CN105463086A - 一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物。检测方法包括样品采集、PCR扩增以及测序。本发明可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高；家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代Dubin-Johnson综合症的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前景。

Description

一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法。
背景技术
Dubin-Johnson综合征(DJS)是一种少见的以慢性持续性或间歇性黄疸为临床特点的常染色体隐性遗传病，以结合胆红素增高为主的先天性非溶血性黄疸。由Dubin和Johnson于1954年首先报道，常见于青少年和幼年。复合耐药相关蛋白2MRP2(编码基因ABCC2)，是ATP依赖的有机阴离子的重要转运体，如二葡萄糖苷酸胆红素、硫酸盐、还原型谷胱甘肽等的转运，是非胆汁酸盐依赖性胆汁流形成的重要因素。由于毛细胆管上位于10q24的多特异性有机阴离子转运蛋白(cMOAT)的基因(ABCC2/MRP2超家族)缺陷，导致毛细胆管对有机阴离子尤其是两性化合物如二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，肝细胞先天性胆红素排泌障碍，对非水溶性有机阴离子的排泄也有缺陷，但对胆盐的排泌正常，导致DJS。
本病较罕见，以多见于男性。Dubin-Johnson4000例肝脏活体组织检查中有12例(0.3％)，美国肝病登记8000例有23例(0.29％)，国内也有本病的报导，发病率亦不高。本综合征的临床表现大致有三种类型:第一种是临床无任何自觉症状，常因其它疾病就诊而被发现，此类少见。第二种是长期黄疸反复发作，食欲不振、疲乏无力，肝区不适，恶心甚至呕吐，尿色加深，酷似病毒性肝炎。此类最常见。第三种是持续黄疸不退，尿色深黄，但胃肠症状不明显，可应付日常工作。DJS常见于青少年，因为该疾病症状轻微，医生或患者对该疾病认识不足不予重视，导致患者长期误诊。
ABCC2基因位于染色体10q24，为45kb，包括32个外显子，不同的种族存在不同的MRP2/ABCC2基因突变类型。ABCC2基因在1066密码子突变，使4个跨膜区和整个第2个三磷酸腺苷结合位点缺失，从而丧失转运非胆汁酸有机阴离子的功能。最新报道表明ABCC2基因第17号外显子错义突变和第28外显子无义突变共同引起杂合性突变，也可导致MRP2蛋白功能丧失，使二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，从而引起DJS。
明确诊断可以避免反复就诊和不必要的治疗，以及避免其加重损害的因素。通过对ABCC2基因的检测，尤其是编码MRP2段基因的检测有助于诊断DJS，减少误诊的发生。Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用Sanger测序法对编码MRP2的基因ABCC2的序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。
为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液全基因组DNA，由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。
溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，对于设定PCR退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以在保证特异性的情况下，设计引物的Tm值尽量接近，使PCR的退火温度可以保持一致，从而达到PCR条件的统一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高。
本发明的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物；其中，PCR引物如下：
ABCC2-3F：CCTATCCATCACCGGAAACC；
ABCC2-3R：TGTTTCACCCCATTCCAACC；
ABCC2-7F：TATCGACAAGATCGCAACTCC；
ABCC2-7R：ATCTTCCGCTGGCAATCA；
ABCC2-8F：TGGAACAGTGAAGGCAGC；
ABCC2-8R：CATCTTGAAAACTGCCTGC；
ABCC2-9F：GCTAGATGCGATGGCGTATG；
ABCC2-9R：CCTCAACCTTGGAATCAATGCT；
ABCC2-13F：AGGTGGTGTAGGTCTATAGTGGA；
ABCC2-13R：AGTTTACCAGCAAAAGTTAGACAT；
ABCC2-15F：AGATTTCATTCACCTCCTGTTAG；
ABCC2-15R：GATATTCATGGCCCCATAGTAG；
ABCC2-16F：CAGACTTCATGGAGACTCAGAGA；
ABCC2-16R：GGAGAAGGCACTGAGGGCTA；
ABCC2-17F：AGCATCACACACATTTATCATCTAA；
ABCC2-17R：CCACTTAGTACAAACACATGATTTC；
ABCC2-18F：ACCTCTGCTCTACATTGTCACA；
ABCC2-18R：GTGTAACCAAGAGTCGAGTCTATAA；
ABCC2-23F：TTAGCCCAAGGTATGTCTGATG；
ABCC2-23R：GTCTTCTTCACTAGATGCTGAGCTA；
ABCC2-25F：CGGAGCCTCTCATCATTCTG；
ABCC2-25R：CCTCCCACCGCTAATATCAA；
ABCC2-28F：AAGTCTAGTTCAGCCTATTAAATGC；
ABCC2-28R：CTGCTCTCCACTCTGTCCAAT；
ABCC2-29F：CTTACCTCCTGTGACTGTGAATG；
ABCC2-29R：CCGAGTAGACCGTGGAATTGA；
ABCC2-30F：GAACTCCGAGGTCCTTTTCTG；
ABCC2-30R：AGGAATCAGACCTGGATGAAAAT。
所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
本发明的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。
所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、62℃30s、72℃40s，15个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃10min。
所述步骤(2)中的PCR反应体系为：PCR扩增反应试剂10μL，ddH2O6μL，上下游引物各1μL，样品DNA2μL。
有益效果
本发明可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高；可用于临床作为Dubin-Johnson综合症早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，降低误诊率和避免延误治疗；家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代Dubin-Johnson综合症的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是ABCC2基因Exon3(A)和Exon7(B)野生型的测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.样本抽提
(1)抽取200μL的全血，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
(2)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液。
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2.实验过程
(1)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应体系每管20μL分装于反应管中。
(2)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：
试剂名称 用量(uL)
premix Taq 10
上游引物(5uM) 1
上游引物(5uM) 1
ddH2O 6
模板 2
PCR反应条件，见下表：
3.测序分析
4.Sanger测序的具体步骤如下：
4.1测序PCR：
4.1.1试剂配制：按下表进行，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。
BigDye体系：
酶纯化体系：
原料 1X 需要体积量(ul/管)
CIP 0.1ul -
Exo I 0.5u l -
去离子水 1.4ul -
4.2PCR产物纯化
4.2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。
4.2.2取9ulPCR产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。
4.2.3将混匀样品按照如下反应条件上PCR仪，进行酶纯化扩增。
37℃→95℃→4℃
50'5'+∞
4.2.4纯化好的样品用于下一步测序反应，如当日不用放冷冻保存。
4.3测序反应
4.3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。
4.3.2每反应体系5ul，BigDye混合液和5P引物固定加1ul，模板一般加2ul，最大量为3ul(根据PCR产物电泳结果调整，)，用水补足5ul。
4.3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul引物加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的BigDye混合液，最后加入模板。
4.3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。
4.3.5按照如下反应条件上PCR仪，进行测序反应。
95℃→95℃→56℃→60℃→4℃
4'15”20”2'+∞
25个循环。
4.4.测序反应后乙醇纯化，上机。
4.4.1将扩增完的PCR产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mMEDTA，然后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。
4.4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。
4.4.3加入50ul的20℃预冷75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。
4.4.4300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。
4.4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和Hi-DiTM各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静置15min.使测序产物完全溶解。
4.4.6将Hi-DiTM溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至PCR扩增仪上，95℃预变性5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。
数据分析：应用sequencinganalysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的标准序列进行比对，确认样本的基因序列。
5.临床标本比对：前期临床标本检测30例，试剂盒检测结果符合率90％。
因此，使用本发明试剂盒，采用测序技术，对ABCC2基因突变进行检测。可以通过特异性引物和带荧光标记的ddNTP，检测出与Dubin-Johnson综合症相关的基因突变位点。可以用于临床可Dubin-Johnson综合症的早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，以及Dubin-Johnson综合症病人的早期筛选方法。

Claims (5)

1.一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物；其中，PCR引物如下：
ABCC2-3F：CCTATCCATCACCGGAAACC；
ABCC2-3R：TGTTTCACCCCATTCCAACC；
ABCC2-7F：TATCGACAAGATCGCAACTCC；
ABCC2-7R：ATCTTCCGCTGGCAATCA；
ABCC2-8F：TGGAACAGTGAAGGCAGC；
ABCC2-8R：CATCTTGAAAACTGCCTGC；
ABCC2-9F：GCTAGATGCGATGGCGTATG；
ABCC2-9R：CCTCAACCTTGGAATCAATGCT；
ABCC2-13F：AGGTGGTGTAGGTCTATAGTGGA；
ABCC2-13R：AGTTTACCAGCAAAAGTTAGACAT；
ABCC2-15F：AGATTTCATTCACCTCCTGTTAG；
ABCC2-15R：GATATTCATGGCCCCATAGTAG；
ABCC2-16F：CAGACTTCATGGAGACTCAGAGA；
ABCC2-16R：GGAGAAGGCACTGAGGGCTA；
ABCC2-17F：AGCATCACACACATTTATCATCTAA；
ABCC2-17R：CCACTTAGTACAAACACATGATTTC；
ABCC2-18F：ACCTCTGCTCTACATTGTCACA；
ABCC2-18R：GTGTAACCAAGAGTCGAGTCTATAA；
ABCC2-23F：TTAGCCCAAGGTATGTCTGATG；
ABCC2-23R：GTCTTCTTCACTAGATGCTGAGCTA；
ABCC2-25F：CGGAGCCTCTCATCATTCTG；
ABCC2-25R：CCTCCCACCGCTAATATCAA；
ABCC2-28F：AAGTCTAGTTCAGCCTATTAAATGC；
ABCC2-28R：CTGCTCTCCACTCTGTCCAAT；
ABCC2-29F：CTTACCTCCTGTGACTGTGAATG；
ABCC2-29R：CCGAGTAGACCGTGGAATTGA；
ABCC2-30F：GAACTCCGAGGTCCTTTTCTG；
ABCC2-30R：AGGAATCAGACCTGGATGAAAAT。
2.根据权利要求1所述的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
3.一种如权利要求1所述的检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。
4.根据权利要求3所述的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、62℃30s、72℃40s，15个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃10min。
5.根据权利要求3所述的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR反应体系为：PCR扩增反应试剂10μL，ddH2O6μL，上下游引物各1μL，样品DNA2μL。
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