JP5674753B2 - トウモロコシイベントtc1507およびそれを検出するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、詳しくは、本発明は植物に対して昆虫抵抗性を与えるためのDNA構築物に関する。さらに詳しくは、本発明は昆虫抵抗性トウモロコシ植物TC1507と、サンプル中のトウモロコシ植物TC1507DNAおよびその組成物の存在を検出するためのアッセイとに関する。
本発明は、昆虫抵抗性トウモロコシ(Zea mays)植物TC1507(トウモロコシTC1507系統もしくはトウモロコシのイベントTC1507とも呼ばれる)と、トウモロコシ植物TC1507のDNA植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物TC1507およびその子孫にある導入遺伝子/隣接挿入領域の検出とに関する。
本発明は、好ましくは、昆虫抵抗性単子葉植物作物の生産および選択のための方法に関する。より詳しくは、植物細胞および植物で発現された場合に昆虫に対する耐性を与えるDNA構築物が提供される。したがって、本発明の第1の局面によれば、植物細胞および植物で発現された場合に植物細胞および植物に対して昆虫抵抗性を与える宿主細胞への導入および該宿主細胞内での複製が可能なDNA構築物が提供される。DNA構築物は、PHI8999Aと命名されたDNA分子から構成され、2つの導入遺伝子発現カセットを含む。第1の発現カセットは、プロモーター、5’非翻訳エキソン、およびアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)から単離された3’ORF25 転写終結因子を含むDNA分子(Barkerら(1983)Plant Mol.Biol.2:335−350)に作用自在に結合したCRy1Fとして同定されるB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第5,188,960号および第6,218,188号)に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン(Ubni−1)遺伝子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689およびChristensen and Quail(1996)Transgenic Res..5:213−218)の第1のイントロンを含むDNA分子を有する。上記DNA構築物の第2の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター由来の3’転写終結因子を含むDNA分子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59を参照せよ)に作用自在に結合したホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子をコードするDNA分子(Wohlleben W.ら(1988)Gene 70:25−37)に作用自在に結合したCaMV35SプロモーターのDNA分子(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を有する。上記DNA構築物を含む植物も提供される。
5’−GTAGTACTATAGATTATATTATTCGTAGAG−3’(配列番号1);
5’−GCCATACAGAACTCAAAATCTTTTCCGGAG−3’(配列番号2);
5’−CTTCAAACAAGTGTGACAAA−3’(配列番号23);
5’−TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA−3’(配列番号3);
5’−AGCACCTTTTCATTCTTTCATATAC−3’(配列番号4);
5’−GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC−3’;(配列番号5)
からなる群ならびにそれらの相補体からなる群より選択することが可能である。これらの分子を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の一局面である。さらに、上記イベントTC1507の同定のためのそれらのプライマー配列を利用するキットが提供される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
単離DNA分子であって、配列番号21として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
(項目2)
単離DNA分子であって、配列番号22として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
(項目3)
単離DNA分子であって、配列番号24として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
(項目4)
単離DNA分子であって、配列番号26として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
(項目5)
単離DNA分子であって、配列番号27として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
(項目6)
TC1507特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントTC1507を同定するためのキットであって、該キットは、少なくとも第1のプライマーを備え、該第1のプライマーが配列番号21内の配列または配列番号22内の配列を認識する、キット。
(項目7)
配列番号25内の配列を認識する少なくとも第2のプライマーを、さらに備える、項目6に記載のキット。
(項目8)
配列番号22内の配列を認識する少なくとも第2のプライマーを、さらに含む、項目6に記載のキット。
(項目9)
前記第1のプライマーが配列番号21内の配列を認識する、項目6に記載のキット。
(項目10)
前記第1のプライマーが配列番号22内の配列を認識する、項目6に記載のキット。
(項目11)
前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号1の配列および配列番号2の配列を含む、項目7に記載のキット。
(項目12)
前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号2の配列および配列番号23の配列を含む、項目7に記載のキット。
(項目13)
前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号3の配列および配列番号5の配列を含む、項目8に記載のキット。
(項目14)
前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号4の配列および配列番号5の配列を含む、項目8に記載のキット。
(項目15)
トウモロコシのイベントTC1507およびその子孫のジャンクションDNAに対して特異的なDNA検出キットであって、配列番号26に対して相同的または相補的であるDNA検出法で機能するのに十分な長さの隣接DNAポリヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を備える、DNA検出キット。
(項目16)
トウモロコシのイベントTC1507およびその子孫のジャンクションDNAに対して特異的なDNA検出キットであって、配列番号27に対して相同的または相補的であるDNA検出法で機能するのに十分な長さの隣接DNAポリヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を備える、DNA検出キット。
(項目17)
生物学的サンプル内のイベントTC1507を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号21および配列25とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
(項目18)
生物学的サンプル内のイベントTC1507を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号22および配列25とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
(項目19)
DNA検出キットであって、該キットは、以下:トウモロコシのイベントTC1507およびその子孫に対して特異的なDNAプライマーまたはプローブとして機能する配列番号26または配列番号27に対して相同または相補的な十分な長さの隣接ヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を備える、DNA検出キット。
(項目20)
DNA構築物であって、該DNA構築物は、以下:第1の発現カセットおよび第2の発現カセットを含み、作用可能な連結で該第1の発現カセットが、
(a)トウモロコシユビキチンプロモーター;
(b)トウモロコシユビキチン遺伝子の5’非翻訳エキソンと;
(c)トウモロコシユビキチンイントロン;
(d)Cry1FコードDNA分子;および
(e)3’ORF25転写終結因子を含み、作用可能な連結で該第2の発現カセットが、
(i)CaMV35Sプロモーター;
(ii)patコードDNA分子;および
(iii)(CaMV)35S由来の3’転写終結因子を含む、DNA構築物。
(項目21)
項目20に記載のDNA構築物を含む、植物。
(項目22)
前記植物がトウモロコシ植物である、項目21の植物。
(項目23)
生物学的サンプル中のイベントTC1507を同定するための方法であって、該方法は、配列番号21および配列番号22内の配列を特異的に認識するプローブまたは第1のプライマーを用いてTC1507特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
(項目24)
少なくとも2種類のプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を使用して前記生物学的サンプル中に存在する核酸からDNAフラグメントを増幅する工程をさらに包含し、前記第1のプライマーが配列番号21または配列番号22内の配列を認識し、そして第2のプライマーが配列番号22または配列番号25内の配列を認識する、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第1のプライマーが配列番号21内の配列を認識し、前記第2のプライマーが配列番号25内の配列を認識する、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記第1のプライマーが配列番号22内の配列を認識し、前記第2のプライマーが配列番号22内の配列を認識する、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号2の配列および配列番号1の配列を含む、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号2の配列および配列番号23の配列を含む、項目25に記載の方法。
(項目29)
前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号3の配列および配列番号5の配列を含む、項目26に記載の方法。
(項目30)
前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号4の配列および配列番号5の配列を含む、項目26に記載の方法。
(項目31)
TC1507 PCR同定プロトコルを用いて、約912bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目27に記載の方法。
(項目32)
TC1507 PCR同定プロトコルを用いて、約844bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目28に記載の方法。
(項目33)
TC1507 PCR同定プロトコルを用いて、約342bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目29に記載の方法。
(項目34)
TC1507 PCR同定プロトコルを用いて、約252bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目30に記載の方法。
(項目35)
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号1および配列番号2を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目36)
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号2および配列番号23を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目37)
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号3および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目38)
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号4および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目39)
項目35に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離DNA。
(項目40)
項目36に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離DNA分子。
(項目41)
項目37に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離DNA分子。
(項目42)
項目38に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離DNA分子。
(項目43)
サンプル中のTC1507イベントに対応するDNAの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
a.トウモロコシDNAを含むサンプルと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でトウモロコシのイベントTC1507に由来するDNAとハイブリダイズし、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でTC1507でないトウモロコシ植物DNAとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程;
b.該サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;ならびに
c.該DNAに対する該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの検出が該TC1507イベントの存在を示す、工程、を包含する、方法。
(項目44)
配列番号1、2、3、4、5、23、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57からなる群よりなる群より選択される配列またはその相補体を含む、単離DNAヌクレオチドプライマー配列。
(項目45)
配列番号1、2、3、4、5、および23からなる群より選択される配列またはその相補体を含む、項目44に記載の単離DNAヌクレオチドプライマー。
(項目46)
一対のDNA分子であって、該一対のDNA分子は、以下:第1のDNA分子と第2のDNA分子とを含み、ここで、該DNA分子が、TC1507トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたDNAにとって特徴的であるDNAプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号26の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のDNA分子。
(項目47)
一対のDNA分子であって、該一対のDNA分子は、以下:第1のDNA分子と第2のDNA分子とを含み、ここで、該DNA分子が、TC1507トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたDNAにとって特徴的であるDNAプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号27の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のDNA分子。
(項目48)
配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57からなる群より選択される配列またはその相補体を含むジャンクション配列を含む、単離DNA分子。
(項目49)
種子サンプル中で、配列番号21または配列番号22内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、TC1507特異的領域を検出する工程を包含する、種子純度を確認するための方法。
(項目50)
イベントTC1507の存在について種子をスクリーニングする方法であって、1つの種子ロットのサンプル中で、配列番号21または配列番号22内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、TC1507特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
(項目51)
昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分であって、ここで、配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそのそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を有するDNAが、該植物のゲノムの一部分を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分。
(項目52)
項目51に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の後代植物であって、ここで、配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を有するDNAが、該植物のゲノムの一部分を形成する、後代植物。
(項目53)
項目51または52に記載の植物の種子。
(項目54)
昆虫抵抗性トウモロコシ植物を生産するための方法であって、該方法は、項目51または52に記載の植物を用いて育種する工程、ならびに配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列について分析することによって子孫を選択する工程、を包含する方法。
(項目55)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57からなる群より選択される少なくとも1つのDNAならびにそれらの相補体からなる群より選択される配列を含む、単離DNA配列。
(項目56)
一対の単離DNA配列であって、その各々が、少なくとも10個のヌクレオチドを含み、かつDNA増幅手順で一緒に使用される場合、イベントTC1507にとって特徴的な単位複製配列を生産する、一対の単離DNA配列。
(項目57)
各々が配列番号26から選択される、項目56に記載の一対の単離DNA配列。
(項目58)
各々が配列番号27から選択される、項目56に記載の一対の単離DNA配列。
(項目59)
トウモロコシ組織へのTC1507イベント挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)プライマー対の各メンバーが、該TC1507イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、配列番号26または配列番号27由来の少なくとも10個のヌクレオチドを、各々、含むプライマー対を選択する工程;
(b)該トウモロコシ組織のサンプルと該プライマー対とを接触させる工程;および
(c)DNA増幅を実行し、そして単位複製配列について分析する工程、
を包含する、方法。
(項目60)
前記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57およびそれらの相補体からなる群より選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
トウモロコシ組織へのイベントTC1507挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で該トウモロコシ組織のサンプルと、配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される1つ以上のDNA配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;ならびに
(c)該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程、
包含する、方法。
(項目62)
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される1つ以上のDNA配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを備える、DNA検出キット。
(項目63)
DNA検出キットであって、該DNA検出キットは、プライマー対を備え、該プライマーは、配列番号26および配列番号27由来の少なくとも10個のヌクレオチドを各々含み、ここで、各々が、TC1507イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、DNA検出キット。
(項目64)
前記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される、項目61に記載のDNA検出キット。
(項目65)
生物学的サンプル中のイベントTC1507を同定するためのキットであって、配列番号24内のTC1507特異的領域を検出する、キット。
(項目66)
生物学的サンプル中のTC1507を同定するための方法であって、配列番号24内のTC1507特異的領域を検出する、方法。
本発明の上記局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付した図面から、よりいっそう明らかになる。
以下の定義および方法は、本発明をより良く定義するために、また本発明の実施に際して当業者を導くために、提供される。特に示さない限り、用語は関連技術分野における当業者の慣例的用法にしたがって理解される。また、分子生物学での共通する用語の定義も、Riegerら,Glossary of Genetics:Classical and Molecular、第5版、Springer−Verlag;New York,1991;およびLewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994に見いだされよう。37CFR1.822に記載のDNA塩基についての命名法が用いられる。
acid Probe,Part I,Chapter 2(Elsevier、New York);and Ausubelら,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley−Interscience、New York)に見いだされる。Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、N.Y.)を見よ。
PHI8999Aと表された6.2kbのDNA分子(図1参照、配列番号25)は、アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)から単離した3’ORF25転写終結因子(Barkerら(1983)Plant Mol.Biol.2:335−350)を含むDNA分子に作用自在に結合したCry1Fと同定されたバチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)のδ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第5,188,960号および6,218,188号)に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン(Ubni−1)遺伝子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689およびChristensen and Quail(1996)Transgenic Res.5:213−218)のプロモーター、5’非翻訳エキソン、および第1のイントロンを含む第1の導入遺伝子発現カセットと、(CaMV)35S由来の3’転写終結因子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を含むDNA分子に作用自在に結合した選択可能なマーカーであるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子(Wohlleben W.ら(1988)Gene 70:25−37)をコードするDNA分子に作用自在に結合したカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35プロモーター(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)のDNA分子を含む第2の導入遺伝子発現カセットとを有し、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いられた。
イベントTC1507内のPHI899A挿入に対して5’側の配列を含んだDNA断片を同定するために、イベントTC1507ゲノムDNA由来のSpeI制限酵素断片をアガロースゲル上でサイズ選択、精製、およびサザン分析によるスクリーニングをおこなうことで、Cry1Fプローブに対するハイブリダイゼーションを確認した。エンリッチされたサイズ選択プラスミド系ゲノムDNAライブラリーを調製するために、ハイブリダイゼーションおよび断片サイズの確認後、目的とする断片をpBluescript II SK(+)(商標)クローニングベクターにクローニングした。Cry1F遺伝子の一部に相同なプローブを用いて、陽性クローンに対するプラスミドライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、新たなスクリーニングによって精製し、さらにCry1Fプローブにハイブリダイズした場合に陽性シグナルをもたらすかを確認した。単離された陽性クローンに含まれるSpeI断片のおよそ3kbを、プライマーウオーキングアプローチを用いて、シークエンシングをおこなった。第1のシークエンシングを開始させるために、クローニングベクターDNA内の既知の配列に結合するプライマーを設計して目的とするDNAの一部分をシークエンシングした。逆方向に配向した別のプライマーを用いた同一領域にわたる第2のシークエンシングの実行は、第2の鎖の範囲(カバリッジ)を与えた。プライマーウオーキングは、先行する実行から得た配列データを繰り返し用いて、新規のプライマー(このプライマーは、次に、トウモロコシのイベントTC1507の挿入遺伝子組換えDNAに対して5’側の隣接領域が得られるまで、目的とするDNAまでさらにシークエンシングの次のラウンドを伸ばすために用いられる)を設計することによって達成された。具体的な配列情報を実施例4に示す。
B.t.Cry1FトウモロコシTC1507系統挿入の5’隣接配列を確認するために、PCRプライマー対を設計して5’隣接領域から完全長PHI8999A遺伝子組換え挿入に延びる重複PCR産物を得た。PCR産物を成功裏にB.t.Cry1FトウモロコシTC1507系統ゲノムDNAから増幅し、単離し、表1に示すように領域1から領域6までのシークエンシングをおこない、実施例2に記載したSpeI断片由来の既に決定された配列と一致するか確認した。しかし、完全長挿入の開始に対して直に隣接し、かつ5’側である2358bpから2829bpまでの領域は、PCR増幅にとっては扱いにくく、上記したSpeIクローンから得た配列よりも大きいことがわかった。この領域に隣接するプライマー対とAdvantage(登録商標)−GC2Polymerase Mix(BD Biosciences Clontech、Palo Alto、Calif.)の使用は、シークエンシングのためのB.t.Cry1FトウモロコシTC1507系統ゲノムDNA由来のPCR産物の増幅では成功裏になされた。Advantage(登録商標)−GC2システムによる単位複製配列の生産に用いられる増幅条件を表10に示す。2358bpないし2829bpの領域にある配列を確認するために用いられるDNAプライマー対は、配列番号1および配列番号2ならびに配列番号2および配列番号23に挙げられたものである。この領域の配列を表1に記載する(領域7a、7b、および8)。
(領域1(配列番号28)トウモロコシゲノム(有意な相同性なし))
(領域7a(配列番号34)pat遺伝子の断片)
(実施例5.トウモロコシのイベントTC1507の挿入に対して5’側にある隣接配列の記述)
イベントTC1507の5’隣接配列をさらに完全に説明するために、相同性検索を、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)を用いて、GenBankの公的データベース(リリース122、2/01)に対しておこなった。BLASTプログラムは、配列類似性検索を実行し、未知の配列に対する相同性を同定する上で特に有用である。公的データベース検索に加えて、二つ一組の位置合わせをAlignX(InforMax Inc.,Bethesda、Md.)を用いて実行し、トウモロコシのイベントTC1507の隣接配列とPHI8999Aトランスジェニック挿入とのあいだの相同性について調べた。これらの相同性検索の結果を表1に示す。TC1507の5’隣接配列に、挿入に対して最も遠い5’側の塩基1と、完全長PHI8999Aトランスジェニック挿入の開始点の塩基2830とによって番号がつけられている(図1参照)。同一性パーセントの値は、分析した配列の長さにわたる完全な一致の割合を示す。
トウモロコシTC1507を生成する形質転換について用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統に、イベントTC1507の5’隣接領域中の領域1、2、および3(表1)が存在して、それによってトウモロコシゲノムDNAによって境界が示されるかどうかを判断するために、PCR分析を用いた。9通りの異なるPCR分析を、表3に示すプライマー配列を用いて表2に概説したように、 TC1507および未修飾コントロールトウモロコシHi−II系統からから調製したゲノムDNA上で実施した(Hi−IIの情報については、Armstrong(1994)The Maize Handbook、ed.Freeling and Walbot、Springer−Verlag、New York、pp.663−671を参照せよ)。2つの反応が、25ないし324bpの5’隣接領域の領域1内のDNA(反応A−300bp単位複製配列)と25ないし480bpの5’隣接領域の領域1内のDNA(反応B−456bp単位複製配列)を増幅するように、設計された。予想される単位複製配列は、Hi−II未修飾トウモロコシ系統およびトウモロコシのイベントTC1507の両方に存在した。1つのPCRプライマー対、反応C、759ないし1182bpの5’隣接領域(424pb単位複製配列)の領域2ないし領域3をスパン化し、Hi−IIおよびTC1507の両方で期待される大きさのPCR産物を再び生成した。反応D、415ないし1182bpの5’隣接領域(768pb単位複製配列)の領域1ないし領域3をスパン化し、Hi−IIおよびTC1507の両方で期待される大きさのPCR産物を再び生成した。反応EおよびFは、TC1507内のPHI8999Aの完全長挿入のpat遺伝子領域に対する特異的プライマー対として設計されたことから、未修飾Hi−IIトウモロコシ系統の単位複製配列は期待されない。結果は、EおよびFの反応が共に、pat遺伝領域によって形質転換されたトウモロコシ系統に対して特異的であり、期待される単位複製配列を生成し、その一方で未修飾Hi−IIトウモロコシ系統では単位複製配列が生成されなかった。反応Gもまた、トウモロコシのイベントTC1507で366bpの単位複製配列を生成し得るプライマー対として設計され、未修飾Hi−IIトウモロコシ系統では単位複製配列の生成は見られなかった。
トウモロコシのイベントTC1507の完全長PHI8999A挿入に対して3’側の配列情報の長さを伸ばすのに、2通りの異なるPCRアプローチを用いた。第1のアプローチでは、PCRプライマー対を、完全長挿入と逆方向ORF25ターミネーターとのあいだの連結をスパン化した産物を増幅するように設計した。逆方向ORF25ターミネーターを示す図1を参照せよ。順方向プライマーを完全長PHI8999A挿入の末端に配置させ、一連の逆方向プライマーを逆方向配列に100bp間隔で配置させた。このようにして、トウモロコシのイベントTC1507に存在する逆方向断片の長さを、成功裏になされるPCR反応に基づいて100bp領域内に定めることができた。この方法は、ORF25ターミネーターの大部分を含むがCry1F配列は含まない逆方向断片を示した。この領域からPCR断片を単離してシークエンシングした。
(領域10(配列番号38)ORF25ターミネーター(相補体)の断片)
(領域12(配列番号40)トウモロコシ葉緑体ゲノムの断片)
(領域14(配列番号42)トウモロコシ葉緑体ORF241(相補体)の断片)
3’隣接配列の末端上の未記載の領域(表1の領域15)が、トウモロコシのイベントTC1507を生成するために形質転換で用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統に存在し、それによってトウモロコシゲノムDNAとの境界が示されるかどうかを決定するために、PCR分析が用いられる。トウモロコシTC1507系統と未修飾Hi−IIコントロールトウモロコシ系統との両方における領域15の成功裏になされるPCR増幅によって、領域15が実際にトウモロコシゲノムDNAに存在することが明らかになった。5通りの異なるPCR分析を、表8に示すプライマー配列を用いて、トウモロコシTC1507系統と未修飾Hi−IIコントロールトウモロコシ系統とから調製したゲノムDNA上で、以下の表7に概説したように、実施した。3’隣接領域の領域15内でのDNA増幅をおこなうために、3通りの反応を設計した。すなわち、反応L−175bp単位複製配列を生産、反応M−134bp単位複製配列を生産、さらに反応N−107bp単位複製配列を生産。予想される単位複製配列は、未修飾コントロールトウモロコシ系統とトウモロコシTC1507系統とのなかに存在した。反応JおよびKを、挿入の末端を3’隣接領域にスパン化し得るTC1507に対して特異的プライマー対として設計した。反応Jでは、順方向プライマーを、完全長PHI8999A挿入(表1の領域13)の3’末端上のpat遺伝子フラグメントに配置し、逆方向プライマーを未定義の領域15に配置した。反応Kでは、順方向プライマーを、完全長挿入の3’末端上の葉緑体と仮定するタンパク質遺伝子に配置した(表1の領域14)。また、逆方向プライマーを未定義の領域15に配置した。反応Jおよび反応Kの両方とも、トウモロコシ系統TC1507中で単位複製配列を生産したが、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列が生産されなかった。このような結果は、反応JおよびKの両方がイベントTC1507に対して特異的であることを示す。
DNAイベント特異的プライマー対を用いて、TC1507に特徴的な単位複製配列を生成した。これらのイベントプライマー対として、限定されるものではないが、配列番号1および配列番号2、配列番号2および配列番号23、配列番号3および配列番号5、ならびに配列番号4および配列番号5が挙げられる。これらのプライマー対に加えて、DNA増幅反応で使用した場合にTC1507に対して特異的なDNA単位複製配列を作る配列番号26および配列番号27に由来する任意のプライマー対は、本発明の一局面である。この分析のための増幅条件を表9に示すが、TC1507に特徴的な増幅DNA分子を生産するためのDNAプライマーまたはその相補体を用いたこれらの方法の任意の修飾は、当技術分野の通常技量の範囲内である。配列番号1、2、および23によって同定されるPCRプライマーを利用した反応のための好ましい増幅条件を表10に示す。また、内因性のトウモロコシ遺伝子の増幅のために、コントロールプライマー対(配列番号10および11、配列番号10および12、配列番号13および14、配列番号14および15、配列番号5および16、配列番号5および17、ならびに配列番号5および18を含む)を反応条件の内部基準として包含する。さらに含まれるものは、pat遺伝子を含むトランスジェニックイベントで単位複製配列を生産するプライマー対(配列番号6および7、配列番号8および9)とcry1F遺伝子を含むトランスジェニックイベントで単位複製配列を生産するプライマー対(配列番号19および20)とである。
Claims (42)
- 単離DNA分子であって、配列番号21として同定されたヌクレオチド配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- 単離DNA分子であって、配列番号22として同定されたヌクレオチド配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- 単離DNA分子であって、配列番号24として同定されたヌクレオチド配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- 単離DNA分子であって、配列番号26として同定されたヌクレオチド配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- 単離DNA分子であって、配列番号27として同定されたヌクレオチド配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- TC1507特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントTC1507を同定するためのキットであって、該キットは、第1のプライマーおよび第2のプライマーを備え、該第1のプライマーが配列番号26内の配列または配列番号27内の配列を認識し、該第2のプライマーが配列番号25内の配列または配列番号22内の配列を認識し、該プライマー配列が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、および、23、ならびに、その相補体からなる群から選択される、キット。
- 前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号1の配列および配列番号2の配列を含む、請求項6に記載のキット。
- 前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号2の配列および配列番号23の配列を含む、請求項6に記載のキット。
- 前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号3の配列および配列番号5の配列を含む、請求項6に記載のキット。
- 前記少なくとも第1および第2のプライマーがそれぞれ配列番号4の配列および配列番号5の配列を含む、請求項6に記載のキット。
- トウモロコシのイベントTC1507およびその子孫を検出するためのキットであって、該キットは、以下:
(a)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列;または
(b)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含む少なくとも1つのDNA分子を備える、キット。 - 生物学的サンプル内のイベントTC1507を同定するためのキットであって、該キットは、少なくとも1つの特異的プローブを備え、ここで、該プローブは、以下:
(a)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列;または
(b)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該プローブは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含む、キット。 - 生物学的サンプル中のイベントTC1507を同定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択される配列;または
(b)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含むプローブを用いて、配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57からなる群より選択される配列を検出する工程を包含する、方法。 - 生物学的サンプル中のイベントTC1507を同定するための方法であって、該方法は、2種類のプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を使用して前記生物学的サンプル中に存在する核酸からDNAフラグメントを増幅する工程を包含し、該プライマー配列が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、および、23、ならびに、その相補体からなる群から選択される、方法。
- 前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号2の配列および配列番号1の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号2の配列および配列番号23の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号3の配列および配列番号5の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーがそれぞれ、配列番号4の配列および配列番号5の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号1および配列番号2を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。 - 生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号2および配列番号23を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。 - 生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号3および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。 - 生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントTC1507またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号4および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程;および
(e)該DNA単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該DNA増幅反応での該DNA単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントTC1507の存在を示す、工程、
を包含する、方法。 - (a)生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号1および配列番号2を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;ならびに
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程
によって生産された単位複製配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。 - (a)生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号2および配列番号23を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;ならびに
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程
によって生産された単位複製配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。 - (a)生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号3および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;ならびに
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程
によって生産された単位複製配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。 - (a)生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)DNAプライマー分子である配列番号4および配列番号5を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;ならびに
(d)該DNA増幅反応を実行して、それによってDNA単位複製配列分子を生成する工程
によって生産された単位複製配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。 - サンプル中のTC1507イベントに対応するDNAの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
a.トウモロコシDNAを含むサンプルと、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、以下:
(i)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択される少なくとも1つのDNA配列;または
(ii)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含む、工程;
b.該サンプルおよびプローブを高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;ならびに
c.該DNAに対する該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの検出が該TC1507イベントの存在を示す、工程、を包含する、方法。 - 配列番号1、2、3、4、23、45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57からなる群より選択される配列またはその相補体を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離核酸。
- 配列番号1、2、3、4、および23からなる群より選択される配列またはその相補体を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、請求項28に記載の単離核酸。
- 一対のDNA分子であって、該一対のDNA分子は、以下:第1のDNA分子と第2のDNA分子とを含み、ここで、該DNA分子が、TC1507トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたDNAにとって特徴的であるDNAプライマーまたはプローブとして機能する、少なくとも18隣接ヌクレオチド長の、配列番号26のヌクレオチドまたはその相補体のフラグメントである、一対のDNA分子。
- 一対のDNA分子であって、該一対のDNA分子は、以下:第1のDNA分子と第2のDNA分子とを含み、ここで、該DNA分子が、TC1507トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたDNAにとって特徴的であるDNAプライマーまたはプローブとして機能する、少なくとも18隣接ヌクレオチド長の、配列番号27のヌクレオチドまたはその相補体のフラグメントである、一対のDNA分子。
- 配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択される配列を含み、かつイベントTC1507ゲノムに含まれる配列からなる、単離DNA分子。
- 種子サンプル中で、配列番号26または配列番号27内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、TC1507特異的領域を検出する工程を包含し、そして、該プライマー配列またはプローブ配列が、配列番号1、2、3、4、5、23、45、46、47、49、50、51、52、54、55、56、および、57、ならびに、その相補体からなる群から選択される、種子純度を確認するための方法。
- イベントTC1507の存在について種子をスクリーニングする方法であって、1つの種子ロットのサンプル中で、配列番号26または配列番号27内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、TC1507特異的領域を検出する工程を包含し、そして、該プライマー配列またはプローブ配列が、配列番号1、2、3、4、5、23、45、46、47、49、50、51、52、54、55、56、および、57、ならびに、その相補体からなる群から選択される、方法。
- 昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分であって、ここで、配列番号24のヌクレオチド配列を有するDNAが、該植物のゲノムの一部分を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分。
- 請求項35に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の後代植物であって、ここで、配列番号24のヌクレオチド配列を有するDNAが、該植物のゲノムの一部分を形成する、後代植物。
- 配列番号24のヌクレオチド配列を有するDNAが種子のゲノムの一部分を形成する、請求項35または36に記載の植物の種子。
- 一対の単離核酸であって、DNA増幅手順で一緒に使用される場合、イベントTC1507にとって特徴的な単位複製配列を生産し、ここで、該対の各メンバーは該単位複製配列の反対の端に存在し、該対の各メンバーは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、および、23、ならびに、その相補体からなる群から選択される、一対の単離核酸。
- トウモロコシ組織へのTC1507イベント挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)配列番号26または配列番号27由来の少なくとも10個のヌクレオチドを、各々、含むプライマー対を選択する工程;
(b)該トウモロコシ組織のサンプルと該プライマー対とを接触させる工程;および
(c)DNA増幅を実行し、そして単位複製配列について分析する工程、
を包含し、ここで、該プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される、方法。 - トウモロコシ組織へのイベントTC1507挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該トウモロコシ組織のサンプルと、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程であって、該プローブが、以下:
(i)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列;または
(ii)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該プローブは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含む、工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;ならびに
(c)該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程、
包含する、方法。 - ポリヌクレオチドプローブを備える、キットであって、該プローブが、以下:
(i)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列;または
(ii)配列番号45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにその相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも18ヌクレオチド長である、フラグメント、
を含む、キット。 - プライマー対を備えるキットであって、該プライマーの各々は、配列番号26および配列番号27由来の少なくとも10個のヌクレオチドを各々含み、ここで、該プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、45、46、47、49、50、51、52、54、55、56および57ならびにそれらの相補体からなる群より選択される、キット。
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