JP2007290929A - ナノ構造体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質が固定された新規なナノチューブ構造体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】たんぱく質を含む溶液に窒化ホウ素ナノチューブを分散させ、１００時間以上攪拌する。これにより、窒化ホウ素ナノチューブ上にたんぱく質が固定化する。また、窒化ホウ素ナノチューブを１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆することにより、攪拌時間を短縮できる。たんぱく質には、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン、ブドウ糖酸化酵素を用いる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質が固定されたナノ構造体及びその製造方法に関する。

最近、カーボンナノチューブの応用の一環として、バイオセンサーのような生物分野への応用に努力が払われてきている。例えば、単層カーボンナノチューブを用いたグルコースバイオセンサー（例えば、非特許文献１参照）、カーボンナノチューブにポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルを結合させた材料から構成された電界効果トランジスタを用いてたんぱく質の一つであるストレプトアビジンを認識させるセンサー（例えば、非特許文献２参照）、単層カーボンナノチューブにグルコースオキシダーゼを固定化した材料からなる半導体を用いたグルコースの酸化（例えば、非特許文献３参照）、単層カーボンナノチューブにキモトリプシンを固定化したバイオ触媒フィルム（例えば、非特許文献４参照）などが知られている。

これらの基礎となるアイディアは、どこから来ているかといえば、カーボンナノチューブへのたんぱく質の固定化であり、単層カーボンナノチューブに１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルを作用させ、たんぱく質のアミノ基と反応させて固定化する方法（例えば、非特許文献５参照）、単層カーボンナノチューブにチトクロームＣを固定化する方法（例えば、非特許文献６参照）、アミノ基を有する単層カーボンナノチューブとモデルペプチドとの反応による固定化（例えば、非特許文献７参照）、単層カーボンナノチューブへのフェリチンの固定化（例えば、非特許文献８参照）等が知られている。

Jason J. Davis他、Chem. Eur. J.、9巻、3732頁、2003年 Alexander Star他、Nano Lett.、3巻、459頁、2003年 Koen Besteman他、Nano Lett.、3巻、727頁、2003年 Kaushal Rege他、Nano Lett.、3巻、829頁、2003年 Robert J. Chen他、J. Am. Chem. Soc.、123巻、3838頁、2001年 Bobak R. Azamian他、J. Am. Chem. Soc.、124巻、12664頁、2002年 Davide Pantarotto他、J. Am. Chem. Soc.、125巻、6160頁、2003年 Yi Lin,他、J. Phys. Chem. B、108巻、3760頁、2004年

しかしながら、現在まで窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質を固定化してなる材料は得られていない。

本発明は、上記課題に鑑み、窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質が固定されてなる、新規なナノ構造体及びその製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明のナノチューブ構造体は、たんぱく質が窒化ホウ素ナノチューブに固定されてなる。
上記構成によれば、窒化ホウ素ナノチューブの表面に、たんぱく質を固定化したナノチューブ構造体が得られる。

本発明の上記ナノチューブ構造体の製造方法は、たんぱく質を含む溶液に窒化ホウ素ナノチューブを分散させて分散液を作成し、この分散液を撹拌することにより、たんぱく質を固定した窒化ホウ素ナノチューブを得ることを特徴とする。
上記構成において、好ましくは、分散液の攪拌時間が１００時間以上である。好ましくは、たんぱく質は、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン及びブドウ糖酸化酵素の何れかである。
上記製造方法によれば、窒化ホウ素ナノチューブの表面に、たんぱく質を固定することができる。

本発明のナノチューブ構造体は、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆されてなる窒化ホウ素ナノチューブに、たんぱく質が固定されてなる。
上記構成において、好ましくは、たんぱく質は、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン及びブドウ糖酸化酵素の何れかである。
上記構成によれば、窒化ホウ素ナノチューブが１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆されおり、その表面に、たんぱく質を固定化したナノチューブ構造体が得られる。

本発明のナノ構造体の製造方法は、窒化ホウ素ナノチューブと１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルとの混合物を含んだ有機溶媒分散液を撹拌し、有機溶媒分散液をろ過することにより、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブを得て、次に、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブを、たんぱく質を含む溶液に分散させて分散液を作成し、分散液を攪拌することで、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質を固定することを特徴とする。
上記構成において、好ましくは、有機溶媒分散液の攪拌時間が２時間以上であり、分散液の攪拌時間が２０時間以上である。たんぱく質は、好ましくは、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン及びブドウ糖酸化酵素の何れかである。
上記製造方法によれば、窒化ホウ素ナノチューブの表面を１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆し、その表面にたんぱく質を固定化することができる。

本発明により、窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質が固定されてなるナノ構造体及びその製造方法を提供することができる。これにより、バイオセンサーなどに応用することができる。

最初に、本発明の、窒化ホウ素ナノチューブへたんぱく質が固定されてなるナノチューブ構造体の第１の製造方法について説明する。
先ず、たんぱく質を含んだ溶液に窒化ホウ素ナノチューブを分散させ、この分散液を１００時間以上攪拌する。次に、ろ過して水洗する。以上の操作を行なうことで、窒化ホウ素ナノチューブの表面にたんぱく質が固定化されてなるナノチューブ構造体を得ることができる。

攪拌時間は１００時間以上が好ましい。攪拌時間が１００時間未満では、十分な量のたんぱく質が固定化されないので、好ましくない。

たんぱく質としては、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン、ブドウ糖酸化酵素(グルコースオキシダーゼ)などを挙げることができる。

次に、本発明の、窒化ホウ素ナノチューブへたんぱく質が固定されてなるナノチューブ構造体の第２の製造方法について説明する。
先ず、窒化ホウ素ナノチューブをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドその他の有機溶媒に分散させる。得られた分散液に、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルを添加し、２時間撹拌する。この攪拌操作により、窒化ホウ素ナノチューブの表面を１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆することができる。
次に、この１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブをたんぱく質溶液に分散させ、２０時間以上撹拌した後、ろ過、水洗する。この操作により、たんぱく質が固定化される。

ここで、たんぱく質としては、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン、ブドウ糖酸化酵素（グルコースオキシダーゼ）などを挙げることができる。

第１の製造方法とは異なり、第２の製造方法では、窒化ホウ素ナノチューブを１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで処理することにより、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆された窒化ホウ素ナノチューブとし、これを使用することによって、たんぱく質が固定化される時間が著しく短縮される。これは、窒化ホウ素ナノチューブのホウ素及び窒素からなる六員環と１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルのピレン環との間の強い相互作用や、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルの酪酸エステル部分とたんぱく質のアミノ基との反応によるものである。

以上により、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆された窒化ホウ素ナノチューブに、たんぱく質が強固に固定されてなるナノチューブ構造体を得ることができる。このようにして得られたナノチューブ構造体は、窒化ホウ素ナノチューブのホウ素と窒素からなる六員環平面と１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルのピレン環平面同士が強く相互作用するとともに、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル部分とたんぱく質のアミノ基とが反応することにより、たんぱく質が強固に固定されている。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
まず、窒化ホウ素ナノチューブを既知の方法で次のように製造した。
ホウ素粉末２ｇ、酸化鉄(II)粉末（ＦｅＯ）１ｇ及び酸化マグネシウム（ＭｇＯ）１ｇの混合物を窒化ホウ素製坩堝に入れ、この坩堝を縦型高周波誘導加熱炉中の窒化ホウ素製ボートの中に設置した。加熱炉の中に、４００ｃｍ^３／分の流量のアンモニアガスを流しながら、１５００℃で１時間加熱した。窒化ホウ素製ボート内に、直径が２０〜８０ｎｍで、長さが数十μｍの白色の窒化ホウ素ナノチューブが２００ｍｇ堆積した。得られた窒化ホウ素ナノチューブを約１９００℃に加熱して、触媒粒子や不純物を除去した。

馬脾臓由来のフェリチン溶液（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇを、濃度７．５ミリモルの食塩水溶液に加えて、総量１０ｃｍ^３の溶液とした。この１０ｃｍ^３の溶液に、上記で製造した窒化ホウ素ナノチューブ５ｍｇを分散させて、１２０時間撹拌した。分散液をろ過し、水で洗浄したものを分析用試料とした。

図１は、実施例１で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。図１から明らかなように、窒化ホウ素ナノチューブの表面に黒い斑点としてフェリチンが固定されていることが分かった。また、直径約６ｎｍのフェリチン分子の鉄を含んだコアを確認できた。

図２は、実施例１で得た試料のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ：Energy-Dispersiv
e X-ray Analysis）の結果を示す図である。図の縦軸はＸ線強度（任意目盛）を示し、横軸はＸ線エネルギー（ｋｅＶ）を示している。なお、銅（Ｃｕ）のシグナルは試料を取り付ける際に用いた銅グリッドから発生したものである。
図２のＥＤＸスペクトルから明らかなように、フェリチン中に含まれる鉄（Ｆｅ）の存在が確認できた。これは、窒化ホウ素ナノチューブの表面にフェリチンが固定されたためである。

図３は、実施例１において、窒化ホウ素ナノチューブの製造直後、すなわち、フェリチン溶液に分散させる前の窒化ホウ素ナノチューブのエネルギー分散型Ｘ線分析の結果を示す図である。図の縦軸はＸ線強度（任意目盛）を示し、横軸はＸ線エネルギー（ｋｅＶ）を示している。なお、銅（Ｃｕ）のシグナルは試料を取り付ける際に用いた銅グリッドに由来している。
図３から明らかなように、ＥＤＸスペクトルにおいて、鉄（Ｆｅ）のシグナルは見出されない。これにより、フェリチン溶液に分散させる前の窒化ホウ素には、鉄が含まれていないことが確認できた。

図２及び図３の結果を比較することで、窒化ホウ素ナノチューブを製造する際に触媒として用いた酸化鉄（II）による鉄成分は、約１９００℃の熱処理を施しているので消失していることが分かった。

次に、実施例１に対する比較例について説明する。
（比較例）
攪拌時間を４８時間とした点以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果、窒化ホウ素ナチューブの表面にはフェリチン分子が少し点在するだけであった。

馬心筋由来のチトクロームＣ（和光純薬工業（株）製）１５０ｍｇを濃度５ミリモルの食塩水溶液に加え、１０ｃｍ^３の溶液とした。この溶液中に実施例１と同様に合成した窒化ホウ素ナノチューブ５ｍｇを添加して、１２０時間撹拌し、ろ過、水洗して、実施例２の試料を得た。

図４は、実施例２で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。図４から明らかなように、窒化ホウ素ナノチューブの最も外側の表面に非晶質の層が存在しているのが確認される。この層がチトクロームＣの層で窒化ホウ素ナノチューブに固定されていることが分かった。

ストレプトマイセス属由来のストレプトアビジン（和光純薬工業（株）製）２００ｍｇを濃度１．５ミリモルの食塩水溶液に加え、１０ｃｍ^３の溶液とした。この溶液中に実施例１と同様に合成した窒化ホウ素ナノチューブ５ｍｇを添加して、１２０時間撹拌し、ろ過、水洗し、実施例の試料を得た。

図５は、実施例３で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。図５から明らかなように、ナノチューブの最も外側の層に非晶質のストレプトアビジンが固定されていることが分かった。

アスペルギルスニガー由来のブドウ糖酸化酵素（グルコースオキシダーゼ）（和光純薬工業（株）製）３００ｍｇを水中へ添加して１０ｃｍ^３の水溶液とした。この溶液に実施例１と同様に合成した窒化ホウ素ナノチューブ５ｍｇを加えて、１２０時間撹拌後、ろ過
、水洗し、実施例４の試料を得た。

図６は、実施例４で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。図６から明らかなように、ナノチューブの最も外側に非晶質のグルコースオキシダーゼが固定されていることが分かった。

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（純度９９．５％、和光純薬工業（株）製）１００ｃｍ^３の中に、実施例１と同様に合成した窒化ホウ素ナノチューブ２０ｍｇを分散させた。この分散液に１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（アルドリッチ社製、純度９５％）２００ｍｇを加えて、２時間撹拌し、生成物をろ過すると共に、過剰の１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルを除去するために、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで繰り返し洗浄した。この洗浄したものを以下、中間生成物と呼ぶ。
一方、実施例１と同様に、馬脾臓由来のフェリチン溶液（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇを、濃度７．５ミリモルの食塩水溶液に加えて、総量１０ｃｍ^３の溶液とした。上記で得た中間生成物５ｍｇを、この１０ｃｍ^３の溶液に分散させ、２４時間撹拌した。分散液をろ過し、水で洗浄し、実施例５の試料を得た。

図７は、実施例５で得た中間生成物の透過型電子顕微鏡像を示す図である。図７から明らかなように、窒化ホウ素ナノチューブの表面が厚い非晶質の１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで覆われていることが分かる。

図８は、実施例５で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
図８から明らかなように、厚い非晶質の１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで覆われている窒化ホウ素ナノチューブの表面には、黒い斑点からなるフェリチン分子が数多く固定されているのが分かる。このように、窒化ホウ素ナノチューブが予め１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで覆われている中間生成物を使用しているため、撹拌時間が２４時間であってもフェリチン分子が十分に固定化されていることが判明した。さらに、実施例１と比較すると、フェリチン分子の固定に要する撹拌時間が大幅に短縮できた。

窒化ホウ素ナノチューブの表面又は１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで覆われた窒化ホウ素ナノチューブの表面に、たんぱく質を固定化することができ、尿中の糖検査などに用いるバイオセンサーに利用可能である。

実施例１で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 実施例１で得た試料のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ：Energy-Dispersive X-ray Analysis）の結果を示す図である。 実施例１において、窒化ホウ素ナノチューブの製造直後、すなわち、フェリチン溶液に分散させる前の窒化ホウ素ナノチューブのエネルギー分散型Ｘ線分析の結果を示す図である。 実施例２で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 実施例３で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 実施例４で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 実施例５で得た中間生成物の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 実施例５で得た試料の透過型電子顕微鏡像を示す図である。

Claims (8)

1. たんぱく質が窒化ホウ素ナノチューブに固定されてなる、ナノチューブ構造体。
2. １−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルで被覆されてなる窒化ホウ素ナノチューブに、たんぱく質が固定されてなる、ナノチューブ構造体。
3. 前記たんぱく質が、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン及びブドウ糖酸化酵素の何れかであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のナノチューブ構造体。
4. たんぱく質を含む溶液に窒化ホウ素ナノチューブを分散させて分散液を作成し、該分散液を撹拌することにより、たんぱく質を固定した窒化ホウ素ナノチューブを得ることを特徴とする、ナノチューブ構造体の製造方法。
5. 前記分散液の攪拌時間が１００時間以上であることを特徴とする、請求項４に記載のナノチューブ構造体の製造方法。
6. 窒化ホウ素ナノチューブと１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルとの混合物を含んだ有機溶媒分散液を撹拌し、該有機溶媒分散液をろ過することにより、１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブを得て、
   次に、上記１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブを、たんぱく質を含む溶液に分散させて分散液を作成し、該分散液を攪拌することで、上記１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステルが付着した窒化ホウ素ナノチューブにたんぱく質を固定することを特徴とする、ナノ構造体の製造方法。
7. 前記有機溶媒分散液の攪拌時間が２時間以上であり、前記分散液の攪拌時間が２０時間以上であることを特徴とする、請求項６に記載のナノ構造体の製造方法。
8. 前記たんぱく質が、フェリチン、チトクロームＣ、ストレプトアビジン及びブドウ糖酸化酵素の何れかであることを特徴とする、請求項４乃至７の何れかに記載のナノチューブ構造体の製造方法。