ES2493615T3 - Secuencias de nucleótidos que median en la fertilidad masculina vegetal y un método para usar las mismas - Google Patents

Abstract

Una casete de expresión que comprende una secuencia de alfa-amilasa 1 que comprende: (a) la región codificadora de alfa-amilasa 1 procedente de Zea mays establecida en la Figura 24 (SEQ ID NO: 26); ó (b) una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la misma ligada operativamente a un promotor preferido de tejido masculino

Description

Secuencias de nucleótidos que median en la fertilidad masculina vegetal y un método para usar las mismas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El desarrollo del cultivo de plantas de híbridas ha hecho posible avances considerables tanto en la calidad como en la cantidad de los cultivos producidos. Un aumento del rendimiento y una combinación de características deseables, tal como resistencia a enfermedades e insectos, tolerancia al calor y la sequía, junto con variaciones de la composición de la planta son todos posibles gracias a procedimientos de hibridación. Estos procedimientos se basan frecuentemente en gran medida en proporcionar una parte masculina que aporte polen a una parte femenina para producir el híbrido resultante.

Los cultivos de campo se cultivan mediante técnicas que aprovechan el método de la planta para la polinización. Una planta es autopolinizante si el polen de una flor es transferido a la misma o a otra flor de la misma planta. Una planta tiene una polinización cruzada si el polen procede de una flor de una planta diferente.

En la Brassica, la planta normalmente es auto-estéril y solo puede tener polinización cruzada. En las especies autopolinizantes, tal como la soja y el algodón, las plantas masculinas y femeninas se encuentran yuxtapuestas anatómicamente. Durante la polinización natural, los órganos reproductores masculinos de una flor dada polinizan los órganos reproductivos femeninos de la misma flor.

Las plantas del maíz (Zea mays L.) presentan una situación única en la que pueden ser cultivadas con técnicas tanto de auto-polinización como de polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas, localizadas en la panoja, y flores femeninas, localizadas en la mazorca, sobre la misma planta. Puede autopolinizarse o tener polinización cruzada. La polinización natural se da en el maíz cuando el viento arrastra el polen desde las panojas a la barba del maíz que sobresale de la parte superior de las mazorcas incipientes.

Un método fiable para controlar la fertilidad en plantas ofrecería la oportunidad de mejorar el cultivo de plantas. Esto es especialmente cierto para el desarrollo de híbridos de maíz, que se basa en alguna clase de sistema de esterilidad masculina y en el que un sistema de esterilidad femenina reduciría los costes de producción.

El desarrollo de híbridos de maíz requiere el desarrollo de líneas innatas homocigotas, el cruce de dichas líneas y la evaluación de los cruces. El cultivo de pedigrí y la selección recurrente son dos de los métodos de cultivo usados para desarrollar líneas innatas a partir de poblaciones. Los programas de cultivo combinan rasgos deseables procedentes de dos o más líneas innatas o varias fuentes de amplio espectro en los conjuntos de cultivo a partir de los cuales se desarrollan nuevas líneas innatas mediante autopolinización y selección de fenotipos deseados. Una variedad de maíz híbrido es el cruce de dos de dichas líneas innatas, cada una de las cuales puede tener una o más características deseables no presentes en el otro o que complementan al otro. Los nuevos innatos se cruzan con otras líneas innatas y los híbridos procedentes de dichos cruces son evaluados para determinar cuáles tienen potencial comercial. La progenie híbrida de la primera generación se designa F1. En el desarrollo de híbridos solo se buscan las plantas híbridas F1. El híbrido F1 es más vigoroso que sus precursores innatos. Este vigor de híbrido, o heterosis, puede manifestarse de muchos modos, que incluyen un crecimiento vegetativo incrementado y un rendimiento incrementado.

La semilla de maíz híbrido se puede producir mediante un sistema de esterilidad masculina que incorpora un despanojamiento manual. Para producir la semilla híbrida, la panoja masculina es eliminada del precursor innato femenino en crecimiento, que puede ser plantado con diferentes patrones de fila junto con el precursor innato masculino. Por consiguiente, siempre que haya un aislamiento suficiente de fuentes de polen de maíz ajenas, las mazorcas del innato femenino serán fertilizadas solo con polen procedente del innato masculino. La semilla resultante es por tanto un híbrido (F1) y formará plantas híbridas.

La variación ambiental en el desarrollo de la planta puede dar como resultado que las plantas generen panojas una vez completado el despanojado manual del precursor femenino. O un despanojador podría no eliminar completamente la panoja de una planta innata femenina. En cualquiera de estos casos, el resultado es que la planta femenina esparcirá polen con éxito y algunas plantas serán auto-polinizadas. Esto dará como resultado que la semilla de los innatos femeninos sea recolectada junto con las semillas híbridas que se producen normalmente. La semilla innata femenina no es tan productiva como la semilla F1. Además, la presencia de semillas innatas femeninas puede representar un riesgo de seguridad de germoplasma para la compañía que produce el híbrido.

Alternativamente, el innato femenino puede ser despanojado mecánicamente con una máquina. El despanojado mecánico es aproximadamente tan fiable como el despanojado manual, pero es más rápido y menos costoso. Sin embargo, la mayoría de las máquinas despanojadoras producen más daño a las plantas que el despanojado manual. Por tanto, ninguna forma de despanojado es totalmente satisfactoria actualmente, y sigue existiendo una necesidad de alternativas que reduzcan adicionalmente los costes de producción y de eliminar la auto-polinización del precursor femenino en la producción de semillas híbridas.

Un sistema fiable de esterilidad genética masculina proporcionaría ventajas. El laborioso proceso de despanojado puede evitarse en algunos genotipos usando innatos citoplásmicos masculinos estériles (CMS, del inglés “cytoplasmic male-sterile”). En ausencia de un gen restaurador de fertilidad, las plantas de un innato CMS son estériles masculinas como resultado de los factores resultantes del genoma citoplásmico, en contraposición con el genoma nuclear. Por tanto, esta característica es heredada exclusivamente a través del precursor femenino en las plantas de maíz, ya que solo la planta femenina proporciona citoplasma a la semilla fertilizada. Las plantas CMS son fertilizadas con polen procedente de otro innato que no sea estéril masculino. El polen procedente del segundo innato puede o no aportar genes que hagan que las plantas híbridas sean estériles masculinas. Habitualmente, las semillas procedentes de un maíz despanojado y las semillas CMS producidas del mismo híbrido deben mezclarse para asegurar que una carga de polen adecuada está disponible para la fertilización cuando las plantas híbridas son cultivadas, y para asegurar una diversidad citoplásmica.

Puede haber otras desventajas del CMS. Una es una asociación observada históricamente de una variante específica de CMS con susceptibilidad hacia determinadas enfermedades de cultivo. Este problema ha limitado el uso extendido de dicha variante CMS en la producción de maíz híbrido y ha tenido un impacto negativo sobre el uso de CMS en maíz en general.

Un tipo de esterilidad genética se describe en las Patentes de EE.UU. 4.654.465 y 4.727.219 a nombre de Brar et al. Sin embargo, esta forma de esterilidad masculina genética requiere el mantenimiento de múltiples genes mutantes en localizaciones separadas dentro del genoma y requiere un sistema de marcadores complejo para seguir los genes y hacer uso del sistema adecuado. Patterson también describió un sistema génico de traslocalizaciones cromosomales que pueden ser efectivas, pero que son complicadas. (Véanse las Patentes de EE.UU. Nº 3.861.709 y 3.710.511).

Se han realizado otros muchos intentos para mejorar en estas desventajas. Por ejemplo, Fabijanski et al. desarrollaron varios métodos para provocar esterilidad masculina en plantas (véase el documento EPO 89/3010153.8 publicación nº 329.308 y la solicitud de PCT PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828). Un método incluye la administración a la planta de un gen que codifique una sustancia citotóxica asociada a un promotor específico de tejido masculino. Otro implica un sistema antisentido en el que se identifica un gen crítico para la fertilidad y un antisentido al gen insertado en la planta. Mariani et al. también muestran otros varios sistemas antisentido. Véase EP 89/401.194. Otros sistemas adicionales usan genes “represores” que inhiben la expresión de otro gen crítico para la esterilidad masculina. Documento PCT/GB90/00102, publicado como WO 90/08829.

Una mejora adicional de este sistema es la descrita en la Patente de EE.UU. nº 5.478.369 en la que se consigue un método para impartir esterilidad masculina controlable silenciando un gen nativo de la planta que es crítico para la fertilidad masculina y reemplazando el ADN nativo con el gen crítico para la fertilidad masculina ligado a un promotor inducible que controla la expresión del gen. Por tanto, la planta es constitutivamente estéril, volviéndose fértil solo cuando el promotor es inducido y se expresa su gen de fertilidad masculina unido.

En determinadas circunstancias, se expresa un rasgo vegetal de esterilidad masculina mediante el mantenimiento de una condición recesiva homocigota. Surgen dificultades para mantener la condición homocigota, cuando se debe usar un gen de restauración transgénico para el mantenimiento. Por ejemplo, una mutación natural en un gen crítico para la esterilidad masculina puede conferir un fenotipo de esterilidad masculina a plantas cuando dicho alelo mutante está en el estado homocigoto. Esta esterilidad se puede restaurar cuando la forma no mutante del gen se introduce en la planta. Sin embargo, esta forma de restauración elimina la condición recesiva homocigota deseada, restaura por completo la fertilidad masculina y previene el mantenimiento de líneas maternales estériles masculinas puras. Este episodio se puede evitar cuando se elimina la producción de polen que contiene el gen de restauración, proporcionando de este modo una planta mantenedora que produce solo polen que no contiene el gen de restauración, y la progenie retiene la condición homocigota. Un ejemplo de una estrategia se muestra en Dellaporta et al., 6.743.968, en la cual se produce una planta que tiene una construcción hemicigótica que comprende un gen que produce un producto fatal para una célula, ligado a un promotor específico de polen, y el gen de restauración. Cuando se cruza con la planta estéril masculina recesiva homocigota, la progenie retiene por tanto la condición recesiva homocigota.

Tal como se indica, un aspecto esencial de gran parte del trabajo actual con los sistemas de esterilidad masculina es la identificación de genes que confieren fertilidad masculina.

Dicho gen puede usarse en una variedad de sistemas para controlar la fertilidad masculina, incluyendo los descritos en la presente memoria. Previamente, se ha identificado un gen de fertilidad masculina en Arabidopsis thaliana y se usa para producir una planta estéril masculina. Aarts et al., “Transposon Tagging of a Male Sterility Gene in Arabidopsis”, Nature, 363: 715-717 (24 de junio de 1993). Patente de EE.UU. nº 5.478.369 describe un gen de este tipo que afecta a la fertilidad masculina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona:

[1] Una casete de expresión que comprende una secuencia de alfa-amilasa 1 que comprende:

(a)

la región codificadora de alfa-amilasa de Zea mays fijada en la Figura 24 (SEQ ID NO: 26); o

(b)

una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la misma. Ligada operativamente a un promotor preferido de tejido masculino.

[2] Una planta o célula vegetal que comprende una casete de expresión de 1.

[3] El uso de una casete de expresión de 1 en la represión del desarrollo de polen. La planta es preferiblemente una planta de maíz, sorgo o soja.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: es un mapa de localización del gen de fertilidad masculina Ms26. Figura 2A: es un ensayo Southern blot de la familia ms26-m2::Mu8 hibridada con una sonda Mu8. Figura 2B: es un ensayo Southern blot de la familia ms26-m2::Mu8 hibridada con un fragmento Pstl aislado del clon

ms26. Figura 3: es un gel de análisis Northern blot hibridado con un fragmento Pstl aislado del gen Ms26. Figura 4A-4D es la secuencia de Ms26 (El ADNc es la SEQ ID NO: 1, la proteína es la SEQ ID NO: 2). Figura 5A-5C: es la secuencia genómica de Ms26 (también referida como SEQ ID NO: 7). Figura 6A-6D: es una comparación de la secuencia genómica de Ms26 (Residuos 1051-3326 de SEQ ID NO: 7) con

el ADNc de Ms26 (SEQ ID NO: 1).

Figura 7A: es un gel de análisis Northern que muestra la expresión en diversos tejidos vegetales y la Figura 7B es un gel que muestra etapas de expresión de microsporogénesis. Figura 8: es el promotor de longitud completa de Ms26 (SEQ ID NO: 5). Figura 9: es un gráfico de barras que muestra actividad de luciferasa tras las eliminaciones de regiones

seleccionadas del promotor Ms26. Figura 10: muestra regiones esenciales del promotor Ms26 (SEQ ID NO: 6). Figura 11: es un gráfico de barras que muestra la actividad de luciferasa tras la sustitución mediante escaneo de

ligando de sitio de restricción de regiones seleccionadas pequeñas (9-10 pb) del fragmento promotor esencial Ms26. Figura 12A y 12B: son una comparación de la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) del ortólogo de Ms26

procedente de un panículo de sorgo y ADNc de Ms26 de maíz (Residuos 201-750 de la SEQ ID NO: 1), y la secuencia de proteína de sorgo (SEQ ID NO: 4) y proteína de maíz Ms26 (Residuos 87-244 de SEQ ID NO: 2). Figura 13: es una representación del mapeo del gen de esterilidad masculina ms26. Figura 14: muestra una comparación de secuencia de la región de escisión del alelo ms26-ref (SEQ ID NO: 8) con

Ms26 natural (SEQ ID NO: 9). Figura 15: muestra la secuencia de transposón dentro de ms26-ref (SEQ ID NO: 10). Figura 16: muestra la secuencia ms26-ref entera (SEQ ID NO: 11). Figura 17A: muestra un alineamiento de secuencia de proteína traducida entre las regiones del CYP704B1, un gen

P450 (SEQ ID NO: 12) y Ms26 (SEQ ID NO: 13); la Figura 17B muestra el análisis de árbol filogenético de genes

P450 seleccionados. Figura 18: demuestra el cambio de marco de dominio de unión heme, mostrando el alineamiento de secuencia traducida de regiones del ADNc de Ms26 (SEQ ID NOS: 14 y 28-29), las regiones genómicas de exón 5 en plantas fértiles (SEQ ID NOS: 15 y 30-31) y plantas estériles (SEQ ID NOS: 16 y 32-33).

Figura 19: muestra el ADNc de Ms26 de arroz (SEQ ID NO: 17) y de la proteína (SEQ ID NO: 18). Figura 20: muestra el alineamiento del promotor Ms26 del maíz (residuos 650-1089 de la SEQ ID NO: 5), del sorgo (SEQ ID NO: 19) y del arroz (SEQ ID NO: 20).

Figura 21: muestra el alineamiento de la proteína Ms26 del maíz (SEQ ID NO: 21); de la proteína Ms26 del arroz (SEQ ID NO: 18) y de la proteína Ms26 del sorgo (SEQ ID NO: 22) junto con una secuencia de consenso.

Figura 22: es un mapa de plásmido de PHP 18091, que contiene el gen de fertilidad Ms45 con un promotor de polen, gen citotóxico y marcador seleccionable.

Figura 23: es un mapa de plásmido de PHP 24101, que contiene el gen de fertilidad Ms26 con un promotor de polen, gen citotóxico y marcador seleccionable.

Figura 24: muestra una secuencia de la región codificadora de α-amilasa 1 de Zea mays.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado entendido habitualmente por el especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. A menos que se mencione lo contrario, las técnicas empleadas o contempladas en la presente memoria son metodologías estándares bien conocidas por el especialista en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no limitativos.

La esterilidad masculina genética es el resultado de una mutación, supresión u otro impacto en uno de los genes críticos de una etapa específica de la microsporogénesis, el término aplicado al proceso completo de formulación de polen. Estos genes pueden referirse de forma colectiva como genes de fertilidad masculina (o, alternativamente, genes de esterilidad masculina). Existen muchas etapas en la ruta global donde la función génica afecta a la fertilidad. Esto se ve apoyado consistentemente por la frecuencia de esterilidad masculina genética en el maíz. Nuevos alelos de mutantes de esterilidad masculina son descubiertos en materiales que oscilan entre innatos de élite a poblaciones inadaptadas.

Las secuencias se pueden aislar de cualquier planta, que incluye, aunque sin limitación, maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), mijo (Panicum spp.), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), avena (Avena sativa), cebada (Hordeum vulgare), verduras, plantas ornamentales y coníferas. Preferiblemente, las plantas incluyen maíz, soja y sorgo.

Se pueden aislar secuencias de otras plantas siguiendo técnicas bien conocidas en base a su homología de secuencia con respecto a la región codificadora homóloga de las secuencias codificadoras establecidas en la presente memoria. En dichas técnicas, se usa toda o parte de la secuencia codificadora conocida como sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado (es decir, bibliotecas genómicas) a partir de un organismo elegido. Para la hibridación de secuencias de ácido nucleico se encuentran disponibles métodos con facilidad en la técnica. Una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York (1993); y en Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995).

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) “secuencia de referencia”, (b) “ventana de comparación”, (c) “identidad de secuencia”, y (d) “porcentaje de identidad de secuencia”.

(a)

Tal como se usa en la presente memoria, “secuencia de referencia” es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc o de gen de longitud completa, o la secuencia de ADNc o génica completa.

(b)

Tal como se usa en la presente memoria, “ventana de comparación” hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50 ó 100 nucleótidos de longitud, o más. Los especialistas en la técnica comprenderán que para evitar una elevada similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia de polinucleótidos normalmente se introduce una penalización de hueco y se resta del número de coincidencias.

Los métodos para alinear secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Por tanto, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; el método de búsqueda de alineamiento local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877.

Las implementaciones en ordenador de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para comparar secuencias a fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, aunque sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Los alineamientos que usan estos programas pueden ser llevados a cabo usando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL se describe bien en Higgins et al. (1988) Gene 73: 237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1998), ver anterior. Se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácido. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), ver anterior. Se pueden llevar a cabo búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. Se pueden llevar a cabo búsquedas de proteína BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácido homólogas a una proteína o polipéptido. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Alternativamente, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para llevar a cabo una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997), ver anterior. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p.ej., BLASTN para las secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también se puede llevar a cabo manualmente mediante inspección.

A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente memoria se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótido usando un Peso de GAP de 50 y un Peso de Longitud de 3 y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un Peso de GAP de 8 y un Peso de Longitud de 2; y la matriz de puntuación BLOSUM62 o cualquier programa equivalente. Por “programa equivalente” se entiende cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualesquier dos secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene nucleótidos idénticos o coincidencias de residuos de aminoácido y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se comparan con el correspondiente alineamiento generado mediante GAP Versión 10.

GAP usan el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximice el número de coincidencias y que minimice el número de huecos. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de hueco y crea el alineamiento con el mayor número de bases coincidentes y el menor número de huecos. Permite la provisión de una penalización de creación de hueco y una penalización de extensión de hueco en unidades de bases coincidentes. GAP debe sacar provecho del número de coincidencias de penalización de creación de huecos para cada hueco que inserta. Si se elige una penalización de extensión de hueco superior a cero, GAP debe, además, sacar provecho para cada hueco insertado de la longitud del hueco multiplicado por la penalización de extensión de hueco. Los valores de penalización de creación de hueco y los valores de penalización de extensión de hueco por defecto en la Versión 10 del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la penalización de creación de hueco por defecto es 50, mientras que la penalización por extensión de hueco por defecto es 3. Las penalizaciones de creación de hueco y de extensión de hueco pueden expresarse como números enteros seleccionados del grupo de números enteros que va de 0 a 200. Por lo tanto, por ejemplo, las penalizaciones de creación de hueco y de extensión de hueco pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó más.

GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de dicha familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para los alineamientos: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la medida maximizada con el objetivo de alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por el número de bases del segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que coinciden en realidad. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que se encuentran a lo largo de los huecos se ignoran. Una similitud se puntúa cuando el valor de matriz de puntuación para un par de símbolos es superior o igual a 0,50, el umbral de

similitud. La matriz de puntuación usada en la Versión 10 del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).

(c)

Tal como se usa en la presente memoria, “identidad de secuencia” o “identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptidos hace referencia a los residuos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas a menudo difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (p.ej., carga o hidrofobicidad) y por tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, se puede ajustar el porcentaje de identidad de secuencia hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas tienen “similitud de secuencia” o “similitud”. Los medios para realizar dicho ajuste son bien conocidos por los especialistas de la técnica. Normalmente implican la asignación de una puntuación a una sustitución conservativa como discordancia parcial en lugar de total, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por tanto, por ejemplo, si a un aminoácido idéntico se le asigna una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se le asigna una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le asigna una puntuación entre cero y 1. La puntuación de sustituciones conservativas se calcula, p.ej., como está implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

(d)

Tal como se usa en la presente memoria, “porcentaje de identidad de secuencia” significa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de nucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se da la base de ácido nucleico idéntica o el resido de aminoácido idéntico en ambas secuencias para generar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones de la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar lugar al porcentaje de identidad de secuencia.

Identidad para la secuencia de la presente invención significaría una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia.

Las regiones promotoras pueden ser identificadas fácilmente por el especialista en la técnica. Se identifica el codón de inicio putativo que contiene la estructura ATG y por encima del codón de inicio se encuentra el presunto promotor. Por “promotor” se entiende una región reguladora de ADN que normalmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificadora particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente posicionadas por encima o en dirección 5’ respecto a la caja TATA, referidas como elementos de promotor por encima, que influyen en la velocidad de iniciación de la transcripción. Se reconoce que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región promotora descrita en la presente memoria, se encuentra al alcance del estado de la técnica el poder aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la región por encima de la caja TATA a partir de la región de promotor particular identificada en la presente memoria. Por tanto, la región de promotor descrita en la presente memoria generalmente se define adicionalmente por comprender elementos reguladores por encima tales como aquellos responsables de la expresión de tejido y la expresión temporal de la secuencia codificadora, potenciadores y otros similares. Del mismo modo, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado tal como el tejido masculino pueden identificarse, aislarse y usarse con otros promotores de núcleo para confirmar la expresión preferida de tejido masculino. Por promotor de núcleo se entiende la secuencia mínima requerida para iniciar la transcripción, tal como la secuencia denominada caja TATA que es común a los promotores de genes que codifican proteínas. Por tanto, el promotor por encima de Ms26 opcionalmente puede usarse en conjunción con sus promotores propios o de núcleo procedentes de otras fuentes. El promotor puede ser nativo o no nativo respecto a la célula en la que se encuentra

La secuencia de promotor aislada de la presente descripción puede modificarse para proporcionar un rango de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Se puede utilizar menos que la región promotora entera y mantener la capacidad para dirigir la expresión preferida de antera. Sin embargo, se reconoce que se pueden reducir los niveles de ARNm con eliminaciones de porciones de la secuencia promotora. Por tanto, el promotor puede modificarse para ser un promotor débil o fuerte. Generalmente, por “promotor débil” se entiende un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificadora a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 tránscritos a aproximadamente 1/100.000 tránscritos a aproximadamente 1/500.000 tránscritos. Inversamente, un promotor fuerte conduce la expresión de una secuencia codificadora a un nivel elevado, o a aproximadamente 1/10 tránscritos a aproximadamente 1/100 tránscritos a aproximadamente 1/1.000 tránscritos. Generalmente, se usarán al menos aproximadamente 30 nucleótidos de una secuencia

promotora aislada para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos. Se reconoce que para aumentar los niveles de transcripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con las regiones promotoras de la descripción. Los potenciadores son secuencias de nucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. En la técnica se conocen potenciadores e incluyen la región potenciadora SV40, el elemento potenciador 35S, y otros similares.

El promotor de la presente descripción puede ser aislado a partir de la región 5’ de su región codificadora nativa de región de no traducción 5’ (5’UTR). Igualmente, el terminador se puede aislar de la región 3’ que flanquea su respectivo codón de parada. El término “aislado” se refiere a material tal como un ácido nucleico o una proteína que está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que acompañan o que interaccionan normalmente con el material según se encuentra en su entorno natural, o si el material está en su entorno natural, el material ha sido alterado mediante intervención humana deliberada a una composición y/o ha sido colocado en una localización en una célula distinta de la localización nativa del material. Los métodos para el aislamiento de regiones promotoras son bien conocidos en la técnica.

Las “variantes funcionales” de las secuencias reguladoras también son contempladas por las composiciones de la presente invención. Las variantes funcionales incluyen, por ejemplo, las secuencias reguladoras nativas de la invención que tienen una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótidos. Se pueden crear variantes funcionales de la invención mediante mutagénesis dirigida a sitio, mutación inducida, o pueden existir como variantes alélicas (polimorfismos).

Tal como se usa en la presente memoria, un “fragmento funcional” de la secuencia reguladora es una secuencia de nucleótidos que es una variante de secuencia reguladora formada por una o más eliminaciones a partir de una secuencia de mayor tamaño. Por ejemplo, la porción 5’ de un promotor hasta la caja TATA cerca del sitio de inicio de transcripción se puede borrar sin eliminar la actividad de promotor, tal como describen Opsahl-Sorteberg, H-G. et al., "Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression" Gene 341: 4958 (2004). Dichas variantes deberían retener la actividad de promotor, particularmente la capacidad para dirigir la expresión en tejidos masculinos. La actividad se puede medir mediante análisis Northern blot, mediciones de actividad de informador cuando se usan fusiones transcripcionales, y otros similares. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Se pueden obtener fragmentos funcionales mediante el uso de enzimas de restricción para romper las secuencias de nucleótidos de elementos reguladores descritas en la presente memoria; sintetizando una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia de ADN natural; o pueden obtenerse a través del uso de tecnología PCR. Véase particularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York).

Las secuencias que se hibridan con las secuencias reguladoras de la presente invención se encuentran dentro del alcance de la invención. Las secuencias que corresponden a las secuencias promotoras de la presente invención y se hibridan con las secuencias promotoras descritas en la presente memoria serán al menos un 50% homólogas, un 70% homólogas, e incluso un 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homólogas o más con respecto a la secuencia reguladora nativa.

Se pueden aislar secuencias promotoras procedentes de otras plantas de acuerdo a técnicas bien conocidas en base a su homología de secuencia con respecto a la secuencia promotora establecida en la presente memoria. En estas técnicas, se usa toda o parte de la secuencia promotora como sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado (es decir, bibliotecas genómicas) procedente de un organismo seleccionado. Los métodos de hibridación de secuencias de ácido nucleico se encuentran fácilmente en la técnica.

La secuencia promotora entera o sus porciones se pueden usar como una sonda capaz de hibridarse específicamente con las correspondientes secuencias promotoras. Para alcanzar una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y que preferiblemente tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar las correspondientes secuencias promotoras procedentes de un organismo seleccionado mediante un proceso bien conocido de reacción en cadena de polimerasa (PCR, del inglés “polymerase chain reaction”). Esta técnica puede usarse para aislar secuencias promotoras adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia promotora en un organismo. Los ejemplos incluyen el escrutinio de hibridación de bibliotecas de ADN en placa (tanto placas como colonias; véase p.ej. Innis et al., eds., (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press).

Adicionalmente, puede ligarse un promotor de la presente descripción con las secuencias de nucleótidos para expresar otras secuencias de nucleótidos heterólogas. La secuencia de nucleótidos para el promotor de la descripción, así como los fragmentos y variantes de la misma, pueden proporcionarse en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótidos heterólogas para expresión en la planta de interés, más particularmente en el tejido

masculino de la planta. Dicha casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para inserción de la secuencia de nucleótidos para estar bajo la regulación transcripcional del promotor. Estas casetes de expresión son útiles en la manipulación genética de cualquier planta para alcanzar una respuesta fenotípica deseada.

El rango de promotores compatibles vegetales disponibles incluye promotores específicos de tejido e inducibles. Un elemento regulador inducible es aquel capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor las secuencias de ADN o los genes no serán trascritos. Habitualmente el factor proteínico que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la trascripción está presente en una forma inactiva que a continuación es convertida directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, un metabolito, un regulador del crecimiento, un herbicida o un compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente mediante calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o un agente de enfermedad tal como un virus. Se puede exponer una célula vegetal que contenga un elemento regulador inducible a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta mediante pulverización, riego, aplicación de calor o métodos similares.

Se pueden utilizar promotores preferidos de tejido para dirigir una transcripción y/o expresión potenciadas dentro de un tejido vegetal particular.

Los promotores son aquellos que expresan preferentemente al tejido masculino de la planta. La invención no requiere el uso de ningún promotor particular preferido de tejido masculino en el proceso, y se puede emplear cualquiera de los muchos promotores de este tipo conocidos por el especialista en la técnica. El promotor nativo Ms26 descrito en la presente memoria es un ejemplo de promotor útil. Otro promotor de este tipo es el promotor 5126, que dirige preferencialmente la expresión del gen al cual está ligado al tejido masculino de las plantas, tal como se describe en las Patentes de EE.UU. nº 5.837.851 y 5.689.051. Otros ejemplos incluyen el promotor Ms45 descrito en la Patente de EE.UU. nº 6.037.523; el promotor SF3 descrito en la Patente de EE.UU. nº 6.452.069; el promotor BS92-7 descrito en WO 02/063021; un elemento regulador SGB6 descrito en la Patente de EE.UU. nº 5.470.359; el promotor TA29 (Koltunow et al. (1990) "Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2: 1201-1224; Goldberg, R. B., Beals, T. P. y Sanders, P. M., (1993) "Anther development: basic principles and practical applications" Plant Cell 5: 1217-1229; y la Patente de EE.UU. nº 6.399.856); el promotor génico de tipo metalotioneína de tipo 2 (Charbonnel-Campaa et al., Gene (2000) 254: 199208); y el promotor Bca9 de Brassica (Lee et al., Plant Cell Rep. (2003) 22: 268-273).

Los promotores preferidos de gametos masculinos incluyen el promotor PG47, ver anterior, así como el promotor ZM13 (Hamilton et al., Plant Mol. Biol. (1998) 38: 663-669); promotores de factor despolimerizante de actina (tal como Zmabp1, Zmabp2; ver por ejemplo Lopez et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 7415-7420); el promotor del gen de pectina de tipo metilesterasa de maíz, ZmC5 (Wakeley et al. Plant Mol. Biol. (1998) 37: 187-192); el promotor génico de perfilado Zmpro1 (Kovar et al., The Plant Cell (2000) 12: 583-598); el gen de fitosulfoquina de pentapéptido sulfatado ZmPSK1 (Lorbiecke et al., Journal of Experimental Botany (2005) 56(417): 1805-1819); el promotor de la proteína de unión a calmodulina Mpcbp (Reddy et al. J. Biol. Chem. (2000) 275(45): 35457-70).

Se pueden incluir otros componentes del vector, también dependiendo del uso pretendido para el gen. Los ejemplos incluyen marcadores seleccionables, secuencias dirigidas o reguladoras, secuencias estabilizadoras o líderes, intrones, etc. Las descripciones y los ejemplos generales de vectores de expresión vegetales y de genes informadores se pueden encontrar en Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" en Method in Plant Molecular Biology-and Biotechnology, Glick et al editores; CRC Press pág. 89-119 (1993). La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del hospedante y del método de introducción del vector de expresión en el hospedante. La casete de expresión también incluirá en el extremo 3’ de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con respecto a la secuencia de nucleótidos del promotor de la presente invención, puede ser nativa con respecto a la secuencia de ADN de interés, o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes se encuentran disponibles en el plásmido-Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y de nopalina sintasa. Ver también, Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262: 141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64: 671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5: 141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2: 12611272 (1990); Munroe et al. Gene 91: 151-158 (1990); Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639 (1987).

Las casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5’. Dichas secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. En la técnica se conocen líderes de traducción e incluyen a modo de ejemplo, líderes de picornavirus, líder EMCV (región no codificadora 5’ de encefalomiocarditis), Elroy-Stein et al. Proc. Nat Acad. Sci. USA 86: 6126-6130 (1989); líderes de potivirus, por ejemplo, líder TEV (Virus del Grabado de Tabaco, del inglés “Tobacco Etch Virus”), Allison et al.; líder MDMV (Virus de Mosaico Enano de Maíz, del inglés “Maize Dwarf Mosaic Virus), Virology 154: 9-20 (1986); proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), Macejak et al. Nature 353: 90-94 (1991); líder no traducido procedente de ARNm de proteína de cobertura del virus de mosaico de alfalfa (ARN 4 de AMV), Jobling et al. Nature 325: 622-625 (1987); líder de virus de mosaico de tabaco (TMV, del inglés “Tobacco mosaic virus”), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; y

líder de virus moteado clorótico de maíz (MCMV, del inglés “maize chlorotic mottle virus”) Lommel et al. Virology 81: 382-385 (1991). Véase también Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84: 965-968 (1987). La casete también puede contener secuencias que potencien la traducción y/o la estabilidad de ARNm, tal como intrones.

En los casos en los que es deseable tener el producto expresaba de la secuencia de nucleótidos heteróloga dirigida a un orgánulo concreto, particularmente el plástido, amiloplasto o el retículo endoplásmico, o secretada en la superficie celular o extracelularmente, la casete de expresión puede comprender además una secuencia codificadora para un péptido transitorio. Dichos péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, el péptido de tránsito para la proteína portadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, sintasa EPSP vegetal, péptido de tránsito de cloroplasto frágil 1 de Zea mays (Nelson et al. Plant physiol 117(4): 1235-1252 (1998); Sullivan et al. Plant Cell 3(12): 1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3): 477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26): 18999-9004) y otros similares. El especialista en la técnica apreciará fácilmente las múltiples opciones disponibles para expresar un producto en un orgánulo particular. Por ejemplo, la secuencia de alfa amilasa de la cebada se usa a menudo para dirigir la expresión al retículo endoplásmico (Rogers, J. Biol. Chem.

260: 3731-3738 (1985)). El uso de péptidos de tránsito es bien conocido (p.ej., véanse las Patentes de EE.UU. nº 5.717.084; 5.728.925).

Al preparar la casete de expresión se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN de tal modo que se proporcionen las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o ligandos para unir los fragmentos de ADN, o se pueden implicar otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, la eliminación de ADN superfluo, la eliminación de sitios de restricción, u otros similares. Con este propósito, se pueden implicar la mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, maduración y resustituciones, tal como transiciones y transversiones.

Tal como se indica en la presente memoria, la presente descripción proporciona vectores capaces de expresar genes de interés. En general, los vectores deberían ser funcionales en células vegetales. A veces, puede ser preferible tener vectores que sean funcionales en E. coli (p.ej., producción de proteína para activar anticuerpos, análisis de secuencia de ADN, construcción de injertos, obtención de cantidades de ácidos nucleicos). Los vectores y los procedimientos para clonar y expresar en E. coli se discuten en Sambrook et al. (ver anterior).

El vector de transformación que comprende la secuencia promotora de la presente descripción ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga en una casete de expresión, también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen que va a ser co-transformado en el organismo. Alternativamente, la(s) secuencia(s) adicional(es) se puede(n) proporcionar sobre otro vector de transformación.

Los genes indicadores pueden incluirse en los vectores de transformación. Los ejemplos de genes indicadores adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar, por ejemplo, en Jefferson et al. (1991) en “Plant Molecular Biology Manual”, editores Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pág. 1-33; DeWet et al. Mol. Cell. Biol. 7: 725737 (1987); Goff et al. EMBO J. 9: 2517-2522 (1990); Kain et al. BioTechniques 19: 650-655 (1995); y Chiu et al. Current Biology 6: 325-330 (1996).

Los genes indicadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados se pueden incluir en los vectores de transformación. Éstos pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, aunque sin limitación, genes que codifican resistencia a cloranfenicol, Herrera Estrella et al. EMBO J. 2: 987-992(1983); metotrexato, Herrera Estrella et al. Nature 303: 209-213(1983); Meijer et al. Plant Mol. Biol. 16: 807-820 (1991); higromicina, Waldron et al. Plant Mol. Biol. 5: 103-108 (1985), Zhijian et al. Plant Science 108: 219-227 (1995); estreptomicina, Jones et al. Mol. Gen. Genet. 210: 86-91(1987); espectinomicina, Bretagne-Sagnard et al. Transgenic Res. 5: 131-137 (1996); bleomipina, Hille et al. Plant Mol. Biol. 7: 171-176 (1990); sulfonamida, Guerineau et al. Plant Mol. Biol. 15: 127-136 (1990); bromoxinil, Stalker et al. Science 242: 419-423 (1988); glifosato, Shaw et al. Science 233: 478-481(1986); y fosfinotricina, DeBlock et al. EMBO J. 6: 2513-2518 (1987).

También se pueden emplear marcadores escrutables o puntuables, en los que la presencia de la secuencia produce un producto mensurable. Los ejemplos incluye una β-glucuronidasa, o gen uidA (GUS), que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, Patentes de EE.UU. nº 5.268.463 y 5.599.670); cloranfenicol acetil transferasa (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 nº 13 pág. 3901-3907); y fosfatasa alcalina. Otros marcadores escrutables incluyen los genes antocianina/flavonoide en general (Véase la discusión en Taylor y Briggs, The Plant Cell (1990) 2: 115-127) que incluyen, por ejemplo, un gen R-locus, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales ((Dellaporta et al., en Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels y Gustafson editores, pág. 263-282 (1988)); los genes que controlan la biosíntesis de pigmentos flavonoides, tal como el gen C1 de maíz (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242: 40-48) y el C2 de maíz (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203: 202-207); el gen B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1: 1175-1183), el gen p1 (Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88: 4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76: 543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999) 39: 11-19); los genes de locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119: 185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2 (11): 1039-1049), entre otros. Otros ejemplos adicionales de marcadores

adecuados incluyen el gen de proteína fluorescente cian (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), el gen de proteína fluorescente amarilla (PhiYFPTM de Evrogen; ver Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); un gen lux, que codifica una luciferasa, cuya presencia puede detectarse usando, por ejemplo, película de rayos X, conteo de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de baja luz, cámaras de conteo de fotones o luminometría multipocillo (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8: 343); un gen de proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5): 777-84); y DsRed2 donde las células vegetales transformadas con el gen marcador son de color rojo, y por tanto detectables visualmente (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2): 286-293). Ejemplos adicionales incluyen un gen de p-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75: 3737), que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (p.ej., PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. (1983)

80: 1101), que codifica una catecol desoxigenasa que puede convertir catecoles cromogénica; un gen de α-amilasa (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8: 241); y un gen de tirosinasa (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129: 2703), que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez condensa para formar el compuesto de melanina fácilmente detectable. Claramente, el especialista en la técnica dispone de muchos de dichos marcadores.

El método de transformación/transfección no es crítico para la presente descripción; actualmente se dispone de varios métodos de transformación o transfección. Según se vaya disponiendo de nuevos métodos para transformar cultivos u otras células hospedantes, se pueden aplicar directamente, Por consiguiente, se han desarrollado una amplia variedad de métodos para insertar una secuencia de ADN en el genoma de una célula hospedante para obtener la transcripción o tránscrito y la traducción de la secuencia para efectuar cambios fenotípicos en el organismo. Por tanto, se puede emplear cualquier método que proporcione una transformación/transfección eficiente.

Los métodos para introducir vectores de expresión en tejido vegetal disponibles para el especialista en la técnica varían y dependerán de la planta seleccionada. Los procedimientos para transformar una amplia variedad de especies vegetales son bien conocidos y se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Miki et al, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biotechnology, ver anterior; Klein et al, Bio/Technology 10: 268 (1992); y Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Por ejemplo, la construcción de ADN puede introducirse en el ADN genómico de la célula vegetal usando técnicas tales como la administración mediada por microproyectiles, Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); electroporación, Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985); precipitación en polietilen glicol (PEG), Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); transferencia génica directa WO 85/01856 y EP nº 0 275 069; transformación de protoplastos in vitro, Patente de EE.UU. nº 4.684.611; y microinyección de protoplastos de célula vegetal o callos embriogénicos, Crossway, Mol. Gen. Genetics 202: 179-185 (1985). Otra opción es el co-cultivo de tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, donde las construcciones de ADN se colocan en un sistema de vector binario. Véase, p.ej., Patente de EE.UU. nº 5.591.616; Ishida et al., "High Efficiency Transformation of Maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens" Nature Biotechnology 14: 745-750 (1996). Las funciones de virulencia del hospedante de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción en el ADN de la célula vegetal cuando la célula está infectada por la bacteria. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984), y Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983).

Los métodos estándares para la transformación de canola se describen en Moloney et al. "High Efficiency Transformation of Brassica napus using Agrobacterium Vectors" Plant Cell Reports 8: 238-242 (1989). La transformación de maíz se describe en Fromm et al, Bio/Technology 8: 833 (1990) y en Gordon-Kamm et al, ver anterior. En dicotiledóneas se usa principalmente Agrobacterium, pero ciertas monocotiledóneas tal como el maíz pueden ser transformadas por Agrobacterium. Véase anterior y la Patente de EE.UU. nº 5.550.318. La transformación de arroz se describe en Hiei et al., "Efficient Transformation of Rice (Oryza sativs L.) Mediated by Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA" The Plant Journal 6(2): 271-282 (1994), Christou et al, Trends in Biotechnology 10: 239 (1992) y Lee et al, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991). El trigo puede transformarse mediante técnicas similares a las usadas para transformar maíz o arroz. La transformación de sorgo se describe en Casas et al., ver anterior, y el sorgo por Wan et al, Plant Physicol. 104: 37 (1994). La transformación de soja se describe en una serie de publicaciones, que incluye la Patente de EE.UU. nº

5.015.580.

Cuando se habla de “introducción” de la secuencia de nucleótidos en una planta, se entiende que ésta puede producirse mediante métodos de transformación directa, tal como transformación de Agrobacterium de tejido vegetal, bombardeo de microproyectiles, electroporación, o uno cualquiera de los muchos métodos conocidos por el especialista en la técnica; o, puede darse mediante cruce de una planta que tenga la secuencia de nucleótidos heteróloga con otra planta de tal modo que la progenie tenga la secuencia de nucleótidos incorporada en su genoma. Dichas técnicas de cultivo son bien conocidas por el especialista en la técnica.

Los métodos de cultivo de plantas usados en la presente memoria son bien conocidos por el especialista en la técnica. Para una discusión de técnicas de cultivo de plantas, véase Poehlman (1987) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn. Muchas de las plantas que serían más preferidas en este método se cultivan mediante técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta.

Se pueden usar métodos de retrocruce para introducir un gen en las plantas. Esta técnica se ha usado durante décadas para introducir rasgos en una planta. Un ejemplo de una descripción de ésta y otras metodologías de cultivo de plantas que son bien conocidos se pueden encontrar en referencias tales como Plant Breeding Methodology, editor Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). En un protocolo típico de retrocruce, la variedad original de interés (precursor recurrente) se cruza con una segunda variedad (precursor no recurrente) que porta el gen individual de interés para ser transferido. La progenie resultante de dicho cruce se cruza a continuación con el precursor recurrente y el proceso se repite hasta que se obtiene una planta en la que esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas del precursor recurrente se han recuperado en la planta convertida, además del gen individual transferido procedente del precursor no recurrente.

En determinadas situaciones, es deseable mantener la condición recesiva homocigota estéril masculina de una planta estéril masculina, cuando se usa una estrategia de restauración transgénica, a la vez que se disminuye el número de plantas, plantaciones y etapas necesarias para el mantenimiento de una planta con dichos rasgos. La homocigosidad es una condición genética que existe cuando alelos idénticos residen en las correspondientes localizaciones en cromosomas homólogos. La heterocigosidad es una condición genética que existe cuando alelos diferentes residen en las correspondientes localizaciones de cromosomas homólogos. La hemicigosidad es una condición genética que existe cuando hay solo una copia de un gen (o conjunto de genes) sin contrapartida alélica en el cromosoma hermano. En una realización, la condición recesiva homocigota da como resultado que se confiere a la planta un rasgo de interés, que puede ser cualquier rasgo deseado y que es el resultado del genotipo recesivo, tal como una tolerancia incrementada a la sequía o al frío, una madurez temprana, un cambio del contenido de aceite o de proteínas, o cualquiera de una multitud de los muchos rasgos de interés para los cultivadores de plantas. La condición recesiva homocigota puede conferir esterilidad masculina a la planta. Cuando la secuencia que es el complemento funcional de la condición homocigota se introduce en la planta (es decir, una secuencia que, cuando se introduce y se expresa en la planta que tiene la condición recesiva homocigota, restaura la condición natural), la fertilidad se restaura en virtud de la restauración del fenotipo fértil natural.

El mantenimiento de la condición recesiva homocigota se logra introduciendo una construcción transgénica de restauración en una planta que está ligada a una secuencia que interfiere con la función o la formación de gametos masculinos de la planta para crear una planta mantenedora o donante. El transgén de restauración, tras ser introducido en una planta que es homocigota recesiva para el rasgo genético, restaura la función genética de dicho rasgo, con la planta produciendo únicamente polen viable que contiene una copia del alelo recesivo pero que no contiene el transgén de restauración. El transgén se mantiene en el estado hemicigoto en la planta de mantenimiento. Con transgén, se pretende indicar cualquier secuencia de ácido nucleico que es introducida en el genoma de una célula mediante técnicas de ingeniería genética. Un transgén puede ser una secuencia de ADN nativa, o una secuencia de ADN heteróloga (es decir “ADN extraño”). El término secuencia de ADN nativa se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra de forma natural en la célula pero que puede haber sido modificado desde su forma original. El polen procedente del mantenedor puede usarse para fertilizar plantas que son homocigotas para el rasgo recesivo, y la progenie, por tanto, retendrá su condición homocigota recesiva. La planta mantenedora que contiene la construcción de transgén restaurador se propaga mediante auto-fertilización, usándose las semillas resultantes para producir plantas adicionales que son plantas homocigotas recesivas y que contienen la construcción transgénica.

La planta mantenedora actúa como un donante de polen para la planta que tiene el rasgo homocigoto recesivo. El mantenedor se produce de forma óptima a partir de una planta que tiene el rasgo homocigoto recesivo y que también tiene secuencias de nucleótidos introducidas que restaurarían el rasgo creado por los alelos homocigotos recesivos. Adicionalmente, la secuencia de restauración está ligada a secuencias de nucleótidos que interfieren con la función o la formación de gametos masculinos. El gen puede operar para prevenir la formación de gametos masculinos o para prevenir la función de los gametos masculinos.

En esta invención se usa un gen de α-amilasa con un promotor preferido de tejido masculino. Durante el periodo inicial de germinación de semillas de cereales, las células de la capa aleurona sintetizarán α-amilasa, que participa en la hidrólisis de almidón para formar glucosa y maltosa, de tal modo que se proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento del germen (J. C. Rogers y C. Milliman, J. Biol. Chem., 259 (19): 12234-12240, 1984; Rogers, J. C., J. Biol. Chem., 260: 3731-3738, 1985). El gen de α-amilasa usado puede ser el gen de α-amilasa-1 de Zea mays. (Young et al. "Cloning of an α-amylase cDNA from aleurone tissue of germinating maize seed" Plant Physiol. 105(2) 759-760 y Nº de Acceso del GenBank L25805, GI:426481). Las secuencias que codifican α-amilasa no se encuentran habitualmente en células de polen, y cuando la expresión está dirigida a tejido masculino, el resultado es una ruptura de la fuente de energía de los granos de polen, y una represión del desarrollo de polen.

El especialista en esta área apreciará con facilidad que los métodos descritos en la presente memoria son aplicables a cualesquier otros cultivos que tengan potencial para el cruce externo. A modo de ejemplo, aunque sin limitación, puede incluir maíz, soja, sorgo o cualquier planta con capacidad para el cruce externo.

De forma ordinaria, para producir más plantas que tengan la condición recesiva, uno podría cruzar la planta recesiva con otra planta recesiva. Esto puede no ser deseable para algunos rasgos recesivos y puede ser imposible para rasgos recesivos que afecten al desarrollo reproductivo. Alternativamente, uno podría cruzar la planta homocigota con una segunda planta que tenga el gen de restauración, pero esto requiere cruzar adicionalmente para segregar el

gen de restauración para de nuevo alcanzar el estado fenotípico recesivo. En su lugar, en un proceso se puede mantener la condición recesiva homocigota, a la vez que cruzarla con la planta mantenedora. Este método puede usarse con cualquier situación en la que se desee continuar la condición recesiva. Esto da como resultado un sistema eficiente económicamente que es relativamente fácil de operar para mantener una población de plantas recesivas homocigotas.

A continuación se proporciona una descripción más detallada a modo de instrucción e ilustración, y que no pretende limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1

Identificación y Co-segregación de ms26-m2::Mu8

Se identificaron familias de plantas procedentes de una población mutadora (Mu) que se segregaron de plantas que eran principalmente estériles masculinas, con ninguna antera anormal extruida o con tan solo unas pocas, ninguna de las cuales tenía presente polen. Se espera que la esterilidad masculina surja en los casos en los que el elemento Mu se ha integrado aleatoriamente en un gen responsable de alguna etapa en la microesporogénesis, alterando su expresión. Las plantas procedentes de una familia F2 segregante en la que una mutación estéril masculina se designó ms26*-SBMu200, fueron cultivadas y clasificadas para fertilidad/esterilidad masculina en base a los anteriores criterios. Se tomaron muestras de hojas y se aisló posteriormente ADN en aproximadamente 20 plantas por clasificación fenotípica, que es la fertilidad masculina frente a la esterilidad masculina.

Se llevó a cabo un análisis Southern para confirmar la asociación de Mu con la esterilidad. El análisis Southern es una técnica bien conocida por los especialistas en la técnica. Este procedimiento común implica aislar el ADN de la planta, cortar con endonucleasas de restricción, fraccionar el ADN cortado por peso molecular sobre un gel de agarosa, y transferir a membranas de nylon para arreglar el ADN separado. Estas membranas son hibridadas posteriormente con un fragmento de sonda que está marcado radiactivamente con P32P-dCTP, y lavadas en una disolución de SDS. Southern, E., "Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments by Gel Electrophoresis,"

J. Mol. Biol. 98: 503-317 (1975). Se cultivaron y clasificaron plantas de una familia F2 segregante ms26*-SBMu200 para fertilidad/esterilidad masculina. Se llevó a cabo la toma de muestras de hojas y posterior aislamiento de ADN en aproximadamente 20 plantas por clasificación fenotípica. Se digirió ADN (~7ug) procedente de 5 plantas fértiles y 12 estériles con EcoRI y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,75%. El ADN digerido fue transferido a membrana de nylon a través de transferencia Southern. La membrana fue hibridada con un fragmento interno del transposón Mu8. Una autorradiografía de la membrana reveló la co-segregación de un fragmento de EcoRI de aproximadamente 5,6 Kb con el fenotipo de esterilidad como se muestra en la Figura 1. Esta banda de EcoRI se segregó en las plantas fértiles, lo que sugiere una condición natural heterocigota para el alelo.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2

Construcción de biblioteca, escrutinio y mapeado

El proceso de escrutinios de biblioteca genómica es conocido comúnmente entre los especialistas en la técnica y se describe en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY (1989). Las bibliotecas se crearon como se indica a continuación.

Se digirió ADN procedente de plantas estériles con EcoRI y se corrió sobre un gel preparativo. Se escindió del gel el ADN con un peso molecular entre 5,0 y 6,0 Kb, se electroeluyó y se precipitó en etanol. Dicho ADN fue ligado en el vector Lambda Zap (StratageneTM) usando el protocolo del fabricante. El ADN ligado fue empaquetado en partículas de fagos usando Gigapack Gold (StratageneTM). Se llevaron a placa aproximadamente 500.000 PFU y se elevaron sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas se hibridaron con la sonda Mu8. Se obtuvo un clon puro tras 3 rondas de escrutinio. El inserto se escindió del fago como un plásmido y se designó SBMu200-3.1. Un fragmento de borde PstI de este clon se aisló y se usó para resondear la mancha de co-segregación de EcoRI original tal como se muestra en la Figura 2B. El fragmento de EcoRI de 5,6 kb es homocigoto en todas las plantas estériles, lo que confirma que se aisló el fragmento Mu correcto. Tres de las plantas fértiles son heterocigotas para la banda de EcoRI de 5,5 kb y una banda de EcoRI de 4,3 Kb. Dos de las plantas fértiles son homocigotas para la banda de EcoRI de 4,3 kb, presumiblemente el alelo natural.

La sonda PstI se usó para mapear la mutación ms*-SBMu200 en una población de mapeo RFLP. El mutante mapeado en el brazo corto de cromosoma 1, cerca de la localización de estéril masculino, Ms26 (Loukides et al., (1995) Amer. J. Bot 82, 1017-1023). Para evaluar si el ms*-SBMu200 es un alelo de ms26-ref, se cruzó ms*-SBMu200 y ms26-ref uno con otro usando un heterocigoto conocido como donante de polen. La progenie del ensayo de cruce segregó plantas estériles masculinas y naturales en una proporción 1:1, que indica alelismo entre ms*-SBMu200 y ms26-ref. El alelo ms*-SBMu200 se designó ms26-m2::Mu8. La localización de mapa se muestra en la Figura 13.

EJEMPLO DE REFERENCIA 3

Identificación y clonación de alelos ms26 adicionales

Se identificó una mutación de inserción Mu adicional de Ms26 usando un cebador de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para Mu y un cebador específico de gen para Ms26 y escrutando una población de familias F1 de Mu. Los análisis de secuencia de los productos de PCR mostraron que las tres inserciones Mu se producían en el segundo exón (Figura 1). Las semillas F2 de una de dichas familias fueron cultivadas y examinadas para fertilidad/esterilidad masculina. Los análisis de Southern blot de esta familia confirmaron la co-segregación de la inserción Mu en Ms26 con el fenotipo estéril masculino y el alelo se designó ms26-m3::Mu.

El alelo ms26 descrito en Loukides et al., (1995) Amer. J. Bot 82, 1017-1023 y designado ms26ref también fue investigado. Para analizar la mutación en ms26-ref, se clonaron secuencias genómicas Ms26 procedentes de plantas estériles y fértiles ms26-ref. Se clonó Ms26 como un fragmento EcoRI de -4,2 kb y se clonó ms26-ref como un fragmento HindII de -6 kb y un fragmento EcoRI de -2,3 kb solapante de la planta estéril. El análisis reveló la presencia de un nuevo segmento (1430 pb) en el último exón del alelo ms26-ref mostrado en la Figura 1. Se encontró una duplicación de sitio hospedante de 8 pb (GCCGGAGC) que flanquea el elemento insertado y el elemento también contiene una repetición invertida terminal de 15 pb (TIR) (TAGGGGTGAAAACGG; SEQ ID NO: 23). La secuencia de transposón se muestra en la Figura 15 (SEQ ID NO: 10). La secuencia genómica ms26-ref entera se muestra en la Figura 16, SEQ ID NO: 11. También se encontró una variante del alelo ms26-ref. Se encontró que el análisis de secuencia de este alelo, designado my26’-0406 había perdido el segmento de 1430 pb observado en el último exón del alelo ms26-ref pero dejó una huella de 8 pb en el sitio de inserción. Las plantas homocigotas para el alelo ms26’-0406 eran estériles masculinas. Una comparación del alelo de escisión, ms26’-0406 (SEQ ID NO: 8) con la región del gen natural Ms26 (SEQ ID NO: 9) se muestra en la Figura 14.

EJEMPLO DE REFERENCIA 4

Análisis de expresión y aislamiento de ADNc

El análisis Northern se puede usar para detectar la expresión de genes característicos del desarrollo de anteras en varios estados de microesporogénesis. El análisis Northern también es una técnica usada habitualmente por los especialistas en la técnica y es similar al análisis Southern excepto en que se aísla ARNm en lugar de ADN y se lleva a un gel. A continuación el ARN se hibrida con la sonda marcada. Potter, E., et al., "Thyrotrotropin Releasing Hormone Exerts Rapid Nuclear Effects to Increase Production of the Primary Prolactin in RNA Transcript," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 6662-6666 (1981), Lechelt, et al., "Isolation & Molecular Analysis of the Plows," Mol. Gen. Genet.

219: 225-234 (1989). El fragmento Pstl procedente del clon SBMu200-3.1 se usó como sonda en un Northern blot que contiene ARN de grano, mazorca inmadura, planta de semillero y panoja. Se observó una señal solo en el ARN de panoja aproximadamente en el estadio de cuartete de la microesporogénesis, tal como refleja la Figura 3. El tránscrito tiene aproximadamente 2,3 kb de longitud. También se usó la misma sonda para escrutar una biblioteca de ADNc construida a partir de ARNm aislado de anteras de estadio meiótico a uninucleado tardío. A partir de la biblioteca se aisló un clon, designado Ms26-8.1.

EJEMPLO DE REFERENCIA 5

Análisis de secuencia y de expresión

El clon genómico SBMu200-3.1 y el clon de ADNc Ms26-8.1 fueron secuenciados por Loftstrand Labs Limited. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson A.R. (1977) "DNA sequencing with chain terminating inhibitors" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. Las secuencias se fijan en las Figura 4 y 5 y la comparación se muestra en la Figura 6. La comparación ADNc/genómica revela que hay cinco intrones presentes en el clon genómico. La inserción de Mu8 se produce en el exón 1. La evaluación de la preferencia de codón y la no-aleatoriedad en la tercera posición de cada codón fue consistente con que el ORF principal del ADNc probablemente es el ORF que codifica proteína. Existe un codón de inicio Met putativo en la posición 1089 en el clon genómico. La homología de ADNc con respecto al clon genómico empieza en el nucleótido 1094. Por tanto, Ms26-8.1 no representa en un clon de longitud completa y carece de 5 bases hasta el codón de inicio Met putativo. Una búsqueda en base de datos reveló una homología significativa con las enzimas P450 encontradas en levadura, plantas y mamíferos. Las enzimas P450 han sido estudiadas ampliamente y se han elucidado tres dominios proteínicos característicos. La proteína Ms26 contiene varios motivos estructurales característicos de P450’s ecuarióticas, que incluyen el dominio de heme-unión FxxGxRxCxG (dominio D; SEQ ID NO: 24), dominio A A/GGXD/ETT/S (unión de di oxígeno), dominio B (unión de esteroide) y dominio C. El motivo de unión heme altamente conservado se observó en Ms26 como FQAGPRICLG (SEQ ID NO: 25), a 51 aminoácidos del extremo C. El dominio de unión a dioxígeno AGRDTT (SEQ ID NO: 26) fue localizado entre los aminoácidos 320-325. El dominio de unión a esteroide se encontró como LVYLHACVTETLR (SEQ ID NO: 27), aminoácidos 397-409. La secuencia homóloga más significativa detectada en la base de datos Genebank es una secuencia de proteína deducida a partir de arroz (número de acceso GeneBank 19071651). La segunda secuencia de mayor homología es un gen putativo P450 de Arabidopsis (CYP704B1) cuya función también es desconocida. La Figura 17A muestra un alineamiento de secuencia entre CYP704B1 (SEQ ID NO: 12) y Ms26 (SEQ ID NO: 13). El análisis de árbol filogenético de algunos genes P450 reveló que el Ms26 está relacionado más estrechamente a P450s implicados en la hidroxilación de ácidos grasos omega observada en Arabidopsis thaliana y Vicia sativa (Figura 17B). Se cree que el cambio de marco traduccional provocó en la mutación de escisión ms26’

0406 destruye la actividad del dominio de unión heme, dando así como resultado la esterilidad. Véase la comparación en la Figura 18 (ADNc de Ms26 en la SEQ ID NO: 14; región 5 de exón fértil en la SEQ ID NO: 15 y región 5 de exón estéril en la SEQ ID NO: 16).

Se realizaron estudios de expresión adicionales usando la sonda de ADNc Ms26 contra un Northern que contenía ARNm en las etapas discretas de la microesporogénesis. La Figura 7A muestra un Northern blot con muestras de ARN de diferentes tejidos que incluyen raíz (1), hoja (2), cáscara (3), mazorca (4), espiquelete de mazorca (5), pelillos (6), embrión inmaduro (7), embrión maduro (8) y panoja procedentes de, planta fértil (9), planta estéril ms26m2::Mu8 (10), planta estéril ms26-ref (11) y planta fértil (12). Se detectó una señal de hibridación usando ADNc de Ms26 solo en tejidos de panoja. La Figura 7B muestra un Northern blot que contiene ARNm en etapas discretas de la microesporogénesis. Se detectaron señales de hibridación usando ADNc de Ms26 entre la etapa de meiosis II/ cuartete (4) y la etapa uninucleada tardía (10), observándose la máxima señal entre la etapa uninucleada temprana y la etapa uninucleada tardía (10).

EJEMPLO DE REFERENCIA 6

Identificación de promotor y sus regiones esenciales

Se puede identificar una caja TATA putativa mediante análisis de extensión de cebador como se describe en “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel, F.M. et al. editores; John Wiley and Sons, Nueva York pág.4.8.1

4.8.5 (1987).

Se pueden identificar regiones reguladoras de genes de antera, tal como promotores, en subclones genómicos usando análisis funcional, normalmente verificado mediante la observación de expresión de gen indicador en tejido de antera y un menor nivel o ausencia de expresión de gen indicador en tejido que no sea de antera. La posibilidad de las regiones reguladoras que residen “por encima” o en dirección 5’ del sitio de inicio traduccional puede evaluarse subclonando un fragmento de ADN que contiene la región por encima en vectores de expresión para experimentos de expresión transitoria. Es de esperar que fragmentos subgenómicos más pequeños puedan contener las regiones esenciales para la expresión preferida de tejido masculino. Por ejemplo, las regiones esenciales de los promotores CaMV 19S y 35S han sido identificadas en fragmentos relativamente pequeños derivados de piezas genómicas más grandes, tal como se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.352.605.

La selección de un vector de expresión apropiado con el que evaluar la expresión funcional dependerá del hospedante y del método de introducción del vector de expresión en el hospedante, y dichos métodos son bien conocidos por el especialista en la técnica. Para eucariontes, las regiones del vector incluyen regiones que controlan el inicio de la transcripción y que controlan el procesamiento. Dichas regiones están ligadas operativamente a un gen informador tal como UidA, que codifica glucuronidasa (GUS) o luciferasa. Las descripciones generales y los ejemplos de vectores de expresión y de genes informadores vegetales se pueden encontrar en Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. editores; CRC Press; pág. 89-119; (1993). Los vectores de expresión GUS y las casetes génicas GUS se encuentran disponibles comercialmente en Clonetech, Palo Alto, CA, mientras que los vectores de expresión de luciferasa y las casetes génicas de luciferasa se encuentran disponibles en Promega Corporation, Madison, WI. En Ishida, Y., et al., Nature Biotechnology; Vol. 14; pág. 745-750; (1996) y en la Patente de EE.UU. nº 5.591.616 "Method for Transforming Monocotyledons" (1994), se describen plásmidos Ti y otros vectores de Agrobacterium.

Se pueden introducir vectores de expresión que contienen regiones reguladoras putativas localizadas en fragmentos genómicos en tejidos intactos tales como anteras de etapas, embriones o en callos. Los métodos de administración de ADN incluyen el bombardeo de microproyectiles, la inyección de ADN, la electroporación y la transferencia génica mediada por Agrobacterium (véase Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation," en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, et al. editores; CRC Press; (1993); la Patente de EE.UU. nº 5.591.616; e Ishida, Y., et al., Nature Biotechnology; Vol. 14; pág. 745-750; (1996)). Los métodos generales de cultivo de tejidos vegetales se encuentran en Gruber, et al., ver anterior, y en Glick, ver anterior.

Para el sistema de ensayo transitorio, anteras de etapas aisladas son colocadas inmediatamente sobre un medio de cultivo de panoja (Pareddy, D.R. y J.F. Petelino, Crop Sci. J.; Vol. 29; pág. 1564-1566; (1989)) solidificado con un 0,5% de Phytagel (Sigma, St. Louis) u otro medio solidificante. El ADN vector de expresión es introducido en 5 horas preferiblemente mediante administración mediada por microproyectiles con partículas de 1,2 µm a 1000 – 1100 Psi (68 – 75 bar). Tras la administración de ADN, las anteras son incubadas a 26ºC sobre el mismo medio de cultivo de panoja durante 17 horas y se analizan preparando un homogenato de tejido completo y evaluando la actividad de GUS o de luciferasa (véase Gruber, et al., ver anterior).

Por encima del codón de inicio traduccional probable de Ms26, 1088 pb de ADN estaban presentes en el clon genómico ms26-m2::Mu8. Se generaron fusiones traduccionales vía un sitio NcoI modificado con genes informadores que codifican luciferasa y β-glucuronidasa para evaluar si dicho fragmento de ADN tenía actividad de promotor en los ensayos de expresión transitoria de tejidos vegetales bombardeados. La actividad se demostró en anteras y no en coleóptilos, raíces y callos, lo que sugiere una actividad de promotor específica de anteras o preferida de anteras.

Se observó una caja TATA razonable mediante inspección, aproximadamente 83-77 pb por encima del codón de inicio traduccional. El clon genómico ms26-m2::Mu8 incluye por tanto aproximadamente 1005 pb por encima de la posible caja TATA. Para los genes vegetales típicos, el inicio de la transcripción está 26-36 pb por debajo de la caja TATA, lo que daría al ARNm de Ms26 un líder 5’ no traducido de aproximadamente 48-58 nt. El fragmento subgenómico total de ms26-m2::Mu8 de 1088 pb, que incluye el líder no traducido, el inicio de la transcripción, la caja TATA y las secuencias por encima de la caja TATA, demostró así ser suficiente para la actividad de promotor. Véase la Figura 8, que es la SEQ ID NO: 5. La caja TATA putativa (TATATCA) está subrayada. Así, la presente descripción abarca una molécula de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 (o aquellas con identidad de secuencia) y que tiene la función de una región reguladora preferida de tejido masculino.

Los análisis de eliminación pueden producirse entre los extremos 5’ y 3’ de la región reguladora: los fragmentos se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis usando reacción en cadena de polimerasa, y otros similares (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). El extremo 3’ de la región reguladora preferida de tejido masculino puede desalinearse por proximidad de la caja TATA putativa o por eliminaciones 3’ si es necesario. La región esencial puede a continuación ser ligada operativamente a un promotor de núcleo elegido. Una vez identificada la región esencial, se puede controlar la transcripción de un gen exógeno mediante la región preferida de tejido masculino de Ms26 más un promotor de núcleo. El promotor de núcleo puede ser uno cualquiera de los promotores de núcleo conocidos, tal como el promotor de Virus de Mosaico de Coliflor 35S ó 19S (Patente de EE.UU. nº 5.352.605), Ubiquitina (Patente de EE.UU. nº 5.510.474), el promotor de núcleo IN2 (Patente de EE.UU. nº 5.364.780) o un promotor de Virus de Mosaico de Escrofularia (Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. editores; CRC Press; pág. 89-119; (1993)). Preferiblemente, el promotor es el promotor de núcleo de un gen preferido de tejido o el promotor de núcleo CaMV 35S. Más preferiblemente, el promotor es un promotor de un gen preferido de tejido masculino y en particular, el promotor de núcleo de Ms26.

Análisis mutacionales adicionales, por ejemplo mediante escaneo de ligando, un método bien conocido en la técnica, pueden identificar segmentos pequeños que contienen las secuencias requeridas para la expresión preferida de antera. Dichas mutaciones pueden introducir modificaciones de funcionalidad tales como en los niveles de expresión, en la programación temporal de la expresión o en el tejido de expresión. Las mutaciones también pueden ser silenciosas y no tener efectos observables.

Los procedimientos precedentes fueron usados para identificar regiones esenciales del promotor Ms26. Tras ligar el promotor con el gen marcador de luciferasa se llevó a cabo un análisis de eliminación sobre las regiones del promotor por encima de la caja TATA putativa, tal como se representa en la Figura 9. El eje x del gráfico de barras indica el número de pares base inmediatamente por encima de la caja TATA putativa retenida en una serie de derivados de eliminación que comienza desde el extremo 5’ del promotor. El eje y muestra la actividad de luciferasa normalizada como un porcentaje de la actividad de promotor de longitud completa.

Como puede observarse en el gráfico, aproximadamente 176 pb inmediatamente por encima de la caja TATA son suficientes, cuando se acoplan al promotor de núcleo (caja TATA putativa a través del inicio de la transcripción), más líder 5’ no traducido, para la expresión transitoria en anteras. Por el contrario, la actividad de luciferasa fue mínima tras una eliminación adicional desde el extremo 5’ hasta 91 pb por encima de la caja TATA putativa. Estas 176 pb por encima de la caja TATA putativa a través del líder no traducido pueden considerarse un promotor mínimo, que está representado adicionalmente en la Figura 10. La caja TATA está subrayada. La eliminación dentro del promotor de longitud completa desde -176 hasta -92 relativo a la caja TATA redujo la actividad hasta aproximadamente el 1% de la actividad natural. La eliminación de -39 hasta -8 no redujo enormemente la actividad. Por tanto, la región entre -176 y -44 pb contiene una región esencial y por tanto constituiría un elemento potenciador por encima que confiere expresión de antera al promotor, a la que denominamos “caja de antera”.

Se llevó a cabo un análisis de escaneo de ligando a través de la caja de antera en incrementos de 9-10 pb. Las localizaciones de las sustituciones de escaneo de ligando en esta región se muestran en la Figura 10, y los niveles de expresión de los mutantes relativos a la secuencia natural se muestran en la Figura 11. El efecto más drástico sobre la expresión transitoria en anteras se observó para los mutantes LS12 y LS13, en la región 52-71 pb por encima de la caja TATA putativa. También se observó un efecto principal sobre la expresión transitoria en anteras para los mutantes LS06, LS07, LS08 y LS10, dentro de la región 82-131 pb por encima de la caja TATA putativa. Por tanto, se demuestran las secuencias de la caja de antera requeridas para niveles naturales de expresión transitoria en anteras en la región de -52 a -131 relativa a la caja TATA putativa, particularmente la región de -52 a -71. Las regiones esenciales se muestran en la SEQ ID NO: 6 (Figura 10) y, en comparación con la secuencia genómica, la SEQ ID NO: 7 (Figura 5) es las bases 1-1088; 830-962; 830-914; 917-962; 875-954; 935-954; y 875-924.

EJEMPLO DE REFERENCIA 7

Comparación de Ms26 de sorgo, arroz y maíz

Tal como se ha indicado antes, Ms26 es un gen de fertilidad masculina en maíz. Cuando es mutado, y convertido en recesivo homocigoto, se produce la esterilidad masculina. En sorgo se identificó un ortólogo de Ms26. Se aisló el ortólogo de sorgo del ADNc de Ms26 usando los cebadores de gen de Ms26 de maíz en una reacción en cadena de

polimerasa con ADNc de panoja de sorgo como plantilla. El fragmento de ADNc resultante fue secuenciado mediante los métodos antes descritos y a continuación se comparó con el ADNc de Ms26 de maíz. Las comparaciones de secuencia de nucleótidos se muestran en la Figura 12 e indican un 90% de identidad. También se identificó un ortólogo de arroz y la secuencia codificadora predicha (SEQ ID NO: 17) y de proteína (SEQ ID NO: 18) se establecen en la Figura 10. Tiene un intrón menos que el Ms26 de maíz y sorgo, y las secuencias codificadoras están altamente conservadas.

Se llevó a cabo la identificación de los promotores de sorgo y de arroz. La Figura 20 muestra un alineamiento del promotor Ms26 de maíz (SEQ ID NO: 5), sorgo (SEQ ID NO: 19) y arroz (SEQ ID NO: 20). Las últimas tres bases del promotor de maíz mostradas en la figura es el inicio de traducción ATG.

El alineamiento como se refleja en la Figura 21 de la proteína Ms26 de maíz (SEQ ID NO: 2), proteína MS26 de arroz (SEQ ID NO: 18) y proteína Ms26 de sorgo (SEQ ID NO: 4), y una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 21). La comparación de las secuencias de proteína muestra que la proteína es altamente conservada entre los ortólogos, compartiendo la proteína de arroz un 92% de similitud y un 86% de identidad cuando se compara con el ortólogo de maíz. La especificidad de tejido predicha en arroz y sorgo se refleja adicionalmente en una comparación de la proteína Ms26 en el sorgo y la base de datos EST de arroz derivada de bibliotecas de panoja (flor). Las secuencias de sorgo que producen alineamientos significativos (números de acceso GenBank BI075441.1; BI075273.1; BI246000.1; BI246162.1; BG948686.1; BI099541.1 and BG948366.1, entre otros) fueron todas secuencias procedentes de panoja inmadura de sorgo, y las secuencias que muestran un alineamiento significativo en arroz (números de acceso GenBank C73892.1; CR290740.1, entre otros) también procedían de panoja inmadura de arroz.

Como es evidente a partir de lo anterior, las secuencias de nucleótidos que mapean el brazo corto del cromosoma 1 del genoma de Zea mays, en el mismo sitio que el gen Ms26, ms26-m2::Mu8 y sus alelos, son genes críticos para fertilidad masculina en plantas, es decir, son necesarios para la fertilidad de una planta, o, cuando están mutados a partir de la secuencia de una planta fértil, provocan esterilidad en la planta.

EJEMPLO DE REFERENCIA 8

Construcción de un vector de transformación vegetal que comprende un marcador seleccionable, un gen de fertilidad masculina Ms45 y un gen de citotoxina de polen

Una construcción designada PHP18091, mostrada en la Figura 22 se prepara montando los siguientes componentes de ADN:

1.

El ADN de cadena principal de plásmido pSB11 (pSB31 que carece del fragmento EcoRI que porta los genes 35SGUS y 35SBAR, Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996) 14: 745-750). Esta cadena principal de ADN contiene secuencias frontera ADN-T y el origen de replicación de pBR322.

2.

El gen 35S:PAT que codifica la enzima fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) de Streptomyces viridochomagenes (nucleótidos 6-557 del número de acceso A02774, Strauch et al. 1988, EP 0275957-A; SEQ ID NO: 22) bajo control transcripcional del promotor 35S y terminador de virus de mosaico de coliflor (CaMV) (nucleótidos 6906-7439 y 7439-7632, respectivamente, de Franck et al. 1980, Cell 21: 285-294; SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24).

3.

El gen 5126:Ms45 que contiene la región codificadora del gen de fertilidad masculina de maíz (nucleótidos 1392-3343, número de acceso AF360356, Albertsen et al. Am. J. Bot. (1993) 80: 16; SEQ ID NO: 25) bajo control del promotor 5126 específico de antera de maíz (nucleótidos 985-1490, número de acceso I75204; SEQ ID NO: 26).

4.

El gen PG47:DAM que contiene la región codificadora de ADN de E. coli (Adenosina-N6) metiltransferasa (DAM) (nucleótidos 195-1132, Brooks et al., Nucleic. Acids Res (1983) 11: 837-851; SEQ ID NO: 26) dirigida por el promotor PG47 específico de polen de maíz (nucleótidos 1-2780, número de acceso X66692, Allen y Lonsdale, Plant J. (1993) 3: 261-271; SEQ ID NO: 27). La transcripción de este gen es terminada por el terminador de inhibidor II de proteinasa de patata (PinII) (nucleótidos 2-310, An et al., Plant Cell (1989) 1: 115-122; SEQ ID NO: 28).

5.

Un fragmento NcoI de 3,34 kb que contenía Ms45:Ms45 se clonó hacia arriba del gen 35S:PAT en pUC8, creando PHP6641. Un fragmento de ADN HindIII/EcoRI de 4,7 kb que contenía Ms45:Ms45-35S:PAT procedente de PHP6641 se clonó en pSB11, creando PHP10890 (Cigan et al, Sex. Plant Reprod. (2001)14: 135-142). El promotor nativo Ms45 en PHP10890 se reemplazó por un fragmento HindIII/NcoI de 528 pb que contenía el promotor 5126 de maíz, creando PHP11943.

6.

Un fragmento HindIII/NcoI de 2,87 kb que contenía el promotor PG47 se ligó con un fragmento NcoI/HindIII de 0,8 kb que contenía la región codificadora DAM, el terminador PinII y el potenciador 35S que procedía de PHP10404 (Unger, et al., Transgenic Res. (2001)10: 409-422), creando un fragmento HindIII de 3,67 kb que contenía la fusión de genes PG47:DAM (con el potenciador 35S). Este fragmento HindIII de 3,67 kb fue clonado a continuación en el sitio HindIII de PHP11943, creando PHP20005. El potenciador 35S de

PHP20005 se eliminó, creando PHP18071. El PHP18071 se introdujo en la cepa de Agrobacterium de LBA4404 que porta el plásmido pSB1 mediante apareamiento triparental (Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996) 14: 745-750). El co-integrado de PHP18071 y pSB1 se denominó PHP18091.

EJEMPLO DE REFERENCIA 9

Transformación de maíz con la construcción transgénica de restauración del Ejemplo 8

Una planta femenina estéril masculina que era homocigota para un alelo de escisión Ac de mutante ms45, ms45’9301 (ms45) se cruzó repetidamente con polen en masa procedente de plantas Hi-type II de maíz (Armstrong 1994, En: Freeling and Walbot (editores). The Maize Handbook. Springer, Nueva York, pág. 663-671) dando como resultado la introgresión de este alelo de ms45 en germoplasma de maíz susceptible de transformación en múltiples generaciones. La fuente resultante de material para transformación consistió en embriones que segregaban ms45

(1:1 ó 3:1) y permitían la transformación directamente en un fondo de ms45 homocigoto y la evaluación de la complementación genética de la mutación ms45 en plantas To. Se llevó a cabo una transformación mediada por Agrobacterium de acuerdo a Zhao et al., 1999, (Patente de Estados Unidos número 5.981.840). El genotipado y el análisis molecular (integración y PTU) de transformantes se realizaron según Cigan et al., (Sex. Plant. Reprod. (2001)14: 135-142 ). Se seleccionaron los transformantes con integración individual y PTU completo para estudios adicionales.

EJEMPLO DE REFERENCIA 10

Análisis de transformantes de maíz

Las plantas transgénicas (To) del Ejemplo 9 fueron evaluadas para la morfología de planta completa y analizadas para determinar la transmisión transgénica a través tanto de polen como de células óvulos. No se observó ninguna diferencia morfológica entre las plantas transgénicas y las plantas de control no transgénicas excepto para el grado de fertilidad masculina. Los transformantes con integración individual y PTU intacto eran fértiles masculinos parciales mientras que las plantas de control eran estériles masculinas, lo que indica que la expresión de gen Ms45 complementó el fenotipo estéril masculino ms45 recesivo homocigoto.

Esto también demostró que la expresión del gen DAM provocó esterilidad masculina parcial eliminando los granos de polen que portan los transgenes. Sin el gen DAM, el transgén Ms45 puede recuperar completamente la mutación estéril masculina ms45 (Cigan et al., Sex. Plant. Reprod. (2001) 14: 135-142). La función correcta del gen DAM fue determinada adicionalmente mediante polinizaciones controladas entre plantas transgénicas To y plantas no transgénicas. Se usaron granos de polen procedentes de plantas transgénicas To para polinizar plantas de control no transgénicas. Los embriones inmaduros fueron recolectados de las mazorcas de dichas plantas transgénicas 18 días después de la polinización y cultivados en medio MS o medio MS que contiene 3,0 mg/L de bialafos (Murashige, T. y Skoog, F. “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”. Physiol. Plant (1962) 15: 437-439). El 100% de los embriones fueron capaces de germinar en medio de control mientras que ninguno de los embriones fue capaz de germinar en medio que contenía 3 mg/L de bialafos, lo que indica que la construcción transgénica de restauración no se transmitió a través del polen a la progenie.

Adicionalmente, se usó polen de plantas no transgénicas para polinizar las plantas mantenedoras transgénicas To. Se recolectaron embriones inmaduros procedentes de mazorcas de dichas plantas mantenedoras To 18 días después de la polinización y se cultivaron como se ha indicado antes en medio de control o en medio de control que contenía 3 mg/L de bialafos. Todos los embriones fueron capaces de germinar en medio de control mientras que el 50% de los embriones fueron capaces de germinar en el medio que contenía bialafos, lo que indica que la construcción transgénica restaurante se transmitió a través del óvulo a la progenie con la frecuencia esperada. Los resultados de rescates de embrión se resumen en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1: Transmisión de transgén a través de polen

Plantas transgénicas

Polen a plantas no transgénicas

Medio de control

Medio + 3 mg/L bialafos

Nº embriones cultivados

Nº embriones germinados % Nº embriones cultivados Nº embriones germinados %

14089263

40 40 100 60 0 0

14089277

100 100 100 100 0 0

14089839

40 40 100 60 0 0

Tabla 2: Transmisión de transgén a través de células óvulos

Plantas transgénicas

Polen a plantas no transgénicas

Medio + 3 mg/L bialafos

Nº embriones cultivados

Nº embriones germinados %

14089262

20 8 40

14089277

40 22 55

14089839

40 21 53

EJEMPLO DE REFERENCIA 11

Conversión de plantas To en diferentes líneas innatas y análisis de plantas Tn.

Las plantas transgénicas mantenedoras To del Ejemplo 9 fueron convertidas en diferentes fondos innatos a través de retrocruces repetidos mediante polinización a partir de líneas innatas tales como PH09B. Para este fin, se usó polen producido por PH09B que es fondo heterocigoto de ms45 para polinizar las mazorcas de plantas mantenedoras T0 que eran homocigotas para los alelos mutantes de ms45. Las semillas T1 recolectadas de dichas plantas T0 se segregaron para ambos transgenes y alelos de ms45. Las plantas T1 que no contenían la construcción transgénica restauradora fueron eliminados mediante selección con herbicida. Las plantas T1 que contenían transgenes fueron analizadas para fondo de ms45 y fertilidad masculina de acuerdo a Cigan et al., (Sex. Plant. Reprod., (2001) 14: 135-142). En general, las plantas T1 en condición homocigota ms45 que contenían la construcción transgénica restauradora mostraron fertilidad masculina parcial como la observada para las plantas precursoras T0, mientras que las plantas T1 en condición homocigota ms45 pero que no contenían transgenes fueron completamente estériles masculinas. Esto sugiere que el transgén Ms45 continúa actuando correctamente en un fondo genético diferente. Se examinaron granos de polen de plantas T1 para determinar su viabilidad usando tinción microscópica e histoquímica. Se recolectaron granos de polen a diferentes estadios de desarrollo y se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA), 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y bromuro de etidio (EB). Aproximadamente el 50% de los granos de polen de las plantas transgénicas T1 perdieron su viabilidad según se determinó a través de la ausencia de fluorescencia tras tinción con FDA después de la primera mitosis de polen, mientras que los granos de polen procedentes de plantas de control no transgénicas mostraron una tinción de FDA uniforme. Esto se confirmó con los estudios de germinación de polen in vitro. La velocidad de germinación de los granos de polen procedentes de las plantas transgénicas T1 fue aproximadamente la mitad de las plantas de control no transgénicas. Los granos de polen procedentes de plantas T1 también se usaron para polinizar plantas no transgénicas para evaluar la transmisión del transgén a través del polen. Por ejemplo, ninguno de los 248 embriones procedentes de una planta no transgénica polinizados con una planta T1 (20118954) fueron capaces de germinar en el medio que contenía 3 mg/L de bialafos. Estos experimentos confirmaron la función correcta de los transgenes Ms45 y DAM en diferentes fondos genéticos. Las plantas T1 con características deseadas fueron usadas para la siguiente iteración de retrocruce usando polen procedente del precursor innato paterno, que era heterocigoto para el alelo de ms45 mutante. Este proceso se repetirá hasta la sexta generación.

EJEMPLO DE REFERENCIA 12

Transmisión y mantenimiento a gran escala de esterilidad masculina ms45 usando la construcción del Ejemplo 8.

Se usaron plantas T1 derivadas de T0 14089277 tal como se describe en el Ejemplo 9 como parte masculina para polinizar plantas innatas naturales o plantas innatas estériles ms45/ms45. La progenie T2 10.117 procedente de los cruces naturales y la progenie T2 6688 procedente de cruces ms45/ms45 fueron evaluadas para transmisión transgénica mediante escrutinio para resistencia a herbicida. Para ambos tipos de cruces se encontró que el total de plantas T2 16786 eran sensibles a herbicida, dando lugar una frecuencia de no transmisión del 99,89%. Todas las plantas T2 de cruces ms45/ms45 que no contenían el transgén, fueron completamente estériles masculinas, lo que indica que dicha línea transgénica puede mantener la esterilidad ms45.

EJEMPLO 13

Construcción de un vector de transformación vegetal que comprende un marcador seleccionable, un gen de fertilidad masculina Ms26 y un gen de citotoxina de polen.

Una construcción designada PHP24101, mostrada en la Figura 23, se construye montando los siguientes componentes de ADN:

1. El ADN de cadena principal de plásmido pSB11 (psB31 que carece del fragmento EcoRI que porta los genes 35SGUS y 35SBAR, Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996) 14: 745-750). Dicha cadena principal de ADN contiene secuencias de frontera de ADN-T y el origen de replicación de pBR322.

2.

El gen PG47PRO:ZM-AA1 que contiene la región codificadora de alfa-amilasa 1 de Zea mays como se establece en la Figura 24. (SEQ ID NO: 26). La transcripción de este gen es terminada por un terminador IN2-1 (Patente de EE.UU. nº 5.364.780).

3.

El gen GENOMIC de Ms26 (SB200) (SEQ ID NO: 7) que contiene la región codificadora de gen de fertilidad masculina.

4.

LTP2:DS-RED2 (ALT1) que contiene la región codificadora de fluorescencia roja (una variante de la proteína fluorescente roja de Discosoma sp. (DsRed), de Clontech mutada para eliminar el sitio BstEII, sin cambiar la secuencia de codón) dirigida por el promotor LTP2, ver anterior.

5.

Un fragmento de ADN EcoRV/DraI de 2,143 kb que contiene LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1) de PHP21737 se clonó por debajo del gen GENOMIC Ms26 en vector SK, creando SK-Ms26 GENOMIC-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1).

6.

Un fragmento de ADN EcoRV/DraI de 2,143 kb que contiene LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1) de PHP21737 se clonó por debajo del gen GENOMIC Ms45PRO:Ms45 en vector SK, creando SK-Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1).

7.

Un fragmento NotI de 5,429 kb que contiene 5126PRO:Ms45 GENOMIC-UBI:MOPAT:PINII en PHP20532 fue reemplazado por un fragmento NotI de 4,318 kb que contiene Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1) from SK-Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1), creando PHP22623.

8.

Un fragmento NotI de 4,318 kb que contiene Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1) en PHP22623 fue reemplazado por un fragmento de ADN NotI de 5,960 kb que contiene Ms26 GENOMIC-LTP2PRO:DS-RED2(ALT1) de SK-Ms26 GENOMIC-LTP2PRO:DS-RED2 (ALT1), creando PHP24014. El PHP24014 se introdujo en la cepa LBA4404 de Agrobacterium que porta el plásmido pSB1 mediante Electroforesis. El cointegrado de PHPPHP24014 y pSB1 se denominó PHP24101.

EJEMPLO 14

Transformación de maíz con la construcción transgénica restauradora del Ejemplo 13.

Una planta femenina estéril masculina que era homocigota para un alelo de escisión mutante ms26, (ms26) se cruzó repetidamente con polen en masa de plantas de maíz Hi-type II (Armstrong 1994, En: Freeling y Walbot (editores). The Maize Handbook. Springer, Nueva York, pág. 663-671) dando como resultado la introgresión de dicho alelo ms26 en germoplasma de maíz susceptible de transformación a lo largo de múltiples generaciones. La fuente resultante de material para la transformación consistió en embriones que se segregan (1:1 ó 3:1) para ms26 y se permitió la transformación directamente en un fondo ms26 homocigoto y para evaluar la complementación genética de la mutación ms26 en plantas T0. La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo según Zhao et al. 1999, (Patente de Estados Unidos número 5.981.840). El genotipado y el análisis molecular (integración y PTU) de transformantes se realizaron según Cigan et al., (Sex. Plant. Reprod. 1(2001) 4: 135-142). Los transformantes con integración individual y PTU completo fueron seleccionados para estudios adicionales.

EJEMPLO 15 – Análisis de transformantes de maíz.

Se evaluaron las plantas transgénicas (T0) del Ejemplo 14 para morfología de planta entera y se analizaron para transmisión transgénica a través de polen. No se observó ninguna diferencia morfológica entre las plantas transgénicas y las plantas de control no transgénicas excepto por el grado de fertilidad masculina. Los transformantes con integración individual y PTU intacto fueron estériles masculinos parciales mientras que las plantas de control no transgénicas fueron completamente estériles masculinas, lo que indica que la expresión del gen Ms26 complementaba el fenotipo estéril masculino de ms26 recesivo homocigoto. Esto también sugirió que la expresión de polen del gen de alfa amilasa (AA) provocó esterilidad masculina parcial alternando la función normal de los granos de polen que portan los transgenes. La tinción del polen procedente de los transformantes con yoduro potásico (KI), que tiñe gránulos de almidón, demostró que aproximadamente la mitad de los granos de polen contenían almidón (granos negros, no transgénicos) y que la otra mitad no contenían almidón (granos dorados, transgénicos). La función correcta del gen AA fue determinada adicionalmente mediante polinizaciones controladas entre plantas transgénicas T0 y plantas no transgénicas. Las semillas T1 resultantes fueron evaluadas para un fenotipo de fluorescencia roja. Si los transgenes eran transmitidos a través del polen entonces la semilla T1 contendría semillas fluorescentes rojas debido a la expresión de RFP en la capa aleurona. Para cuatro eventos independientes mostrados en la Tabla 3 no se observó ninguna expresión RFP en las semillas T1, mientras que las semillas procedentes de las propias mazorcas T0 (semillas T1) contenían aproximadamente un 50% de semillas fluorescentes rojas.

Tabla 3: Transmisión de transgén a través de polen

Plantas transgénicas

Polen a plantas no transgénicas

Fluorescencia roja de semilla

Nº semillas amarillas

Nº semillas rojas %

42772379

338 0 100

42772385

277 0 100

42772400

268 0 100

42772411

598 0 100

De este modo, se puede observar que la invención alcanza al menos todos sus objetivos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.

<120> SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS QUE MEDIAN EN LA FERTILIDAD MASCULINA VEGETAL Y UN MÉTODO PARA USAR LAS MISMAS

<130> 1148CR-PCT

<140> PCT/US2006/024273

<141> 2006-06-22

<150> 11/166,609

<151> 2005-06-24

<160> 36

<170> PatentIn Versión 3.3

<210> 1

<211> 1906

<212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1638)

<220>

<221> CDS

<222> (1642)..(1767)

<400> 1

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

<210> 3

<211> 494

<212> ADN

<213> Sorghum sp.

<220>

<221> base_modificada

<222> (351)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (367)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (369)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (384)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (409)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (444)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (462)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<220>

<221> base_modificada

<222> (490)

<223> a, c, g, t, desconocido u otro

<400> 3

<210> 4

<211> 158

<212> PRT

<213> Sorghum sp.

<220>

<221> MOD_RES

<222> (113)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (119)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (133)

<223> Aminoácido variable

<400> 4

<210> 5

<211> 1092

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 5

<210> 6

<211> 267

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 6

<210> 7

<211> 3897

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 7

<210> 8

<211> 360

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 8

<210> 9

<211> 352

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 9

<210> 10

<211> 1440

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 10

<210> 11

<211> 4182

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 11

<210> 12

<211> 505

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

<210> 13

<211> 518

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 13

<210> 14

<211> 128

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 14

<210> 15

<211> 128

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 15

<210> 16

<211> 87

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 16

<210> 17

<211> 1635

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 17

<210> 18

<211> 544

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 18

<210> 19

<211> 436

<212> ADN

<213> Sorghum sp.

<400> 19

<210> 20

<211> 450

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 20

<210> 21

<211> 543

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 21

<210> 22

<211> 532

<212> PRT

<213> Sorghum sp.

<400> 22

<210> 23

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótidos sintético

<400> 23 taggggtgaa aacgg 15

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(3)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)

<223> Aminoácido variable

<400> 24

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 25

<210> 26

<211> 1618

<212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (108)..(1430)

<400> 26

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 27

<210> 28

<211> 42

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 28

<210> 29

<211> 28

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 29

<210> 30

<211> 42

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 30

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 31

<210> 32

<211> 24

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 32

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 33

<210> 34

<211> 42

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 34

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 35

<210> 36

<211> 441

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 36

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una casete de expresión que comprende una secuencia de alfa-amilasa 1 que comprende:

   (a)

   la región codificadora de alfa-amilasa 1 procedente de Zea mays establecida en la Figura 24 (SEQ ID NO: 26); ó

   (b)

   una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la misma ligada operativamente a un promotor preferido de tejido masculino.

2. 2.

   Una casete de expresión de la reivindicación 1, parte (b), en la que dicha identidad de secuencia es al menos del 95%.

3. 3.

   Una célula vegetal que comprende una casete de expresión de la reivindicación 1 ó 2.

4. 4.

   Una planta que comprende una casete de expresión de la reivindicación 1 ó 2.

5. 5.

   Una planta de la reivindicación 4 que es maíz, sorgo o planta de soja.

6. 6.

   El uso de una casete de expresión de la reivindicación 1 ó 2 en la represión del desarrollo de polen en una planta como la definida en la reivindicación 4 ó 5.

   FIGURAS