CN105189539A - 来自玉蜀黍的ms9基因的克隆和使用 - Google Patents

Abstract

核苷酸序列、氨基酸序列和相关的启动子序列在控制植物的雄性育性的方法中是有用的。重组表达盒、载体、植物细胞和植物包含所公开的核苷酸序列并且可编码所公开的氨基酸序列。所述重组表达盒对于控制育性尤其是一年生作物的雄性育性是有用的。所述启动子对于驱动有效连接的异源多核苷酸的表达是有用的。与所述启动子序列具有同源性的构建体对于下调与所述启动子相关的多核苷酸是有用的。

Description

来自玉蜀黍的MS9基因的克隆和使用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地讲，涉及影响雄性育性。

背景技术

杂交植物育种的发展已使产生的作物在质量和数量方面取得相当大的进展成为可能。由于经过了杂交程序，故产量增加，所需特性的有利组合如对病害和虫害的抗性、耐热性和耐旱性，以及植物组成发生变化都可能出现。这些程序在很多情况下主要依赖于提供向雌性亲本贡献花粉的雄性亲本以产生所得的杂交体。

大田作物通过利用植物的授粉方法的技术进行育种。如果来自植物的一朵花的花粉转移到同一植物或遗传上相同的植物的同一朵花或另一朵花，则植物自花授粉。如果花粉来自遗传上不同的植物的花，则植物异花授粉。

在芸苔属(Brassica)中，植物通常自花不育，并且只能够异花授粉。在自花授粉的物种中，诸如大豆和棉花，雄性和雌性植株在解剖学上是雌雄同株的。在自然授粉过程中，一朵花的雄性繁殖器官给同一朵花的雌性繁殖器官授粉。

玉蜀黍植物(ZeamaysL.)不寻常的地方在于它们易于通过自花授粉和异花授粉两种技术来繁育。玉蜀黍在同一植株上具有位于雄穗上的雄花和位于雌穗上的雌花。玉蜀黍可自花授粉或异花授粉。当风或重力将花粉从雄穗移动至从初期(incipient)雌穗顶部突出的穗丝时便会在玉蜀黍中发生天然的授粉。

控制植株中的育性的可靠方法将提供改良植物育种的机会。对于玉蜀黍杂交种的开发而言特别是如此，玉蜀黍杂交种的开发通常依赖于某些雄性不育系统。

玉蜀黍杂种的开发需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。谱系育种和轮回选择是用于从种群开发近交系的育种方法中的两种。育种程序将来自两个或更多个近交系或多种基础广泛的来源的所需性状组合进育种库，通过自交和对所需表型的选择从所述库中开发出新的近交系。杂种玉蜀黍品种是两种此类近交系的杂交，每种都可能具有另一种所缺乏的一种或多种所需特性，或补足另一者的一种或多种所需特性。新的近交系与其它近交系杂交，对从这些杂交获得的杂种进行评价，确定哪些具有商业潜能。第一代的杂种子代被定为F₁。在对杂种的开发中，仅寻求F₁杂种植物。F₁杂种比其近交亲本更有活力。这种杂种活力或杂种优势可以多种途径体现，包括增加的营养生长和提高的产率。

可通过结合人工去雄在内的雄性不育系统来产生杂种玉蜀黍种子。为产生杂种种子，从正在生长的雌性近交亲本(其可与雄性近交亲本以各种交替行模式种植)除去雄穗。因此，如果与外来玉蜀黍花粉来源充分隔离，雌性近交系的雌穗将仅被来自雄性近交系的花粉受精。因此，得到的种子是杂种(F₁)并将形成杂种植物。

植物发育过程中的环境变化可导致在雌性亲本的人工去雄完成后植物又抽出雄穗。或者，去雄植物可能没有完全移除雌性近交植物的雄穗。在任何情况下，结果都是雌性植物成功散播花粉，一些雌性植物被自花授粉。这将导致连同正常产生的杂种种子一起收获雌性近交系的种子，这对于种植者来说是不利的，因为雌性近交系种子的生产力不如F₁种子。此外，雌性近交种子的存在对生产杂种的公司来说可能代表着种质安全风险。

或者，可以机械方式对雌性近交系去雄。机械去雄和手工去雄的可靠性大致相同，但更快并且成本更低。然而，与手工去雄相比，大多数去雄机器会对植物造成更多的伤害。因此，目前没有令人完全满意的去雄形式，故而还是需要进一步降低生产成本并消除杂种种子生产中的雌性亲本自花授粉的替代方法。

遗传雄性不育的可靠系统具有优势。使用胞质雄性不育(CMS)近交系可在一些基因型中避免繁琐的去雄过程。在不存在育性恢复基因的情况下，由于是细胞质而非细胞核、基因组所引起的因素，所以CMS近交系的植物是雄性不育的。因而，该特性只通过母本在玉蜀黍植株遗传，因为仅母本为受精种子提供胞质。来自非雄性不育的另一近交系的花粉使CMS植株受精。来自第二近交系的花粉可能会，也可能不会贡献使杂种植物成为雄性可育的基因。通常，必须混合来自去雄正常玉蜀黍的种子和相同杂种的CMS生成的种子，才能保证足够的花粉负荷在种植杂种植物时可用于受精，并且确保细胞质多样性。

对于CMS而言还有其他缺点。其中一个缺点是，历史上观察到CMS的特定变体与对某些作物病害的易感性之间的关联。此问题已经阻碍CMS-T变体在杂种玉蜀黍种子的生产中广泛使用，而且总体来说，已经对CMS在玉蜀黍中的使用产生负面影响。

在多种情况下，雄性不育的植物性状通过维持纯合隐性条件来表达。当恢复基因必须用于维持时，维持纯合条件出现困难。例如，对于雄性不育至关重要的基因中的天然突变在该突变型等位基因处于纯合状态时可赋予植物雄性不育表型。当将该基因的非突变形式引入植物中时，可恢复该不育性。然而，这种形式的恢复移除了所需的纯合隐性条件，恢复了全部雄性育性并且阻止了对纯的雄性不育母系的维持。如果消除生成包含恢复基因的花粉，提供仅生成不包含恢复基因的花粉的保持系植物，让后代保留纯合隐性条件，这样可避免出现这种问题。

如所指出的那样，用雄性不育体系进行的大部分工作的必要方面是识别影响雄性育性的基因。这种基因可以在包括本文所述的那些体系在内的多种体系中使用以控制雄性育性。

发明概述

本发明涉及核酸序列，具体地讲，涉及对于雄性育性关键的DNA分子及由所述DNA分子编码的氨基酸。本发明鉴定了所述DNA的启动子。本发明还涉及使用此类DNA分子介导植物的育性。

在本发明中，发明人提供了对于植物中雄性育性至关重要的新型DNA分子和所编码的氨基酸序列。这些序列可用于可利用育性控制的任何体系，包括上述那些体系。

因此，本发明的一个目标是提供一种核酸序列，所述核酸序列的表达对于植物中的雄性育性至关重要。

本发明的另一个目标是提供编码氨基酸序列的DNA分子，所述氨基酸序列的表达对于植物中的雄性育性至关重要。

本发明的又一个目标是提供使用此类DNA分子介导植物中的雄性育性的方法。

在随后的描述和权利要求书中，本发明的其他目标将变得显而易见。

附图说明

图1-通过基于图谱的克隆技术所鉴定的染色体1基因组区域的示意图。在该区间中发现两个基因：无任何已知同源性的预测基因、与植物R2-R3myb蛋白质具有同源性的第二基因。根据发现，该未知基因包含重组，而myb基因旁侧分布有重组体并代表Ms9的候选基因。

图2-天然(野生型)Ms9基因的示意图，其示出了内含子和外显子结构，以及该天然基因的各部分与ms9参考等位基因的外显子1和ms9-AD62A等位基因的外显子3的比对。ms9-参考等位基因比较将ms9参考等位基因CDS(SEQIDNO：6)的一部分与ZmMS9野生型CDS(SEQIDNO：2)的一部分进行比对。ms9-AD62A等位基因比较将ms9-AD62ACDS(SEQIDNO：7)的一部分与ZmMS9野生型CDS(SEQIDNO：2)的一部分进行比对。

图3-Ms9野生型等位基因(SEQIDNO：3)、ms9参考等位基因(SEQIDNO：10)和ms9-AD62A等位基因(SEQIDNO：9)的蛋白质翻译的比对。mybR2结构域由比对上方的黑线表示，mybR3结构域由比对下方的黑线表示，它们分别被ms9-ref和ms9-AD62A突变所破坏。

图4-来自玉蜀黍(SEQIDNO：3)、高粱(SEQIDNO：13)和水稻(SEQIDNO：14)的Ms9蛋白质序列的比对。

序列简述

表1

发明内容

提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。

遗传雄性不育由对于小孢子发生(该术语适用于花粉形成的整个过程)的特定步骤至关重要的基因之一的突变、抑制或其他影响而引起。这些基因可统称为雄性育性基因(或者，雄性不育基因)。在基因功能影响育性的整个途径中有多个步骤。这似乎适当地被玉蜀黍的遗传雄性不育的频率所支持。在范围从优良近交系到未适应群体的材料中揭示了雄性不育突变体的新等位基因。

因此，本发明包括使用本文所示的序列影响植物的雄性育性，即，通过使用本发明的基因操纵基因组来控制雄性育性。举例来说(但不限于此)，下文所述的任何方法可与本发明的序列一起使用，诸如将突变体序列引入植物中以引起不育，造成天然序列突变，将序列的反义链引入植物中，使用发夹式形成物，将其与其他序列相连以控制其表达或控制本领域技术人员可用来影响植物的雄性育性的大量过程中的任何一者。

Ms9表型在1932年首次在玉蜀黍中鉴定出。Beadle，(1932)Genetics17：413-431(Beadle，1932年，《遗传学》，第17卷，第413-431页)。据发现，Ms9表型与染色体1上的P1基因相关。雄性繁殖组织发育的破坏发生在前减数分裂的很早期；绒毡层细胞也可能受到影响。Greyson，etal.，(1980)Can.J.Genet.Cytol.22：153-166(Greyson等人，1980年，《加拿大遗传学与细胞学杂志》，第22卷，第153-166页)。

对于本领域技术人员显而易见的是，可使用保留该基因的雄性不育控制性质的多种变型、突变型、衍生型，包括比所示整条序列更短的片段。本领域的普通技术人员可以通过以下所述来容易地评估变体或片段：引入到对于Ms9的稳定雄性不育等位基因而言为纯合的植物中，随后观察植物的雄性组织发育。

本发明的序列可分离自任何植物，包括但不限于玉米(Zeamays)、卡诺拉油菜(甘蓝型油菜(Brassicanapus)、芜菁(Brassicarapassp.))、苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、粟(Panicumspp.)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Oleaeuropaea)、燕麦(Avenasativa)、大麦(Hordeumvulgare)、蔬菜类、观赏植物类和针叶树类。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、卡诺拉油菜、小麦、大麦、黑麦、苜蓿、水稻、棉花和高粱。

来自其他植物的序列可根据熟知的技术，基于它们与本文所示编码序列的同源编码区的序列同源性来分离。在这些技术中，将已知的编码序列的全部或者一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。本领域易于获得用于核酸序列杂交的方法。有关核酸杂交的详尽指导可在如下文献中找到：Tijssen，IaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecular Biology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，PartI，Chapter2“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术--用核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针分析策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993年)和CurrentProtocolsin MolecularBiology，Chapter2，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995).(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版和Wiley-Interscience出版公司，纽约，1995年)。

因此，本发明还包括在严格条件下与Ms9核苷酸序列选择性杂交的那些核苷酸序列。在提及与Ms9“选择性杂交”的序列时，该术语包括指核酸序列在严格杂交条件下与指定的核酸靶序列的杂交达到比其与非靶核酸的杂交可检测地更高的程度。

术语“严格条件”或者“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高的条件。严格条件是靶序列依赖性的，并且将因多核苷酸的结构而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般来讲，该类型的探针在约1000个核苷酸长至约250个核苷酸长的范围内。

有关核酸杂交的详尽指导可在如下文献中找到：Tijssen，Laboratory TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleic AcidProbes，PartI，Chapter2“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术--用核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针分析策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993年)和CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter2，Ausubel，etal.，Eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版和Wiley-Interscience出版公司，纽约，1995年)。另参见Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2nded.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)。

一般来讲，对应于本发明的核苷酸序列并且与本文公开的核苷酸序列杂交的序列将与所公开的序列具有至少50％同源性、70％同源性以及甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性或更大。即，探针与靶标之间的序列相似性可在共用至少约50％、约70％和甚至约85％或更大序列相似性的范围内。

特异性通常随杂交后的洗涤而变化，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。一般来讲，将严格洗涤温度条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的解链温度(Tm)低约5℃至约2℃。DNA的解链温度或变性发生在较窄温度范围内，表示双螺旋分裂为其互补单链。该过程由转变中点的温度Tm(也称为解链温度)描述。本领域有用于测定解链温度的公式。

本发明核苷酸序列的优选杂交条件包括在42℃下于50％(w/v)甲酰胺、6XSSC、0.5％(w/v)SDS、100g/ml鲑鱼精DNA中杂交。示例性的低严格洗涤条件包括在42℃下于2XSSC、0.5％(w/v)SDS的溶液中杂交30分钟并重复。示例性的中等严格条件包括在50℃下于2XSSC、0.5％(w/v)SDS中洗涤30分钟并重复。示例性的高严格条件包括在65℃下于0.1XSSC、0.1％(w/v)SDS中洗涤30分钟到一小时并重复。可使用所有以上条件获得与本发明启动子相对应的序列。出于限定本发明的目的，使用高严格条件。

如下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。

(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。

(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的且指定的区段，其中该比较窗口中的多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列进行最佳比对。通常，比较窗口为至少20个连续核苷酸长，任选可为30、40、50或100个核苷酸长或者更长。本领域技术人员应当理解，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列比对以作比较的方法是本领域熟知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定。这类数学算法的非限制性例子有MyersandMiller，(1988)CABIOS4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith，etal.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部比对算法；Needlemanandwunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的全局比对算法；PearsonandLipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的搜索局部(search-for-local)比对方法；KarlinandAltschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第2264页)的算法，其在KarlinandAltschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中有所修改。

可利用这些数学算法的计算机执行进行序列的比较以确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可得自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California))中的CLUSTAL；GCG威斯康星遗传软件包(GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage)版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，SanDiego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。CLUSTAL程序在以下文献中得到很好的描述：Higgins，etal.，(1988)Gene73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins，etal.，(1989)CABIOS5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，etal.，(1992)CABIOS8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)以及Pearson，etal.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weightresiduetable)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul，etal.，(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul，etal.，(1997)NucleicAcidsRes.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)所述采用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)(出处同上)。当采用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的对应的比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

GAP使用NeedlemanandWunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG威斯康星遗传软件包的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0至200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的度量(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。GCG威斯康星遗传学软件包的版本10中使用的打分矩阵为BLOSUM62(参见HenikoffandHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。

(c)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口进行比对以获得最大对应时这两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。

(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。

与本发明序列的同一性意指多核苷酸序列具有至少65％序列同一性、更优选地至少70％序列同一性、更优选地至少75％序列同一性、更优选地至少80％同一性、更优选地至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。

本领域技术人员可易于鉴定启动子区。只要鉴定出推定的包含ATG基序的起始密码子，该起始密码子的上游便是推测的启动子。所谓“启动子”，是指这样的DNA调控区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适当转录起始位点处起始RNA合成的TATA框。启动子可以另外包含通常位于TATA框的上游或5′的其他识别序列，称为上游启动子元件，它们影响转录起始速率。应认识到，在鉴定到本文所公开的启动子区的核苷酸序列的情况下，分离和鉴定在本文所鉴定的特定启动子区的TATA框上游的区域中的更多调控元件属于本领域的技术范围内。因此，本文所公开的启动子区通常进一步通过包含上游调控元件和增强子等等来限定，所述上游调控元件诸如为那些负责编码序列的组织表达和时序表达的调控元件。按相同的方式，可鉴定、分离出能使表达发生在所需的组织，诸如雄性组织中的启动子元件，并将其与其他核心启动子一起使用以确认雄性组织偏好的表达。所谓核心启动子意指起始转录所需的最小序列，诸如称为TATA框的序列，该序列是编码蛋白质的基因中的启动子所共有的。因此，Ms9的上游启动子可任选地与来自其他来源的其自身启动子或核心启动子结合使用。启动子对于其所在的细胞而言可为天然的或非天然的。

可以修饰本发明的分离启动子序列以提供所述异源核苷酸序列的一系列表达水平。可以利用小于完整的启动子区，并且驱动花药偏好表达的能力得到保持。然而，应认识到，可以通过缺失启动子序列的部分，来降低mRNA的表达水平。因此，启动子可被修饰成弱启动子或强启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。一般来讲，分离的启动子序列的至少约30个核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本发明的启动子区组合使用。增强子是起到增加启动子区的表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。

本发明的启动子可从5’非翻译区(5’UTR)的其天然编码区的5’区域分离。同样，终止子可从位于其相应终止密码子旁侧的3’区分离。术语“分离的”是指材料诸如核酸或蛋白质实质上或基本上不含通常在该材料的天然环境中存在的、与该材料相伴随或相互作用的组分，或如果该材料处于其天然环境中，则已通过对组成的蓄意人为干预改变该材料和/或将该材料置于细胞中并非该材料天然基因座的基因座上。分离启动子区的方法是本领域熟知的。

调控序列的“功能变体”也涵盖在本发明的组合物中。功能变体包括例如本发明的具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的天然调控序列。本发明的功能变体可通过定点诱变、诱发突变来形成，也可能作为等位基因变体(多态性)出现。

本文所用的调控序列的“功能片段”是核苷酸序列，这些核苷酸序列是通过从较大序列的一处或多处缺失所形成的调控序列变体。例如，可使达到转录起始位点附近的TATA框的启动子的5′部分缺失，而不消除启动子活性，如Opsahl-Sorteberg，etal.，(2004)Gene341：49-58(Opsahl-Sorteberg等人，2004年，《基因》，第341卷，第49-58页)所述。此类变体应保持启动子活性，特别是驱动在雄性组织中表达的能力。可通过RNA印迹分析测量活性，当使用转录融合体时测量报告基因活性等等。参见例如Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2nded.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)，其以引用方式并入本文。

可通过使用限制性酶切割本文所公开的天然存在的调控元件核苷酸序列或通过由天然存在的DNA序列合成核苷酸序列，来获得功能片段；也可通过使用PCR技术来获得功能片段。具体参见Mullis，etal.，(1987)MethodsEnzymol.155：335-350(Mullis等人，1987年，《酶学方法》，第155卷，第335-350页)和Erlich，ed.(1989)PCRTechnology(StocktonPress，NewYork)(Erlich编辑，1989年，《PCR技术》，纽约斯托克顿出版社)。

与本发明调控序列杂交的序列在本发明的范围内。对应于本发明的启动子序列并且与本文公开的启动子序列杂交的序列，与所公开的序列具有至少50％同源性、70％同源性以及甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性或更大。

较小片段可能还包含由此鉴定的启动子的调控性质，并且缺失分析是鉴定必需区域的一种方法。可对调控区的5’端和3’端进行缺失分析。可通过定点诱变、采用聚合酶链式反应的诱变等等，来获得片段。(参见DirectedMutagenesis：APracticalApproachIRLPress(1991)(《定点诱变：实用方法》，IRL出版社，1991年))。3’缺失可描绘出必需区域并鉴定3’端，因此可随后将该区域有效连接到所选的核心启动子。一旦鉴定出必需区域，就可通过必需区域加上核心启动子来控制外源基因的转录。所谓核心启动子意指称为TATA框的序列，该序列是编码蛋白质的所有基因中的启动子所共有的。因此，Ms9的上游启动子可任选地与来自其他来源的其自身启动子或核心启动子结合使用。启动子对于其所在的细胞而言可为天然的或非天然的。

核心启动子可为已知核心启动子中的任何一者，诸如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素启动子(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子(Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”MethodsinPlant MolecularBiologyandBiotechnologyetal.eds，CRCPresspp.89-119(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，《植物分子生物学与生物技术的方法》，CRC出版社，第89-119页，1993年)。

来自其他植物的启动子序列可根据熟知的技术，基于它们与本文所示启动子序列的序列同源性来分离。在这些技术中，将已知的启动子序列的全部或者一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。本领域易于获得用于核酸序列杂交的方法。

整个启动子序列或其一部分可用作能够与对应的启动子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸，并且最优选地长为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过熟知的聚合酶链反应(PCR)的过程来扩增来自所选的生物体的对应启动子序列。该技术可用于从所需的生物体分离另外的启动子序列，或用作诊断分析以确定启动子序列在生物体中的存在。例子包括杂交筛选所铺板的DNA文库(菌斑或菌落，参见例如Innis，etal.，eds.，(1990)PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，AcademicPress(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法与应用的指南》，学术出版社))。

此外，本发明的启动子可与非Ms9基因的核苷酸序列相连，以表达其他异源核苷酸序列。本发明启动子的核苷酸序列以及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起提供于表达盒中，以便在所关注的植物中，更具体地讲在植物的雄性组织中表达。这种表达盒可以配有多个限制位点，使该核苷酸序列的插入处于启动子的转录调节之下。这些表达盒在任何植物的基因操纵中都很有用，可用于实现所需的表型响应。

表型响应可相对于对照来测量。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对所关注基因实现了遗传变更(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。

对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型(WT)植物或细胞，即与用于进行遗传变更得到受试植物或细胞的原始材料有相同的基因型；(b)与原始材料有相同的基因型、但已转化了无效(null)构建体(即转化了对所关注性状已知没有作用的构建体，如包含标记基因的构建体)的植物或植物细胞；(c)属受试植物或植物细胞的后代中非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同、但不被暴露于会诱导所关注基因的表达的条件或刺激的植物或植物细胞或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照可包括代表以上类别中的一种或多种的许多个体；例如，类别“c”的非转化分离子的集合通常称为批量无效对照。

可用作具有Ms9启动子或者本文教导或本领域技术人员已知的其他启动子或者本文教导或本领域技术人员已知的其他启动子的表达载体的外源基因的其他核苷酸序列的例子包括互补的核苷酸单元诸如反义分子(胼胝质酶反义RNA、芽孢杆菌RNA酶反义RNA和查尔酮合成酶反义RNA、Ms45反义RNA)、核酶和外部引导序列、适体或单链核苷酸。外源核苷酸序列也可编码碳水化合物降解或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，诸如WO2007/002267的图24中所公开的α淀粉酶基因、生长素、rolB、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或可选自原核调控系统。举例来说，Mariani，etal.，(1990)Nature347：737(Mariani等人，1990年，《自然》，第347卷，第737页)表明，绒毡层中米曲霉(Aspergillusoryzae)RNA酶T1或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的RNA酶(称为“芽孢杆菌RNA酶”)的表达诱导了绒毡层细胞的破坏，从而导致雄性不育。Quaas，etal.，(1988)Eur.J.Biochem.173：617(Quaas等人，1988年，《欧洲生物化学杂志》，第173卷，第617页)描述了RNA酶T1的化学合成，而芽孢杆菌RNA酶基因的核苷酸序列公开于Hartley，(1988)J.Molec.Biol.202：913(Hartley，1988年，《分子生物学杂志》，第202卷，第913页)。发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolB基因所编码的酶催化从吲哚基-β-葡糖苷释放游离吲哚而干扰生长素代谢。Estruch，etal.，(1991)EMBOJ.11：3125(Estruch等人，1991年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第11卷，第3125页)和Spena，etal.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：520(Spena等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第520页)表明，烟草中rolB基因的花药特异性表达导致了植物具有干瘪的花药，这些植物中花粉生成严重减少，因而rolB基因是可用于控制花粉生成的基因的一个例子。Slightom，etal.，(1985)J.Biol.Chem.261：108(Slightom等人，1985年，《生物化学杂志》，第261卷，第108页)公开了rolB基因的核苷酸序列。编码白喉毒素基因的DNA分子可从马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)以ATCC编号39359或ATCC编号67011获得，请参见Fabijanski等人的EP专利申请No.90902754.2，了解使用例子和方法。在美国专利No.5,689,049和PCT/US95/15229，Cigan和Albertsen，“ReversibleNuclearGeneticSystemforMaleSterilityinTransgenicPlants”(转基因植物中雄性不育的可逆细胞核遗传系统)中讨论的方法中，使用DAM甲基化酶基因引起不育。另请参见，Albertsen等人的美国专利No.5,962,769“InductionofMaleSterilityinPlantsbyExpressionofHighLevelsofAvidin”(通过表达高水平亲和素诱导植物中的雄性不育)中有关使用亲和素基因引起不育的讨论。

本发明包括具有Ms9基因的载体。制备载体，所述载体包含Ms9、将驱动该基因在植物中表达的启动子以及终止子区。如所指出的，构建体中的启动子可为将提供植物中的表达的天然启动子或经置换的启动子。构建体中的启动子可为诱导型启动子，以使得可通过暴露于诱导物来控制构建体中的正义分子或反义分子的表达。就这一点而言，可在构建体中采用任何植物相容性启动子元件，这受到所需的最终结果影响。这些启动子可以是植物基因启动子，例如，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的启动子，或来自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导质粒的启动子诸如胭脂碱合成酶，以及章鱼碱合成酶启动子，或病毒启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，或玄参花叶病毒35S启动子。参见Kay，etal.，(1987)Science236：1299(Kay等人，1987年，《科学》，第236卷，第1299页)和EP专利申请No.0342926；大麦脂质转运蛋白质启动子LTP2(Kalla，etal.，(1994)PlantJ.6(6)：849-60(Kalla等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第6期，第849-860页))；泛素启动子(参见例如美国专利No.5,510,474)；END2启动子(Linnestad等人，美国专利No.6,903,205)和聚半乳糖醛酸酶PG47启动子(参见AllenandLonsdale，(1993)PlantJ.3：261-271(Allen和Lonsdale，1993年，《植物杂志》，第3卷，第261-271页)；WO1994/01572；美国专利No.5,412,085)。参见国际专利申请No.WO1991/19806，了解本发明中合适采用的示例性植物启动子的综述。

可用植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调控元件是能够响应诱导物而直接或者间接激活一个或者多个DNA序列或者基因的转录的调控元件。在不存在诱导物的情况下，DNA序列或者基因将不转录。通常特异性结合到诱导型调控元件以激活转录的蛋白因子以失活形式存在，然后其由诱导物直接或间接转化为活性形式。诱导物可以是化学剂诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或者酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加的或通过病原体或病害剂诸如病毒的作用间接施加的生理胁迫。可通过以下方式使含有可诱导调控元件的植物细胞暴露于诱导物：通过将该诱导物例如通过喷雾、喷淋、加热或类似方法而外施于该细胞或者植物。

任何诱导型启动子都可用于本发明。参见Ward，etal.，(1993)PlantMol.Biol.22：361-366(Ward等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页)。示例性诱导型启动子包括蜕皮激素受体启动子(美国专利No.6,504,082)；来自对铜作出响应的ACE1系统的启动子(Mett，etal.，(1993)PNAS90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页))；来自对苯磺酰胺除草剂安全剂作出响应的玉蜀黍的In2-1和In2-2基因(美国专利No.5,364,780；Hershey，etal.，(1991)Mol.Gen.Genetics227：229-237(Hershey等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第227卷，第229-237页)和Gatz，etal.，(1994)Mol.Gen.Genetics243：32-38(Gatz等人，1994年，《分子和普通遗传学》，第243卷，第32-38页))；玉蜀黍GST启动子(其通过用作萌前除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他所关注的化学调控启动子包括类固醇响应启动子(参见，例如，Schena，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)和McNellis，etal.，(1998)PlantJ.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页)中的糖皮质素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，Gatz，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第227卷，第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)。

组织偏好的启动子可用来将增强的转录和/或表达靶向特定的植物组织内。启动子可在所关注的组织中表达，同时也在其他植物组织中表达，可在所关注的组织中强效表达但表达程度远低于其他组织，或可高度偏好于在所关注的组织中表达。组织偏好的启动子包括如下文献所述的那些启动子：Yamamoto，etal.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata，etal.，(1997)PlantCellPhysiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen，etal.，(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子和普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell，etal.，(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；VanCamp，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535(VanCamp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto，etal.，(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam，(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化的结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，etal.，(1993)PlantMolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka，etal.，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)和Guevara-Garcia，etal.，(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。在一个实施例中，启动子是对植物的雄性或雌性组织优先地表达的那些启动子。本发明不需要任何特定雄性组织偏好的启动子用于该过程，并且可使用本领域技术人员已知的许多此类启动子中的任一者。本文所述的天然Ms9启动子是可用启动子的一个例子。另一个这种启动子为5126启动子，其优先地将其所连接的基因的表达引导向植物的雄性组织，如在美国专利No.5,837,851和No.5,689,051中所述。其他例子包括在美国专利No.6,037,523中所述的Ms45启动子；在美国专利No.6,452,069中所述的SF3启动子；在WO2002/063021中所述的BS92-7启动子；在美国专利No.5,470,359中所述的SGB6调控元件；TA29启动子(Koltunow，etal.，(1990)PlantCell2：1201-1224(Koltunow等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1201-1224页)；Goldberg，etal.，(1993)PlantCell5：1217-1229(Goldberg等人，1993年，《植物细胞》，第5卷，第1217-1229页)和美国专利No.6,399,856)；2型金属硫蛋白样基因启动子(Charbonnel-Campaa，etal.，Gene(2000)254：199-208(Charbonnel-Campaa等人，《基因》，2000年，第254卷，第199-208页))和芸苔属Bca9启动子(Lee，etal.，(2003)PlantCellRep.22：268-273(Lee等人，2003年，《植物细胞报道》，第22卷，第268-273页))。

雄配子偏好的启动子包括PG47启动子(出处同上)以及ZM13启动子(Hamilton，etal.，(1998)PlantMol.Biol.38：663-669(Hamilton等人，1998年，《植物分子生物学》，第38卷，第663-669页)；肌动蛋白解聚因子启动子如Zmabp1、Zmabp2；参见例如Lopez，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7415-7420(Lopez等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第7415-7420页)；玉蜀黍果胶甲酯酶样基因ZmC5的启动子(Wakeley，etal.，(1998)PlantMol.Biol.37：187-192(Wakeley等人，1998年，《植物分子生物学》，第37卷，第187-192页))；前纤维蛋白(profiling)基因启动子Zmpro1(Kovar，etal.，(2000)ThePlantCell12：583-598(Kovar等人，2000年，《植物细胞》，第12卷，第583-598页))；硫酸化五肽植物磺肽素基因ZmPSK1(Lorbiecke，etal.，(2005)JournalofExperimentalBotany56(417)：1805-1819(Lorbiecke等人，2005年，《实验植物学杂志》，第56卷，第417期，第1805-1819页))；钙调蛋白结合蛋白Mpcbp的启动子(Reddy，etal.，(2000)J.Biol.Chem.275(45)：35457-70(Reddy等人，2000年，《生物化学杂志》，第275卷，第45期，第35457-35470页))。

可包括载体的其他组分，这也取决于基因的预期应用。例子包括可选择标记、靶向或调控序列、稳定或前导序列、内含子等等。植物表达载体和报告基因的一般描述和例子可见于Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，Glick，etal.，eds；CRCPresspp.89-119(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术的方法》，Glick等人编辑，CRC出版社，第89-119页，1993年)。适当表达载体的选择将取决于宿主及将表达载体引入宿主中的方法。表达盒还将在所关注异源核苷酸序列的3’端包含在植物中有功能的转录和翻译终止区。终止区可对于本发明的启动子核苷酸序列是天然的，可对于所关注的DNA序列是天然的，也可来自于另一种来源。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。另参见Guerineau，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot，(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon，etal.，(1991)GenesDev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因与发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen，etal.，(1990)PlantCell2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，etal.，(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，etal.，(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；Joshi，etal.，(1987)NucleicAcidRes.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括例如，小核糖核酸病毒前导序列、EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，etal.，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人)；MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)(Virology154：9-20(1986)(《病毒学》，第154卷，第9-20页，1986年))；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，etal.，(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外被蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMVRNA4)(Jobling，etal.，(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，etal.，(1989)MolecularBiologyofRNA，pages237-256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，第237-256页))和玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，etal.，(1991)Virology81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。另参见Della-Cioppa，etal.，(1987)PlantPhysiology84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。表达盒还可包含增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，诸如内含子。

在那些希望使异源核苷酸序列的表达产物被引导至特定细胞器，特别是质体、造粉体或引导至内质网，或被分泌于细胞表面或胞外的情况下，表达盒还可包含转运肽的编码序列。此类转运肽是本领域熟知的并且包括但不限于酰基载体蛋白质的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合成酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽(Nelson，etal.，(1998)PlantPhysiol117(4)：1235-1252(Nelson等人，1998年，《植物生理学》，第117卷，第4期，第1235-1252页)；Sullivan，etal.，PlantCell3(12)：1337-48(Sullivan等人，《植物细胞》，第3卷，第12期，第1337-1348页)；Sullivan，etal.，(1995)Planta196(3)：477-84(Sullivan等人，1995年，《植物》，第196卷，第3期，第477-484页)；Sullivan，etal.，(1992)J.Biol.Chem.267(26)：18999-9004(Sullivan等人，1992年，《生物化学杂志》，第267卷，第26期，第18999-19004页))等。本领域技术人员将易于认识到，有多种选择可用于将产物表达于特定细胞器。例如，大麦α淀粉酶序列通常用于定向表达于内质网(Rogers，(1985)J.Biol.Chem.260：3731-3738(Rogers，1985年，《生物化学杂志》，第260卷，第3731-3738页))。转运肽的使用是熟知的(例如，参见美国专利No.5,717,084；5,728,925)。

在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶解、退火和再置换(诸如，转换和颠换)。

如本文所指出的，本发明提供能够表达所关注基因的载体。一般来讲，载体应当在植物细胞中有功能。有时，可能优选的是具有在大肠杆菌(E.coli)中有功能的载体(例如，用于诱发抗体的蛋白质的生成、DNA序列分析、插入物的构建、得出核酸的量)。用于在大肠杆菌中克隆和表达的载体和程序在Sambrook等人(出处同上)中有所讨论。

包含与异源核苷酸序列有效连接的本发明启动子序列的转化载体，还可含有要被共转化到该生物中的基因的至少一个额外核苷酸序列。或者，所述额外序列(一个或多个)可以在另一转化载体上提供。

表达盒可包含有效连接到本文所公开的雄性育性多核苷酸的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注的多核苷酸与调控序列(例如，启动子)之间的有效连接是可使该所关注的多核苷酸得以表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。

报告基因可包括在转化载体中。本领域已知的合适报告基因的例子可在例如以下文献中找到：Jefferson，etal.，(1991)inPlantMolecularBiologyManual，ed.Gelvin，etal.，(KluwerAcademicPublishers)，pp.1-33(Jefferson等人，1991年，载于《植物分子生物学手册》，Gelvin等人编辑，克吕韦尔学术出版社，第1-33页)；DeWet，etal.，(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737(DeWet等人，1987年，《分子与细胞生物学》，第7卷，第725-737页)；Goff，etal.，(1990)EMBOJ.9：2517-2522(Goff等人，1990年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第2517-2522页)；Kain，etal.，(1995)BioTechniques19：650-655(Kain等人，1995年，《生物技术》，第19卷，第650-655页)以及Chiu，etal.，(1996)CurrentBiology6：325-330(Chiu等人，1996年，《当代生物学》，第6卷，第325-330页)。

用于选择经转化的细胞或组织的可选择报告基因可包括在转化载体中。这些基因可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的可选择标记基因的例子包括但不限于编码对以下物质的抗性的基因：氯霉素(HerreraEstrella，etal.，(1983)EMBOJ.2：987-992(HerreraEstrella等人，1983年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第2卷，第987-992页))；甲氨喋呤(HerreraEstrella，etal.，(1983)Nature303：209-213(HerreraEstrella等人，1983年，《自然》，第303卷，第209-213页))；Meijer，etal.，(1991)PlantMol.Biol.16：807-820(Meijer等人，1991年，《植物分子生物学》，第16卷，第807-820页))；潮霉素(Waldron，etal.，(1985)PlantMol.Biol.5：103-108(Waldron等人，1985年，《植物分子生物学》，第5卷，第103-108页)，Zhijian，etal.，(1995)PlantScience108：219-227(Zhijian等人，1995年，《植物科学》，第108卷，第219-227页))；链霉素(Jones，etal.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91(Jones等人，1987年，《分子和普通遗传学》，第210卷，第86-91页))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard，etal.，(1996)TransgenicRes.5：131-137(Bretagne-Sagnard等人，1996年，《转基因研究》，第5卷，第131-137页))；博莱霉素(Hille，etal.，(1990)PlantMol.Biol.7：171-176(Hille等人，1990年，《植物分子生物学》，第7卷，第171-176页))；磺胺(Guerineau，etal.，(1990)PlantMol.Biol.15：127-136(Guerineau等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第127-136页))；溴苯腈(Stalker，etal.，(1988)Science242：419-423(Stalker等人，1988年，《科学》，第242卷，第419-423页))；草甘膦(Shaw，etal.，(1986)Science233：478-481(Shaw等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页))以及膦丝菌素(DeBlock，etal.，(1987)EMBOJ.6：2513-2518(DeBlock等人，1987年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第2513-2518页))。

也可采用可评分或可筛选标记，其中该序列的存在产生可测量的产物。例子包括β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种显色底物已知的酶(例如，美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson，etal.，TheEMBOJournal6(13)：3901-3907(Jefferson等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第13期，第3901-3907页))和碱性磷酸酶。其他可筛选的标记一般包括花青素/类黄酮基因(参见TaylorandBriggs，(1990)ThePlantCell2：115-127(Taylor和Briggs，1990年，《植物细胞》，第2卷，第115-127页))处的讨论，包括例如R基因座基因，其编码调节植物组织中花青素色素(红色)产生的产物(Dellaporta，etal.，inChromosomeStructureandFunction，KluwerAcademicPublishers，AppelsandGustafsoneds.，pp.263-282(1988)(Dellaporta等人，载于《染色体结构与功能》，克吕韦尔学术出版社，Appels和Gustafson编辑，第263-282页，1988年))；控制类黄酮色素的生物合成的基因，诸如玉蜀黍C1基因(Kao，etal.，(1996)PlantCell8：1171-1179(Kao等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1171-1179页)；Scheffler，etal.，(1994)Mol.Gen.Genet.242：40-48(Scheffler等人，《分子和普通遗传学》，第242卷，第40-48页))和玉蜀黍C2(Wienand，etal.，(1986)Mol.Gen.Genet.203：202-207(Wienand等人，1986年，《分子和普通遗传学》，第203卷，第202-207页))；B基因(Chandler，etal.，(1989)PlantCell1：1175-1183(Chandler等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第1175-1183页))、p1基因(Grotewold，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.SciUSA88：4587-4591(Grotewold等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第4587-4591页)；Grotewold，etal.，(1993)Cell76：543-553(Grotewold等人，1993年，《细胞》，第76卷，第543-553页)；Sidorenko，etal.，(1999)PlantMol.Biol.39：11-19(Sidorenko等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第11-19页))；bronze基因座基因(Ralston，etal.，(1988)Genetics119：185-197(Ralston等人，1988年，《遗传学》，第119卷，第185-197页)；Nash，etal.，(1990)PlantCell2(11)：1039-1049(Nash等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第11期，第1039-1049页))等等。合适标记的其他例子包括青色荧光蛋白质(CYP)基因(Bolte，etal.，(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato，etal.，(2002)PlantPhysiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))、黄色荧光蛋白质基因(得自Evrogen公司的PhiYFP^TM；参见Bolte，etal.，(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))；编码荧光素酶的发光基因(其存在可使用例如，X光片、闪烁计数、荧光光度法、微光摄像机、光子计数照相机或多孔发光测定法来检测)(Teeri，etal.，(1989)EMBOJ.8：343(Teeri等人，1989年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第343页))；绿色荧光蛋白质(GFP)基因(Sheen，etal.，(1995)PlantJ.8(5)：777-84(Sheen等人，1995年，《植物杂志》，第8卷，第5期，第777-784页))和DsRed2，其中用该标记基因转化的植物细胞为红色，并因而为视觉上可选择的(Dietrich，etal.，(2002)Biotechniques2(2)：286-293(Dietrich等人，2002年，《生物技术》，第2卷，第2期，第286-293页))。另外的例子包括p-内酰胺酶基因(Sutcliffe，(1978)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.75：3737(Sutcliffe，1978年，《美国国家科学院院刊》，第75卷，第3737页))，其编码各种显色底物(例如，PADAC、显色头孢菌素)已知的酶；xylE基因(Zukowsky，etal.，(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.80：1101(Zukowsky等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第1101页))，其编码可转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta，etal.，(1990)Biotech.8：241(Ikuta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第241页))和酪氨酸酶基因(Katz，etal.，(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703(Katz等人，1983年，《普通微生物学杂志》，第129卷，第2703页))，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，所述多巴醌继而缩合形成可易于检测的化合物黑色素。明显地，本领域技术人员可获得许多此类标记。

转化/转染的方法对本发明而言并不关键；目前可获得多种转化或转染的方法。当有更新的转化作物或其它宿主细胞的方法出现时，可以直接应用。因此，开发了多种方法将DNA序列插入宿主细胞的基因组，以获得序列的转录或转录物和翻译，使生物体发生表型变化。因此，可使用提供有效转化/转染的任何方法。

本领域技术人员可获得的用于将表达载体引入植物组织中的方法是多样的，并且将取决于所选择的植物。用于转化多种植物物种的程序是熟知的，并且在文献中有所描述。参见例如Miki，etal.，“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants”inMethodsinPlantMolecular Biotechnology，supra(Miki等人，“用于将外来DNA引入植物中的程序”，载于《植物分子生物技术的方法》，出处同上)；Klein，etal.，(1992)Bio/Technology10：268(1992)(Klein等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第268页，1992年)和Weising，etal.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weising等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)。例如，可使用下列技术将DNA构建体引入植物细胞的基因组DNA中，所述技术诸如微粒介导的递送(Klein，etal.，(1987)Nature327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》，第327卷，第70-73页))；电穿孔(Fromm，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：5824(Fromm等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824页))；聚乙二醇(PEG)沉淀(Paszkowski，etal.，(1984)EMBOJ.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))；直接基因转移(WO1985/01856和EPNo.0275069)；体外原生质体转化(美国专利No.4,684,611)以及植物细胞原生质体或胚性愈伤组织的显微注射(Crossway，(1985)Mol.Gen.Genetics202：179-185(Crossway，1985年，《分子和普通遗传学》，第202卷，第179-185页))。植物组织与根瘤农杆菌共培养是另一项选择，其中将DNA构建体置于双元载体系统中。参见例如美国专利No.5,591,616；Ishida，etal.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)。当细胞被细菌感染时，根瘤农杆菌宿主的毒性功能将引导构建体插入到植物细胞DNA中。参见例如Horsch，etal.，(1984)Science233：496-498(Horsch等人，1984年，《科学》，第233卷，第496-498页)以及Fraley，etal.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803(Fraley等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第4803页)。

用于转化卡诺拉油菜的标准方法的描述见Moloney，etal.，(1989)PlantCellReports8：238-242(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238-242页)。玉米转化在Fromm，etal.，(1990)Bio/Technology8：833(Fromm等人，1990年，《生物/技术》，第8卷，第833页)和Gordon-Kamm等人的如上文献中有所描述。农杆菌主要用于双子叶植物，但某些单子叶植物诸如玉蜀黍也可被农杆菌转化。参见如上文献及美国专利No.5,550,318。水稻转化在如下文献中有所描述：Hiei，etal.，(1994)ThePlantJournal6(2)：271-282(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第271-282页)；Christou，etal.，(1992)TrendsinBiotechnology10：239(Christou等人，1992年，《生物技术趋势》，第10卷，第239页)；以及Lee，etal.，(1991)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA88：6389(Lee等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第6389页)。小麦可通过与用于转化玉米或水稻的技术类似的技术来转化。高粱转化的描述见Casas等人的如上文献，并且高粱在Wan，etal.，(1994)PlantPhysicol.104：37(Wan等人，1994年，《植物生理学》，第104卷，第37页)中有所描述。大豆转化的描述可见于多份出版物中，包括美国专利No.5,015,580。

当提及将核苷酸序列“引入”植物中时，意味着这可通过直接转化方法进行，诸如植物组织的农杆菌转化、微粒轰击、电穿孔或本领域技术人员已知的多种方法中的任一种，或者可通过将具有异源核苷酸序列的植物与另一植物杂交来进行，以使得子代具有掺入其基因组中的该核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员熟知的。

本文所用的植物育种方法是本领域技术人员熟知的。有关植物育种技术的讨论，参见Poehlman，(1987)BreedingFieldCropsAVIPublicationCo.，WestportConn.(Poehlman，1987年，《培育田间作物》，AVI出版公司，康涅狄格州韦斯特波特)。在该方法中最优选的许多植物是通过利用植物的授粉方法的技术来培育的。

可使用回交方法将基因引入植物中。该技术已被使用了数十年以将性状引入植物中。描述该技术的例子以及人们所熟知的其他植物育种方法可在诸如PlantBreedingMethodology，edit.NealJensen，JohnWiley&Sons，Inc.(1988)(《植物育种方法》，NealJensen编辑，约翰威立国际出版公司，1988年)等参考文献中找到。在典型的回交方案中，初始所关注品种(回交亲本)与携带待转移的单个所关注基因的第二品种(非回交亲本)杂交。然后将这次杂交所得的子代再次与回交亲本杂交，并且重复该过程直至获得植物，在所述植物中除了来自非回交亲本的单个转移基因之外，回交亲本的基本所有所需形态和生理特性都在该转换的植物上恢复。

在本发明的某些实施例中，有利的是在使用转基因恢复方法时保持雄性不育植物的雄性不育纯合隐性条件，同时减少保持具有此类性状的植物所需的植物、种植和步骤的数量。纯合性为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。杂合性为当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。半合子状态为当仅有基因(或基因组)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时存在的遗传条件。在一个实施例中，纯合隐性条件导致赋予植物所关注的性状，其可为任何所需的性状并且由隐性基因型引起，诸如干旱或寒冷耐受性增强、早熟、油或蛋白质含量改变，或者植物育种者所关注的许多性状的众多种中的任何一种。在一个实施例中，纯合隐性条件赋予植物雄性不育性。当将作为纯合条件的功能互补的序列引入植物中时(即，序列在引入具有纯合隐性条件的植物中并在其中表达时会恢复野生型条件)，育性借助于野生型可育表型的恢复而恢复。

通过如下方式实现纯合隐性条件的保持：将恢复转基因构建体引入植物中，所述构建体连接到干扰植物雄配子的功能或形成的序列，从而生成保持系或供体植物。恢复转基因在引入对于该基因性状为纯合隐性的植物中后会恢复该性状的遗传功能，其中植物仅产生有活力的花粉，所述花粉包含隐性等位基因的一个拷贝但不包含恢复转基因。该转基因在保持系植物中保持为半合状态。转基因是指通过基因工程技术被引入细胞的基因组的任何核酸序列。转基因可为天然DNA序列或异源DNA序列(即，“外来DNA”)。术语天然DNA序列是指天然存在于细胞中但可能已由其初始形式进行了修饰的核苷酸序列。可使用来自保持系的花粉对隐性性状纯合的植物进行受精，子代将因此保留其纯合隐性条件。包含恢复转基因构建体的保持系植物通过自花受精来繁殖，所得种子用于产生另外的植物，所述另外的植物为纯合隐性植物并且包含恢复转基因构建体。

保持系植物充当具有纯合隐性性状的植物的花粉供体。保持系最佳地由这样的植物产生，所述植物具有纯合隐性性状并且也具有引入其中的将恢复纯合隐性等位基因所生成的性状的核苷酸序列。此外，恢复序列连接到干扰雄配子的功能或形成的核苷酸序列。该基因可起到防止雄配子形成或防止雄配子以多种熟知模式中的任一种发挥功能的作用，并且不限于具体方法。以举例而非限制的方式，这可包括使用这样的基因，其表达对雄配子有细胞毒性的产物(参见例如美国专利No.5,792,853；5,689,049；PCT/EP89/00495)；抑制对雄配子功能或形成很重要的另一种基因的产物形成(参见美国专利No.5,859,341；6,297,426)；与另一种基因产物组合而产生妨碍基因形成或功能的物质(参见美国专利No.6,162,964；6,013,859；6,281,348；6,399,856；6,248,935；6,750,868；5,792,853)；反义作用于对雄配子功能或形成很关键的基因或引起所述基因的共抑制(参见美国专利No.6,184,439；5,728,926；6,191,343；5,728,558；5,741,684)；通过使用发夹式形成物干扰表达(Smith，etal.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；WO1999/53050和WO1998/53083)等。抑制花粉的形成或功能的许多核苷酸序列是已知的，并且实现该功能的任何序列都是满足条件的。可影响适当的发育或功能的基因的讨论包括在美国专利No.6,399,856中，并且其包括显性负基因诸如细胞毒素基因、甲基化酶基因和生长抑制基因。显性负基因包括白喉毒素A链基因(CzakoandAn(1991)PlantPhysiol.95：687-692(Czako和An，1991年，《植物生理学》，第95卷，第687-692页)和Greenfield，etal.，(1983)PNAS80：6853(Greenfield等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第6853页)，以及Palmiter，etal.，(1987)Cell50：435(Palmiter等人，1987年，《细胞》，第50卷，第435页))；细胞周期分裂突变体，诸如玉蜀黍中的CDC(Colasanti，etal.，(1991)PNAS88：3377-3381(Colasanti等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第3377-3381页))；WT基因(Farmer，etal.，(1994)Hum.Mol.Genet.3：723-728(Farmer等人，1994年，《人类分子遗传学》，第3卷，第723-728页))和P68(Chen，etal.，(1991)PNAS88：315-319(Chen等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第315-319页))。

所谓的“细胞毒性”基因的另外的例子如上所述，并且可包括但不限于来自菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthermi)的果胶裂解酶基因pelE(Kenn，etal.，(1986)J.Bacteriol.168：595(Kenn等人，1986年，《细菌学杂志》，第168卷，第595页))；来自cms-T玉蜀黍线粒体基因组的T-urf13基因(Braun，etal.，(1990)PlantCell2：153(Braun等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第153页)；Dewey，etal.，(1987)PNAS84：5374(Dewey等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5374页))；来自苏云金芽孢杆菌以色列变种(BacillusthuringiensisIsraeliensis)的引起细胞膜破坏的CytA毒素基因(McLean，etal.，(1987)J.Bacteriol169：1017(McLean等人，1987年，《细菌学杂志》，第169卷，第1017页)，美国专利No.4,918,006)；DNA酶、RNA酶(美国专利No.5,633,441)；蛋白酶或表达反义RNA的基因。合适的基因还可编码涉及抑制雌蕊发育、花粉和柱头的相互作用、花粉管生长或受精或它们的组合的蛋白质。此外，干扰淀粉在花粉中的正常积聚或影响花粉内的渗透平衡的基因也可能是合适的。

在示例性实施例中，使用DAM-甲基化酶基因，其在上文以及美国专利No.5,792,852和5,689,049中有所讨论，其表达产物催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化。甲基化的腺嘌呤将影响细胞活力并且将仅存在于DAM-甲基化酶基因在其中表达的组织中。在另一个实施例中，α-淀粉酶基因可与雄性组织偏好的启动子一起使用。在谷类种子的初始萌发期期间，糊粉层细胞将会合成α-淀粉酶，其参与水解淀粉以形成葡萄糖和麦芽糖，从而提供胚芽生长所需要的营养物质(RogersandMilliman，(1984)J.Biol.Chem.259(19)：12234-12240(Rogers和Milliman，1984年，《生物化学杂志》，第259卷，第19期，第12234-12240页)；Rogers，(1985)J.Biol.Chem.260：3731-3738(Rogers，1985年，《生物化学杂志》，第260卷，第3731-3738页))。在一个实施例中，所用的α-淀粉酶基因可为玉米α-淀粉酶-1基因。Young，etal.，PlantPhysiol.105(2)：759-760(Young等人，《植物生理学》，第105卷，第2期，第759-760页)和GenBank登录号L25805、GI：426481)。编码α-淀粉酶的序列通常不存在于花粉细胞中，并且当表达涉及雄性组织时，结果是用于花粉粒的能量源被分解并且花粉发育受抑制。

本领域技术人员易于理解，本文所述的方法适用于具有远交的可能性的任何其他作物。通过举例但非限制的方式，其可包括玉蜀黍、大豆、高粱或具有远交能力的任何植物。

一般地，为产生更多具有隐性条件的植物，可以将隐性植物与另一隐性植物杂交。这对于一些隐性性状可能是不期望的，并且对于影响繁殖发育的隐性性状可能不可行。或者，可以将纯合植物与具有恢复基因的第二植物杂交，但这需要进一步杂交来将恢复基因隔离开以便再次达到隐性表型状态。相反，在一个过程中，可保持纯合隐性条件，同时将其与保持系植物杂交。可在需要延续隐性条件的任何情形下使用该方法。这能得到经济有效的系统，所述系统相对较易操作以保持纯合隐性植物的群体。

孢子体基因是可独立于配子操作的基因。当纯合隐性条件是通过防止雄性孢子体发育而产生雄性不育的条件时，必要的保持系植物必须包含能够补足突变并使纯合隐性植物能产生功能性花粉的功能恢复性转基因构建体。将该孢子体恢复基因与干扰植物雄配子的功能或形成的第二功能性核苷酸序列相连，会得到这样的保持系植物：即由于第二核苷酸序列干扰花粉形成或功能的作用，所述保持系植物产生在其天然基因座处仅包含孢子体基因的隐性等位基因的花粉。该功能性花粉级分对于恢复转基因构建体而言是非转基因的。

在又一个实施例中，可在具有恢复转基因的构建体中提供如上文所讨论的标记基因。以举例而非限制的方式，除草剂抗性标记诸如bar的使用允许排除不具有恢复转基因的细胞或其子代。在又一个例子中，当使用可评分标记诸如红色荧光标记如DsRed2时，还可在视觉上检测转基因的任何非有意传递，并且可从子代中排除此类逃逸体。显然，本领域技术人员可获得恢复构建体的许多其他变型。

在示例性实施例中，提供了保持雄性不育植物在基因座处的纯合隐性条件的方法，其中采用了作为对雄性育性很关键的基因的第一核苷酸序列、抑制有活力的雄配子的功能或形成的第二核苷酸序列、有效连接到第一序列并且优先地在雄性植物细胞中表达该序列的任选的第三核苷酸序列、有效连接到第四核苷酸序列的任选的第四核苷酸序列、定向表达于雄配子的第四序列，以及作为允许选择植物细胞的可选择或可评分标记的任选的第五核苷酸序列。

参见美国专利No.5,478,369、5,850,014、6,265,640、5,824,524、7,696,405和7,759,543。在近交和杂交生产过程中，非常需要保持该纯合隐性条件。当将编码Ms9基因的序列引入具有纯合ms9ms9条件的植物中时，产生雄性育性。通过本发明的方法，ms9ms9纯合隐性的植物可能在其中引入了功能性孢子体Ms9基因，因此是雄性可育的。该基因可连接到这样的基因：即致使包含恢复转基因构建体的花粉不发挥功能或防止花粉形成或在花粉中产生致死产物，并且连接到使其定向表达于雄配子的启动子，以产生仅产生包含ms9而无恢复转基因构建体的功能性花粉的植物。

一个例子是包含Ms9基因的构建体，所述基因与5126启动子即雄性组织偏好的启动子(参见美国专利No.5,750,868；5,837,851；5,792,853；5,689,049和5,689,051)相连，并且进一步连接到在聚半乳糖醛酸酶启动子即PG47启动子(参见美国专利No.5,545,546和5,412,085)控制下处于半合条件的细胞毒性DAM甲基化酶基因。因此所得植物产生花粉，但唯一有活力的花粉由不包含恢复Ms9/DAM甲基化酶构建体的等位基因产生，从而仅包含ms9基因。因此其可用作传粉媒介以对纯合隐性植物(ms9/ms9)受精，由于保持了ms9的纯合性，所产生的子代将仍然为雄性不育的。子代也将不包含所引入的恢复转基因构建体。

在又一个恢复构建体例子中，Ms9基因与5126启动子相连，并且进一步连接到在雄性组织偏好的PG47启动子控制下的玉米α-淀粉酶基因。在一个实施例中使用的可评分标记是DS-REDEXPRESS(Clontech)。

本发明的过程的理想结果是具有恢复系核苷酸序列的植物可以自花受精以实现恢复系植物的繁殖。花粉将不具有恢复转基因构建体，但该构建体将包含于50％的胚珠(雌配子)中。可种植由自花受精所产生的种子，并且对具有恢复转基因构建体的种子或子代植物进行选择。选择过程可通过多种已知过程中的任一种进行，最常见的是恢复核苷酸序列连接到标记基因的情况。该标记可为可评分或可选择的，并且允许鉴定具有恢复基因的种子或由该种子产生的那些植物。

在本发明的一个实施例中，可以实现雄配子组织偏好的启动子是诱导型的。因此在需要的情况下，允许在该过程中进行附加控制，方法是使具有恢复核苷酸序列的植物为组成型雄性不育的。该类型的雄性不育在美国专利No.5,859,341中有阐明。为了使植物变成可育的，必须提供诱导物质，进而植物将变成可育的。同样，当与上文所述的本发明的过程结合时，所产生的唯一花粉将不包含恢复核苷酸序列。

下文以说明和举例的方式提供了更详细的描述，但无意于限制本发明的范围。

实例1：Ms9的鉴定和克隆

使用基于图谱的克隆方法分离和克隆玉蜀黍ms9基因。使用约450个个体的小群体鉴定基因连接的侧翼标记。使约2500个个体的大群体生长。使用从小群体鉴定的侧翼标记并与新设计的标记一起鉴定重组体，确定染色体1上ms9基因附近的物理区间。发现该区间中ms9的一个候选基因是R2/R3植物特异性myb转录因子。此类转录因子作用于多个植物特异性过程，包括次生代谢(如，苯丙素和色氨酸生物合成；细胞决定和发育，如glabrous1、Werewolf和叶不对称蛋白因子1(AsymmetricalLeaves1)；环境响应，如真菌胁迫和低氧条件。参见例如Zhang，etal.，(2007)PlantJ52：528-538(Zhang等人，2007年，《植物杂志》，第52卷，第528-538页)和Zhu，etal.，(2008)PlantJ.55：266-277(Zhu等人，2008年，《植物杂志》，第55卷，第266-277页))。

实例2：另外的ms9等位基因的鉴定和克隆

发现参考等位基因ms9-ref在第一外显子中包含4碱基对插入，导致翻译移码突变。该突变发生于R2结合结构域。第二等位基因ms9-AD62A在第三外显子中具有16bp缺失，这破坏了R3结合结构域。

本领域技术人员应认识到，可在整个玉蜀黍近交系中观察到突变位点处或附近的轻微序列变化。这可能是由于(例如)基因组中的天然多态性和/或转座子插入后不完全切割。

实例3：表达分析和cDNA分离

可使用Northern分析来检测处于小孢子发生的各种状态的花药发育所特有的基因的表达。Northern分析也是本领域技术人员常用的技术，并且与Southern分析类似，不同的是在凝胶上分离和布置的是mRNA而非DNA。然后使RNA与标记探针杂交。Potter，etal.，(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.USA78：6662-6666(Potter等人，1981年，《美国国家科学院院刊》，第78卷，第6662-6666页)，Lechelt，etal.，(1989)Mol.Gen.Genet.219：225-234(Lechelt等人，1989年，《分子和普通遗传学》，第219卷，第225-234页)。

Ms9天然地在花药中以高水平表达，而在任何其他组织中的表达很少乃至没有。在发育的花粉母细胞阶段、减数分裂阶段、四分孢子阶段和早期单核阶段期间，其在花药内具有最高表达。在减数分裂之前小孢子发育的很早期，玉蜀黍雄性不育ms9突变具有生理影响。Ms9基因可以是进入减数分裂的控制点。该基因的野生型和/或突变形式可用于控制繁殖发育的方法，诸如US7,759,543或US7,696,405中所述的制种技术(SPT)系统。在水稻和高粱中存在该基因的直系同源物，并且该基因可能在单子叶作物中是高度保守的，从而为多个物种中的育性介导提供了机会。

例如，调节Ms9在近交系玉蜀黍植物中的表达具有杂交制种的价值。玉蜀黍是一年生植物。供农民每年种植的高质量杂交制种需要在近交系亲本的生成和繁殖中以及在对近交系亲本进行杂交以产生杂交种子的过程中使用授粉控制系统。对Ms9表达的调节可以是此类授粉控制系统的组成部分。

在通常高度自花授粉的作物植物诸如水稻或小麦中，Ms9的显性抑制可在生成雄性不育系的过程中发挥作用。用于保持这种株系以及使这种株系或其子代恢复育性的系统已有所描述；参见例如国际专利申请PCT/US2014/023932。

实例4：启动子及其必要区域的鉴定

所鉴定的Ms9启动子及其变体和片段具有驱动有效连接的异源多核苷酸表达的作用。如上文所指出，玉蜀黍Ms9基因的天然表达高度偏好于花药组织；Ms9启动子可用于提供有效连接的异源多核苷酸的花药组织偏好的表达。如上文所进一步指出，Ms9的天然表达在发育的花粉母细胞阶段、减数分裂阶段、四分孢子阶段和早期单核阶段期间发生；在控制减数分裂形成雄配子的方法中，可在这些阶段期间使用Ms9启动子靶向表达。作为另外一种选择或除此之外，在发育的该关键阶段，可将该启动子用于非其天然MS9的基因的表达。

启动子序列或其部分也可在(例如)通过启动子反向重复构建体下调天然或转基因多核苷酸在植物中的表达的方法中使用，其中所述构建体靶向有效连接到要下调的多核苷酸的启动子。参见例如国际专利公布WO2008/112970；Mette，etal.，(2000)EMBOJ19：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；以及国际专利申请PCT/US2014/023932。借助启动子反向重复构建体下调的多核苷酸对于所靶向的启动子而言可以是天然或异源的。

可通过引物延伸分析来鉴定推定的TATA框，如CurrentProtocolsin MolecularBiology，Ausubel，etal.，eds；JohnWileyandSons，NewYorkpp.4.8.1-4.8.5(1987)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，约翰威立国际出版公司，纽约，第4.8.1-4.8.5页，1987年)中所述。

可使用功能分析在基因组亚克隆中鉴定花药基因的调控区诸如启动子，通常通过观察到花药组织中的报告基因表达和非花药组织中的低水平或缺失报告基因表达来证实。调控区位于翻译起始位点的“上游”或5’区的可能性，可通过将包含该上游区的DNA片段亚克隆到表达载体中进行瞬时表达实验来测试。预计较小的亚基因组片段可包含雄性组织偏好的表达所必需的区域。例如，已在源自较大基因组部分的相对较小片段中鉴定到CaMV19S和35S启动子的必需区域，如美国专利No.5,352,605中所述。

用来测试功能性表达的适当表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体引入到宿主中的方法，而此类方法是本领域技术人员熟知的。对于真核生物，载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域有效连接到报告基因，诸如编码葡糖苷酸酶(GUS)的UidA或荧光素酶。植物表达载体和报告基因的一般描述和例子可见于Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology；Glick，etal.，eds；CRCPress；pp.89-119；(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术的方法》，Glick等人编辑，CRC出版社，第89-119页，1993年)。GUS表达载体和GUS基因盒可从加利福尼亚州帕罗奥图的克隆泰克公司(Clonetech，PaloAlto，CA)商购获得，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因盒可从威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格公司(PromegaCorporation，Madison，WI)商购获得。Ti质粒和其他农杆菌载体的描述可见于Ishida，etal.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)和美国专利No.5,591,616。

可将包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体引入完整组织(诸如分期的花药、胚)中，或引入愈伤组织中。DNA递送的方法包括微粒轰击、DNA注射、电穿孔和农杆菌介导的基因转移(参见Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlantMolecularBiologyand Biotechnology，Glick，etal.，eds.；CRCPress；(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术的方法》，Glick等人编辑，CRC出版社，1993年)；美国专利No.5,591,616以及Ishida，etal.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页))。培养植物组织的一般方法可见于Gruber等人和Glick的如上文献。

对于瞬时测定系统，立即将分期的、分离的花药置于用0.5％植物凝胶(圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis))凝固的雄穗培养基(PareddyandPetelino，(1989)CropSci.J.；29：1564-1566(Pareddy和Petelino，1989年，《作物科学杂志》，第29卷，第1564-1566页))或其他固化培养基上。优选地通过用1.2μm粒子以1000-1100Psi进行微粒介导递送，在5小时内引入表达载体DNA。在DNA递送后，于26℃下将花药在相同的雄穗培养基上温育17小时，并通过如下方式进行分析：制备全组织匀浆并测定GUS或荧光素酶活性(参见Gruber等人的如上文献)。

可对调控区的5’和3’端进行缺失分析：通过定点诱变、采用聚合酶链式反应的诱变等可获得片段(DirectedMutagenesis：APracticalApproach；IRLPress；(1991)(《定点诱变：一种实用方法》，IRL出版社，1991年))。可通过靠近推定的TATA框或必要时通过3’缺失，来描绘雄性组织偏好的调控区的3’端。然后可将必要区域有效连接到所选择的核心启动子。一旦鉴定出必要区域，就可通过Ms9的雄性组织偏好区域加上核心启动子来控制外源基因的转录。核心启动子可以是已知核心启动子中的任何一者，诸如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子(Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlant MolecularBiologyandBiotechnology；Glick，etal.，eds.；CRCPress；pp.89-119；(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术的方法》；Glick等人编辑，CRC出版社，第89-119页，1993年))。优选地，启动子为雄性组织偏好基因的核心启动子或CaMV35S核心启动子。更优选地，启动子为雄性组织偏好基因的启动子，并且具体地讲，为Ms9核心启动子。

例如通过本领域熟知的方法接头分区进行的进一步突变分析，可鉴定包含花药偏好表达所需序列的小区段。这些突变可在诸如表达水平、表达时机或表达的组织方面引入功能的修饰。突变也可以是沉默的并且没有可观察效应。

Claims (27)

1.一种调节植物雄性育性的方法，所述方法包括控制多核苷酸在植物中的表达，其中所述多核苷酸选自：

a.与选自SEQIDNO：1、2、4、5、6、7和8的多核苷酸的全长序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸；

b.具有SEQIDNO：1、2、4、5、6、7或8的序列的多核苷酸；

c.编码与选自SEQIDNO：3、13和14的多肽的全长具有至少90％同一性的多肽的多核苷酸；以及

d.与(a)、(b)或(c)的所述多核苷酸互补的多核苷酸，

其中所述多核苷酸编码影响植物的雄性育性的多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与对照植物相比，所述SEQIDNO：3的多肽以较低水平存在于所述植物中。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述植物的雄性繁殖组织中未检出所述SEQIDNO：3的多肽。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的表达通过启动子反向重复构建体的表达来控制，所述启动子反向重复构建体靶向与SEQIDNO：1或2天然相关的启动子。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述所靶向的启动子具有与SEQIDNO：15有至少95％同一性的多核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述所靶向的启动子包含SEQIDNO：15。

7.一种调节第一植物物种的雄性育性的方法，所述方法包括如下步骤：

a)下调天然Ms9基因在所述第一物种的植物中的表达以便导致雄性不育；以及

b)引入构建体，所述构建体包含编码源于第二植物物种的MS9多肽的多核苷酸，

其中所述所引入的多核苷酸使所述第一物种的所述植物或所述第一物种的所述植物的子代恢复育性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一物种选自玉蜀黍、高粱和水稻；并且其中所述第二物种选自玉蜀黍、高粱和水稻。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述下调通过靶向与所述多核苷酸天然相关的所述启动子来实现，其中所述多核苷酸编码所述第一物种的所述天然MS9多肽。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述引入通过杂交进行。

11.一种保持雄性不育植物的纯合隐性条件的方法，所述方法包括：

(a)提供包含所述ms9基因的纯合隐性等位基因的第一植物，其中所述植物是雄性不育的；

(b)将构建体引入第二植物中，所述第二植物包含所述ms9基因的纯合隐性等位基因，所述构建体包含：

(i)包含所述Ms9核苷酸序列的第一核苷酸序列，其中所述第一序列选自：

a.编码选自SEQIDNO：3、13和14的多肽的序列；

b.SEQIDNO：1或2的序列；以及

c.与SEQIDNO：1或2的全长具有至少90％同一性的序列；

所述第一核苷酸序列在所述第一植物中表达时将恢复雄性育性；

(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列在表达时抑制所述第二植物中雄配子的功能或形成，使得由所述第二植物产生的功能性雄配子不包含所述构建体；以及

(iii)用所述第二植物的雄配子对所述第一植物进行受精，以产生保持所述第一植物的纯合隐性条件的子代。

12.一种分离或重组的多核苷酸，所述多核苷酸选自：

a.与选自SEQIDNO：1、2、4、5、6、7和8的多核苷酸的全长序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码影响植物的雄性育性的多肽；

b.编码与选自SEQIDNO：3、13和14的多肽的全长具有至少90％同一性的多肽的多核苷酸；

c.SEQIDNO：1、2、4、5、6、7或8的多核苷酸；以及

d.与(a)、(b)或(c)的所述多核苷酸互补的多核苷酸。

13.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义取向有效连接至启动子。

14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求13所述的表达盒。

15.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求14所述的重组表达盒。

16.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。

17.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。

18.一种分离或重组的多肽，其与SEQIDNO：3、9、10、11、12、13或14的全长具有至少95％同一性并且影响植物的雄性育性。

19.一种包含权利要求18所述的重组多肽的植物，其中所述植物为雄性可育的。

20.一种包含权利要求18所述的重组多肽的植物，其中所述植物为雄性不育的。

21.根据权利要求18或19所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、黑麦、大豆、向日葵或拟南芥。

22.一种在植物或植物细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括将表达盒引入到所述植物或所述植物细胞中，其中所述表达盒包含有效连接到所关注的异源多核苷酸的启动子，其中所述启动子包含选自以下的多核苷酸序列：

a.SEQIDNO：15；以及

b.SEQIDNO：15的核苷酸序列的片段或变体，其中所述序列在植物细胞中起动转录；

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述所关注的异源多核苷酸编码赋予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草剂耐受性、病原体抗性或昆虫抗性或者影响所述植物的雄性育性的基因产物。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍或小麦。

26.一种优先在植物的繁殖组织中表达所关注的多核苷酸的方法，所述方法包括将表达盒引入到植物细胞中并从所述植物细胞再生植物，所述植物在其基因组中稳定掺入了所述表达盒，所述表达盒包含有效连接到所关注的异源多核苷酸的启动子，其中所述启动子包含选自以下的多核苷酸：

a.包含SEQIDNO：15的序列的多核苷酸；以及

b.包含SEQIDNO：15的核苷酸序列的片段或变体的多核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中起动转录。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述所关注的多核苷酸优先在所述植物的雄性繁殖组织中表达。