CN103421799B - 猪hoxa1基因在种猪遗传疾患选育改良中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种位于猪18号染色体上的导致外耳发育畸形（先天性无耳症）的HOXA1基因因果突变位点g.50111251G>TC及其在种猪遗传改良中的应用。针对该因果突变，本发明采用PCR-RFLP技术进行基因型判定，剔除携带不利等位基因g.50111251TC的个体，可以避免患病个体出生后不久即死亡带来的经济损失，从而提纯复壮中国地方猪种。
Description
技术领域
本发明涉及动物遗传育种领域，尤其是涉及一个导致猪耳缺陷的DNA突变及其在种猪遗传改良中的应用。
背景技术
耳朵由外耳、中耳和内耳三部分构成。外耳负责搜集声波，由耳廓和外耳道组成。中耳和内耳将外耳搜集到的声波转换为神经信号传给大脑，形成听觉。外耳是哺乳动物听力系统的重要组成部分，人类外耳畸形发病率高、类型多样且常伴有听力障碍的发生。例如，人类先天性小耳畸形症，国内的发病率已达5.18/10000，表现为耳廓发育不全至缺失、外耳道闭锁或狭窄和中耳畸形，内耳发育多为正常。目前虽已知有少部分基因与外耳畸形相关，但其真正的致病机理却少有报道。
申请人前期获得了一个家猪先天性外耳发育畸形的近交家系：二花脸×沙子岭F2家系，该家系由1头二花脸公猪和1头沙子岭母猪杂交生产F1个体。两头F1全同胞交配时，F2个体中出现了外耳缺陷的个体，表现为外耳极小，狭长，患病严重的个体外耳完全缺失，且患病个体出生当天至1周内即死亡，给养猪生产带来了经济损失。图1列出了该二花脸×沙子岭F2近交系群体个体外耳表型图，其中a为正常个体，而b为外耳畸形个体。根据系谱信息和患病表型在此F2群体中的分离情况，推定该遗传疾患由常染色体单个基因所控制，呈隐性遗传模式。因此，在常规的育种实践中，无法通过表型选择剔除该遗传疾患的致病基因。
鉴于以上研究背景，申请人利用该近交系为研究材料，采用全基因组连锁定位分析和目标区域深度重测序的方法，结合生物信息学分析，鉴别到导致该疾病的因果基因（Causitive gene）和因果突变（Causal mutation），并建立了高效低成本的致病基因检测方法。这不仅为中国地方猪种的提纯复壮提供全新高效的基因诊断手段，也为人类先天性外耳发育畸形的遗传解析研究提供重要科学借鉴。
发明内容
本发明的一个目的是提供一个导致猪先天性外耳发育畸形的因果基因和因果突变位点，即：序列表SEQ ID NO:1所示的位于猪18号染色体上的HOXA1基因外显子1上的变异序列，序列标注位置为451处的G451-TC451的核苷酸突变。通过现代分子生物学技术检测这个因果突变，可以剔除携带不利等位基因的个体。
本发明的另一个目的是导致猪外耳发育畸形的因果突变位点在种猪遗传改良中的应用；即通过现代分子生物学技术检测上述因果突变的基因型，淘汰携带致病等位基因的个体，提纯种猪特别是中国地方猪，避免致病基因给养猪生产带来的经济损失。
本发明的上述因果突变位点在种猪遗传改良中的应用是这样实现的：利用本发明上述鉴别到的因果突变，建立因果突变基因型检测方法，选择g.50111251G>TC突变的有利基因型（GG）个体留种，将导致外耳缺陷疾病的因果突变应用于种猪遗传改良，淘汰杂合子（G/TC）个体。剔除致死突变的危害，进而达到提纯中国地方猪种的目的。
附图说明
图1为二花脸×沙子岭F2近交系群体个体外耳表型图；
图2为影响猪先天性外耳发育畸形的全基因组连锁定位结果示意图；
图3为18号染色体上猪先天性外耳发育畸形因果突变所在目的区间的示意图；
图4为因果突变g.50111251G>TC突变前后示意图；
图5为因果突变g.50111251G>TC的PCR SmaI-RFLP方法检测结果示意图。
具体实施方式
本发明中因果突变位点的筛选过程如下：
1、实验动物和表型测定
本发明所使用的实验群体为二花脸×沙子岭猪F2近交群体。
该群体以1头二花脸公猪和1头沙子岭母猪交配得到1头F1公猪和1头F1母猪，两头F1自交四胎次，生产45头F2个体；1头F2公猪和2头F2母猪回交，生产24头回交个体。所有F2个体和回交个体出生时即观察外耳表型，拍照留档。
2、猪的全基因组60K SNP分型
选取上述实验群体的F0、F1和前三胎的F2个体33头；用苯酚氯仿提取法抽提每个个体耳组织的全基因组DNA。经Nanodrop-1000分光光度计检测，将质量合格的DNA样品统一稀释至50ng/μl后，送往北京怡美通德有限公司，通过Illumina Beedstation系统，对所有个体进行猪全基因组60K SNP芯片（Illumina,美国）扫描分型。利用R语言GenABEL包中checkmarker对芯片分型结果进行质量控制：剔除SNP检出率低于95%，次等位基因频率小于0.05，基因组定位信息不清和家系孟德尔错误率高于0.1的SNP信息；剔除家系孟德尔错误率高于0.05的个体信息。最后，用于分析的有效SNPs共49204个，个体33个。
3、全基因组连锁分析和表型正常个体的断点重组分析
利用Plink软件的DFAM程序进行18条常染色体的全基因组连锁分析，结果仅在18号染色体上定位到了显著影响此疾病的信号峰，见图2。图2为影响猪先天性外耳发育畸形的全基因组连锁定位结果示意图；其中，猪的18条常染色体信息标识于X轴，49204个SNPs与先天性外耳发育畸形相关性的-log10(P)值按SNP在基因组中的位置显示于Y轴。
从图2可知，信号最强的80个SNP（P=6.33×10-5）位于国际猪基因组参考序列（10.2版本）上SNP ss131556188～ss120023110（40762844-50837228bp）之间10.1Mb的区域内。
利用Phase软件对上述33头个体的60k芯片分型结果构建18号染色体上的单倍型，结果显示全部8个患病个体的16条染色体、2个F1个体的2条染色体和F0沙子岭的1条染色体共享上述10.1Mb的片段。在此10.1Mb区间内，对表型正常的21个F2个体进一步进行断点重组分析。结果显示C2546、C3014和C3016个体与患病个体各自共享一条染色体，剩余3条染色体在SNP ss71867771处发生重组，此SNP的上游区段同时为患病个体所共有。
因此，导致猪先天性外耳发育畸形的因果突变的目的区间为下游区段的SNPss71867771～ss120023110（48877373-50837228bp）之间的1.96Mb区域，见图3，致病突变来源于F0代的沙子岭母猪。图3为18号染色体上猪先天性外耳发育畸形因果突变所在目的区间的示意图。其中，ID表示个体号；F0和F1表示个体的世代；“1”“2”数字上面对应的是SNP信息。图3中碱基ATCG用1234代替；所有患病个体的共享染色体区域（IBD）用黑框标识。
4、目的区域的重测序
将目的区间向上下游延伸至4.0Mb（47363051-51354249bp）大小，通过NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载18号染色体该区间4.0Mb的猪基因组序列。选取1头患病个体及其F1杂合子父母本共3个DNA样品，委托深圳华大基因研究院，利用NimbleGen捕获平台进行有效深度为100倍的重测序。
5、重测序结果分析
按照深圳华大基因研究院的标准流程对目的区域进行捕获重测序，针对重测序结果进行SNP和INDEL分析，共发现1288个SNPs和188个插入缺失突变。其中，可能导致基因功能改变且符合患病家系孟德尔遗传规律的共有12个突变，包括3个错义突变、1个移框突变、1个剪接突变、6个UTR区突变和1个启动子区突变，这些突变是可能导致外耳遗传疾患的候选因果突变。
6、因果突变确定及验证
（1）比较测序确定候选因果突变
针对上述12个候选因果突变，利用Primer Premier6.0设计引物；表1为检测12个候选因果突变所用的引物及其扩增片段大小。选取来源广泛且表型正常的中国地方猪12个品种的24个个体进行双向比较测序，表2为12个候选因果突变位点在24个中国地方猪个体中的基因型分布。25μL的聚合酶链式反应（PCR）体系包括40ng猪基因组DNA，0.1mM MgCl2，8μM dNTP，各40pmol正反向引物，2.0U DNA聚合酶及2.5μl10×buffer（上海申能博彩公司）。
表1
引物6和9的扩增条件为94℃5min；94℃30s，68℃（每个循环减1℃）40s，72℃1min，18个循环；94℃30s，50℃40s，72℃1min，共20个循环；最后在72℃延伸8min；其余引物的PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，68℃（每个循环减1℃）40s，72℃1min，13个循环；94℃30s，55℃40s，72℃1min，共20个循环；最后在72℃延伸8min。PCR扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行双向测序，测序结果利用DNAStar的SeqMan软件进行分析。
表2（1）
表2（2）
从表2的比较测序结果可知：只有位于HOXA1基因外显子1上的移框突变g.50111251G>TC在24个测序个体中都不存在突变，而其余11个候选突变在这24个个体中存在突变纯合子或高频率的杂合子，由此推测移框突变g.50111251G>TC是目的因果突变。
此外，HOXA1基因的ORF分析表明此移框突变导致HOXA1蛋白翻译的提前终止，使正常编码的336个氨基酸缩短为177个氨基酸。突变蛋白较正常蛋白缺少了HOX基因家族的标志功能结构域-HOX结构域（见图4），由此改变HOXA1蛋白的生物学功能。图4为因果突变g.50111251G>TC的示意图；其中，A为该突变的序列示意图（反向测序峰图）；B显示了该突变导致HOXA1蛋白缺失HOX结构域。此外，HOXA1基因敲除的小鼠也显示耳朵发育异常。由此进一步支持了g.50111251G>TC是导致上述近交系耳发育畸形的因果突变。
（2）因果突变g.50111251G>TC在中国地方猪及西方商品猪中的分布情况
通过NEBcutter网站，发现区分正常和患病个体的致病基因内切酶SmaI，选取代表5大生态类型30个中国地方猪种472个个体及来源广泛的杜长大商品猪72个个体，及二花脸×沙子岭F2近交系全部73个个体进行PCR SmaI-RFLP分型检测。表3列出了因果突变g.50111251G>TC在中西方猪种中的遗传变异。
表3
表3中PCR反应所用引物为表1中的测序引物7，即5’-TGG ACA ATG CAA GAA TGAGC-3’和5’-CCC ACG TCC TAC TTC CAA AA-3’。15μl的PCR反应体系包括基因组DNA40ng，0.05mM MgCl2，0.2μl10×Buffer，0.4mM dNTP，正反向引物各20pmol，1.0U DNA聚合酶（上海申能博彩公司）。PCR的反应条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，共30个循环；72℃8min。
酶切反应体系为10μl，包含5μl PCR反应产物，5U SmaI，1μl10×T buffer，1μl0.1%BSA，至于37℃水浴锅中酶切过夜（TAKARA）。酶切产物经1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，于凝胶成像系统中观测电泳条带。患病个体只有一条453/438bp的条带，正常个体只有一条891bp的条带，杂合子个体分别有一条891bp和453/438bp的条带。图5为因果突变g.50111251G>TC的PCR SmaI-RFLP方法检测结果示意图；从图中可见，泳道3、4、6和7为正常个体，酶切产物为一条891bp条带，基因型为GG；泳道1、2和5为杂合子，酶切产物为一条891bp条带和一条453/438bp条带，基因型为G/TC；泳道9为患病个体，酶切产物为一条453/438bp条带，基因型为TC/TC；泳道8为水对照；M为1kb分子标记。
判型结果显示g.50111251G>TC突变仅出现在二花脸×沙子岭F2近交群体和沙子岭群体中，且表型和基因型100%吻合，14个突变纯合子（TC/TC）均为先天性外耳发育畸形患病个体，且符合孟德尔遗传定律；3个杂合子出现在沙子岭群体中；在其他中国地方猪和商品猪个体中，表型和基因型均100%吻合，即所有外耳发育正常个体均为野生型个体。由此，可以确定移框突变g.50111251G>TC就是导致猪先天性外耳发育畸形的因果突变。
7、因果突变序列
下列SEQ ID NO:1序列第451个核苷酸处的突变451G-451TC，突变后的序列即SEQ IDNO:2。SEQ ID NO:1为NCBI网站公布的国际猪基因组参考序列（10.2版本）18号染色体上第50110801个核苷酸至第50112293个核苷酸之间的序列。
实施例
针对湖南省湘潭市沙子岭猪所有的核心群个体，利用上述的PCR SmaI-RFLP方法检测g.50111251G>TC突变位点的基因型，剔除携带不利等位基因g.50111251TC的个体，提纯沙子岭猪。具体是：采集湖南省湘潭市沙子岭原种场核心群75头沙子岭猪的耳组织样品，利用酚氯仿抽提DNA。采用前述的PCR SmaI-RFLP方法检测因果突变位点g.50111251G>TC的基因型，结果显示75头中有3头杂合子个体，剔除这三头个体，此后沙子岭育种中心群体中无外耳先天性发育畸形疾病的发生。
Claims (5)
1.一种位于猪18号染色体上的HOXA1基因，其核苷酸序列为如下序列a)或b)：
a)如SEQ ID NO：2所示的序列；
b)能与序列a)互补的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的HOXA1基因在与先天性外耳发育畸形相关的种猪选育中的应用。
3.一种影响猪先天性外耳发育畸形的因果突变标记，其特征在于：所述因果突变标记为位于猪18号染色体上HOXA1基因的序列标注位置为451处的G451-TC451突变。
4.一种如权利要求3所述的因果突变标记在种猪遗传改良中的应用。
5.一种种猪遗传改良的方法，其特征在于，在种猪群中，检测猪18号染色体上的HOXA1基因中的核苷酸是SEQ ID NO:1序列5’端第451位的G，还是SEQ ID NO:2序列5’端第451位的TC，保留GG基因型个体，淘汰G/TC基因型和TC/TC基因型个体。
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