CN112595766A - 一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器及其应用 - Google Patents

一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器及其应用，采用一步电化学沉积法制备SPCE‑Au电极，引入巯基修饰的捕获链形成SH‑DNA/SPCE‑Au电化学检测基底；将靶标、crRNA和LwaCas13a特异性结合形成三元复合物，实现对报告探针的非特异性、非靶标性降解(反式切割)。SH‑DNA/SPCE‑Au作为检测平台对报告探针进行捕获，完成检测信号从无到有的过程，即“signal on”检测机理，实现对靶标序列的检测。

Description

一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器及其应用
技术领域
本发明涉及一种传感器的构建策略及应用，特别是涉及一种CRISPR/Cas13a与电化学联用技术的开发与应用。
背景技术
目前，CRISPR/Cas系统已成功应用于各类核酸检测中，主要利用溶液相的荧光分析技术。其主要原理是Cas13a蛋白结合crRNA识别靶标，通过激活Cas13a的反式切割活性，对周围存在的RNA荧光探针进行非特异性、非靶标性降解(反式切割)。通过切割，使RNA探针两端的荧光基团和淬灭基团分离开，实现荧光信号的恢复。目前荧光分析技术依赖特定的仪器，不能满足现场检测需求；此外，荧光信号易被游离的猝灭基团猝灭，使检测信号的丢失，造成假阴性结果，对真实检测结果容易形成误判。因此，急需发展快速、准确、便捷、稳定的的检测方法和开发相关检测器件。
发明内容
发明目的：本发明的目的之一是提供一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，发展一种可移动电化学传感平台，且具有高灵敏度、高选择性的检测效果；本发明的目的之二是提供一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器用于病原微生物的检测应用。
技术方案：本发明提供的一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，该传感器的构建方法包括如下步骤：
(1)在丝网印刷电极SPCE上制备花状金纳米颗粒，得到SPCE-Au电极；
(2)在SPCE-Au电极上通过Au-S键连接巯基修饰的捕获链SH-DNA，形成SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台；
(3)将电化学信号分子修饰的RNA探针结合在基底表面，RNA探针为DNA和RNA嵌合链，含有Cas13a切割位点，RNA探针中的DNA序列部分与SH-DNA互补。
其中，所述电化学信号分子为亚甲基蓝、辣根过氧化物酶或现有技术中其他电化学信号分子。
本发明中使用生物素、亚甲基蓝修饰的RNA(ssRNA)与链霉亲和素修饰的96孔板结合，使ssRNA探针固定在孔板表面；ssRNA为DNA和RNA嵌合链，含有Cas13a切割位点，部分序列与SH-DNA互补。
本发明采用一步沉积法，在低成本SPCE表面制备一种形貌规则可控、电子传递性能佳的花状纳米结构，增加电极的比表面积用以组装更多探针DNA，进一步提高检测灵敏度；选择CRISPR/Cas13a体系和DNA特异性杂交技术，提高检测平台的检测特异性。相较于传统电极而言，SPCE成本低廉、易于修饰、携带方便并且能够大规模生产。
其中，SPCE-Au电极的制备方法包括如下步骤：
(1)将SPCE电极表面清洗、吹干备用；具体地，可用乙醇、超纯水各冲洗3次后用氮气吹干；
(2)在SPCE表面修饰聚丙烯酸/聚乙烯亚胺层(PAA/PEI)，本发明通过在电极表面结合聚电解质多层，为金属离子提供更加有效的成核位点，并为纳米结构生长提供更加精确的路径。
具体地，配置质量分数为20％的聚丙烯酸(PAA)和聚乙烯亚胺(PEI)，将电极浸没在20％的PAA溶液中10min，取出用超纯水冲洗并用氮气吹干，然后放入20％的PEI溶液中10min；按此方法交替处理电极3次，完成最后一次处理后，将电极从PEI中取出，用超纯水将电极表面冲洗干净，并用氮气吹干备用。
(3)配置氯金酸溶液，将一定浓度的氯金酸滴加在电极表面，电化学沉积花状金纳米结构。
其中，步骤(3)中，氯金酸的浓度为20～30mM，沉积电势为-0.1～-0.5V，沉积时间为900～1800s，可通过改变氯金酸的浓度、沉积电势和沉积时间对金纳米结构的形貌进行调控。
优选地，氯金酸的浓度为24～26mM，沉积电势为-0.2～-0.3V，沉积时间为1100s～1300s，该电沉积条件下的所形成的花状纳米形貌具有较强的电化学响应。进一步地，氯金酸的浓度为25mM，沉积电势为-0.25V，沉积时间为1200s时电沉积所形成的花状纳米形貌具有最强的电化学响应。
本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器在检测特定序列中的应用。该应用为非疾病诊断目的。
将电化学信号分子修饰的RNA结合在基底表面，本发明中使用生物素、亚甲基蓝修饰的RNA(ssRNA)与链霉亲和素修饰的96孔板结合，使ssRNA固定在孔板表面；实现对96孔板上ssRNA的切割，使电化学信号分子(如亚甲基蓝)标记的ssRNA从96孔板表面脱离，游离于溶液中；SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台通过DNA杂交捕获切割后的ssRNA探针，通过检测亚甲基蓝信号实现对靶标的检测。当靶标不存在时，SPCE电极上的电信号则没有改变。
引入特定靶标，通过激活LwaCas13a的反式切割活性，实现对96孔板上ssRNA的切割，使亚甲基蓝标记的ssRNA从96孔板表面脱离，游离于溶液中；SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台通过DNA杂交捕获切割后的ssRNA，通过检测亚甲基蓝电化学信号实现靶标的检测。本发明实施例中的靶标使用的是H7N9，当检测其它靶标时，只需要改变对应的crRNA即可。
本发明的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，可实现不同靶标浓度的高效、快速、精准检测，靶标浓度为1pM-10nM。
其中，上述制备SH-DNA/SPCE-Au电化学检测基底和三元复合物包括如下步骤：
(1)配置缓冲溶液：10mM Tris-HCl，10mM NaCl，1.5mM MgCl2；
(2)用1mM TCEP活化1μM SH-DNA30 min，取10μL滴加在SPCE-Au电极表面，室温孵育16h；
(3)用缓冲溶液稀释LwaCas13a至20nM，稀释crRNA至10nM，混合后孵育形成crRNA-Cas13a复合物；加入靶标(H7N9)与crRNA特异性结合，孵育形成三元复合物从而激活Cas13a的反式切割活性。
本发明采用电化学一步沉积法，在低成本SPCE表面制备一种形貌规则可控、电子传递性能佳的纳米结构花状表面，增加电极的比表面积用以组装更多探针DNA。用生物素与亚甲基蓝修饰的RNA(ssRNA)与链霉亲和素修饰的96孔板结合，将ssRNA固定在孔板表面。ssRNA为DNA和RNA嵌合链，含有Cas13a切割位点，部分序列与SH-DNA互补。当靶标存在时，靶标(H7N9)、crRNA与LwaCas13a特异性结合形成三元复合物，实现对96孔板上连接ssRNA的非特异性、非靶标性降解(反式切割)，使亚甲基蓝标记的ssRNA从96孔板表面脱离，游离于溶液中；在SPCE-Au表面通过Au-S键连接巯基(SH)修饰的捕获链(SH-DNA)，SH-DNA/SPCE-Au作为检测平台对ssRNA进行捕获，完成检测信号从无到有的过程，即“signal on”检测机理，实现对靶标序列的检测。当靶标不存在时，SPCE电极上的电化学信号没有改变。
本发明通过CRISPR/Cas13a体系和电化学联用，通过检测电化学信号分子实现靶标的检测。本发明采用“signal on”检测机制，避免了“signal off”所带来的假阳性信号。
电化学分析技术是一种公认的易于器件化的检测方法，因其具有低成本，易操作，高灵敏度和良好的选择性等特点，已被广泛用于各种检测场景和开发高效检测器件，如家用血糖仪等。相比于传统电极，丝网印刷碳电极(SPCE)具有易于修饰、携带方便并且能够大规模生产等优点而备受关注。而本发明通过可控制备基于SPCE的电化学检测芯片，结合设计的小型便携式电化学设备，利用CRISPR/Cas13a体系的高效识别与切割能力，可实现对病原微生物高灵敏、高特异性的检测。本发明所设计的检测平台，可实现现场、实时、快速检测，满足农村等偏远地区或缺少相关大型仪器等场所的检测需求，为疾病乃至传染病的早期筛查与检测提供新的检测方法与检测器件。本发明采用一步电化学沉积法制备SPCE-Au电极，引入巯基修饰的捕获链形成SH-DNA/SPCE-Au电化学检测基底；将靶标、crRNA和LwaCas13a特异性结合形成三元复合物，实现对报告探针的非特异性、非靶标性降解(反式切割)。SH-DNA/SPCE-Au作为检测平台对报告探针进行捕获，完成检测信号从无到有的过程，即“signal on”检测机理，实现对靶标序列的检测。
有益效果：
(1)与现有技术相比，本发明通过在SPCE表面滴加前驱体溶液、一步电化学沉积法在SPCE电极表面制备特定花状形貌的金纳米结构；本发明SPCE-Au电极制备方法简单、成本低廉，沉积所需的前驱体HAuCl4溶液仅需10-15μL，成本在0.3元左右；
(2)本发明通过激活LwaCas13a的反式切割活性，实现对基底表面的ssRNA的切割，使标记有信号分子的ssRNA切割片段游离于溶液中，便于与SPCE-Au表面的捕获探针杂交，完成检测信号的捕获，具有高的特异性；
(3)本发明设计可便携式小型电化学检测设备，将SPCE通过USB接口与便携式电化学设备相连，利用蓝牙技术，实现设备与手机的同步，通过手机APP软件进行检测与读数，具有很好的应用前景；
(4)本发明采用“signal on”检测机制，避免了“signal off”所带来的假阳性信号；
(5)本发明具有现场操作、检测时间短，精度高等显著优点。
附图说明
图1是本发明的CRISPR/Cas13a-电化学检测原理示意图；
图2是花状金纳米结构的形貌示意图；
图3是花状金纳米结构的形貌示意图，放大倍数为图2的10倍左右；
图4是实施例2的金纳米结构形貌示意图；
图5是实施例3的金纳米结构形貌示意图；
图6是对比例1的金纳米结构形貌示意图；
图7是对比例2的金纳米结构形貌示意图；
图8是实施例1～3和对比例金纳米结构的DPV检测图；
图9是在未扩增条件下，SPCE-Au电极检测不同浓度靶标的线性曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步地详细描述。
本实施例涉及的试剂均为市售。
如图1所示为CRISPR/Cas13a-电化学检测原理图，图中A表示SPCE-Au基底的制备，B表示激活LwaCas13a蛋白反式切割活性的过程。本发明采用简单、高效的一步沉积法成功制备分散性良好的花状形貌SPCE-Au电极。采用链霉亲和素和生物素特异性结合将探针ssRNA固定在96孔板上。当靶标存在时，靶标(H7N9)、crRNA会与LwaCas13a特异性结合从而反式非靶标切割，实现对96孔板上探针ssRNA的切割，使亚甲基蓝标记的ssRNA切割片段从96孔板表面脱离，游离于溶液中，并与SPCE-Au表面的捕获探针DNA杂交，通过检测亚甲基蓝的电化学信号实现对特定序列的检测。
实施例1：
本实施例采用电化学一步沉积法，在低成本SPCE表面制备一种形貌规则可控、电子传递性能佳的花状纳米结构，得到SPCE-Au电极，包括如下步骤：
(1)SPCE电极的清洗
将SPCE电极表面用乙醇、超纯水各冲洗3次，后用氮气吹干备用；
(2)在SPCE表面修饰PAA/PEI
配置质量分数为20％的聚丙烯酸(PAA)和聚乙烯亚胺(PEI)，将电极浸没在20％的PAA溶液中10min，取出用超纯水冲洗并用氮气吹干，然后放入20％的PEI溶液中10min；按此方法交替处理电极3次，完成最后一次处理后，将电极从PEI中取出，用超纯水将电极表面冲洗干净，并用氮气吹干备用；
(3)金纳米结构的沉积：
配置氯金酸溶液，通过将一定浓度的氯金酸滴加到电极表面，电化学沉积花状金纳米结构。通过在电极表面结合聚电解质多层，为金属离子提供更加有效的成核位点，并为纳米结构生长提供更加精确的路径。
本实施例中的氯金酸的浓度为25mM、沉积电势为-0.25V、沉积时间为1200s，如图2、3所示，呈典型的花状金纳米结构。
(4)沉积结束后，取出电极，用超纯水冲洗氮气吹干备用，得到SPCE-Au电极。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为25mM、沉积电势为-0.1V、沉积时间为1200s。
制备得到的金纳米结构如图4所示，呈刺状形貌金纳米结构。
实施例3：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为20mM、沉积电势为-0.25V、沉积时间为1200s。
制备得到的金纳米结构如图5所示，呈球状形貌金纳米结构。
通过场发射电子显微镜(SEM)观察实施例1～3制备获得的花状金纳米结构的形貌，结果如图2～5所示；从SEM图结果可见，沉积条件不同会产生不同形貌的金纳米结构，图2，3所示当氯金酸的浓度为25mM、沉积电势为-0.25V、沉积时间为1200s时时沉积的金纳米结构具有良好的花状形貌，规则度和尺寸均一性均较好。
对比例1：
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为10mM、沉积电势为0.3V、沉积时间为1800s。
制备得到的金纳米结构如图6所示，呈颗粒状形貌金纳米结构。
对比例2：
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为50mM、沉积电势为-0.3V、沉积时间为1800s。
制备得到的金纳米结构如图7所示，呈枝状形貌金纳米结构。
如图8所示为设上述实施例1～3和对比例1、2中不同金纳米结构的DPV检测图，可以看出采用实施例1的电沉积参数所制备得到的花状纳米结构具有最强的电化学响应，而对比例1和对比例2未在相应的电沉积参数范围内，金纳米结构与典型的花状结构相差较大，且电化学响应特性很差；同时，对比例1的颗粒状相貌金纳米结构对应的电化学相应特性最差，进一步说明了制备花状金纳米结构的电化学沉积参数的重要性。
实施例4：
本实施例与与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为24mM、沉积电势为-0.2V、沉积时间为1100s。
制备得到的金纳米结构同实施例1相同，呈典型的花状金纳米结构，其电化学响应特性结果同实施例1相符。
实施例5：
本实施例与与实施例1基本相同，不同之处在于步骤(3)的电沉积工艺参数，氯金酸的浓度为26mM、沉积电势为-0.3V、沉积时间为1300s。
制备得到的金纳米结构同实施例1相同，呈典型的花状金纳米结构，其电化学响应特性结果同实施例1相符。
以下实施例采用上述实施例1制备得到的SPCE-Au电极，构建SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台。
实施例6：
本实施例制备SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台和三元复合物，步骤如下：
(1)配制缓冲溶液：10mM Tris-HCl，10mM NaCl，1.5mM MgCl2；
(2)用1mM TCEP活化1μM SH-DNA30 min，取10μL滴加在SPCE-Au电极表面，室温孵育16h；
(3)用之前配置的缓冲溶液稀释LwaCas13a至20nM，稀释crRNA至10nM，混合后孵育形成crRNA-Cas13a复合物；加入靶标(H7N9)与crRNA特异性结合，孵育形成三元复合物从而激活Cas13a的反式切割活性。
实施例7：
(1)用pH 9.6的碳酸盐溶液配置12mg/L的链霉亲和素(SA)溶液；
(2)在96孔板中加入100μL 12mg/L SA溶液，4℃孵育16h；
(3)除去96孔板中的溶液，加入100μL的PBS洗液，在300rpm条件下洗板1min，重复3次，并将1％BSA加入96孔板中，37℃孵育1h；
(4)除去96孔板中的溶液，加入100μL的PBS洗液，在300rpm条件下洗板1min，重复3次，并将1μM ssRNA加入96孔板中，37℃孵育2h；
(5)除去96孔板中的溶液，加入100μL的PBS洗液，在300rpm条件下洗板1min，重复3次，并将实施例2步骤(3)中形成的三元复合物加入96孔板中，室温孵育30min实现对ssRNA的反式切割，使亚甲基蓝标记的ssRNA切割片段从96孔板表面脱离，游离于溶液中，取出孔板中溶液保留待用。
将实施例3步骤(5)中的溶液滴加在SH-DNA/SPCE-Au电极表面，室温孵育30min通过ssRNA与SH-DNA杂交，电化学检测电化学活性分子亚甲基蓝的信号，实现特定序列的检测。
将SH-DNA/SPCE-Au作为检测平台，通过SH-DNA和ssRNA特异性结合捕获亚甲基蓝信号实现对病原微生物的快速检测。如图9所示，在未扩增条件下靶标(H7N9)浓度低至1pM时，仍有明显信号，证明该检测平台具有较好的检测性能。
其中，本发明中所涉及的核素序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0002727676960000071

Claims (9)

1.一种基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，其特征在于该传感器的构建方法包括如下步骤：
(1)在丝网印刷电极(SPCE)上制备花状金纳米结构，得到SPCE-Au电极；
(2)在SPCE-Au电极上通过Au-S键连接巯基修饰的捕获链SH-DNA，形成SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台；
(3)将电化学信号分子修饰的RNA探针结合在基底表面，RNA探针为DNA和RNA嵌合链，含有Cas13a切割位点，RNA探针中的DNA序列部分与SH-DNA互补。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，其特征在于SPCE-Au电极的制备方法包括如下步骤：
(1)将SPCE电极表面清洗、吹干备用；
(2)在SPCE表面修饰聚丙烯酸/聚乙烯亚胺层(PAA/PEI)；
(3)配置氯金酸溶液，将氯金酸溶液滴加在电极表面，电化学沉积花状金纳米结构。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，其特征在于：氯金酸的浓度为20～30mM，沉积电势为-0.1～-0.5V，沉积时间为900～1800s。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，其特征在于：氯金酸的浓度为24～26mM，沉积电势为-0.2～-0.3V，沉积时间为1100～1300s。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器，其特征在于：所述电化学信号分子为亚甲基蓝或辣根过氧化物酶。
6.一种权利要求1～5中任一项所述的基于CRISPR/Cas13a的电化学传感器在检测特定序列中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：引入特定靶标，通过激活LwaCas13a的反式切割活性，实现对基底上ssRNA的切割，使电化学信号分子标记的ssRNA从96孔板表面脱离，游离于溶液中；SH-DNA/SPCE-Au电化学检测平台通过DNA杂交捕获切割后的ssRNA，通过检测电化学信号分子的电化学信号实现靶标的检测。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述靶标的浓度为1pM～10nM。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，制备SH-DNA/SPCE-Au电化学检测基底和三元复合物包括如下步骤：
(1)配置缓冲溶液；
(2)用TCEP活化SH-DNA，后滴加在SPCE-Au电极表面，后进行室温孵育；
(3)用缓冲溶液稀释LwaCas13a和crRNA，混合后孵育形成crRNA-Cas13a复合物；加入靶标与crRNA特异性结合，孵育形成三元复合物从而激活Cas13a的反式切割活性。
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