2 (uk) 2011-07-26 2012-07-26 Рослина сої, яка стійка до комах і гербіцидів

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201401818A UA118009C2 (uk) 2011-07-26 2012-07-26 Рослина сої, яка стійка до комах і гербіцидів

Country Status (21)

Country Link
US (3) US8680363B2 (uk)
EP (2) EP2736322B1 (uk)
JP (2) JP6182530B2 (uk)
KR (2) KR102010609B1 (uk)
CN (3) CN103826445A (uk)
AP (2) AP2014007453A0 (uk)
AR (2) AR088421A1 (uk)
AU (2) AU2012286879B8 (uk)
BR (2) BR102012019434B1 (uk)
CA (2) CA2843168A1 (uk)
CL (3) CL2014000179A1 (uk)
DK (1) DK2736321T3 (uk)
ES (1) ES2714432T3 (uk)
IL (2) IL230624A (uk)
MX (2) MX348117B (uk)
RU (2) RU2627161C2 (uk)
TW (2) TW201318555A (uk)
UA (2) UA116975C2 (uk)
UY (2) UY34224A (uk)
WO (2) WO2013016527A1 (uk)
ZA (2) ZA201401208B (uk)

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102012019436B8 (pt) * 2011-07-26 2022-10-11 Dow Agrosciences Llc Método de detecção do evento de soja pdab9582.814.19.1
MX354787B (es) * 2012-06-25 2018-03-21 Dow Agrosciences Llc Evento de soja pdab9582.816.15.1 resistente a insectos y tolerante a herbicidas.
US20160025697A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for evaluating insect resistance in a plant
CA2909725A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
CN105120664A (zh) * 2013-04-19 2015-12-02 拜耳作物科学股份公司 对抗害虫的方法
CN104611308B (zh) * 2015-02-13 2019-01-11 北京大北农科技集团股份有限公司 除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
EP3555056A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US11555202B2 (en) 2016-12-22 2023-01-17 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event EE-GM5 and methods and kits for identifying such event in biological samples
CA3046232A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event ee-gm4 and methods and kits for identifying such event in biological samples
BR112019015338B1 (pt) 2017-02-21 2023-03-14 Basf Se Compostos de fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso dos compostos e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos
US20200045974A1 (en) 2017-04-07 2020-02-13 Basf Se Substituted Oxadiazoles for Combating Phytopathogenic Fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CN110621669A (zh) 2017-05-04 2019-12-27 巴斯夫欧洲公司 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US20200190043A1 (en) 2017-06-19 2020-06-18 Basf Se 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi
BR112020001585A2 (pt) 2017-07-27 2020-08-11 Basf Se usos de uma composição e método para controlar plantas prejudiciais em uma cultura de campo tolerante a glufosinato
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
US11076596B2 (en) 2017-09-18 2021-08-03 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3713936B1 (en) 2017-11-23 2021-10-20 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2019145221A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 BASF Agro B.V. New agrochemical formulations
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
US20200354321A1 (en) 2018-02-07 2020-11-12 Basf Se New pyridine carboxamides
WO2019166257A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions of mefentrifluconazole
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
US20210323950A1 (en) 2018-06-04 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Herbicidally active bicyclic benzoylpyrazoles
EP3613736A1 (en) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituted glutarimide derivatives
EP3628158A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide
BR112021006121A2 (pt) 2018-10-23 2021-07-20 Basf Se compostos, uso dos compostos de fórmula (i), mistura de pesticidas, composições agroquímicas ou veterinárias, métodos para controlar pragas invertebradas e para tratar ou proteger animais e semente
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
EP3670501A1 (en) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
EP3908584B1 (en) 2019-01-11 2023-04-26 Basf Se Crystalline forms of 1-(1,2-dimethylpropyl)-n-ethyl-5-methyl-n-pyridazin-4-yl-pyrazole-4-carboxamide
EP3696177A1 (en) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2020239517A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
EP3769623A1 (en) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
BR112021021028A2 (pt) 2019-06-06 2021-12-14 Basf Se Uso dos compostos de fórmula i, compostos da fórmula i, composição e método para combater fungos fitopatogênicos
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
EP3903583A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii
EP3903584A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv
EP4143167B1 (en) 2020-04-28 2024-05-15 Basf Se Pesticidal compounds
EP3903582A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii
EP3903581A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i
EP3909950A1 (en) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
EP3945089A1 (en) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v
EP3939961A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
WO2022026566A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Inir17 transgenic maize
US20240011042A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Excisable plant transgenic loci with signature protospacer adjacent motifs or signature guide rna recognition sites
EP3970494A1 (en) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii
WO2022043559A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Basf Se Yield improvement
CN116209355A (zh) 2020-10-27 2023-06-02 巴斯夫农业公司 包含氯氟醚菌唑的组合物
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
MX2023006990A (es) 2020-12-14 2023-06-26 Basf Se Plaguicidas de sulfoximina.
EP4043444A1 (en) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
CN117479836A (zh) 2021-05-03 2024-01-30 巴斯夫欧洲公司 提高农药微生物的农药有效性的添加剂
EP4091451A1 (en) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
CN117355520A (zh) 2021-05-18 2024-01-05 巴斯夫欧洲公司 用作杀真菌剂的新型取代喹啉类
AU2022279357A1 (en) 2021-05-18 2023-11-30 Basf Se New substituted pyridines as fungicides
BR112023024017A2 (pt) 2021-05-18 2024-02-06 Basf Se Compostos, composição, método para combater fungos fitopatogênicos e semente
EP4355764A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Basf Se Yield improvement by gene combinations
EP4119547A1 (en) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
WO2023011958A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Basf Se (3-pirydyl)-quinazoline
IL310497A (en) 2021-08-02 2024-03-01 Basf Se (3-quinolyl)-quinazoline
EP4140986A1 (en) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4140995A1 (en) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4151631A1 (en) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
EP4194453A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4198033A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023156270A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Basf Se Coumarin synthesis and uses thereof
EP4238971A1 (en) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
EP4342885A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
EP4361126A1 (en) 2022-10-24 2024-05-01 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv
WO2024100069A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine derivatives
WO2024104815A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
WO2024104818A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
WO2024104822A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides
WO2024104823A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se New substituted tetrahydrobenzoxazepine
EP4389210A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests
CN117144054B (zh) * 2023-10-27 2024-06-11 莱肯生物科技(海南)有限公司 一种核酸检测方法及其应用

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5176995A (en) 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US4808426A (en) * 1986-04-23 1989-02-28 Epe Incorporated Vegetable oil extraction process
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US6017534A (en) * 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
ID25530A (id) * 1996-11-20 2000-10-12 Ecogen Inc δ-ENDOTOKSIN BERSPEKTRUM-LEBAR
US6218188B1 (en) * 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6720475B1 (en) 1997-11-18 2004-04-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
AR025349A1 (es) * 1999-08-23 2002-11-20 Mycogen Corp Metodos para controlar las plagas del gusano gris
US7112721B2 (en) 2000-02-08 2006-09-26 Sakata Seed Corporation Methods and constructs for plant transformation
US20070083945A1 (en) 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US7214786B2 (en) * 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7179965B2 (en) * 2004-03-26 2007-02-20 Dow Agrosciences Llc Cry1F and Cry1Ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof
US8541653B2 (en) * 2004-06-07 2013-09-24 Basf Plant Science Gmbh Transformation of soybean
EP1794308B1 (en) 2004-09-29 2013-08-28 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Corn event das-59122-7 and methods for detection thereof
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
AP2693A (en) * 2005-05-27 2013-07-16 Monsanto Technology Llc Soybean event MON89788 and methods for detection thereof
WO2007027777A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Monsanto Technology Llc Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins
CN103361316B (zh) * 2005-10-28 2017-05-17 美国陶氏益农公司 新除草剂抗性基因
WO2011066360A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Detection of aad-12 soybean event 416
AU2007204597B2 (en) * 2006-01-11 2013-01-24 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Method of producing transgenic graminaceous cells and plants
CN105296527B (zh) 2006-08-11 2020-11-27 陶氏益农公司 锌指核酸酶介导的同源重组
JP5632610B2 (ja) 2006-12-14 2014-11-26 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質
MX2009012120A (es) * 2007-05-09 2010-02-12 Dow Agrosciences Llc Genes novedosos con resistencia a herbicidas.
WO2009132850A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Bayer Bioscience N.V. Armyworm insect resistance management in transgenic plants
CN102066566A (zh) * 2008-06-13 2011-05-18 拜尔生物科学公司 转基因植物中的棉铃虫昆虫抗性管理
AU2009296625B2 (en) * 2008-09-26 2015-06-11 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant AHAS-mutants and methods of use
KR20110026545A (ko) * 2009-09-08 2011-03-16 주식회사 농우바이오 ＣｒｙＩＡｃ 유전자로 형질전환된 배추좀나방 저항성 양배추 및 이의 제조 방법
BR112012012522A2 (pt) 2009-11-24 2015-09-15 Dow Agrosciences Llc controle de voluntárias dicotiledôneas com add em culturas monocotiledôneas
UY33059A (es) * 2009-11-24 2011-06-30 Dow Agrosciences Llc Evento 416 de aad-12, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificación específica del evento
CA2782627A1 (en) * 2009-12-16 2011-06-23 Dow Agrosciences Llc Combined use of cry1fa and cry1i for management of spodoptera fugiperda and ostrinia nubilalis
BR112012014746B1 (pt) * 2009-12-16 2024-03-05 Dow Agrosciences Llc Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, bem como composição e método para o controle de pragas de lepidópteros
UA111936C2 (uk) * 2009-12-16 2016-07-11 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Vip3Ab, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Ca, ДЛЯ КЕРУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ КОМАХ
DK2585600T3 (da) 2010-06-24 2016-05-09 Dow Agrosciences Llc Reduktion af indholdet af mættet fedtsyre i plantefrø
RU2608650C2 (ru) * 2010-12-03 2017-01-23 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Пакетированное событие 8264.44.06.1 с устойчивостью к гербицидам, связанные трансгенные линии сои и их детектирование
WO2012075429A1 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 Dow Agrosciences Llc Stacked herbicide tolerance event 8291.45.36.2, related transgenic soybean lines, and detection thereof
BR102012019436B8 (pt) 2011-07-26 2022-10-11 Dow Agrosciences Llc Método de detecção do evento de soja pdab9582.814.19.1

Also Published As

Publication number Publication date
ES2714432T3 (es) 2019-05-28
KR20140051362A (ko) 2014-04-30
US20140201873A1 (en) 2014-07-17
KR102010609B1 (ko) 2019-08-13
AU2012286879A8 (en) 2017-05-18
CL2014000179A1 (es) 2014-08-01
CN109207507B (zh) 2022-05-13
CN103826444B (zh) 2019-02-01
CL2014000182A1 (es) 2014-07-11
CN109207507A (zh) 2019-01-15
EP2736322A4 (en) 2014-12-17
MX348115B (es) 2017-05-29
BR102012019434A2 (pt) 2014-03-11
US9695441B2 (en) 2017-07-04
US8680363B2 (en) 2014-03-25
UY34217A (es) 2013-02-28
AU2012286879A1 (en) 2014-03-06
EP2736322B1 (en) 2018-06-27
ZA201401208B (en) 2015-10-28
AU2012286879B8 (en) 2017-05-18
CL2020002549A1 (es) 2021-01-15
DK2736321T3 (en) 2019-03-25
MX348117B (es) 2017-05-29
IL230620A0 (en) 2014-03-31
EP2736321A4 (en) 2015-02-11
WO2013016527A1 (en) 2013-01-31
US9738904B2 (en) 2017-08-22
AR087340A1 (es) 2014-03-19
EP2736321B1 (en) 2019-01-02
ZA201401212B (en) 2015-11-25
AU2012286879B2 (en) 2017-05-04
RU2014106983A (ru) 2015-11-27
KR20140050079A (ko) 2014-04-28
EP2736322A1 (en) 2014-06-04
UA118009C2 (uk) 2018-11-12
MX2014001021A (es) 2015-03-11
US20140344994A1 (en) 2014-11-20
JP6182530B2 (ja) 2017-08-16
TW201317351A (zh) 2013-05-01
IL230620A (en) 2017-02-28
JP6023806B2 (ja) 2016-11-09
IL230624A (en) 2017-10-31
AP2014007453A0 (en) 2014-02-28
RU2014106986A (ru) 2015-09-10
AU2012286797B2 (en) 2017-06-22
WO2013016516A1 (en) 2013-01-31
CA2843168A1 (en) 2013-01-31
CN103826444A (zh) 2014-05-28
RU2628099C2 (ru) 2017-08-14
AR088421A1 (es) 2014-06-11
JP2014523749A (ja) 2014-09-18
BR102012018662A2 (pt) 2015-12-29
BR102012019434B1 (pt) 2021-11-09
UY34224A (es) 2013-02-28
CA2843175C (en) 2021-11-02
EP2736321A1 (en) 2014-06-04
JP2014531197A (ja) 2014-11-27
AU2012286879A2 (en) 2014-07-03
TW201318555A (zh) 2013-05-16
US20130061346A1 (en) 2013-03-07
MX2014001014A (es) 2015-03-11
AP2014007451A0 (en) 2014-02-28
CA2843175A1 (en) 2013-01-31
IL230624A0 (en) 2014-03-31
CN103826445A (zh) 2014-05-28
RU2627161C2 (ru) 2017-08-03
AU2012286797A1 (en) 2014-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116975C2 (uk) Спосіб боротьби із комахами-шкідниками та стійка до комах-шкідників рослина сої
KR101906605B1 (ko) Ａａｄ-12 이벤트 416, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 이벤트-특이적 확인
JP6778235B2 (ja) 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１
UA127176C2 (uk) Спосіб одержання трансгенної рослини кукурудзи, стійкої до гербіциду гліфосату і/або глуфосинату, нуклеотидна послідовність і спосіб її виявлення
TWI597365B (zh) 大豆品件ｐＤＡＢ９５８２.８１６.１５.１檢測方法
TW202409284A (zh) 轉殖基因甜菜事件ｂｖ＿ｃｓｍ６３７１３及其偵測及使用方法
EA044838B1 (ru) Трансформант кукурузы mon87429 и способы его использования