TWI378103B - Corn event tc1507 and methods for detection thereof - Google Patents

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1378103 玖、發明說明： 【^明所屬技領】 相關申請案之交互參照 本案請求美國臨時申請案第60/467,772號，申請日2003 年5月2曰之優先權。 發明領域 本發明係有關植物分子:生物學領域，特別本發明係有 關提供昆蟲抗性給植物之DNA建構體。特別本發明係有關 昆蟲抗性玉米植株TC1507 ’以及偵測於一樣品及其組成物 中是否存在有玉米植株TC1507 DNA之檢定分析。 I：先前技術3 發明背景 本發明係有關昆蟲抗性玉米（Zea mays)植株TC1507， 也稱作為玉米種系TC1507或玉米品件TC1507，以及關於玉 米植株TC1507之DNA植株表現建構體，以及於玉米植株 TC1507及其子代之轉殖基因區/側出插入區之須測。 玉米是一項重要農作物’於地球上許多區域是主要食 物來源。儘管已經使用保護措施例如應用化學農藥，但玉 米受害蟲之害造成全球玉米收成損失的主要因素。有鑑於 此利用基因工程方法將昆蟲抗性結合至農作物例如玉米， 意圖控制昆蟲的損害’以及減少傳統化學農藥的需求。有 一組用來產生轉殖基因昆蟲抗性農作物之基因為得自蘇桿 菌（Bacillus thuringiensis)(B.t.)之δ-内毒素。δ-内毒素已經成 功地表現於多種農作物例如棉花、馬鈴薯、稻米、向曰葵 7

及玉米，已經證實可對害蟲提供絕佳控制（Perlak，F.J等人 (1990)生物/技術8,939-943;?61^1^卩]等人（1993)植物分子 生物學 22:313-321 ; Fujimoto H.等人（1993)生物 / 技術 11:1151-1155 ; Tu等人（2000)自然生物技術18:1101-1104 ; PCT公告案編號WO 01/13731 ;及Bing JW等人(2000)CrylF 轉殖基因玉米功效，第14屆兩年一度國際植物對昆蟲抗性 工作坊，克羅拉多州克林堡）。 外來基因於植物表現已知受到該外來基因於植物基因 體所在位置的影響，可能原因為染色質結構（例如異染色 質）、或轉錄調節元體（促進基因）與接合位置的接近程度 (Weising等人’遺傳综論年報22:421477，1988)。同時於 基因體不同位置存在有轉殖基因將以不同方式影響植物的 整體表現型。因此理由故，經常需要篩選大量品件，來識 別具有該感興趣之導入基因最佳表現特徵的品件。例如於 植物及其它有機體觀察到多種品件對導入基因的表現程度 有寬廣變化。表現的空間樣式或時間樣式也有差異，例如 轉殖基因於不同植物組織的相對表現差異可能非對應於由 存在於被導入的基因建構體之轉錄調節元體所預期的樣 式。因此理由故，常見製造數百種至數千種不同的品件， 對該專品件篩檢出具有預定轉殖基因表現程度具有商用價 值轉殖基因表現樣式之單’品件。具有預定轉殖基因表現 矛王度或樣式之品件可用於使用習知之育種方法藉有性雜交 將°亥轉殖基因導入其它遺傳月景。此種雜交的子代維持原 先轉形株之轉殖基因表現特徵。此項策略用來確保於多種 1378103 文種之可靠基因表現，其極為適合用於局部生長條件。 較佳可偵測是否存在有特定品件，來判定雜交子代是 否含有感興趣之轉殖基因。此外，一種偵測特定品件之方 法將有助於符合法令規定，法令規定要求衍生自重組農作 ， 物的食品須在上市前經過核准且加以標示，例如用於環保 監視’用於田間監視農作物的特徵，或監視衍生自該農作 ， 物生成的產品，以及用於確保受法規規範或契約規範雙方 是否符合條款。 可藉業界已知之任一種核酸偵測方法來偵測是否存在 鲁 有轉殖基因，偵測方法包括（但非限制性）聚核酶連鎖反應 (PCR)或使用核酸探針之dna雜交。此等偵測方法通常之目 光焦點集中於常用的遺傳元體，例如啟動基因、終結基因、 標記基因等，原因在於對多種DNA建構體 而吕，編碼區為 可互換。結果，除非毗鄰於所插入之異種基因DNa之側出 DNA之DNA序列為已知，否則此種方法無法用於甄別不同

的品件’特別為使用相同的DNa建構體或極為類似的DNA 建構體製造的品件◊例如品件專一性PCR檢定分析述於美 · 國專利第6,395,485號來偵測菁英品件GAT-ZM1。如此希望 有簡單且有鑑別力的方法來識別品件TC1507。 【^^明内】

A 發明概要 本發明較佳係有關製迤其選擇昆蟲抗性單子葉農作物 > 植株之方法。特別提供一種DNA建構體，其當於植物細胞 及植物表現時可提供艮蟲抗性。根據本發明之一方面，提 9 1378103 供一種DNA建構體’其可被導入宿主細胞且於宿主細胞複 製’該DNA建構體當於植物細胞及植物表現時可對植物細 胞及植物提供昆蟲抗性。DNA建構體係由定名為PHI8999A 之DNA分子組成’包括兩個轉殖基因表現卡匣。第一表現 卡匣包含一個DNA分子其包括啟動基因、5,非轉譯表現序 列及玉米泛素（Ubi-Ι)基因之插入序列（Christensen等人 (1992)植物.分子生物學 18:675_689 及 Christensen 及 Quail(1996)轉殖基因研究5:213-218)以可操作方式連結至 編碼B.t.5-内毒素之DNA分子’被識別為CrylF美國專利第 5，188,960及6,218，188號），以可操作方式連結至包含由根癌 土壌桿菌（Agrobacterium tumefaciens)分離之3,ORF25轉錄 終結基因之DNA分子（Barker等人（1983)植物分子生物學 2:335-350)。該DNA建構體之第二轉殖基因表現卡匣包含花 椰菜嵌紋病毒（CaMV)之DNA分子35S啟動基因（〇dell j τ 等人（1985)自然313:810-812; Mitsuhara等人（1996)植物細胞 生理學37:49-59)以工作方式連結至編碼膦赤素 (phosphinothricin)乙醯基轉移酶（PAT)基因之DNA分子 (Wohlleben W.等人（1988)基因70:25-37)，以工作式連結至包 含得自（CaMV)35S之3’轉錄終結基因之DNA分子（參考 Mitsuhara等人（1996)植物細胞生理學37:49-59)。也提供含 有該DNA建構體之植物。 根據本發明之另一方面’提供識別定名為TC1507之新 穎玉米植株之組成物及方法，該方法係基於可特別辨識 TC1507之5’及/或3’側出序列之引子或探針。提供^^八分 10 1378103 子，其包含引子序列當用於PCR反應時將產生轉殖基因品 件TC1507之獨特染色體擴增片段。此等分子可選自於由下 列組成之群組： 5，-GTAGTACTATAGATTATATTATTCGTAGAG-3，(序列辨識編號:1); ， 5，-GCCATACAGAACTCAAAATCTTTTCCGGAG-3，(序列辨識編號:2); · 5、CTTCAAACAAGTGTGACAAA-3,(序列辨識編號:23); 5，-TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA-3，(序歹ij辨識編號:3); 5 ’ -AGCACCTTTTCATTCTTTCATATAC-3 ’ (序列辨識編號:4); 5 ' -GACCTCCCCA CAGGCATGAT TGATC-3'(序列辨識編號:5) ; ® 及其互補體。包含此等分子之玉米植株及種子構成本發明 之一方面。此外，提供利用此等引子序列來識別TC1507之 套件組。 本發明之又一方面係有關此處所述TC1507之特定側 出序列’其可用來發展出於生物樣品之TC1507之特定識別 方法。特別本發明係有關TC1507、序列辨識編號:21及序列 辨識編號:22之5,及/或3,側出區，其可用於發展特定引子及 探針。本發明進一步係有關基於使用此等特定引子及探針 ® 識別於生物樣品是否存在有TC1507之方法。 根據本發明之另一方面，提供之偵測於樣品内是否存 在有對應玉米品件TC1507之DNA之方法。該種方法包含:(a) ^ 包含DNA之樣品接觸一DNA引子集合，該引子集合當用於 與萃取自玉米品件TC1507之基因體DNA進行核酸擴增反 ， 應時，可產生一種對玉米品件TC1507具有診斷作用之染色 體擴增片段；（b)進行核酸擴增反應，因此產生染色體擴增 11 1378103 片段；以及(C)偵測該擴增片段。 包含新穎轉殖基因八則出插入區序列辨識編號:26及序 列辨識編號:27之DNA分子’且為序列辨識編號:26及序列辨 識編號:27之同貝或互補DNA分子構成本發明之一方面。 - ，

包含新穎轉殖基因/側出插入區序列辨識編號:26之 DNA序列屬於本發明之一方面。包含足夠長度轉殖基因插 入序列之聚核苷酸以及足夠長度得自玉米植株丁^%?之玉 米基因體及/或側出序列聚核苷酸序列辨識編號:26之DNA 序列也含括於本發明，其可用作為引子序列用來製造可診 · 斷玉米植株TC1507之擴增片段產物。 此外，提供包含新穎轉殖基因/側出插入區序列辨識編 號:27之DNA序列。包含足夠長度轉璋基因插入序列之聚核 苷酸以及足夠長度得自玉米植株TC15〇72玉米基因體及/ 或側出序列聚核苷酸序列辨識編號:27之DNa序列也含括 於本發明，其可用作為引子序列用來製造可診斷玉米植株 TC1507之擴增片段產物。 根據本發明之另一方面，包含至少11個或11個以上序 · 列辨識編號:26或其互補體之DNA序列轉殖基因部分之核 苔酸’以及類似長度之序列辨識編號:26或其互補體之5,側 出玉米DNA序列之該DNA序列可用作為DNA擴增方法之 DNA引子。使用此等引子製造的擴增片段可診斷玉米品件 气 TC1507。因此本發明也包括藉序列辨識編號:26同質或互補 ， DNA引子所製造的擴增片段。 根據本發明之另一方面，包含至少11個或11個以上序 12 列辨識編號:27或其互補體之DNA序列轉殖基因部分之核 甘酸’以及類似長度之序列辨識編號:27或其互補體之3，側 出玉米DNA序列之該DNA序列可用作為dna擴增方法之 DNA引子。使用此等引子製造的擴增片段可診斷玉米品件 ， TC15〇7。因此本發明也包括藉序列辨識編號:27同質或互補 DNA引子所製造的擴增片段。 · 特別’一種成對DNA分子包含dNA引子集合，其中該 DNA分子被識別為序列辨識編號:1或其互補體及序列辨識 編號:2或其互補體；序列辨識編號:2或其互補體及序列辨識 鲁 編號:23或其互補體；序列辨識編號:3或其互補體及序列辨 識編號:5或其互補體；序列辨識編號:4或其互補體及序列辨 識編號:5或其互補體構成本發明之方面。 本發明之其它方面包括包含序列辨識編號:1及序列辨 識編號:2 DNA分子之擴增片段；序列辨識編號:2及序列辨 識編號:23 DNA分子之擴增片段；序列辨識編號:3及序列辨 識編號:5 DNA分子之擴增片段；以及序列辨識編號:4及序 列辨識編號:5 DNA分子之擴增片段。 根據本發明之另一方面’偵測於樣品是否存在有對應 於TC1507品件之一種£^八分子之方法，該方法包含办)讓 包含萃取自一玉米植株2DNA之樣品與〇1^八探針接觸，該 汽 h針分子於最嚴苛雜交條件下可與萃取自玉米品件TC15〇7 之DNA雜交，但於嚴苛雜交條件下不會與對照玉米植株 · DNA雜交；（b)將該樣品之探針置於嚴苛雜交條件下；以及 (c)偵測探針雜交至DNA。特別一種彳貞測於樣品是否存在有 13 1378103 對應於TC1507品件之DNA分子之方法，該方法包含讓包 含萃取自玉米植株之DNA之樣品接觸DNA探針分子該 D N A探針分子係由對該品件為獨特之序列例如接合序列組 成，其中該DNA分子於最嚴苛雜交條件下可與萃取自玉米 品件TC1507之·A雜交，但於嚴苛雜交條件下不會與對^ 玉米植株DNA雜交；⑼將該樣品之探針置於嚴苛雜交條件 下；以及（c)偵測探針雜交至djsta。 此外提供可於生物試樣識別品件TC15〇7之套件組及 方法，其可偵測出於序列辨識編號:24内部之丁匸15〇7特Λ 區。 ·疋 提供DNA分子其包含至少一個TC15〇7接合序列該接 合序列係選自於由序列辨識編號:45、46、47、仆、49、％、 51、52 ' 53、54、55、56及57及其互補體組成之群組；其 中接合序列跨據插人基因體之非同質DNA與側出插入位置 之得自玉米細胞DNA亦即側出DNA間之接頭，可供診斷 TC1507品件。 根據本發明之另一方面，產生昆蟲抗性玉米植株之方 法，包含下列步驟:(a)雜交包含本發明之表現卡匣之第一親 代玉米種系（其提供昆蟲抗性）與缺昆蟲抗性之第二親代玉 米種系，因此產生㈣子代植株；以及(b)選擇具有昆蟲抗 性之子代植株。此種方法選擇性包含反向雜交子代植株與 第二親代玉米種系，來產生具有昆蟲抗性之真正育種用玉 米植株之額外步驟。 本七明h供一種製邊一對昆蟲有抗性之玉米植株之 14 1378103 方法，包含以DNA建構體PHI8999A(序列辨識編號:25)轉形 一玉米細胞，將該轉形後之玉米細胞生長成為一玉米植 棟’選出對昆蟲顯示抗性之玉米植株，進一步將該玉米植 株生長成多產玉米植株。多產玉米植株可自我授粉、咬與 相容之玉米變異株交叉授粉來產生昆蟲抗性子代。 本發明進一步係關於一種於生物樣品識別玉米品件 ， TC1507之DNA偵測套件組。較佳本發明之套件組包含—第 一引子其可特別識別TC1507之5,或3,側出區，以及—第二 引子其可特別識別於TC1507之外來DNA内部之序列，或側 馨 出DNA内部，用於PCR識別方案。本發明亦係關於—種識 別於生物樣品之品件TC1507之套件組，該套件組包含—特 定探針，該探針具有一序列其係對應於或互補於—序列， 後者序列具有與品件TC1507特定區80%至1〇〇%序列相同 型。較佳探針序列係對應於包含品件TC1507之5’側出區戋 3’側出區部分之特定區。 本發明涵蓋之方法及套件組可用於不同目的，例如（但 非限於）下列目的：識別於植株、植物材料或產物之品件 鲁 TC1507 ’該產物例如（但非限制性）包含或衍生自植物材料 之食品或飼料產品（新鮮或加工產品）；另外或此外，本發明 方法及套件組可用於識別轉殖基因植物產物用於轉殖基因 材料與非轉殖基因材料間之隔離；另外或此外，本發明方 a 法及套件組可用於測定包含玉米品件TC15〇7之植物材料含 ％ 置。套件組也包含偵測方法效能所需之試劑及材料。 本發明進一步係關於TC1507玉米植株或其部分包括 15 1378103 (但非限於)玉米植株TC1507及其衍生子代之花粉、胚珠、 營養細胞、花粉細胞核及卵細胞核。衍生得本發明之DNA 引子分子由其中提供特定擴增片段產物之玉米植株及種子 TC1507構成本發明之一方面。 前述及其它本發明之方面由後文詳細說明及附圖將更 為明瞭。 圖式簡單說明 第1圖係為線性映射圖，顯示轉殖基因插子 PHI8999A，以及轉殖基因插子之側出序列。 _ C實施方式3 較佳實施例之詳細說明 後文定義及方法係供更明白了解本發明以及導引熟諳 技藝人士實施本發明。除非另行指示，否則各術語係依據 業界人士之習慣用法。分子生物學常用術語定義可參考 Rieger等人’基因詞彙：古典與分子第5版，Springer-Verlag ; 紐約’ 1991 ;及Lewin，Genes V，牛津大學出版社：紐約 1994。使用於37CFR 1.822列舉之DNA鹼基命名。 ❿ 用於此4，「包含」一詞表示「包括但非限制性」。 用於此處，「玉米」一詞表示Zea may s或玉蜀黍，且包 括全部可與玉米育種之植物變種，包括野生種玉米。 用於此處「TC1507專一性」一詞表示核苷酸序列，其 適合用於植物、植物材料或產品例如但非限於包含或衍生 * 自植物材料之食品或飼料產品（新鮮或加工）之品件TC1507 的鑑別。 16 1378103 用於此處「昆蟲抗性」及「影響害蟲」等詞表示於任 何發育階段執行昆蟲進食、生長及/或行為的改變，包括（但 非限制性）殺滅昆蟲；延遲生長；阻礙繁殖能力等。 -用於此處「殺害蟲活性」及「殺蟲活性」等詞表示同 義字，表示有機體或物質（例如蛋白質）之能力可藉多項參數 量測，該等參數包括（但非限制性）害蟲進食及/或暴露於該 有機體或物質經歷適當長度時間後害蟲死亡、害蟲體重減 輕、害蟲被誘捕驅逐害蟲及害蟲之其它行為變化及生理變 化。例如「殺害蟲蛋白質」為本身或組合其它蛋白質顯示 殺害蟲活性之蛋白質。 「編碼序列」表示編碼特定胺基酸序列之核苔酸序 列。用於此處「編碼」或「被編碼」等詞用於特定核酸， 表示核酸包含所需資訊，指導核苷酸序列轉譯成為特定蛋 白質。蛋白質被編碼之資訊係使用字碼子規定。編碼蛋白 質之核酸包含於核酸轉譯區之非轉譯序列（例如插入序 列）、或可缺乏此種介入之非轉譯序列（例如於cDNA)。 「基因」表示可表現特定蛋白質之核酸片段，包括於 編碼序列之前（5’非編碼序列）及編碼序列之後（35非編碼序 列）之調節序列。「天然基因」表示天然出現基因帶有其本 身之調節序列。「嵌合體基因」表示任何非天然基因之基 因，包含非天然出現之調節序列及編碼序列。如此，嵌合 體基因包含調節序列及編碼序列，其係衍生自不同來源， 或包含衍生自相同來源之調節序列及編碼序列，但排列方 式與天然不同。「内生基因」表示天然基因於其有機體基因 17 體之自然所在位置。「外來」表示一種物質並非感興趣位置 天然出現之物質。如此「外來DNA」包含重組!)!^^以及新 導入且經過重排之植物DNA。「外來」基因表示通常非出現 於宿主有機體之基因，係藉基因移轉而被導入宿主有機 體。外來基因包含被插入非天然有機體之天然基因或嵌合 體基因。「轉殖」基因係已經藉轉形程序而被導入基因體之 基因。重組DNA已經被插入之植物基因體位置可稱作為「插 入位置」或「目標位置」。 用於此處，「插子DNA」表示表現卡匣内之非同質DNA 用來轉形植物材料，而「側出DNA」可存在於天然存在於 有機體如植物之基因體DNA，或透過轉形處理而被導入之 外來DNA(非同質DNA)，其為原先插子dNa分子以外部 分，例如關聯轉形品件片段。用於此處「側出區」或「側 出序列」表不至少20鹼基對及較佳至少5〇鹼基對且高達 5000鹼基對之序列其係緊鄰於原先外來插子DNA分子上游 且連續、或緊鄰原先外來插子DNA分子下游且連續。結果 導致外來DNA隨機整合之轉形程序，將導致獲得轉形株含 有各轉形株之特徵性獨特不同側出區。當重組][)]^八經由傳 統雜交而被導入植物時，其側出區通常不變。轉形株也含 有一片非同質插子DNA與基因間之獨特接合，或兩 片基因體DNA或兩片非同質DNA間之獨特接合。「接合J為 二特定DNA片段接合點。例如一接合存在於插子DNa接合 側出DNA位置。一接合點也存在於：DNA>;段共同接合之 轉形有機體’該接合方式係與天然有機體不同。「接合DNA」 18 1378103 表示包含一接合點之DNA。 用於此處，「非同質」述及核酸，表示核酸係來自異種， 或核酸來自同種但經由蓄意的人為介入而就組成及基因體 位置於天然形式實質上修改。例如工作式聯結至非同質核 酸序列之啟動基因可來自於與核誓酸序列衍生之種屬不同 種；或若啟動基因係來自於同種，則啟動基因未天然工作 式鍵聯至核苷酸序列。非同質蛋白質可來自於不同種，或 若來自於同種，非同質蛋白質由蓄意人為介入與其原先形 式實質上修改。 「調節序列」表示位在編碼序列上游(5’編碼序列）、内 部、或下游(3’非編碼序列）之核苷酸序列，其影響相關編碼 序列之轉錄、RNA處理或穩定性或轉譯。調節序列包括啟 動基因、轉譯前導子序列、插入序列及聚腺苷化辨識序列。 「啟動基因」表示可控制編碼序列或功能RNA表現之 核苷酸序列。通常編碼序列係位於啟動序列之3’。啟動基 因序列係由近端元體及較為遠端之上游元體組成，後者元 體俗稱為促進基因。如此「促進基因」為可刺激啟動基因 活性之核苷酸序列，促進基因可為啟動基因之内生元體， 或為非同質元體插入來促進啟動基因的濃度或組織專一 性。啟動基因可完全衍生自天然基因，或可由衍生自自然 界不同啟動基因的不同元體組成，或甚至包含合成核苷酸 節段。熟諳技藝人士須了解不同啟動基因可指導於不同組 織或不同細胞類型的基因表現，或於不同發育階段或回應 於不同環境條件的基因表現。可造成核酸片段於大部分細 19 1378103 胞類別被表現最多次之啟動基因俗稱為「組成啟動義 經常發現可用於植物細胞之各類型新的啟動義土因J。 ，多範(合ij 可參考OJcamuro及G〇Idberg(1989)植物生物化學15工8 範例。進一步了解，因大部分情況下，調節序列之 之 界尚未完全界定，故具有不同長度之核酸片段可有相^邊 動基因活性。 同啟 「轉譯前導子序列」表示位在—個基ϋ之啟動基因序 列與編碼序列間之核菩酸序列。轉譯前導子序列係存在、 轉譯起點序列上游完全經過處理的mRNA。轉譯前導子序 列影響多項參數，該等參數包括一次轉錄本被加工成為 mRNA、mRNA安定性及/或轉譯效率。已經說明轉譯前導 子序列範例（Turner及Foster(1995)分子生物技術 3:225-236)。 「3 ’非編碼序列」表示位在編碼序列下游之核答酸序 列，包括聚腺誓化辨識序列及其它編碼調節信號而可影響 mRNA處理或基因表現之序列。聚腺苔化信號通常係以二 響聚腺苷酸加成之m R Ν Α前驅物3，端之軌跡為其特徵。使用 不同3’非編碼序列係以Ingelbrecht等人（1989)植物細胞 1:671-680舉例說明。 蛋白質」或「多肽」為排列成由編碼多肽之聚核苷 酸編碼序列決定的特定順序之胺基酸鏈。 DNA建構體為DNA分子聯結在一起提供一或多個表現 卡匣之總成。DNA建構體可為質體’質體可於細菌細胞自 我複製，含有各種核酸内切酶限剪位置，其可用於導入可 20 提供功能基因元體之DNA分子，亦即啟動基因、插入序列、 W導子、编碼序列、3’終結區等；或DNA建構體可為DNA 分子線性總成，例如表現卡匣。含於DNA建構體内部之表 現卡匣包含提供信使RNA轉錄需要的遺傳物質。表現卡匣 可設計成於原核細胞表現或於真核細胞表現。本發明之表 現卡匣設計成最佳於植物細胞表現。 本發明之DNA分子提供於表現卡匣供於感興趣之有機 體表現。卡匣包括5’及3’調節序列，其係工作式聯結至本發 明之編碼序列。「工作式聯結」聯結之核酸序列為毗連，若 有所需接合二蛋白質編碼區、毗連、且於相同讀取架構。 工作式聯結意圖指示啟動基因與第二序列間之功能聯結’ 其中啟動基因序列初始化且媒介對應第二序列之DNA序列 轉錄。卡匣可額外含有至少一個額外基因來共同轉形至該 有機體。另外’額外基因可提供於複數個表現卡匣或複數 個DNA建構體上。 表現卡匣於5’至3’轉錄方向包括:轉錄起始區或轉譯起 始區、編碼區、及於作為宿主之有機體内有功能之轉錄終 結區或轉譯終結區。轉錄起始區（亦即啟動基因）可為宿主有 機體之天然或類似基因、或外來或非同質基因。此外啟動 基因可為天然序列或另外，為合成序列。表現卡匣可額外 含有5,前導子序列於表現卡匣建構體。此種前導子序列可 用來促進轉譯。 須了解此處用於「轉殖基因」一詞包括任一種細胞、 細胞系、胼胝體、組織、植物部分或植物，其基因形已經 21 1378103 藉非同質核酸的存在而改變，包括最初被改變之轉殖笑 因’以及經由最初轉殖基因之有性雜交或無性繁殖所形成 的轉殖基因。「轉殖基因」一詞用於此處並未涵蓋藉習知植 物育種法或天然事件所造成的基因體（染色體或外染色體） 變更’該等天然事件例如為隨機交又受精、非重組病毒感 染、非重組細菌轉形、非重組轉位或自發突變。 轉殖基因「品件」係使用非同質DNA建構體轉形植物 細胞產生’該非同質DNA建構體包括核酸表現卡£，其包 含感興趣之轉殖基因、由轉殖基因插入植物基因體可再生 之一群植物，以及藉插入特定基因體位置為特徵之特殊植 物選擇。一品件係以轉殖基因之表現為表現型特徵。於基 因層面，一品件為植物之基因組成之一部分。「品件」一气 也表示藉轉形株與另一種包括非同質DNA之變異株間之有 性雜交所產生之子代。即使重複反向雜交至親代，來自轉 形親代之插入DNA及側出DNA係存在於雜交種子代的相同 染色體位置。「品件」一詞也表示來自原先轉形株， 該DNA包含插入DNA及緊鄰插入DNA之側出序列，該dna 預期將移轉給接收插入DNA包括感興趣轉殖基因的子代， 該轉殖基因係由一種包括插入DNA之親代種系（例如原先 轉形株以及由自體受精所得子代）與一種不含插々DNA之 親代種系進行有性雜交的結杲。 昆蟲抗性TCl5〇7玉米植株之育種係經由首先有性雜 父第一親代玉米植株與第二親代玉米植株，該第—親代玉 米植株包含衍生自轉形㈣有本發明之表現卡E可賦予昆 22 1378103 蟲抗性之轉殖基因TC1507玉米植株及其子代生長所得玉米 植株組成，以及該第二親代玉米植株缺昆蟲抗性因此產 生多種第一子代植株；以及然後選擇對昆蟲有抗性之第一 子代植株；以及第一子代植株自體受精，因而產生多種第 二子代植株；然後由該第二子代植株選出昆蟲抗性植株。 此等步驟進-步包括第一昆蟲抗性子代植株或第二昆蟲抗. 性子代植株反向雜.交至第二親代玉米植株或第三親代玉^ 植株，因而產生對昆蟲有抗性之玉米植株。 ^ 用於此處，「植株」-詞包括對全株、植物器官（例如 _ 葉、莖、根等）、種子、植物細胞及其子代。須了解轉殖基 因植物部分屬於本發明之範圍，例如包含植物細胞、原Z 質體、組織、胼胝體、胚以及花、莖、果實、葉、及根其 係來自於轉殖基因植株、或其原先使用本發明dna分子轉 殖之子代’因此至少部分係由轉殖細胞組成，也構成本發 明之一方面。 用於此處，「植物細胞」—詞包括(但非限制性)種子、 懸浮培養、胚、分生子區、胼胝體組織、葉、根、芽、配 φ 子體、孢子體、花粉及微孢子。可用於本發明方法之植物 類別通常係寬廣至適合轉形技術之高等植物，包括單子葉 植物及雙子葉植物。 「轉形」表示核酸片段移轉至宿主有機體基因體，結 ’ 果獲得基因穩定的移傳。含有轉形核酸片段之宿主有機體 ， 稱作為「轉瘦基因」有機體。植物轉形方法例如包括土壤 才干菌媒介的轉形（De Blaere等人（1987)酶學方法143:277)及 23 粒子加速或「基因搶」轉移技術（Klein等人（1987)自然（倫 敦)327:70-73)美國專利第4,945,050號，以引用方式併入此 處）。額外轉形方法揭示如後。 如此本發明之單離聚核苔酸可結合於重組建構體，典 型為DNA建構體，其可被導入宿主細胞且於宿主細胞複 製。此種建構體為載體，載體包括一複製系統及序列，該 序列可轉錄及轉譯於一指定宿主細胞之多肽編碼序列。多 種適合穩定轉移感染植物細胞或適合建立轉殖基因植株之 載體說明於例如Pouwells等人（1985 ;補遺1987)轉殖載體: 實驗室手冊，Weissbach及Weissbach(1989)植物分子生物學 方法（學術出版社，紐約）；及Flevin等人（1990)植物分子生 物學手冊（Kluwer學術出版社）。典型植物表現載體例如包括 於5,及3’調節序列及主控可選擇標記的轉錄控制之下之一 或多種經選殖植物基因。此種植物表現載體也含有啟動基 因調節區（例如控制可誘生表現或組成表現、環境調節或發 育調節表現、或細胞專一性或組織專一性表現之調節區）、 轉錄引發起點位置、核糖體結合位置、RNA處理信號、轉 錄終結位置及聚腺苷化信號。 ^ 也須了解兩種不同轉殖基因植株也可雜交來產生含有 兩種分開額外外來基因之子代。適當子代的自體受精可產 生所添加外來基因的同質接合。如同營養繁殖般，也預期 包含回交至親代植物，以及與非轉殖基因植株作異種# 交。其它常用於不同形質及農作物的育種方法說明可參考 若干參考文獻，例如Fehr，培養變種發育之育種法，Wilcos 24 J.編輯，美國農藝學會，威斯康辛州麥迪遜(1987)。 「探針」是一種單離核酸，該單離核酸附接有習知可 偵測之標記分子或通報子分子，例如放射性同位素、配位 子、化學發光劑、或酵素。此種探針係與目標核酸股互補， .， 於本發明之情況下，係與來自玉米品件TC1507之單離dna 股互補，無論該dna股係來自於玉米植株 '或來自於包括 s亥品件DNA之樣品。根據.本發明之探針不僅包括去氧核糖 核酸或核糖核酸，同時也包括聚醯胺類及其它探針材料， 其可專一性結合至目標DNA序列，可用來偵測是否存在有 · 該目標DNA序列》 「引子」為單離核酸，引子藉核酸雜交而煉合至互補 目標DNA股，來形成引子與目標DNA股間之雜交體，然後 藉聚合酶例如DNA聚合酶而順著目標DNA股延長。本發明 之引子對可用於擴增目標核酸序列，例如藉聚合峰連鎖反 應（PCR)或其它習知核酸擴增方法擴增。「pcRj或「聚合 崎連鎖反應」為一種用於擴增特定DNA節段之技術（參考美 國專利第4,683，195及4,8〇0，159號；以引用方式併入此處）。 φ 楝針及引子有足夠核苷酸長度’可於操作員測定之雜 父條件或反應條件下專一性結合至目標!)]^八序列。此種長 度可為任一種夠長而可用於首選偵測方法之長度。通常使 用11核苷酸或以上，較佳18核苷酸或以上及更佳22核苷酸 * 或以上。此種探針及引子於高度嚴苛的雜交條件下專一性 、 雜交至目標序列。較佳根據本發明之探針及？丨子具有毗鄰 核苷酸與目標序列之完整DNA序列類似性，但與目標DNa 25 1378103 =不同之探針且保有雜交至目標DNA序列能力之探針可 错白知方法設計。探針可用作利子，但 成結合至_NA«NA，轉祕擴增方法/係6又汁 /寺定引子可用來擴增整合片段，製造擴增片段擴增 片&可用作為識別生物樣本品件TCi5〇7之 :允許探-合至樣品-件下，探針與錄樣 =時’此種結合可被偵測，如此允許指示生物樣品存在有 «口件TCl5〇7。此種結合探針之識別已經經過業界說明。特 定探針較佳為序列，該序列於最佳條件下，可專—性雜交 至。。件5側出區或3’側出區内部之一區，特定探針也較佳包 含晚連外來DNA之―部分。較佳特定探針包含與該品件特 疋區有至少80%相同（或互補）之序列’較佳為8〇%至85%， 更佳為85%至90%，特佳為90%至95%及最佳為95%至 100% 〇

ί采針及引子之製備及使用方法例如述於分子選殖：實 驗至手冊第2版第1-3集，編者Sambrook等人，冷泉港實驗 室出版社，紐約冷泉港1989年（後文稱作「Sambr00k等人 1989」）；分子生物學之流行方案編者Ausubel等人，Greene 出版社及約输威力父子公司’紐約1992年（定期更新）(後文 稱作「Ausubel等人1992」）；及Innis等人，PCR方案：方法 與應用指南，學術出版社：聖地牙哥，1990年。PCR引子對 可衍生自已知序列’例如使用意圖用於該項目的之電腦程 式而衍生’例如PCR引子分析工具於向量NTI版本6 (Informax公司馬里蘭州貝塞達）；prirnerseiect (DNASTAR 26 A司，威斯康辛州麥迪遜）；及Primer(0 5版權，1991年麻 省劍橋白社f研究協會）。此外，序列可以視覺掃描，弓丨 子可使用熟諳技藝人士已知之指南識別。 套件組」β司用於此處表示一組試劑用來進行本發 明方法，特別識別於生物樣品之品件TC1507。本發明之套 ， 件組可使用，其組成兀件可特別經調整用於品質控制(例如 . 種子批次純度之品質控制）、植物材料之品件1(:1507之偵 測、或包含植物材料或财自植物材料之材料，例如（但非 =制性)食品或飼料產品。「植物材料」一詞用於此處表示 · 待自或衍生自植物之材料。 基於此處揭示之旁出DNA及插子序列之引子及探針可 用來藉習知方法例如藉再度轉殖序列及定序序列之方法而 證實所揭示之序列（或若有所需校正所揭示之序列）。本發明 之核酸楝針及引子於嚴苛條件下雜交至目標DNA序列。任 -種習知核酸雜交或擴增方法皆可用來識別樣本存在有得 自轉殖基因品件的DNA。核酸分子或其片段於某些條件下 可專-性雜父至其它核酸分子1於此處，兩個核酸好 Φ 若可形成逆平打雙股核酸結構，則據稱可專一性彼此雜交。 核酸分子方有完整互補性，則據稱可為另一個核酸分 子的「互補體」。用於此處，當—個分子每個核㈣係互_ · 於另-個分子之核誓酸時’該分子稱作為具有「完整互補 性」。兩個分子若可彼此雜交，有足_定性可讓其於至少 · 習知「低嚴苛度」條件下維持煉合，則兩分子難為「最 小互補性」。同理，若二分子可彼此雜交，有足夠穩定性讓 27 其於習知「高度嚴苛」條件下可維持彼此煉合，則二分子 稱作為「互補」。習知嚴苛條件係如Sambr00w人卿所 述，以及Haymes等人於:核酸雜交，使用辦法，irl出版社， 華盛頓特印985年)所述1此_完全互補性為可被允 許’只要此㈣離不會完全排除分子形成雙股結構的能力 即可。為了讓減分子㈣以丨子或探針，於序列上只需 要足夠互.補’來於漏的特定溶劑及鹽濃度下可形成穩定 雙股結構。 於雜交反應，專-性典型係依據雜交後洗蘇之函數變 化而改變’關鍵因素為最終洗條溶液之離子強度及溫度。 熱炼點(Tm)為50%互補目標序列雜交至完美匹配探針之溫 度（於所定義之離子強度及pH之溫度）。對DNA_DNA雜交 體，Tm可由Meinkoth及Wahl(1984)分析生物化學 138:267-284 之方程式估算：Tm=81 5+16 6(1〇gM)+〇 4i (%GC)-0.61(%f〇rm)-500/L ;此處M為一價陽離子之莫耳濃 度’ ％GC為DNA之鳥苷及胞苷核誓酸百分比，％f〇rm為雜 父溶液之曱醯胺百分比，以及L為雜交體長度，以鹼基對為 單位。Tm對於每1%錯誤雜交減少約戊；因此Tm、雜交及 /或洗滌條件可經調整來雜交至預定身分之序列。例如若追 求序列有大於90%相同性，則Tm可降低10。(：。通常嚴苛條 件係選擇對特定序列及其互補體於定義的離子強度及， 比Tm低約5°C。但高度嚴苛條件可利用比化低]^、2。〇、3 C或4°C雜交及/或洗滌；中等嚴苛條件利用於、 7C、8°C、9°C、或10°C雜交或洗滌；低度嚴苛條件利用於 1378103 比Tm低lit、12°C ' 13°C ' 14°C、15t：、或2(TC。 使用該方程式、雜交及洗滌組成物以及預定Tm，熟諳 技藝人士了解將描述雜交及/或洗滌溶液的嚴苛程度變 化。若預定不匹配程度結果導致Τπι低於45t (水溶液）或32 · c(甲醯胺溶液）’則較佳提高ssc濃度，因而可使用較高溫 度。核酸雜交之徹底指南可參考Tijssen(1993)生物化學及分 子生物學貫驗室技術_與核酸探針雜交，第一部分，第2章 (Elsevier，紐約）；以及Ausube丨等人編輯（1995年）分子生物 學流行方案第2章（格林出版社及威力科技公司，紐約）。參 鲁 考Sambrook等人（1989)分子選殖:實驗室手冊（第2版冷泉港 實驗室出版社’紐約Plainview)。 用於此處，實質上同質序列為核酸分子，其專一性雜 父至於雨度嚴苛條件下可媲美之核酸分子互補體。可促成 DNA雜交例如6X氣化鈉/檸檬酸鈉（SSC)於約4rc，接著於 50°C使用2X SSC洗滌之適當嚴苛條件為熟諳技藝人士已 知，或可參考分子生物學流行方案，約翰威力父子公司， 紐約（1989年）’ 6.3.1-6·3·6。典型之嚴苛條件為鹽濃度低於 鲁 約1.5Μ鈉離子’典型於ρΗ 7.〇至8.3為約〇〇1至1〇河鈉離子 濃度（或其它鹽），溫度對短探針(例如1〇至5〇核苷酸)溫度至 少為約30°C ’對長探針(例如大於50核苷酸)溫度至少為約6〇 C。嚴苛條件也可以加入去穩定劑如甲酿胺達成。低度嚴 苛條件例如包括與30至50%曱醯胺緩衝溶液、1M氣化鈉、 、

1% SDS(硫睃十二烷酯鈉）於37°C雜交，於IX SSC至2X

SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M擰檬酸三鈉）於5〇。(：至55°C 29 1378103 洗務。範例中等嚴苛條件包括於4〇至45%曱醯胺、1M NaCb 1% SDS於37°C 雜交；以及於0 5χ SSC^1X ssc^55

C至60 C洗務。範例高度嚴苛條件包括於5〇%曱醯胺、iM

NaC卜 1%SDS於37°C雜交；以及於0 ixssc；^6(rcj_65°c· ， 洗滌》較佳具體例中，本發明核酸特別於中等嚴苛條件下， 雜交至TC1507品件或其互補體或任一種片段所獨特之一或 多個核酸分子.。 供比較用序列校準方法為業界眾所周知。如此二序列 間相同性百分比之測定可使用數學演繹法則達成。此種數 隹 學演繹法則之非限制例為]y[yers& Miller (1988) CABI〇s 4:11-17之演繹法則；Smith等人（1981) Adv. Appl. Math. 2:482之局部同質性演繹法則；Needienian及Wunsch(l‘970)J.

Mol· Biol，48:443-453之同質校準演繹法則；Pears〇n及 Lipman(1988)美國國家科學院議事錄85:2444_2448之搜尋 類似性方法；Karlin及Altschul(1990)美國國家科學院議事錄 87.2264之>負繹法則’修改為如^1^11及八1加|1111(1993)美國 國家科學院議事錄90:5873-5877。 · 此等數學演繹法則之電腦實施例可用來比較各序列來 決定序列之相同性。此等實施例包括（但非限於）:clustal 於PC/Gene程式（得自 inteiiigenetics，加州山景市）；ALIGN 程式（版本2.0) ; ALIGN PLUS程式（版本3.0，版權1997年）； 及 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA於威斯康辛 ’ 基因軟體’版本1〇(得自Accelrys，美國加州92121聖地牙科 史奎頓路9685號）。使用此等程式之校準可使用内設參數進 30 1378103 行0 CLUSTAL程式係由下列參考文獻詳細說明：Higgins及

Sharp，基因73:237-244(1988) ; Higgins及Sharp，CABIOS 5:151-153(1989) ； Corpet 等人，核酸研究 · 16:10881-90(1988) ; Huang等人’生物科學之電腦應用 I» 8:155_65(1"2)及Pearson等人，分子生物學方法 24:307-331(1994)。ALIGN及 ALIGN PLUS程式係基於Myers 及Miller(1988)參見上文之演繹法則。Altschul等人（1990)J.

Mol. Biol.2l5:4〇3 之 BLAST 程式係基於 Karlin 及 籲 AItschul(1990)參見上文之演繹法則。可用於資料庫類似性 搜尋之BLAST族程式包括:BLASTN用於相對於核苷酸資料 庫序列作核苷酸查詢序列；BLASTX用於相對於蛋白質資 料庫序列作核苷酸查詢序列；BLASTP用於相對於蛋白質資 料庫序列作蛋白質查詢序列；TBLASTN用於相對於核誓酸 資料庫序列作蛋白質查詢序列；及TBLASTX用於相對於核 ^•酸資料庫序列作核苷酸查拘序列。參考分子生物學流行 方案第19章’ Ausubel等人編輯，格林出版社及威力科技公 · 司’紐約（1995年）。也可藉檢視以人工進行校準。 為了獲得供比較用之間隙校準，可利用間隙BLAST(於 BLAST 2.0)，如Altschul等人（1997年）核酸研究25:3389所 教 述。另外PSI-BLAST(於BLAST2.0)可用來進行迭代搜尋， 债測分子間之距離關係。參見Altschul等人（1997)參見上 ’ 文。當利用BLAST、間隙BLAST、PSI-BLAST時，可使用 個別程式之内設參數（例如BLASTN用於核荅酸序列、 31 BLASTX用於蛋白質）。 參考www.ncbi.hlm.nih.gov。

用於此處’二核苷酸或多肽序列内文之「序列相同性」 或「相同性」係參照於二序列之殘基其當於特定比較視 国"^準最大對應關係時為相同。當序列相同性百分比用於 蛋白貝¥ ’ 了解非相同之殘基位置經常因保留胺基酸取代 而有差異’此處胺基酸殘基係以類似化學性賀（例如電荷或 心水性）之殘基取代其它胺基酸因此不會改變分子之功能 貝。當保留取代之序列有差異時，序列相同性百分比向 上調整而修正取代之保留性質。由於如此保留取代而不會 之序列據稱具有「序列相似性」或Γ相似性」。進行此種調 1之手段為熟諳技藝人士眾所周知。典型地，涉及將保留 取代D平級為部分不匹配，而非完全不匹配，因此提高序列 相同性百分比。如此例如若相同胺基酸評分為1，非保留取 代被6平分為〇 ’則保留取代被評分為〇至1間。保留取代之分 數例如如程式PC/GENE (Intelligenetics，加州山景市）進行 計算。

用於此處’「序列相同性百分比」表示於一比較窗比較 兩個最佳校準序列之測定值，其中於比較窗之多肽序列部 刀’比較參考序列（不含加成或刪除）可包含加成或刪除（亦 p間隙）來獲得兩個序列之最佳校準。百分比係由於二序列 之相同核酸鹼殘基或胺基酸殘基之位置編號測定，獲得匹 配位置編號’將匹配位置編號除以於比較視窗之總位置數 目’乘以100獲得序列相同性百分比計算而得。 有關使用特定擴增引子對擴增目標核酸序列（例如藉 32 1378103 PCR)，「嚴苛條件」而允許引子對只雜交至目標核酸序列之 條件，該目標核酸序列為具有對應野生型序列之引子（或其 互補體）將結合之核酸序列，較佳於DNA熱擴增反應產生獨 特擴增產物亦即擴增片段。 * 「（目標序列）特定」一詞指示探針或引子於嚴苛條件下 只雜交至包含目標序列樣品之目標序列。 * 用於此處’「擴增後之DNA」或「擴增片段」表示目標 核酸序列之核酸擴增產物為核酸樣板之一部分。例如為了 測定來自有性雜交之玉米植株是否含有來自本發明玉米植 鲁 株之轉殖基因品件基因體DNA，萃取自玉米植株組織樣品 之DNA可使用DNA引子對進行核酸擴增方法，該DNA引子 對包括毗鄰於所插入之非同質DNA插入位置之側出序列衍 生而得之第一引子，以及包括衍生自插入之非同質DNA之 第二引子’來產生擴增片段’該擴增片段可診斷是否存在 有該品件DNA。另外，第二引子可衍生自側出序列。擴增 片段具有某種長度，以及有某種序列，其也可珍斷該品件。 0 擴增片^又之長度可由引子對加一個核答酸驗基對之組合長 度、至DNA擴增方案所能產生之擴增片段之任一種長度。 另外’引子對可衍生自於插入DNA兩側之側出序列，因而 產生包括PHI8999A表現建構體之整個插入核答酸序列之 * 擴增片段，參考第1圖，大小約6.2 Kb。衍生自側出序列之 ” 引子對之一成員可位在距離插入DNA序列之~段距離。此 種距離.由約一對核苷酸鹼基對至擴增片段極限，或約 20,000核苷酸鹼基對。使用「擴增片段」一詞特別排除於 33 1378103 dna熱擴增反應可形成之引子二元體。 核酸擴增可藉業界已知之多種核酸擴増方法之任一種 包括聚合酶連鎖反應(PCR)達成。多種擴增方法為業界已知 述於美國專利第4,683,195及4,683,202號以及PCR方案：方法 ，， 與應用指南，編者Innis等人，學術出版社，聖地牙哥1990 年。PCR擴增方法已經發展成擴增高達22 Kb基因體DNA及 至多42 Kb嗟菌體DNA(Cheng等人，美國國家科學院議事錄 … 91:5695-5699 ’ 1994)。此等方法以及業界已知之其它DNA 擴增方法可用於實施本發明。須了解，於特定PCR方案之 · 多種參數須調整來配合特定實驗室條件，可略經修改而又 允許收集類似結果。此等調整為熟諳技藝人士顯然易知。 藉此種方法所產生的擴增可藉多項技術偵測，偵測技 術包括（但非限制性）基因位元分析（Nikiforov等人，核酸研 究22:4167-4175，1994)，此處DNA寡核苷酸係設計成毗鄰 側出DNA序列重疊插入DNA序列。寡核苷酸於微孔孔板之 孔内被制動。於感興趣該區PCR後(使用一個引子於插入序 列，以及一個引子於毗鄰側出序列），單股PCR產物可雜交 ® 至制動寡核苷酸，作為使用DNA聚合酶以及對預期次一驗 基之專一性經過標記之ddNTPs ’進行單一鹼基延伸反應之 樣板。可藉螢光讀取或基於ELISA讀取。信號指示由於成

A 功地擴增、雜交及單一鹼基延伸，而存在有插入序列/側出 序列。 另一種偵測方法為熱解定序技術（Pyrosequencing technique)，如 Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) 34 1378103 所述。於此種方法，寡核苷酸被設計為重疊毗鄰DNA及插

入DNA接合。寡核苷酸雜交至得自感興趣該區的單股pCR 產物（一個引子於插入序列，以及一個引子於側出序列），以 及於DNA聚合酶、ATP、硫酸晦、蟲螢光素酶、apyrase、 . 腺％5鱗酸硫酸及蟲螢光素存在下培養。個別添加dNTps， 結合獲得之光信號經測定。光信號指示因成功的擴增、雜 交以及單鹼基延伸或多鹼基延伸，存在有轉殖基因插入序 列/側出序列。 螢光偏極化係如Chen等人(基因體研究9:492-498，1999) 所述，為一種偵測本發明之擴增片段之方法。使用此種方 法，寡核誓酸設計成重合側出DNA與插入DNA接合。寡核 苷酸雜交至得自感興趣該區之單股PCR產物（一個引子於插 入;DNA，一個引子於側出DNA序列），於DNA聚合酶及螢光 標記ddNTP存在下培養。單一鹼基延伸，結果攙混入 ddNTP。攙混可使用螢光劑以偏光的改變來測定。偏光改 變指示由於成功地擴增、雜交及單股延長而存在有轉殖基 因插入序列/側出序列。 ®

Taqman®(PE應用生物系統公司，加州福斯特城）描述 為偵測與定量是否存在有DNA序列之方法，可由製造商提 供之指令而更完整了解。簡言之，設計FRET寡核苷酸探 卜 針，其重疊側出DNA及插入DNA接合。FRET探針及PCR引 子（〆個引子於插入DNA序列，一個引子於側出基因體序列） % 於熱穩定聚合酶及dNTPs存在下循環。FRET探針的雜交， 結果導致遠離FR ET探針之淬熄部分之螢光部分的裂解與 35 1378103 釋放。螢光信號指示由於成功地擴增與雜交而存在有側出 序列及轉殖基因插入序列。 分子呼叫台描述用於序列偵測’如Tyangi等人（自然生 技14:303-308,1996)所述。簡言之，FRET寡核答酸探針設計 · 為重疊側出DNA及插入DNA接合。FRET探針的獨特結構結 果導致其含有二次結構’二次結構可維持螢光部分及淬熄 · 部分緊鄰。FRET探針及PCR引子（一個引子於插入dNA序 列，以及一個引子於側出序列）係於熱穩定聚合梅及dNTPs 存在下循環。於成功的PCR擴增之後，FRET探針雜交至目 修 標序列，結果導致探針二次結構的去除，以及螢光部分與 淬熄部分的空間隔開。獲得螢光信號。螢光信號指示由於 成功地擴增與雜交而存在有側出序列及轉殖基因插入序 列。 使用的擴增片段内部序列專一性探針進行雜交反應， 乃又另一種用來藉PCR反應偵測產生之擴增之方法。 本發明進一步於下列實施例定義。須了解此等實施例 雖然指示本發明之較佳具體例，但僅供舉例說明之用。由 鲁 前文討論及實施例，熟諳技藝人士確定本發明之精要特 性’可未恃離本發明之精髓及範圍’對本發明做出多項變 化及修改來配合多項用途及條件。如此除了此處所示及所 述之外’本發明之各項修改為熟諸技藝人士由前文說明& ’ 已知。此等修改也意圖落入隨附之申請專利範圍。 ， 此處引述之各參考文獻之齡以Μ方式併入此處。 實施例 36 實施例1.藉粒子撞擊及含C r y 1F基因之轉殖基因植株再生 而轉形玉米 6.2 Kb之DNA分子定名為PHI8999A(參考第1圖及序列 辨識編號:25)，其包括第一轉殖基因表現卡匣包含啟動基 · 因、5’非轉譯表現序列及玉米泛素(Ubi-Ι)基因之插入序列 (Christensen等人（1992)植物分子生物學18:675-689及 Christensen及Quail(1996)轉殖基因研究5:213-218)以可操作

方式連結至編碼ΒΛ.δ-内毒素之DNA分子，被識別為CrylF 美國專利第5，188，％0及6,218,188號），以可操作方式連結至 籲 包含由根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)分離之 3 ORF25轉錄終結基因之DNA分子（Barker等人（1983)植物 分子生物學2:335-350);以及包括一第二轉殖基因表現卡匣 包含花椰菜嵌紋病毒（CaMV)之DNA分子35S啟動基因 (Odell J.T·等人（1985)自然313:810-812; Mitsuhara等人（1996) 植物細胞生理學37:49-59)以工作方式連結至編碼膦赤素 (phosphinothricin)乙醯基轉移酶（pat)基因之DNA分子 (Wohlleben W.等人(I988)基因7〇:25_37)，以工作式連結至包 籲 含得自（CaMV)35S之3’轉錄終結基因之DNA分子（參考 Mitsuhara等人（1996)植物細胞生理學37:49-59)，該DNA分 子PHI8999A用來轉形玉米胚組織。 蘇桿菌CrylF玉米植株係經由使用Bi〇iistics PDS-lOOOHe粒子搶(加州赫克立市拜雷（Bi〇_Rad)公司製造） ， 藉微彈道撞擊獲得；大致上如Klein等人（1987)自然UK 327(6117):70-73所述。由玉米穗單離之成熟胚，於授粉後 37 久收I於胼胝體引發培養基培養數日。轉形單曰，顯 微鶴粒子塗~ 土 i以經純化之PHI8999A DNA(序列辨識編 )肩粒子加速進入培養胚’此處插入DNA結合於細胞 木色體轉形期間只使用插入PHI8999A，而未結合額外質 . ^DNA於轉形株。撞擊後’胚被移轉至含有glufosinate作為 、擇^之饼低體引發培養基。個別胚之培養期間維持物理 上"刀開，大部分植株於選擇培養基培養死亡。 可倖存且可產生健康glufosinate抗性胼胝體組織之該 等胚給予-個獨特識別碼，來表示推定為轉形品件，繼續 φ 移轉至新鮮選擇培養基。植株由衍生自各個獨特品件的組 織而再生’ 1移至溫室。葉片採樣來作分子分析，藉PCR '貫轉殖基因的存在，以及藉ELISA來證實Cry 1F蛋白質的 表現。然後植株使用歐洲玉米填蟲接受全株生檢。陽性植 株與近親父配種系雜交’來獲得初步轉形植物的種子。於 田野評比多個種系。TC15G7品件絲於？項特徵的優異組 合’而由獨立轉殖基因品件的族群中選出，該等特徵包括 昆蟲杬性及農藝表現（參考Bing JW等人(2000) CrylF轉殖 · 基因玉米功效’第14屆兩年一度國際植物對昆蟲抗性工作 坊’克羅拉多州克林堡，以引用方式併入此處）。 實施例2，於蘇桿菌Cry 1F玉米種系TC1507包含轉殖基因插 子DNA5’側出序列之核苷酸之識別 為了識別於品件TC1507包括PHI8999A插子5,序列之 · DNA片段’得自品件TC1507基因體dna的Spe I限剪酶片段 於瓊脂凝膠上作尺寸選擇’純化，藉南方分析筛檢來證實 38 1378103 與CrylF楝針的雜交。於證實雜交以及證實片段大小之後， 感興趣片段被選殖入pBluescriptII sk(+)tm選殖載體，來製 備豐富之尺寸經過選擇之基於質體的基因體DNA存庫。與 部分CrylFIS] f的探針絲筛檢質體存庫的陽性純株。酬 , 陽性純株，藉額外篩檢純化，當雜交至CrylF探針時證實可 . 獲得陽性信號。所分離的陽性純株所含的接近3 Kb Spe Μ #又使用引子行走辦法定序。為了開始第一定序回合，於選 殖載體DNA結合至已知序列的引子被設計成定序部分感興 趣DNA。使用方向性相反的另—個引子，對同一區進行第 鲁 一定序回合，來獲得第二股。引子行走係經由重複使用得 自前一回合的定序資料來設計新的引子，然後使用新的引 子來將次一定序回合進一步延長至感興趣的DNA，直到獲 得玉米品件TC1507的插入轉殖基因DNA 5,側出序列獲得 為止，來完成引子行走。特定序列資訊提供於實施例4。 實施例3.蘇桿菌CrylF玉米種系TC1507插子5,側出序列之 證實 為了證實蘇桿菌CrylF玉米種系TC1507插子之5,側出 鲁 序列’設計PCR引子對，來獲得重疊PCR產物，由5,側出區 延長至全長PHI8999A轉殖基因插子。pcr產物成功地由蘇 桿菌CrylF玉米種系TC1507基因體DNA擴增，分離，定序 第一區至第六區，如表1所示’以及證實匹配先前決定之Spe I片段序列’如實施例2所述。但緊鄰於全長插子起點5,的bp '

2358至bp 2829區域不接受PCR擴增，顯然係大於前述得自 Spe I純株的序列。使用此區側出引子對，以及Advantage_GC 39 1378103 2聚合酶混合物(BD生科純株技術公司’加州保羅奥圖）成功 地擴增得自蘇桿菌CrylF玉米種系TC1507基因體DNA定序 之PCR產物。使用來以Advantage-GC 2系統製造擴増片段的 擴增條件顯示於表10。用來證實bp 2358至bp 2829區域序列 的DNA引子對列舉於序列辨識編號:1及序列辨識編號2及 序列辨識编號:2及序列辨識編號23。得自此區之序列敘於 表 1(區 7a、7b、7c及 8)。

實施例4.品件TC15075,側出序列 各區之說明提供於表1。 第1區（序列辨識編號:28)玉米基因體（無顯著同質性）

1 ACTAGTTTCC TAGCCCGCGT CGTGCCCCTA CCCCACCGAC GTTTATGGAA 51 GGTGCCATTC CACGGTTCTT CGTGGCCGCC CCTAAGGATG TAAATGGTCG 101 GTAAAATCCG GTAAATTTCC GGTACCGTTT ACCAGATTTT TCCAGCCGTT 151 TTCGGATTTA TCGGGATATA CAGAAAACGA GACGGAAACG GAATAGGTTT 201 TTTTTCGAAA ACGGTACGGT AAACGGTGAG ACAAACTTAC CGTAAGTTTT 251 CGTATTTCTC GGGAAACTCT GGTATATTCC CGTATTTGTC CCGTATTTTC 301 CCGACCCACG GACCTGCCAA TCAACCATCA GCCAGTCAGC CCATCCCCAC 351 AGCTATGGCC CATGGGGCCA TGTTGGCCAC ATGCCCACGC AACGCAAGGC 401 AGTAAGGCTG GCAGCCTGGC ACGCATTGAC GCATGTGGAC ACACACAGCC 451 GCCGCCTGTT CGTGTTTCTG TGCCGTTGTG CGAGACTGTG ACTGCGAGTG 501 GCGGAGTCGG CGAACGGCGA GGCGTCTCCG GAGTCTGGAC TGCGGCTGTG 551 GACAGCGACG CTGTGACGGC GACTCGGCGA AGCCCCAAGC TACCAAGCCC 601 CCAAGTCCCC ATCCATCTCT GCTTCTCTGG TCATCTCCTT CCCCTGGTCG 651 ATCTGCAGGC GCCAGACCG 40 1378103

第2區(序列辨識編號:29)未經描述之玉米基因體序列(互補體） 670 GCCGAAGCATC ACGAAACGCA CTAAGACCTC

701 GAAGGAGTCA AACCACTCCT CCGAGGCCTC GGGGGCTACA CCCGGCGGGT 751 GCGCTCGCGC GCACCCACCG GAACAAAATG TAACCGAGAA AGGTCGGTCC 801 CCTTGCAAAA AAAGTGCGAC AAAAGCCTCC AAGCGAGTAT TAACACTCAC 851 TTTGAGGCTC GGGGGCTAC 第3區（序列辨識編號:30)玉米Huck-1逆轉因子片段

870 TGTCGGGGACC ATAATTAGGG GTACCCCCAA

901 GACTCCTAAT CTCAGCTGGT AACCCCCATC AGCACAAAGC TGCAAAGGCC 951 TGATGGGTGC GATTAAGTCA AGGCTCGGTC CACTCAAGGG ACACGATCTC 1001 GCCTCGCCCG AGCCCAGCCT CGGGCAAGGG CGGCCGACCC CGAGGATTCA 1051 CGTCTCGCCC GAGGGCCCCC TCAAGCGACG GGCACACCTT CGGCTCGCCC 1101 GAGGCCCATT CTTCGCCGAG AAGCAACCTT GGCCAGATCG CCACACCGAC 1151 CGACCGTATC GCAGGAGCAT TTAATGCGAG GATCGCCTGA CACCTTATCC 1201 TGACGCGCGC TCTTCAGTCG ACAGAGCCGA AGTGACCGCA ATCACTTCGC 1251 CGCTCCACTG ACCGACCTGA CAAGAAGACA GCGCCGCCTG CGTCGCTCCG 1301 ACTGCTGTGC CACTCGACAG AGTGAGGCTG ACAGCAGCCA AGTCCGGCCT 1351 CGGGCGCCAT AGGAAGCTCC GCCTCGCCCG ACCCTAGGGC TCGGACTCGG 1401 CCTCGGCTCC GGAAGACGAC GAACTACGCT TCGCCCGACC CCAGGGCTTG 1451 GACTCAGCCT CGGCTCCGGA AGACGACGAA TTCCGCCTCG CCCGACCCCA 1501 GGGCTCGGAC TCGGCCTCGG CTCCAGAAGA CGACGAACTC CGCCTCGCCC 1551 GACCCCAGGG CTCGGACTCA GCCTCGGCTC CGGAAGACGA CGAACTCCGC 1601 CTCGCCCGAC CCCAGGGCTC GGACTCAGCC TCGGCCTCAG ACGATGGTCT 1651 CCGCCTCGCC CGACCCGGGG CTCGGACTCG A 41 第4區（序列辨識編號:31)CrylF基因片段

1682 CCTTTCTAT CGGACCTTGT

1701 CAGATCCTGT CTTCGTCCGA GGAGGCTTTG GCAATCCTCA CTATGTACTC 1751 GGTCTTAGGG GAGTGGCCTT TCAACAAACT GGTACGAATC ACACCCGCAC 1801 ATTCAGGAAC TCCGGGACCA TTGACTCTCT AGATGAGATA CCACCTCAAG 1851 ACAACAGCGG CGCACCTTGG AATGACTACT CCCATGTGCT GAATCATGTT 1901 ACCTTTGTGC GCTGGCCAGG TGAGATCTCA GGTTCCGACT CATGGAGAGC 1951 ACCAATGTTC TCTTGGACGC ATCGTAGCGC TACCCCCACA AACACCATTG 2001 ATCCAGAGAG AATCAC 第5區（序列辨識編號:32)玉米葉綠體rpoC2基因片段

2017 TCATCTCTTCAAGAA CTGCATATCT TGCCGAGATC

2051 CTCATCCCTA AAGGTACTTG ACAATAGTAT TATTGGAGTC GATACACAAC 2101 TCACAAAAAA TACAAGAAGT CGACTAGGTG GATTGGTCCG AGTGAAGAGA 2151 AAAAAAAGCC ATACAGAACT CAAAATCTTT TCCGGAGATA TTCATTTTCC 2201 TGAAGAGGCG GATAAGATAT TAGGTGGCAG TTTGATACCA CCAGAAAGAG 2251 AAAAAAAAGA TTCTAAGGAA TCAAAAAAAA GAAAAATTG GGTTTATGTT 2301 CAACGGAAAA AATTTCTCAA AAGCAAGGAA AAGTATT 第6區(序列辨識編號:33)玉米葉綠體或ubiZMl(2)啟動基因片段

2338 GTG GCTATTTATC

2351 TATC 核苷酸2355-2358(CGT)連結第6區至第7a區。 第7a區（序列辨識編號:34)pat基因片段

2358 GCA GCTGATATGG CCGCGGTTTG TGATATCGTT AACCATTACA

2401 TTGAGACATC TACAGTGAAC TTTAGGACAG AGCCACAAAC ACCACAAGAG 42 1378103

2451 TGGATTGATG ATCTAGAGAG GTTGCAAGAT AGATACCCTT GGTTGGTTGC 2501 TGAGGTTGAG GGTGTTGTGG CTGGTATTGC TTACGCTGGG CCCTGGAAGG 2551 CTAGGAAC

第7b區(序列辨識編號:35)pat基因片段（互補體） 2559 CC TCAACCTCAG CAACCAACCA ATGGTATCTA TCTTGCAACC 2601 TCTCTAGATC ATCAATCCAC TCTTGTGGTG TTTGTGGCTC TGTCCTAAAG 2651 TTCACTGTAG ACGTCTCAAT GTAATGGTTA ACGATATCAC AAACCG 第7c區（序列辨識編號:36)crylF基因片段(互補體）

2697 AGAG

2701 AAGAGGGATC T 第8區（序列辨識編號:3 7)多聯結子片段

2 712 CGAAGCTTC GGCCGGGGCC CATCGATATC CGCGGGCATG 2751 CCTGCAGTGC AGCGTGACCC GGTCGTGCCC CTCTCTAGAG ATAATGAGCA 2801 TTGCATGTCT AAGTTATAAA AAATTACCA 第9區（序列辨識編號:25)PHI8999A之全長插子 實施例5.玉米品件TC15〇7之5,側出區之說明

為了完整描述品件TC15075,側出序列，使用基本局部 校準搜尋工具(BLAST)對GenBank公開基因存庫（發行122, 2/01)進行同質性搜考^ BLAST程式進行序列類似性搜尋， 特別可用來識別與未知序列的同質性。除了搜尋公開基因 存庫之外，使用AlignX(Inf0rMax公司，麻省貝色拉）進行逐 對校準，來尋找玉米品件TC1507側出序列與pHI8999A轉殖 基因插子間的同質性。同質性搜尋結果示於表i。TC15〇7 5, 側出序列編號為鹼基1，最遠離插子的5,端，鹼基283〇係位 43 1378103 在全長PHI89"A轉殖基因插子起點（參考第⑽。相同性百 分比指示跨接受分析序列全長的相同匹配百分比。 大部H兄下，使用品件TC1507 5,側出序列作類似性 搜寻，結果獲得基於極高相同性百分比匹配於一個獨特序 列。此等序列識別於表i。.此外於TCl5〇7 5，DNA側出序列 有二區，其與多於一種已知序列有高度相似性。於區 870-1681及2338-2354，與二序列片段之相同性百分比分數 夠尚，因而無法测得為單一匹配（同質性）。各區的兩種可能 同質性示於表1。 對全部序列（但首669鹼基對除外)識別高度相似序列。 通常相似性搜尋結果指示與驗基1681 5,之玉米基因體序列 有尚度同質性。由驗基1682至位置2830的PHI8999A起點區 域含有若干與轉形品件關聯的片段。 表1.品件TC1507插子之序列摘要 於序列辨識編 號:24之位置 大小bp %相同性 同原性 於同原序列 所在位置 說明 1 1-669 669 N/A1 N/A N/A 未測得顯著同原性 2 670-869 200 90.5 AF123535 52432-52632 (互補體） 未經描述之玉米基因趙序 列 1¾ 於序列辨識编 號_·24之位置 大小bp %相同性 同原性 於同原序列 所在位置 說明 3 870-1681 812 89.4 AF050439 1-801 玉米Huck-l逆轉因子5, LTR2片段 812 86.6 AF050438 1-797 玉米Huck-l逆轉因子3， LTR片段 4 1682-2016 335 100.0 PH8999A 3149-3482 〇yiF基因片段 5 2017-2337 321 100.0 X86563 29429-29749 玉米葉綠體ipoC2基因片 段(RNA聚合酶β·2亞單 位） 6 2338-2354 17 100.0 X86563 97643-97658 玉米葉綠體tml基因片段 (tRNA-182-197De) 814 PHI8999A 182-197 玉米ubiZMl(2)啟動基因 片段 7a 2358-2558 201 100.0 PHI8999A 5320-5475 pat基因片段 7b 2559-2696 138 99 PHI8999A 5336-5518 (互補體） pat基因片段 44 1378103 7c 2697-2711 15 100.0 PHI8999A 2544-2558 i互補體） ciylF基因片段 8 2712-2829 118 100.0 PHI8999A 36-153 多聯結子區(驗基36>80>及 ubiZMl(2)啟動基因(驗基 81-153) Μ 段 9 2830-9015 6186 100.0 PHI8999A 11-6196 ΡΗΙ8999Α之全長插子 10 9016-9565 550 100,0 PHI8999A 39064456 ί互補體） 反轉ORF25终結子 11 9566-9693 128 100.0 NC_001666 121851-121978 (互補體） 100759-100886 玉米葉綠體rpsl2 rRNA 片段(23S核糖體RNA) 择 於序列辨識编 號:24之位置 大小bp %相同性 同原性 於同原序列所 在位置 說明 12 9696-10087 392 99 NC_001666 17091-17483 (互補體） 玉米葉綠體基因體片段 13 10088-10275 188 99 PH8999A 5333-5520 (互補體） 挪基因片段 14 10278-10358 81 100 NC_001666 137122-13720 2(互補體） 玉米葉綠體「^241」片_ 段說蛋白皙其田 15 10359-10612 254 N/A1 N/A N/A 未測得顯著同原性 16 1 X 10613-11361 749 N/A1 N/A N/A 未說明 .N/A ;不適用 .LTR ;長終端重複子 實施例6:證實於未經改性之對照玉米種系存在有區1、2及3 PCR分析用來測定品件TC1507之5,側出區的區1、2及 3(表1)是否存在於用來轉形而製造玉米品件TC1507之未經 改性對照玉米種糸’如此表示帶有玉米基因體dna的填 蟲。對由TC1507製備的基因體DNA、以及未經改性之對照 玉米種系Hi-II(參考Armstrong(1994)玉米手冊，編輯 春

Freeling及Walbot ’ Springer-Verlag，紐約，663-671頁有關 Hi-II資訊）如表2之摘述’使用表3所示引子序列進行9項不 同的PCR分析。設計兩項反應來擴_5,側出區由bp 25至 324(反應A-300 bp擴增片段）；及bp 25至480(反應B-456 bp 擴增片段）區1内部擴增DNA。預期擴增片段存在於拓七未 、 經改性玉米種系，且存在於玉米品件TC1507。一對PCR引 子對反應C跨bp 759至bp 1182(424 bp擴增片段)之5,側出區 45 1378103 區2至區3，再度製造於Hi-II及TC1507二者具有預期尺寸的 pCR產物。反應D跨5’側出區由bp 415至bp 1182(768 bp擴增 片段）的區1至區3,且再度製造於Hi-II及TC1507二者具有預 期尺寸的PCR產物。反應E及反應F設計作為TC1507 PHI8999A全長插子pat基因區的特定引子對，如此非預期未 經改性Hi-II玉米種系的擴增片段。結果指出反應E及反應F 對於以pat基因區轉形的玉米種系有專一性，可產生預期的 擴增片段，如此於未經改性之Hi-II玉米種系並未產生擴增 片段。反應G也設計為引子對，其將於玉米品件TC1507產 生366 bp擴增片段，而於未經改性的Hi-II玉米種系不會產 生擴增片段。 反應Η及反應I設計為TC1507的專一性引子對，其將跨 轉殖基因插子至5’側出區末端。於反應Η及I，反錄引子係 位在全長ΡΗΙ8999Α插子的泛素啟動基因區（表1區9)，以及 正向引子係位在區5 ’ rpoC2基因片段（參考表1)。反應η及 反應I皆可於玉米種系TC1507產生擴增片段，而於未經改性 的對照玉米種系不會產生擴增片段。結果指示反應Η及反應 I對TC1507品件有專一性。 PCR結果顯示未經描述的序列（區υ存在於未經改性的 玉米種系Hi-II ’區1、2及3於未經改性之玉米種系為連 續區。於反應A、B、C及D擴增的DNA序列並非玉米品件 TC1507 5’側出區的獨特序列，也存在於未經改性之玉米種 系 Hi-Π。 46

反應 擴增片段 大小 引子對 引子序列5’至3’ F 482 序列辨識編號:8 AAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGC 序列辨識編號:9 TAATCTCAACTGGTCTCCTCTCCGG G 366 序列辨識编號:19 GGCTCGGACTCGACCTTTCTAT 序列辨識編號:20 GCAGTTCTTGAAGAATGAGTGA Η 912 序列辨識编號:1 GTAGTACTATAGATTATATTATTCGTAGAG 序列辨識编號:2 GCCATACAGAACTCAAAATCTTTTCCGGAG I 844 序列辨識编號:2 GCCATACAGAACTCAAAATCTTTTCCGGAG 序列辨識编號:23 CTTCAAACAAGTGTGACAAA 1378103 實施例7.玉米品件TC1507之插入轉殖基因DNA之3,側出序列 使用兩種不同PCR辦法來延長於玉米品件TC1507對全 長PHI8999A3,之序列資訊長度。於第一辦法，PCR引子對 春 設計用來擴增跨全長插子與反向ORF25終結基因間的接 合’參考第1圖有關反向ORF25終結基因之描述。正向引子 係位在全長PHI8999A插子末端，一系列反向引子係位在反 向序列的100 bp間隔。藉此方式，存在於玉米品件TC1507 之反向片段長度可基於成功PCR反應而於1〇〇 bp區被測 定。此種方法指示反向片段含有大部分ORF25終結基因， 但不含CrylF序列。PCR片段由此區分離及定序。 於第二辦法，PCR引子係設計成可由反向ORF25終結 籲 基因區走出而進入側出DNA序列，如前述PCR實驗測定。 由2至3株品件TC1507及未經改性對照玉米種系分離的基因 體DNA以各種限剪酶消化’然後接合至用來消化之限剪酶 % 之專一性配接子（通用基因體行走者套件組，可龍科技 (Clontech)實驗室公司及Devon等人（1995)核酸研究 、 23:1644-1645)。使用ORF25終結基因專一性引子以及與接 合至被消化DNA之配接子序列同質引子，進行第一次 48 1378103 PCR。為了提高反應專一性’再度使用另一個〇RF25終結基 因專一性引子、以及與配接子序列同原的二次引子再度進 行巢套二次PCR，二次引子係位在第一次PCR使用的個別引 子内部。藉巢套PCR製造的產物藉瓊脂凝膠電泳分析，將 · TC1507 DNA樣品所特有的片段分離及定序。片段係由全長 插子所含ORF25終結基因、以及由全長PHI8999A插子3,端 的鎖定目標（反向）ORF25終結基因二者擴增。得自全長插子 之片段基於位在全長插子之限剪酶位置資訊，具有可預測 的大小。由3,反向ORF25終結基因產生的片段顯然是具有未 _ 經預期尺寸的片段。得自反向〇rf25終結基因之擴增片段 進行序列分析’結果導致1043 bp之側出DNA序列。由前述 一系列基因體行走實驗所得序列，用來設計額外引子，進 一步由插子走出而進入鑽孔玉米基因體，具有最終3,側出 序列 2346 bp。 為了描述TC1507 3,側出序列，使用基本局部校準搜尋 工具(BLAST) ’對基本存庫公開資料庫進行同原性搜尋。 BLAST程式進行序列相似性搜尋，特別可用來識別對未知 | 序列的同質性。除了搜尋公開資料庫之外，使用SeqMan 4.05、Martinez 及 Needleman-Wunsch 校準演繹法貝,j (DNASTAR公司）進行校準來找出TC1507 3,側出序列與 PHI8999A轉殖基因插子間的同質性。同質性搜尋結果示於 》 表1。相同性百分比指示跨接受分析的序列全長之相同匹配 、 百分比。3’側出序列之相似性搜尋結果，指示與玉米葉綠 體01^八二區有高度同質性’ pat基因之188 bp片段及254 bp 49 1378103 DNA(表1區15)則無顯著同質性。超出區15(參見表丨)之額外 749 bP(區16)也被定序。區16並未獲得相似性搜尋結果。 對對照組以及TC1507基因體DNA進行PCR分析，測得 254 bp序列（區is，玉米葉綠體「〇RF241」片段)係存在於 玉米基因體。3’側出區之區15 DNA序列並非玉米品件 TC1507之3’側出區所特有，反而係存在於未經改性之對照 玉米種系。TC1507 3,側出序列呈現於實施例8,繪圖於第1 圖。

實施例8.於玉米品件TC1507之全長插子DNA 3,端區序 列。各區說明如表1所述。 區1〇(序列辨識編號:38) ORF25終結基因片段（互補體）

9016 TCAC TCCGCTTGAT CTTGGCAAAG ATATTTGACG

9051 ATTTATTAG TATGTGTTAA TTTTCATTTG CAGTGCAGTA TTTTCTATTC 9101 ATCTTTATG TAATTCGTTA CAATTAATAA ATATTCAAAT CAGATTATTG 9151 CTGTCATTT GTATCAAATC GTGTTTAATG GATATTTTTA TTATAATATT 9201 ATGATATCT CAATCAAAAC GTAGATAATA ATAATATTTA TTTAATATTT 9251 TGCGTCGCA CAGTGAAAAT CTATATGAGA TTACAAAATA CCGACAACAT 9301 ATTTAAGAA ACATAGACAT TAACCCTGAG ACTGTTGGAC ATCAACGGGT 9351 GATTCCTTC ATGCATAGCA CCTCATTCTT GGGGACAAAAGCACGGTTTG 9401 CCGTTCCAT TGCTGCACGA ACGAGCTTTG CTATATCCTC GGGTTGGATC 9451 TCTCATCAGGTCCAATCAA ATTTGTCCAAGAACTCATGT TAGTCGCAAC 9501 AAACCGGGG CATATGTCGGGTATCTCGAG CTCGCGAAAG CTTGGCTGCA 9551 GTCGACGGA TCCTT 區11(序列辨識編號:39) 玉米葉綠體rpsl2 rRNA基 50 1378103 因片段(互補體）

9566 AACA AAAGGGTACC TGTACCCGAA ACCGACACAG

9601 TGGGTAGGT AGAGAATACC TAGGGGCGCG AGACAACTCT CTCTAAGGAA

9651 TCGGCAAAA TAGCCCCGTA ACTTCGGGAG AAGGGGTGCC CCC 核苷酸9694_9695(CG)連結區11至區12 區12(序列辨識編號:40) 玉米葉綠體基因體片段

9696 TAAC

9701 ATAAACGAA TACGGTTTAT GTATGGATTC CGGTAAAATA CCGGTACTCG 9751 TTTCATAAG AGTCGAATAG GAAGTTAAGA TGAGGGTGGT ATCATCATAA 9801 AATGGAGTA GTATCCTAAA TTATACTAAT CCACGTATGA TATGTATGCC 9851 TTCCTTATC AACCGGAAGT AGTGCAAAAA AAATTCTATA CTGCACTGCT 9901 TCTTTTTAC TGAGAAATGC AAAAAAATAA AAGTGAAGTA AGGGTGCCCC 9951 TAGATATTT GATCTTGCCT CCTGTCCCCC CCCCCCTTTT TTCATCAAAA 10001 TTTCCATGA AAAAAGAAAA GATGAATTTG TCCATTCATT GAACCCTAGT 10051 CGGGACTGA CGGGGCTCGA ACCCGCAGCT TCCGCCT 區13(序列辨識編號:41) . pat基因片段(互補體）

10088 TT CCTAGCCTTC

10101 AGGGCCCAGCCGTAAGCAAT ACCAGCCACA GCACCCTCAA CCTCAGCAAC 10151 AACCAAGGG TATCTATCTT GCAACCTCTC TAGATCATCA ATCCACTCTT 10201 TGGTGTTTG TGGCTCTGTC CTAAAGTTCA CTGTAGACGT CTCAATGTAA 10251 GGTTAACGA TATCACAAAC CGCGG 核苷酸10276-10277(AA)連結區13至區14。 區14(序列辨識編號:42) 玉米葉綠體ORF241片段(互補體）

10278 AC AAGAACGAAA GCACCTTTTC 51 1378103

10301 TTCTTTCAT ATACTAGGGG TTTTTACTTG GAAAAGACAA TGTTCCATAC 10351 AAAGGAT 區15(序列辨識編號:43) 玉米基因體(無顯著同原性）

10359 G CTGCAGAAGC CGCCACCGTC TTGAGGACCT TCCGGGGAGC 10401 GACCGGTC GAACCGTGCC TCCACTTGCT AAGGAGAAAG GGAAAATCAG 10451 GCCAGGACA TACGAAGGAG GAGCCAGAAC GAAGATATCC TAAGATACTT 10501 CTCGCTCCG GGCCATGATC AATCATGCCT GTGGGGAGGT CTCTCGCACC 10551 CGATCCATG AAGGTACCAC CGAGGTCTGC CCCGCCGCCG GCTTCGGTAC 10601 GTCCTCGCC TT 區16(序列辨識編號:44) 玉米基因體

10613 GGCGCCC GAGGCACCCG GGGGATGGAC TGCCCAGGCG

10651 AGCCACGAC GACCCAAGGA TCACCCTCCT GCGCAGTCGG CACGAGCAAT 10701 GTTCTCGGG GAACAGGCAG CTTGGCCTGA CTCCCCGGGG TCACCTCAA 10751 ACCTCGGCC GAGGGGTCAA GTACCCCCTC AGTCCGCCCC CGCTCTTCGG 10801 CGGGACCC CGACGTCCCG GCCCCGGATA CCGACGGCAC CAGCCCGCTC 10851 GGGGCTGGC TTGACGACCC CTGGCCCAGC CTCAGATCTG GGCTGAGGCC 10901 AGGCAGGCG GCCATGTCGT CGTCTTCATC ATCGTCTTCA TCATCGTCGT 10951 GTCATCAGG CGTCTCCGGC GACGGCTCCC TTGGGAGCCC CTCCCTCTCC 11001 GCCGACGAC GAAGCCTTTC CAAGGCATCC CGAGCCCACG TCCGCTCGTG 11051 GCCCGAGCC TTCTTTGCGT CCTTCTTCTC CTTCCTCTTC TCCGCGGTGA 11101 CCTCCGCGC AGCTCGGTCC ACCGCATCCT CCGGGACTGG TGGCAGGGAA 11151 GCTTGTGAT GCCCTACCTC CTGGAGACAG ACGAAAAGTC TCAGCTATGA 11201 AACCGAGGG CAATCTGACG CAAGAAGGAA GAAGGAGCGG ATACTCACCA 11251 AGACACGCA CCCGCGATCG GGACGCATTA AGGGCTGGGA AAAAGTGCCG 52 1378103

11301 CCTCTAATT TCGCTACCGT GCCGTCCACC CACCTGTGGA GGTCATCGAT 11351 GGAAGGGGAA 實施例9 ·未經改性對照玉米種系證實存在有區i 5 進行PCR分析來判定3’側出區末端之未經描述序列區 (表1區15)是否存在於用來轉形製造玉米品件TC1507之未 經改性對照玉米種系，如此表示螟蟲帶有玉米基因體 DNA。於玉米種系TC1507及未經改性的Hi-Π對照玉米種系 二者成功地進行區15的PCR擴增，顯示區15確實係存在於 玉米基因體DNA。如下表1摘述’使用表8所示引子序列， 對由TC1507及未經改性Hi-II對照玉米種系製備的基因體 DNA ’進行五項不同PCR分析。設計三項反應來擴増3，側 出區之區15的DNA ’亦即反應L-產生175 bp擴增片段，反 應M-產生134 bp擴增片段，以及反應N-產生1〇7 bp擴增片 段。預期擴增片段係存在於未經改性對照玉米種系及玉米 種系TC1507二者。反應J及Ks史計為跨插子末端至3,側出區 的TC1507專一性引子對。於反應J ’正向引子係位在全長 PHI8999A插子3,端的pat基因片段（表1區13)，反向引子係位 在未經界疋的區15。於反應K，正向引子係位在全長插子3, 端的葉綠體假說蛋白質基因（表1區14)，反向引子係位在未 經界定的區15。反應J及反應K可於玉米種系TC1507產生於 增片段，而不會於未經改性的對照玉米種系產生擴增片 段。結果指示反應J及K對TC1507品件有專一性。 PCR結果指示TC1507 3’侧出序列之未經描述序列（區 15)也存在於分離自未經改性Hi-II對照玉米種系之基因體 53 1378103 DNA。於反應l、Μ及N擴增的DNA序列並非TC1507 3,侧出 區所特有，反而也存在於未經改性之對照玉米種系。 表7.玉米品件TC1507之PHI8999A插子3,序列之PCR反應 反應 擴拷片段 大小(bp) TC1507 3’側出序 列區 存在於對照 之擴增片段 存在於玉米種系 TC1507之擴增片段 J 342 區13(pat基因片段) 至區15 否 是 K 252 區14(染色體基因） 至區15 否 是 L 175 區15 是 是 Μ 134 區15 是 Ν 107 區15 是 是 表8.玉米品件TC1507之PHI8999A插子3,序列之PCR引子

反應 擴增片段 大小(bp) 引子對 引子序列5’至3’ J 342 序列辨識編號:3 TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA 序列辨識編號:5 GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC Κ 252 序列辨識編號:4 AGCACCTTTTCATTCTTTCATATAC 序列辨識編號:5 GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC L 175 序列辨識編號:16 AAGCCGCCACCGTCTTGAGGACCTT ^列辨識編號:5 GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC Μ 134 序列辨識編號:17 GTCGAACCGTGCCTCCACTTGCTAA 序列辨識編號:5 GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC Ν 107 序列辨識編號:18 AGAAAGGGAAAATCAGGGCCAGGAC 序列辨識編號:5 GACCTCCCCACAGGCATGATTGATC

實施例10. PCR引子 DNA品件專一性引子對用來產生可診斷TC15〇7之擴 增片段。此等品件引子對包括（但非限制性)序列辨識編號:1 及序列辨識編號:2 ;序列辨識編號:2及序列辨識編號:23 ; 序列辨識編號:3及序列辨識編號J ;以及序列辨識編號μ及 序列辨識編號:5。除了此等引子對之外，當用於dna擴增·. 反應，可產生TC1507診斷用DNA擴增片段之任何衍生自序 列辨識編號:26及序列辨識編號:27之引子對皆構成本發明 54 1378103 之一方面。分析之擴増條件顯示於表9，但使用dna引子或 其互補體來產生TC1507診斷用擴增DNA分子之方法之任 一種修改方法皆屬於熟諳技藝人士的技巧範圍。較佳利用 於序列辨識編號:1、2及23識別之PCR引子進行反應之較佳 ， 擴增條件舉例說明於表1〇。此外，供内生性玉米基因擴增 用之對照引子對，包括序列辨識編號·⑺及^ ;序列辨識編 號:10及12 ’序列辨識編號:13及14 ;序列辨識編號:14及15 ; 序列辨識編號:5及16 ;序列辨識編號:5及17 ;以及序列辨識 編號:5及18含括作為反應條件内部標準。也包括引子對， 春 其將於含pat基因之轉殖品件產生擴增片段（序列辨識編 號:6及7’序列辨識編號及9)，也包括引子對其將於含cryif 基因之轉殖品件產生擴增片段(序列辨識編號:19及20)。 植物組織DNA萃取物分析來試驗是否存在有TC1507 品件’須包括陽性組織DNA萃取對照（DNA樣品已知含有轉 殖基因序列）。陽性對照的成功擴增，驗證係於允許目標序 列擴增之條件下進行PCR。陰性DNA萃取對照或野生型 DNA萃取對照其中提供樣板DNA，為由非轉殖基因楂株製 籲 備的基因體DNA，或為非TC1507轉殖基因植株也含括於本 發明。此外，不含樣板玉米DNA萃取物之陰性對照為pcr 方案使用之反應劑之條件有用量度標準。 熟諳DNA擴增方法業界人士可由序列辨識編號:26及 序列辨識編號:27選出其它夠長的DNA引子分子，製造擴增 · 片段之最佳條件係與表9或表10所示方法不同，但結果獲得 品件TC1507的診斷用擴增片段。以表9及表10所示方法之修 55 1378103

改方法使用DNA引子序列係屬本發明之範圍。擴增片段其 中至少一個衍生自序列辨識編號:26及序列辨識編號之 夠長DNA引子分子可供品件TC1507診斷用之擴增片段構 成本發明之一方面。其中至少一個衍生自PHI8999A任一個 基因元體之夠長DNA引子可供診斷品件TC1507之擴增片 段也構成本發明之一方面。TC1507擴增片段之檢定分析可 使用Stratagene Robocycler，MJ引擎，博金艾瑪 (Perkin-Elmer)97〇0或Eppendorf主循環器梯度熱循環器，或 使用業界已知方法及裝置進行。 表9. PCR條件： 條件： 使用套件組 容積___ 5微升 = 4微升 2微升 2微升 2微升 0.1微升 4.9微升_ 20微升 循環參數

Gene Amp®PCR 系統 9700 9分鐘92°C 30週期：

94°C 30秒 60〇C 30秒 72°C1分鐘 7分鐘72°C 維持4°C 博金艾瑪AmpliTAQ金套件組 成分 Ϊ板（10奈克/微升）~ 各2微升引子（ΙΟμΜ) 10XPCR金緩衝液 25 mM MgCl2 50X dNTP5s(10 mM)

Amplitaq金聚合酶 水 總量 "~~

56 1378103 表10. Advantage-GC2聚合酶混合物使用之pCR條件 條件： 使用之套件組 容積 5微升 5微升 10微升 10微升 1.5微升 1.0微升 * 17.5微升 50微升 循環參數

Advantage-GC2^^J^- 成分 S·板(10 奈克 /微升)° -»»». 各2.5微升引子（1〇μΜ) 5XGC2緩衝液 GC熔體（1.〇 Μ終濃度) 50Χ dNTP，s(10 mM)

Advantage GC2聚合崎 水 一· 總量

GeneAmp®PCR 系統 9700 5分鐘941

35週期： 94°C1分鐘 60°C2分鐘 72°C3分鐘 7分鐘72°C 維持4°C

已經舉例說明本發明之原理，熟諳技藝人士顯然易知 可未脖離此項原理而對排列及細節上做修改。發明人申請 保護屬於隨狀中請專利範圍之精髓及關_全部修改。 本^月曰引用之王部公開文獻以及公告的專利文件以 引式併入此處彷彿個別公開文獻或專利申請案已經特 別指明併入作為參考文獻般。 【圖式簡單讀* %】 第1圖係為線性映射圖，顯示轉殖基因老 PHI8999A，以及轉殖基因插子之側出序列。 57 1378103 【圖式之主要元件代表符號表】 1.. .玉米基因體 2.. .AF123535 同質 3.. .HUCK-1 LTR 同質 4.. .crylF 同質 5…rpoC2同質 6.. .tml或ubiZMl 同質 7a...pat 同質 7b…pat同質 8.. .PHI8999A 同質 9.. .PHI8999A 起點 9.. .PHI8999A 終點 10.. .0.F25 同質 11.. .msl2 同質 12.. .葉綠體基因體同質 13.. .pat 同質 14.. .0.F241 同質

7c...crylF同質 15及16·.·玉米基因體

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Claims (1)

1378103 P 導％ 修(更’)正本 93m237 t ^裝亨請專利範圍修ϋ修1日期101年7月13日 拾、申請專利範圍： 1. 一種單離DNA分子，其係由一被識別為序列辨識編 號:21之核苷酸序列所組成。 2. —種單離DNA分子，其係由一被識別為序列辨識編 5 號:22之核苷酸序列所組成。 3. —種單離DNA分子，其係由一被識別為序列辨識編 號:24之核苷酸序列所組成。 4. 一種單離DNA分子，其係由一被識別為序列辨識編 號:26之核苷酸序列所組成。 10 5· —種單離DNA分子，其係由一種識別為序列辨識編 號:27之核苷酸序列所組成。 6. —種用於在一生物樣品中識別品件T C15 0 7之套件組，其 偵測TC1507專一性區，該套件組包含至少一第一引子， 其可識別序列辨識編號:21或序列辨識編號:22内之序 15 列。 7. 如申請專利範圍第6項之套件組，進一步包含至少一個 第二引子，其可識別序列辨識編號:25内之序列。 8. 如申請專利範圍第6項之套件組，進一步包含至少一個 第二引子，其可識別序列辨識編號:22内之序列。 20 9.如申請專利範圍第6項之套件組，其中該第一引子可識 別序列辨識編號:21内之序列。 10.如申請專利範圍第6項之套件組，其中該第一引子可識 別序列辨識編號:22内之序列。 1