BR112012014665B1 - Constructo de dna, método para obtenção de uma planta transformada, molécula de ácido nucleico isolada, amplicon, métodos de produção de sementes de milho híbridas, para produzir uma planta de milho resistente às pestes lepidoptera, para a produção de uma planta de milho resistente ao menos ao crisomelídeo do milho, de detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico, de detecção da presença do dna e kit para detectar ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

CONSTRUCTO DE DNA, PLANTA, SEMENTE, EVENTO DE MILHO DP-004-3, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, AMPLICON, AMOSTRA BIOLÓGICA, EXTRATO E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE SEMENTES DE MILHO HÍBRIDAS, PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE ÁS PESTES LEPIDOPTERA, PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE AO MENOS AO CRISOMELÍDEO DO MILHO, DE DETERMINAÇÃO DA ZIGOSIDADE DO DNA DE UMA PLANTA DE MILHO, DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, PAR DE INICIADORES DE KIT PARA DETECTAR ÁCIDOS NUCLEICOS. A invenção fornece composições de DNA que se referem a plantas de milho resistentes a insetos transgênicas. São também fornecidos ensaios para detectar a presença do evento de milho DP- 0004114-3 com base na sequência de DNA do constructo recombinante inserido no genoma do milho e as sequências de DNA que flanqueiam o sítio de inserção. Kits e condições úteis para realizar os ensaios são fornecidos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] As modalidades da presente invenção referem-se ao campo de biologia molecular vegetal, especificamente à modalidade da invenção relacionada aos constructos de DNA para conferir resistência a insetos a uma planta. As modalidades da invenção referem-se mais especificamente ao evento de planta de milho resistente a inseto DP-004114-3 e aos ensaios para detectar a presença do evento de milho DP-004114-3 em uma amostra e composições do mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Uma modalidade desta invenção refere-se à planta de milho resistente a inseto (Zea mays) DP-004114-3, também chamada de “linha de milho DP-004114-3,” “evento de milho DP-004114-3,” e “MILHO 4114,” e ao constructo de expressão de DNA vegetal da planta de milho DP-004114-3 e a detecção da região de inserção de transgene/flanqueadora na planta de milho DP-004114-3 e a progenia da mesma.

[003] Milho é uma safra importante e é uma fonte de alimento principal em muitas áreas do mundo. Danos causados por pragas de insetos é um fator principal na perda de safras de milho no mundo, apesar do uso de medidas de proteção como pesticidas químicos. Em vista disso, a resistência a insetos foi geneticamente elaborada em safras como milho a fim de controlar danos a insetos e para reduzir a necessidade de pesticidas químicos tradicionais. Um grupo de genes que foram utilizados para a produção de safras resistentes a insetos transgênicas é o grupo da delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis (Bt). Delta-endotoxinas foram expressas corretamente em plantas de safra como algodão, batatas, arroz, girassol, bem como milho, e provaram proporcionar excelente controle sobre as pestes de insetos. (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8:939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:313-321; Fujimoto, H. et al. (1993) Bio/Technology 11:1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; Publicação PCT WO 01/13731; e Bing, J.W. et al. (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO, EUA).

[004] A expressão de genes estrangeiros em plantas é conhecida por ser influenciada pelas suas localizações no genoma vegetal, provavelmente devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade de elementos regulatórios transcricionais (por exemplo, intensificadores) próximos do sítio de integração (Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. volume 22, páginas 421 a 477. Ao mesmo tempo a presença do transgene em locais diferentes no genoma irá influenciar o fenótipo como um todo da planta em diferentes formas. Por esta razão, é comumente necessário testar um grande número de eventos a fim de identificar um evento caracterizado pela expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, foi observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma grande variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também haver diferenças nos padrões espacial ou temporal de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que podem não corresponder aos padrões esperados a partir de elementos regulatórios transcricionais presentes no constructo de gene introduzido. Por esta razão, é comum produzir centenas de milhares de eventos diferentes e fazer a varredura daqueles eventos para um único evento que possua níveis de expressão de transgene desejados e padrões para fins comerciais. Um evento que possui níveis desejados de padrões de expressão de transgene é útil para introgredir o transgene em outros cenários genéticos por fertilização sexuada cruzada com outras plantas com o uso de métodos de geração convencionais. A progenia de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar a expressão gênica confiável em inúmeras variedades que são bem adaptadas às condições de crescimento locais.

[005] Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de um evento particular a fim de determinar se a progenia de um cruzamento sexuado contém um transgene de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular poderia ser útil para atender os regulamentos que exigem a aprovação pré- comercialização e rotulagem dos alimentos derivados de plantas de safras recombinantes, por exemplo, ou para o uso no monitoramento ambiental, características de monitoramento em safras no campo, ou monitoramento de produtos derivados de uma colheita de safra, bem como para o uso na garantia da adesão das partes sujeitas aos termos regulatórios ou contratuais.

[006] É possível detectar a presença de um transgene por um método de detecção de ácido nucleico conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando, à reação em cadeia de polimerase (PCR) ou hibridização de DNA com o uso de sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção em geral focam em elementos genéticos frequentemente usados, como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., porque para muitos constructos de DNA, a região codificadora é intercambiável. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos com o uso do mesmo constructo de DNA ou constructos muito semelhantes a não ser que a sequência de DNA do DNA flanqueador adjacente ao DNA heterólogo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR de evento específico é descrito na patente US n° 6.395.485 para a detecção do evento de elite GAT-ZM1. Consequentemente, seria desejável possuir um método simples e discriminativo para a identificação do evento DP-004114-3.

RESUMO DA INVENÇÃO

[007] As modalidades desta invenção referem-se aos métodos para produzir e selecionar uma planta de safra monocotiledônea resistente a insetos. Mais especificamente, um constructo de DNA é fornecido que, quando expresso em células vegetais e plantas confere resistência aos insetos. De acordo com um aspecto da invenção, um constructo de DNA, capaz de introduzir em e se replicar em uma célula hospedeiro, é fornecido que, quando expresso em células vegetais e plantas, confere resistência a insetos para as células vegetais e plantas. O evento de milho DP-004114-3 foi produzido por transformação mediada por Agrobacterium com o plasmídio PHP27118. Este evento contém os cassetes de gene cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat que conferem resistência a certas pestes de lepidoptera e coleoptera, bem como tolerância à fosfofinotricina.

[008] Especificamente, o primeiro cassete contém uma versão truncada do gene cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai. A inserção do gene cry1F confere resistência aos danos por pestes lepidoptera. A proteína Cry1F (SEQ ID n° 1) é compreendida por 605 aminoácidos e tem um peso molecular de aproximadamente 68 KDa. A expressão do gene cry1F é controlada pelo promotor de poliubiquitina de milho (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 118(4):675-89), proporcionando expressão constitutiva da proteína Cry1F no milho. Esta região inclui, também, a região 5’ não-traduzida (UTR) e o íntron associado ao promotor de poliubiquitina nativo. O terminador para o gene cry1F gene é o sinal de poli(A)adição do Quadro de Leitura Aberto 25 (ORF 25) do plasmídio Ti de Agrobacterium tumefaciens pTi15955 (Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol. volume 2, páginas 335 a 350.

[009] O segundo cassete contém o gene cry34Ab1 isolado da cepa de Bacillus thuringiensis PS149B1 (Patente U.S. n° 6.127.180; 6.624.145 e 6.340.593). A proteína Cry34Ab1 (SEQ ID n° 2) possui 123 resíduos de aminoácido de comprimento e tem um peso molecular de aproximadamente 14 KDa. A expressão do gene cry34Ab1 é controlada por uma segunda cópia do promotor de poliubiquitina de milho com 5’ UTR e íntron (Christensen et al., 1992, supra). O terminador para o gene cry34Ab1 é o terminador pinII (Keil et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-5650; An et al. (1989) Plant Cell 1:115-22).

[0010] O terceiro cassete de gene contém o gene cry35Ab1 gene, também isolado da cepa de Bacillus thuringiensis PS149B1 (Patente U.S. n° 6.083.499; 6.548.291 e 6.340.593). A proteína cry35Ab1 (SEQ ID n° 3) tem um comprimento de 383 aminoácidos e um peso molecular de aproximadamente 44 KDa. A expressão simultânea das proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 na planta confere resistência aos insetos de coleoptera. A expressão do gene cry35Ab1 é controlada pelo promotor da peroxidase de Triticum aestivum (trigo) e pela sequência de iniciação (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. volume 16, páginas 171 a 174. O terminador para o gene cry35Ab1 é uma segunda cópia do terminador pinII (Keil et al., 1986, supra; An et al., 1989, supra).

[0011] O quarto e último cassete do gene contém uma versão do gene da fosfofinotricina acetil transferase de Streptomyces viridochromogenes (pat) que foi otimizado para expressão no milho. O gene pat expressa a enzima fosfofinotricina acetila transferase (PAT) que confere tolerância à fosfofinotricina. A proteína PAT (SEQ ID n° 4) é uma de 183 resíduos de aminoácidos de comprimento e tem um peso molecular de aproximadamente 21 KDa. A expressão do gene pat é controlada pelas regiões promotora e terminadora do transcrito CaMV 35S (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Pietrzak, et al. (1986) Nucleic Acids Res. volume 14, páginas 5857 a 5868. Plantas contendo os constructos de DNA são também apresentadas.

[0012] De acordo com uma outra modalidade da invenção, composições e métodos são fornecidos para identificar uma nova planta de milho designada DP-004114-3. Os métodos são à base de iniciadores ou sondas que reconhecem especificamente a sequência flanqueadora 5’ e/ou 3’ de DP-004114-3. As moléculas de DNA são fornecidas que compreendem sequências iniciadoras que, quando utilizadas em uma reação de PCR, irão produzir amplicons únicos para o evento transgênicoDP-004114-3. A planta de milho e a semente compreendendo essas moléculas é uma modalidade desta invenção. Além disso kits que utilizam essas sequências iniciadoras para a identificação do evento DP-004114-3 são fornecidas.

[0013] Uma modalidade adicional da invenção refere-se à sequência flanqueadora específica de DP-004114-3 aqui descrita, que pode ser usada para desenvolver métodos de identificação específicos para DP-004114-3 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se às regiões flanqueadoras 5’ e/ou 3’ de DP-004114-3 que podem ser usadas para o desenvolvimento de iniciadores e sondas específicos. Uma modalidade adicional da invenção refere-se aos métodos de identificação para a presença de DP-004114-3 em amostras biológicas com base no uso de tais iniciadores ou sondas específicos.

[0014] De acordo com uma outra modalidade da invenção, métodos de detecção da presença de DNA correspondendo ao evento de milho DP-004114-3 em uma amostra são fornecidos. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra que compreende DNA com um conjunto iniciador de DNA, que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico extraído do evento de milho DP-004114-3 produz um amplicon que é diagnóstico para o evento de milho DP-004114-3; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, por meio disso produzindo o amplicon; e (c) detectar o amplicon.

[0015] De acordo com uma outra modalidade da invenção, métodos de detecção da presença de uma molécula de DNA que corresponde ao evento DP-004114-3 em uma amostra, tais métodos que compreendem: (a) contatar a amostras que compreende DNA extraído de uma planta de milho com uma molécula de sonda de DNA que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA extraído do evento de milho DP-004114-3 e não hibridiza sob as condições de hibridização rigorosas com um DNA de planta de milho controle; (b) submeter a amostra e a sonda às condições de hibridização estringentes; e (c) detectar a hibridização da sonda ao DNA. Mais especificamente, um método para detectar a presença de uma molécula de DNA correspondendo ao evento DP-004114-3 em uma tomar amostras, tais métodos consistindo em (a) contatar a amostra que compreende DNA extraído de uma planta de milho com uma molécula de sonda de DNA que consiste de sequências que são únicas para o evento, por exemplo, sequências de junção, em que a dita molécula de sonda de DNA hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA extraído do evento de milho DP- 004114-3 e não hibridiza sob as condições de hibridização estringentes com um DNA de planta de milho controle; (b) submeter a amostra e a sonda às condições de hibridização estringentes; e (c) detectar a hibridização da sonda ao DNA.

[0016] Além disso, um kit e métodos para identificar o evento DP-004114-3 em uma amostra biológica que detecta uma região específica de DP-004114-3 são fornecidos.

[0017] Moléculas de DNA são fornecidas que compreendem ao menos uma sequência de junção de DP-004114-3; em que uma sequência de junção estende-se sobre a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de milho flanqueando o sítio de inserção isto é flanqueando o DNA, e é diagnóstico para o evento DP-004114-3.

[0018] De acordo com uma outra modalidade da invenção, métodos de produção de uma planta de milho resistente a insetos que compreendem as etapas de: (a) efetuar o cruzamento sexuado de uma primeira linhagem de milho de origem que compreende os cassetes de expressão da invenção, que confere resistência aos insetos, e uma segunda linhagem de milho de origem que não tem resistência a insetos, por meio disso produzindo uma pluralidade de plantas de progenia; e (b) selecionar uma planta de progenia que é resistente a insetos. Tais métodos podem, opcionalmente, compreender a etapa adicional de cruzamento reverso da planta de progenia com a segunda linhagem de milho de origem para produzir uma planta de milho de geração verdadeira que é resistente a insetos.

[0019] Uma modalidade adicional da invenção fornece um método de produção de uma planta de milho que é resistente a insetos que compreende transformar uma célula de milho com o constructo de DNA PHP27118, crescendo a célula de milho transformada em uma planta de milho, selecionar a planta de milho que mostra resistência a insetos, e adicionalmente crescendo a planta de milho em uma planta de milho fértil. A planta de milho fértil pode ser auto polinizada ou cruzada com variedades de milho compatíveis para produzir progenia resistente a insetos.

[0020] Outra modalidade da invenção refere-se ainda a um kit de detecção de DNA para identificar o evento de milho DP-0041143 em amostras biológicas. O kit compreende um primeiro iniciador que reconhece especificamente a região flanqueadora 5’ ou 3’ de DP-004114-3, e um segundo iniciador que reconhece especificamente uma sequência dentro do DNA estrangeiro de DP- 004114-3, ou dentro do DNA flanqueador, para uso em um protocolo de identificação de PCR. Uma modalidade adicional da invenção refere-se a um kit para identificar o evento DP-004114-3 em amostras biológicas, o dito kit compreende uma sonda específica apresentando uma sequência que corresponde ou é complementar a uma sequência apresentando entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma região específica do evento DP-004114-3. A sequência da sonda corresponde a uma região específica que compreende parte da região flanqueadora 5’ ou 3’ do evento DP- 004114-3.

[0021] Os métodos e kits englobados pelas modalidades da presente invenção podem ser usados para finalidades diferentes como, mas não se limitando, ao seguinte: para identificar o evento DP-004114-3 em plantas, material de origem vegetal ou em produtos como, mas não se limitando, aos produtos alimentícios ou de ração (frescos ou processados) que compreendem, ou são derivados de material de origem vegetal; adicional ou alternativamente, os métodos e kits podem ser usados para identificar material vegetal transgênico para fins de segregação entre material transgênico e não transgênico; adicional ou alternativamente, os métodos e kits podem ser usados para determinar a qualidade do material de origem vegetal que compreende o evento de milho DP-004114-3. Os kits podem conter, também, os reagentes e materiais necessários para o desempenho do método de detecção.

[0022] Uma outra modalidade dessa invenção refere-se à planta de milho DP-004114-3 ou às suas partes, incluindo, mas não se limitando, ao pólen, óvulos, células vegetais, os núcleos das células de pólen e os núcleos das células ovo da planta de milho DP-004114-3 e a progenia derivada destas. A planta de milho e a semente de DP-004114-3 do qual as moléculas iniciadoras de DNA fornecem um produto de amplicon específico é uma modalidade da invenção.

[0023] O que foi anteriormente mencionado e outros aspectos da invenção ficarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e desenho em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] Figura 1. Diagrama esquemático do plasmídio PHP27118 com elementos genéticos indicados e sítios da enzima de restrição Hind III. O tamanho do plasmídio é de 54910 pb.

[0025] Figura 2. Diagrama esquemático do T-DNA indicando os genes cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat (setas) juntamente com os seus respectivos elementos regulatórios. Os sítios da enzima de restrição Hind III no T-DNA são indicados. O tamanho do T-DNA é de 11978 pb.

[0026] Figura 3. Diagrama esquemático da Transformação e Desenvolvimento de DP-004114-3.

[0027] Figura 4. Os efeitos do desenvolvimento de larvas do crisomelídeo do milho (WCRW) no ensaio de mudas subletal que utiliza mudas híbridas de milho no mesmo fundo genético: Milho DP-004114-3 com uma isolina como um controle negativo. Os resultados são à base de três réplicas. Os perfis gráficos mostram a porcentagem de larvas em cada um dos três ínstares em 17 dias após a incubação do ovo. Um deslocamento para o instar 3 indica uma diminuição na eficácia.

[0028] Figura 5. Representação esquemática da inserção e das regiões de borda genômicas sequenciadas no milho 4114. O diagrama indica os fragmentos de PCR gerados a partir do DNA genômico do milho 4114 que foram clonados e sequenciados: fragmentos A até F. A linha tracejadas verticais representa as junções da borda/inserção genômicas. Os fragmentos G e H representam as regiões de borda genômicas 5’ e 3’, respectivamente. A figura não é desenhada em escala.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] AS definições e métodos a seguir são fornecidos para melhor definir a presente invenção e para guiar os elementos versados na técnica na prática da presente invenção. Exceto onde especificado em contrário, termos devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional pelas pessoas normalmente versadas na técnica relevante. Definições de termos comuns na biologia molecular pode também ser encontrados em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, SpringerVerlag; New York, E.U.A., 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. A nomenclatura para bases de DNA conforme estabelecida em 37 CFR §1.822 é usada.

[0030] A tabela a seguir estabelece abreviações utilizadas em todo este documento, e em particular na seção Exemplos. Tabela de Abreviaturas

[0031] Composições desta revelação incluem sementes depositadas como o Depósito de Patente n° PTA-11506 e plantas, células vegetais e sementes derivadas disso. Os requerente(s) fizeram um depósito de ao menos 2500 sementes do evento de milho DP-004114-3 com a American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209 USA, em 24 de novembro de 2010, e os depósitos foram atribuídos so Depósito ATCC n° PTA-11506. Esses depósitos serão mantidos sob os termos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para fins de Procedimento de Patentes. Esses depósitos foram feitos meramente como uma a conveniência para as pessoas versadas na técnica e não são uma aceitação de que um depósito é necessário sob o 35 U.S.C. §112. As sementes depositadas com ATCC no dia 24 de novembro de 2010 foram tomadas do depósito mantido por Pioneer Hi-Bred International, Inc., 7250 NW 62nd Avenue, Johnston, Iowa 50131-1000. Acesso a este depósito será disponível durante a pendência do aplicação ao Comissionário de Marcas e Patentes e pessoas determinadas pelo Comissionário a serem intituladas a isso mediante solicitação. Mediante a aprovação de quaisquer reivindicações no pedido, os Requerente(s) disponibilizarão ao público, de acordo com 37 C.F.R. § 1.808, amostra(s) do depósito de ao menos 2500 sementes de milho híbrido com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Este depósito de sementes do evento de milho DP- 004114-3 será mantido no depositório ATCC, que é um depositório público, durante um período de 30 anos, ou 5 anos após a solicitação mais recente, ou pela vida executável da patente, o que for mais longo, e será substituído se ele se tornar não viável durante aquele período. Adicionalmente, os Requerente(s) cumpriram todos os requerimentos de 37 C.F.R. §§1.801 - 1.809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade da amostra no depósito. Os requerente(s) não têm autoridade para ceder a quaisquer restrições impostas pela lei sobre a transferência de material biológico ou seu transporte no comércio. Os requerente(s) não abrem mão de qualquer violação dos seus direitos garantidos sob stea patente ou direitos aplicáveis ao evento DP- 004114-3 sob o Ato de Proteção de Variedade Vegetal (7 USC 2321 et seq.). Multiplicação de sementes não autorizada proibida. A semente pode ser regulada.

[0032] Conforme usado na presente invenção, o termo “que compreende” significa “incluindo, mas não se limitando a”.

[0033] Conforme usado na presente invenção, o termo “milho” significa Zea mays ou milho (variedade de milho graúdo) e inclui todas as variedades de plantas que podem ser cruzadas com milho, incluindo espécies de mais.

[0034] Para uso na presente invenção, o termo “DP-004114-3 específico” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é adequada para identificar discriminativamente o evento DP- 004114-3 em plantas, material de origem vegetal ou em produtos como, mas não se limitando a produtos alimentícios ou de ração (frescos ou processados) que compreendem ou são derivados de material de origem vegetal.

[0035] Para uso na presente invenção, os termos “resistência a insetos” e “impactando as pestes de inseto” refere-se à realização de alterações na alimentação do inseto, crescimento e/ou comportamento em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao: extermínio do inseto; retardamento do crescimento; prevenção da capacidade reprodutora; inibição da alimentação; e similares.

[0036] Para uso na presente invenção, os termos “atividade pesticida” e “atividade inseticida” são usados como sinônimos para se referir à atividade de um organismo ou de uma substância (como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida por vários parâmetros incluindo, mas não se limitando, à mortalidade da peste, perda de peso da peste, atração da peste, repelência da peste e outras mudanças comportamentais e físicas de uma peste após alimentação em e/ou exposição ao organismo ou substância por uma duração de tempo apropriada. Por exemplo “proteínas pesticidas” são proteínas que exibem atividade pesticida por si mesmas ou em combinação com outras proteínas.

[0037] “Sequência de codificação” refere-se a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Para uso na presente invenção, os termos “codificando” ou “codificado” quando usados no contexto de um ácido nucleico especificado compreende a informação requerida para guiar a tradução da guia sequência de nucleotídeos em uma proteína especificada. As informações segundo as quais uma proteína é codificada são especificadas pelo uso de códons. Um ácido nucleico codificador de uma proteína pode compreender sequências não traduzidas (por exemplo, íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucleico ou pode não conter tais sequências não traduzidasintervenientes (porexemplo, como em cDNA).

[0038] “Gene” refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras precedentes (sequências 5’ não codificantes) e após (sequências 3’ não codificantes) da sequência de codificação. “Gene nativo” refere-se a um gene conforme encontrado na Natureza com as suas próprias sequências reguladoras. “Gene quimérico” refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas junto na Natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, porém dispostas de um modo diferente do que aquele encontrado na Natureza. “Gene endógeno” refere-se a um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. “Estrangeiro” refere-se a um material não encontrado normalmente no local de interesse. Dessa forma, o “DNA estrangeiro” pode compreender um DNA recombinante bem como DNA rearranjado, recém-introduzidos, da planta. Um gene “estrangeiro” refere-se a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro pela transferência de gene. Genes estrangeiros podem compreender genes naturais inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um “transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. O sítio no genoma vegetal onde um DNA recombinante foi inserido pode ser chamado de “sítio de inserção” ou “sítio alvo”.

[0039] Para uso na presente invenção, “DNA de inserção” refere-se ao DNA heterólogo dentro dos cassetes de expressão usados para transformar o material de origem vegetal, enquanto que “DNA flanqueador” pode existir no DNA genômico naturalmente presente em um organismo, como uma planta, ou DNA estrangeiro (heterólogo) introduzido através do processo de transformação que é estranho à molécula de DNA de inserção original, por exemplo fragmentos associados com o evento de transformação. Uma “região flanqueadora” ou “sequência flanqueadora”, para uso na presente invenção, refere-se à sequência de ao menos 20 pb, de preferência de ao menos 50 pb, e até 5000 pb, que está situada imediatamente à montante de e contígua com ou imediatamente à jusante de e contígua com a molécula de DNA de inserção estrangeira original. Procedimentos de transformação levando à integração aleatória do DNA estrangeiro irá resultar em transformantes contendo diferentes regiões flanqueadoras características e únicas para cada transformante. Quando DNA recombinante é introduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, suas regiões flanqueadoras não serão geralmente modificadas. Transformantes também conterão junções únicas entre um pedaço de DNA de inserção heteróloga e DNA genômico, ou dois (2) pedaços de DNA genômico, ou dois (2) pedaços de DNA heterólogo. Uma “junção” é um ponto onde dois (2) fragmentos de DNA específico se unem. Por exemplo, uma junção existe onde o DAN de inserção se une ao DNA flanqueador. Um ponto de junção também existe em um organismo transformado, onde dois (2) fragmentos de DNA se unem de modo que é modificado em relação àquele encontrado no organismo nativo. “DNA de junção” refere-se ao DNA que compreende um ponto de junção. Duas sequências de junção estabelecidas nesta revelação são o ponto de junção entre o DNA genômico do milho e a extremidade 5’ da inserção, conforme estabelecido na SEQ ID n° 27, e o ponto de junção entre a extremidade 3’ da inserção e o DNA genômico do milho conforme estabelecido na SEQ ID n° 28.

[0040] Para uso na presente invenção, o termo “heterólogo”, em referência a um ácido nucleico, é um ácido nucleico que origina-se de um espécie estranha, ou caso seja originado da mesma espécie, é modificado substancialmente de sua forma nativa em composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeo heteróloga pode ser de uma espécie diferente daquela que a sequência de nucleotídeo foi derivada, ou, se for da mesma espécie, o promotor não é naturalmente encontrado ligado de maneira funcional à sequência de nucleotídeo. Uma proteína heteróloga pode originar-se de uma espécie, estranha, ou, caso seja originada da mesma espécie, é modificada substancialmente de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[0041] “Sequências reguladoras” refere-se às sequências de nucleotídeo localizadas à montante (sequências não codificantes 5’), dentro ou à jusante (sequências não codificadoras 3’) de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.

[0042] “Promotor” refere-se a uma sequência de nucleotídeo capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma sequência de codificação está situada 3' a uma sequência promotora. A sequência promotora consiste de elementos à montante proximais e mais distais, os últimos elementos sendo comumente referidos como intensificadores. Consequentemente, um “intensificador” é uma sequência de nucleotídeo que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para melhorar o nível de especificidade de tecido de um promotor. Promotores podem ser derivados nas suas totalidades de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na Natureza, ou mesmo compreender segmentos de segmentos de nucleotídeos. É compreendido pelas pessoas versadas na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Promotores que fazem com que um fragmento de ácido nucleico seja expresso na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são comumente denominados “promotores constitutivos”. Novos promotores de diversos tipos úteis em células vegetais são constantemente revelados; Vários exemplos podem ser encontrados na compilação por Okamuro e Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. É adicionalmente reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de ácido nucleico de diferentes comprimentos podem possuir atividade promotora idêntica.

[0043] A “sequência de iniciação de tradução” refere-se a uma sequência de nucleotídeo localizada entre a sequência promotora de um gene e a sequência de codificação. A sequência de iniciação de tradução está presente no mRNA completamente processado à montante da sequência de partida de tradução. A sequência de iniciação de tradução pode afetar vários parâmetros, incluindo o processamento do transcrito primário ao mRNA, a estabilidade do mRNA e/ou eficiência de tradução. Exemplos de sequências líder de tradução foram descritas (Turner e Foster (1995) Mol. Biotechnol. volume 3, páginas 225 a 236.

[0044] As “sequências não codificadoras 3’” refere-se às sequências de nucleotídeo localizadas à jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais regulatórios capazes de afetar o processamento de mRNA ou a expressão de genes. O sinal de poliadenilação é comumente caracterizado por afetar a adição das regiões do ácido poliadenílico à extremidade 3’ do precursor de mRNA. O uso de diferentes sequências não codificadoras 3’ é exemplificado por Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680.

[0045] Uma “proteína” ou “polipeptídeo” é uma cadeia de aminoácidos disposta em uma ordem específica determinada pela sequência de codificação em um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[0046] Um constructo de DNA é um conjunto de moléculas de DNA unidas que proporcionam um ou mais cassetes de expressão. O constructo de DNA pode ser um plasmídio que é capaz de se auto replicar em uma célula bacteriana e contém vários sítios de restrição da enzima endonuclease que são úteis para introduzir moléculas de DNA que proporcionam elementos genéticos funcionais, isto é, promotores, íntrons, líderes, sequências codificadoras, regiões de terminação 3’, dentre outros; ou um constructo de DNA pode ser um conjunto linear de moléculas de DNA, como um cassete de expressão. O cassete de expressão contido no interior de um constructo de DNA compreende os elementos genéticos necessários para proporcionar a transcrição de um RNA mensageiro. O cassete de expressão pode ser projetado para expressar em células procariotas ou em células eucariotas. Cassetes de expressão das modalidades da presente invenção são projetados para expressar em células vegetais.

[0047] As moléculas de DNA das modalidades da invenção são fornecidas em cassetes de expressão para expressão em um organismo de interesse. O cassete irá incluir sequências reguladoras 5’ e 3' ligadas de maneira funcional a uma sequência de codificação. 'Ligado de maneira funcional' significa que as sequências de ácido nucleico que estão sendo ligadas são contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, são contíguas e na mesma fase de leitura. Ligado de maneira funcional é destinado a indicar uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, sendo que a sequência do promotor inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. O cassete pode conter, adicionalmente, pelo menos um gene adicional a cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional/adicionais podem ser fornecidos em múltiplos cassetes de expressão ou em múltiplos constructos de DNA.

[0048] O cassete de expressão irá incluir na direção 5’ para 3’ de transcrição: uma região de iniciação transcricional e de tradução, uma região codificadora e uma região transcricional e de tradução funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação transcricional (isto é, o promotor) pode ser nativa ou análoga, ou estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter as sequências líder 5’ no constructo do cassete de expressão. Estas sequências líder podem atuar acentuando a tradução.

[0049] Deve-se compreender que, para uso na presente invenção, o termo “transgênico” incluem qualquer célula, linhagem de células, calo, tecido, parte de planta ou planta cujo genótipo foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo, inclusive aqueles transgênicos inicialmente assim alterados, bem como aqueles criados por meio de cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. O termo “transgênico”, para uso na presente invenção, não abrange a alteração do genoma (cromossômico ou extracromossômico) através de métodos de reprodução de planta convencionais ou através de eventos de ocorrência natural como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[0050] Um “evento” transgênico é produzido pela transformação de células vegetais com (um) constructo(s) de DNA heterólogo, incluindo um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta e seleção de uma planta específica caracterizada pela inserção em um local específico do genoma. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. No nível genético, um evento faz parte da constituição genética de uma planta. O termo “evento” também refere-se à progênie produzida por um cruzamento sem parentesco próximo entre o transformante e inclui outra variedade que inclui DNA heterólogo. Mesmo após o cruzamento reverso repetido para uma origem recorrente, o DNA inserido e o DNA flanqueador da origem transformada está presente na progenia do cruzamento no mesmo local cromossômico. O termo “evento” também refere-se ao DNA do transformante original que compreende o DNA inserido e a sequência flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que se esperaria que fosse transferido para uma progenia que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexuado de uma linhagem de origem que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progenia resultante da autopolinização) e uma linhagem de origem que não contém o DNA inserido.

[0051] Uma planta de milho resistente a insetos DP-004114-3 pode ser be produzida primeiro pelo cruzamento sexuado de uma primeira planta de milho de origem que consiste em uma planta de milho crescida a partir da planta de milho transgênica DP-0041143 e a sua progenia derivada da transformação com os cassetes de expressão das modalidades da presente invenção que confere resistência a insetos, e uma segunda planta de milho de origem que não tem resistência a insetos, por meio disso produzindo uma pluralidade de primeiras plantas de progenia; e, então, selecioando uma primeira planta de progenia que é resistente a insetos; e autopolinização a primeira planta de progenia, por meio disso produzindo uma pluralidade das segundas plantas de progenia; e, então, selecionando as segundas plantas de progenia e plantas resistentes a insetos. Estas etapas podem incluir, ainda, o cruzamento reverso da primeira planta de progenia resistente a insetos ou a segunda planta de progenia resistente a insetos ou uma terceira planta de milho de origem, por meio disso produzindo uma planta de milho que é resistente a insetos.

[0052] Para uso na presente invenção, o termo “planta” inclui referência a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), sementes, células vegetais e a progênie da mesma. Partes de plantas transgênicas entendidas como estando dentro do escopo da invenção compreendem, por exemplo, células de plantas, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, caules, frutos, folhas e raízes que se originam em plantas transgênicas ou sua progênie anteriormente transformada com uma molécula de DNA da invenção e consistindo, portanto, pelo menos em parte, em células transgênicas, também são uma modalidade da presente invenção.

[0053] Conforme usado na presente invenção, o termo “célula de planta” inclui, sem limitações, sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos da invenção é em geral tão ampla quanto a classe de plantas superiores tratáveis por técnicas de transformação, incluindo plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

[0054] “Transformação” refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico no genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são chamados de organismos “transgênicos”. Exemplos de métodos de transformação vegetal incluem transformação mediada por Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) e tecnologia de transformação acelerada por partícula ou de “arma de gene” (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70-73; patente US n° 4.945.050, aqui incorporadas, a título de referência). Métodos de transformação adicionais são apresentados abaixo.

[0055] Dessa forma, polinucleotídeos isolados da invenção podem ser incorporados em constructos recombinantes, tipicamente em constructos de DNA, que são capazes de introduzir e replicar em uma célula hospedeira. Tal construir pode ser um vetor que inclui um sistema de replicação e sequências que são capazes de transcrição e tradução de uma sequência que codifica polipeptídeo em uma dada célula hospedeira. Uma variedade de vetores adequados para a transfecção estável e células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foi descrita, por exemplo, em Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach e Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York, E.U.A.); e Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Tipicamente, vetores de expressão de plantas incluem, por exemplo, um ou mais genes de plantas clonados sob o controle transcricional das sequências reguladoras 5' e 3' e um marcador selecionável dominante. Esses vetores de expressão podem conter uma região reguladora de promotor (por exemplo uma região regulatória que controla a expressão induzível ou constitutiva, regulada pelo ambiente ou desenvolvimento, ou específica de célula ou tecido), um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sítio de ligação de ribossoma, um sinal de processamento de RNA, um sítio de terminação de transcrição eou um sinal de poliadenilação.

[0056] Deve-se também compreender que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser acasaladas para produzir uma descendência que contém dois genes independentemente segregadores adicionados exógenos. A autopolinização de uma progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento de uma planta parental e sem parentesco próximo com uma planta não-transgênica também é contemplado, como é o caso da propagação vegetativa. As descrições de outros métodos de reprodução comumente usados para traços e safras diferentes podem ser encontrados em uma das várias referências, por exemplo, em Fehr, em Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

[0057] Uma “sonda” é um ácido nucleico isolado ao qual é fixado um marcador detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a uma fita de DNA isolado do evento de milho DP-004114-3 seja de uma planta de milho ou de uma amostras que inclui DNA do evento. Sondas de acordo com a presente invenção incluem não apenas ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usadas para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.

[0058] “Iniciadores” são ácidos nucleicos isolados que são anelados a uma fita de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e que então se estendem ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Pares de iniciadores da invenção refere-se aos seus usos para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, por PCR ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais. “PCR” ou “reação em cadeia de polimerase” é uma técnica usada para a amplificação de segmentos de DNA específicos (consulte as patentes americanas n° 4.683.195 e 4.800.159; aqui incorporadas a título de referência).

[0059] Sondas e iniciadores são de comprimento de nucleotídeo suficiente para se ligar à sequência de DNA alvo especificamente nas condições de hibridização ou condições reacionais determinadas pelo operador. Este comprimento pode ser de qualquer comprimento que seja de comprimento suficiente para ser útil em um método de detecção de escolha. Geralmente, 11 nucleotídeos ou mais em comprimento, 18 nucleotídeos ou mais e 22 nucleotídeos ou mais são usados. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente para uma sequência-alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Sondas e iniciadores de acordo com modalidades da presente invenção podem possuir similaridade de sequência de DNA completa de nucleotídeos contíguos com a sequência-alvo, embora sondas que diferem da sequência de DNA alvo e que retêm a capacidade de hibridizar para sequências de DNA alvo podem ser projetadas por métodos convencionais. Sondas podem ser usadas como iniciadores, porém são geralmente projetadas para se ligar ao DNA ou RNA alvo e não são usadas em um processo de amplificação.

[0060] Iniciadores específicos podem ser usados para amplificar um fragmento de integração para produzir um amplicon que pode ser usado como uma “sonda específica” para identificar o evento DP-004114-3 em amostras biológicas. Quando a sonda é hibridizada com os ácidos nucleicos de uma amostra biológica sob condições que permitem a ligação da sonda à amostra, esta ligação pode ser detectada e, deste modo, permitir uma indicação da presença do evento DP-004114-3 na amostra biológica. Tal identificação de uma sonda ligada foi descrita na técnica. Em uma modalidade da invenção, a sonda específico é uma sequência que, sob condições otimizadas, hibridiza especificamente a uma região dentro da região flanqueadora 5’ ou 3’ do evento e compreende também uma parte do DNA contíguo estrangeiro com isso. A sonda específica pode compreender uma sequência ao menos 80%, entre 80 e 85%, entre 85 e 90%, entre 90 e 95% e entre 95 e 100% idêntica (ou complementar) a uma região específica do evento.

[0061] Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (deste ponto em diante do presente documento, “Sambrook et al., 1989”); Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995 (com atualizações periódicas) (deste ponto em diante do presente documento, “Ausubel et al., 1995”); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: São Diego, 1990. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, pelo uso de programas de computador destinados àquele propósito como a ferramenta de análise de iniciador de PCR em Vector NTI versão 6 (Informax Inc., Bethesda MD); PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, WI); e Primer (Versão 0.5©, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Adicionalmente, a sequência pode ser visualmente varrida e os iniciadores manualmente identificados utilizando as diretivas conhcidas pelos elementos versados na técnica.

[0062] Um “kit”, para uso na presente invenção, refere-se a um conjunto de reagentes com o propósito de realizar as modalidades do método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento DP-004114-3 em amostras biológicas. O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para fins de controle de qualidade (por exemplo pureza dos lotes de sementes), detecção do evento DP-004114-3 em material de origem vegetal, ou material que compreende ou é derivado de material de origem vegetal, como, mas não se limitando a produtos alimentícios ou de ração. “Material de origem vegetal”, para uso na presente invenção, refere-se ao material que é obtido ou derivado de uma planta.

[0063] Iniciadores e sondas com base no DNA flanqueador e nas sequências de inserção apresentadas na presente invenção podem ser usados para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências apresentadas por métodos convencionais, por exemplo, por reclonagem e sequenciamento de tais sequências. As sondas de ácido nucleico e iniciadores da presente invenção hibridizam sob condições estringentes a uma sequência de DNA alvo. Qualquer hibridização de ácido nucleico convencional ou método de amplificação pode ser usado para identificar a presença do DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Para uso na presente invenção, duas moléculas de ácido nucleico são consideradas como sendo capazes de hibridizar especificamente entre si se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla antiparalela.

[0064] Uma molécula de ácido nucleico é considerada como sendo o “complemento” da outra molécula de ácido nucleico se elas exibirem complementaridade completa. Para uso na presente invenção, moléculas são consideradas como exibindo “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são consideradas como sendo minimamente complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições ao menos de “baixa-estringência” convencionais. De modo similar, as moléculas são consideradas como sendo “complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições de “alta-estringência” convencionais. Condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985), afastamentos da complementaridade completa são, consequentemente permissíveis, contanto que tais afastamentos não impeçam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de fita dupla. A fim de uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as concentrações de solvente e sal particulares utilizadas.

[0065] Nas reações de hibridização, a especificidade é tipicamente a função de lavagens de pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. O ponto de fusão térmico (Tm) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Para híbridos DNA-DNA, Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem dos nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de mau emparelhamento; dessa forma, Tm, as condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, quando o que se busca são sequências com >90% de identidade, a Tm pode ser diminuída para 10°C. Em geral, as condições estringentes são selecionadas para ter uma temperatura cerca de 5°C mais baixa que a Tm para a sequência específica e seu complemento, a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C inferior do que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8 9 ou 10°C inferior do que a Tm; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13 14 15 ou 20°C inferior do que a Tm.

[0066] Com o uso da equação, da hibridização e das composições de lavagem, e da Tm desejada, os versados na técnica entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de falta de correspondência resultar em um Tm menor que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferencial aumentar a concentração de SSC de modo que se possa usar uma temperatura mais alta. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, capítulo 2 (Elsevier, New York, EUA.) e Ausubel et al., eds. (1995) e Sambrook et al. (1989).

[0067] Para uso na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucleico que irá especificamente hibridizar com o complemento da molécula de ácido nucleico a que ela está sendo comparada sob condições de alta estringência. Condições de estringência adequadas que promovem a hibridização do DNA, por exemplo, 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido de uma lavagem de 2X SSC a 50°C, são conhecidas pelos versados na técnica ou podem ser encontradas em Ausubel et al. (1995), 6.3.1-6.3.6. Tipicamente, as condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M da concentração de íons de Na (para outros sais) a um valor de pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de um agente desestabilizador, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M /citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C e uma lavagem em 0,5X a 1X de SSC a 55 a 60°C. As condições de estringência elevadas exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a 65°C. Um ácido nucleico da invenção pode hibridizar especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucleico exclusivas para o evento DP-004114-3 ou complementos do mesmo ou fragmentos de qualquer uma das condições moderadamente estringentes.

[0068] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desta forma, a determinação do percentual de identidade entre quaisquer duas sequências pode ser feito com o uso de um algoritmo matemático. Exemplos não-limitadores destes algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS volume 4, páginas 11 a 17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. 1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman eWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado conforme descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873- 5877.

[0069] Implementações computacionais destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação entre sequências para determinar a identidade de sequência. Tais implementações incluem, mas não se limitam a,: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível junto à Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA); o programa ALIGN (Versão 2.0); o programa ALIGN PLUS (versão 3.0, direitos autorais 1997); e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de software de Wisconsin Genetics, versão 10 (disponível junto à Accelrys, 9685 Scranton Road, São Diego, CA 92121, EUA). Alinhamentos usando estes programas podem ser feitos com os parâmetros padrão.

[0070] O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), e Pearson, et al., Methods in Molecular Biology: volume 24, (páginas 307 a 331 (1994). Os programas ALIGN e ALIGN PLUS são basados no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. A família BLAST de programas que pode ser usada para pesquisas de similaridade de banco de dados inclui: BLASTN para sequências de busca de nucleotídeo em relação a sequências de banco de dados de nucleotídeo; BLASTX para sequências de busca de nucleotídeo em relação a sequências de banco de dados de proteína; BLASTP para sequências de busca de proteína em relação a sequências de banco de dados de proteína; TBLASTN para sequências de busca de proteína em relação a sequências de banco de dados de nucleotídeo; e TBLASTX para sequências de busca de nucleotídeo contra sequências de banco de dados de nucleotídeo. Ver Ausubel, et al., (1995). O alinhamento pode também ser realizado manualmente por inspeção visual.

[0071] Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Consulte Altschul et al. (1997) supra. Quando se usa os programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeo, BLASTX para proteínas) podem ser usados.

[0072] Para uso na presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade”, no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com relação a proteínas, reconhece-se que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácido conservativas, quando os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou capacidade hidrofóbica) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para cima para compensar a Natureza conservativa da substituição. As sequências que diferem por causa dessas substituições conservativas são ditas tendo “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos aos versados na técnica. Isto envolve tipicamente pontuar uma substituição conservativa como um pareamento errado parcial ao invés de total aumentando, assim, a porcentagem de identidade de sequência. Desta forma, por exemplo, quando uma pontuação de 1 é dada a um aminoácido idêntico e uma pontuação zero é dada a uma substituição não- conservativa, uma pontuação entre zero e 1 será dada a uma substituição conservativa. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

[0073] Para uso na presente invenção, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, buracos) quando comparada à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorre uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências para gerar o número de posições pareadas, dividindo-se o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.

[0074] Considerando a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciador de amplificação particular, “condições estringentes” são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize apenas para a sequência de ácido nucleico alvo a que um iniciador que tem a sequência correspondente de ocorrência natural (ou o seu complemento) poderia se ligar e de preferência produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.

[0075] O termo “específico para (uma sequência-alvo)” indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização estringentes apenas para a sequência-alvo em uma amostra que compreende a sequência-alvo.

[0076] Para uso na presente invenção, “DNA amplificado” ou “amplicon” refere-se ao produto de uma amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo que faz parte de um molde de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se uma planta de milho resultante de um cruzamento sexuado contém DNA genômico de evento transgênico da planta de milho da invenção, DNA extraído da amostra de tecido da planta de milho pode ser submetido a um método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciadores de DNA que inclui um primeiro iniciador derivado da sequência flanqueadora em posição adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA do evento. Alternativamente, o segundo iniciador pode ser derivado da sequência flanqueadora. O amplicon é de um comprimento e tem uma sequência que também é diagnóstica para o evento. O amplicon pode variar de comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciador mais um par de base de nucleotídeos a qualquer comprimento do amplicon produzível por um protocolo de amplificação de DNA. Alternativamente, pares de iniciadores podem ser derivados da sequência flanqueadora em ambos os lados do DNA inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui toda a sequência de nucleotídeo da inserção do constructo de expressão PHP27118 bem como a sequência flanqueando a inserção transgênica. Um membro de um par de iniciador derivado da sequência flanqueadora pode estar situado a uma distância da sequência de DNA inserida, esta distância pode situar-se na faixa de um par de base de nucleotídeos até os limites da reação de amplificação, ou cerca de 20.000 pb. O uso do termo “amplicon” especificamente exclui dímeros iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA.

[0077] Amplificação de ácido nucleico pode ser realizada por qualquer um dos várias métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo PCR. Uma variedade de métodos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos como, entre outros, nas Patentes US n° 4.683.195 e 4.683.202 e em in Innis et al., (1990) supra. Métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 Kb de DNA genômico e até 42 Kb de DNA bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Esses métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica da amplificação do DNA podem ser usados na prática das modalidades da presente invenção. É compreendido que uma variedade de parâmetros em um protocolo de PCR específico pode precisar ser ajustada às condições de laboratório específicas e podem ser levemente modificados e ainda permitir a coleta de resultados similares. Estes ajustes serão evidentes para uma pessoa versada na técnica.

[0078] O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas, incluindo, mas não se limitando, à análise tipo Genetic Bit (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) onde um oligonucleotídeo de DNA é projetado que sobrepõe tanto a sequência de DNA flanqueadora em posição adjacente quanto a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de microtitulação. Após a PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora em posição adjacente) um produto de PCR de filamento único pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e serve como um molde para uma reação de extensão de base única usando uma DNA polimerase e ddNTPs identificados específicos para a base seguinte esperada. A leitura pode ser baseada em ELISA ou fluorescente. Um sinal indica a presença da sequência de inserção/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base única bem sucedida.

[0079] Outro método de detecção é a técnica de pirossequenciamento conforme descrita por Winge (2000) Innov. Pharma. Tech. 00:18-24. Neste método um oligonucleotídeo é projetado que sobrepõe o DNA em posição adjacente e a junção de DNA da inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina. dNTPs são acrescentados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença de uma sequência de inserção de transgene/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples ou múltipla bem sucedida.

[0080] Polarização de fluorescência conforme descrito por Chen et al., (1999) Genome Res. 9:492-498 também é um método que pode ser usado para detectar um amplicon da invenção. Usando este método um oligonucleotídeo é projetados que sobrepõe a junção do DNA inserido e flanqueador. O oligonucleotídeo é hibridizado a um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA flanqueador) e incubado na presença de uma DNA polimerase e de um ddNTP marcado fluorescente. A extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma alteração na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença de uma sequência de inserção de transgene/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples bem sucedida.

[0081] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é descrito como um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que sobrepõe a junção do DNA flanqueador e de inserção. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência do DNA de inserção e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da porção fluorescente da porção de supressão na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção flanqueadora/do transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedida.

[0082] Sinais moleculares foram descritos para uso na detecção de sequências conforme descrito em Tyangi et al. (1996) Nature Biotech. 14:303-308. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que sobrepõe a junção do DNA flanqueador e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta no contato da estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de supressão muito próximas. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência do DNA de inserção e um na sequência flanqueadora) sao ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação do PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET à sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das porções fluorescente e de supressão. Um sinal fluorescente é produzido. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção flanqueadora/do transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedida.

[0083] Uma reação de hibridização usando uma sonda específica para uma sequência encontrada no amplicon é ainda outro método usado para detectar o amplicon produzido por uma reação de PCR.

[0084] O evento de milho DP-004114-3 é eficaz contra pestes de insetos incluindo insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera e Lepidoptera.

[0085] Os insetos da ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, lagarta-do-cartucho, lagarta-amarela, lagartas, e heliotines na: família Noctuidae: Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca negra); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. segetum Denis & Schiffermuller (traça do nabo); A. subterranea Fabricius (lagarta granular); Alabama argillaceaHubner (curuquerê); Anticarsia gemmatalisHubner (lagarta-da-soja); Athetis mindara Barnes e McDunnough (lagarta de pele rugosa); Earias insulana Boisduval (lagarta rosada); E. vittella Fabricius (lagarta pintada); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca cítrica); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Helicoverpa armigera Hubner (lagarta americana); H. zea Boddie (lagarta da espiga do milho ou lagarta do algodão); Heliothis virescensFabricius (lagarta do tabaco); Hypena scabraFabricius (lagarta desfolhadora); Hyponeuma taltula Schaus; (Mamestra configurata Walker (lagarta-do-cartucho bertha); M. brassicaeLinnaeus (lagarta do repolho); Melanchra picta Harris (lagarta zebra); Mocis latipes Guenée (traça de mocis pequena); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-do-cartucho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta falsa-medideira); Richia albicosta Smith (lagarta-rosca ocidental); Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-do-cartucho); S. exigua Hubner (lagarta-do-cartucho da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta-rosca do tabaco, lagarta de cacho); Trichoplusia ni Hubner (larva do repolho); brocas, ecatotecas, larva de teias, lagarta cone e esqueletonizantes das famílias Pyralidae e Crambidae como Achroia grisella Fabricius (mariposa da cera); Amyelois transitella Walker (lagarta laranja); Anagasta kuehniella Zeller (mosca do mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça do cacau); Chilo partellus Swinhoe (broca do talo pintado); C. suppressalis Walker (broca do arroz/talo listrado); C. terrenellus Pagenstecher (broca do caule da cana-de-açúcar; Corcyra cephalonica Stainton (traça do arroz); Crambus caliginosellusClemens (lagarta da raiz do milho); C. teterrellus Zincken (lagarta das gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (lagarta enroladeira); Desmia funeralisHubner (mosca de folha da uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (broca do melão); D. nitidalis Stoll (broca-das-cucurbitácias); Diatraea flavipennella Box; D. grandiosella Dyar (broca do milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca da cana-de-açucar); Elasmopalpus lignosellus Zeller (lagarta elasmo); Eoreuma loftini Dyar (broca mexicana do arroz); Ephestia elutella Hubner (traça); Galleria mellonella Linnaeus (traça da cera); Hedylepta accepta Butler (enroladeira da cana de açucar); Herpetogramma licarsisalis Walker (traça); Homoeosoma electellum Hulst (traça do girassol); Loxostege sticticalis Linnaeus (traça da baterraba); Maruca testulalis Geyer (lagarta das vagens); Orthaga thyrisalisWalker (traça do chá); Ostrinia nubilalis Hubner (broca europeia do milho); Plodia interpunctellaHubner (traça-dos-cereais); Scirpophaga incertulas Walker (broca do colmo); Udea rubigalis Guenée (traça tortricidae de aipo); e traças tortrix, lagartas, traças de sementes, e traças das frutas na família Tortricidae Acleris gloveranaWalsingham (larva cabeça negra do oeste); A. variana Fernald (larva cabeça negra do leste); Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (traça tortrix de fruta do verão); Archips spp. incluindoA. argyrospila Walker (lagarta das frutas) e A. rosanaLinnaeus (broca europeia de folha); Argyrotaenia spp.; Bonagota salubricola Meyrick (traça tortix da maçã brasileira); Choristoneura spp.; Cochylis hospes Walsingham (traça do girassol listrada); Cydia latiferreana Walsingham (verme do chá); C. pomonellaLinnaeus (traça da maçã); Endopiza viteanaClemens (traça dos cachos); Eupoecilia ambiguella Hubner (vinha); Grapholita molesta Busck (mariposa oriental); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (traça da videira europeia); Platynota flavedana Clemens (enroladeira multicor); P. stultana Walsingham (traça tortix onívora); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (traça acama); e Suleima helianthana Riley (traça do girassol).

[0086] Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, mas não se limitam a, Alsophila pometariaHarris (broca do pessegueiro); Anarsia lineatella Zeller (lagarta mineira); Anisota senatoria J.E. Smith (larva de listra laranja); Antheraea pernyiGuérin-Méneville (bicho-da-seda tasar chinês); Bombyx mori Linnaeus (bicho-da-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (perfurador de folha do algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta da alfalfa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da noz); Dendrolimus sibiricusTschetwerikov (bicho-da-seda siberiano), Ennomos subsignaria Hubner (lagarta do olmo); Erannis tiliaria Harris (larva da tília); Erechthias flavistriata Walsingham (larva da cana-de-açucar); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (platipo); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletonizante da folha da uva); Heliothis subflexa Guenée; Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de pasto); Hyphantria cunea Drury (larva de teia do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (lombriga do tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (larva geometrídea da cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (larva geometrídea da cicuta ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (traça cetim); Lymantria dispar Linnaeus (traça de mariposa); Malacosoma spp.; Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão pintada, larva de chifre do tomate); M. sexta Haworth (larva de chifre do tomate, larva de chifre do fumo; Operophtera brumata Linnaeus (mariposa de inverno); Orgyia spp.; Paleacrita vernata Peck (lagarta da primavera); Papilio cresphontes Cramer (borboleta papilionídea gigante); Phryganidia californica Packard (larva California); Phyllocnistis citrella Stainton (minador de folha cítrica); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador de folha tentiforme pintado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta branca da couve grande); P. rapae Linnaeus (borboleta branca da couve pequena); P. napi Linnaeus (borboleta branca raiada); Platyptilia carduidactyla Riley (traça pluma da alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça de tartaruga palustre); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta rosa); Pontia protodice Boisduval & Leconte (verme do repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta onívora); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta vermelha corcunda); Sitotroga cerealella Olivier (traça dos cereais); Telchin licus Drury (broca da cana-de-açúcar gigante); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária); Tineola bisselliella Hummel (traça correias); Tuta absoluta Meyrick (traça-do-tomateiro) e Yponomeuta padella Linnaeus (traça arminho).

[0087] De interesse são as larvas e adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae, e Curculionidae incluindo, mas não se limitando a: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodoeiro); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule do girassol); Diaprepes abbreviatus Linnaeus (gorgulho de raiz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha do alho); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (bicheira-da-raiz-norte-americana); Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus (gorgulho da cana indiana); M. hemipterus sericeus Olivier (gorgulho sedoso da cana); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho granário); S. oryzae Linnaeus (gorgulo do arroz); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho da semente de girassol vermelho); S. sordidus LeConte (gorgulho da semente do girassol cinza); Sphenophorus maidis Chittenden (bicudo do milho); S. livis Vaurie (gorgulho da cana-de-açúcar); Rhabdoscelus obscurus Boisduval (gorgulho da cana-de-açúcar de Nova Guiné); pulgões, besouro do pepino, crisomelídeos, besouros de folha, besuros da batata e minadoes de folhas da família Chrysomelidae incluindo, mas não se limitando a: Chaetocnema ectypaHorn (besouro-pulga do deserto milho); C. pulicaria Melsheimer (pulgão do milho); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de videira); Diabrotica barberi Smith & Lawrence (crisomelídeo do milho do Norte); D. undecimpunctata howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sudeste); D. virgifera virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental); Leptinotarsa decemlineata Say (besouro da batata do Colorado); Oulema melanopus Linnaeus (pulgão de cereal leaf beetle); Phyllotreta cruciferae Goeze (pulgão do milho); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro de girassol); besouros da família Coccinellidae incluindo, mas não se limitando a: Epilachna varivestis Mulsant (besouro do feijão mexicano); joaninhas e outros besouros da família Scarabaeidae incluindo, mas não se limitando a: Antitrogus parvulus Britton (lagarta da cana); Cyclocephala borealis Arrow (joaninha mascarada do Norte, larva branca); C. immaculata Olivier (joninha mascarada so Sul, larva branca); Dermolepida albohirtum Waterhouse (Greyback cana-de- besouro); Euetheola humilis rugiceps LeConte (besouro de cana-de- açúcar); Lepidiota frenchi Blackburn (lagarta da cana francesa); Tomarus gibbosus De Geer (besouro da cenoura); T. subtropicus Blatchley (lagarta da cana-de-açúcar); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); P. latifrons LeConte (besouro de junho); Popillia japonica Newman (besouro Japonês); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (joaninha europeia); besouro de carpete da família Dermestidae; brocas da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp. incluindo M. communis Gyllenhal (broca); Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros de cortiça da família Scolytidae; besouros da família Tenebrionidae; besouros da família Cerambycidae como, mas não se limitando, a Migdolus fryanus Westwood (besouro de chifre longo); e besouro da família Buprestidae incluindo, mas não se limitando a Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger (besouro buprestid minador de folha).

[0088] Formas adultas e imaturas da ordem Diptera são de interesse incluindo minadores de folha Agromyza parvicornis Loew (minador de folha do milho); mosquitos-pólvora incluindo, mas não se limitando a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); moscas de fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de fruta); larvas de insetos incluindo, mas não se limitando a: Delia spp. Incluindo Delia platura Meigen (larva da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (mosca doméstica); Meromyza americana Fitch (larva do caule de trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas dométicas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas de face, moscas de chifre, moscas varejeiras, Chrysomya spp.; Phormia spp.; e outras pestes de insetos moscoides, moscas de cavalo Tabanus spp.; gastrófilas Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de gado Hypoderma spp.; moscas de cervídeos Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (carrapatos); e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; borrachudos Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos-pólvora mordentes, flebotomíneos, sciarídeos e outros Nematocera.

[0089] São incluídos como insetos de interesse aqueles da ordem Hemiptera como, mas não se limitando a, as seguintes famílias: Adelgidae, Aleyrodidae, Aphididae, Asterolecaniidae, Cercopidae, Cicadellidae, Cicadidae, Cixiidae, Coccidae, Coreidae, Dactylopiidae, Delphacidae, Diaspididae, Eriococcidae, Flatidae, Fulgoridae, Issidae, Lygaeidae, Margarodidae, Membracidae, Miridae, Ortheziidae, Pentatomidae, Phoenicococcidae, Phylloxeridae, Pseudococcidae, Psyllidae, Pyrrhocoridae e Tingidae.

[0090] Membros importantes do ponto de vista agronômico da ordem Hemiptera incluem, mas não se limitam a: Acrosternum hilare Say (percevejo); Acyrthisiphon pisum Harris (pulgão-da-ervilha); Adelges spp. (adelgídeos); Adelphocoris rapidus Say (inseto de planta rápido); Anasa tristis De Geer (inseto de polpa); Aphis craccivora Koch (pulgão de feijão-fradinho); A. fabae Scopoli (pulgão de feijão-preto); A. gossypii Glover (pulgão de melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz do milho); A. pomi De Geer (afíeo de maçã); A. spiraecola Patch (pulgão de arbusto); Aulacaspis tegalensis Zehntner (cochonilha da cana-de-açúcar); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de dedaleira); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata- doce); fole de B. argentifolii & Perring (mosca branda da folha prateada); Blissus leucopterus leucopterus Say (percevejo comum); Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Cacopsylla pyricola Foerster (piolho de pereira); Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo capsídeo da batata); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgão do morango); Cimicidae spp.; Coreidae spp.; Corythuca gossypii Fabricius (percevejo do algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); C. notatus Distant (mosca sugadora); Deois flavopicta Stâl (mosca de saliva); Dialeurodes citri Ashmead (mosca branca cítrica); Diaphnocoris chlorionis Say (mosca so espinheiro da Virgínia); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Duplachionaspis divergens Green (cochonilha blindada); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo da maçã rosada); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchador de algodão); Dysmicoccus boninsis Kuwana (inseto da farinha de cana-de-açúcar cinza); Empoasca fabae Harris (cigarrinhas da batata); Eriosoma lanigerum Hausmann (pulgão de maçã lanígero); Erythroneoura spp. (gafanhoto da uva); Eumetopina flavipes Muir (cigarrinha laranja da cana-de- açucar); Eurygaster spp.; Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo com uma pinta); Graptostethus spp. (complexo de percevejos de semente); e Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgão da ameixa); Icerya purchasi Maskell (colchonilha do algodão); Labopidicola allii Knight (percevejo da cebola); Laodelphax striatellus Fallen (gafanhoto marrom pequeno); Leptoglossus corculus Say (percevejo da semente de pinho); Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer (percevejo da cana-de-açúcar); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (inseto da planta manchado); L. Hesperus Knight (inseto de planta manchado do ocidente); L. pratensis Linnaeus (inseto do prado comum); L. rugulipennis Poppius (inseto de planta manchado europeu); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Macrosteles quadrilineatus Forbes (gafanhoto áster); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Mahanarva fimbriolata Stâl (cigarrinha da cana-de- açúcar) ; M. posticata Stâl (pequena cigarra da cana-de-açúcar); Melanaphis sacchari Zehntner (afídeo da cana-de-açúcar); Melanaspis glomerata Green (cochonilha negra); Metopolophium dirhodum Walker (afídeo do grão rosa); Myzus persicae Sulzer (pulgão da batata-pêssego, pulgão do pêssego verde); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgão da alface); Nephotettix cinticeps Uhler (gafanhoto verde); N. nigropictus Stâl (gafanhoto do arroz); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha marrom); Nysius ericae Schilling (percevejo comum falso); Nysius raphanus Howard (percevejo coum falso); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (percevejo grande asclépia); Orthops campestris Linnaeus; Pemphigus spp. (pulgão de raiz e pulgões galha); Peregrinus maidis Ashmead (cirgarrinha do milho); Perkinsiella saccharicida Kirkaldy (delfacídeo da cana-de-açúcar); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de noz pecã); Planococcus citri Risso (colchonila do citrus); Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Poecilocapsus lineatus Fabricius (inseto de planta de quatro listras); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga de algodão); Pseudococcus spp. (outros percevejos complexos); Pulvinaria elongata Newstead (colchonilha de algodão); Pyrilla perpusilla Walker (cigarrinha da cana-de-açúcar); Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus perniciosus Comstock (cochonilha de São José); Reduviidae spp.; Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (pulgão da aveia); Saccharicoccus sacchari Cockerell (inseto farináceo da cana-de-açúcar rosa); Scaptocoris castanea Perty (percevejo de raiz castanho); Schizaphis graminum Rondani (inseto verde); Sipha flava Forbes (pulgão amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgão inglês de grão); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de dorso branco); Sogatodes oryzicola Muir (delfacídeo do arroz); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Therioaphis maculata Buckton (pulgão pintado da alfafa); Tinidae spp.; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo de plantas cítricas negro); y T. citricida Kirkaldy (afídeo de plantas cítricas castanho); Trialeurodes abutiloneus (mosca branca) e T. vaporariorum Westwood (mosca branca de estufa); Trioza diospyri Ashmead (persimmon psylla); and Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha da maçã branca).

[0091] Também são incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros) como Aceria tosichellaKeifer (ácaro enrolado do trigo); Panonychus ulmi Koch (ácaro europeu vermelho); Petrobia latens Muller (ácaro marrom do trigo); Steneotarsonemus bancrofti Michael (acarino do caule da cana-de-açúcar); acarinos e acarinos vermelhos da família Tetranychidae, Oligonychus grypus Baker & Pritchard, O. indicus Hirst (acarino da folha de cana-de-açúcar), O. pratensis Banks (acarino de gramínea Banks), O. stickneyi McGregor (acarino da cana-de-açúcar); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas pintas); T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha do carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (acarino do morangueiro), ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de plantas cítricas); ácaros de ferrugem e de broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, ácaros da poeira na família Epidermoptidae, ácaros de folículo na família Demodicidae, ácaros de grão na família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do cervo); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano da paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato americano do cão); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitário); e ácaros que provocam feridas e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae, e Sarcoptidae.

[0092] Pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, como a Lepisma saccharina Linnaeus (bichinho-de-prata; traça-dos- livros); Thermobia domestica Packard (termóbia).

[0093] Pestes artrópodes adicionais englobadas incluem: aranhas da ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (aranha recusa castanha); e Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra); e centopeias da ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica). Além disso, pestes de insetos da ordem Isoptera são de interesse, inclusive aquelas da família termitidae, como, mas não se limitando a, Cornitermes cumulans Kollar, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren e Pseudacanthotermes militaris Hagen (térmite da cana-de-açúcar); bem como aquelas da família Rhinotermitidae incluindo, mas não se limitando, a Heterotermes tenuis Hagen. Os insetos da ordem Thysanoptera também são de interesse, incluindo, mas não se limitando a, Stenchaetothrips minutusvan Deventer (tripes da cana-de- açúcar).

[0094] As modalidades da presente invenção são adicionalmente definidas nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que estes Exemplos são dados apenas por meio de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, o versado na técnica pode averiguar as características essenciais desta invenção, e sem que se desvie do caráter e âmbito das mesmas, pode fazer várias alterações e modificações das modalidades da invenção para adaptá-las a vários usos e condições. Portanto, várias modificações das modalidades da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas ficarão evidentes aos versados na técnica a partir da supracitada descrição. Essas modificações também se destinam a enquadrar-se no escopo das reivindicações em anexo.

[0095] A descrição de cada referência aqui descrita está aqui incorporada, a título de referência em sua totalidade.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. TRANSFORMAÇÃO DO MILHO POR TRANSORMAÇÃO DE AGROBACTERIUM E REGENERAÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO OS GENES CRY1F, CRY34AB1, CRY35AB1 (CRY34/35AB1) E PAT

[0096] O milho 4114 foi produzido por transformação mediada por Agrobacterium com o plasmídio PHP27118. Este evento contém os cassetes do gene cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat que conferem resistência a certas pestes de lepidoptera e coleoptera.

[0097] Especificamente, o primeiro cassete contém uma versão truncada do gene cry1F de Bt var. aizawai. A inserção do gene cry1F confere resistência aos danos por pestes de lepidoptera, incluindo ECB e FAW. A proteína Cry1F (SEQ ID n° 1) é compreendida de 605 aminoácidos e tem um peso molecular de aproximadamente 68 KDa. A expressão do gene cry1F é controlada pelo promotor de poliubiquitina de milho (Christensen et al., 1992, supra), proporcionando expressão constitutiva da proteína Cry1F no milho. Esta região inclui, também, a 5’ UTR e o íntron associado ao promotor de poliubiquitina nativo. O terminador para o gene cry1F gene é o sinal de poli(A)adição do quadro de leitura aberto 25 (ORF 25) do plasmídio Ti de Agrobacterium tumefaciens pTi15955 (Barker, et al., 1983, supra).

[0098] O segundo cassete contém o gene cry34Ab1 isolado da cepa Bt PS149B1 (Patentes US n° 6.127.180; 6.624.145 e 6.340.593). A proteína Cry34Ab1 (SEQ ID n° 2) é de 123 resíduos de aminoácido de comprimento e tem um peso molecular de aproximadamente 14 KDa. A expressão do gene cry34Ab1 é controlada por uma segunda cópia do promotor de poliubiquitina de milho com 5’ UTR e íntron (Christensen et al., 1992, supra). O terminador para o gene cry34Ab1 é o terminador pinII (Keil et al., 1986, supra; An et al., 1989, supra).

[0099] O terceiro cassete do gene contém o gene cry35Ab1 gene, também isolado da cepa Bt PS149B1 (Patentes US n° 6.083,499; 6.548.291 e 6.340.593). A proteína Cry35Ab1 (SEQ ID n° 3) tem um comprimento de 383 aminoácidos e um peso molecular de aproximadamente 44 KDa. A expressão simultânea das proteínas Cry34Ab1 e Cry35Ab1 na planta confere resistência aos insetos de coleoptera, incluindo WCRW. A expressão do gene cry35Ab1 é controlada pelo promotor da peroxidase de Triticum aestivum (trigo) e pela sequência de iniciação (Hertig et al. 1991, supra). O terminador para o gene cry35Ab1 é uma segunda cópia do terminador pinII (Keil et al. 1986, supra; An et al. 1989, supra).

[00100] O quarto e último cassete do gene contém uma versão pat da Streptomyces viridochromogenes que foi otimizado para expressão no milho. O gene pat expressa PAT, que confere tolerância à fosfofinotricina (glifosinato-amônio). A proteína PAT (SEQ ID n° 4) é de 183 resíduos de aminoácidos de comprimento e tem um peso molecular de aproximadamente 21 KDa. A expressão do gene pat é controlada pelas regiões promotora e terminadora do transcrito CaMV 35S (Franck et al., 1980, supra; Odell et al., 1985, supra; Pietrzak, et al., 1986, supra). Plantas contendo os constructos de DNA são também apresentadas. Uma descrição dos elementos genéticos no T-DNA PHP27118 (definido na SEQ ID n° 5) e suas fontes são descritos adicionalmente na Tabela 1. Tabela 1: Elementos Genéticos na Região de T-DNA do Plasmídio PHP27118

[00101] Embriões imaturos do milho (Zea mays L.) foram assepticamente removidos da caripose em desenvolvimento de nove a onze dias após a polinização e foram inoculados com a cepa de A. tumefaciens LBA4404 contendo o plasmídio PHP27118 (Figura 1), essencialmente conforme descrito em Zhao (patente US n° 5.981.840, os conteúdos da qual sendo aqui incorporados, por referência). A região do T-DNA de PHP27118 é mostrada na figura 2. Após três a seis dias do co-cultivo do embrião e de Agrobacterium em meio de cultura sólido em seleção, os embriões foram a seguir transferidos para um meio sem seleção de herbicida, porém contendo carbenicilina. Após três a cinco dias neste meio, os embriões foram a seguir transferido para meio seletivo que foi estimulatório à embriogênese somática do milho e continha bialafos para seleção de células expressando o transgene pat. O meio também continha carbenicilina para matar qualquer Agrobacterium remanescente. Após seis a oito semanas no meio seletivo, caules saudáveis em crescimento que demonstraram resistência ao bialafos foram identificados. Os caules transgênicos putativos foram subsequentemenbte regenerados para produzir plantículas T0.

[00102] As amostras foram tomadas a partir das plantículas T0 para análise por PCR para verificar a presença e o número de cópias dos genes cry1F, cry35Ab1, cry34Ab1 e/ou pat inseridos. O evento de milho DP-004114-3 foi confirmado como contendo uma cópia única do T-DNA (consulte os Exemplos 2 e 3). Em adição a esta análise, as plantículas T0 foram analisadas quanto à presença de certas sequências de estrutura do vetor binário de Agrobacterium por PCR (dados não mostrados). As plantas que foram determinadas como sendo cópia única para os genes inseridos e negativos para sequências de estrutura de Agrobacterium foram selecionadas para propagação em estufa adicional. Essas plantas T0 selecionadas foram varridas para a eficácia da característica e expressão de proteína realizando vários bioensaios (vide Exemplo 5). As plantas T0 atendendo a todos os critérios progrediram e cruzaram para linhagens inatas para produzir sementes para testagem adicional. Uma visão geral esquemática da transformação e do desenvolvimento do evento é apresentada na figura 3.

EXEMPLO 2. IDENTIFICAÇÃO DO EVENTO DE MILHO DP-004114-3

[00103] DNA genômico de tecido de folha de semente de teste do milho 4114 e uma substância de controle (semente de um milho não geneticamente modificado com um fundo genético representativo do fundo do evento) foi isolado e submetido à amplificação por PCR qualitativo usando um par de iniciadores específico para constructo. Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose para confirmar a presença do constructo inserido no DNA genômico solado da semente de teste, e a ausência do constructo inserido no DNA genômico isolado da semente de controle. Um padrão de referência (Ladder de baixa massa de DNA; # Catálogo da Invitrogen Corporation 10380-012) foi usado para determinar o tamanho do produto de PCR. A confiabilidade do método de PCR específico de constructo foi avaliada pela repetição do experimento três vezes. A sensibilidade da amplificação por PCR foi avaliada por várias diluições do DNA genômico de milho 4114.

[00104] Amostras de folha de teste e controle (estágio de folha V5-V7) foram coletadas de plantas crescidas na Estação Experimental da DuPont (Wilmington, DE, EUA) a partir de sementes obtidas a partir de Pioneer Hi-Bred (Johnston, IA, EUA). Extrações de DNA genômico a partir de tecidos de folha de teste e controle foram realizadas usando um protocolo de extração de ureia padrão.

[00105] O DNA genômico foi quantificado usando o Espectrofotômetro NanoDrop 1000 usando o software ND-1000 V3.6 (ThermoScientific, Wilmington, DE, EUA) e o reagente Quant-iT PicoGreen® (Invitrogen, Carslbad, CA, EUA). Amostras de DNA foram visualizadas em um gel de agarose para confirmar os valores de quantificação e para determinar a qualidade do DNA.

[00106] Amostras de DNA genômico isoladas de tecido de folha de milho 4114 e amostras de controle foram submetidas à amplificação por PCR (kit da Roche High Fidelity PCR Master, # Catálogo da Roche 12140314001) utilizando um par de iniciadores específico de constructo (SEQ ID n° 7 e 8) que vãos o terminador ORF 25 do milho e o promotor de ubiquitina (consulte Figura 2) e permite a identificação exclusiva do T-DNA inserido no milho 4114. Um segundo conjunto iniciador (SEQ ID n°s 9 e 10) foi usado para amplificar o gene da invertase do milho endógeno (número de acesso GenBank AF171874.1) como um controle positivo para a amplificação por PCR. O sítio alvo de PCR e o tamanho do produto de PCR esperado para cada conjunto de iniciador são mostrados na Tabela 2. O reagentes de PCR e as condições reacionais são mostrados na Tabela 3. Neste estudo, 50 ng de DNA genômico de folha foram usados em todas as reações de PCR. Tabela 2: Sítio Alvo de DNA Genômico de PCR e Tamanho Esperado dos Produtos de PCR Tabela 3: Reagentes de PCR e Condições Reacionais ddH2O: água bidestilada *Mistura da Roche High Fidelity Master

[00107] Um produto de PCR de aproximadamente 300 pb de tamanho amplificado pelo conjunto de iniciador específico de constructo (SEQ ID n°s 7 e 8) foi observado em reações de PCR utilizando o plasmídio PHP27118 (10 ng) como um molde e todas as amostras de DNA de milho 4114, porém ausente em todas as amostras de milho de controle e o controle que não é molde. Este experimento foi repetido três vezes, e resultados similares foram obtidos. Os resultados observados para os extratos de DNA de cinco plantas de milho de 4114 e cinco plantas de milho de controle corresponderam quase igualmente com o tamanho do produto de PCR esperado (287 pb) para amostras contendo o DNA genômico do milho 4114. Um produto de PCR de aproximadamente 220 pb no tamanho foi observado tanto para o milho 4114 quanto para as amostras de milho de controle após a reação de PCR com o conjunto iniciador (SEQ ID n°s 9 e 10) para detecção do gene da invertase do milho endógeno. Estes resultados corresponderam intimamente com o tamanho do produto de PCR esperado (225 pb) para amostras de DNA genômico contendo o gene da invertase endógeno de milho. A banda alvo endógena não foi observada no controle sem molde.

[00108] A fim de avaliar a sensibilidade da amplificação por PCR, várias concentrações e uma única amostra de DNA do milho 4114 foram diluídas em DNA de controle não geneticamente modificado, resultando em quantidades de DNA de milho 4114 na faixa de 500 fg, 5 pg, 10 pg, 50 pg, 100 pg, 5 00 pg, 5 ng e 50 ng (a quantidade total de DNA genômico em todas as amostras de PCR foi 50 ng). Cada diluição foi submetida À amplificação por PCR conforme anteriormente realizado. Baseando-se nesta análise, o limite de detecção (LOD) foi determinado como sendo aproximadamente de 100 pg de DNA de milho 4114 em 50 ng de DNA total, ou 0,2% de DNA de milho 4114.

[00109] Em conclusão, a análise por PCR quantitativa utilizando um conjunto iniciador específico de constructo para o milho 4114 confirmou que as plantas de teste continham o T- DNA inserido do plasmídio PHP27118, conforme fica evidente pela presença da banda alvo específica de constructo em todas as amostras vegetais de teste analisadas, e a ausência nas plantas de controle não geneticamente modificadas. Este resultado foi reproduzível. Tanto as plantas de teste quanto de controle continham o gene da invertase do milho endógena. A sensibilidade da análise sob as condições descritas é de aproximadamente 100 pg do DNA genômico do milho 4114 em 50 ng de DNA genômico total ou 0,2% de DNA genômico de milho 4114.

EXEMPLO 3. ANÁLISE DE SOUTHERN BLOT DO MILHO DP-004114-3 QUANTO À INTEGRIDADE E NÚMERO DE CÓPIAS

[00110] A análise de Southern blot foi usada para confirmar a integridade e número de cópias do T-DNA inserido de PHP27118 e para confirmar a presença dos cassetes de gene cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat no milho 4114.

[00111] Cinco plantas individuais a geração T1 do milho 4114 foram selecionados para análise de Southern blot. Material de folhas jovens foram coletados de plantas do milho 4114 (teste) e do milho não transgênico (controle) e foi imediatamente colocado em gelo seco. As amostras congeladas foram liofilizadas e DNA genômico foi extraído dos tecidos de teste e controle utilizando um método de extração CTAB.

[00112] Após as digestões com a enzima de restrição, conforme detalhado abaixo, os fragmentos de DNA foram separados em géis de agarose, depurinados, desnaturados e neutralizados localmente, e transferidos para uma membrana de náilon em tampão 20x SSC usando o método conforme descrito pelo sistema de transferência à jusante rápido TURBOBLOTTER™ (Schleicher & Schuell). Após a transferência para a membrana, o DNA foi ligado à membrana por reticulação por luz ultravioleta.

INTEGRIDADE

[00113] A enzima de restrição Hind III foi selecionada para análise Southern de integridade, uma vez que há três sítios localizados dentro do T-DNA (Figura 2). Aproximadamente de 1 a 3 μg de DNA genômico foi digerido com Hind III e separado por tamanho em um gel de agarose. Como um controle positivo, aproximadamente 15 pg de plasmídio contendo o T-DNA PHP27118 foi was reforçado em uma amostra de DNA de planta de controle, digerido e incluído no gel de agarose. Um controle negativo também foi incluído para verificar a hibridização de fundo da sonda para o genoma do milho.

[00114] Quatro sondas homólogas aos genes cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat no T-DNA PHP27118 (para elementos de gene, consulte a Figura 2) foram usadas para hibridização para confirmar a presença dos genes. A fim de desenvolver as sondas, fragmentos homólogos aos genes cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat foram gerados por PCR a partir de plasmídio contendo o T-DNA PHP27118, separado por tamanho em um gel de agarose, e purificado usando um kit de extração de gel QIAquick® (Qiagen). Todas as sondas de DNA foram subsequentemente geradas a partir dos fragmentos usando o Sistema de Marcação de DNA Rediprime™ II (Amersham) que realiza marcação de iniciadores aleatória com [32P]dCTP.

[00115] As sondas marcadas foram hibridizadas ao DNA alvo nas membranas de náilon para a detecção dos fragmentos específicos utilizando a Solução de Hibridização MiracleHyb® essencialmente conforme descrito pelo fabricante (Stratagene). As lavagens após a hibridização foram executadas sob alta estringência. As manchas foram expostas a filme para raios X a -80°C por um ou mais pontos de tempo para detectar fargmentos de hibridização.

[00116] Uma vez que os sítios da enzima Hind III foram reconhecidos no T-DNA, os tamanhos da banda esperada exatos foram determinados para cada uma das sondas (Tabela 4, Figura 2). Para uma cópia intacta do T-DNA, era esperado que a sonda cry1F hibridizasse para um fragmento de 3891 pb. Era esperado que as sondas do gene cry34Ab1, cry35Ab1 e pat hibridizassem até um fragmento de 7769 pb. Fragmentos das amostras de teste correspondendo aos tamanhos esperados, bem como correspondendo às bandas na amostra de controle de plasmídio poderiam confirmar a integridade do T-DNA inserido e a presença de cada gene.

[00117] Os resultados da análise de Southern blot com Hind III e as sondas do gene cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat confirmaram os tamanhos de fragmentos esperados e, dessa forma, confirmaram que o T-DNA inserido intacto em cada um dos eventos e que que cada um dos genes estava presente.

[00118] Uma banda de aproximadamente 4 kb foi observada com a sonda cry1F que é consistente com o tamanho de fragmento esperado. Um fragmento similar de aproximadamente 4 Kb foi observado na raia de controle positivo de plasmídio, que foi presumida como sendo a banda esperada de 3891 pb. Baseando-se na migração equivalente da banda de hibridização nos eventos para a banda no controle positivo de plasmídio, foi confirmado que a porção do T-DNA contendo cry1F tinhah se inserido intacta no milho 4114.

[00119] Na hibridização com a sonda cry34Ab1, uma banda de aproximadamente 8 Kb foi observada no evento e também no controle positivo do plasmídio. A banda de hibridização na raia de controle positivo do plasmídio foi presumida como sendo a banda esperada de 7769 pb. Uma vez que a banda de hibridização no evento migrou equivalentemente com esta banda, foi confirmado que esta porção do T-DNA contendo cry34Ab1 foi inserida intacta.

[00120] De modo similar, as hibridizações com cry35Ab1 e pat hibridizaram para o mesmo fragmento de 7769 pb na planta e no controle positivo do plasmídio, conforme esperado. Esses resultados confirmaram que a porção do T-DNA contendo os genes cry35Ab1 e pat genes foram inseridas intactas.

[00121] Esta análise de Southern blot confirma que o milho 4114 contém uma cópia intacta do T-DNA de PHP27118 contendo os genes cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat. Tabela 4: Resumo dos FRagmento de Hibridização Esperados e Observados em Southern Blots para DNA de milho 4114 digerido com Hind III 1Tamanhos de fragmentos esperados baseados no mapa de PHP27118 T-DNA (Figura 2). 2Todos os fragmentos observados migraram equivalentemente com o controle positivo do plasmídio e, consequentemente, foram confirmados como representantes da porção intacta do T-DNA de PHP27118.

NÚMERO DE CÓPIA

[00122] As sondas cry1F e pat foram usadas em hibridizações Southern blot para avaliar o número de cópias das inserções no milho 4114.

[00123] A enzima de restrição Bcl I foi selecionada para análise Southern do número de cópias, uma vez que há um único sítio localizado dentro do T-DNA (Figura 2). Aproximadamente 3 μg de DNA genômico de plantas individuais da geração T1 do evento 4114 foram digeridas com Bcl I e separadas por tamanho em um gel de agarose. Um plasmídio contendo o T-DNA PHP27118 foi reforçado em uma amostra de DNA de planta de controle, digerido e incluído no gel de agarose para servir como um controle de hibridização positivo. Um DNA de milho de controle negativo também foi incluído para verificar a hibridização de fundo da sonda para o genoma do milho. O Marcador de Peso Molecular de DNA VII, digoxigenina (DIG) marcada (Roche, Indianapolis, IN), foi incluído em manchas Bcl I como um tamanho padrão para fragmentos de hibridização.

[00124] Sondas para os genes cry1F e pat também foram marcadas por uma reação de PCR incorporando um nucleotídeo marcado com digoxigenina (DIG), [DIG-11]-dUTP, no fragmento. A marcação por PCR de fragmentos isolados foi executadA de acordo com os procedimentos fornecidos no kit de síntese de sondas DIG de PCR (Roche).

[00125] As sondas marcadas com DIG foram hibridizadas para o Southern blots de Bcl I da geração T1 do evento 4114. As sondas foram hibridizadas para o DNA alvo para detecção dos fragmentos específicos usando solução DIG Easy Hyb (Roche) essencialmente conforme descrito pelo fabricante. Lavagens após a hibridização foram executadas sob alta estringência. Sondas marcadas com DIG hibridizadas para os fragmentos ligados foram detectadas usando o Sistema de Detecção de Ácido Nucleico Quimiluminescente CDP-Star (Roche). As manchas foram expostas a filme para raios X em temperatura ambiente por um ou mais pontos de tempo para detectar fargmentos de hibridização. As membranas foram removidas de sonda hibridizada de acordo com as recomendações do fabricante antes da hibridização com sondas adicionais.

[00126] A enzima de restrição Bcl I, apresentando um único sítio de restrição no T-DNA (Figura 2) foi selecionada para confirmar a presença de uma única inserção de T-DNA PHP27118 no milho 4114. O sítio para Bcl I está situado no pb 2546 do T-DNA (Figura 2) e irá produzir fragmentos maiores que cerca de 2500 pb e 9400 pb para um único T-DNA inserido. A hibridização com a sonda pat poderia indicar o número de cópias deste elemento encontradas no evento com base no número de bandas de hibridização (por exemplo, uma banda de hibridização indica uma cópia do elemento). A sonda pat poderia hibridizar com o fragmento maior que 9400 pb. Devido ao fato do sítio da enzima de restrição Bcl I estar dentro do gene cry1F, espera-se que a sonda cry1F hibridize com ambos os fragmentos e resulte em duas bandas para uma única inserção de T-DNA (Figura 2).

[00127] Os resultados da análise de Southern blot com Bcl I e as sondas do gene cry1F e pat gene para o milho 4114 estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5: Resumo dos Fragmentos de Hibridização Esperados e Observados em Southern Blots para digestos Bcl I do Milho 4114 1Tamanhos de fragmentos esperados baseados no mapa de PHP27118 T-DNA (Figura 2). 2Todos os tamanhos de fragmentos observados são aproximados com base na migração do marcador de peso molecular DIG VII. 3Dois fragmentos são esperados com a sonda cry1F devido ao local do sítio de restrição Bcl I dentro do gene cry1F.

[00128] Os resultados da análise de Southern blot do milho 4114 com a digestão Bcl I e a sonda cry1F apresentaram duas bandas conforme esperado, uma banda maior que 8,6 Kb e uma segunda banda de aproximadamente 3,1 Kb. Duas bandas são esperadas para uma única inserção devido ao local do sítio Bcl I no gene cry1F, de modo que estes resultados indicam que há uma única cópia de cry1F no milho 4114. Os resultados da análise de Southern blot do milho 4114 com a digestão Bcl I e a sonda pat apresentaram uma única banda maior que 8,6 Kb que coincidiu com o tamanho da banda cry1F maior, conforme esperado. Estes resultados indicam que também há uma única inserção do gene pat no evento de milho 4114.

[00129] Uma vez que os genes cry34Ab1 e cry35Ab1 estão localizados no mesmo fragmento que o gene pat e parte do gene cry1F, e entre os genes cry1F e pat genes no T-DNA, por extensão isto também demonstra que este evento é provável de conter uma única cópia de cada um desses genes.

EXEMPLO 4. CARACTERIZAÇÃO DO SEQUENCIAMENTO DAS REGIÕES DE INSERÇÃO E DE BORDA GENÔMICA DO EVENTO DE MILHO DP-004114-3

[00130] A sequência das regiões de inserção e de borda genômica foi determinada para confirmar a integridade do DNA inserido e para caracterizar a sequência genômica que flanqueia o sítio de inserção presente no milho 4114. Ao total, 16.752 pb da sequência genômica do milho 4114 foram confirmados, que compreende 2.422 pb da sequência de borda genômica 5’, 2,405 pb da sequência de borda genômica 3’, e 11.925 pb do T-DNA inserido de PHP27118. Foi verificado que o T-DNA inserido no milho 4114 tem uma eliminação de 29 pb na extremidade da Borda Direita (RB) e uma eliminação de 24 pb na extremidade de Borda Esquerda (LB). Toda a sequência remanescente é intacta e idêntica àquela do plasmídio PHP27118. As regiões de borda 5’ e 3’ genômicas do milho 4114 foram identificadas como sendo de origem de milho por amplificação por PCR e o sequencialmente das regiões de borda genômica do milho 4114 e das plantas de milho de controle.

[00131] Semente contendo o evento DP-004114-3 foi obtida a partir de uma T1S2 geração do milho 4114. A semente de controle foi obtida a partir de uma linhagem de milho que tem um fundo genético semelhante ao milho 4114, mas que não contém os cassetes do gene cry1F, cry34Ab1, cry35Ab1 e pat. Todas as sementes foram obtidas junto à Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Johnston, IA, EUA). O Ladder de massa de DNA baixa (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA) e o Ladder de massa de DNA alta (Invitrogen Corp.) foram usados para eletroforese em gel para estimar os tamanhos do fragmento de DNA em géis de agarose.

[00132] A semente do milho 4114 e a semente de controle foram plantadas em câmaras de crescimento na Estação Experimental da DuPont (Wilmington, DE, EUA) para produzir tecidos vegetais utilizados para este estudo. Uma semente foi plantada por vaso, e o vaso foi identificado de modo inequívoco. Todas as plantas cresceram com luz, temperatura e água regulados para o crescimento de planta saudável. As amostras de folha foram coletadas do controle e das plantas de milho 4114. Para cada planta individual, o material da folha foi coletado em uma bolsa pré-marcada, colocado em gelo seco e, a seguir, transferido para um freezer de temperatura ultra baixa (<-55°C) após a coleta. Todas as amostras foram mantidas congeladas até o processamento do tecido.

CONFIRMAÇÃO DO GENÓTIPO VIA ANÁLISE DE PCR ESPECÍFICA DE EVENTO

[00133] Uma amostra de folha foi tomada de todas as plantas de teste e controle para análise de PCR específica de evento. DNA foi extraído de cada amostra de folha usando o kit de PCR vegetal Extract-N-Amp™ seguido pelo procedimento descrito (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para análise de PCR em tempo real.

[00134] PCR em tempo real foi realizado em cada amostra de DNA utilizando um Sistema de DEtecção de Sequência ABI PRISM® 7500HT (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA). A sonda TaqMan® (Applied Biosystems, Inc.) e conjuntos de iniciadores (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, EUA) foram projetados para detectar uma sequência-alvo do milho 4114. Além disso, uma segunda sonda TaqMan® e o conjunto iniciador para um gene endógeno do milho de referência foi usado para confirmar a presença de DNA amplificável em cada reação. A análise consistiu da determinação po PCR em tempo real de calos positivos/negativos qualitativos. O DNA extraído foi analisado usando a Mistura TaqMan® Universal PCR Master, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems, Inc.).

[00135] A determinação positiva ou negativa para o milho 4114 foi baseada na comparação do CT (ciclo limite) do PCR alvo evento específico com aquele do alvo de referência endógeno do milho. Se os alvos de PCR de evento e endógeno amplificaram acima do limiar CT, então a planta foi classificada como positiva para aquele evento. Se o alvo endógeno amplificou e o alvo evento não amplificou, então a planta foi classificada como negativa. Se nem o alvo amplificou para uma amostra específica, então ela foi determinada como sendo uma amostra de DNA de qualidade ruim ou falhou no teste e o ensaio foi repetido.

[00136] Todas as plantas de milho 4114 foram positivas para o PCR evento específico e as proteínas PAT, Cry1F, e Cry34Ab1, enquanto que todas as plantas de milho de controle foram negativas. Os resultados estão resumidos na Tabela 6. Tabela 6. Resumo da Análise de PCR específica de evento e da Expressão de Proteína CrylF, Cry34Ab1 e PAT no milho 4114 e em plantas de milho de controle 1 .Resumo do Ensaio de PCR em tempo real evento específico para o milho 4114. Positivo (+) indica a presença do evento de milho 4114. Negativo (-) indica a ausência do evento de milho 4114. 2 .Resumo da expressão da proteína Cry1F, Cry34Ab1 e PAT no milho 4114 e plantas de milho de controle usando dispositivos de fluxo lateral. Positivo (+) indica a presença da proteína. Negativo (-) indica a ausência da proteína.

SEQUENCIAMENTO DE DNA

[00137] Fragmentos de DNA foram clonados e submetidos para o sequencialmente nas instalações de sequenciamento da Pioneer Crop Genetics Research (Wilmington, DE, EUA). O software Sequencher™ de Gene Codes Corporation (Ann Arbor, Michigan) foi usado para montar as sequências. A anotação da sequência foi realizada utilizando o Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen Corp) pela comparação das sequências de inserção de T-DNA geradas de milho 4114 com as sequências da região de T-DNA do plasmídio PHP27118 (usado para transformação para produzir o milho 4114).

[00138] A região de T-DNA do plasmídio PHP27118, usada para criar o milho 4114, foi sequenciada e comparada com a sequência de T-DNA inserida no milho 4114.

[00139] A sequência da região de T-DNA do plasmídio PHP27118 foi usada para modelar os pares de iniciadores para caracterizar o T-DNA inserido no milho 4114. Seis produtos de PCR sobrepostos foram gerados usando DNA genômico a partir de quatro diferentes plantas de milho 4114 como molde. Esses produtos de PCR foram clonados e sequenciados.

SEQUENCIAMENTO DAS REGIÕES DE BORDA GENÔMICA FLANQUEADORAS 5’ E 3’

[00140] A caracterização de Sequência Preliminar das regiões de borda genômica flanqueadoras 5’ e 3’ foi executada usando vários ciclos de PCR inverso (Silver e Keerikatte (1989) J. Virol. 63: 1924; Ochman et al. (1988) Genetics 120:621-623; Triglia et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16:8186) com iniciadores ancorados em várias regiões do T-DNA inserido. A informação da sequência obtida junto ao PCR inverso foi submetida à análise BLASTn e apresentou uma correlação com o clone BAC do milho AC211214 do banco de dados de nucleotídeo GenBank do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Esta sequência foi, então, usada para modelar iniciadores que englobaram as junções de inserção/genômicas 5’ e 3’ no milho 4114. Os produtos de PCR gerados a partir de quatro plantas de milho 4114 foram clonados e sequenciados para verificar as junções de inserção/genômicas 5’ e 3’ e as regiões de borda genômicas.

[00141] Além disso, para demonstrar que as regiões de borda genômica 5’ e 3’ identificadas eram originárias do milho, PCR foi realizada no milho 4114 e plantas de milho de controle nas regiões genômicas. Cada fragmento de PCR foi diretamente sequenciado para verificar a sua identidade da origem do milho.

[00142] A informação da sequência de T-DNA do plasmídio PHP27118 foi usada para modelar iniciadores para verificar a sequência inserida no milho 4114 (Tabelas 7 e 8). Tabela 7. Iniciadores de PCR Usados para Caracterizar as Regiões das Bordas Genômicas e o T-DNA inserido no Milho 4114 Tabela 8: Sequência e Local dos Iniciadores Usados para as Reações de PCR. 1Local na sequência do Milho 4114. Bases 1 - 2.422 = Região da Borda Genômica 5’ Bases 2.423 - 14.347 = inserção Bases 14,348 - 16,752= Região da Borda Genômica 3’

[00143] Para caracterizar o T-DNA inserido no milho 4114, os iniciadores de PCR foram projetados para amplificar a inserção de T-DNA em seis produtos de PCR sobrepostos separados, conforme esboçado na Tabela 7: fragmentos A até F (Posições Indicadas na Figura 5). Conforme esperado, os produtos de PCR previstos foram gerados apenas das amostras de DNA genômico do milho 4114 e não estavam presentes nas amostras de milho de controle. Os seis produtos de PCR foram clonados e sequenciados. Ao comparar a sequência do T-DNA inserido no milho 4114 com a região de T-DNA do plasmídio PHP27118 usada para criar o milho 4114, foi constatado que há uma eliminação de 29 pb na extremidade RB, e uma eliminação de 24 pb na extremidade LB. As eliminações dos terminais RB e LB comument ocorrem na tansformação mediada por Agrobacterium (Kim et al. (2007) Plant J. volume 51, páginas 779 a 791. Toda a sequência remanescente é intacta e idêntica àquela do plasmídio PHP27118. A sequência da inserção é apresentada na SEQ ID n° 6.

[00144] Para verificar a sequência da borda genômica 5' adicional, PCR foi realizado com um iniciador normal (SEQ ID n° 11) na região de borda genômica 5’ e um iniciador reverso (SEQ ID n° 12) no T-DNA inserido. O fragmento de PCR de 2.511 pb resultante A de amostras de DNA genômicas do milho 4114 foi clonado e sequenciado (Figura 3). Os 2.422 pb da sequência de região da borda genômica 5’ é estabelecida nos nucleotídeos 1 a 2.422 da SEQ ID n° 6.

[00145] Para verificar a sequência de borda genômica 3’ adicional, PCR foi realizado com um iniciador normal (SEQ ID n° 21) no T-DNA inserido e um iniciador reverso (SEQ ID n° 22) na região de borda genômica 3’. O fragmento de PCR de 2,612.F de amostras de DNA genômicas do milho 4114 foi clonado e sequenciado (Figura 3). Os 2.405 pb da sequência de região de borda genômica 3’ são estabelecidos nos nucleotídeos 14.348 a 16.752 da SEQ ID n° 6.

[00146] No total, 16.752 pb da sequência do DNA genômico do milho 4114 foram confirmados: 2.422 pb da sequência de borda genômica 5’, 2.405 pb da sequência de borda genômica 3' e 11.925 pb que compreende o T-DNA inserido.

[00147] Para demonstrar que as sequências da borda genômica flanqueadora 5' e 3' identificadas são de origem do milho, PCR foi realizada nas regiões de borda genômica 5’ e 3’ (o par de iniciadores estabelecido nas SEQ ID n°s 23 e 24 e o par de iniciadores estabelecido nas SEQ ID n°s 25 e 26, respectivamente) nas amostras de DNA genômico do milho 4114 e nas amostras de milho de controle. O fragmento de PCR esperado G (257 pb para a região genômica 5’) e o fragmento de PCR H (283 pb para a região genômica 3’) foram gerados a partir do milho 4114 e do milho de controle. Esses produtos de PCR foram clonados e sequenciados, e os produtos correspondentes do milho 4114 e do milho de controle são idênticos, dessa forma confirmando que as sequências são de origem genômica do milho.

EXEMPLO 5. EFICÁCIA CONTRA INSETOS DO EVENTO DE MILHO DP-0041143

[00148] Os dados sobre eficácia foram gerados no milho 4114. O teste de campo comparou o milho 4114 em dois fundos genéticos com um controle negativo (isolina) nos mesmos fundos. O teste de eficácia incluiu: Danos às folhas ECB de primeira geração (ECB1) e danos ao caule ECB de segunda geração (ECB2) em quatro locais, danos à raiz WCRW em três locais, e danos às folhas FAW em um local. Em cada local, canteiros com uma única fileira foram plantados em um bloco completo aleatório com três replicatas (20 sementes/canteiro x 12 entradas x 3 réplicas = 1 experimento/local). Todas as plantas foram tecidualmente amostradas após a emergência para confirmar a presença do evento por PCR específico de evento. Quaisquer negativos foram separados e cada canteiro diminuído até um suporte alvo de 10 a 15 plantas uniformemente espaçadas por canteiro.

[00149] Para testes caracterizando os danos ECB1, cada planta foi manualmente infestada com aproximadamente 100 larvas recém- nascidas ECB durante 3 vezes (total de 300 larvas) durante aproximadamente uma semana iniciando aproximadamente no estágio de crescimento V5. Aproximadamente três semanas após a última infestação bem sucedida, as classificações de danos à folha (à base de uma escala de classificação visual 9 - 1 onde 9 indica ausência de danos e 1 indica dano máximo) foram tomadas em 8 plantas consecutivas por canteiro (total de 24 plantas por fundo genético, por entrada) e as médias foram calculadas para cada tratamento. O resultados da alimentação foliar ECB da primeira geração no milho 4114 são mostrados na Tabela 9. Tabela 9. Eficácia do milho DP-004114-3 Contra Larvas ECB de aClassificações de Danos em plantas individuais foram determinadas usando a seguinte escala de classificação visual: 9.Nenhuma injúria às folhas visível ou uma pequena quantidade de injúria tipo pino ou orifício por pistola fina em algumas folhas. 8.Pequena quantidade de lesões tipo orifício por pistola em algumas folhas. 7.Injúria de orifício por pistola comum em várias folhas. 6.Várias folhas com lesões tipo orifício por pistola e alongadas (lesões de <1,3 cm (0,5”) de comprimento). 5.Várias folhas com lesões alongadas (lesões de 1,3 cm (0,5”) a 2,5 cm (1,0") de comprimento). 4.Várias folhas com lesões alongadas (lesões de>2,5 cm (1,0”) de comprimento). 3.Lesões longas (>2,5 cm (1,0”)) comuns em cerca de metade das folhas. 2.Lesões longas (>2,5 cm (1,0”)) comuns em cerca de dois terços das folhas. 1.A maioria das folhas com lesões longas. bEm um local, médias com a mesma letra não são significativamente diferentes (teste LSD protegido de Fisher, P > 0,05).

[00150] Para testes que caracterizam os danos ECB2, as mesmas plantas infestadas acima para ECB1 foram manualmente infestadas novamente mais tarde na estação de crescimento com aproximadamente 100 larvas recém-nascidas ECB (total de 300 larvas) por planta 3 vezes durante aproximadamente uma semana iniciando no estágio de crescimento R1, quando aproximadamente 50% das plantas estavam espalhando pólen. Aproximadamente de 50 a 60 dias após a última infestação, caules de 8 plantas consecutivas por canteiro (total de 24 plantas por fundo genético, por entrada) foram divididos a partir do topo do 4° entrenó acima da primeira espiga até a base da planta. O comprimento total do tunelamento do caule ECB (ECBXCM) foi então medido em centímetros e anotado para cada planta. Túneis de 1 cm ou menos foram considerados orifícios de entrada (larvas não foram capazes de se estabelecer no caule) e não foram incluídas no cm total de tunelamento. As médias (cm total de tunelamento) foram calculadas para cada tratamento. Os resultados da alimentação do caule ECB2 para o milho 4114 são mostrados na Tabela 10. Tabela 10. Eficácia do Milho DP-004114-3 Contra as Larvas ECB de Segunda Geração bEm um local, médias com a mesma letra não são significativamente diferentes (teste LSD protegido de Fisher, P > 0,05).

[00151] Danos à raiz causados por WCRW também foram investigados. Plantas aproximadamente no estágio de crescimento V2 foram manualmente infestadas com aproximadamente 500 ovos de WCRW aplicados no solo em cada lado da planta (~total de 1.000 ovos/planta). Adicionalmente, canteiros foram plantados em campos que apresentavam uma alta probabilidade de conter uma infestação natural de WCRW. As raízes das plantas foram avaliadas aproximadamente no estágio de crescimento R2. Cinco plantas consecutivas por canteiro (total de 45 plantas por fundo genético, por entrada) foram removidas do canteiro e lavadas com água pressurizada. O dano à raiz foi classificado usando a escala de injúria de nó de 0 a 3 (CRWNIS) (Oleson, et al. (2005) J. Econ. Entomol., 98(1):1-8) e as médias foram calculadas para cada tratamento. As classificações de danos à raiz médias da alimentação WCRW são mostradas na Tabela 11. Tabela 11. Eficácia do Milho DP-004114-3 Contra Larvas WCR bAs classificações dos danos em massas de raiz de plantas individuais foram determinadas usando a Escala de Injúria de Nós de 0 a 3 (Oleson et al. 2005, supra). cEm um local, médias com a mesma letra não são significativamente diferentes (teste LSD protegido de Fisher, P > 0,05).

[00152] Para o teste de eficácia FAW, plantas individuais foram manualmente infestadas com aproximadamente 75 neonatos aproximadamente no estágio de crescimento V5. As folhas foram classificadas para os danos em 8 planta consecutivas por canteiro (total de 24 plantas por fundo genético, por entrada) (FAWLF baseado em uma escala de classificação visual 9-1 onde 9 indica nenhum dano e 1 indica máximo de danos aproximadamente duas semanas após a última inoculação bem sucedida e as médias foram calculadas para cada tratamento. AS classificações de danos médios caracterizando a alimentação foliar FAW em DP- 004114-3 são mostradas na Tabela 12. Tabela 12. Eficácia do Milho DP-004114-3 Contra Larvas FAW aClassificações de Danos em plantas individuais foram determinadas usando a seguinte escala de classificação visual: 9.Nenhum dano às lesões de orifício presentes nas folhas 8.Orifícios e pequenas lesões circulares presentes em folhas dverticiladas. 7.Pequenas lesões circulares e algumas lesões pequenas alongadas (formato retangular) de até 1,3 cm (0,5”) de comprimento presentes em folhas verticiladas e enroladas. 6.Várias lesões pequenas alongadas de 1,3 cm (0,5”) a 2,5 cm (1”) de comprimento em algumas folhas verticiladas e enroladas. 5.Várias lesões grandes alongadas maiores do que 2,5 cm (1”) de comprimento presentes em algumas folhas verticiladas e enroladas e/ou alguns orifícios em formato uniforme para irregular de pequenos a médios (membrana basal consumida) em folhas verticiladas e enroladas. 4.Várias lesões alongadas grandes presentes em várias folhas verticiladas e enroladas e/ou vários orifícios de formato uniforme para irregular grandes em folhas verticiladas e enroladas. 3.Muitas lesões alongadas de todos os tamanhos presentes em várias folhas verticiladas mais vários orifícios de formato uniforme para irregular grandes em folhas verticiladas e enroladas. 2.Muitas lesões alongadas de todos os tamanhos presentes na maioria das folhas verticiladas e enroladas mais vários orifícios de formato uniforme para irregular de tamanho mediano a grande em folhas verticiladas e enroladas. 1.Folhas verticiladas e enroladas quase totalmente destruídas. bEm um local, médias com a mesma letra não são significativamente diferentes (teste LSD protegido de Fisher, P > 0,05).

[00153] Em adição aos estudos de eficácia de campo, milho 4114 foi avaliado no ensaio de muda subletal em laboratório (SSA) (publicação US n° 2006/0104904 os conteúdos da qual estão aqui incorporados, por referência). O SSA permitiu uma comparação da eficácia do milho 4114 com um controle não protegido (próximo da isolinha) sem os efeitos interferentes do ambiente de campo. A técnica SSA envolve a exposição de uma população de WCRW recém- nascidos às mudas de milho contendo os eventos de milho 4114 ou mudas de milho não transgênicas (controle negativo). As larvas foram expostas durante um período de 17 dias a partir da data de eclosão do ovo inicial. A unidade experimental para SSA foi um único recipiente plástico com dimensões de 23 x 30 x 10 cm (Pactiv Corp., Lake Forest, IL, EUA). As entradas foram dispostas em um bloco completo aleatório com 3 replicatas por entrada. Para cada entrada, a configuração do SSA envolveu a colocação de 115 sementes em cada recipiente com 225 mL de uma solução de fungicida de 1% tiofanato-metila e 1000 mL de meio de planta de crescimento Metro-Mix 200 (Scotts-Sierra Horticultural Products Company, Marysville, OH, EUA). Imediatamente após a adicionando do MetroMix, os ovos WCRW foram infestados sobre a superfície de cada recipiente a uma taxa de 1.000 ovos por recipiente. Os ovos WCRW foram pré-incubados a 25°C de modo que a eclosão dos ovo inicial foi temporizada para ocorrer de 5 a 7 dias após a configuração do recipiente. Os recipientes infestados foram mantidos em uma câmara ambiental com entrada direta com parâmetros de 25°C, 65% de umidade relativa e ciclo de claro:escuro de 14:10. As larvas foram extraídas dos recipientes 17 dias após a eclosão dos ovos usando um sistema de funil Burlese. Uma subamostra aleatória de 30 larvas por recipiente foi selecionada e suas cápsulas de cabeça foram medidas sob um microscópio dessecante para classificar cada uma em 1 dos 3 ínstares. Os dados coletados incluem a estrutura da idade da população de larvas determinada a partir do número de larvas em cada um dos três ínstares potenciais. Histogramas que exibiram graficamente a distribuição de idade das larvas para cada entrada foram representados graficamente e visualmente comparados, conforme mostrado na figura 4.

[00154] O espectro da peste para o milho 4114 é fornecido na Tabela 13. Tabela 13. Pestes de Insetos Que são Controladas ou Suprimidas pelo Milho DP-004114-3 Maize Expressando CrylF, Cry34Ab1 e Cry35Ab1

EXEMPLO 6. EXPRESSÃO E CONCENTRAÇÃO DA PROTEÍNA GERAÇÃO DO MATERIAL DE ORIGEM VEGETAL

[00155] milho 4114 da geração PHNAR x BC3F3 cresceu em cinco locais nos Estados Unidos e Canadá. Cada sítio utilizou um modelo de bloco completo selecionado aleatoriamente contendo quatro blocos, com cada bloco separado por uma distância de proteção de ao menos 0,9 m (36 polegadas). Cada entrada foi plantada em vasos de 2 fileiras margeadas em cada lado por 1 fileira de semente na margem.

COLETA E PROCESSAMENTO DE TECIDO DE FOLHA

[00156] Uma amostra de tecido de folha foi coletada em cada bloco no estágio V9. Todas as amostras foram coletadas de plantas representativas imparcialmente selecionadas e saudáveis para cada evento. Cada amostra de folha foi obtida pela seleção da folha mais jovem que surgiu a pelo menos 20 cm (8 polegadas, tecido visível) do verticilo. Se esta folha foi danificada ou, de outro modo, não estava saudável, a folha seguinte abaixo dela foi amostrada. A folha foi desbastada (cortada) da planta em aproximadamente 20 cm (8 polegadas) da ponta da folha. A amostra da folha (incluindo a nervura central) foi cortada em pedaços < 2,5 cm (1 polegada) e colocada em um frasco de amostra de 50 mL. As amostras foram a seguir colocadas em gelo seco até serem transferidas para um congelador (<-10°C). As amostras foram despachadas congeladas e armazenadas a <-10°C na recepção. Todas as amostras de tecido foram liofilizadas, sob vácuo, até a secura. As amostras de folha liofilizadas foram finamente homogeneizadas na preparação para análise. As amostras foram armazenadas congeladas entre as etapas de processamento.

DETERMINAÇÕES DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA

[00157] As concentrações das proteínas Cry1F, Cry34Ab1, Cry35Ab1, e PAT foram determinadas usando métodos de ELISA quantitativos específicos.

EXTRAÇÃO DE PROTEÍNA

[00158] Alíquotas do tecido foliar processado foram pesadas em tubos de 1,2 mL no peso alvo de 10 mg. Cada amostra analisada para as concentrações de proteína Cry1F, Cry34Ab1, Cry35Ab1 e PAT foi extraída em 0,6 mL de pbST resfriado (solução salina tamponada com fosfato mais Tween-20). Após a centrifugação, os sobrenadantes foram removidos, diluídos e analisados.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA CRY1F, CRY34AB1 E PAT

[00159] Os kits de ELISA Cry1F, Cry34Ab1 e PAT ELISA utilizados foram obtidos junto à EnviroLogix, Inc. (Portland, ME, EUA), e o kit de ELISA Cry35Ab1 utilizado foi obtido junto à Acadia BioScience, LLC (Portland, ME, EUA). O método de ELISA para cada uma dessas quatro proteínas utilizou um formato de “sanduíche” sequencial para determinar a concentração da proteína nos extratos de amostra. Extratos de amostra padrão (analisados em poços em triplicata) e diluídos (analisados em poços em duplicata) foram incubados em placas pré-revestidas com um anticorpo específico para uma proteína única escolhida de Cry1F, Cry34Ab1, Cry35Ab1 ou PAT. Após a incubação, substâncias não ligadas foram lavadas da placa. Um anticorpo específico diferente para a proteína respectiva selecionada, conjugado com a enzima peroxidase de raiz-forte (HRP), foi adicionado à placa e incubado. A seguir, substâncias não ligadas foram lavadas da placa deixando a proteína ligada “imprensada” entre o anticorpo revestido na placa e o conjugado anticorpo-HRP. A detecção do complexo anticorpo-proteína ligado foi realizada mediante a adição de substrato, que gerou um produto colorido na presença de HRP. A reação foi interrompida com uma solução ácida e a densidade ótica (OD) de cada poço foi determinada usndo o leitor de placa. Uma média dos resultados dos poços em duplicata foi usada para determinar a concentração da proteína Cry1F, Cry34Ab1, Cry35Ab1 ou PAT na amostra em ng/mg em peso seco.

CÁLCULOS PARA DETERMINAR AS CONCENTRAÇÕES DE PROTEÍNA

[00160] software SoftMax® Pro foi usado para realizar os cálculos necessários para converter os valores de OD obtidos pelo leitor de placas em concentrações de proteína.

1. CURVA PADRÃO

[00161] Uma curva padrão foi incluída em cada placa de ELISA. A equação para a curva padrão foi gerada pelo software, que utilizou um ajuste quadrático para relacionar os valores de OD média obtidos para os padrões com a respectiva concentração do padrão (ng/mL). A equação de regressão quadrática foi aplicada da seguinte forma: y = Cx2 + Bx + A onde x = concentração de padrão conhecido e y = respectivo valor de absorvância média (OD).

2. CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA

[00162] A interpolação da concentração da amostra (ng/mL) foi realizada solucionando para x na equação acima usando os valores para A, B e C determinados pela curva padrão.

[00163] Por exemplo Parâmetros da Curva: A = 0,0476, B = 0,4556, C = -0,01910 e OD da amostra = 1,438

[00164] Os valores da concentração da amostra foram ajustados para o fator de diluição expresso como 1:N

[00165] Concentração Ajustada = Concentração da Amostra x Fator de Diluição

[00166] Por exemplo, Concentração da Amostra = 3,6 ng/mL e Fator de Diluição = 1:10

[00167] Concentração Ajustada = 3,6 ng/mL x 10 = 36 ng/mL

[00168] Os valores de concentração da amostra ajustados foram convertidos de ng/mL para ng/mg de peso da amostra como a seguir:

[00169] Peso da Amostra em ng/mg = ng/mL x Volume de Extração (mL)/Peso da Amostra (mg)

[00170] Por exemplo, Concentração = 36 ng/mL, Volume de Extração = 0,60 mL, e

[00171] Peso da Amostra = 10,0 mg

[00172] Peso da Amostra em ng/mg = 36 ng/mg x 0,60 mL/10,0 mg = 2,2 ng/mg

3. LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO INFERIOR (LLOQ)

[00173] LLOQ, em ng/mg de peso da amostra, foi calculado da seguinte forma: por exemplo, para PAT em folha: LLOQ do ensaio reportável = 2,3 ng/mL, volume de extração = 0,6 mL, e peso alvo da amostra 10 mg

RESULTADOS

[00174] As proteínas Cry1F, Cry34Ab1, Cry35Ab1, e PAT foram detectadas no tecido de folha V9 do milho 4114 nas concentrações apresentada na Tabela 14 abaixo. Tabela 14: Concentrações de proteína no milho 4114 *O LLOQ para Cry1F e PAT foi de 0,14 ng/mg de peso seco; o LLOQ para Cry34Ab1 e Cry35Ab1 foi de 0,16 ng/mg de peso seco

[00175] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ficar evidente para as pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada na disposição e detalhes sem se afastar de tais princípios. Nós reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações em anexo.

[00176] Todas as publicações e documentos patente publicados citados neste relatório descritivo estão aqui incorporados a título de referência até o mesmo nível de que se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (16)

1. Constructo de DNA, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: um primeiro, segundo, terceiro e quarto cassete de expressão, sendo que o dito primeiro cassete de expressão em ligação operável compreende: (a) um promotor da ubiquitina de milho; (b) um éxon não traduzido 5’ de um gene da ubiquitina de milho; (c) um íntron da primeira ubiquitina de milho; (d) uma molécula de DNA que codifica Cry1F conforme definido pela SEQ ID NO: 1; e (e) um sinal de adição poli(A) do terminador ORF 25; o dito segundo cassete de expressão em ligação operável compreende: (1) um promotor da ubiquitina de milho; (2) um éxon não traduzido 5’ de um gene da ubiquitina de milho; (3) um íntron da primeira ubiquitina de milho; (4) uma molécula de DNA que codifica Cry34Ab1 conforme definido pela SEQ ID NO: 2; e (5) um terminador de transcrição PinII; o dito terceiro cassete de expressão em ligação operável compreende (i) um promotor da peroxidase de trigo; (ii) uma molécula de DNA que codifica Cry35Ab1 conforme definido pela SEQ ID NO: 3; e (iii) um terminador de transcrição PinII; e o dito quarto cassete de expressão em ligação operável compreende (a) um promotor CaMV 35S; (b) uma molécula de DNA que codifica pat conforme definido pela SEQ ID NO: 4; e (c) um terminador de transcrição 3’ de CaMV 35S, sendo que os quatro cassetes são flanqueados por uma sequência de junção 5’ da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de junção 3’ da SEQ ID NO: 28.

2. Método para obtenção de uma planta transformada CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) transformar uma célula vegetal com o constructo de DNA conforme definido na reivindicação 1; (b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; e (c) regenerar uma planta transformada a partir da referida célula vegetal transformada.

3. Método de acordo com a reivindicação 2 CARACTERIZADO pelo fato de que a referida planta é uma planta de milho compreendendo o genótipo do evento de milho DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6, sendo que o dito genótipo consiste das sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, e os quatro cassetes do constructo de DNA conforme definido na reivindicação 1, sendo que os quatro cassetes são flanqueados por uma sequência de junção 5’ da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de junção 3’ da SEQ ID NO: 28.

4. Molécula de ácido nucleico isolada, CARACTERIZADA pelo fato de consistir de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28.

5. Amplicon CARACTERIZADO pelo fato de consistir da sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28.

6. Método de produção de sementes de milho híbridas, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) plantar sementes de uma primeira linhagem de milho inata que consiste da sequência de nucleotídeo conforme definida pela SEQ ID NO: 6 e sementes de uma segunda linhagem inata que tem um genótipo diferente; (b) cultivar as plantas de milho resultantes do dito plantio até o momento da florescência; (c) emascular as ditas flores das plantas de uma das linhagens inatas de milho; (d) cruzar sexuadamente as duas linhagens inatas diferentes uma com a outra; (e) coletar a semente híbrida produzida por meio disso; e (f) detectar a presença na semente do DNA correspondente ao evento DP-004114-3 conforme definido na SEQ ID NO: 6.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que as plantas da primeira linhagem de milho inata são as origens femininas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que as plantas da primeira linhagem de milho inata são as origens masculinas.

9. Método para produzir uma planta de milho resistente às pestes lepidoptera, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) cruzar sexualmente uma primeira planta de milho de origem com uma segunda planta de milho de origem, em que a dita primeira ou segunda planta de milho de origem compreende o DNA do evento DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6, por meio disso produzindo uma pluralidade da primeira geração de plantas de progenia; (b) selecionar uma primeira geração de plantas de progenia que é resistente à infestação por insetos lepidoptera; (c) autofecundar a primeira geração de plantas de progenia, por meio disso produzindo uma pluralidade de segunda geração de plantas de progenia; (d) selecionar da segunda geração de plantas de progenia uma planta que é resistente às pestes lepidoptera; e (e) detectar a presença na planta de segunda geração do DNA correspondente ao evento DP-004114-3 conforme definido na SEQ ID NO: 6; sendo que a segunda geração de plantas de progenia compreende o constructo de DNA conforme definido na reivindicação 1.

10. Método de produção das sementes de milho híbridas, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) plantar sementes de uma primeira linhagem de milho inata, que compreende o constructo de DNA conforme definido na reivindicação 1 e sementes de uma segunda linhagem inata que tem um genótipo diferente da primeira linhagem de milho inata; (b) cultivar plantas de milho resultantes do dito plantio até o momento da florescência; (c) emascular as ditas flores das plantas de uma das linhagens inatas de milho; (d) cruzar sexuadamente as duas linhagens inatas diferentes uma com a outra; (e) coletar a semente híbrida produzida por meio disso; e (f) detectar a presença na semente do DNA correspondente ao evento DP-004114-3 conforme definido na SEQ ID NO: 6.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de compreender, ainda, a etapa de cruzar reversamente a segunda geração de plantas de progenia da etapa (d) que compreende o DNA do evento de milho DP-004114-3, conforme definido pela SEQ ID NO: 6, com a plana de origem que não tem o referido DNA do evento de milho DP-004114-3, por meio disso produzindo uma progenia reversamente cruzada que é resistente ao menos ao crisomelídeo do milho ocidental.

12. Método para a produção de uma planta de milho resistente ao menos ao crisomelídeo do milho, o dito método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) cruzar sexualmente uma primeira planta de milho de origem com uma segunda planta de milho de origem, em que a dita primeira ou segunda planta de milho de origem é uma planta do evento DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6, por meio disso produzindo uma pluralidade da primeira geração de plantas de progenia; (b) selecionar uma primeira geração de plantas de progenia que é resistente ao menos à infestação pelo crisomelídeo do milho; (c) cruzar reversamente a primeira geração de plantas de progenia da etapa (b) com a planta de origem que não tem o DNA do evento de milho DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6, por meio disso produzindo uma pluralidade de plantas de progenia reversamente cruzadas; (d) selecionar dentre as plantas de progenia reversamente cruzadas uma planta que é resistente ao menos à infestação pelo crisomelídeo do milho; e (e) detectar a presença na planta de progenia cruzada reversamente do DNA correspondente ao evento DP-004114-3 conforme definido na SEQ ID NO: 6 sendo que a planta de progenia cruzada reversamente selecionada da etapa (d) compreende a SEQ ID NO: 6.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que as plantas da primeira linhagem de milho inata são as origens femininas ou as origens masculinas.

14. Método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico que é exclusiva ao evento DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6 em uma amostra que compreende ácidos nucleicos de milho, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores de polinucleotídeo que, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico do referido evento DP-004114-3 produz um amplicon que é diagnóstico para o referido evento DP-004114-3; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, por meio disso produzindo o amplicon; e (c) detectar o amplicon, sendo que o par de iniciadores de polinucleotídeo compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo, em que o par de iniciadores de polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 11 e 12 ou SEQ ID NOs: 21 e 22 e sendo que o amplicon é definido pelas SEQ ID NOs: 27 e 28.

15. Método de detecção da presença do DNA correspondendo ao evento DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6 em uma amostra, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) colocar a amostra que compreende DNA de milho em contato com um iniciador de polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 11, 12, 21 e 22, sendo que o referido iniciador de polinucleotídeo hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA do referido evento de milho DP-004114-3 e que não hibridiza sob as ditas condições de hibridização estringentes com um DNA de planta de milho não-DP-004114-3; (b) submeter a amostra e o iniciador às condições de hibridização estringentes; e (c) detectar a hibridização do iniciador ao DNA; sendo que a detecção da hibridização indica a presença do referido evento DP-004114-3.

16. Kit para detectar ácidos nucleicos que são exclusivos ao evento DP-004114-3 conforme definido pela SEQ ID NO: 6, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um par de iniciadores em um método de detecção de ácido nucleico, e que mediante amplificação de ou hibridização a uma sequência de ácido nucleico alvo em uma amostra seguido de detecção do amplicon ou hibridização para a sequência-alvo, são diagnósticos para a presença das sequências de ácido nucleico únicas ao referido evento DP-004114-3 na amostra, sendo que o par de iniciadores compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo, em que o par de iniciadores de polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 11 e 12 ou SEQ ID NOs: 21 e 22 e sendo que o amplicon é definido pelas SEQ ID NOs: 27 e 28.