CN101851683A - 一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途，它包括与急性髓系白血病药物治疗密切相关的四个基因组合：药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GSTO2，药物转运蛋白类基因OATP1B1。包括下述SNP位点：CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rs1799931位点、GSTO2的rs156697和OATP1B1的rs4149056位点。其方法是应用特异性引物和经过不同颜色荧光标记的探针与PCR扩增后的核酸样品中目的基因片段进行杂交。通过单核苷酸延伸技术检测和分析白血病药物治疗效果，指导临床用药，减少患者用药的毒副作用，增加疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因组合、引物、探针和用途，尤其是一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是造血干细胞正常分化受阻，恶性肿瘤细胞克隆性增生取代正常造血，从而造成贫血、出血，感染及脏器浸润等一系列症状的疾病，是一种异质性疾病。如果不予治疗，患者将于数周或数月内由于出血或感染而死亡。我国白血病的发病率约为3～4/10万。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在儿童及35岁以下成人中居第一位，是威胁儿童及中青年身体健康的杀手。近年来急性髓系白血病的发病率逐年上升。目前，化学药物治疗仍然是治疗急性髓系白血病的主要手段。除急性早幼粒细胞白血病经全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(三氧化二砷、ATO)治疗，CR率可＞90％外，其他急性髓系白血病的标准诱导化疗的缓解率约为50％-85％。目前尚有50％-15％患者未能达到完全缓解。缓解率受到多种危险因素的影响。其中，个体的遗传差异在化疗药物的敏感性中起着重要的作用。
个体基因的多样性导致药物在吸收，分布，生物转化，代谢，转运及清除，以及药物作用靶点方面都存在差异性，从而导致每个个体对不同化疗药物的敏感性及毒副作用不同。随着药物基因组学的发展，个体化治疗逐渐成为新的治疗趋势。
药物进入人体后，绝大部分依靠转运蛋白的协助，广泛分布于人体的组织。有研究指出MMDR1 G2677T/A基因多态性可以作为AML患者第一疗程是否CR的预测因素，为个体化给药提供理论基础。近来还有研究指出MDR1 G1199A可介导对紫杉醇，长春碱类，依托泊苷等多种药物的耐药。
药物代谢酶分为I相反应和II相反应酶。细胞色素P450单氧化酶(CYPs)是催化药物进行氧化、还原等I相反应的特异性酶。有研究表明在AML难治组中CYP3A5*3(A/G)基因的AA型比例明显高于持续缓解组，可能与AA基因型代谢酶活性升高，导致化疗药物有效性及毒性降低有关。药物II相反应为结合反应，催化该类反应的酶主要有N_乙酰转移酶2(NAT2)、谷氨酰转移酶(GST)、UDP-葡萄糖苷酸转移酶(UGT)、巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)等。该类酶多态性位点的改变将会导致药物毒性反应产生差异。有的实验研究表明GSTT1和GSTM1的NULL基因变异型不但和急性白血病的发病有关，而且还影响化疗及放疗的治疗效果。
为此，通过相关基因型检测，分析急性髓系白血病药物治疗效果，可以指导临床医生用药减少患者用药的毒副作用增加疗效。
发明内容
本发明是通过检测一组与急性髓系白血病化疗疗效相关的基因及位点，自行设计特异性寡核苷酸引物和探针，应用于单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术；综合分析急性髓系白血病化疗疗效相关基因多态性，从而能够通过有效的方法来选择化疗药物，调整化疗剂量，提高化疗疗效及预后，同时减少药物毒副作用，以指导临床合理用药。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合：药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GSTO2，药物转运蛋白类基因OATP1B1。
包括下述SNP位点：CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rs1799931位点、GSTO2的rs156697位点和OATP1B1的rs4149056位点。
用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合中针对所述位点自行设计的特异性引物。DNA通过多重PCR扩增，能够同时得到上述4个位点的基因片段。
用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性探针，应用此探针能够同时对4个位点进行基因型检测。
所述的引物和探针，应用单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术能够特异性检出与急性髓系白血病化疗疗效相关的基因多态性位点。
本发明的有益效果是：(1)分型结果准确性高达99％以上，重复性好。(2)同时检测多个SNP位点，检测成本低；(3)高通量，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便；(5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅30ng。(6)通过单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型及时、准确，为临床对急性髓系白血病选择用药及剂量提供可靠依据。
具体实施方式
本发明用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，它包括与白血病化疗疗效关系密切的四个基因的组合：药物代谢I相酶类基因CYP3A5，rs776746位点，药物代谢II相酶类基因NAT2，rs1799931位点、GSTO2，rs156697，药物转运蛋白类基因OATP1B1，rs4149056位点。以及检测急性髓系白血病化疗疗效相关基因位点所设计的特异性引物和探针。
设计的特异性引物序列如下：
| 基因名称及rs号 | 序列 | 长度(nt) |
| CYP3A5 rs776746 | 5’-TGGCATAGGAGAKACCCAC | 19 |
| 5’-TTCATATGATGAAGGGTAATGTG | 23 | |
| NAT2r s1799931 | 5’-TTTAAGATTTCCTTGGGGAG | 20 |
| 5’-ACACAAGGGTTTATTTTGTTCCT | 23 |
| 基因名称及rs号 | 序列 | 长度(nt) |
| GSTO2 rs156697 | 5’-ACCTCTTCCAGGTTGCTGA | 19 |
| 5’-CAAGGAGTRCCTGGTAGCG | 19 | |
| OATP1B1 rs4149056 | 5’-TCATTGGAAGCTGTCGCG | 18 |
| 5’-AACTCTCCAGATGTCTTCCAGTAA | 24 |
设计的特异性探针序列如下：
| 基因名称及rs号 | 序列 | 长度(nt) |
| CYP3A5 rs776746 | ATACCTACCACGCTACAGCCCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA | 45 |
| NAT2 rs1799931 | AGACTTCTACGCAAGCACTGAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG | 45 |
| GSTO2 rs156697 | CACTAGTCATAACGCAGCCTTCCTGACGCAGGGCTGCCTTCAGAT | 45 |
| OATP1B1 rs4149056 | TCCAGAATAGACAACAGACGCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCA | 45 |
根据检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性引物和探针，被检测的DNA通过多重PCR扩增，能够同时得到上述4个位点的目的基因片段.应用此探针能够同时对4个位点进行基因型检测。
特异性寡核苷酸引物及探针可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员均能够理解此技术。本发明不限于这8条特异性引物及其相应的4条特异性探针。
本发明中所述探针特指单核苷酸延伸技术中的延伸引物，下面实施例中将叙述为延伸引物。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
1.DNA的提取：
采取受检者骨髓或静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65℃孵育10分钟，异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤沉淀两次，晾干后溶于适量TB溶液中。
2.PCR扩增
取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板或0.2mlPCR管中，进行多重PCR扩增：
每孔反应总体积5ul，其中10mmol/L 4*dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer 0.5ul，25mmol/L MgCl2 1ul，模板DNA 30ng，4重引物混合液10uM/L each 0.025ul，AmplitaqGold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上进行扩增。循环条件为：预变性94℃ 1min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1min，40个循环；Hold 4℃。
PCR扩增引物：
1F 5’-TGGCATAGGAGAKACCCAC
1R 5’-TTCATATGATGAAGGGTAATGTG
2F 5’-TTTAAGATTTCCTTGGGGAG
2R 5’-ACACAAGGGTTTATTTTGTTCCT
3F 5’-ACCTCTTCCAGGTTGCTGA
3R 5’-CAAGGAGTRCCTGGTAGCG
4F 5’-TCATTGGAAGCTGTCGCG
4R 5’-AACTCTCCAGATGTCTTCCAGTAA
3.纯化
在PCR扩增产物中加入2ul Exo I-SAP-IT纯化试剂(购自USB)。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序：37℃ 30min，96℃ 10min，Hold 4℃。
4.引物延伸反应
纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer 3.76ul，延伸引物混合液(10uM/L each)0.03ul，20×Extension Mix 0.2ul，DNA聚合酶0.02ul，补足水到7ul。将装有延伸反应混合物的96孔板放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序：Hold 96℃ 3min；94℃ 20sec，40℃ 11sec，46个循环；Hold 4℃。
延伸引物序列：
1-ATACCTACCACGCTACAGCCCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA
2-AGACTTCTACGCAAGCACTGAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG
3-CACTAGTCATAACGCAGCCTTCCTGACGCAGGGCTGCCTTCAGAT
4-TCCAGAATAGACAACAGACGCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCA
以上延伸探针的5’端具有与微阵列芯片Tag地址引物的互补序列。
5.延伸反应结束后，加入杂交液与微阵列芯片进行杂交反应。
杂交温度42℃，孵育时间2小时。
6.扫描检测荧光信号分析基因型结果。
本发明采用单核苷酸延伸和微阵列芯片技术相结合，利用SNP Stream平台，针对上述4个SNP位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增待测SNP位点的4个目的基因片段。根据待测SNP位点上游5’端序列及微阵列芯片的Tag地址序列，设计43-45bp的寡核苷酸探针，其3’末端仅结合一个标记不同颜色荧光的ddNTP，互补位点位于SNP位点5’上游1bp处。探针的5’端与微阵列芯片特定区域的20bp的Tag地址序列互补，其余23-25bp的序列与SNP位点上游5’端序列互补。杂交后，不同探针结合在芯片的不同区域，通过检测芯片上对应位置的荧光信号，进行基因型分析。此方法同时可以进行多个SNP分型。
由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本。
本发明将与急性髓系白血病化疗疗效密切相关的四个基因位点进行组合。通过大量的筛选数据表明所述4个基因及其位点：CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rs1799931位点、GSTO2的rs156697位点和OATP1B1的rs4149056位点与急性髓性白血病化疗疗效密切相关。提示这些遗传变异与药物有效性和安全性密切相关。通过检测分析受检人与白血病化疗疗效相关的基因多态性，对临床合理的选择化疗药物，调整化疗剂量，提高化疗疗效及预后，减少药物毒副作用具有重要指导意义同时节省患者开支。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内，轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>协和干细胞基因工程有限公司，中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)
<120>一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途
<130>
<160>12
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
tggcatagga gakacccac 19
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
ttcatatgat gaagggtaat gtg 23
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>3
agacttctac gcaagcactg aatctcgtgc ccaaacctgg tgatg 45
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>4
tttaagattt ccttggggag 20
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>5
acacaagggt ttattttgtt cct 23
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>6
agacttctac gcaagcactg aatctcgtgc ccaaacctgg tgatg 45
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>7
acctcttcca ggttgctga 19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>8
caaggagtrc ctggtagcg 19
<210>9
<211>45
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>9
cactagtcat aacgcagcct tcctgacgca gggctgcctt cagat 45
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>10
tcattggaag ctgtcgcg 18
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>11
aactctccag atgtcttcca gtaa 24
<210>12
<211>45
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>12
tccagaatag acaacagacg cagtaatgtc gaagttttta tccca 45
Claims (6)
1.一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，其特征在于，它包括与白血病化疗疗效密切相关的四个基因组合：药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GSTO2，药物转运蛋白类基因OATP1B1。
2.根据权利要求1所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，其特征在于，包括下述基因位点：CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rs1799931位点、GSTO2的rs156697和OATP1B1的rs4149056位点。
3.如权利要求2所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，用于针对所述位点设计的特异性引物和探针。
4.如权利要求2所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合设计的特异性寡核苷酸引物，其特征在于，以下列出的特异性引物序列，用于对DNA进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述4个位点的特异性目的基因片段：
针对rs776746位点： 上游5’-TGGCATAGGAGAKACCCAC
下游5’-TTCATATGATGAAGGGTAATGTG
针对rs1799931位点：上游5’-TTTAAGATTTCCTTGGGGAG
下游5’-ACACAAGGGTTTATTTTGTTCCT
针对rs156697位点： 上游5’-ACCTCTTCCAGGTTGCTGA
下游5’-CAAGGAGTRCCTGGTAGCG
针对rs4149056位点：上游5’-TCATTGGAAGCTGTCGCG
下游5’-AACTCTCCAGATGTCTTCCAGTAA。
5.如权利要求2所述的用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所列出的特异性探针序列，能同时对4个位点进行基因型检测：
针对rs776746位点：ATACCTACCACGCTACAGCCCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA
针对rs1799931位点：AGACTTCTACGCAAGCACTGAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG
针对rs156697位点：CACTAGTCATAACGCAGCCTTCCTGACGCAGGGCTGCCTTCAGAT
针对rs4149056位点：TCCAGAATAGACAACAGACGCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCA。
6.如权利要求4和5所述的引物及探针，用于单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术特异性检出急性髓系白血病化疗疗效相关的基因分型。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20101006 |