BR112013014427B1 - Método para produzir uma colônia derivada do campo de lagartas do cartucho (faw) que compreendem suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem cry1f, colônia de faw - Google Patents

Método para produzir uma colônia derivada do campo de lagartas do cartucho (faw) que compreendem suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem cry1f, colônia de faw Download PDF

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Abstract

método para produzir uma colônia derivada do campo de lagartas do cartucho (faw) que compreendem suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem cry1f a presente invenção fornece métodos para usar colônias de insetos derivadas do campo que compreendem resistência desenvolvida no campo a toxinas inseticidas que são produzidas em plantas transgênicas. os métodos da presente invenção podem ser usados em estratégias de manejo de resistência para plantas de cultivo transgênicas que expressam toxinas inseticidas.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COLÔNIA DERIVADA DO CAMPO DE LAGARTAS
DO CARTUCHO (FAW) QUE COMPREENDEM
PLANTAS DE MILHO QUE PRODUZEM
Campo da Invenção
A presente invenção se de insetos plantas de inseticidas.
Antecedentes
SUSCETIBILIDADE REDUZIDA A
CRY1F, COLONIA
DE FAW derivadas cultura refere aos métodos de uso do campo com transgênicas da Invenção milho, Zea mays L., é uma das cultivadas nos Estados Unidos, de milho plantados anualmente corn plans eds., tolerância de colônias aumentada a que expressam toxinas safras mais amplamente com mais de 60 milhões de acres (Andow e Hutchison (1998) Btresistance management.
to save a natural pest pg. 19 a
MA) . A
Smith)) milho
Em Now control, lagarta e uma no sul
66, Union of do cartucho das pragas dos Estados
Concerned or never: serious new eds. Mellon e Rissler,
Scientists, Cambridge, (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E.
lepidópteras mais importantes do
Unidos (Buntin (2008) Florida
Entomol. 91:523-530), assim como nas Américas
Os danos pela frequentemente assim perdas evitar
Latina e do Sul.
como se
FAW envolvem se alimentar da observado alimentar de produtividade.
folha, o que é em plantas no estágio de das espigas, controle espiral, causando substanciais com inseticidas para a lesão das espigas no milho no campo é difícil e geralmente não é barata. 0 milho transgênico que expressa toxinas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Bt) é uma tecnologia de controle eficaz contra FAW, oferecendo grande potencial para a redução de perdas por este inseto praga no
2/80 milho no campo
42; Buntin et (Buntin et al. (2001) al. *72004)' *J. Econ.
Florida
Entomol.
Entretanto, há uma preocupação em que os
Entomol. 84:3797:1603-1611) .
insetos podem rapidamente desenvolver resistência ao
Bt expresso nas plantas em áreas onde se aplica uso continuo e grande pressão de seleção (Mallet e Porter (1992) Proc. R. Soc. B 250:165-169;
Chaufaux et al.
(2001) J.
Econ. Entomol. 94:1564-1570)
A evolução da resistência dos insetos tem sido bem documentada e é um grave problema na produção agrícola e de gado, em ambientes urbanos e de saúde pública magnitude strategies of and
44, National resistance tactics
Academy
McKenzie (1987)
Annu.
problem, In for management,
Tabashnik (1990)
NY, Chapman and
Pesticide Resistance:
Council, ed., pg.
Press, Washington, D.C.; Roush
Rev. Entomol. 32:361-380,
Pesticide resistance in arthropods,
Hall) . 0 Bt é uma fonte valiosa de a
and
Roush and
New York, proteínas inseticidas para uso no controle de controle de insetos pragas em formulações de pulverização convencionais ou em cultivos
transgênicos (Roush (1994) Biocontrol Sei. Technol. 4:501-516;
Ferré e J. Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Contudo, a evolução da resistência dos insetos em populações de campo é uma ameaça importante a esta tecnologia (Ferré e J.
Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533), especialmente com plantas transgênicas que expressam toxinas Bt (Mallet and
Porter (1992) Proc. R. Soc. B 250:165-169).
Os híbridos de milho contendo o evento TC1507 expressam os genes CrylF e PAT. A proteína CrylF confere resistência a praga lepidópteras chave de milho, como broca europeia do
3/80 milho (Ostrinia nubilalis) , broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), FAW, e lagarta rosca (Agrotis ipsilon) . 0 gene pat codifica a proteína PAT para conferir tolerância ao ingrediente ativo herbicida glufosinato de amônio. Os híbridos de milho contendo o evento TC1507 foram amplamente adotados nos
Estados
Unidos desde sua comercialização em 1998. Como parte da submissão regulatória um plano compulsório de manejo de resistência de insetos (IRM) foi proposto para retardar a taxa de evolução da resistência.
Λο
Atualmente, a estratégia preferencial e mais amplamente adotada envolve da toxina Bt em cultura não-Bt (International o uso de conjunto para
Life
Environmental Sciences plantas que expressam uma alta dose com o plantio de um refúgio de uma preservação de genes suscetíveis
Sciences
Institute insect resistance management in Bt framework for risk assessment and et al. 2003.
Institute.
(1999) An field corn:
Health and evaluation of
A science-based risk management;
Tabashnik
J. Econ. Entomol. 96:1031-1038). Esta abordagem foi considerada a mais exequível e realista em termos de práticas de cultivo e no prolongamento do uso de cultivos transgênicos de Bt (Gould (1998) Annu. Rev. Entomol.
43:70125
726) .
podem áreas
Entretanto, ainda há uma preocupação de que desenvolver resistência ao Bt expresso em onde se aplica uso contínuo e grande pressão (Mallet and Porter (1992) Proc.
R.
os insetos plantas em de seleção
Soc. B 250:165-169;
Chaufaux et al. (2001) J. Econ. Entomol. 94:1564-1570).
As populações de FAW em Porto Rico foram expostas à formulação de Bt microbiano usada em inseticidas convencionais e a plantas transgênicas contendo o evento TC1507 ao longo de
4/80 vários anos, ambas contendo proteínas inseticidas Cryl de Bt.
Ainda que a toxina CrylF seja inequivocamente eficaz no controle de FAW quando comparada a outras toxinas Cryl (Waquil et al. (2002)
Revista
Brasileira de Milho e
Sorgo
1:1-11;
Waquil et (2004)
Revista
Brasileira de
Milho e Sorgo
3:161-171) exposições repetidas a esta toxina e as condições únicas de
Porto Rico (isto é, geografia de ilha tropical, disponibilidade reduzida de hospedeiros alternativos devido às condições de seca, crescimento contínuo do milho e alta •10 densidade populacional com gerações sobrepostas) colaboraram para o aumento da pressão de seleção sobre a população de pragas e, portanto, aumentou a probabilidade para a evolução de resistência.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção apresenta a produção de uma colônia derivada do campo de lagarta do cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda) selecionada para suscetibilidade reduzida a plantas de milho que expressam a proteína inseticida CrylF.
Desta forma, em um aspecto, invenção fornece métodos para produzir uma colônia de FAW derivada do campo que compreende suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem
CrylF. A FAW de tal colônia derivada do campo compreendem resistência a CrylF desenvolvida no campo. Os métodos envolvem coletar FAW de um campo que compreende plantas de milho, particularmente, um campo que compreende plantas de milho que produzem CrylF, fornecer o material de folha de plantas de milho que expressam CrylF como alimento para a FAW, selecionar os indivíduos FAW que sobreviveram à exposição.
Os
5/80 métodos da presente invenção podem ainda envolver a transferência da FAW sobrevivente para uma dieta de lagarta do cartucho padrão sem CrylF para permitir que os sobreviventes completem o desenvolvimento. Os métodos da presente invenção podem ainda envolver deixar a FAW sobrevivente acasalar para manter a colônia com seleção aplicada periodicamente em gerações subsequentes por fornecer o material de folha de plantas de milho que expressam CrylF como alimento para a FAW e selecionar as FAW sobreviventes e, portanto, fixar
resistência pela eliminação de indivíduos que não carregam alelos de resistência homozigotos. É reconhecido que os métodos para produzir uma colônia de FAW derivada do campo podem ser usados de uma maneira semelhante com qualquer outro inseto praga que desenvolve resistência a uma ou mais toxinas inseticidas, em particular, uma ou mais toxinas inseticidas de
Bacillus thuringiensis (Bt), que produziram uma planta transgênica, particularmente, uma planta de cultivo transgênica.
Em uma modalidade, os métodos da presente invenção foram usados para produzir uma colônia de FAW derivada do campo (chamada na presente invenção de FAW-SPR) com alelos fixos para resistência a partir de ovos coletados em Porto Rico, EUA em um campo de plantas de milho transgênicas que compreendem o evento de milho TC1507, que expressa CrylF. A FAW desta 25 colônia apresenta suscetibilidade reduzida a plantas de milho que compreendem o evento de milho TC1507.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para determinar a frequência de alelos de resistência em populações
6/80 onde a resistência não se desenvolveu. Os métodos envolvem coletar insetos de um campo ou outro local, acasalar adultos virgens dos insetos coletados com insetos adultos virgens de uma colônia derivada do campo do inseto resistente da mesma 5 espécie que os insetos coletados, deixar as larvas do acasalamento se alimentarem de uma dieta que compreende uma toxina inseticida a uma concentração que é letal para insetos suscetíveis e determinar a mortalidade. Tais métodos podem ser usados, por exemplo, no desenvolvimento de estratégias de
manejo de resistência.
Em uma modalidade da invenção estão métodos para determinar a frequência de alelos resistência a CrylF coletar FAW virgens das resistentes larvas do compreende suscetível de um de resistência em populações de não se desenvolveu. Os campo ou outro local,
FAW coletadas com adultos da colônia derivada do campo, acasalamento se alimentem de
CrylF a uma concentração que é e determinar a mortalidade. Tais métodos acasalar virgens permitir
FAW onde envolvem adultos de que uma dieta letal para a métodos podem usados, por exemplo, no desenvolvimento de estratégias
FAW as que
FAW ser de manejo de resistência.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos de uso de uma colônia derivada do campo de um inseto praga de interesse que compreende um inseto praga de interesse com resistência desenvolvida no campo a uma toxina inseticida que é expressa em uma planta transgênica. Tal colônia derivada do campo de um inseto praga pelos métodos de interesse pode ser produzida, por exemplo, aqui apresentados ou por qualquer outro método
7/80
4kio
conhecido na exemplo, usar de interesse técnica. Os métodos uma colônia derivada em métodos: para resistência do inseto à potencial qualquer proteínas toxina de resistência outro inseticida inseticidas com interesse;
resistência geográficas para para onde inseticida foram comercializadas;
conhecidos resistência inseticida;
de para melhorar o inseto da invenção incluem, por do campo de um inseto praga entender o mecanismo da inseticida;
para avaliar o cruzada da toxina existente ou novos atividade contra o inseticida inseticidas inseto praga as estratégias de monitoramento com ou de da praga de interesse em localizações as plantas de cultivo que expressam a toxina comercializadas ou estão previstas para serem de validar suposições usadas em modelos simulação as plantas para avaliar em computador de cultivo que estratégias de risco para expressam a toxina alternativas de posicionamento de exemplo, misturas refúgio para de sementes uma-bolsa; para investigar se insetos existentes irão afetar de interesse transgênicas condições de moleculares (alteração inseticida interesse;
plantas de cultivo, como, por ou estratégias de refúgio-emas táticas para controle de a taxa na qual o inseto praga pode desenvolver resistência que expressam a toxina a plantas de cultivo inseticida sob as campo; para desenvolver tecnologia de para monitorar na frequência em populações e fornecer uma de de marcadores desenvolvimento de alelos resistentes) campo do inseto resistência à toxina praga de melhor compreensão sobre o modo de ação da toxina inseticida no controle do inseto praga de interesse.
8/80
Wio
Em uma modalidade da invenção, o inseto toxina inseticida é CrylF expressa em transgênicas, particularmente, plantas de que compreendem o invenção incluem, derivada do campo praga é a FAW e a plantas de milho milho transgênicas evento de milho TC1507.
por exemplo, usar tal em métodos: para entender
Os métodos colônia de o mecanismo da
FAW de resistência da lagarta do cartucho potencial de resistência cruzada de inseticida inseticidas melhorar as à CrylF;
CrylF com existente ou novos inseticidas com atividade contra lagarta do estratégias de monitoramento de para avaliar o qualquer outro ou proteínas cartucho; para resistência da lagarta do cartucho para TC1507 em milho e outras localizações geográficas, onde nos EUA Continentais o evento de milho
TC1507 foi comercializado ou está previsto para ser comercializado; de validações de suposições usadas em modelos conhecidos de simulação em computador de risco para resistência para o evento de milho TC1507; para avaliar estratégias alternativas de posicionamento de refúgio para o evento de milho TC1507, como, por exemplo, misturas de sementes ou estratégias de refúgio-em-uma-bolsa;
para investigar se as táticas para controle de lagarta do cartucho existentes, especificamente as plantas de milho MON810 e Btll, que expressam CrylAb, e inseticidas químicos, irão afetar a taxa na qual a lagarta do cartucho pode desenvolver resistência a TC1507 sob condições de campo naturais; para desenvolver tecnologia de marcadores moleculares para monitorar o desenvolvimento de resistência (alteração na frequência de alelos resistentes) à CrylF em populações de
9/80 campo de FAW; e para fornecer uma melhor compreensão sobre o modo de ação da toxina CrylF no controle de FAW.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1 é uma curva de mortalidade de cruzamentos recíprocos de FAW de FAW-SPR a FAW suscetível, conforme descrito no exemplo 5.
A figura 2 é uma curva de mortalidade de Sr, rr FAW e retrocruzamentos de rS a rr FAW, conforme descrito no exemplo
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção será agora descrita mais completamente com relação aos desenhos em anexo, nos quais algumas, mas não todas, as modalidades da invenção são mostradas. De fato, essas descrições podem ser incorporadas sob muitas formas diferentes não devem ser interpretadas como limitações às modalidades aqui apresentadas;
ao invés modalidades são fornecidas de modo que essa descrição satisfaça as exigências legais aplicáveis.
Números iguais referem-se a elementos iguais em todo este documento.
Colônias de insetos resistentes a toxinas fornecem, em geral, bons meios para avaliar os riscos associados com a evolução da resistência, validar estratégias de manejo de resistência, e melhorar as práticas de manejo da resistência. Além disso, elas servem como uma ferramenta poderosa para elucidar vários aspectos relacionados à resistência aos inseticidas, incluindo o modo de ação dos inseticidas, previsão ou determinação do mecanismo de resistência do inseto, compreensão da genética
10/80 associada com a resistência do inseto, e para a descoberta ou design de novas táticas de controle de inseto que irão reduzir a possibilidade de resistência cruzada às tecnologias de controle existentes. Os métodos tradicionais de criação de 5 resistência do inseto a uma tática de controle envolvem a exposição de cepas suscetíveis adaptadas em laboratório (ou populações de insetos suscetíveis coletadas no campo) a concentrações crescentes da toxina em uma dieta artificial e manutenção de quaisquer sobreviventes após cada geração de h.0 exposição. As desvantagens associadas com esta técnica incluem o grande número de indivíduos necessário para gerar a colônia, especialmente se a frequência de alelos de resistência for extremamente rara na população. Além disso, pelo fato da pressão de seleção aplicada a colônias selecionadas em 15 laboratório ser geralmente menor que a observada no campo, frequentemente este tipo de regime seleciona indivíduos que não reproduzem necessariamente os mecanismos de resistência que provavelmente irão se desenvolvem sob as condições de campo.
A disponibilidade das colônias de insetos com resistência desenvolvida aos inseticidas químicos, ou agentes de proteção incorporados nas plantas, no caso de plantas transgênicas que expressam toxinas inseticidas, ajuda a compreender a importância relativa de quaisquer alterações na 25 suscetibilidade detectadas nas populações de campo através de monitoramento de rotina. Além disso, ela fornece aos pesquisadores a oportunidade de melhorar a sensibilidade de técnicas de monitoramento por identificar o gene ou genes responsáveis pela resistência (por exemplo, uso de ferramentas
11/80 moleculares de alta produtividade para detectar a presença de genes resistentes em populações de campo de diferentes regiões, e monitorar alterações na frequência de alelos). Adicionalmente, as informações geradas a partir de tais 5 colônias são particularmente valiosas como parâmetros de entrada em tentativas de modelagem.
A disponibilidade de uma do campo que sobrevive à expressa a toxina CrylF destes riscos, assim como resistência.
Pelo fato resistência à
CrylF desta colônia serão irão melhorar nossa colônia de FAW selecionada derivada exposição ao material é especialmente útil na validação e melhoria de na do folha que avaliação manejo da da FAW-SPR ser selecionada para no campo, as informações geradas a partir especialmente relevantes para o campo e capacidade de mitigar o desenvolvimento de resistência para preservar a durabilidade de TC1507 nas áreas geográficas onde alelos de resistência ainda são encontrados em menor frequência.
A presente invenção apresenta a produção de uma colônia de ) lagarta do cartucho a partir de várias centenas de ovos 20 coletados em campos de milho em Porto Rico em outubro de 2008 e janeiro de 2009. Pelo fato da origem dos ovos ser Porto Rico, a colônia foi chamada de Colônia de Porto Rico selecionada que é chamada aqui como FAW-SPR. A FAW desta colônia compreende resistência desenvolvida no campo à CrylF.
Para uso na presente invenção, resistência desenvolvida no campo a CrylF significa uma característica hereditária de FAW que confere tolerância intensificada de FAW aos efeitos inseticidas de CrylF e que se originou de um campo agrícola ou
12/80 outro ambiente não laboratorial. Uma FAW que apresenta a resistência desenvolvida no campo a CrylF será capaz de sobreviver a uma dieta que compreende uma concentração mais elevada de CrylF que uma FAW suscetível que não expressa a 5 característica de resistência. Em uma modalidade da invenção, a resistência desenvolvida no campo a CrylF FAW será causada por um único gene ou locus genético, e em outras modalidades, dois ou mais genes podem estar envolvidos. Além disso, é #L0 reconhecido que a resistência desenvolvida no campo pode ser dominante, semi-dominante, ou recessiva. Em uma modalidade da invenção, uma colônia de FAW derivada do campo que compreende resistência desenvolvida no campo à CrylF foi produzida pelos métodos da presente invenção e foi determinado que a resistência desenvolvida no campo à CrylF é causada por um 15 único gene ou locus genético e a resistência era recessiva.
Desta forma, apenas FAW que são homozigotas para o alelo de resistência apresentam resistência intensificada à CrylF, quando comparada à FAW similar que não possui duas cópias do alelo de resistência.
Para uso na presente invenção, FAW suscetível, ou lagarta do cartucho suscetível ou indivíduos suscetíveis significa uma lagarta do cartucho (ou lagartas cartucho) que não apresentam a tolerância intensificada à CrylF aqui descrita.
A presente invenção se refere à produção de uma colônia de lagarta do cartucho que compreende resistência desenvolvida no campo à proteína inseticida CrylF. Por causa da resistência à CrylF desenvolvida em um campo agrícola, acredita-se que o uso de FAW em métodos, por exemplo, para desenvolver estratégias
13/80 de manejo de resistência, é mais vantajoso que o uso de FAW resistente que foi produzida através de um procedimento laboratorial de seleção artificial. Desta forma, as colônias de FAW usadas exemplo, derivadas do campo em ao mecanismo de
A presente derivada do frugiperda) da presente invenção podem ser inúmeros métodos gerenciamento da aprimorados relacionados, por resistência e ao conhecimento do resistência da lagarta do cartucho à CrylF.
invenção apresenta campo de lagarta selecionada para do produção de uma colônia cartucho (FAW, Spodoptera suscetibilidade reduzida a plantas de milho que expressam a proteína inseticida CrylF.
Desta forma, em um aspecto, produzir uma colônia de FAW suscetibilidade reduzida a invenção derivada do plantas de
CrylF. A FAW de tal colônia derivada fornece métodos para campo que compreende milho que produzem do campo compreendem resistência a CrylF desenvolvida no campo.
Os métodos para produzir uma colônia de FAW derivada do campo
que compreende suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem CrylF envolvem coletar FAW, de preferência, FAW que compreende resistência à Cryl, de um campo, particularmente, um campo agrícola que compreende uma ou mais plantas de milho, mais particularmente, um campo agrícola que compreende uma ou mais plantas de milho que expressam a proteína inseticida CrylF, o mais particularmente, um campo agrícola que 25 compreende uma ou mais plantas de milho que compreendem o evento TC1507. As plantas de milho que compreendem o evento TC1507 são plantas de milho transgênicas que produzem CrylF nas suas folhas a partir de um transgene que compreende um
14/80 promotor do gene de ubiquitina de milho (Ubi-1) ligado de maneira funcional a uma molécula de DNA que codifica uma delta-endotoxina de bacilo identificada como CrylF. Plantas de milho que compreendem o evento TC1507 foram apresentadas 5 anteriormente. Consulte, as patentes US n°s 7.449.564;
7.435.807; 7.417.132; e 7.288.643; todas os quais estão aqui incorporadas na sua totalidade por referência. CrylF também ®L0 foi apresentado anteriormente. Consulte, as patentes US n°s
5.188.960 e 6.218.188; ambas aqui incorporadas na sua totalidade por referência.
Tipicamente, a FAW será coletada de um ou mais campos agrícolas nos quais se suspeita de evolução de FAW resistente por causa da observação de números aumentados de FAW em tais campos agrícolas, o que é indicativo da evolução de 15 resistência em uma população de plantas de milho que anteriormente compreendia apenas FAW suscetível.
A FAW pode ser coletada em qualquer estágio de vida (por exemplo, ovo, larvas, pupa, e adulto) embora seja preferencial
coletar ovos por uma questão de conveniência.
Se ovos forem coletados, eles podem ser chocados e pode-se permitir que as larvas resultantes compreende CrylF a para matar resistência preferencial material de todas (neonatos) se alimentem de uma uma concentração eficaz que é as FAW suscetíveis, mas não desenvolvida no da invenção, as folha de plantas campo dieta que suficiente
FAW com
Em uma modalidade larvas são alimentadas com um de milho que expressa CrylF, particularmente, plantas de milho que compreendem o evento de milho TC1507.
15/80
É reconhecido que uma concentração eficaz de CrylF pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, que envolvem variar a concentração de CrylF alimentado aos indivíduos suscetíveis e resistentes e contar os sobreviventes após um 5 certo período de exposição. É reconhecido que os métodos também podem ser usados para determinar a LC50, que a concentração letal na qual 50% dos indivíduos expostos a CrylF não sobrevive.
Permite-se que as larvas
(neonatos) se alimentem da dieta contendo CrylF durante um período tempo suficiente para matar as larvas suscetíveis e a FAW sobrevivente selecionada. Em geral, o período de tempo pelo qual as larvas são expostas à dieta contendo CrylF é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais dias, de preferência, entre 2 e 6 dias, com mais preferência, 15 entre 3 e 5 dias, com a máxima preferência, 4 dias.
Os métodos da invenção podem ainda
FAW sobrevivente sem CrylF para desenvolvimento.
material de folha envolver a transferência da para uma dieta de permitir que os
Tal dieta pode, de milho que não lagarta do cartucho padrão sobreviventes completem o por exemplo, compreender compreende CrylF.
Os métodos podem envolver ainda permitir que a FAW sobrevivente acasale para manter a colônia com uma seleção secundária aplicada periodicamente em gerações subsequentes por alimentar a FAW com uma dieta, conforme descrito acima, 25 que compreende CrylF a uma concentração eficaz que é suficiente para matar todas as FAW suscetíveis, mas não FAW com resistência desenvolvida no campo a partir de plantas de
16/80 milho que expressam CrylF. Os métodos podem envolver ainda selecionar a FAW sobrevivente.
Tipicamente, esta seleção secundária para manter a resistência desenvolvida no campo na colônia será aplicada a cada terceira geração, embora a invenção não dependa da aplicação de uma seleção secundária a uma geração específica. A seleção secundária só precisa ser aplicada de modo suficientemente frequente para manter a resistência desenvolvida no campo na
colônia. Desta forma, a seleção secundária pode ser aplicada a cada geração, à segunda geração, à terceira geração, à quarta geração, à quinta geração, ou mesmo uma geração posterior.
Em uma modalidade, os métodos da presente invenção foram usados para produzir uma colônia de FAW derivada do campo, chamada aqui como FAW-SPR, a partir de ovos coletados em 15 Porto Rico, EUA em um campo de plantas de milho transgênicas compreendendo o evento de milho TC1507. A FAW desta colônia apresenta suscetibilidade reduzida a plantas de milho que compreendem o evento de milho TC1507. A colônia de FAW-SPR foi ) produzida essencialmente da seguinte forma.
1. A colônia de Porto Rico selecionada de lagarta do cartucho (FAW-SPR) foi iniciada por coletar pelo menos 1000 ovos de lagarta do cartucho de campos compreendendo plantas de milho compreendendo o evento de milho TC15O7 em Porto Rico em outubro de 2008 e janeiro de 2009.
2. Ao chegar ao laboratório, os ovos foram incubados a aproximadamente 25°C até a eclosão. A eclosão ocorreu dentro de 1 dia.
17/80
3. As larvas recentemente eclodidas (neonatos) foram expostos a discos de folha expressando CrylF e deixadas crescer por 4 dias.
4. Os sobreviventes foram coletados e transferidos para uma dieta padrão de lagarta do cartucho sem CrylF (por exemplo, milho Isoline) e deixadas completar o desenvolvimento.
5. Os indivíduos que completaram o desenvolvimento são deixados acasalar de modo a manter a colônia.
6. A cada três gerações, é conduzida seleção em tecido de folha que expressa CrylF usando uma população de pelo menos
500 neonatos.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para determinação a herança da resistência de uma colônia de FAW derivada do campo que compreende resistência desenvolvida no 15 campo à CrylF. Os métodos envolvem acasalar FAW resistentes da colônia derivada do campo com FAW que são suscetíveis à CrylF, de preferência, em cruzamentos recíprocos, e analisar as taxas ) de mortalidade da progênie de cada acasalamento quando cultivada na presença de CrylF. Os métodos também podem 20 envolver retrocruzar a progênie de cada acasalamento com FAW resistente. Tais métodos podem ser usados para determinar se a resistência à CrylF é dominante, semi-dominante, ou recessiva ou se ligação ao sexo está envolvida e também podem ser usados para determinar o número de genes de resistência.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para determinar a frequência de alelos de resistência em uma população na qual a resistência não se desenvolveu. Os métodos
18/80 envolvem coletar insetos de um inseto praga de interesse a partir de um campo ou outro local que não seja o laboratório, acasalar adultos virgens dos insetos coletados com adultos virgens de insetos resistentes de uma colônia derivada do 5 campo do inseto praga de interesse de modo que as larvas da progênie sejam produzidas e em que os insetos resistentes compreendam resistência a uma toxina inseticida, permitir que as larvas de progênie do acasalamento se alimentem de uma dieta que compreende toxina inseticida a uma concentração (k.0 que é letal para os insetos do inseto praga de interesse suscetíveis, mas não letal para insetos do inseto praga de interesse resistentes, e determinar a mortalidade.
Tais métodos podem ser usados, por exemplo, no desenvolvimento de estratégias de manejo de resistência.
Em uma modalidade da presente invenção, os métodos para determinar a frequência de alelos de resistência em uma população na qual a resistência não se desenvolveu compreendem coletar FAW de um campo ou outro local não-laboratório, acasalar adultos virgens da FAW coletada com adultos virgens da FAW resistente da colônia derivada do campo, permitir que as larvas do acasalamento se alimentem de uma dieta que compreende CrylF a uma concentração que é letal para FAW suscetível, mas não letal para FAW resistente, e determinar a mortalidade. Tais métodos podem ser usados, por exemplo, no desenvolvimento de estratégias de manejo de resistência.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos de uso de uma colônia derivada do campo de um inseto praga de interesse que compreende um inseto praga de interesse com resistência
19/80 desenvolvida no campo a uma toxina inseticida que é expressa em uma planta transgênica, em particular, uma planta de cultivo transgênica. Tal colônia derivada do campo de um inseto praga de interesse pode ser produzida, por exemplo, 5 pelos métodos aqui apresentados ou por qualquer outro método conhecido na técnica. Tais colônias derivadas do campo incluem, por exemplo, aquelas apresentadas em Tabashnik et al. ((2009) J. Econ. Entomol. 102:2011-2025).
Os métodos da invenção incluem, por exemplo, usar uma colônia derivada do campo de um inseto praga de interesse em métodos:
para entender o mecanismo da resistência do inseto à toxina inseticida; para avaliar o potencial de resistência cruzada da toxina inseticida com qualquer outro inseticida existente ou novos inseticidas ou proteínas inseticidas com atividade 15 contra o inseto praga de interesse; para melhorar as estratégias de monitoramento da resistência para o inseto praga de interesse em localizações geográficas onde as plantas de cultivo que expressam a toxina inseticida foram comercializadas ou estão previstas para serem comercializadas;
para validação de suposições usadas em modelos conhecidos de simulação em computador de risco para resistência para as plantas de cultivo que expressam a toxina inseticida; para avaliar estratégias alternativas de posicionamento de refúgio para plantas de cultivo, como, por exemplo, misturas de 25 sementes ou estratégias de refúgio-em-uma-bolsa; para investigar se as táticas para controle de insetos existentes irão afetar a taxa na qual o inseto praga de interesse pode desenvolver resistência a plantas de cultivo transgênicas que expressam a toxina inseticida sob as condições de campo; para
20/80 desenvolver tecnologia de marcadores moleculares para monitorar o desenvolvimento de resistência (alteração na frequência de alelos resistentes) à toxina inseticida em populações de campo do inseto praga de interesse; e para 5 fornecer uma melhor compreensão sobre o modo de ação da toxina inseticida no controle do inseto praga de interesse.
A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para usar uma colônia de FAW derivada do campo que compreende FAW com resistência desenvolvida no campo à CrylF.
derivada do campo pode ser produzida, métodos aqui apresentados ou conhecido na técnica. Em geral, gerenciamento de resistência à
Tal por por tais
FAW compreendem CrylF e à compreensão do colônia exemplo, de FAW pelos qualquer métodos se em plantas outro método relacionam ao de milho que mecanismo de resistência da lagarta do cartucho à CrylF. Inúmeros de tais métodos de uso de uma colônia de FAW derivada do campo que compreende FAW • com resistência desenvolvida no campo à CrylF são apresentados abaixo, embora muitas modificações e outras modalidades dos métodos aqui apresentados virão à mente do versado na técnica à qual estas invenções pertencem, tendo o beneficio dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriormente mencionadas e nos desenhos associados.
Os métodos da invenção incluem, mas não se limitam ao uso de uma colônia de FAW derivada do campo que compreende FAW com resistência desenvolvida no campo à CrylF:
1. Para entender o mecanismo de resistência da lagarta do cartucho à CrylF; Estas informações irão ajudar no design e desenvolvimento de novas táticas para o gerenciamento da
21/80 resistência da lagarta do cartucho. O mecanismo mais frequente de resistência às toxinas de B. thuringiensis é a modificação do sítio de ligação, que foi mostrada como a base da resistência cruzada entre toxinas CrylA (Ferré e J. Van Rie 5 (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). A partir de uma perspectiva do gerenciamento de resistência, toxinas que agem sobre os mesmos sítios de ligação não devem ser usadas como complementos ou substituições umas para as outras. Por (È10 exemplo, várias espécies de inseto mostraram sítios de ligação comuns para CrylA e CrylJa, aparentemente um padrão geral em espécies lepidópteras (Hua et al. (2001) App. Environ. Microbiol. 67:872-879). Hernandes e Ferré ((2005) Appl.
Environ.
Entomol. 71:5627-5629) mostraram que Helicoverpa armigera,
Helicoverpa zea, e Spodoptera exigua compartilham um receptor comum para CrylAc, CrylFa,
CrylJa através de estudos de ligação usando
1251-CrylAc toxinas de CrylFa biotiniladas.
Este estudo foi conduzido usando cepas de laboratório suscetíveis.
A disponibilidade de uma cepa resistente de
FAW derivada no campo irá permitir, por exemplo, «o a geração de informações relevantes sobre o campo, que podem ajudar no desenvolvimento de estratégias de manejo de resistência.
2. Para avaliar o potencial de resistência cruzada de CrylF com qualquer outro inseticida existente ou novos inseticidas ou proteínas inseticidas com atividade contra lagarta do cartucho. Estas informações irão ajudar no desenvolvimento de novos conceitos de produto como características únicas ou em combinação com TC1507 para minimizar a probabilidade de desenvolvimento de resistência em áreas onde a resistência
22/80 ainda não se desenvolveu. Estudos de resistência cruzada com novos ativos são comumente conduzidos usando bioensaios à base de dieta, conforme descrito por Pereira et al ((2008) Entomologia Experimentalis et Applicata 126:115-121) e 5 Siqueira et al. ((2004) J. Pest Manag. Sei. 90:1189-1196.
3. Para avaliar o potencial de resistência cruzada de TC1507 com quaisquer ativos atuais contra a lagarta do cartucho que podem ser usados em combinação com TC1507 para minimizar a probabilidade de desenvolvimento de resistência em áreas onde a resistência ainda não se desenvolveu. Os estudos de resistência cruzada com ativos comercialmente disponíveis são comumente conduzidos usando bioensaios à base de dieta ou bioensaio à base de tecido, conforme descrito por Pereira et al ((2008) Entomologia Experimentalis et Applicata 126:11515 121), Siqueira et al. ((2004) J. Pest Manag. Sei. 90:11891196, e Crespo et al. ((2009) Pest Manag Sei. 65:1071-1081).
4. Para melhorar as estratégias de monitoramento de resistência da lagarta do cartucho para
TC1507 em milho nos
EUA Continentais e outras localizações evento TC1507 é ou será comercializado, importante pode ser resistência resistência e onde feito em geográficas onde o onde FAW é uma praga ainda não se desenvolveu resistência. Isto por estimar a populações que usando uma triagem de por Gould et al.
frequência de alelos de ainda não desenvolveram
F1 ou F2, conforme descrito ((1997) PNAS 94:3519-3523) e Andow and Alstad ((1998) J. Econ.
5. Para validar
Entomol., 91:572-578), respectivamente.
suposições usadas no modelo de simulação em computador de risco para resistência para o evento TC1507. Por
23/80 exemplo, simulações em computador com base em parâmetros derivados empiricamente, como mortalidade e estimativas de dispersão, serviríam como uma ferramenta aprimorada para indicar melhor se diferentes estratégias de posicionamento de refúgio teriam um impacto sobre o retardo da evolução de resistência em diferentes espécies da população de insetos (Davis e Onstad
2000).
Os parâmetros derivados empiricamente obtidos a partir de cepas suscetíveis e resistentes irá fortalecer as previsões geradas por simulações em computador.
6. Para avaliar estratégias alternativas de posicionamento de refúgio para o evento TC1507, como misturas de sementes ou refúgio-em-uma-bolsa;
Ao proj etar estratégias de posicionamento de refúgio funcionais, alguns dos aspectos que se deve levar com conta incluem a biologia do inseto praga em questão e também aspectos específicos para interações insetoplanta.
Por exemplo, há duas cepas de FAW (cepas de arroz e milho) que são morfologicamente idênticas, mas geneticamente distintas. Estas cepas também diferem fisiologicamente e em comportamento. Um melhor entendimento sobre a biologia destas cepas hospedeiras serviría como uma ferramenta para gerar previsões mais precisas do comportamento da população de lagarta do cartucho no campo (Nagoshi e Meagher (2004) Florida
Entomol. 87:440-449). Outro componente comportamental que importante ao projetar estratégias de posicionamento de refúgio a dispersão do inseto nos estágios de larva adulto.
Os padrões de dispersão do adulto podem ter um impacto sobre o acasalamento aleatório de indivíduos suscetíveis e com potencial resistência que surgem dos campos transgênicos, dependendo da colocação do refúgio (Hunt et al. (2001) J.
24/80
Econ. Entomol. 94:1369-1377). Além disso, embora se considere a mistura de semente como uma estratégia de refúgio, deve-se levar em conta se a sobrevivência diferencial de insetos heterozigotos seria favorecida no caso de movimento larval 5 entre as plantas (Davis e Onstad (2000) J. Econ. Entomol.
93:937-948).
7. Para investigar se cartucho existentes, inseticidas químicos, as táticas para controle de especificamente MON810, Btll, irão afetar a taxa na qual a cartucho pode desenvolver lagarta
MIR162 lagarta do do resistência a TC1507 sob condições de campo naturais. Estas informações seriam geradas com base na presença ou ausência de resistência cruzada entre ou através das táticas de controle de inseto usadas nas localizações geográficas em questão.
8. Para desenvolver tecnologia de marcadores moleculares para monitorar o desenvolvimento de resistência (alteração na frequência de alelos de resistência) em populações de campo de FAW; Isto pode ser feito por estimar a frequência de alelos de resistência em populações que ainda não desenvolveram resistência usando uma triagem de F1 ou F2, conforme descrito por Gould et al. ((1997) PNAS 94:3519-3523) e Andow e Alstad ((1998) J. Econ. Entomol., 91:572-578), respectivamente.
9. Para fornecer uma melhor compreensão sobre o modo de ação da toxina CrylF no controle de FAW. É geralmente aceito que as etapas envolvidas no modo de ação de Bt incluem solubilização da toxina, ativação enzimática, e ligação a receptores no intestino intermediário (Knowles (1994) Advances Insect Physiol. 24:275-308; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol.
25/80
Biol. Rev. 62:775-806; Bravo et al. (2007) Toxicon 49:423435). Cada uma das várias etapas envolvidas no modo de ação de
Bt representa uma oportunidade para adaptação do inseto que poderia resultar em suscetibilidade reduzida ou mesmo resistência completa à exposição a Bt (Schnepf et al. (1998)
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806; Ferré e J. Van Rie (2002)
Annu. Rev. Entomol., 47:501-533; Bravo e
Soberón (2008)
Trends
Biotechnol. 26:573-579).
A suscetibilidade reduzida também poderia se manifestar sob a forma de regeneração do
Alo trato gastrointestinal, sequestro de toxinas ou modificação comportamental (Lockwood et al.
(1984) Bull.
Entomological
Soc. America 30:41-51; Heckel et al. (2007)
J. Invertebrate
Pathol. 95:192-197). Entretanto, as alterações do receptor a forma mais frequentemente relatada de resistência à são
Bt (Ferré e J. Van
Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533) modo de ação do
Bt é complexa e vias de toxicidade não podem ser definidas por nenhuma técnica isolada. Diferenciar claramente o modo de ação de uma toxina de outra pode exigir uma combinação de abordagens, como análises estruturais, estudos de ligação do receptor (Hua et al.
(2001) Appl.
Environ.
Microbiol.
67:872-879;
Sena et al.
(2009) Appl.
Environ.
Microbiol.
75:2236-2237) , estudos de formação de poros (Chen et al. (1993) PNAS 90:9041-9045; Lee et al. (2003)
Appl. Environ. Entomol. 69:4648-4657), e avaliações de resistência cruzada (Pereira et al. (2008) Entomologia
Experimentalis et Applicata 126:115-121; Hernández-Martinez et al. (2009) Pest Manag. Sei. 65:645-650).
É reconhecido que os métodos de uso de uma colônia de FAW derivada do campo apresentados acima e abaixo podem ser usados
26/80 com outros insetos praga de interesse que desenvolveram resistência no campo a uma ou mais toxinas inseticidas que são expressas em pelo menos uma planta, em particular, plantas de cultivo, mais particularmente, plantas de cultivo transgênicas 5 que expressam uma toxina inseticida como, por exemplo, uma toxina de Bt.
Os insetos praga de mas não se limitam ordens Coleoptera, interesse da aos insetos
Diptera,
Mallophaga, Homoptera,
Hemiptera,
Dermaptera, Isoptera,
Anoplura, presente invenção incluem, selecionados
Hymenoptera,
Orthoptera,
Siphonaptera, a partir das
Lepidoptera,
Thysanoptera,
Trichoptera, etc., particularmente, Coleoptera e
Lepidoptera.
Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, lagarta-do-cartucho, lagarta-amarela, lagartas, e heliotines 15 na família Noctuidae Agrotis ipsilonHufnagel (lagarta-rosca);
A. orthogoniaMorrison (lagarta-rosca ocidental); A. segetum Denis & Schiffermüller (traça do nabo); A. subterrânea Fabricius (lagarta granular); Alabama argillaceaHübner (curuquerê); Anticarsia gemmatalisHübner (lagarta-da-soja);
Athetis mindara Barnes e McDunnough (lagarta de pele rugosa); Earias insulana Boisduval (lagarta rosada); E.
vittellaFabricius (lagarta pintada); Egira (Xylomyges) curialis Grote (minador-dos-citros) ; Euxoa messoria Harris (mariposa); Helicoverpa armigeraHübner (lagarta americana); H.
Zea Boddie (lagarta-da-espiga do milho ou lagarta-da-maçã-doalgodoeiro); Heliothis virescens Fabricius (lagarta do tabaco); Hypena scabraFabricius (lagarta desfolhadora); Hyponeuma taltula Schaus; (Mamestra configurata Walker
27/80 (lagarta-do-cartucho bertha); M. Brassicae Linnaeus (lagarta do repolho); Melanchra picta Harris (lagarta zebra); Mocis latipes Guenée (traça de mocis pequena); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-do-cartucho); Pseudoplusia includens Walker 5 (lagarta falsa-medideira); Richia albicosta Smith (lagartarosca ocidental); Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-docartucho) ;
S.
exigua Hübner (lagarta-do-cartucho da beterraba);
S.
litura Fabricius (lagarta-rosca do tabaco, lagarta de cacho); Trichoplusia ni
Hubner (larva do repolho);
βίο brocas, ecatotecas, larva de teias, lagarta cone e esqueletonizantes das famílias Pyralidae e Crambidae como
Achroia grisella Fabricius (mariposa da cera); Amyelois transitella Walker (lagarta
Zeller (mosca do mediterrâneo) ; Cadra cautella
Walker (traça do cacau); Chilo partellus
Swinhoe (broca ponteada); C.
suppressalisWalker
C.
Terrenellus
Pagenstecher (broca-da-cana-de-açucar); Corcyra cephalonica
Stainton (traça do arroz); Crambus caliginosellus
Clemens (lagarta da raiz do milho); C. teterrellus
Zincken (lagarta das gramineas);
Cnaphalocrocis medinalis
Guenée (lagarta enroladeira); Desmia funeralis Hübner (mosca de folha da uva);
Diaphania hyalinata Linnaeus (broca do melão); D. nitidalis Stoll (broca-das-cucurbitácias); Diatraea flavipennella Box; D. grandiosella Dyar (broca do milho do sudoeste), D.
saccharalis Fabricius (broca da cana-de-açucar); Elasmopalpus lignosellus Zeller (lagarta elasmo); Eoreuma loftini Dyar (broca mexicana do arroz); Ephestia elutella Hübner (traça); Galleria mellonella Linnaeus (traça da cera); Hedylepta accepta Butler (enroladeira da cana de açúcar); Herpetogramma
28/80 licarsisalis Walker (traça); Homoeosoma electellum Hulst (traça do girassol); Loxostege sticticalis Linnaeus (traça da baterraba); Maruca testulalis Geyer (lagarta das vagens); Orthaga thyrisalis Walker (traça do chá); Ostrinia nubilalis 5 Hübner (broca européia do milho); Plodia interpunctella Hübner (traça-dos-cereais); Scirpophaga incertulas Walker (broca do colmo);
Udea rubigalis Guenée (traça tortricidae de aipo) traças frutas (larva cabeça tortrix, lagartas, traças de sementes, e traças na família cabeça negra das
Tortricidae Acleris gloveranaWalsingham do oeste); A. variana Fernald (larva da negra do leste); Adoxophyes orana
Fischer von
Rôsslerstamm (traça tortrix da fruta);
incluindoA. argyrospila Walker (lagarta rosanaLinnaeus (broca européia de folha) ;
das
Archips frutas)
Argyrotaenia
SPPe A.
Bonagota salubricola
Meyrick apple leafroller);
Choristoneura spp.;
Cochylis hospes
Walsingham (banded sunflower moth) ; Cydia latiferreana Walsingham (verme
C.
Pomonella Linnaeus (traça da maçã);
Endopiza viteana
Clemens
(traça dos cachos); Eupoecilia ambiguella
Hübner (vinha);
Grapholita molesta Busck (mariposa oriental);
botrana
Denis & Schiffermuller (traça da videira europeia);
Platynota flavedana Clemens (enroladeira multicor); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira onívara); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça acama); e Suleima 25 helianthana Riley (traça do girassol).
Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, Alsophila pometariaHarris (broca do pessegueiro); Anarsia lineatella Zeller (lagarta mineira); Anisota senatoria J.E. Smith (lagarta do carvalho
29/80 com listras laranja); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (bicho-da-seda tasar chinês); Bombyx mori Linnaeus (bicho-daseda); Bucculatrix thurberiella Busck (minador-das-folhas); Colias eurytheme Boisduval (broca da alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da noz); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (bicho-da-seda siberiano), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta do olmo); Erannis tiliaria Harris (larva da tília); Erechthias flavistriata Walsingham (larva da cana-de-açucar); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (platipo); L·) Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletonizante da folha da uva); Heliothis subflexaGuenée; Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de pasto); Hyphantria cunea Drury (larva de teia do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (lombriga do tomate); Lambdina fiscellaria fiscellariaHulst (larva do pinheiro oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (larva do pinheiro ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (traça cetim); Lymantria díspar Linnaeus (traça cigana); Malacosoma spp.; Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão pintada, larva de chifre do «o do tomate, larva
Linnaeus (mariposa vernata
Cramer tomate); M. sexta Haworth (borboleta de de (larva de chifre chifre do fumo; Operophtera brumata inverno); Orgyia spp.;
da primavera); Papilio papilionidea gigante);
Paleacrita cresphontes
Phryganidia californica Packard (larva Califórnia); Phyllocnistis citrella
Stainton (minadora do citrus); Phyllonorycter blancardella
Fabricius (minadora tentiforme); Pieris brassicae
Linnaeus (borboleta branca da couve grande);
P.
rapae
Linnaeus (borboleta branca da couve pequena);
P.
napi
Linnaeus (borboleta branca raiada); Platyptilia carduidactyla Riley
30/80 (traça pluma da alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça das cruciferas); Pectinophora gossypiella Saunders (Lagarta-rosada) ; Pontia protodice Boisduval & Leconte (verme do repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta onívora); Schizura concinna J.E. Smith (red humped caterpillar); Sitotroga cerealella Olivier (traça dos cereais); Telchin licus Drury (broca da cana-de-açúcar gigante); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária);
roupas) ;
Tuta
Tineola bisselliella absoluta Meyrick
Hummel (traça-das(traça-do-tomateiro) eYponomeuta padella Linnaeus (traça arminho).
De interesse são as larvas e adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae, e Curculionidae incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus 15 grandisBoheman (bicudo-do-algodoeiro); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule do girassol); Diaprepes abbreviatus Linnaeus (gorgulho de raiz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha do alho); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (bicheira-da-raiz-norte-americana);
Metamasius hemipterus hemípterusLínnaeus (gorgulho da cana indiana); M. hemipterus sericeus Olivier (gorgulho sedoso da cana); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho granário); S. oryzae Linnaeus (gorgulo do arroz); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho da semente de girassol vermelho); S. sordidus 25 LeConte (lagarta cinza de semente de girassol); Sphenophorus maidis Chittenden (bicudo do milho); S. livis Vaurie (sugarcane weevil); Rhabdoscelus obscurus Boisduval (gorgulho da cana-de-açúcar de Nova Guiné); pulgões, besouro do pepino, crisomelídeos, besouros de folha, besouros da batata e
31/80 minadoes de folhas da família Chrysomelidae incluindo, mas não se limitando a: Chaetocnema ectypa Horn (besouro-pulga do deserto milho); C. pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de videira);
Diabrotica barberi Smith & Lawrence (crisomelídeo do milho do Norte); D. undecimpunctata howardi Barber (lagarta da raiz do milho do virgifera virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental); Leptinotarsa decemlineata Say (besouro da batata do Colorado); Oulema melanopusLinnaeus
Ao (besouro-da-folha-do-cereal);
Phyllotreta cruciferaeGoeze (besouro-pulga do milho); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro de girassol); besouros da família Coccinellidae incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro do feijão mexicano); joaninhas e outros 15 besouros da família Scarabaeidae incluindo, mas não se limitando a: Antitrogus parvulus Britton (lagarta da cana); Cyclocephala borealis Arrow (besouro mascarado do norte); C.
immaculata Olivier (besouro
Dermolepida albohirtum Waterhouse (besouro-da-cana);
Euetheola humilis
rugiceps LeConte (besouro cascudo-preto);
Lepidiota frenchi
Blackburn (lagarta da cana francesa);
Tomarus gibbosus
De Geer (besouro da cenoura); T. subtropicus Blatchley (lagarta da cana-de-açúcar); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); P. latifrons LeConte (besouro de junho); Popillia 25 japonica Newman (besouro Japonês); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (joaninha europeia); besouro de carpete da família
Dermestidae; brocas da família Elateridae, Eleodes spp.,
Melanotus spp. incluindo M. communis Gyllenhal (broca) ;
Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.;
32/80
Aeolus spp.;
besouros de cortiça da família Scolytidae;
besouros da família
Tenebrionidae; besouros da família
Cerambycidae como, mas não se limitando, a Migdolus fryanus
Westwood (besouro de chifre longo); e besouro da família
Buprestidae incluindo, mas não se limitando a Aphanisticus cochinchinae seminulum
Obenberger (besouro buprestid minador de folha)
Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo minadores de folha Agromyza parvicornis Loew (minador de folha do milho); pequenas moscas incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructo rSay (mosca Hessian); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); moscas de fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de fruta); larvas de insetos incluindo, mas não se limitando a: Delia spp. Incluindo Delia platura Meigen (larva da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (mosca doméstica); Meromyza americana Fitch (larva do caule de trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas dométicas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas de face, moscas de chifre, moscas varejeiras, Chrysomya spp.; Phormia spp.; e outras pestes de insetos moscoides, moscas de cavalo Tabanus spp.; gastrófilas Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas de cervídeos Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (carrapatos); e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; borrachudos
33/80
Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos-pólvora mordentes, flebotomíneos, sciarídeos e outros Nematocera.
São incluídos como insetos de interesse aqueles da ordem
Hemiptera como, mas não se limitando a, as seguintes famílias:
Adelgidae,
Aleyrodidae,
Aphididae,
Asterolecaniidae,
Cercopidae,
Cicadellidae,
Cicadidae, Cixiidae, Coccidae,
Coreidae,
Dactylopiidae,
Delphacidae,
Diaspididae,
Eriococcidae,
Flatidae,
Fulgoridae,
Issidae,
Lygaeidae,
Margarodidae,
Membracidae, Miridae,
Ortheziidae, Pentatomidae,
Phoenicococcidae, Phylloxeridae,
Pseudococcidae, Psyllidae,
Pyrrhocoridae e Tingidae.
Membros importantes do ponto de vista agronômico da ordem Hemiptera incluem, mas não se limitam a: Acrosternum hilareSay (percevejo); Acyrthisiphon pisum Harris (pulgão-da-ervilha); Adelges spp. (adelgideos); Adelphocoris rapidus Say (percevejo de plantas); Anasa tristis De Geer (percevejo de legumes); Aphis craccivora Koch (pulgão de feijão-fradinho); A. fabae Scopoli (pulgão de feijão-preto); A. gossypii Glover (pulgão de melão) ; A. maidiradicis Forbes (pulgão da raiz de milho); A. pomi De Geer (pulgão da maçã); A. spiraecolaPatch (pulgão de arbusto); Aulacaspis tegalensis Zehntner (colchonila da cana-de-açucar); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgão dedal); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata-doce); fole de B. argentifoliis Perring (mosca branda da folha prateada); Blissus leucopterus leucopterus Say (percevejo comum); Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Cacopsylla pyricola Foerster (piolho de pereira); Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo
34/80 •o capsideo da batata); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgão do morango); Cimicidae spp.; Coreidae spp.; Corythuca gossypii
Distant sugadora)
Fabricius (percevejo do algodão); Cyrtopeltis modesta (percevejo do tomate); C. notatus Distant (mosca ; Deois citri Ashmead chlorionis Say flavopicta Stâl (cigarrinha);
(mosca branca do (percevejo de noxiaKurdjumov/Mordvilko
Duplachionaspis (pulgão divergensGreen
Dysaphis plantaginea
Dysdercus suturellus
Dysmicoccus boninsis citrus);
alfarroba) russo (colchonilha
Dialeurodes
Diaphnocoris
Diuraphis do trigo) blindada)
Paaserini (pulgão da rosa
Herrich-Schãffer (manchador de
Kuwana açúcar); Empoasca fabaeHarris lanigerum (gafanhoto laranja da da maçã) algodão)
Hausmann (pulgão (piolho farinhento da (gafanhoto da batata);
cana-deEriosoma da maçã); Erythroneoura spp.
da uva); Eumetopina flavipes Muir (cigarrinha cana-de-açucar);
Say (percevejo marrom); E.
(percevej o percevejos da ameixa) com uma pinta) ;
Eurygaster spp.; Euschistus servus variolarius Palisot de Beauvois
Graptostethus spp. (complexo de de semente); e Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgão
Labopidicola striatellus
Icerya allii
Fallen purchasi Maskell (colchonilha
Knight (percevejo (gafanhoto marrom corculus Say (percevejo da tabida Herrich-Schaeffer
Lipaphis erysimiKaltenbach pabulinus
Linnaeus semente da cebola) pequeno);
de pinho);
(percevejo da (pulgão do (capsideo verde do algodão);
; Laodelphax
Leptoglossus
Leptodictya cana-de-açúcar);
nabo); Lygocoris comum);
Lygus lineolarisPalisot de Beauvois (percevejo maculado);
L.
Hesperus Knight (percevejo marrom ocidental); L. pratensis
Linnaeus (percevejo do prado); L. rugulipennis Poppius (pulgão
35/80 manchado europeu); Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgão da batata); Macrosteles quadrilineatusForbes (gafanhoto áster);
Magicicada septendecimLinnaeus (cigarra periódica);
Mahanarva fimbriolata Stâl (cigarrinha da cana-de-açúcar);
M.
posticata
Stâl (cigarrinha de folha da cana de açúcar)
Melanaphis sacchari Zehntner (pulgão da cana de açúcar)
Melanaspis glomerata Green (escama-negra) ;
Metopolophium dirhodum Walker (pulgão-da-folha); Myzus persicae
Sulzer (pulgão da batatapêssego, pulgão do pêssego verde);
Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgão da alface); Nephotettix cinticeps Uhler (gafanhoto verde);
N. nigropictus Stâl (gafanhoto do arroz); Nezara viridula
Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha (percevejo falso); Nysius
Oebalus pugnax Fabricius fasciatus Dallas campestris Linnaeus;
galha); Peregrinus marrom);
raphanus
Nysius
Howard (percevejo do ericae Schilling (percevejo falso);
arroz); Oncopeltus (percevejo grande asclépia);
Pemphigus spp.
maidis Ashmead
Perkinsiella saccharicida Kirkaldy
Orthops (pulgão de raiz e (cirgarrinha do (delfacideo da pulgões milho);
cana-deaçúcar); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de noz pecã); Planococcus citriRisso (colchonila do citrus); Plesiocoris rugicollis Fallen (capsideo da maçã); Poecilocapsus ÜneatusFabricius (percevejo de quatro linhas); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga de algodão);
Pseudococcus spp. (outros percevejos complexos); Pulvinaria elongata Newstead (colchonilha de algodão); Pyrilla perpusilla
Walker (cigarrinha da cana de açúcar); Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochonilha de São José); Reduviidae spp.; Rhopalosiphum maidis Fitch (afideo da folha
36/80 do milho); R. Padi Linnaeus (pulgão da aveia); Saccharicoccus sacchari Cockerell (piolho rosa da cana
Scaptacoris castanea Perty (percevejo marrom) graminum Rondani (pulgão-verde-dos-cereais) ; Schizaphis
Sipha fiava
Forbes (pulgão amarelo da cana-de-açúcar);
Sitobion avenae
Fabricius (pulgão inglês fureiferaHorvath (cigarrinha de dorso branco); Sogatodes oryzicola Muir (delfacídeo do arroz)
Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca)
Therioaphis maculata Buckton (pulgão ®1O pintado da alfafa);
Tinidae spp.; Toxoptera aurantii Boyer de
Fonscolombe (afídeo citricida Kirkaldy de plantas cítricas negro); and T.
(afídeo de plantas cítricas castanho);
Trialeurodes abutiloneus (mosca branca) e T. vaporariorum
Westwood (mosca branca de estufa); Trioza diospyri Ashmead (persimmon psylla); e Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha
Também são incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros) como Aceria tosichellaKeifer (ácaro enrolado do trigo);
Panonychus ulmi Koch (ácaro europeu vermelho); Petrobia latens
Müller (ácaro marrom do trigo); Steneotarsonemus bancrofti
Michael (acarino do acarinos vermelhos grypus Baker & amp;
folha de gramínea açúcar);
pintas) ;
caule da cana-de-açúcar);
da família Tetranychidae,
Pritchard, cana-de-açúcar),
O.
Banks), 0. stickneyi
Tetranychus urticae
T.
acarinos e
Oligonychus
0. indicus Hirst pratensis Banks
McGregor (acarino
Koch medanieli McGregor (acarino da (acarino de da cana-de (ácaro aranha de duas (ácaro McDaniel); T.
cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha do carmim); T. turkestani
Ugarov & Nikolski (acarino do morangueiro), ácaros planos da
37/80 família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de plantas cítricas) ; ácaros de ferrugem e de broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, ácaros da 5 poeira na família Epidermoptidae, ácaros de foliculo na família Demodicidae, ácaros de grão na família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do cervo); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano da paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato americano do
cão) ; Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitário); e ácaros que provocam feridas e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae, e Sarcoptidae.
Pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, como a
Lepisma saccharina Linnaeus (bichinho-de-prata; traça-dos15 livros); Thermobia domestica Packard (termóbia).
Pestes artrópodes adicionais englobadas incluem: aranhas da ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch & amp; Mulaik
(aranha recusa castanha); e Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra); e centopeias da ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).
Além disso, pestes de insetos da ordem Isoptera são de interesse, inclusive aquelas da família termitidae, como, mas não se limitando a, Cornitermes cumulans Kollar, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren e Pseudacanthotermes 25 militaris Hagen (térmite da cana-de-açúcar); bem como aquelas da família Rhinotermitidae incluindo, mas não se limitando, a Heterotermes tenuis Hagen. Os insetos da ordem Thysanoptera também são de interesse, incluindo, mas não se limitando a,
38/80
Stenchaetothrips minutus van Deventer (tripés da cana-deaçúcar) .
A presente invenção usa quaisquer espécies de planta que expressam uma toxina inseticida, particularmente, plantas transgênicas que foram manipuladas para expressar uma toxina inseticida, manipuladas de planta mais para da monocotiledôneas particularmente, plantas de cultivo que foram expressar uma toxina inseticida.
invenção incluem, mas não se e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus,
As espécies limitam a espécies da
B. rapa, B.
juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfalfa (Medicago arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso sativa), (Sorghum milheto (Panicum miliaceum), milheto rabo de raposa (Setaria italica) milheto de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), tinctorius), trigo (Triticum aestivum) , feijão soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), citrus 25 trees (Citrus spp.), cocoa (Theobroma cacao), tea (Camellia sinensis) , banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), noz de macadâmia
39/80 (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais, e coníferas.
Os vegetais comestíveis incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (e.g., vulgaris), (Lathyrus sativus), fei j ão-de-lima
Lactuca sativa), vagem spp.) e membros do gênero Cucumis, como (Phaseolus , ervilha pepino (C.
melão cantalupe (C.
cantalupensis) e melão almiscarado (C. melo). As Plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Hydrangea macrophylla), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.
Coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção loblolly pinheiro incluem, por exemplo, pinheiros como (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro (Pinus contorta) e pinheiro Monterey (Pinus radiata) fir (Pseudotsuga menziesii);
Western pinheiro elliotii), lodgepole
Douglashemlock (Tsuga spruce (Picea glauca);
redwood (Sequoia como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies cedros como cedro vermelho ocidental amarelo do alaska (Chamaecyparis nootkatensis) .
Em modalidades específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol,
Brassica, feijão soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo,
40/80 milheto, tabaco, plantas de milho e algodão são ótimas, e em ainda outras modalidades, plantas de milho são ótimas.
Os métodos da presente invenção podem ser usados com qualquer toxina inseticida que pode ser expressa em uma planta para fornecer resistência à planta a um ou mais insetos praga da invenção. Em algumas modalidades, a proteína inseticida é uma δ-endotoxina de Bacillus spp. ou derivados dessas substâncias
que compreendem atividade inseticida. Tal δ-endotoxina e
10 derivados sintéticos são chamados <
atividade específica das toxinas Bt
benéfica. Ao contrário da maioria dos
Bt não têm um amplo espectro de
inseticidas, atividade, tipicamente não matam insetos de toxinas Bt.
é considerada altamente as toxinas então elas toxinas Bt são não-tóxicas para humanos, animais domesticados benéficos.
os mamíferos, e selvagens
Além disso, as inclusive seres
Em modalidades particulares, a toxina Bt é uma proteína Cry.
Uma lista e Cyt) e tabela 1 de algumas δ-endotoxínas conhecidas seus números
Qualquer uma expressa em uma planta (endotoxinas
Cry de acesso ao Genbank destas toxinas e usada como a métodos aqui apresentados. Além disso, é mencionada inseticidas pode toxina inseticida na ser nos pode ser reconhecido que derivados de qualquer uma ou mais destas proteínas inseticidas podem ser produzidos usando o método conhecido na técnica, como, por exemplo, embaralhamento de DNA para produzir toxinas inseticidas que compreendem, por exemplo, atividade inseticida aumentada contra uma praga de interesse e/ou para alterar a especificidade pela praga alvo da toxina
41/80 inseticida. O uso de tais derivados nos métodos aqui revelados é abrangido pela presente invenção.
Tabela 1: Algumas δ-endotoxinas Conhecidas e seus n°s de Acesso no GenBank®.
Endotoxina N° de acesso no GenBank®
CrylAal
CrylAa2
CrylAa3
CrylAa4
CrylAa5
CrylAaô
CrylAa7
CrylAa8
CrylAa9
CrylAalO
CrylAall
CrylAal2
CrylAal3
CrylAal4
CrylAal5
CrylAbl
AAA22353
AAA22552
BAA00257
CAA31886
BAA04468
AAA86265
AAD46139
126149
BAA77213
AAD55382
CAA70856
AAP80146
AAM44305
AAP40639
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AAA22330
42/80
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5 CrylAbô AAA22420
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• CrylAb8 AAA22551
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• CrylAbl5 AAO13302
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CrylAb22 ABW87320
43/80 semelhante à CrylAb AAK14336 semelhante à CrylAb AAK14337 semelhante à CrylAb AAK14338 semelhante à CrylAb ABG88858
CrylAcl
AAA22331
CrylAc2
AAA22338
CrylAc3
CAA38098
CrylAc4
AAA73077
CrylAc5
AAA22339
CrylAc6
AAA86266
CrylAc7
AAB46989
CrylAc8
AAC44841
CrylAc9
AAB49768
CrylAclO
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CrylAcll
CAA10270
CrylAcl2
112418
CrylAcl3
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CrylAcl4
AAQ06607
CrylAcl5
AAN07788
CrylAcl6
AAU87037
44/80
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CrylAc23 CAQ30431
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CrylAc27 FJ617447
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CrylAdl
AAA22340
CrylAd2
CAA01880
CrylAel
AAA22410
CrylAfl
AAB82749
CrylAgl
AAD46137
CrylAhl
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CrylAh2
ABB76664
CrylAil
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CrylBal CAA29898
45/80
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46/80
CrylCa7
CrylCa8
CrylCa9
CrylCalO
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CrylCall
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CrylCbl
M97880
CrylCb2
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CrylCb3
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CrylDal
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CrylEal
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A15535
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semelhante à CrylH
20 Cryllal CAA44633
AAF01213
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48/80
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49/80
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50/80
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52/80
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53/80
Cry4Bal
Cry4Ba2
Cry4Ba3
Cry4Ba4
Cry4Ba5
CAA30312
CAA30114
AAA22337
BAA00178
CAD30095 semelhante à Cry4Ba ABC47686
Cry4Cal
Cry4Cbl
Cry4Cb2
Cry4Ccl
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Cry5Abl
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Cry5Bal
Cry5Ba2
Cry6Aal
Cry6Aa2
Cry6Aa3
Cry6Bal
Cry7Aal
EU646202
FJ403208
FJ597622
FJ403207
AAA67694
AAA67693
134543
ABQ82087
AAA68598
ABW88932
AAA22357
AAM46849
ABH03377
AAA22358
AAA22351
54/80
Cry7Abl AAA21120
Cry7Ab2 AAA21121
Cry7Ab3 ABX24522
Cry7Ab4 EU380678
5 Cry7Ab5 ABX79555
Cry7Ab6 ACI44005
• Cry7Ab7 FJ940776
Cry7Ab8 GU145299
Cry7Bal ABB70817
10 Cry7Cal ABR67863
Cry7Dal ACQ99547
Cry8Aal AAA21117
Cry8Abl EU044830
• Cry8Bal AAA21118
15 Cry8Bbl CAD57542
Cry8Bcl CAD57543
Cry8Cal AAA21119
Cry8Ca2 AAR98783
Cry8Ca3 EU625349
20 Cry8Dal BAC07226
Cry8Da2 BD133574
55/80
Cry8Da3 BD133575
Cry8Dbl BAF93483
Cry8Eal AAQ73470
Cry8Ea2 EU047597
5 Cry8Fal AAT48690
Cry8Gal AAT46073
• Cry8Ga2 ABC42043
Cry8Ga3 FJ198072
Cry8Hal EF465532
10 Cry8Ial EU381044
Cry8Jal EU625348
Cry8Kal FJ422558
Cry8Ka2 ACN87262
semelhante à Cry8 FJ770571 semelhante à Cry8 ABS53003
Cry9Aal CAA41122
Cry9Aa2 CAA41425
Cry9Aa3 GQ249293
Cry9Aa4 GQ249294 semelhante à Cry9Aa AAQ5237 6
Cry9Bal CAA52927
56/80
Cry9Bbl AAV28716
Cry9Cal CAA85764
Cry9Ca2 AAQ52375
Cry9Dal BAA19948
5 Cry9Da2 AAB97923
Cry9Da3 GQ249295
• Cry9Da4 GQ249297
Cry9Dbl AAX78439
Cry9Eal BAA34908
10 Cry9Ea2 AAO12908
Cry9Ea3 ABM21765
Cry9Ea4 ACE88267
Cry9Ea5 ACF04743
• Cry9Ea6 ACG63872
15 Cry9Ea7 FJ380927
Cry9Ea8 GQ249292
Cry9Ebl CAC50780
Cry9Eb2 GQ249298
Cry9Ecl AAC63366
20 Cry9Edl AAX78440
Cry9Eel GQ249296
57/80 semelhante à Cry9 AAC63366
CrylOAal
CrylOAa2
CrylOAa3
AAA22614
E00614
CAD30098 semelhante à CrylOA DQ167578
CryllAal
CryllAa2
CryllAa3
AAA22352
AAA22611
CAD30081 semelhante à CryllAa
DQ166531
CryllBal
CryllBbl
Cryl2Aal
Cryl3Aal
Cryl4Aal
Cryl5Aal
Cryl6Aal
Cryl7Aal
Cryl8Aal
Cryl8Bal
Cryl8Cal
Cryl9Aal
CAA60504
AAC97162
AAA22355
AAA22356
AAA21516
AAA22333
CAA63860
CAA67841
CAA67506
AAF89667
AAF89668
CAA68875
58/80
Cryl9Bal BAA32397
Cry20Aal AAB93476
Cry20Bal ACS93601
semelhante à Cry20
5 Cry21Aal 132932
Cry21Aa2 166477
• Cry21Bal BAC06484
Cry22Aal 134547
Cry22Aa2 CAD43579
10 Cry22Aa3 ACD93211
Cry22Abl AAK50456
Cry22Ab2 CAD43577
Cry22Bal CAD43578
• Cry23Aal AAF76375
15 Cry24Aal AAC61891
Cry24Bal BAD32657
Cry24Cal CAJ43600
Cry25Aal AAC61892
Cry26Aal AAD25075
20 Cry27Aal BAA82796
GQ144333
Cry28Aal AAD24189
59/80
Cry28Aa2 Cry29Aal AAG00235 CAC80985 CAC80986 BAD00052
Cry30Aal Cry30Bal
5 Cry30Cal BAD67157
Cry30Ca2 ACU24781
• Cry30Dal EF095955
Cry30Dbl BAE80088
Cry30Eal ACC95445
10 Cry30Ea2 FJ499389
Cry30Fal ACI22625
Cry30Gal ACG60020
Cry31Aal BAB11757
• Cry31Aa2 AAL87458
15 Cry31Aa3 BAE79808
Cry31Aa4 BAF32571
Cry31Aa5 BAF32572
Cry31Abl BAE79809
Cry31Ab2 BAF32570
20 Cry31Acl BAF34368
Cry32Aal AAG36711
60/80
Cry32Bal BAB78601
Cry32Cal BAB78602
Cry32Dal BAB78603
Cry33Aal AAL26871
5 Cry34Aal AAG50341
Cry34Aa2 AAK64560
• Cry34Aa3 AAT29032
Cry34Aa4 AAT29030
Cry34Abl AAG41671
10 Cry34Acl AAG50118
Cry34Ac2 AAK64562
Cry34Ac3 AAT29029
Cry34Bal AAK64565
• Cry34Ba2 AAT29033
15 Cry34Ba3 AAT29031
Cry35Aal AAG50342
Cry35Aa2 AAK64561
Cry35Aa3 AAT29028
Cry35Aa4 AAT29025
20 Cry35Abl AAG41672
Cry35Ab2 AAK64563
61/80
Cry35Ab3 AY536891
Cry35Acl AAG50117
Cry35Bal AAK64566
Cry35Ba2 AAT29027
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Cry36Aal AAK64558
• Cry37Aal AAF76376
Cry38Aal AAK64559
Cry39Aal BAB72016
10 Cry40Aal BAB72018
Cry40Bal BAC77648
Cry40Cal EU381045
Cry40Dal ACF15199
• Cry41Aal BAD35157
15 Cry41Abl BAD35163
Cry42Aal BAD35166
Cry43Aal BAD15301
Cry43Aa2 BAD95474
Cry43Bal BAD15303
20 semelhante à Cry43
BAD15305
Cry44Aa BAD08532
62/80
Cry45Aa BAD22577
Cry4 6Aa BAC79010
Cry46Aa2 BAG68906
Cry46Ab BAD35170
5 Cry47Aa AAY24695
Cry48Aa CAJ18351
• Cry48Aa2 CAJ86545
Cry48Aa3 CAJ86546
Cry48Ab CAJ86548
10 Cry48Ab2 CAJ86549
Cry49Aa CAH56541
Cry49Aa2 CAJ86541
Cry49Aa3 CAJ86543
• Cry49Aa4 CAJ86544
15 Cry49Abl CAJ86542
Cry50Aal BAE86999
Cry51Aal ABI14444
Cry52Aal EF613489
Cry52Bal FJ361760
20 Cry53Aal EF633476
Cry53Abl FJ361759
63/80
Cry54Aal ACA52194
Cry55Aal ABW88931
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Cry56Aal FJ597621
Cry56Aa2 GQ483512
Cry57Aal ANC87261
Cry58Aal ANC87260
Cry59Aal ACR43758
CytlAal X03182
CytlAa2 X04338
CytlAa3 Y00135
CytlAa4 M35968
CytlAa5 AL731825
CytlAa6 ABC17640
semelhante à CytlAa ABB01172
CytlAbl X98793
CytlBal U37196
CytlCal AL731825
Cyt2Aal Z14147
Cyt2Aa2 AF472606
Cyt2Aa3 EU835185
64/80
Cyt2Bal
Cyt2Ba2
Cyt2Ba3
Cyt2Ba4
Cyt2Ba5
Cyt2Ba6
Cyt2Ba7
Cyt2Ba8
Cyt2Ba9
Cyt2BalO
Cyt2Ball
Cyt2Bal2
U52043
AF020789
AF022884
AF022885
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AF034926
AF215645
AF215646
AL731825
ACX54358
ACX54359
ACX54360 semelhante à Cyt2Ba ABE99695
Cyt2Bbl U82519
Cyt2Bcl CAC80987 semelhante à Cyt2B DQ341380
Cyt2Cal AAK50455
Desconhecido
AAA22332
Desconhecido
AAL26870
Desconhecido
CAA63374
Desconhecido
BAA13073
65/80
Desconhecido CAA67205
Desconhecido CAA67329
Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração mas sem que isto constitua uma limitação.
Exemplo 1
Produção da Colônia de Lagarta do Cartucho Derivada no Campo Selecionada para Suscetibilidade Reduzida a Plantas de Milho que Expressam a Proteína Inseticida CrylF.
Uma colônia de lagarta do cartucho que exibe resistência selecionada no campo a milho que expressa o evento TC1507 foi estabelecida em um laboratório. 0 processo pelo qual a colônia foi produzida compreendeu as seguintes etapas.
1. A colônia de Porto Rico selecionada (FAW-SPR) foi iniciada por coletar pelo menos 1000 ovos de lagarta do cartucho de campos em Porto Rico em outubro de 2008 e novamente em janeiro de 2009.
2. Ao chegar ao laboratório, os ovos foram incubados a aproximadamente
25°C até a eclosão.
A eclosão ocorreu dentro de dia.
3.
As larvas recentemente eclodidas (neonatos) foram expostas discos de folha expressando CrylF de plantas de milho compreendendo evento TC1507 e deixadas crescer por 4 dias. A concentração de
CrylF nos discos de folha foi 12,1 ± 6,2 g/mg de peso seco de tecido de folha.
66/80
4. Os sobreviventes foram coletados e transferidos para uma dieta padrão de lagarta do cartucho e deixadas completar o desenvolvimento. Os sobreviventes das coletas de outubro de 2008 e janeiro de 2009 foram combinados.
5. Os indivíduos que completaram o desenvolvimento são deixados acasalar aleatoriamente de modo a manter a colônia.
6. A cada três gerações, é conduzida seleção em tecido de folha que expressa CrylF de plantas de milho que compreendem o
evento TC1507 usando uma população de pelo menos 500 neonatos.
Exemplo 2
Caracterização de Resistência à CrylF em Lagarta do Cartucho
Usando uma Colônia Derivada do Campo
Um estudo foi conduzido para caracterizar a suscetibilidade da colônia de Porto Rico à CrylF usando um ensaio de diagnóstico.
A caracterização da suscetibilidade de FAW-SPR à toxina inseticida CrylF de Bt foi avaliada mediante a medição dos efeitos de dar material de folha de FAW-SPR de plantas de milho que compreendem o evento TC1507 (expressam CrylF) sobre neonatos (larvas <24 h após a eclosão) . O sistema de teste teve como objetivo o uso de neonatos que foram expostos a um disco de folha, das substâncias de teste ou de controle, em uma bandeja multi-arena. Os discos de folha eram a única fonte alimentar para as larvas pela duração do experimento. Discos de folha frescos foram adicionados conforme necessário para fornecer uma fonte constante de alimento. As folhas coletadas na estufa foram enxaguadas com água corrente. As bandejas multi-arena tiveram sua umidade controlada por colocar uma
67/80 camada de fundo de ágar dentro de cada poço. Este sistema de
teste já foi validado e usado para medir os efeitos
inseticidas das proteínas incorporadas nas plantas.
A exposição das larvas ao tecido de folha fresco foi escolhida
como um meio de administração porque ela é representativa da exposição do inseto aos protetores incorporados nas plantas nas condições do campo. Além disso, os efeitos destas proteínas inseticidas são antibióticos e antixenóticos e a
exposição ao tecido da planta pode ser mais realista do ponto de vista ecológico. Este método de administração foi escolhido em relação a um ensaio de resposta à dosagem com base em dieta usando proteína pura ou tecido vegetal liofilizado por causa dos efeitos causadores de confusão que poderíam resultar de tentar imitar a exposição da larva relevante no campo.
A substância para teste era tecido de folha fresco cultivado em estufa de plantas de milho híbridas contendo o evento que expressa a proteína inseticida CrylF de Bacillus thuringiensis (evento TC1507). 0 controle para os efeitos naturais do sistema de teste (controle negativo) era tecido de folha fresco cultivado em estufa de plantas de milho híbridas em fundo genético similar (milho Isoline) isento de eventos que expressam proteínas inseticidas (milho Isoline). 0 controle tinha um ou ambos os parentais endogâmicos em comum com o híbrido de teste.
O tecido das substâncias de teste e de controle foram sistematicamente amostradas a partir de folhas similares. As substâncias de teste e de controle foram submetidas a ELISA quantitativo para determinar o nível de expressão da proteína
68/80
CrylF em tecido TC1507 e confirmar a ausência da expressão de proteína CrylF em tecido de Isoline.
As bandejas foram preparadas por fazer uma solução de ágar a
2% e pipetar 1 ml de solução de ágar morna em cada poço de uma bandeja de 128 poços (CV International). A solução de ágar foi deixada para resfriar naturalmente e solidificar e um disco de tecido de folha de milho recentemente coletado foi colocado em cada poço. Na medida em que o tecido foi coletado para o
experimento, perfurações de folha foram obtidas para ELISA quantitativo e submetidas imediatamente à avaliação. Uma FAWSPR neonata foi colocada em cada poço e uma tampa foi colocada de forma segura sobre o poço para evitar escape do inseto. Os insetos foram monitorados diariamente quanto à mortalidade e reservas de alimento. 0 alimento foi substituído conforme necessário durante a duração do teste. A mortalidade do neonato foi monitorada diariamente e as contagens de mortalidade foram feitas no final do período de exposição de 4 dias.
As bandejas foram colocadas em uma câmara de crescimento com temperatura-alvo de 25°C (± 5°C), umidade relativa > 60% e escuro total.
experimento foi conduzido usando um design de bloco incompleto randomizado com 32 réplicas para a substância para teste e 4 réplicas para a substância de controle. Cada réplica 25 consistiu em 16 observações por tratamento em uma bandeja multi-arena. A unidade experimental foi composta por um poço individual na bandeja de 128 poços (CV International). Cada bandeja foi marcada com o número do estudo e tratamentos
69/80 individual dentro de cada bandeja foram marcadas para identificar o tratamento e o número da replicação usando tinta indelével.
Os grupos de tratamento foram os seguintes:
Tratamento 1: 512 indivíduos de FAW-SPR alimentados com material de folha de plantas de milho compreendendo o evento TC1507 (evento que expressa CrylF), e
Tratamento 2: 64 indivíduos de FAW-SPR alimentados com material de folha de plantas de milho Isoline que não expressam CrylF (controle negativo).
Os resultados da exposição de FAW-SPR ao material de folha de plantas de milho que expressam o evento TC1507 são apresentados na tabela 2. Nenhuma larva da cepa suscetível (FAW-lab) foi capaz de sobreviver à exposição ao material de 15 folha TC1507 (tabela 2) . Os dados apresentados mostram que a população de FAW-SPR foi capaz de sobreviver ao material de origem vegetal de TC1507 de maneira similar a sua sobrevivência em tecido de planta de milho Isoline, sugerindo um nível significativamente reduzido de suscetibilidade à 20 toxina CrylF.
Tabela 2 Resposta de FAW-SPR e FAW-lab à Alimentação com Material de Folha que expressa CrylF de Plantas de Milho TC1507
Material de planta* n° de indivíduos Mortalidade (%)
FAW-SPR TC1507 512 5,2
Isoline 64 4,7
70/80
FAW-lab TC1507 32 100
Isoline 32 9,4 * O material da planta TC1507 compreende CrylF. O material da planta Isoline não possui CrylF.
Desta forma, o presente estudo indicou que a população de S.
frugiperda coletada no campo FAW-SPR mostrou altos teores de resistência à CrylF, conforme mostrado pela sobrevivência de
neonatos no tecido de folha de TC1507.
O desenvolvimento de uma colônia de lagarta do cartucho que mostrou tal alto grau de resistência apresenta várias oportunidades para investigação e uso de colônias tolerantes ao evento. Adicionalmente, pelo fato da resistência à CrylF ter se desenvolvido no campo, podería ser esperado que a colônia de FAW-SPR refletisse mais intimamente a tolerância que se desenvolve naturalmente através de exposição repetida no campo ao invés da tolerância artificial desenvolvida através de exposição progressiva no laboratório.
Exemplo 3
Caracterização Adicional da Resistência à CrylF em Lagarta do 20 Cartucho Usando uma Colônia Derivada do Campo
A resistência à CrylF que foi identificada em populações de lagarta do cartucho (FAW) coletadas de Porto Rico e usadas para produzir a colônia derivada do campo (FAW-SPR) que é descrita nos exemplos 1 e 2 foi caracterizada adicionalmente e 25 usada para estimar o risco de evolução da resistência em populações de FAW que são atualmente suscetíveis à CrylF.
71/80
1. Desenvolver estoques genéticos de FAW resistente e estabelecer métodos de bioensaio para quantificar os níveis de resistência.
Uma etapa chave no desenvolvimento de uma estratégia de gerenciamento de resistência racional é desenvolver colônias selecionadas no laboratório que mostram altos teores de resistência a uma toxina específica. A disponibilidade de cepas resistentes permitirá análise genética subsequente da herança da resistência, a determinação da base bioquímica e fisiológica da resistência e, potencialmente, o desenvolvimento de sondas moleculares para monitorar a evolução da resistência no campo. A colônia resistente de FAW de Porto Rico que é descrita no Exemplo 1 acima será usada como o material de partida para o desenvolvimento das colônias selecionadas no laboratório.
A manutenção da colônia resistente à CrylF será obtida pela exposição das larvas neonatas ao material de folha de plantas de milho que expressam CrylF. As larvas neonatas individuais (pelo menos 1.000 por geração) serão expostas a discos de folha de híbridos de milho que compreendem o evento TC1507. As larvas sobreviventes (as que iniciaram a alimentação e cresceram além do Io instar) serão transferidas para uma dieta não-tratada e cultivadas até a idade adulta usando técnicas de criação padrão.
Um bioensaio das larvas de FAW neonatas foi conduzido para quantificar o nível de resistência identificado na cepa resistente à CrylF e para avaliar a resistência cruzada a outras toxinas Bt. Os bioensaios envolveram técnicas
72/80 desenvolvidas anteriormente para ensaios com broca europeia do milho (Marçon et al. 1999). Para exposição, as toxinas Bt foram aplicadas à superfície de poços isolados de dieta artificial em bandejas de 128 poços (cada poço com 16 mm de 5 diâmetro x 16 mm de altura; CD International, Pitman, NJ,
EUA). As soluções de toxina foram preparadas em 0,1% de
Triton-X 100 para obter espalhamento uniforme da solução Bt sobre a superfície da dieta. As larvas neonatas individuais foram colocadas em poços contendo a dieta e a mortalidade e
peso larval combinados foram registrados sete dias mais tarde.
Os tratamentos de controle consistiram em poços tratados com
0,1% de Triton-X 100. Ao se registrar a mortalidade, as larvas que não cresceram além do primeiro instar (isto é, <0,1 mg) foram consideradas mortas. Os bioensaios foram conduzidos em 15 duplicata em três datas diferentes e incluíram pelo menos cinco concentrações de Bt que produziram mortalidade >0, mas <100%. Os dados foram analisados por análise de próbite (Finney (1971)
Probit analysis,
Cambridge University Press,
Inglaterra; Programa LeOra (1987) POLO-PC
A user's guide to
probit and logist analysis, Berkeley,
CA, EUA) para determinar as concentrações letais. A mortalidade observada é corrigida para a mortalidade nos tratamentos de controle, e as concentrações letais com 95% de limites fíduciais são calculadas. Os pesos das larvas são transformados em % de 25 inibição do crescimento em relação aos controles, e estes dados são analisados por regressão não-linear (Marçon et al.
(1999) J. Econ. Entomol. colônia selecionada serão colônias de laboratório
92:2799-285). Os bioensaios da comparados com pelo menos duas não selecionadas disponíveis
73/80 atualmente no nosso laboratório para estimar as razões de ...
resistência.
Para medir a sobrevivência da colônia selecionada sobre o tecido de milho que expressa CrylF, discos de folha de plantas de milho V3-V5 que haviam sido mantidos sob condições de estufa e que foram testados para expressão de CrylF usando imunoensaios padrão serão utilizados. Os discos de folha (0,5 cm de diâmetro) são colocados sobre um poço de ágar solidificado nas bandejas do bioensaio descritas acima, e um único neonato é colocado em cada poço. Permite-se que as larvas se alimentem por quatro dias, e a mortalidade e as estimativas qualitativas do consumo de folha são registradas após quatro dias. As respostas a plantas que expressam CrylF e a plantas Isoline não-Bt serão determinadas para as cepas selecionadas e de controle.
2. Determinar a herança da resistência (isto é, dominância, ligação do sexo, número de genes de resistência)
Um componente chave do gerenciamento de resistência bem sucedido de qualquer espécie de praga é a determinação da expressão genética da resistência (isto é, dominante e recessivo, autossômico vs. ligado ao sexo) associada com um dado mecanismo de resistência. Outro fator importante é identificar o número de genes associados com a resistência. Os dados genéticos são essenciais para diferenciar entre resistência cruzada (a ocorrência de um mecanismo que confere resistência a várias toxinas diferentes) e resistência múltipla (vários mecanismos coexistentes, cada um dos quais conferindo resistência a um ou mais pesticidas diferentes).
74/80
Adicionalmente, algumas táticas de gerenciamento de resistência, como a abordagem de alta dose/refúgio proposta para o milho Bt, são dependentes de um dado padrão de herança embora dados para suportar tal herança sejam geralmente 5 inexistentes. Finalmente, a disponibilidade de cepas de genótipos suscetíveis e resistentes conhecidos pode ser usada para aprimorar os bioensaios de diagnóstico usados em programas de monitoramento.
cruzamentos
A herança da resistência à CrylF foi determinada usando
Uma porção submetida a recíprocos de da progênie um bioensaio parentais resistentes e suscetíveis.
F1 de cruzamentos individuais foi para a suscetibilidade de Bt usando técnicas descritas anteriormente. As curvas de mortalidade foram avaliadas para a ligação ao sexo e para avaliar o grau 15 de dominância (Stone (1968) Bull. WHO 38:325-329; Alves et al.
(2006) J. Econ. Entomol., 99:494-501). Pelo fato da resistência ser causada por uma característica autossômica, a progênie de um único par de cruzamentos foi retro-cruzada à cepa parental suscetível ou resistente. A progênie foi 20 submetida a um bioensaio para determinar se a resistência é conferida por um único fator genético ou se múltiplos genes estavam envolvidos com base no desvio da razão esperada de 1:1 dos genótipos RS a SS para herança de um único fator. Curvas de resposta foram geradas para os vários genótipos para 25 estimar as frequências dos alelos (consulte abaixo).
3. Estimar a frequência dos alelos de resistência em populações onde a resistência não se desenvolveu usando uma triagem F1 ou F2 para detectar alelos de resistência
75/80
Conforme descrito por Gould et al. ((1997) PNAS 94:3519-3523) se uma cepa resistente homozigota (RR) estiver disponível resistência for recessiva, as estimativas da frequência do alelo de resistência podem ser obtidas através de acasalamentos de um unico par de indivíduos coletados do campo com indivíduos resistentes da colônia de laboratório resistente. Pelo fato de os alelos de resistência estarem mais provavelmente presentes em heterozigotos antes de um episódio de resistência ou falha do controle (Roush e Daly (1990) The «o role of population genetics in resistance research and management, em Pesticide resistance in arthropods, Roush e
Tabashnik, eds., pg. 97 a 152, Chapman e Hall, NY, EUA), acasalamentos de pares únicos da colônia do laboratório resistente (RR) com indivíduos coletados do campo resultará em progênie (Fl) que é
100% RS se o indivíduo coletado no campo for SS ou uma razão de 1RR:1RS se o parental coletado no campo carregar um alelo de resistência.
A triagem desta progênie a uma concentração de
Bt que discrimina entre os genótipos RS e
RR fornecería um «o resistência raros.
estimativas determinadas meio eficaz para selecionar alelos de
Na similares usando uma ausência de das frequências uma cepa resistente, do alelo podem ser abordagem F2 (Andow e Alstad (1998) J.
Econ. Entomol., 91:572-578) na qual uma etapa de endogamia permite a expressão de alelos recessivos.
As coletas do campo de FAW foram obtidas como larvas dos campos de milho. Um campo não-Bt foi selecionado, o qual é está o mais distante possível do campo Bt mais próximo para minimizar a possibilidade de que a seleção local pudesse resultar em uma distribuição não-uniforme de alelos
76/80 resistência através da paisagem e, portanto, aumentar artificialmente a estimativa da frequência do alelo de resistência.
4. Consequências da resistência sobre a aptidão reprodutora
Compensações (associações negativas entre as características) ocorrem comumente entre as características chave dos organismos, como fecundidade, longevidade, duração do desenvolvimento constringem fortemente a evolução das
características individuais. Há uma crescente aprecicação da importância no gerenciamento da resistência de identificar compensações entre a resistência e outras características, especialmente com relação à mitigação da resistência. Um foco da pesquisa do gerenciamento da resistência de insetos (IRM) é documentar a existência de compensações entre resistência e componentes de aptidão para a cepa resistente. A existência de tais compensações, ou sua falta, irá influenciar a estratégia particular usada para gerenciar a resistência e potencialmente
mitigar o surto de resistência, se ele ocorrer.
Informações sobre as potenciais compensações entre resistência à toxina Bt e outras características do organismo virão de estudos sobre o mecanismo da resistência à Bt na população de campo resistente de Porto Rico. Antes de iniciarmos as comparações de aptidão, iremos estabelecer as linhagens isogênicas próximas resistentes e suscetíveis por cruzamento repetido e retro-cruzamento combinado com seleção para minimizar as diferenças genéticas entre as cepas que poderíam confundir as avaliações das compensações de aptidão. As características de aptidão chave, como o tempo de
77/80 desenvolvimento, fecundidade e longevidade em cepas suscetíveis e resistentes serão medidas. As pupas serão isoladas individualmente das cepas resistentes e suscetíveis para se obter machos e fêmeas virgens. Os pares macho-fêmea 5 emergentes serão mantidos em gaiolas de lua-de-mel para que os parâmetros de aptidão (peso pupal, n° das massas do ovo, peso da massa do ovo, tempo até a primeira oviposição e longevidade) possam ser registrados para pares individuais
(Siegfried et al. (2001) Entomol. Exper. Appl. 100: 15-20).
Exemplo 4
Nível de Resistência em
Lagartas do Cartucho a Partir de FAWSPR
Para avaliar o nível partir de FAW-SPR, de resistência em lagartas do cartucho a bioensaios foram conduzidos com FAW da colônia de FAW-SPR apresentada no exemplo 1 e FAW suscetível de uma colônia de laboratório
As FAW foram expostas a dietas compreendendo quantidades diferentes de
CrylF, conforme descrito no exemplo 3. Os resultados dos bioensaios foram usados para determinar que colônia suscetível tinha uma
LC50= 18,6 ng/cm2, a colônia resistente (FAW-SPR) tinha uma
LC50 de mais que 7200 ng/cm2.
A concentração do diagnóstico também foi determinada como sendo
200 ng/cm2 e a razão da resistência foi maior que ou igual a
387,1
Exemplo 5
Herança da
Resistência em Lagartas do Cartucho a Partir de
FAW-SPR
78/80
Para avaliar a herança da resistência em lagartas do cartucho a partir de FAW-SPR, foram feitos cruzamentos recíprocos entre FAW resistentes da colônia FAW-SPR apresentada no exemplo 1 e FAW suscetíveis, a progênie resultante foi testada para 5 mortalidade, e as curvas de mortalidade foram preparadas conforme descrito no exemplo 3. Retrocruzamentos também foram conduzidos, conforme descrito no exemplo 3.
Os resultados dos cruzamentos recíprocos e retrocruzamentos são ilustrados nas figuras 1
2, respectivamente. Os resultados revelaram que a herança da resistência em FAW-SPR é recessiva, autossômica e conferida por um único gene.
Exemplo 6
Frequência no
As na
Texas e da Resistência em Populações de Lagarta do na Flórida lagartas
Flórida desenvolveu
Rico, onde
Entretanto,
Cartucho do cartucho foram coletadas de campos no onde a resistência da FAW à
Há uma interação limitada entre a resistência se desenvolveu e a
CrylF
Texas e não se a FAW de Porto
FAW no Texas.
é sabido que há uma troca significativa entre a
FAW no Porto Rico e na Flórida (Nagoshi et al. (2010) J. Econ.
Entomol. 103:360-367). As FAW da FAW-SPR foram indivíduos de populações foi bioavaliada para a exemplo 3.
Os resultados tabela 3.
Tabela 3.
Texas e da cruzadas com do Texas e da Flórida mortalidade conforme dos bioensaios estão e a progênie descrito resumidos
Frequência da Resistência nas Populações de FAW
Flórida.
no na do
79/80
Flórida Texas
Famílias testadas 2918 n° SS 2318 n° Sr 6*0 n° rr 00 * Confirmados como Sr em F2.
A partir destes resultados, a frequência do alelo resistente (r) na população da Flórida foi estimada como aproximadamente 0,1. Na população do Texas, o alelo de resistência não foi detectado.
0 artigo um e uma são usados na presente invenção para
referir-se a um ou mais de um (isto é, pelo menos um) do
objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, um
elemento significa um ou mais elementos.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na
especificação são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as publicações, pedidos de patente e sequências de nucleotídeos e aminoácidos referidos pelos números de acesso ao Genbank estão aqui incorporadas, a título de referência, com a mesma abrangência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.
Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos
80/80 ®ιο para os propósitos de clareza de entendimento, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas. Muitas modificações e outras modalidades da invenção aqui descrita virão à mente de um versado na técnica à qual estas invenções pertencem tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições supracitadas e desenhos associados. Portanto, deve ser compreendido que a invenção não deve ser limitada às modalidades específicas apresentadas e que as modificações e outras modalidades são destinadas a serem incluídas dentro do escopo das reivindicações em anexo. Embora termos específicos sejam empregados na presente invenção, eles são usados apenas em um sentido genérico e descritivo e não para fins de limitação.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produzir uma colônia derivada do campo de lagartas do cartucho (FAW) que compreendem suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem Cry1F, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender:
    (a) coletar FAW de um campo agrícola que compreende plantas de milho que expressam Cry1F;
    (b) permitir que as FAW se alimentem de uma dieta que compreende uma concentração eficaz de CrylF de 200 ng/cm2 ou maior, sendo que a concentração eficaz é suficiente para matar mais que 50% da FAW suscetível;
    (c) selecionar as FAW sobreviventes;
    (d) determinar a zigosidade das FAW sobreviventes; e (e) formar uma colônia de FAW sobreviventes que são homozigotos para a resistência desenvolvida no campo a CrylF, e em que a colônia de sobreviventes FAW tem uma relação de resistência maior ou igual a 387.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente:
    (a) acasalar FAW resistentes da colônia derivada do campo com FAW que são suscetíveis à CrylF de modo a produzir progênie; e (b) analisar as taxas de mortalidade da progênie de cada acasalamento quando cultivada na presença de Cry1F.
    Petição 870180168444, de 27/12/2018, pág. 9/15
    2/2
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente retrocruzar a progênie de (a) com a FAW resistente da colônia derivada do campo.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise das taxas de mortalidade compreende preparar uma ou mais curvas de mortalidade.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é usado para determinar a herança da resistência de uma colônia de FAW derivada do campo que compreende resistência desenvolvida no campo à Cry1F.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dieta compreende material de folha de plantas de milho que compreendem o evento TC1507.
BR112013014427-0A 2010-12-12 2011-12-09 Método para produzir uma colônia derivada do campo de lagartas do cartucho (faw) que compreendem suscetibilidade reduzida a plantas de milho que produzem cry1f, colônia de faw BR112013014427B1 (pt)

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