KR100469868B1 - 작용화된나노튜브 - Google Patents

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밍 루
마크 마틴
츈 밍 니우
나오야 오가타
하워드 테넌트
리웬 동
지 선
래리 헬름스
파비안 저메이슨
팸 라이앙
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Abstract

본 발명은 화학적 치환 또는 작용성 잔기의 흡착에 의해 작용화되는, 관상 풀러렌("버키튜브"로 통칭") 및 피브릴을 포함하는 흑연 나노튜브. 더욱 구체적으로 말해서, 본 발명은 화학 잔기로 균일하게 또는 불균일하게 치환되거나 이때 특정의 사이클릭 화합물이 흡착되는 흑연 나노튜브 및 상호 연결된 이러한 작용화 된 나노튜브로 이루어진 복합 구조물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 나노튜브의 표면에 작용그룹을 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 작용화된 나노튜브의 용도에 관한 것이다.

Description

작용화된 나노튜브
본 출원은 1994년 12월 8일자로 출원된 US 출원번호 제 08/352,400 호의 부분 연속출원이고, 이의 내용은 참조로 본원에 인용된다.
본 출원은 화학적 치환 또는 작용성 잔기의 흡착에 의해 작용화되는, 관상 풀러렌("버키튜브"로 통칭") 및 피브릴을 포함하는 흑연 나노튜브에 관한 것이다.
더욱 구체적으로 말해서, 본 발명은 화학 잔기로 균일하게 또는 불균일하게 치환되거나 이때 특정의 사이클릭 화합물이 흡착되는 흑연 나노튜브 및 상호 연결된 이러한 작용화된 피브릴로 이루어진 복합 구조물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 피브릴의 표면에 작용그룹을 도입하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 서브마이크론 크기의 흑연 피브릴(종종 증기 성장 탄소 섬유로 불림) 분야에 관한 것이다. 탄소 피브릴은 직경이 1.0μ, 바람직하게는 0.5μ 이하, 더욱 바람직하게는 0.2μ 이하인 연충 탄소 퇴적물이다. 이들은 다양한 형태로 존재하고 금속 표면에서 각종 탄소-함유 가스의 촉매 분해를 통해 제조되어 왔다. 이러한 연충 탄소 퇴적물은 거의 전자 현미경의 출현 이래로 관찰되어 왔다. 우수한 초기 조사 및 참고자료는 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Baker and Harris, Chemistry and Physics of Carbon, Walker and Thrower ed., Vol. 14, 1978, p. 83]에서 찾아볼 수 있다. 또한 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Rodriguez, N., J. Mater. Research, Vol. 8, p 3233 (1993)] 참조.
1976년에, Endo 등[참조문헌: Obelin, A. and Endo, M., J. of Crystal Growth, Vol. 32 (1976), pp. 335-349, 본원에서 참조로 인용]에 의해 탄소 피브릴이 성장하는 기본 메커니즘이 규명되었다. 탄화수소 함유 가스의 존재하에서 탄소에 과포화되는 금속 촉매 입자로부터 기원하는 것으로 나타났다. Endo 등에 따라, 즉시 열분해 침착된 흑연 외곽층으로 코팅되는 원통형의 규칙적인 흑연 코어가 압출된다. 열분해 오버코트를 갖는 이러한 피브릴은 전형적으로 직경이 0.1μ 초과, 더욱 전형적으로는 0.2 내지 0.5μ이다.
1983년에, 본원에서 참조로 인용되는 Tennent의 US 특허 No. 4,663,230는 열 분해성 탄소로 오염되지 않은 원통형의 규칙적인 흑연 코어를 성장시키는데 성공하였다. 따라서, Tennent 발명은 전형적으로 35 내지 700Å(0.0035 내지 0.07μ)의 소직경 피브릴 및 규칙적인 "성장" 흑연 표면에 대한 접근법을 제공하였다. 구조는 덜 완전하지만, 또한 열분해성 탄소 외곽층이 없는 피브릴성 탄소도 또한 성장한다.
본원에서 작용화되는 피브릴, 버키튜브 및 미세섬유는 보강재로서 시판되는 연속성 탄소섬유와는 구별된다. 바람직하게는 크되 불가피하게도 일정한 종회비를 갖는 피브릴과는 대조적으로, 연속성 탄소섬유는 적어도 104, 종종 106 이상의 종횡비(L/D)를 갖는다. 연속성 섬유의 직경은 또한, 항상 1.0μ, 전형적으로는 5 내지 7μ로서, 피브릴의 것보다 월등히 크다.
연속성 탄소섬유는 유기 전구체 섬유, 통상적으로 레이온, 폴리아크릴로니트릴(PAN) 및 핏치의 열분해에 의해 제조된다. 따라서, 이들은 자신의 구조안에 헤테로 원자를 포함할 수 있다. "제조된" 연속성 탄소섬유의 흑연 성질은 변화하지만, 이들은 후속 흑연화 단계에 투여될 수도 있다. 흑연화도의 차이, 배향 및 흑연 평면의 결정성(존재할 경우), 헤테로 원자의 잠정적인 존재 및 심지어는 기질 직경의 절대차는 연속성 섬유를 이용한 실험을 미세섬유 화학의 예측자를 어렵게 한다.
Tennent의 US 특허 No. 4,663,230은 연속성 열 탄소 오버코트를 함유하지 않고, 피브릴 축에 실질적으로 평행한 다중 흑연 외곽층을 갖는 탄소 피브릴에 대해 기술하고 있다. 그들 자체는 원통형 축에 실질적으로 수직인 흑연의 만곡층의 접선에 실질적으로 수직인 축인 자신의 c-축을 갖는 것으로 특징지워질 수 있다. 이들은 일반적으로, 0.1μ 이상의 직경 및 적어도 5의 길이 : 직경비를 갖는다. 바람직하게는, 이들은 연속성 열 탄소 오버코트, 즉, 이들의 제조에 사용된 가스 공급물의 열 분해로부터 생기는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는다.
본원에서 참조로 인용되는 Tennent 등의 US 특허 No. 5,171,560은 피브릴 축 상의 층의 돌기가 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장하도록 피브릴에 실질적으로 평행한 흑연층을 갖고 열 오버코트가 없는 탄소 피브릴에 대해 기술하고 있다. 전형적으로, 이러한 피브릴은 실질적으로 일정한 직경의 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브이고 c-축이 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 포함한다. 이들은 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않고, 직경이 0.1μ 이하, 길이 : 직경비가 5 이상이다. 이러한 피브릴은 본 발명에서 주로 관심의 대상이 된다.
탄소 피브릴 응집체의 형성에 관한 더 상세한 사항은 1988년 1월 28일자로 출원된 Snyder 등의 US 특허출원 No. 149,573, 및 1989년 1월 28일자로 출원된 PCR출원 No. US 89/00322 WO 89/07163, 및 1989년 9월 28일자로 출원된 Moy 등의 US 특허출원 No.413,837 및 1990년 9월 27일자로 출원된 PCT 출원 No. US 90/05498("Fibril Aggregates and Method of Making Same") WO 91/05089의 내용에서 찾아볼 수 있으며, 이들 모두는 본 발명과 같이 동일 양수인에 양도 되었으며 본원에서 참조로 인용된다.
본원에서 참조로 인용되는 Moy 등의 1992년 5월 22일자 출원된 USSN 07/887,307은 상호 무작위로 엉켜 새둥지("BN")를 닮은 피브릴의 엉킨 볼을 형성하는 다양한 거시적 형태(주사 전자 현미경으로 측정)을 갖는 응집체로서; 또는 실질적으로 동일한 상대적 배향을 갖고, 코밍(combed) 야안("CY")의 외향을 갖는, 즉, 각 피브릴의 종축(개개의 벤드 또는 킹크에도 불구하고)이 다발내 주변을 에워싸는 피브릴의 방향과 동방향으로 연장하는 직선 내지는 약간 구부러지거나 킹킹된 탄소 피브릴의 다발로 이루어지진 응집체로서; 또는 상호 느슨하게 엉켜 "개방 네트"("ON") 구조를 형성하는 직선 내지는 약간 구부러지거나 킹킹된 피브릴로 이루어진 응집체로서 제조되는 피브릴에 대해 기술하고 있다. 개방 네트 구조에 있어서, 피브릴 엉킹도는 코밍 야안 응집체(여기에서 개개 피브릴은 실질적으로 동일한 상대적 배양을 가짐)에서 관찰되는 것보다는 크지만 새둥지의 것보다는 작다. CY 및 ON 응집체는 구조 전반에 걸쳐 균일한 특성이 요망되는 복합 조립 2차 가공시 BN이 유용하게 하는 것보다 더 용이하게 분산된다.
피브릴 축상의 흑연 층의 돌기가 두 피브릴 직경 이하의 거리만큼 연장할때, 흑연 미세섬유의 탄소평면은 단면에, 헤링본 외관을 취한다. 이들은 피쉬본 피브릴로 불린다. 본원에서 참조로 인용되는 Geus의 US 특허 No. 4,855,091호는 열분해성 오버코트를 실질적으로 함유하지 않는 피쉬본 피브릴의 제조절차를 제공한다. 이러한 피브릴은 또한 본 발명의 실행에 유용하다.
전술한 촉매적으로 성장한 피브릴과 유사한 형태를 갖는 탄소 나노튜브는 고온 탄소 아크에서 성장하였다[참조문헌: Iijima, Nature 354 56 1991]. 현재는 이러한 아크-성장 미세섬유가 Tennent의 초기 촉매 성장된 피브릴과 동일한 형태를 취하는 것으로 일반적으로 수용되고 있다. 아크 성장 탄소 미세섬유는 또한 본 발명에 유용하다.
본원에서 참조로 인용되는, 1989년 5월 15일자로 출원된 McCarthy 등의 US 특허출원 No. 351,967는 피브릴을 황산(H2SO4) 및 칼륨 클로레이트(KClO3)를 포함하는 산화제와 , 피브릴의 표면을 산화시키기에 충분한 반응조건(예를 들면, 시간, 온도, 및 압력)하에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄소 피브릴 표면의 산화방법에 대해 기술하고 있다. McCarthy 등의 방법에 따라 산화된 피브릴은 불균일하게 산화, 즉, 탄소원자는 카복실, 알데하이드, 케톤, 페놀 및 기타 카보닐 그룹으로 치환된다.
피브릴은 또한 질산처리에 의해 불균일하게 산화된다. 국제출원 PCT/US94/10168은 작용그룹의 혼합물을 함유하는 산화 피브릴의 형성방법에 대해 기술하고 있다. Hoogenvaad, M.S. 등("Metal Catalysts supported on a Novel Carbon Support", Presented at Sixth International Conference on Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts, Brussels, Belgium, September 1994))는 질산으로 피브릴 표면을 먼저 산화하기 위하여 피브릴-지지된 귀금속의 제조에 유익함을 발견하였다. 산에 의한 이러한 선처리는 탄소-지지된 귀금속 촉매의 제조에서 표준단계이며, 이러한 탄소의 통상의 공급원이 주어질 경우, 이는 바람직하지 않은 물질의 표면을 많이 소제하도록 작용화하는 역할을 한다.
간행물에서, McCarthy 및 Bening[참조문헌: Polymer Preprints ACS Div. of Polymer Chem. 30 (1) 420(1990)]은 표면이 다양한 산화그룹을 포함하는 것을 증명하기 위해 산화된 피브릴의 유도체를 제조하였다. 이들이 제조한 화합물인 페닐하이드라존, 할로아로마티세스터, 탤로스 염 등이 선택되었는 데, 그 이유는 밝게 착색되거나, 일부 다른 강력하고 쉽게 확인되고 구별되는 시그널을 보이는 이들의 분석적인 용도 때문이다 이러한 화합물은 분리되지 않으며, 본원에서 기술한 유도체와는 달리 실용적인 유의성이 없다.
상기 언급한 특허 및 특허출원에 기술된 바와 같이, 탄소 피브릴 및 이의 응집체에 대해 다수의 용도가 발견 되었지만, 피브릴 표면이 작용화되면 다수의 상이하고 중요한 용도가 개발될 수 있다. 균일하게든 또는 불균일하게든, 작용화는 작용화된 피브릴과 다양한 기질의 상호작용을 허용하여 고유한 특성을 지닌 물질로된 고유한 조성물을 형성하고 피브릴 구조가 피브릴 표면에 있는 작용부위 간의 결합을 토대로 생성되게 허용한다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 제 1 목적은 작용화된 피브릴, 즉, 작용성 화학 잔기를 갖도록 표면이 균일하게 또는 불균일하게 개질되는 피브릴을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 관련목적은 산화 또는 화학적 매질과 반응시켜 표면을 작용화시키는 피브릴을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 관련 목적은 그 자체가 화학 반응성을 갖는 종의 화학적 반응 또는 물리적 흡착에 의해 표면이 균일하게 개질되는 피브릴을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가목적은 표면이 예를 들면, 산화에 의해 개질되고, 이어서 작용그룹과 반응시켜 추가로 개질되는 피브릴을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 관련목적은 피브릴이 각종 기질내 화학그룹과 화학적으로 반응하거나 물리적으로 결합될 수 있도록 작용그룹의 스펙트럼으로 개질되는 피브릴을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 관련목적은 피브릴의 작용그룹을 링커 화학 범위에 의해 상호 결합시킴으로써 피브릴의 복합 구조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 관련목적은 각각의 경우에, 피브릴 표면과 결합된 작용성 잔기를 제공하도록, 피브릴 표면상의 종을 물리적으로 흡착하기 위한 방법 및 피브릴 표면의 화학적 개질 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 작용화된 피브릴에 기초한 물질의 신규 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 평범한 피브릴, 카복시 피브릴 및 PEG-개질 피브릴에 결합하는 BSA 분석 그래프도.
도 2는 두 상이한 방법에 의해 제조된 카복시 피브릴 및 PEG-개질 피브릴에 결합하는 β-락토글로뷸린 분석 그래프도.
도 3은 3급 아민 피브릴 컬럼상에서 소 혈청 알부민(BSA)의 용출 프로필 그래프도.
도 4는 4급 아민 피브릴 컬럼상에서 BSA의 용출 프로필의 그래프도.
도 5는 라이신-기본 덴드리머 피브릴의 제조 반응순서도.
도 6은 유동셀내 철 프탈로사이아닌 개질된 피브릴의 사용을 설명하는 사이클릭 볼타모그램의 그래프도.
도 7은 N-(3급-부톡시카보닐)-L-라이신의 첨가에 의해 이작용성 피브릴의 제조를 위한 반응 순서도.
도 8은 피브릴-부동화 리파제를 사용한 에틸 부티레이트의 합성 결과 그래프도.
도 9는 AP 억제제-개질된 피브릴을 사용하는 AP 및 β-갈락토시다제(βG)의 혼합물로부터 알칼리성 포스파타제(AP)의 분리결과 그래프도.
도 10은 βG-개질 피브릴을 사용한 AP 및 βG의 혼합물로부터 βG의 분리결과 그래프도.
본 발명은 광범위하게 하기 화학식을 갖는 조성물에 관한 것이다.
화학식
[CnHL-]Rm
상기식에서,
n은 정수이고,
L은 0.1n 이하의 수이며,
m은 0.5n 이하의 수이며,
각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R' CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR' 3, Si(-OR'-)yR' 3-y, Si(-O-SiR' 2-)OR', R" , Li, AlR' 2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
y는 3 이하의 정수이며,
R' 은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이며,
R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬, 플루오로아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
X는 할라이드이며,
Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브에는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것들이 포함된다. 나노튜브는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브, 더욱 바람직하게는, 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트을 갖는 것들 일 수 있다.
불균일 치환된 나노튜브가 또한 제조된다. 이러한 것들에는 하기 화학식의 조성물이 포함된다.
[CnHL-]Rm
상기식에서,
n, L, m, R 및 나노튜브 자체는 상기에서 정의한 바와 같고, 단 각각의 R은 산소를 함유하지 않으며, 또는 각각의 R이 산소-함유 그룹이면 COOH는 존재하지 않는다.
하기 화학식의 작용화된 나노튜브도 본 발명내에 포함된다.
화학식
[CnHL-]Rm
상기식에서,
n, L, m, R 및 R' 은 상기에서 정의한 바와 같고,
탄소원자는 길이 : 직경 비가 5 이상인 피쉬본 피브릴의 표면 탄소원자이다.
이들은 균일하게 또는 불균일하게 치환된다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
본 발명에 하기 화학식의 작용화된 나노튜브도 포함된다.
화학식
[CnHL-][R' -R]m
상기식에서,
n, L, m, R 및 R' 은 상기에서 정의한 바와 같다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하이다. 나노튜브는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 피브릴 축상의 흑연층 돌기가 연장하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트을 갖는 것들 일수 있다.
두 균일 및 불균일 치환된 나노튜브에서, 표면탄소 Cn이 반응된다. 흑연 피브릴의 표면층에 있는 대부분의 탄소원자는 흑연에서와 같이 기저면 탄소이다. 기저면 탄소는 화학물질 공격에 비교적 비활성이다. 결함부위에서, 예를 들면, 흑연 평면이 피브릴 주위를 완전히 확장하지 못할 경우, 흑연 평면의 엣지 탄소원자와 유사한 탄소원자가 존재하게 된다. 엣지 및 기저면 탄소의 논의에 대해서는 문헌[참조: Urry Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York 1989]를 참조하라.
결함부위에서, 나노튜브의 하부 내부층의 엣지 또는 기저면 탄소가 노출될 수 있다. 표면탄소라는 용어에는 나노튜브의 최외곽층의 기저면 및 엣지의 모든 탄소, 및 최외곽층의 결함부위에서 노출될 수 있는 하부층의 기저면 및/또는 엣지 모두의 탄소가 포함된다. 엣지 탄소는 반응성이고 탄소 원자가를 만족시키기 위해 일부 헤테로원자 또는 그룹을 함유하여야 한다.
전술한 치환된 나노튜브는 유리하게는 더욱 작용화될 수 있다. 이러한 조성물에는 하기 화학식의 조성물이 포함된다.
[CnHL-]Am
상기식에서,
탄소는 나노튜브의 표면탄소이고,
n, L 및 m은 전술한 바와 같으며,
A는
중에서 선택되며,
Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 적당한 작용그룹이거나, R'-OH, R'-NR' 2, R' SH, R' CHO, R' CN, R' X, R' N+(R')3X-, R' SiR' 3, R' Si(-OR'-)yR' 3-y, R' Si(-O-SiR' 2-)OR', R' -R" , R' -N-CO, (C2H4O-)wH, (-C3H6O-)wH, (-C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.1μ이하, 바람직하게는 0.05μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하고/하거나 또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트로 이루어짐을 특징으로 한다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
화학식 [CnHL-][R' -R]m의 작용성 나노튜브를 더욱 작용화시켜 화학식 [CnHL-][R' -A]m(여기에서, n, L, m, R' 및 A는 전술한 바와 같다)의 조성물을 생성시킬 수 있다. 탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5' 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하고/하거나 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 가짐을 특징으로 한다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
본 발명의 입자는 또한 특정 사이클릭 화합물이 흡착되는 나노튜브를 포함한다. 이러한 것들에는 하기 화학식 물질의 조성물이 포함된다.
화학식
[CnHL-][X-Ra]m
상기식에서,
n은 정수이고,
L은 0.1n 이하의 수이며,
m은 0.5n 이하이며,
a는 0 또는 10 이하의 수이며,
X는 다핵성 방향족 잔기, 다이핵성 방향족 잔기 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이며,
R은 전술한 바와 같다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브, 더욱 바람직하게는, 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 갖는 것들 일 수 있다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
바람직한 사이클릭 화합물은 문헌[참조: Cotton and Wilkinson, Advanced Organic Chemistry]의 76 페이지에 기술된 바와 같은 평면 마크로사이클이다. 흡착을 위한 더욱 바람직한 사이클릭 화합물은 포피린 및 프탈로사이아닌이다.
흡착된 사이클릭 화합물은 작용화될 수 있다. 이러한 조성물에는 하기 화학식의 화합물이 포함된다.
[CnHL-][X-Aa]m
상기식에서,
m, n, L, a, X 및 A는 전술한 바와 같고,
탄소는 전술한 바와 같이 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다.
전술한 바와 같이 작용화된 탄소 피브릴은 매트릭스에 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 유기 중합체(예를 들면, 에폭시, 비스말레이미드, 폴리아미드 또는 폴리에스테르 수지와 같은 열경화성 수지; 열가소성 수지; 반응 사출성형 수지; 또는 천연고무, 스티렌-부타디엔 고무, 또는 시스-1,4-폴리부타디엔과 같은 엘라스토머); 무기 중합체(예를 들면, 유리와 같은 중합체 무기 옥사이드), 금속(예를 들면, 납 또는 구리), 또는 세라믹 물질(예를 들면, 포틀랜드 시멘트)이다. 비드는 피브릴이 혼입되는 매트릭스로부터 형성될 수 있다. 이와 달리, 작용화된 피브릴을 작용화된 비트의 외면에 부착시킬 수 있다.
특정 이론에 구애됨이 없이, 작용화된 피브릴은 중합체 시스템 중으로 더 잘 분산되는 데, 그 이유는 개질된 표면특성이 중합체와 더 상용성이거나, 또는 개질된 작용그룹(특히, 하이드록실 또는 아민 그룹)이 말단 그룹으로서 중합체에 직접 결합되기 때문이다. 이러한 방식으로, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리에스테르 또는 폴리아미드/이미드와 같은 중합체 시스템은 피브릴에 직접 결합되며, 이렇게 해서 피브릴은 향상된 접착력을 가지고 더욱 수월하게 분산된다.
본 발명은 또한, 탄소 피브릴을 피브릴 표면의 산화에 충분한 시간 동안 강산화제와 접촉시키고 피브릴을 작용그룹을 산화 표면에 첨가하기에 적합한 반응물과 추가 접촉시킴으로써 작용그룹을 탄소 피브릴의 표면에 도입시키는 방법에 있다. 본 발명의 바람직한 양태로, 산화제는 알칼리 금속 클로레이트의 강산 용액으로 이루어진다. 본 발명의 다른 양태로서, 알칼리 금속 클로레이트는 나트륨 클로레이트 또는 칼륨 클로레이트이다. 바람직한 양태로, 사용된 강산은 황산이다. 산화에 충분한 시간은 약 0.5 내지 약 24 시간이다.
추가의 바람직한 양태로서, 화학식 [CnHL-][CH(R')OH]m(여기에서, n, L, R' 및 m은 전술한 바와 같다)의 조성물은 R' CH2OH를 벤조일 퍼옥사이드와 같은 유리 라디칼 개시제의 존재하에 나노튜브의 표면탄소와 반응시켜 형성시킬 수 있다.
본 발명은 또한, NHS 에스테르와 단백질의 아미노 그룹 간에 공유결합을 형성시킴으로써, NHS 에스테르에 의해 개질된 나노튜브에 단백질을 결합하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 탄소 피브릴의 표면을 산화시키기에 충분한 시간 동안 탄소 피브릴을 산화제와 접촉시키고, 표면-산화된 탄소 피브릴을 작용그룹을 탄소 피브릴의 표면에 첨가하기 적합한 반응물과 접촉시킨 다음, 표면-작용화된 피브릴을 탄소 피브릴의 네트워크 제조에 효과적인 가교결합제와 추가 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄소 피브릴의 네트워크 제조방법에 있다. 바람직한 가교결합제는 폴리올, 폴리아민 또는 폴리카복실산이다.
작용화된 피브릴은 또한 피브릴의 경질 네트워크 제조에 유용하다. 예를 들면, 산-작용화된 피브릴의 양호하게 분산된 3 차원 네트워크는 산 그룹(피브릴간)을 폴리올 또는 폴리아민으로 가교결합시켜 경질 네트워크를 형성시킴으로써 안정화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 작용화된 피브릴을 결합시켜 형성된 3 차원 네트워크를 포함한다. 이러한 복합체는 직접결합 또는 화학 잔기를 포함하는 하나 이상의 링커에 의해 결합된 적어도 두 개의 작용화된 피브릴을 포함한다. 이들 네트워크는 매우 균일하고 동등한 세공 크기의 다공질 매질을 포함한다. 이들은 흡착제, 촉매지지체 및 분리매질로서 유용하다.
비록, 이들 피브릴 간의 간극이 크기와 형상 모두 불규칙하지만, 이들은 세공으로서 생각될 수 있고 다공질 매질의 특징규명에 사용된 방법에 의해 특징규명된다. 이러한 네트워크에서 간극의 크기는 피브릴 분산액의 농도와 수준, 및 가교결합제의 농도와 쇄 길이에 의해 조절될 수 있다. 이러한 물질은 구조를 이룬 촉매 지지체로서 작용할 수 있고 특정크기의 분자를 배제시키거나 포함시키도록 주문제작할 수 있다. 통상적인 공업용 촉매와는 별도로, 이들은 바이오촉매용 대공 지지체로서 특수한 용도를 갖는다.
경질 네트워크는 분자량 인식을 위한 바이오마이메틱 시스템에서 백본으로 작용할 수 있다. 이러한 시스템은 US 특허 NO. 5,110,833 및 국제 특허 공개 No. WO 93/19844에 기술되어 있다. 가교결합제 및 착생성제에 대한 적절한 선택은 특정 분자 프레임워크의 안정화를 허용한다.
나노튜브의 작용화 방법
본 발명의 균일하게 작용화된 피브릴은 설폰화, 탈산소화 피브릴 표면에 친전자체 첨가 또는 금속화에 의해 직접 제조될 수 있다. 아크 성장 나노튜브가 사용될 때, 이들은 작용화에 앞서 고가의 정제단계를 요할 수 있다. Ebbesen 등(Nature 367 519 (1984))는 이러한 정제에 대한 절차를 제공한다.
바람직하게는, 탄소 피브릴은 이들을 작용화제와 접촉시키기에 앞서 처리된다. 이러한 처리에는 피브릴을 용매중에 분산시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 탄소 피브릴은 추가 접촉에 앞서 여과 및 건조시킬 수 있다.
1. 설폰화
배경기술이 문헌[참조: March, J.P., Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Wiley, New York 1985; House, H., Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA 1972]에 기술되어 있다.
활성화된 C-H(방향족 C-H 포함) 결합은 20% 이하 SO3를 함유하는 농황산 용액인 발연 황산(올리움)을 사용하여 설폰화시킬 수 있다. 통상적인 방법은 올리움을 사용하여 T-80℃에서 액상을 통해 이루어지며; 그러나, 활성화된 C-H 결합은 또한 불활성의 비양성자성 용매에서 SO3, 또는 증기상에서 SO3를 사용하여 설폰화시킬 수 있다. 반응은 다음과 같다:
-C-H + SO3 → -C-SO3H
과반응은 반응에 따라 설폰의 형성을 초래한다:
2-C-H + SO3 → -C-SO2-C + H2O
실시예 1
황산을 이용한 C-H 결합의 활성화
반응은 결과에 있어 어떠한 유의할만한 차이도 없이 기체상 또는 액체 중에서 수행된다. 증기상 반응은 린드버그 노(爐)로 가열한 수평 석영관 반응기에서 수행된다. 가스 유입/배출관이 달린, 농 H2SO4 중의 20% SO3를 함유하는 다중-경부 플라스크를 SO3 원으로 사용한다.
포슬린 보우트내 피브릴(BN 또는 CC)의 칭량 샘플을 가스 주입구가 달린 1" 튜브에 넣는다; 배출구를 농 H2SO4 버블러 트랩으로 연결한다. 아르곤을 반응기를 통해 20 분간 플러슁하여 모든 공기를 제거한 다음, 샘플을 300℃로 1 시간 동안 가열하여 잔류 수분을 제거한다. 건조 후, 온도를 아르곤 하에 반응온도로 조정한다.
목적온도가 안정될 때, SO3원을 반응기 튜브에 연결하고 아르곤 스트림을 이용하여 SO3 증기를 석영관 반응기 중으로 운반한다. 반응을 목적하는 온도 동안 목적 온도에서 수행하고, 그 후 반응기를 아르곤 유동하에 냉각시킨다. 피브릴을 이어서, 90℃, 5" Hg 진공에서 건조시켜 건조중량 증가를 수득한다. 0.100N NaOH와 반응시키고 종점으로서 pH 6.0을 이용하여 0.100N HCl로 역-적정하여 설폰산(-SO3H) 함량을 측정한다.
액상 반응을 온도계/온도 조절기 및 마그네틱 교반기가 달린 다중-경부 100cc 용량의 플라스크내 20% SO3를 함유하는 농황산에서 수행한다. 농 H2SO4(50) 중의 피브릴 슬러리를 플라스크에 넣는다. 올리움 용액(20c)을 반응기에 가하기에 앞서 -60℃로 예열한다. 반응 후, 산 슬러리를 분쇄 얼음위에 붓고, 즉시 1ℓ의 탈이온수로 희석한다. 고체를 여과하고 세척 유출액의 pH에 변화가 없을 때까지 탈이온수로 철저히 세척한다. 피브릴을 100℃, 5" Hg 진공에서 건조시킨다. 여과시 이동 손실에 기인하여, 정확한 중량 증가가 수득될 수 없다. 결과를 표 1에 수록하였다.
[표 1]
반응의 요약
증기상 또는 액체상에서의 반응에 의한 설폰산 함량에는 어떠한 유의할 만한 차이도 존재하지 않았다. 온도효과가 존재한다. 더 높은 반응온도(증기상)는 더 많은 양의 설폰을 생성한다. 118-61B에서, 4.2 중량% 증가는 설폰산 함량과 일치하였다(이론치는 0.51meq/g이다). 실행 60A 및 61는 중량 증가가 지나치게 높았는데 설폰산 함량에 의해서만으로 해석된다. 따라서, 감지할만한 양의 설폰이 또한 생성되는 것으로 가정된다.
2. 옥사이드-비함유 피브릴 표면에의 첨가
배경기술이 문헌[참조: Urry, G., Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York 1989]에 기술되어 있다.
피브릴내 표면 탄소는 흑연처럼 행동하며, 즉 이들은 기저면 및 엣지 탄소 모두를 함유하는 6변형 시이트에 배열된다. 기저면 탄소는 화학물질 공격에 비교적 불활성이지만, 엣지 탄소는 반응성이고 탄소원자가를 충족시키기 위해 약간의 헤테로원자 또는 그룹을 함유하여야 한다. 피브릴은 또한 기본적으로 엣지 탄소인 표면 결함 부위를 지니며 헤테로원자 또는 그룹을 함유한다.
피브릴의 표면 탄소에 결합되는 가장 일반적인 헤테로원자는 제조중에 주된 가스 성분인 수소; 높은 반응성에 기인하고 소량이라도 회피하기가 곤란한 이유로 산소; 및 촉매에 기인하여 항상 존재하는 H2O이다. 진공하 약 1000℃에서의 열분해는 미지의 메커니즘, 그러나 기지의 화학양론에 의해 복합반응에서 표면을 탈산소화할 것이다. 산물은 CO 및 CO2(2 : 1 비)이다. 생성되는 피브릴 표면은 활성화된 올레핀에 매우 반응성인 C1-C4 정렬로 라디칼을 함유한다. 표면은 진공에서 또는 불활성 가스의 존재하에서 안정하지만, 반응성 가스에 노출될 때까지는 고 반응성인 채로 존재한다. 따라서, 피브릴은 진공중 또는 불활성 대기중 약 1000℃에서 열분해하고, 이러한 동일조건하에서 냉각한 다음, 저온에서 적당한 분자와 반응시켜 안정한 작용그룹을 생성시킬 수 있다. 전형적인 예는 다음과 같다:
[여기에서, R' 은 탄화수소 라디칼(알킬, 사이클로알킬 등)이다].
실시예 2
아크릴산과 옥사이드-비함유 피브릴 표면의 반응에 의한 작용화된 피브릴의 제조
포슬린 보우트내 BN 피브릴 1g을 열전쌍이 달린 수형 1" 석영관에 넣고 린드버그 튜브로 안에 둔다. 단부에 가스 유입구/배출구를 장치한다. 튜브를 10분간 건조, 탈산소화 아르곤으로 퍼징하고, 이렇게 한 후에 노의 온도를 300℃로 상승시킨 다음 30분간 유지시킨다. 이어서, 아르곤의 연속유동하에, 온도를 100℃씩 증가시켜 100℃로 상승시킨 다음, 16 시간 동안 유지시킨다. 이러한 시간의 말미에 가서, 튜브를 유동 아르곤하에서 실온(RT)으로 냉각한다. 이어서, 아르곤의 유동을 50℃의 니트 정제된 아크릴산을 함유하고 가스 유입구/배출구가 달린 다중-경부 플라스크를 통해 통과하도록 분류시킨다. 아크릴산/아르곤 증기의 유동은 실온에서 6 시간 동안 지속된다. 이러한 시기의 말미에 가서, 먼저 아르곤으로 퍼징하고, 이어서 100℃, <5" 진공에서 진공건조하여 잔류 미반응 아크릴산을 제거한다. 과량의 0.100N NaOH와 반응시키고 0.100N HCl로 pH 7.5의 종점으로 역 적정하여 카복실산 함량을 측정한다.
실시예 3
아크릴산과 옥사이드-비함유 피브릴 표면의 반응에 의한 작용화된 피브릴의 제조
절차는 열분해 및 냉각을 10-4 토르 진공에서 수행하는 것을 제외하고는, 상기절차와 유사한 방식으로 반복된다. 정제된 아크릴산 증기를 전술한 절차에서와 같이 아르곤으로 희석한다.
실시예 4
말레산과 옥사이드-비함유 피브릴 표면의 반응에 의한 작용화된 피브릴의 제조
절차는 실온에서의 반응물이 정제된 말레산 무수물(MAN)이고 80℃에서 용융 MAN 뱃치를 통해 아르곤 가스를 통과시킴으로써 반응기로 공급되는 것을 제외하고는, 실시예 2에서와 같이 반복한다.
실시예 5
아크릴로일 클로라이드와 옥사이드-비함유 피브릴 표면의 반응에 의한 작용화된 피브릴의 제조
절차는 실온에서의 반응물이 정제된 아크릴로일 클로라이드이고 25℃에서 니트 아크릴로일 클로라이드 위로 아르곤 가스를 통과시킴으로써 반응기로 공급되는 것을 제외하고는, 실시예 2에서와 같이 반복한다. 산 클로라이드 함량은 과량의 0.100N NaOH와 반응시키고 0.100N HCl로 역적정함으로써 측정된다.
진공에서 피브릴의 열분해는 피브릴 표면을 탈산소화시킨다. TGA 장치에 있어서, 진공 또는 정제된 Ar 유동하 1000℃에서의 열분해는 BN 피브릴의 3 개의 샘플에 대해 3%의 평균 중량 손실을 발생시킨다. 가스 크로마토그래피 분석으로는 각각 약 2 : 1 비의 CO 및 CO2 만을 검출할 뿐이다. 생성되는 표면은 매우 반응성이고, 아크릴산, 아크릴로일 클로라이드, 아크릴아미드, 아크롤레인, 말레산무수물, 알릴 아민, 알릴 알콜 또는 알릴 할라이드와 같은 활성화된 올레핀은 심지어는 실온에서도 반응하여 활성화된 올레핀에 결합된 작용가만을 함유하는 올레핀 산물을 형성할 것이다. 따라서, 카복실산만을 함유하는 표면은 아크릴산 또는 말레산 무수물과 반응시켜 이용할 수 있고; 산 클로라이드만을 함유하는 표면은 아크릴로일 클로라이드와 반응시켜 이용가능하고; 알데하이드만을 함유하는 것은 아크롤레인으로부터, 하이드록실만을 함유하는 것은 알릴 알콜로부터; 아민만을 함유하는 것은 알릴 아민으로부터, 및 할라이드를 함유하는 것은 알릴 할라이드로부터 이용가능하다.
3. 금속화
배경기술은 문헌[참조: March, Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., p 545]에 제시되어 있다.
방향족 C-H 결합은 탄소-금속 결합(C-M)을 생성하도록 다양한 유기금속 시약으로 금속화시킬 수 있다. M은 통상적으로 Li, Be, Mg, Al, 또는 Tl이지만; 기타 금속도 사용될 수 있다. 가장 간단한 반응은 활성화된 방향족 화합물내 수소의 직접 치환에 의한다:
1. 피브릴-H + R-Li → 피브릴-Li + RH
반응은 부수적으로, 칼륨 t-부톡사이드 또는 킬레이트화 디아민과 같은 강염기를 요할 수 있다. 비양성자성 용매가 필요하다(파라핀, 벤젠).
2. 피브릴-H + AlR3 → 피브릴-AlR2 + RH
3. 피브릴-H + Tl(TFA)3 → 피브릴-Tl(TFA)2 + HTFA
TFA=트리플루오로아세테이트
HTFA=트리플루오로아세트산
금속화 유도체는 제 1 일작용화 피브릴의 일례이다. 그러나, 이들은 다른 제 1 일작용화 피브릴의 생성을 위해 더욱 반응시킬 수 있다. 일부 반응은 중간체의 분리없이 동일장치에서 순차적으로 수행될 수 있다.
실시예 6
피브릴-Li의 제조
CC 피브릴 1g을 포슬린 보우트에 넣고 린드버그 튜브로에 넣은 1" 석영관 반응기 중으로 삽입한다. 튜브의 단부에 가스 유입구/배출구를 장치한다. H2의 연속 유동하에, 피브릴을 700℃로 2 시간 동안 가열하여 여타 표면 산소화물을 C-H 결합으로 전환시킨다. 반응기를 이어서 유동 N2하에 실온으로 냉각시킨다.
수소화된 피브릴을 건조, 탈산소화된 헵탄과 함께(LiAlH4로), 정제된 퍼징 시스템이 장치된 1 리터 용량의 다중-경부 환저 플라스크에 옮겨 모든 공기를 제거하고 불활성 대기, 응축기, 마그네틱 교반기 및 액체가 시린지에 의해 첨가될 수 있는 고무 격막을 유지시킨다. 아르곤 대기하에, 헵탄 중의 5 mmol 부틸리튬을 함유하는 2% 용액을 시린지로 첨가하고 슬러리를 4 시간 동안 온화한 환류하에 교반한다. 이 시기의 말미에 가서, 피브릴을 아르곤 대기 글러브 박스에서 중력 여과에 의해 분리하고 건조, 탈산소화 헵탄으로 필터상에서 수차례 세척한다. 피브릴을 스톱콕이 장치된 50cc 환저 플라스크에 옮기고 10-4 토르 진공하 50℃에서 건조시킨다. 리튬 농도는 피브릴 샘플을 탈이온수 중 과량의 0.100N HCl과 반응시키고 0.100N NaOH로 pH 5.0의 종점으로 역적정하여 측정한다.
실시예 7
피브릴-Tl(TFA) 2 의 제조
CC 피브릴 1g을 실시예 5에서와 같이 수소화하고 건조 아르곤으로 반복 퍼징하여 탈기시킨 HTFA로 다중-경부 플라스크에 부하한다. HTFA 중 5mmol Tl(TFA)3의 5% 용액을 고무 격막을 통해 플라스크에 가하고 슬러리를 온화한 환류하에 6 시간 동안 교반한다. 반응후, 피브릴을 수집하고 실시예 1에서와 같이 건조시킨다.
실시예 8
피브릴-OH의 제조
(OH 작용화만 함유하는 산소화된 유도체)
실시예 6에서 제조한 리튬화 피브릴 0.5g을 아르곤-대기 글러브 백중의 건조, 탈산소화 헵탄과 함께, 스톱콕 및 마그네틱 교반바가 장치된 50cc 단일 경부 플라스크에 옮긴다. 이어서, 스톱콕을 공기중으로 열고 슬러리를 24 시간 동안 교반한다. 이러한 시기의 말미에 가서, 피브릴을 여과에 의해 분리하고 수성 MeOH로 세척한 다음, 50℃에서 5" 진공하에 건조시킨다. OH 그룹의 농도는 80℃에서의 디옥산(0.252M) 중의 아세트산 무수물의 표준화 용액과 반응시켜 OH 그룹을 아세테이트 에스테르로 전환시킴으로써 측정되며, 이렇게 함으로써 반응된 무수물 1 몰 당 아세트산 1 당량이 방출된다. 총 산 함량, 즉 유리 아세트산 및 미반응 아세트산 무수물은 0.100N NaOH로 pH 7.5의 종점으로 적정하여 측정한다.
실시예 9
피브릴-NH 2 의 제조
탈륨화된 피브릴 1g을 실시예 7에서와 같이 제조한다. 피브릴을 디옥산에 슬러리화하고 디옥산에 용해시킨 0.5g의 트리페닐 포스핀을 가한다. 슬러리를 50℃에서 수분간 교반한 다음, 50℃에서 가스상 암모니아를 30분간 가한다. 피브릴을 이어서, 여과로 분리하고, 디옥산, 이어서, 탈이온수에서 세척한 다음, 80℃, 5" 진공에서 건조시킨다. 아민 농도는 과량의 아세트산 무수물과 반응시키고 유리 아세트산 및 미반응 무수물을 0.100N NaOH로 역정정하여 측정한다.
4. 유도체화된 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 및 평면 마크로사이클릭 화합물
피브릴의 흑연표면은 방향족 화합물의 물리적 흡착을 허용한다. 인력작용은 반 데르 발스 힘에 의해 이루어진다. 이러한 힘은 다환 이핵성 방향족 화합물과 흑연표면의 기저면 탄소간에 상당하다. 경쟁성 표면흡착이 가능하거나 흡착물이 고 용해도를 띨 경우 탈착이 일어날 수도 있다.
예를 들면, 피브릴은 프탈로사이아닌 유도체의 흡착에 의해 피브릴이 작용화 될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 프탈로사이아닌 유도체 피브릴은 단백질 부동화용 고체 지지체로서 사용될 수 있다. 상이한 화학그룹이 단순히 프탈로사이아닌의 상이한 유도체를 선택함으로써 피브릴의 표면에 도입될 수 있다.
단백질 부동화용 프탈로사이아닌 유도체 피브릴의 사용은 종래 단백질 부동화법 보다 상당한 이점이 있다. 특히, 공유 변형보다 더 간단하다 또한, 프탈로사이아닌 유도체 피브릴은 높은 표면적을 지니고 광범위 온도와 pH에서 거의 모든 용매에 가용성이다.
실시예 10
피브릴상에서 포피린 및 프탈로사이아닌의 흡착
피브릴상 물리적 흡착을 위한 바람직한 화합물은 흑연 또는 카본 블랙상에서 강력하게 흡착되는 것으로 알려져 있는 유도체화된 포피린 또는 프탈로사이아닌이다. 수종의 화합물이 이용가능하고, 예를 들면, 테트라카복실산 포피린, 코발트(II) 프탈로사이아닌 또는 디리튬 프탈로사이아닌이다. 뒤의 2 종은 카복실산형태로 유도체화시킬 수 있다.
디리튬 프탈로사이아닌
일반적으로, 두 Li+ 이온은 대부분의 금속(특히, 다가) 착물에 의해 프탈로사이아닌(Pc)으로부터 치환된다. 따라서, Li+ 이온을 비-불안정성 리간드와 결합된 금속 이온으로 치환하는 것이 안정한 작용그룹을 피브릴 표면에 도입하는 방법이다. 거의 모든 전이금속 착물은 Pc로부터 Li+를 치환시켜 안정한 비-불안정성 킬레이트를 형성한다. 이어서, 이러한 금속을 적당한 리간드와 커플링하는 것이 주안점이다.
코발트(II) 프탈로사이아닌
코발트(II) 착물이 이러한 목적에 특히 적합하다. Co++ 이온은 두 Li+ 이온을 치환시켜 매우 안정한 킬레이트를 형성할 수 있다. Co++ 이온은 이어서, 펜던트 카복실산 그룹이 달린 피리딘 환을 함유하고 피리딘 그룹에 우선적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 니코틴산과 같은 리간드에 배위될 수 있다. 과량의 니코틴산의 존재하에서, Co(II)Pc는 Co(III)Po로 전기화학적으로 산화되어, 니코틴산의 피리미딘 잔기와의 비-불안정 착물을 형성할 수 있다. 따라서, 니코틴산 리간드의 유리 카복실산 그룹은 피브릴 표면에 견고하게 부착된다.
기타 적당한 리간드는 아미노피리딘 또는 에틸렌디아민(펜던트 NH2), 머캅토 피리딘 (SH), 또는 일단에 아미노- 또는 피리딜- 잔기, 및 타단에 임의의 원하는 작용그룹을 함유하는 기타 다작용성 리간드이다.
포피린 또는 프탈로사이아닌의 부하능은 이들이 점진적으로 첨가될 때 용액의 탈색에 의해 측정된다. 용액의 진한 색조(MeOH 중 테트라카복실산 포피린의 경우 진한 핑크색, 아세톤 또는 피리딘 중 Co(II) 또는 디리튬 프탈로사이아닌의 경우 암 청녹색)는 분자가 피브릴의 흑색 표면상으로의 흡착에 의해 제거됨에 따라 탈색된다.
부하능은 이러한 방법에 의해 평가되며, 유도체의 족적은 이들의 적당한 측정(약 140 입방 옹스트롬)으로부터 계산된다. 250m2/g의 피브릴에 대한 평균 표면적의 경우, 최대 부하는 약 0.3mmol/g이다.
테트라카복실산 포피린을 적정에 의해 분석한다. 흡착의 온전성을 주위온도 및 고온에서 수성 시스템에서의 탈색에 의해 시험한다.
피브릴 슬러리를 초기에 혼합하고(워링 블렌더) 부하하는 동안 교반한다. 더 이상 탈색되지 않은 후에 슬러리 일부를 초음파 처리하며, 효과가 없었다.
부하 후, 실행 169-11, -12, -14 및 -19-1(표 2 참조)를 동일용매에서 세척하여 흡장된 안료를 제거한다. 모두 세척 유출액중에서 연속적인 옅은 색조를 보였으며, 따라서 포화점을 정확히 측정하기가 곤란하였다. 실행 168-18 및 -19-2는 부하를 위해 계산된 양의 안료를 사용하였으며 부하 후에 단지 약간만이 세척되었다.
테트라카복실산 포피린(아세톤) 및 Co 프탈로사이아닌(피리딘으로부터)을 추가의 특징규명을 위해 피브릴상에 부하한다(각각, 실행 169-18 및 -19-2).
테트라카복실산 포피린의 분석
과량의 염기(pH 11-12) 첨가로 적정 슬러리에서 바로 핑크색으로의 착색이 초래되었다. 이러한 과정이 적정을 방지하지는 않았지만, 고 pH에서 포피린이 탈착되었음을 보여준다. 카복실산 농도는 종점으로서 pH 7.5를 사용하여 과량의 NaOH의 역 적정에 의해 측정한다. 적정은 산 g 당 1.10meq의 부하를 부여하며, 이는 포피린 g 당 0.275meq에 해당한다.
코발트 또는 디리튬 프탈로사이아닌의 분석
이들 흡착제의 농도는 탈색시험으로 부터만 평가된다. 30 분 후에도 청록색 색조가 사라지지 않는 시점을 포화점으로 취한다.
다수의 치환된 다핵성 방향족 또는 다이핵성 방향족 화합물이 피브릴 표면에 흡착된다. 흡착을 위해, 방향족 환의 수는 환/펜던트 작용그룹 당 2 이상이다. 따라서, 3 개의 융합환을 함유하는, 치환된 안트라센, 페난트레센 등, 또는 4 개 이상의 융합환을 함유하는 다작용성 유도체가 포피린 또는 프탈로사이아닌 유도체 대신에 사용될 수 있다. 이와 마찬가지로, 퀴놀린과 같은 치환된 방향족 헤테로사이클, 또는 4 개 이상의 환을 함유하는 치환된 헤테로방향족 화합물이 사용될 수 있다. 표 2에 3 종의 포피린/프탈로사이아닌 유도체에 대한 부하실험의 결과를 요약하였다.
[표 2]
흡착실행의 요약
하기 실시예 11 및 12는 탄소 나노튜브상 두 상이한 프탈로사이아닌 유도체의 흡착방법을 설명한다.
실시예 11
니켈(II) 프탈로사이아닌테트라설폰산의 흡착에 의해 작용화된 피브릴
니켈(II) 프탈로사이아닌테트라설폰산(사나트륨 염) 2mg을 dH2O 1ml 중의 평범한 피브릴 4.2mg과 혼합한다. 혼합물을 50분간 초음파처리하고 실온에서 밤새 회전시킨다.
피브릴을 3 x 1ml의 dH2O, 3 x 1ml의 MeOH, 및 3 x 1ml의 CH2Cl2로 세척한 다음 진공건조시킨다.
써모라이신을 흡착에 의해 이들 프탈로사이아닌 유도체상에 부동화시킨다. 피브릴 0.5mg을 250㎕의 dH2O 중에 현탁시키고 20 분간 초음파처리한다. 상등액을 버리고 피브릴을 250㎕의 0.05M 트리스(pH =8.0)에 현탁시키고 동일 완충액에서 제조한 250㎕의 0.6 mM 써모라이신 용액과 혼합한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전시키고 4℃에서 밤새 저장한다. 이어서, 피브릴을 1ml의 25mM 트리스(pH = 8)로 3회 세척하고 40mM 트리스 및 10mM CaCl2를 함유하는 완충액 250㎕에 현탁시킨다.
이들 피브릴상의 써모라이신의 양은 피브릴의 효소 활성을 측정함으로써 측정된다. 써모라이신은 기질 FAGLA(N-(3-[2-퓨릴]아크릴로일)-글라이-류아미드)와 반응하여 -310 M1cm-1의 흡광계수로 345nm에서 흡광도 감소를 초래하는 화합물을 생성한다. 이러한 반응에 대한 분석 완충액 조건은 40mM 트리스, 10mM CaCl2 및 1.75M NaCl, pH 7.5이다. 반응은 1ml 큐벳에서, FAGLA 원액(dH2O내 30% DMF중 25.5mM) 5㎕와 분석 완충액 1ml 중의 써모라이신 피브릴 10㎍을 혼합함으로써 수행한다. 345nm에서 흡광도의 감소는 10분에 걸쳐 시간 스캔에 의해 모니터링한다. 이어서, 효소활성(μM/분)을 흡광계수 -310M-1cm-1를 이용하여 초기 경사로부터 계산해낸다. 피브릴 g당 활성 써모라이신의 양은 0.61μmol이다.
실시예 12
1,4,8,11,15,18,22,25-옥타부톡시-29H,31H-프탈로사이아닌의 흡착에 의해 작용화된 피브릴
1,4,8,11,15,22,25-옥타부톡시-29H,31H-프탈로사이아닌 3mg 및 평범한 피브릴 5.3mg을 CHCl3 1ml 중에 혼합한다. 혼합물을 50분간 초음파처리하고 실온에서 밤새 회전시킨다.
피브릴을 3 x 1 ml의 CH2Cl2로 세척하고 진공하에 건조시킨다.
써모라이신을 실시예 34의 방법에 따른 흡착에 의해 이들 프탈로사이아닌 유도체 피브릴상에 부동화시킨다. 피브릴 g 당 활성 써모라이신의 양은 0.70㎕이다.
실시예 13
써모라이신이 부동화된 프탈로사이아닌 유도체 피브릴을 이용한 아스파탐 전구체 합성
써모라이신이 부동화된 프탈로사이아닌 유도체 피브릴을 사용하여 인공 감미제인 아스파탐의 전구체 합성을 촉매할 수 있다. 반응은 에틸아세테이트 중 80mM L-Z-Asp 및 220mM L-PheOMe를 10μM 피브릴 부동화 써모라이신과 혼합함으로서 수행된다. 산물인 Z-Asp-PheOMe를 HPLC로 모니터링하여 수율을 측정한다.
5. 클로레이트 또는 질산 산화
농 황산 또는 질산중 칼륨 클로레이트와 같은 강 산화제에 의한 흑연 산화에 대한 문헌에는 문헌[참조: R.N. Smith, Quarterly Review 13, 287 (1959); M.J.D. Low, Chem. Rev. 60, 267(1960)이 포함된다. 일반적으로, 엣지 탄소(결합부위 포함)는 공격을 받아 카복실산, 페놀 및 기타 산소화 그룹을 생성한다. 메커니즘은 착물을 수반하는 라디칼 반응이다.
실시예 14
클로레이트를 이용한 카복실산-작용화된 피브릴의 제조
CC 피브릴의 샘플을 농황산중, 스패튤러로 혼합함으로써 슬러리화하고 이어서 가스 유입구/배출구 및 오버헤드 교반기가 장치된 반응기 플라스크로 이송한다. 느린 아르곤 유동하에 교반하면서, NaClO3 충진물을 실온에서 실행 지속기간에 걸쳐 나누어 첨가한다. 실행 전과정 중에 염소 증기가 생성되고 반응기에서 수성 NaOH 트랩 중으로 스위핑된다. 실행 말미에, 피브릴 슬러리를 분쇄 얼음에 붓고 진공여과한다. 필터 케이크를 이어서 속슬렛 팀블로 이송하고, 수 시간마다 새물로 갈아주면서 속슬렛 추출기에서 탈이온수로 세척한다. 세척은 미사용 탈이온수에 첨가하였을 때 피브릴 샘플이 물의 pH를 변화시키지 않을 때까지 지속한다. 이어서, 피브릴을 여과분리하고 5" 진공하 100℃에서 밤새 건조시킨다.
샘플을 과량의 0.100NaOH와 반응시키고 0.100n HCl로 pH 7.5에서 종점으로 역-적정하여 카복실산 함량을 측정한다. 결과를 표에 수록하였다.
[표 3]
직접 산화실행의 요약
실시예 15
질산을 이용한 카복실산-작용화된 피브릴의 제조
무게를 칭량한 피브릴 샘플을 오버헤드 교반기 및 물 응축기를 갖춘 결합된 바닥 다중-경부 만입 반응기 플라스크에서 적절한 농도의 질산으로 슬러리화한다. 일정하게 교반하면서, 온도를 맞추고 정해진 시간 동안 반응을 수행한다. 산의 농도에 관계없이 온도가 70℃를 초과 후 즉시 갈색 연기가 나온다. 반응 후, 슬러리를 분쇄된 얼음에 붓고 탈이온수로 희석한다. 슬러리를 여과하고 슬러리화 샘플이 탈이온수로 인해 pH 변화가 없을 때까지 몇 시간마다 신선한 탈이온수로 저장고를 교체하면서 속슬렛 추출기로 세척하여 과량의 산을 제거한다. 피브릴을 100℃ 5 " 진공에서 밤새 건조한다. 중량을 잰 피브릴 일부를 표준 0.100 N NaOH와 반응시키고 카복실산 함량을 0.100 N HCl로 역-적정하여 결정한다. 표면 산소 함량을 XPS로 측정한다. 물에서의 분산도는 0.1 중량%로 워링 블렌더에서 고속으로 2분간 혼합하여 시험된다. 결과는 하기 표 4에서 요약하고 있다.
[표 4]
직접 산화 실행 요약
6. 피브릴의 아미노 작용화
피브릴을 질산 및 황산으로 처리하여 질산화 피브릴을 수득한 다음, 질산화형을 나트륨 디티오나이트와 같은 환원제로 환원시켜 하기 반응식에 따른 아미노-작용화 피브릴을 수득함으로써 아미노 그룹을 직접 흑연 피브릴상으로 도입시킬 수 있다.
생성되는 피브릴은 단백질(예를 들면, 효소 및 항체)의 부동화, 및 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하여 용도가 다양하다.
실시예 16
질산을 이용한 아미노-작용화된 피브릴의 제조
물(1.6ml) 및 아세트산(0.8ml) 중의 냉각 현탁액(0℃)에 질산(0.4ml)를 적가한다. 반응 혼합물을 0℃에서 15 분간 교반하고 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한다. 반응을 정지하고 원심분리한다. 수성층을 제거하고 피브릴을 물( X 5)로 세척한다. 잔사를 10% 나트륨 하이드록사이드(X3)로 처리하고 물(X5)로 세척하여 질산화 피브릴을 수득한다.
물(3ml) 및 암모늄 하이드록사이드(2ml) 중의 질산화 피브릴의 현탁액에 나트륨 디티오나이트(200mg)를 0℃에서 3회에 나누어 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 5 분간 교반하고 100℃에서 1 시간 동안 환류시킨다. 반응을 정지하고 0℃로 냉각한 다음 아세트산(pH 4)으로 pH를 조정한다. 실온에서 정치한 후, 현탁액을 여과하고, 물(x 10), 메탄올(x5)로 세척하고 진공건조시켜 아미노 피브릴을 수득한다.
아미노 작용화된 피브릴을 시험하기 위해, 피브릴을 호스래디시 퍼옥시다제와 커플링시킨다. HRP-커플링된 아미노 피브릴을 철저히 투석한다. 투석 후, 피브릴을 내주에 걸쳐서 15회 세척한다. 효소-개질 피브릴을 다음과 같이 분석한다.
결과는 Fib-NH2와 커플링된 HRP가 1 주 이상 보유된 우수한 효소 활성을 보이는 것을 시사한다.
7. 유리 라디칼 개시제를 이용한 말단 알콜의 결합
탄소 나노튜브의 고 안정도는 이를 혹독한 환경에 사용되도록 하면서, 이들을 추가 개질을 위한 활성화를 어렵게 만든다. 종래방법은 혹독한 산화제 및 산의 사용을 수반한다. 본 발명에 이르러, 놀랍게도, 말단 알콜이 벤조일 퍼옥사이드(BPO)와 같은 유리 라디칼 개시제를 사용하여 탄소 나노튜브에 부착시킬 수 있음이 밝혀졌다. 탄소 나노튜브는 화학식 RCH2OH(여기에서, R은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이다)의 알콜에 유리 라디칼 개시제와 함께 첨가되고 약 60℃에서 약 90℃로 가열된다. 바람직한 알콜에는 에탄올 및 메탄올이 포함된다. 충분한 시간이 모든 유리 라디칼 개시제가 분해되도록 경과하였을 때, 반응 혼합물을 여과하고 탄소 나노튜브 물질을 세척하고 건조시키며, 이에 따라 화학식 나노튜브-CH(R)OH의 개질 나노튜브가 생성된다. 이러한 방법은 또한 이작용성 알콜의 커플링에 사용될 수 있다. 이렇게 하여 일단이 탄소 나노튜브에 연결되게 되며 다른 하나는 다른 물질을 표면에 간접 연결시키는 데 사용된다.
실시예 17
벤조일 퍼옥사이드를 이용한 알콜 작용화된 나노튜브의 제조
탄소 나노튜브 0.2777g을 탐침 소니케이터를 이용하여 MeOH에 분산시킨다. BPO 0.126g을 실온에서 가하고 온도를 60℃로 증가시킨 다음 추가로 BPO 0.128g을 가한다. 60℃에서 추가로 45분 경과 후, 최종 0.129g의 BPO 충진물을 가하고 혼합물을 60℃에서 추가로 30 분간 유지시킨다. 산물을 막에서 여과하고 MeOH 및 EtOH로 수 차례 세척한 다음 오븐내 90℃에서 건조시킨다. 수율은 0.285g이다. ESCA 분석은 BPO 없이 MeOH 중에서 환류시킨 대조군 샘플의 경우 0.74%와 비교하여 2.5 원자%의 산소 함량을 보였다.
실시예 18
벤조일 퍼옥사이드를 이용한 폴리(에틸렌 글리콜)로 탄소 나노튜브의 개질
탄소 나노튜브 0.1g, BPO 0.5g 및 폴리(에틸렌글리콜) 10g, 평균 분자량 1000(PEG-1000)을 실온에서 함께 혼합한다. 혼합물을 90℃로 가열하여 PEG를 용융시키고 혼합물을 90℃에서 밤새 반응시킨다. 이어서, 전 혼합물을 여과하고 세척하여 과량의 PEG를 제거한 다음 건조시킨다. 생성되는 물질을 그 자체로 사용하거나, 또는 해당 물질을 PEG의 자유 말단에 부착시킴으로써 추가로 개질시킬 수 있다.
실시예 19
비특이성 결합을 감소시키기 위해 PEG로 개질된 탄소 나노튜브의 사용
고 표면적 탄소물질과의 비특이성 결합은 상존한다. PEG와 같은 친수성 올리고머를 탄소 나노튜브에 결합시킴으로써 비특이성 결합이 감소될 수 있음이 밝혀졌다. 추가로, PEG와 같은 쇄상 분자의 일단을 나노튜브의 표면에 부착시킴으로서 자유 말단이 비특이성 결합을 감소시키기 위해 PEG(또는 기타 물질) 층의 특성을 여전히 보유하면서 해당 기타 물질을 부착시키는 데 사용될 수 있는 작용 그룹을 함유할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
PEG-개질된 피브릴과 소 혈청 알부민의 비특이성 결합의 감소
50mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH 7.0) 중의 0.1mg/ml의 비개질 피브릴, 클로레이트 산화 피브릴 및 PEG 개질 피브릴의 원 분산액을, 완충액 10ml중에 초음파처리로 각각을 1.0mg 분산시킴으로써 제조한다. 각각의 2배 연속 희석액 2ml를 9개의 폴리프로필렌 튜브 각각에 배치한다. 동일 완충액내 소 혈청 알부민(BSA)의 0.2mg/ml 용액 100㎕를 각각의 튜브에 가하고 3 개의 완충액 블랭크에 가한다. 단백질이 없는 3 개의 완충액 튜브 또한 준비한다. 모든 튜브를 와동 혼합기상에서 혼합하고 매 10 분마다 30 초간 와동시키면서 30 분간 배양한다. 모든 튜브를 원심분리하여 피브릴을 분리해내고 상등액 1ml 분취량을 새 튜브에 이송한 다음 마이크로 BCA 단백질 분석법(Pierce)을 사용하여 총 단백질 함량에 대해 분석한다. 상등액에 잔류하는 단백질의 수준은 피브릴에 비특이적으로 결합된 양의 간접 측정 수단이다. 모든 BSA는 PEG 개질 피브릴에 대해 상등액에 잔류하면서, 비개질 또는 클로레이트 산화 피브릴에 거의 완전히 결합되었다(도 1 참조).
벤조일 퍼옥사이드를 이용하여 제조한 PEG-개질 피브릴 및 NHS 에스테르 커플링에 의한 비특이성 결합의 감소비교
벤조일 퍼옥사이드를 사용하여 PEG로 개질된 피브릴, 및 NHS 에스테르 커플링에 의해 PEG로 개질된 클로레이트 산화된 피브릴의 분산액 원액을 50mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH 7.0)중 음파처리에 의해 1.0mg/ml로 제조한다. 각각의 3 배 연속 희석액 2ml를 7 개의 폴리프로필렌 튜브 각각에 배치한다. 동일 완충액중의 β-락토글로뷸린(βLG)의 0.2mg/ml 용액 100㎕를 각각의 튜브 및 3 개의 완충액 블랭크에 가한다. 단백질이 없는 3개의 튜브를 또한 준비한다. 모든 튜브를 와동 믹서에서 혼합하고 10 분마다 30 초간 와동하면서 60 분간 배양시킨다. 모든 튜브를 원심분리하여 피브릴을 분리해내고 상등액 1ml 분취량을 새 튜브에 옮기고 마이크로 BCA 단백질 분석(Pierce)를 사용하여 전체 단백질 함량에 대해 분석한다.
상등액에 잔류하는 단백질이 수준은 단백질에 비특이적으로 결합된 양의 간접 측정치이다. 각각의 튜브에 대해, NHS 에스테르 루트를 통해 PEG로 개질된 피브릴에 대해 상등액에 βLG가 잔류하며 이는 비특이적 결합이 없음을 의미한다. BPO 루트를 통해 PEG로 개질된 피브릴은 1.0mg/ml의 최고 피브릴 수준에서 βLG의 경미한(대략 10%) 결합을 보였고 더 낮은 수준에서는 어떠한 유의할 만한 결합도 보이지 않았다. 이와는 대조적으로, 1.0mg/ml 이상의 피브릴 수준에서는 클로레이트 산화된 피브릴에 거의 완전히 결합되었으며 실질적인 결합이 이들 피브릴의 0.01gm/ml로 하락하였다.
8. 작용화된 나노튜브의 2차 유도체
카복실산-작용화된 나노튜브
카복실산만으로부터 제조될 수 있는 2 차 유도체의 수는 본질적으로 제한이 없다. 알콜 또는 아민은 쉽게 산과 결합하여 안정한 에스테르 또는 아미드를 생성한다. 알콜 또는 아민이 이- 또는 다-작용성 분자의 일부인 경우, O- 또는 NH-를 통한 결합은 기타 작용기가 펜던트 그룹으로 이탈된다. 2 차 시약의 전형적인 예는 하기와 같다:
본 반응은 카복실산을 알콜 또는 아민으로 에스테르화 또는 아민화시키기 위해 개발된 임의의 방법을 사용해 수행될 수 있다. 이들 중, N,N'-카보닐디이미다졸(CDI)를 에스테르 또는 아미드에 대한 아실화제로 이용하는 방법[참조문헌: H.A.Staab, Angew. Chem. Internat. Edit., (1), 351 (1962)], 및 아미드화를 위해 카복실산을 활성화시키기 위해 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하는 방법[참조문헌: G.W. Anderson, et al., J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839(1964)]을 이용한다.
실시예 20
작용화된 피브릴의 2 차 유도체의 제조
N, N'-카보닐 디이미다졸
깨끗한, 건조 비양성자성 용매(예: 톨루엔 또는 디옥산)가 이 과정에 요구된다. 화학양론적 양의 시약으로 충분하다. 에스테르의 경우, 톨루엔 중 카복실산 화합물을 실온에서 톨루엔에 용해되는 화학양론적 양의 CDI와 불활성 대기(아르곤)에서 2시간 동안 반응시킨다. 이 기간동안, CO2가 발생한다. 2 시간 후, 알콜을 촉매량의 Na 에톡시드와 함께 첨가하고 80℃에서 4시간 동안 반응을 계속한다.
표준 알콜의 경우, 수율은 정량적이다. 반응은 하기와 같다:
1. R-COOH + Im-CO-Im → R-CO-Im + HIm + CO2
Im = 이미다졸리드, HIm = 이미다졸
2. R-CO-Im + R'OH → R-CO-OR' + HIm
아민의 아미드화는 실온에서 촉매되지 않고 일어난다. 본 과정의 제 1 단계는 동일하다. CO2 방출 후, 화학양론적 양의 아민을 실온에서 첨가하고 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 반응은 정량적이다. 반응은 하기와 같다:
3. R-CO-Im + R' NH2 → R-CO-NHR + HIm
실릴화
트리알킬실릴클로라이드 또는 트리알킬실라놀은 하기의 반응에 따라 산성 H와 즉시 반응한다:
R-COOH + Cl-SiR'3 → R-CO-SiR'3 + HCl
소량의 디아자-1,1,1-비사이클로옥탄(DABCO)을 촉매로 이용한다. 적당한 용매는 디옥산 및 톨루엔이다.
설폰산-작용화된 피브릴
실시예 1에서 제조한 아릴 설폰산을 더 반응시켜 2차 유도체를 수득할수 있다. 설폰산은 LiAlH4 또는 트리페닐 포스핀과 요오드의 배합물에 의해 머캅탄으로 환원시킬 수 있다[참조문헌: March, J.P., P. 1107]. 이들은 또한 디알킬 에테르와 반응시켜, 즉 피브릴--SO3H + R-O-R →피브릴-SO2OR + ROH에 의해 설포네이트 에스테르로 전환시킬 수 있다.
N-하이드록시석신이미드
1급 아민으로의 아미드화를 위한 카복실산의 활성화는 N-하이드록시석신아밀에스테르를 통해 일어난다; 치환 우레아로 방출된 물을 막기 위해 카보디이미드를 이용한다. NHS 에스테르를 실온에서 1급 아민과 반응시켜 아미드로 전환시킨다. 반응은 하기와 같다:
1. R-COOH + NHS + 카보디이미드 → R-CONHS + 치환 우레아
2. R-CONHS + R' NH2 → R-CO-NHR'
이러한 방법은 단백질 측쇄상 유리 NH2를 통해 흑연 피브릴에 단백질의 공유 결합시키는데 특히 유용하다. 이러한 방법에 의해 피브릴상에 부동화시킬 수 있는 단백질의 예로는 트립신, 스트렙타비딘 및 아비딘이 포함된다. 스트렙타비딘(또는 아비딘) 피브릴은 바이오티닐화 물질에 대한 고체 담체이다.
실시예 21
단백질의 NHS 에스테르에 의한 피브릴로의 공유 결합
단백질이 NHS 에스테르에 의해서 피브릴에 공유결합될 수 있음을 설명하기 위해서, 스트렙타비딘, 아비딘 및 트립신을 하기와 같이 피브릴에 부착시킨다.
NHS-에스테르 피브릴 0.5 mg을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH = 7.1)로 세척하고 상등액을 제거한다. 200 ㎕ 스트렙타비딘 용액 (동일한 완충액 중의 1.5 mg)을 피브릴에 첨가하고 혼합물을 실온에서 5.5시간 동안 회전시킨다. 이어서 피브릴을 하기의 완충액 1 ㎖로 순서대로 세척한다: 5 mM 나트륨 포스페이트(pH = 7.1), PBS (0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH = 7.4), ORIGENTM 분석 완충액 (메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) 및 PBS. 스트렙타비딘 피브릴을 추가의 사용을 위해 PBS 완충액에 저장한다.
NHS-에스테르 피브릴 2.25 mg을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH = 7.1) 500 ㎕중에서 40분 동안 초음파처리하고 상등액을 제거한다. 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH = 7.1) 500㎕에 현탁시키고 2 mg 아비딘(Sigma, A-9390)을 함유하는 동일한 완충액에서 제조된 아비딘 용액 300 ㎕를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전시키고 4℃에서 밤새 저장하고 실온에서 추가로 1시간 동안 회전시킨다. 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH = 7.1) 1 ㎖로 4회, PBS 완충액으로 2회 세척한다. 아비딘 피브릴을 저장 동안 PBS 완충액 200 ㎕에 현탁시킨다.
트립신 피브릴을 5 mM의 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.1)에서 제조된 NHS-에스테르 피브릴(아비딘 피브릴에서 처리) 1.1 mg과 1.06 mM의 트립신 용액 200 ㎕를 혼합하고 실온에서 6.5 시간 동안 교반시켜 제조한다. 트립신 피브릴을 5 mM의 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.1) 1 ㎖로 3회 세척하고 저장하는 동안 동일한 완충액 400 ㎕에서 현탁시킨다.
실시예 22
피브릴에서 트립신의 효소 활성 측정
트립신은 기질 L-BAPNA(Nα-벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐린)와 반응하여 410 nm에서 빛을 흡수하는 착색 화합물을 방출할 수 있다. 이러한 반응에 대한 분석 완충액은 pH 8.2의 0.05 M 트리스, 0.02 M CaCl2이다. 반응은 분석 완충액 1 ㎖ 중 L-BAPNA 공급액(H2O 중 37%의 DMSO 50 mM) 5 ㎕ 및 트립신 피브릴 10-25 ㎍을 혼합하여 1 ㎖의 큐벳에서 수행한다. 410 nm에서의 흡광도 증가를 10분에 걸쳐 모니터링한다. 효소 활성(μM/분)을 초기 곡선으로부터 계산한다.
공유 결합된 트립신 피브릴의 경우, 활성은 5.24 μM/분/13 ㎍ 피브릴이다. 이러한 결과는 동일한 분석 조건하에 46 μM/분/1 μM 트립신으로 측정된 기지된 농도의 트립신 용액의 활성도를 분할하여 피브릴상의 활성 트립신 양으로 전환될 수 있다. 따라서, 활성 트립신의 양/그램 피브릴은 8.3 μ몰(또는 195 mg)이다.
실시예 23
표면 티올을 지닌 탄소 나노튜브
실시예 27(하기)에서 기술된 에틸렌디아민을 이용한 개질에 의해 제조된 아미노 탄소 나노튜브(CN) 0.112 gm를 50 mM EDTA를 함유한 pH 8.0 0.05 M 칼륨 포스페이트 20 ml중에 현탁시킨다. 현탁액을 브랜슨 450 와트 탐침 초음파기로 5분간 초음파 처리하여 CN을 분산시킨다. 생성된 현탁액은 매우 진하다. 아르곤을 교반과 동시에 약 30분간 현탁액을 통해 버블링시킨다. 2-이미노티올란 · HCl 50 mg를 첨가하고 이 혼합물을 아르곤하에 연속적으로 교반하면서 70분간 반응시킨다. 생성된 물질을 폴리카보네이트 막 필터로 여과시키고, 모두 아르곤 블랭킷하에 완충액으로 2회, 탈이온수로 1회 및 무수 EtOH로 2회 세척한다. 티올로 개질된 CN을 진공 건조기에 놓고 밤새 펌핑한다. 최종 중량 = 0.118 gm, 중량 증가분을 기준으로 55% 전환율.
티올화 나노튜브 샘플 10 mg을 초음파 처리와 동시에 탈이온수 10 ml에 현탁시키고 0.45 ㎛ 나일론막으로 여과시켜 펠트-형 매트를 형성한다. 매트 절편을 ESCA로 분석하기 이전에 0.46% 황 및 1.69% 질소가 두드러진 진공 건조기에 저장하는데, 이는 티올-개질 CN으로의 성공적인 전환을 확인시킨다.
실시예 24
금 표면에 티올-개질 탄소 나노튜브의 부착
금박(Alfa/Aesar), 2 cm x 0.8 cm을 1 부 30% H2O2 용액 및 3부 농축 H2SO4 용액을 이용해 10분간 클린싱하고 탈이온수로 세정한다. 박막 조각을 Au 와이어 리드에 연결하고 사이클릭 볼타모그램이 불변될 때까지 1 M H2SO4 중 -0.35 V 대 Ag/AgCl 및 1.45 V 대 Ag/AgCl에서 대략 10분간 전기 화학적으로 순환시킨다. 탈이온수로 세정하고 건조한다. 큰 조각을 0.5 cm x 0.8 cm의 4 스트립으로 절단한다.
30분간의 아르곤 퍼징에 의해 탈산소화된 무수 EtOH 10 ml를 각각 두개의 유리 바이알에 놓는다. 하나의 바이알에서 티올-개질 CN(CN/SH) 및 2 Au 조각 16mg을 현탁시키고 나머지 바이알에서는 티올 유도체의 제조에 이용된 Au 1 조각 및 에틸렌 디아민 개질 CN 10 mg을 현탁시킨다. 모든 조작을 Ar로 충진된 글러브 백에서 수행한다. 바이알을 Ar하에 밀봉하고 냉각된 초음파 조에서 1시간 동안 놓아둔다. 밀봉된 바이알을 실온에서 72시간 동안 유지시킨다. Au 샘플을 바이알에서 제거하고, EtOH로 3회 세정하며, 공기 건조시킨 다음 보호용 바이알에 놓아둔다.
CN/에틸렌디아민 및 CN/SH에 노출된 Au 박막 샘플을 주사전자 현미경(SEM)으로 면밀히 조사하여 표면상의 CN의 존재 또는 부재를 검출한다. 40,000배에서의 조사는 CN/SH에 노출된 표면위에 분포된 CN의 존재를 나타내지만 CN/에틸렌디아민에 노출된 Au 박막 샘플에서는 CN이 관찰되지 않는다.
실시예 25
아미노 피브릴로부터 말레이미드 피브릴의 제조
아미노 피브릴을 실시예 13에 따라 제조한다. 아미노 피브릴(62.2 mg)을 나트륨 포스페이트 완충액(5 ㎖, 5 mM pH 7.2)에서 초음파 처리한다. 설포석신미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC: 28.8 mg, 0.66 mmol; Pierce, Cat. No. 22360)를 피브릴 현탁액에 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 피브릴을 물과 메탄올로 세척하고, 산물 피브릴을 진공하에 건조한다. 산물에서의 항체 부동화는 말레이미드 피브릴의 존재를 확신시킨다. 상이한 링커(예: 설포-SMCC, 석신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트[SMPB], 설포-SMPB, m-말레이미도벤질-N-하이드록시석신이미드 에스테르[MBS], 설포-MBS 등) 피브릴을 지닌 기타 말레이미드를 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
생성된 말레이미드 피브릴을 단백질, 예를 들면, 항체 및 효소의 공유적 부동화를 위한 고체 지지체로 이용할 수 있다. 항체를 말레이미드 활성화 피브릴상에 공유적으로 부동화시킨다. 항체의 용량은 질산화/환원법(실시예 13)에서 수득된 아미노 피브릴을 이용할 경우에는 1.84 밀리그램/그램 피브릴이고 카복실 피브릴에서 유도된 아미노 피브릴을 사용할 경우에는 0.875 밀리그램/그램 피브릴이다.
실시예 26
카복실산-작용화된 피브릴로부터 에스테르/알콜 유도체의 제조
카복실산 작용화된 피브릴을 실시예 14에 따라 제조한다. 카복실산 함량은 0.75 meq/g이다. 피브릴을 실온에서 용매로 톨루엔을 이용해 CO2 방출이 멈출때까지 불활성 대기하에 화학양론적 양의 CDI와 반응시킨다. 이 후, 슬러리를 80℃에서 10배 몰 과량의 폴리에틸렌글리콜(분자량 600) 및 촉매인 소량의 NaOEt와 반응시킨다. 2시간 반응 후, 피브릴을 여과시켜 분리하고, 톨루엔으로 세척한 다음 100℃에서 건조한다.
실시예 27
카복실산-작용화된 피브릴로부터 아미드/아민 유도체의 제조(177-041-1)
클로레이트-산화 피브릴(0.62 meq/g) 0.242 g을 혈청 스토퍼가 장착된 100 ㎖ RB 플라스크에서 교반하면서 20 ㎖ 무수 디옥산에 현탁시킨다. 20배 몰 과량의 N-하이드록시석신이미드(0.299 g)를 첨가하고 용해시킨다. 이 다음 2배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDAC)(0.510 g)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 계속 교반한다. 이 시기의 마지막에 교반을 멈추고, 상등액을 빼내며 고형물을 무수 디옥산 및 MeOH로 세척한 다음 0.45 마이크론 폴리설폰 막상에서 여과한다. 고형물을 필터막에서 추가 MeOH로 세척하고 추가 중량 감소가 관찰되지 않을 때까지 진공-건조시킨다. NHS-활성화된 산화 피브릴의 수율은 관찰된 6% 중량 증가분을 기준으로 100%이다.
에틸렌디아민(en) 100 ㎕를 0.2 M NaHCO3 완충액 10 ㎖에 첨가한다. 같은 부피의 아세트산(HOAc)을 첨가하여 pH 8 근처로 유지한다. NHS-활성화된 산화 피브릴(0.310 g)을 격렬히 교반하면서 첨가하고 1시간 동안 반응한다. 추가 en 300 ㎕ 및 HOAc 300 ㎕를 추가 10분간 첨가한다. 용액을 0.45 마이크론 폴리설폰 막 상에서 여과하고 NaHCO3 완충액, 1% HCl, 탈이온수 및 EtOH로 연속 세척한다. 고형물을 진공하에 밤새 건조한다. HCl 염을 추가 분석 및 반응을 위해 NaOH(177-046-1)와 반응시켜 유리 아민으로 전환시킨다.
ESCA를 아민화 피브릴(GF/NH2)상에 존재하는 N을 정량하기 위해 수행한다. 177-046-1의 ESCA 분석은 0.90 at% N(177-059)을 보여준다. 이용하기 쉽고 반응성이 있는 아민 그룹 모두로 존재하는 N의 양을 추가 산정하기 위해, 이용 가능한 1급 아민 그룹과 상응하는 시프 염기 결합을 생성하도록 펜타플루오로벤즈알데하이드와의 가스상 반응에 의해 유도체를 제조한다. ESCA 분석은 여전히 예측한 바대로, 0.91 at% N 및 1.68 at%F를 보여준다. 이는 아민화 피브릴(5F/펜타플루오로 벤즈알데하이드 분자)상에 반응성 1급 아민으로 존재하는 0.34 at%의 N으로 전환한다. 0.45 at%N 수준은 각 N의 유리 말단과 완전한 반응을 가능케하는 것으로 기대된다. 관측된 수준은 NHS-활성화된 피브릴과 N의 반응으로부터 매우 높은 수율을 지시하고 이용 가능한 유리 아민 그룹의 반응성을 확신시킨다.
0.34 at% 수준에서 N은 ESCA 자료로부터 계산된 유리 아민의 형태로 존재하고, 이는 기타 물질의 커플링을 허락하는 유리 아민 그룹에 의해 피브릴의 거의 완전한 적용 범위이다.
카복실 피브릴은 또한 에틸렌디아민(두개-탄소 링커)보다 일-보호된 1,6-디아미노헥산(6개-탄소 링커)을 이용해 아미노 피브릴로 전환된다.
실시예 28
카복실산 작용화된 피브릴로부터 아민 유도체의 제조
피브릴상의 카복실 그룹은 두개 이상의 아민 그룹(적어도 하나는 t-Boc 또는 CBZ와 같은 그룹에 의해 보호되지 않음)을 지닌 화합물의 한 아미노 그룹과 카복실 그룹을 반응시켜 개질될 수 있다. 이렇게 생성된 피브릴은 아미드 카보닐이 피브릴 카복실 그룹에서 유도되고 아미드 질소가 하나 이상의 1급 아민을 함유하는 그룹(예: 알킬 그룹)으로 치환되는 아미드 유도체이다. 아미드 그룹은 적용 또는 추가 개질을 위해 이용될 수 있다.
탄소 피브릴 1그램을 흡입구가 고무 혈청 격막으로 꽉 조여진 건조 소결 글래스 필터 터널에 놓고, 무수 디클로로메탄을 커버에 첨가한다. N-메틸모폴린(758 μL, 7 mmol)을 첨가하고, 현탁액을 주걱으로 혼합한다. 이소부틸 클로로포메이트(915 μL, 7 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 주기적으로 혼합한다. 혼합물을 실용적인 파라필름 덮개에 의해 습기로부터 보호한다.
그 동안, N-boc-1,6-디아미노헥산 하이드로클로라이드(1.94 g, 7.7 mmol)는 디클로로메탄(10 mL) 및 1M NaOH(10 mL) 사이에 분배된다. 하부, 유기상을 무수 칼륨 카보네이트상에서 건조하고 솜마개를 함유한 일회용 파스퇴르 피펫을 통과시켜 여과한 다음, N-메틸모폴린(758 μL, 7 mmol)을 첨가한다.
혈청 격막을 필터 깔때기로부터 제거하고, 시약을 진공 여과에 의해 피브릴로부터 제거하며, 피브릴을 무수 디클로로메탄으로 세척한다. 혈청 격막을 제자리에 놓고, N-메틸모폴린 및 일보호된 디아미노헥산 혼합물을 피브릴에 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 주기적으로 교반한다. 다음, 시약을 여과로 제거하고, 피브릴을 디클로로메탄, 메탄올, 물, 메탄올, 및 디클로로메탄으로 연속 세척한다.
트리플루오르산 및 디클로로메탄의 50% 혼합물을 피브릴에 첨가하고 이 혼합물을 20분 동안 주기적으로 교반한다. 용매를 여과로 제거하고, 피브릴을 디클로로메탄, 메탄올, 물, 0.1 M NaOH, 및 물로 연속 세척한다.
본 방법의 효율을 입증하기 위해, 아미노 피브릴의 소 샘플을 아미노 그룹과 특이하게 반응하도록 개질된 "활성화된" 호스래디시 퍼옥시다제(HRP; 5 mg, Pierce)와 반응시킨다. 피브릴을 차가운 상태로 유지하는 동안 며칠간 반복적으로 세척한다(현탁, 회전 및 에펜도르프 튜브에서 원심분리). 대략 2주간 세척한 후, 효소를 pH 4.4의 글라이신 완충액 중 H2O2/ABTS로 분석한다. 10분내에 용액에서 나타난 청색은 효소의 존재를 지시한다. 대조 피브릴(활성화된 HRP로 처리되고 동일한 기간 동안 세척된 COOH)는 비록 있더라도 촉매 활성을 거의 나타내지 않는다.
실시예 29
카복실산-작용화된 피브릴로부터 실릴 유도체의 제조
실시예 14와 같이 제조된 산 작용화된 피브릴을 불활성 대기하에 디옥산 중에서 슬러리화한다. 교반하면서, 화학양론적 양의 클로로트리에틸 실란을 첨가하고 0.5시간 반응시킨 후, 디옥산 중의 5% DABCO 용액을 몇방울 첨가한다. 시스템을 추가 시간 동안 반응시킨 후, 피브릴을 여과시켜 모아 디옥산에서 세척한다. 피브릴을 100℃ 5 " 진공에서 밤새 건조한다.
표 5는 2 차 유도체 제조를 요약하고 있다. 산물을 C, O, N, Si 및 F 표면 함량에 대해 ESCA로 분석한다.
[표 5]
2 차 유도체 제조의 요약
실시예 30
카복실산-작용화된 피브릴로부터 실릴 유도체의 제조
실시예 14와 같이 제조된 산 작용화된 피브릴을 불활성 대기하에 디옥산에서 슬러리화한다. 교반하면서, 화학양론적 양의 클로로트리에틸 실란을 첨가하고 0.5 시간 동안 반응시킨 후, 디옥산 중 5%의 DABCO 용액을 몇방울 첨가한다. 시스템을 추가 시간 동안 반응시킨 후, 피브릴을 여과시켜 모으고 디옥산에서 세척한다. 피브릴을 100℃ 5 " 진공에서 밤새 건조한다.
표 6은 2 차 유도체의 제조를 요약하고 있다. 산물을 ESCA로 분석한다. 분석은 원하는 펜던트 그룹의 혼입을 확신시킨다. 산물을 C, O, N, Si 및 F 표면 함량에 대해 ESCA로 분석한다.
[표 6]
2 차 유도체 제조의 요약
실시예 31
카복실산 작용화된 피브릴로부터 3급 및 4급 아민 유도체의 제조
3급 및 4급 아민 작용 그룹을 나노튜브상의 카복실 그룹 및 3급 또는 4급 아민 전구체의 아민 또는 하이드록실 그룹에 의해 아미드 또는 에스테르 결합으로 탄소 나노튜브의 표면에 부착할 수 있다. 이러한 3급 또는 4급 아민 피브릴은 생분자의 분리를 위한 크로마토그래피 매트릭스로 유용하다. 3급 또는 4급 아민 피브릴은 디스크-형 매트로 제조되거나 분리를 위해 종래의 크로마토그래피 매질(예: 아가로스)과 혼합될 수 있다.
트리에틸에탄올아민 요오다이드 전구체의 제조
100 ㎖ 환저 플라스크에서, N,N-디에틸에탄올아민(85.3 mmol) 10 g을 무수 메탄올 10 ㎖로 혼합한다. 에틸 요오다이드 20 g(127.95 mmol) 및 무수 메탄올 10 ㎖ 혼합물을 피펫을 사용해 적가한다. 반응 혼합물을 30분간 환류한다. 백색 결정 산물은 반응 혼합물이 실온으로 냉각되는 동안 형성된다. 백색 고체 산물을 여과시켜 모으고 무수 메탄올로 세척한다. 산물을 진공하에 건조기에서 밤새 추가 건조한다. 산물(10.3 g, 37.7 mmol)을 33%의 수율로 수득한다.
4급 아민 작용화된 흑연질 피브릴의 제조
25 ㎖의 Wheaton 일회용 섬광 바이알에서 진공 건조시, 건조 카복실 피브릴(dir 0.7 mmol/g 피브릴) 100 mg을 무수 디메틸포름아미드 2 ㎖와 혼합하고 이 혼합물을 60 초간 초음파 처리한다. 디메틸포름아미드 2 밀리리터 이상, 디메틸-아미노피리딘(0.316 mmol) 39 mg, 및 디이소프로필카보디이미드(0.316 mmol) 50 ㎕를 반응 바이알에 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 트리에틸에탄올아민 요오다이드(0.316 mmol) 88 mg을 바이알에 첨가하고 밤새 반응을 진행시킨다. 생성된 피브릴을 디메틸포름아미드 20 ㎖로 3회, 메틸렌 클로라이드 20 ㎖로 3회, 메탄올 20 ㎖로 3회 및 최종적으로는 탈이온수로 3회 세척한다. 산물을 진공하에 건조한다. 질소의 성분 분석 결과는 피브릴상의 약 50% 카복실 그룹이 4급 아민 부분에서 1차 아미노 그룹과 반응함을 보여준다.
실시예 32
3급 아민 작용화된 흑연질 피브릴상에서 소 혈청 알부민(BSA)의 크로마토그래피
2-디에틸아미노 에틸아민 개질 카복실 피브릴 60 mg 및 세파덱스 G-25 슈퍼화인 수지(Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 함유한 수성 슬러리를 실온에서 밤새 정치시켜 고형 지지체를 완전히 가수분해한다. 슬러리를 1 cm x 3.5 cm의 컬럼으로 패킹한다. 컬럼을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.3)을 이용해 0.2 ㎖/분의 유량으로 평형시킨다. BSA(0.1 ㎖ 탈이온수 중 0.6 mg)를 컬럼상에 부하한다. 컬럼을 5 mM 나트륨 포스페이트를 이용해 0.2 ㎖/분의 유량으로 용출하고 분획 0.6 ㎖를 모은다. 용출 프로필은 UV-가시광 검출기를 이용해 모니터링되고 도 3에 나타나 있다. 검출기는 컬럼으로부터 어떠한 단백질도 용출되지 않음을 지시함과 동시에, 결합 BSA를 5 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.3)에 1 M KCl을 첨가시켜 용출한다. 각 분획에서 단백질의 존재는 마이크로 BCA 분석(Pierce, Rockford, I1)에 의해 확인된다.
실시예 33
4급 아민 작용화된 흑연질 피브릴상에 소 혈청 알부민(BSA)의 크로마토그래피
2-(2-트리에틸아미노 에폭시)에탄올 개질 카복실 피브릴 100 mg 및 세파텍스 G-25 슈퍼화인 수지 300 mg을 함유한 수성 슬러리를 실온에서 밤새 정치한다. 생성된 슬러리를 이용해 1 cm 직경 컬럼을 패킹한다. 컬럼을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.3)을 이용해 0.1 내지 0.6 ㎖/분의 유량으로 평형시킨다. BSA(0.2 ㎖ 탈이온수 중 2.7 mg)를 컬럼상에 부하한다. 컬럼을 5 mM 나트륨 포스페이트를 이용해 0.2 ㎖/분의 유량으로 용출하고 분획 0.6 ㎖를 모은다. 용출 프로필은 UV-가시광 검출기를 이용해 모니터링된다(도 4). 검출기는 5 mM 나트륨 포스페이트 완충액을 이용해 더 이상 단백질이 용출되지 않음을 지시함과 동시에, 용매를 5 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.3)에서 1 M KCl로 전환한다. 각 분획에서 단백질의 존재는 마이크로 BCA 분석(Pierce, Rockford, I1)에 의해 확인된다.
9. 흑연 탄소의 효소 작용화
바이오촉매는 작용 그룹을 흑연 탄소, 특히 탄소 나노튜브의 표면으로 도입하는데 이용될 수 있다. 지금까지, 흑연 탄소는 순수 화학적인 방법(예: 1994년 12월 8일자에 출원된 U.S. 출원 제 08/352, 400 호 참조)에 의해 개질되어 왔다. 이러한 화학적 방법은 하기의 단점을 가진다: (1) 격심한 조건(극한 온도, 극심한 산도 또는 독성 화학제품의 사용), 및 (2) 특이성 결여(예: 산화가 COOH, COH, 및 CHO 그룹을 도입할 수 있음). 고체 흑연 탄소(예: 탄소 피브릴; Hyperion, Inc.)의 수성 현탁액은 흑연 탄소를 기질로 수용하고 화학 반응을 수행하여 화학적으로-개질된 흑연 탄소를 생성할 수 있는 하나 이상의 효소를 함유하도록 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 효소를 흑연 탄소의 표면을 촉매적으로 개질하기에 충분한 시간 동안 반응을 수행하도록 효소의 경우에 허락되는 조건(온도, pH, 염 농도 등)에서 유지된다. 반응 동안, 현탁액을 연속 혼합하여 효소가 흑연 탄소의 표면에 접근하도록 한다. 반응에 적용되는 반응 시간을 충분한 정도로 진행시킨 후, 효소를 여과 세척에 의해 탄소로부터 제거한다.
현재까지 두가지 유형의 효소가 사용되어 왔다: 사이토크롬 p450 효소 및 퍼옥시다제 효소. 이 두 경우, 이러한 효소 유형은 익히-연구되어 있고, 이들은 방향족 유형의 기질을 받아들이며 이들의 최적 반응 조건이 결정되어 왔다. 이 두 효소 유형은 하이드록실 그룹을 그들의 기질로 도입하고 하이드록실 그룹을 흑연 탄소에 도입할 수 있다. 효소 이외에, 리보솜 분해 효소 및 촉매 항체와 같은 기타 바이오촉매, 또는 비-생물적인 효소 모방체는 탄소 나노튜브를 촉매적으로 작용화하도록 고안될 수 있다.
실시예 34
래트의 간 마이크로솜을 이용한 효소 작용화
사이토크롬 p450은 일반적으로 간에서 독성제거제(문헌[참고; F. Peter Guengerich, American Scientist, 81, 440-447 and F. Peter Guengerich, J. Biol. Chem., 266, 10019-10022])로 작용하는 것으로 여겨진다. 이들은 다방향족 독성 화합물과 같은 외래 화합물을 하이드록실화시킨다. 하이드록실화는 이러한 화합물이 요의 형태로 몸에서 제거될 수 있도록 가수성화시킨다. 간에는 다수의 상이한 사이토크롬 p450 효소가 존재하는데, 이들 각각은 상이한 기질 특이성을 지닌다. 해독이 요구되는 광범위한 환경 독성으로 인해 이러한 광범위한 특이성이 중요한 것으로 여겨진다. 개개 사이토크롬 p450이 시판되지만, 이들 중 어떠한 것이 탄소 나노튜브를 기질로 수용할지에 관해서는 입수 가능한 정보가 없다. 이러한 불확실성으로 인해, 본 출원인은 초기에 탄소 나노튜브를 다수의 상이한 사이토크롬 p450을 함유한 래트 간 추출물과 함께 배양하기로 결정했다.
두마리의 래트("실험용" 래트)에 식수중의 페노바비탈(1 g/L, pH 7.0)을 1주간 투여하여 사이토크롬 p450 효소의 발현을 유도한다. 두마리의 다른 래트("대조용" 래트 )에는 페노바비탈이 없는 물을 공급한다. 래트는 치사되고 사이토크롬 p450-함유 마이크로솜은 표준 과정(예, Methods in Enzymology, Vol. 206 참조)에 의해 간에서 제조된다.
마이크로솜을 탄소 나노튜브(피브릴)와 혼합하고 사이토크롬 p450을 흑연 탄소와 반응시킨다. 이 실험에서, 피브릴 5 mg(둘은 "보통" 또는 비작용화되고 "COOH" 또는 산화된 피브릴)을 pH 7의 0.1 M 트리스, 1.0 mM NADPH, 0.01% NaN3, 10 mM 글루코스-6-포스페이트, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(1 단위/mL)를 함유한 완충 용액에서 마이크로솜(실험용 및 대조용 마이크로솜)과 혼합한다. NADPH는 사이토크롬 p450 및 글루코스-6-포스페이트에 대한 보조-기질로 이용되고, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 NADP+에서 NADPH가 재생되도록 첨가된다(NADP+가 사이토크롬 p450에 의해 생성되는 경우). 이 혼합물을 소원심분리관에서 약 1.5일간 실온에서 회전한다. 배양 후, 피브릴을 탈이온수, 1M HCl, 1 M NaOH, 0.05% 트리톤 X-100, 0.05% 트윈, 메탄올 및 1 M NaCl에서 광범위하게 세척한다. 세척 후, 단백질용 마이크로B CA 분석(Pierce)은 피브릴이 이들과 결합된 단백질을 여전히 가지고 있음을 보여준다(단백질이 세척액에서 검출되지 않더라도).
하이드록실 그룹이 피브릴 표면으로 도입되는지 여부를 결정하기 위해, 피브릴을 N-FMOC-이소루이신과 반응시킨다. 상이한 피브릴의 뱃치(대조용 및 실험용)(각각 1.5 mg)를 4.45 mg/㎖ EMOC-이소루이신, 1.54 mg/㎖ 디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 2.6 mg/㎖ 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)를 함유한 건조 DMF 용액 333 ㎖와 반응시킨다. 이틀간 반응시킨 후(연속 회전 동안), 피브릴을 DMF, 피페리딘, 메탄올, 물, DMF, 메탄올, 메틸렌 클로라이드(각각 600 마이크로리터)로 세척한다. 이러한 세척 순서를 3회 반복한다. 피브릴을 이소루이신 존재를 위한 아미노산 분석을 위해 Galbraith Laboratory(Knoxville, TN)로 보낸다. 이소루이신뿐만 아니라 다수의 기타 아미노산도 관찰되기 때문에 결과는 분명하지 않은데, 이는 래트의 간 마이크로솜 추출물에 존재하는 단백질, 펩타이드 및 아미노산이 피브릴로부터 완전히 세척되지 않았음을 지시한다. 따라서, 세척 및 분석의 기술적인 어려움으로 인해, 사이토크롬 p450이 작용화된 피브릴을 가지고 있는지 여부를 측정할 수 없다.
실시예 35
시판되는 재조합 사이토크롬 p450 효소를 이용한 피브릴의 작용화
래트 간 마이크로솜을 사이토크롬 p450원으로 이용하는 것과 관련된 불순물을 피하기 위해, 개개 사이토크롬 p450 효소를 구입한다(GENTEST, Woburn, MA). 사이토크롬 p450 효소는 막과 결합하여서만 활성이 있기 때문에, 이들 효소를 마이크로솜 제조품으로 공급한다. 상술한 것과 유사한 반응 과정을 사용하여, 본 출원인은 하기 사이토크롬 p450을 시험했다: CY1A1(촉매 번호 M111b), CYP1A2(촉매번호 M103c), CYP2B6(촉매 번호 110a), CYP3A4(리덕타제와 함께, 촉매 번호 M107r). MgCl2(0.67 mg/mL)도 또한 이 반응 용액에 포함된다. 이 실험에서, 피브릴을 속슬렛 장치로 세척한다.
도입된 하이드록실 그룹의 분석은 사이토크롬 p450을 반응시키고, 피브릴을 착색된 시약 3,5-디니트로벤조산(DNBA)으로 세척하는 반응에 의해 수행된다. N-FMOC-이소루이신에 대한 커플링은 앞서 기술한 바와 같이 수행된다. DNBA와의 반응 후, 피브릴을 DMF로 세척하고 잔여(공유적으로 부착된) DNBA를 6M HCl 또는 46 단위/㎖ 돼지 간 에스터라제(Sigma)를 이용해 하이드록실화한다. 유리된 DNBA의 분석은 가수분해 처리에 이은 피브릴을 둘러싼 상등액의 HPLC 분석에 의해 수행된다. 유리된 DNBA의 HPLC 분석은 Vydac C18 역상 분석 컬럼(촉매 번호 218TP54)및 0.1% TFA(용매 A)를 함유한 탈이온수에서 0.1% TFA(용매 B)를 함유한 아세토니트릴까지의 직선 구배가 갖추어진 Waters HPLC 시스템상에서 수행된다.
실시예 36
퍼옥시다제를 이용한 피브릴의 작용화
퍼옥시다제 기질 특이성에 관한 문헌적 설명은 탄소 나노튜브가 이러한 효소의 기질일 수 있음을 지적한다(문헌[참조: J. S. Dorick et al., Biochemistry(1986), 25, 2946-2951; D.R. Buhler et al., Arch. Biochem. Biophys.(1961) 92, 424-437; H, S. Mason, Advances in Enzymology, (1957) 19, 79; G. D. Nordblom et al., Arch. Biochem. Biophys.(1976) 175, 524-533]). 퍼옥시다제(하이드록시 퍼옥시다제, 유형 II, Sigma)가 하이드록실 그룹을 피브릴의 표면에 도입할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 피브릴(11 mg)을 50 mM 나트륨 아세테이트(1.25 mL, pH 5.0)를 함유한 용액에서 혼합하고, 호스래디시 퍼옥시다제(200 nM) 및 디하이드록시푸마르산(15 mg)을 초기 반응 3시간 동안 한번에 5 mg을 첨가한다. 가스성 산소를 간헐적으로 버블링하면서 반응을 4 ℃에서 총 5시간 동안 수행한다. 반응 후, 피브릴을 물, 1N NaOH, 메탄올, 및 메틸렌 클로라이드(각각 200 mL)로 세척한다. 대조 반응을 열에서 불활성화되는(100℃ 5분간) 퍼옥시다제를 이용해 수행한다.
퍼옥시다제-촉매 피브릴 하이드록실화의 정도 분석을 위해, 피브릴을 이미다졸의 존재하에 건조 DMF에서 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(Aldrich)와 반응시킨다. 피브릴의 세척 후, 피브릴을 피브릴에 통합된 실리콘의 성분 분석을 위해 Robertson Microlit Laboratories, Inc(Madison, NJ)로 보낸다. 분석 결과는 피브릴 표면상의 실리콘의 존재로 인해 확실하지 않다. 실험에 이용된 글라스웨어의 실리콘은 성분 분석용으로 제공된 피브릴에서 작은 칩의 형태로 존재함이 여겨진다. 이는 실험 및 대조 샘플 모두에서 높은 수준의 실리콘을 야기한다. 실험 결과는 퍼옥시다제가 하이드록실 그룹을 피브릴로 도입할 수는 있지만 기술적인 어려움으로 인해 도입된 하이드록실 그룹의 존재를 결정할 수는 없다는 것이다.
10. 무-산소 피브릴 표면에 대한 친전자성 첨가 또는 금속화에 의해 작용화된 나노튜브
무-산소 피브릴 표면에 대해 활성화된 친전자성 첨가에 의해 수득 가능한 1차 산물은 펜던트 -COOH, -COCl, -CN, -CH2NH2, -CH2OH, -CH2-할로겐, 또는 HC=O를 가진다. 이는 하기에 의해 2차 유도체로 전환될 수 있다:
피브릴-COOH ---→ 상기 참조.
피브릴-COCl(산 클로라이드) + HO-R-Y ---→ F-COO-R-Y(단락4/5)
피브릴-COCl + NH2-R-Y ---→ F-CONH-R-Y
피브릴-CN + H2 ---→ F-CH2-NH2
피브릴-CH2NH2 + HOOC-R-Y ---→ F-CH2NHCO-R-Y
피브릴-CH2NH2 +O=CR-R'Y ---→ F-CH2N=CR-R'-Y
피브릴-CH2OH + O(COR-Y)2 ---→ F-CH2OCOR-Y
피브릴-CH2OH + HOOC-R-Y ---→ F-CH2OCOR-Y
피브릴-CH2-할로겐 + Y- ---→ F-CH2-Y + X- Y- = NCO-, -OR-
피브릴-C=O + H2N-R-Y ---→ F-C=N-R-Y
11. 덴드리머성 나노튜브
나노튜브 표면의 작용 그룹 농도는 덴드리머-형 구조를 형성하기 위해 각 세대에 따라 증가하는 특정 작용 그룹 수를 야기하는 다작용성 시약의 일련 세대와 함께 나노튜브를 개질시켜 증가될 수 있다. 생성된 덴드리머성 나노튜브는 단백질을 공유적으로 부동화시키는 고형 지지체로 특히 유용한데, 이것이 나노튜브 표면상에 부동화된 단백질의 밀도를 증가시키기 때문이다. 본 발명은 고 밀도의 특이 화학 작용기를 고 표면적 미립 탄소 표면에 부여할 수 있음을 입증하고 있는데, 이는 이전의 고 표면적 탄소의 경우에는 어려운 일이었다.
실시예 37
라이신-기본 덴드리머의 제조
반응 순서는 도 5에서 나타내고 있다.
나트륨 비카보네이트(5 ㎖, 0.2 M, pH 8.6) 중 아미노 피브릴(90 mg) 현탁액에 디옥산(5 ㎖) 중 Nα,Nε-디-t-boc-L-라이신-N-하이드록시석신이미드 에스테르(120 mg, 0.27 mmol) 용액을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. t-부톡시카보닐 보호 라이신 피브릴을 물, 메탄올 및 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척하고 진공하에 건조한다. t-부톡시카보닐 보호 라이신 피브릴을 실온에서 2시간 동안 메틸렌 클로라이드(5 ㎖) 중 트리플로로아세트산(5 ㎖)으로 처리한다. 산물 아미노 라이신 피브릴을 메틸렌 클로라이드, 메탄올 및 물로 광범위하게 세척하고 진공하에 건조한다. 제 2 및 제 3 세대 라이신 피브릴의 제조는 동일한 과정을 따른다. 아미노산 분석 자료는 제 1 세대 라이신 피브릴은 0.6 μ몰 라이신/그램 피브릴을 함유하고, 제 2 세대 라이신 피브릴은 1.8 μ몰 라이신/그램 피브릴을 함유하며 제 3 세대 라이신은 3.6 μ몰 라이신/그램 피브릴을 함유함을 보여준다.
카복실 덴드리머성 피브릴은 아스파트산 또는 글루탐산을 카복실 피브릴과 함께 이용해 동일한 방법으로 제조될 수 있다.
실시예 38
카복실레이트-말단 덴드리머의 제조
탄소 나노튜브(CN) 코어를 지닌 카복실레이트 말단 덴드리머를 연속적인 아미노부틸-니트릴로트리아세트산(NTA)의 차후 커플링 및 클로레이트 산화 탄소 나노튜브의 NHS 에스테르를 이용한 개시에 의해 생성한다.
NTA의 제조
NTA는 본문 내용이 본원에서 참조 문헌으로 인용되는 Hochuli 법(문헌[참조; E. Hochuli, H. Dobeli, and A. Schacher, J. Chromatography, 411, 177-184(1987)])에 따라 제조된다.
CN/NHS의 제조
CN/NHS를 실시예 20의 방법에 따라 제조한다.
CN/NTA의 제조
NTA·HCl 0.4 g을 pH 8.1의 0.2 M NaHCO3 25 ㎖에 용해시킨다. 1M NaOH를 첨가하여 pH가 7.8이 되게한다. CN/NHS 0.5 g을 첨가하고, 혼합물을 초음파 처리하여 CN을 분해시키며 생성된 슬러리를 교반하면서 30분간 반응시킨다. 슬러리를 0.45 ㎛ 나일론막으로 여과하고 필터상에서 pH 8.1의 카보네이트 완충액으로 2회, 탈이온수로 2회 세척한다. 개질된 CN을 초음파 처리하면서 MeOH 25 ㎖에서 2회 재현탁시키고, 여과시켜 고체 케이크를 만들어 최종적으로는 진공 건조기에서 건조한다.
CN/NTA/NTA의 제조
CN/NTA를 우선 NHS 활성 에스테르로 전환시킨다. CN/NTA 0.396 그램을 90 ℃ 오븐에서 30분간 건조한 다음 무수 디옥산 30 ㎖를 지닌 100 ㎖ 환저 플라스크에 놓고 아르곤으로 퍼징한다. N-하이드록시석신이미드 0.4 g을 교반하면서 첨가한 다음 연속적인 교반과 동시에 EDC 0.67 그램을 추가 시간동안 첨가한다. CN은 이 시간동안 응집되는 경향이 있다. 디옥산을 기우려 따라내고 고형물을 무수 디옥산 20 ㎖로 2회 세척한다. 고형물을 무수 MeOH 20 ㎖로 세척하고 이 동안 응집 덩어리가 파괴된다. 고형물을 0.45 ㎛ 나일론 막으로 여과하고, MeOH에서 재현탁하며, 여과시킨 후 필터상에서 MeOH로 세척한다.
NTA 0.2 g을 50 ㎖ 플라스크에 첨가하고 1M NaOH 10방울로 용해시킨다. pH 8.1의 0.2 M NaHCO3 20 ㎖를 첨가한 다음 모든 CN/NTA/NHS를 첨가하고 용액을 탐침 초음파 처리기로 가볍게 초음파 처리한다. 혼합물을 실온에서 2.5 시간 동안 반응시킨다. 개질된 CN을 0.45 ㎛ 나일론막으로 여과하고, 카보네이트완충액으로 2회 세척하며, 초음파 처리와 동시에 탈이온수로 재현탁시키며, 여과한 다음 탈이온수로 세척한다. 이를 진공 건조기에 놓고 건조시킨다.
CN/NTA/NTA/NTA의 제조
추가 수준의 NTA를 앞서 기술된 과정에 이어 첨가한다.
CN/NTA/NTA/NTA/NTA의 제조
추가 수준의 NTA를 앞서 기술된 과정에 이어 첨가한다.
4 세대 NTA 첨가의 각 샘플(대략 10 mg)을 초음파 처리와 동시에 탈이온수 10 ㎖에서 현탁시키고 0.45 ㎛ 나일론막으로 여과시켜 펠트-형 매트를 형성한다. 매트 절편을 진공 건조기에 저장하고 NTA의 상대적인 양을 지시하는 질소(N)에 대해 ESCA로 분석한다. 결과는 하기 표에서 나타내고 있다.
ESCA 결과는 각 연속 세대와 함께 증가된 양의 혼입을 입증한다.
실시예 39
단백질 지지체로서의 탄소 나노튜브 덴드리머
탄소 나노튜브상에서 부동화된 단백질의 밀도는 덴드리머를 지니도록 유도된 피브릴을 사용함으로써 굉장히 증가될 수 있다. 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)를 하기의 방법에 따라 덴드리머성 나노튜브상에 부동화시킨다.
보통의 피브릴(0.49 mg), 아미노 피브릴(0.32 mg), 제 1 세대 라이신 피브릴(0.82 mg), 제 2 세대 라이신 피브릴 및 제 3 세대 라이신 피브릴을 실온에서 15분 동안 나트륨 비카보네이트 컨쥬게이트 완충액(600 ㎕, 0.1 M, 0.9% NaCl 함유)으로 초음파 처리한다. 이들을 실온에서 19시간 동안 나트륨 비카보네이트 컨쥬게이트 완충액(490 ㎖, 5.6 mg/㎖의 효소 공급액)에서 HRP 용액과 함께 배양한다. HRP 부동화 피브릴을 하기 완충액(1 ㎖)으로 세척한다: pH 9.5(1회 세척 완충액)의 0.9% NaCl를 함유한 10 mM NaHCO3 완충액 7회, 1회 세척 완충액 중 0.1% 트리톤 X-100 5회, 1회 세척 완충액 중 50% 에틸렌 글리콜 3회. HRP의 활성을 414 nm의 글라이신 분석 완충액(50 mM, pH 4.4) 중 질소 퍼옥시다제 용액(10 ㎕, 10 mM 공급액) 및 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-설폰산 디암모늄 염(ABTS, 3 ㎕, mM 공급액)을 이용해 분석한다. 결과는 하기 표에서 나타내고 있다:
12. 이작용성 피브릴
한가지 유형 이상의 작용 그룹(예: 카복실 그룹 및 아미노 그룹)은 작용화된 나노튜브, 예를 들어, 카복실 나노튜브를 아미노산과 동시에 반응시켜 피브릴로 도입될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 이작용성 피브릴을 사용하여 다중 분자를 특히 1 : 1의 화학양으로 근접하여 부동화시킬 수 있다.
실시예 40
라이신 첨가에 의한 이작용성 피브릴의 제조
Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르의 합성
반응 순서는 도 7에서 나타내고 있다. Nε-(t-부톡시카보닐)-L-라이신(2g, 8.12 mmol)을 메탄올(40 ㎖) 및 물(40 ㎖)에 용해시키고 pH를 트리에틸아민을 이용해 8로 조정한다. 디옥산(2.4 g, 20 ㎖ 중 9.7 mmol) 중 N-(벤질옥시카보닐-옥시)석신이미드 용액을 상기 혼합물에 첨가하고 pH를 트리에틸아민을 이용해 8-9로 유지한다. 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고 Nα-CBZ-Nε-(t-부톡시카보닐)-L-라이신을 수득한다. Nα-CBZ-Nε-(t-부톡시카보닐)-L-라이신을 0.2 M 칼슘 카보네이트(4 ㎖)로 처리하고 수성층을 제거하여 백색 고체를 수득한다. 고체를 N,N-디메틸포름아미드(40 ㎖) 및 벤질 브로마이드(1.16 ㎖)에서 재현탁한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물에 작용시키고, 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조한다. 용매를 제거하여 Nα-CBZ-Nε-(t-부톡시카보닐)-L-라이신 벤질 에스테르를 수득하고 이를 에틸 아세테이트 중 25% 헥산을 용매로 이용해 실리카 겔 크로마토그래피시켜 정제한다. 메틸렌 클로라이드(10 ㎖) 중 Nα-CBZ-Nε-(t-부톡시카보닐)-L-라이신 벤질 에스테르(1 g, 2.2 mmol)에 0℃에서 트리플루오로아세트산을 첨가한다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분간 교반한 다음, 실온에서 추가 2.5 시간 동안 교반한다. 용매를 제거하고 조 산물을 수득한다. 순수한 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 수득한다.
Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르 피브릴의 합성
메틸렌 클로라이드(18 ㎖) 중 카복실 피브릴(300 mg) 현탁액에 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르(148 mg, 20 ㎖ 메틸렌 클로라이드 및 176 ㎕ 트리에틸아민 중 0.32 mmol) 용액을 첨가한다. HOBT(43.3 mg. 0.32 mmol) 및 EDC(61.3 mg, 0.32 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 조 산물을 수득한다. 산물 피브릴을 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 및 물로 광범위하게 세척한 다음, 진공하에 건조한다.
이작용성 피브릴 Fib-Lys(COOH)NH 2 의 합성
메탄올(4 ㎖) 중 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르 피브릴(113 mg)에 나트륨 하이드록사이드(1 N, 4 ㎖)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 산물 Nα-CBZ-L-라이신 피브릴을 물 및 메탄올로 광범위하게 세척하고 피브릴을 진공하에 건조한다. 아세토니트릴(4 ㎖) 중 Nα-CBZ-L-라이신 피브릴(50 mg) 현탁액에 트리메틸 실릴 요오다이드(1 ㎖)를 첨가한다. 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반한다. 최종 이작용성 피브릴을 물, 메탄올, 5 N 나트륨 하이드록사이드, 아세토니트릴 및 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척한다. 아미노산 분석은 0.3 μmol 라이신/그램 피브릴을 보여준다.
하이드록실 및 카복실(또는 아미노) 이작용성 피브릴을 세린, 트레오닌 또는 티로신을 이용해 본원에서 기술된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 티올화 및 카복실(또는 아미노) 이작용성 피브릴을 시스테인을 이용해 제조할 수 있다. 카복실 및 아미노 이작용성 피브릴을 아스파트산 또는 글루탐산을 이용해 제조할 수 있다.
작용화된 나노튜브의 용도
작용화된 흑연질 나노튜브는 높은 다공성, 화학 및 열 안정성 및 높은 표면적으로 인해 다수의 생물공학적 이용에서 고체 지지체로 유용하다. 이들은 격심한 화학 및 열처리에 적합하고 화학 작용화를 상당한 정도로 가능케 하는 것으로 밝혀졌다.
예를 들면, 효소가 생물 활성을 유지하면서 개질된 나노튜브에 공유적으로 부동화될 수 있다. 또한, 나노튜브는 생물분자 분리시 친화성 크로마토그래피 지지체로 이용하는데 적당하다. 예를 들면, 효소 억제제를 다단계 합성시 나노튜브 상에서 제조되어 부동화 억제제가 거대분자에 접근할 수 있고, 가역 특이 생물학적 인식이 단백질과 개질 피브릴간에 일어날 수 있게 된다.
나노튜브 표면의 소수성은 충분하지 못해 흡착에 의해 고 밀도의 단백질을 부동화시킨다. 나노튜브 표면의 소수성을 증가시키고 2차원에서 3차원으로 소수성 환경을 확장시키기 위해, 길이를 변형시키는 알킬 쇄를 나노튜브 표면에 커플링 한다. 흡착에 의해 알킬 나노튜브상에 부동화된 단백질은 트립신, 알칼리성 포스파타제, 리파제 및 아비딘을 포함한다. 이러한 부동화 단백질의 효소 활성은 수용액에서 기질의 가수분해에 대한 촉매적 효율에 의해 증명된 유리 효소의 것과 비교된다.
또한, 알킬쇄의 말단에 페닐 그룹이 첨가된 알킬 나노튜브인 페닐-알킬 나노튜브도 또한 제조될 수 있다. 이러한 개질은 π-π 상호작용을 통해 단백질내의 아미노산 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판과 상호작용하는 방향족 구조를 도입한다. 페닐-알킬 나노튜브상에 알칼리성 포스파타제 및 리파제의 흡착은 C8-알킬 나노튜브상의 흡착에 필적한다.
작용화된 피브릴은 또한 단백질 합성시 고체 지지체로 유용함이 밝혀졌다.
1. 효소에 대한 고체 지지체로서 작용화된 나노튜브
실시예 41
흡착에 의한 효소 부동화
알킬 피브릴의 제조
알킬 피브릴을 -COOH 그룹(10 mg x 0.7 mmol-COOH/피브릴 mg = 0.007 mmol) 약 0.007 mmole을 함유하는 카복실 피브릴 10 mg을 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) 0.14 mmol과 DMAP(4-디메틸아미노피리딘) 0.14 mmol을 사용하여 DMF(N,N-디메틸포름아미드) 1.5 ㎖ 중의 알킬아민 0.14 mmol과 반응시킴으로써 제조한다. 화학 반응은 하기와 같다:
피브릴-COOH + NH2(CH2)nCH2R (R=H 또는 OH) -----→
피브릴-CONH(CH2)nCH2R
상이한 길이의 알킬쇄(n = 5, 7, 9, 17; n=5에 대해서만 R=OH)를 갖는 여러 상이한 알킬 피브릴을 이러한 절차에 의해서 제조한다. 반응을 실온에서 밤새 교반한 후, 피브릴을 CH2Cl2 3 x 25 ㎖, MeOH 3 x 25 ㎖ 및 dH2O 3 x 25 ㎖로 격렬하게 세척한다. 피브릴내 질소 함량의 원소 분석은 반응 수율이 65 내지 100%임을 나타낸다.
효소의 흡착
효소 리파제, 트립신, 알칼리성 포스파타제 및 아비딘을 본 실시예의 알킬 피브릴에 흡착에 의해 부동화한다. 알킬 피브릴 및 효소를 실온에서 3 내지 4 시간 동안 혼합한 다음, 5 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.1)로 2 내지 4 회 세척한다. 알칼리성 포스파타제를 C8-피브릴 및 C6OH-피브릴에, 트립신을 C6-, C8-, C10- 및 C18-피브릴에, 리파제를 C6OH-, C8-, C10- 및 C18-피브릴에, 아비딘을 C8-피브릴에 부동화한다. 결과가 하기의 표에 예시되어 있다:
부동화된 효소의 동역학은 하기의 표에 예시된 바와 같이 자유 효소의 동역학에 필적할만하다고 밝혀졌다.
기질: 리파제; 1,2-O-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산 레조루핀 에스테르
트립신; N-벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐라이드
실시예 42
피브릴-리파제에 의해 촉매된 에스테르화
(에틸 부티레이트의 합성)
리파제를 실시예 41의 절차에 따라 C8-알킬 피브릴 상에 부동화한다. 리파제 피브릴을 헵탄에 분산시키기 위해서 먼저 디옥산으로, 이어서 디옥산과 헵탄의 혼합물로, 최종적으로 헵탄으로 세척한다. 에틸 부티레이트(파인애플-바나나 향미를 제공하는 식품 첨가제)를 합성하기 위해서, 에탄올(0.4 M)과 부티르산(0.25 M)을 헵탄에서 피브릴-부동화 리파제 6.2 ㎛와 혼합한다. 반응 혼합물을 실온에서 교반한다. 설정된 방법을 사용하여 반응 혼합물내 에탄올 농도를 측정함으로써 측정된 수율은 7시간에 60%이다. 반응 및 결과가 도 8에 도시되어 있다.
실시예 43
알칼리성 포스파타제의 페닐-알킬 피브릴 상의 부동화
페닐-알킬 피브릴의 제조
페닐-알킬 피브릴을 두개의 상이한 반응에 의해서 제조한다. 반응 1은 카복시 피브릴(-COOH 약 0.014 mmol을 함유)을 DMF(N,N-디메틸포름아미드) 1.5 ㎖ 중의 4-페닐부틸아민 0.28 mmol, EDC 0.28 mmol 및 DMAP(4-디메틸아미노피리딘) 0.28 mmol과 혼합시킨다. 반응 2는 카복시 피브릴 20 mg을 DMF 1.5 ㎖ 중의 6-페닐-1-헥사놀 0.28 mmol, DCC(1,3-디사이클로헥실카보디이미드) 0.28 mmol 및 DMAP 0.28 mmol과 혼합한다. 반응을 밤새 교반하면서 실온에서 수행한다. 이어서 피브릴을 CH2Cl2 3 x 25 ㎖, MeOH 3 x 25 ㎖ 및 dH2O 3 x 25 ㎖로 심하게 세척한다.
알칼리성 포스파타제-부동화 피브릴의 제조
페닐-알킬 피브릴 0.5 mg을 0.05 M Tris (pH 8.6) 400 ㎕에 현탁하고 20분 동안 초음파처리한다. 이러한 피브릴에 알칼리성 포스페이트 용액(5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 중의 1.67 mg/㎖, pH 7.0) 150 ㎕를 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전시키고 4℃에서 밤새 저장한다. 이어서 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH 7.1) 600 ㎕로 2회 세척하고 동일한 완충제 200 ㎕에 현탁한다.
특이적으로 부동화된 알칼리성-포스파타제의 촉매 활성 측정에 의한 정량
알칼리성 포스파타제는 기질 p-니트로페닐 포스페이트와 반응하고 18,200 M-1cm-1의 흡광 계수를 갖는 405 nm에서 빛을 흡수하는 색채 화합물을 방출한다. 이러한 반응을 위한 분석 완충제 조건은 10 mM Tris, 1 mM MgCl2 및 0.1 mM ZnCl2, (pH 8.4)이다. 반응은 p-니트로페닐 포스페이트 원액(분석 완충제 중의 33% DMSO의 0.5M) 5 ㎕와 분석 완충제 1 ㎖ 중의 알칼리성 포스파타제 피브릴 13 ㎍을 혼합함으로써 1 ㎖ 큐벳에서 수행된다. 405 nm에서의 흡광도 증가가 0분 이상의 시간 스캔에 의해서 모니터링된다. 이어서 효소 활성(μM/분)을 흡광 계수 18200 M-1cm-1를 이용하여 초기 경사로부터 계산한다.
반응 1로부터 페닐 피브릴에 흡착된 알칼리성 포스파타제에 있어서, 활성은 피브릴 13 ㎍당 6.95 μM/분이다. 반응 2로부터 페닐 피브릴에 흡착된 알칼리성 포스파타제에 있어서, 활성은 피브릴 13 ㎍당 2.58 μM/분이다. 이러한 결과를 동일한 분석 조건하에서 1 μM 알칼리성 포스파타제 당 879.8 μM/분으로 측정되는 기지 농도의 알칼리성 포스파타제 용액의 활성을 나눔으로써 각각 피브릴 g당 0.63 μmol (또는 54 mg) 및 0.23 μmol (또는 20 mg) 활성 알칼리성 포스파타제로 전환한다.
실시예 44
리파제의 페닐 알킬 피브릴 상의 부동화
리파제-부동화 피브릴의 제조
페닐-알킬 피브릴 0.5 mg을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 7.1) 50 ㎕에 현탁하고 20분 동안 초음파처리한다. 이러한 피브릴에 리파제 용액(5 mM 나트륨 포스페이트 완충제의 0.2 mM, pH 7.1) 350 ㎕를 첨가하고 혼합물을 실온에서 5시간 동안 회전하고 4℃에서 밤새 저장한다. 이어서 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH 7.1) 600 ㎕로 3회 세척하고 동일한 완충제 200 ㎕에 현탁한다.
특이적으로 부동화된 리파제의 촉매 활성 측정에 의한 정량
리파제는 기질 1,2-o-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-레조루핀 에스테르(Boehringer Mannheim, 1179943)와 반응하고 60,000 M-1cm-1의 흡광 계수를 갖는 572 nm에서 빛을 흡수하는 색채 화합물을 생성한다. 이러한 반응을 위한 분석 완충제 조건은 0.1 M KH2PO4 (pH = 6.8)이다. 반응은 기질 원액(Thesit 중의 50% 디옥산의 7.6 mM) 5 ㎕와 분석 완충제 1 ㎖ 중의 알칼리성 포스파타제 피브릴 13 ㎍을 혼합함으로써 1 ㎖ 큐벳에서 수행된다. 572 nm에서의 흡광도 증가가 0분 이상의 시간 스캔에 의해서 모니터링된다. 이어서 효소 활성(μM/분)을 흡광 계수 60,000 M-1cm-1를 이용하여 초기 경사로부터 계산한다.
실시예 43의 반응 1로부터 페닐알킬 피브릴에 흡착된 리파제에 있어서, 활성은 피브릴 13 ㎍당 0.078 μM/분이다. 실시예 43의 반응 2로부터 페닐알킬 피브릴에 흡착된 리파제에 있어서, 활성은 피브릴 13 ㎍당 0.054 μM/분이다. 이러한 결과를 동일한 분석 조건하에서 1 μM 리파제당 1.3 μM/분으로 측정되는 기지 농도의 리파제 용액의 활성을 나눔으로써 각각 피브릴 g당 4.7 μmol (또는 564 mg) 및 3.3 μmol (또는 396 mg) 활성 리파제로 전환한다.
실시예 45
호스래디시 퍼옥시다제(HRP)의 아미노 알킬-개질 피브릴 상의 부동화
카복실산-작용화 피브릴(카복실 피브릴)의 제조
흑연 피브릴 10.0 g 샘플을 스패튤러로 혼합함으로써 농축된 H2SO4 450 ㎖에서 슬러리화하고 유입구/배출구 및 일반 교반기가 설비된 반응기 플라스크로 이송한다. 교반 및 아르곤의 느린 유동하에서, NaClO3 8.68 g의 충진물을 실온에서 24시간에 걸쳐서 나누어 첨가한다. 실행의 전 과정 동안 생성된 염소 중기를 수성 NaOH 트랩으로 반응기 밖으로 소제한다. 실행 말기에, 피브릴 슬러리를 분쇄된 얼음위로 따르고 진공여과한다. 필터 케이크를 속슬렛(Soxhlet) 팀블로 이송하고 속슬렛 추출기에서 탈이온수로 수시간마다 미사용 물로 교환하면서 세척한다. 미사용 탈이온수에 첨가시 피브릴의 샘플이 물의 pH를 변화시키지 않을 때까지 세척을 계속한다. 이어서 카복실화 피브릴을 여과에 의해 회수하고 100℃, 5" 진공에서 밤새 건조한다. 수율은 10.0 g이다.
HRP-부동화 피브릴의 제조
실시예 27(1.2 mg)의 방법을 사용하여 1,6-디아미노헥산으로부터 제조된 아미노 피브릴을 컨쥬게이트 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.9% NaCl, pH 9.5)에 첨가하고 현탁액을 20분 동안 초음파처리한다. 이어서 피브릴을 에펜도르프 튜브에서 컨쥬게이트 완충액으로 2회 세척하고 컨쥬게이트 완충액 430 ㎕로 현탁한다. 현탁액의 분취량 50-㎕(0.14 mg 피브릴)을 탈이온수 50 ㎕에 용해된 활성화 HRP(일리노이의 Pierce, Rockford) 4.0 mg과 혼합하고 생성된 현탁액을 4℃에서 밤새 회전시킨다. HRP-접합 피브릴을 에펜도르프 원심분리 튜브에서 하기 용액의 배합으로 광범위하게 세척한다; 컨쥬게이트 완충액, 세척 완충제 (20 mM KH2PO4, 0.45% NaCl, pH 6.2), 0.03 내지 0.1 % Triton X-100을 함유하는 세척 완충제, 및 50% 에틸렌 글리콜을 함유하는 완충제. 대조군으로서, 활성화 HRP로의 동일한 조작을 HRP의 아미노 피브릴로의 부착이 사실상 특정 공유 결합임을 나타내는 평이한(비-유도) 피브릴로 수행한다.
특이적으로 부동화된 HRP의 촉매 활성 측정에 의한 정량
광범위한 세척은 대부분의 비-특이 결합 효소를 제거한다. 부동화된 활성 HRP를 H2O2 및 색소원 기질 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산), 디암모늄염 (ABTS)를 사용하여 기질 턴오버에 의해 정량한다. HRP의 촉매 활성을 기질로서 H2O2 100 μM과 ABTS 30 μM을 사용하여 414 nm에서 분광광도계로 모니터링한다. 이러한 예비 연구에서 아미노 피브릴에 결합된 효소의 총량은 0.0230 μmol HRP/g 피브릴이다. 이에 비해서, 대조군(평이한 피브릴)은 0.0048 μmol HRP/g 피브릴을 비특이적으로 결합시킨다. 감법에 의해서, 공유적으로 (특이적으로) 부착된 양은 0.0182 μmol/g 피브릴이다.
실시예 46
부동화 효소 억제제를 지니는 피브릴 상의 알칼리성 포스파타제(AP) 및 β-갈락토시다제(βG)의 친화성 크로마토그래피 분리
알칼리성 포스파타제 억제제 피브릴의 제조
AP-억제제 개질 피브릴의 제조는 문헌[참조: Brenna et al., (1975), Biochem J., 151:291-296]의 방법을 기초로 한다.
카복실화 피브릴을 상기의 실시예 50에 기재된 바와 같이 NHS 에스테르 피브릴을 제조하기 위해서 사용한다. NHS 에스테르 피브릴(114 mg)을 아세톤 4 ㎖에 현탁하고 티라민 10 당량(피브릴 g당 NHS 에스테르 0.7 meq의 측정을 기준으로)을 첨가한다. 건조 트리에틸아민(10 당량)을 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반한다. 티라미닐 피브릴을 진공하에 소결된 유리 깔때기에서 먼저 아세톤으로, 이어서 탈이온수로 광범위하게 세척한다.
4-(p-아미노페닐아조)-페닐아존산(66 mg)을 1N HCL 4 ㎖에 현탁한다. 현탁액을 4℃로 냉각하고 0.5 M NaNO2 0.36 ㎖과 서서히 혼합한다. 15분 후, 아존산/NaNO2 혼합물을 0.1 M NaCO3(pH 10.0) 10 ㎖에 현탁된 티라미닐 피브릴에 첨가한다. 반응 혼합물(약 pH 10)을 4℃에서 밤새 교반한다. 이어서 피브릴을 용출물이 투명해질 때까지 0.1 M Na2CO3 (pH 10.0), 8 M 구아니딘 HCl, 25 mM NaOH 및 물의 연속 세척으로 처리한다. AP-억제제 피브릴내 비소의 원자 흡착 분석을 Galbraith Laboratories(테네시의 녹스빌)에 의해 수행한다. 한 원자의 비소를 함유하는 측쇄를 함유하는 AP-억제제 피브릴이 원자 흡착 분석에 의해서 0.4%의 비소 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것은 측정된 초기 COOH 그룹 중의 약 10%가 이러한 다단계 합성에서 AP-억제제로 전환됨을 나타낸다. 피브릴의 표면적을 기준으로 하여, 이것은 표면적 500 Å2당 하나의 억제제 분자(효소 결합 부위)가 존재함을 의미한다.
β-갈락토시다제-억제제 피브릴의 제조
p-아미노-페닐-β-D-티오갈락토시다제(TPEG) 유도 피브릴을 문헌[참조: Ullman, (1984) Gene, 29:27-31]의 방법을 기초로 하여 제조한다. 탈이온수 0.2 ㎖ 중의 카복실화 피브릴 8 mg에 TPEG 2.24 mg을 첨가한다. 현탁액의 pH를 0.1 M HCl로 4.0으로 조정하고 EDAC 15 mg을 첨가한다. 혼합물을 3시간 동안 pH 4.0, 실온에서 교반한다. 에펜도르프 튜브에서 빠르게 원심분리하고 액체를 제거함으로써 반응을 중단시킨다. β-갈락토시다제-억제제 피브릴을 탈이온수에서의 반복된 재현탁 및 원심분리에 의해 5회 세척한다.
친화성 분리
알칼리성 포스파타제(AP) 유형 III(이. 콜라이로부터 수득; 미주리 세인트 루이스의 Sigma Chemical Co.) 및 β-갈락토시다제(βG)(이. 콜라이로부터 수득; 캘리포니아 라 졸라의 Calbiochem)의 혼합물을 에펜도르프 원심분리 튜브내 AP-억제제 피브릴 또는 βG-억제제 피브릴 상에서 뱃치식으로 분리한다. 친화성 분리를 위해서, AP(일반적으로 약 10 유닛)와 βP(일반적으로 약 280 유닛) 모두를 함유하는 부하 완충 용액(20 mM Tris, 10 mM MgCl, 1.6 M NaCl, 10 mM 시스테인, pH 7.4) 1.0 ㎖를 AP- 또는 βG-억제제 피브릴 0.8 내지 1.0 mg에 첨가한다. 생성된 현탁액을 서서히 와동시킨 다음 실온에서 2시간 동안 회전시킨다. 효소 결합후, 피브릴을 테이블용 원심분리기에서 간단히 원심분리함으로써 침강시키고 비결합 효소를 함유하는 액체 상을 제거하고 효소 분석을 위해 저장한다. 부하 완충제로의 세척(7 x 1.0 ㎖)을 반복된 완충제 첨가, 저속 와동, 15분 회전, 간단한 원심분리 및 파스퇴르 피펫으로의 용매 제거에 의해 수행한다. 7회의 세척후, 동일한 조작을 βG-억제제 피브릴(100 mM 나트륨 보레이트, 10 mM 시스테인, 10 mM 시스테인, pH 10.0) 또는 AP-억제제 피브릴(40 mM NaHPO4, 10 mM Tris, 1.0 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2, pH 8.4)을 위한 적합한 용출 완충제(5 x 1.0 ㎖)로 반복하여 수행한다.
모든 분획(비결합 효소, 세척 및 용출)을 AP 및 βG 활성에 대해 분석한다. 알칼리성 포스파타제 활성을 410 nm(△ε=18,000 M-1cm-1)에서 500 μM p-니트로-페닐포스페이트(PNPP)의 가수분해율을 분광광도계로 모니터링함으로써 측정한다. 알칼리성 포스파타제 활성 측정을 10 mM Tris, 1.0 mM MgCl2 및 0.1 mM ZnCl2, pH 8.4에서 수행한다. β-갈락토시다제를 2-니트로-갈락토-β-D-피라노시드(ONPG)를 가수분해하는 효소능을 분광광도계로 모니터링함으로써 분석한다. 5.0 mM ONPG에 대한 β-갈락토시다제-촉매된 가수분해의 초기 속도를 405 nm(△ε=3500 M-1cm-1)에서 10 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1.6 M NaCl, 10 mM 시스테인, pH 7.4에서 측정한다.
AP-억제제 및 βG-억제제 피브릴 모두에 대해서, AP와 βG의 혼합물을 첨가한다. 특이 결합능의 측정을 촉진하기 위해서, 첨가된 효소의 농도를 부동화된 억제제 농도에 매우 초과한다. AP-억제제 피브릴에 있어서, 0.550 μmol AP/g 피브릴이 결합된다(0.020 μmol βG/g 피브릴의 비특이 결합과 대조적으로). βG-억제제 피브릴에 있어서, 결합능은 0.012 μmol βG/g 피브릴로 측정된다(0.012 μmol AP/g 피브릴의 비특이 결합과 대조적으로). 친화성 크로마토그래피 실험의 결과가 도 9 및 10에 도시되어 있다. AP-억제제 피브릴은 βG를 상당히 결합시키지 않지만, 40 mM 포스페이트, 경쟁하는 억제제를 완충제에 첨가할 경우 특이적으로 용출하는 AP를 결합시킨다 (도 9). βG로 유도된 피브릴은 실질적인 양의 AP를 결합시키지 않지만, pH가 약화된 효소 억제제 결합으로 상승될 경우 특이하게 용출하는 βG를 결합시킨다 (도 10). 이러한 결과는 억제제가 피브릴에 성공적으로 공유 부착되고, 부동화 억제제가 거대 분자로 되기 쉬우며, 억제제가 특이 효소 결합에 이용가능하며, 특이적으로 용출시 효소가 활성 상태로 존재함을 나타낸다. 도 10에서, βG가 βG-억제제 피브릴로부터 계속해서 걸러지는 것으로 보인다. 이것은 동일한 현상이 AP-억제제 피브릴로의 도 9에서 나타나지 않으므로 피브릴의 결점이라기보다는 천연의 약한 효소-억제제 친화력의 결과일 수 있다.
2. 항체에 대한 고체 지지체로서 작용화된 나노튜브
항체가 작용화된 나노튜브 상에 부동화될 수 있고 이러한 나노튜브는 이의 주량당 높은 표면적, 전기 전도성, 및 화학적 물리적 안정성으로 인하여 다수의 적용에 대해 특이한 장점을 지닌다. 예를 들면, 항체 나노튜브는 분자 분리를 위한 친화성 제제로서 사용할 수 있다. 항체 나노튜브는 또한 ECL-기본 면역분석과 같은 진단 면역분석을 포함하는 분석 적용에 유용하다.
항체는 공유 결합 또는 비-고유 흡착에 의해 부동화될 수 있다. 공유 부동화는 항체 탄수화물 그룹의 환원성 아민화, 카복실화 피브릴의 NHS 에스테르 활성화(상기의 실시예 27 참조) 및 티올화 또는 말레이미도 피브릴의 환원 또는 말레이미도-개질 항체와의 반응(상기의 실시예 23과 25 참조)을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성된다.
항체를 나노튜브에 부착시키기 위한 최상의 방법은 이들이 사용될 적용에 좌우될 것이다. 분리 적용에 있어서, 바람직한 방법은 비-공유 흡착이고 그 이유는 단백질 결합능이 이 방법에 대해서 가장 높은 것으로 보이기 때문이다. 피브릴의 전기 전도성이 중요할 수 있는 ECL 수반 방법에 있어서, 공유 방법이 바람직할 수 있다(알킬 부속물이 약한 전도체이고 피브릴을 절연하도록 기대될 수 있다). 환원성 아민화는 항체를 피브릴에 공유결합시키는 최상의 방법일 수 있고 그 이유는 이 방법을 사용함으로써 항체가 결합 부위가 외부를(피브릴부터 멀리) 가리키도록 올바르게 배향되기 때문이다.
3. NAD+ 의 작용화 나노튜브로의 첨가
NAD+와 같은 조인자를 첨가하고 효소 조인자에 결합하는 단백질의 생특이적 친화성 크로마토그래피를 위한 고체 지지체로서 사용할 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들면, NAD+ 피브릴이 디하이드로게나제의 정제를 위한 고체 지지체로서 사용되었다. 피브릴 사용의 주된 장점은 접근하기 쉬운 대량의 표면적이다. 높은 표면적을 갖는 친화성 매트릭스가 높은 잠재능으로 인하여 바람직하다. 피브릴은 느슨하게 분산될 수 있거나 컬럼 또는 매트에 부동화될 수 있다.
실시예 47
NAD + 피브릴 상의 디하이드로게나제의 친화성 크로마토그래피 분리
NAD + 피브릴의 제조
피브릴을 실시예 14 및 15에 따라서 도입하기 위해서 산화한다. 나트륨 비카보네이트 용액(3 ㎖, 0.2 M, pH 8.6) 중의 피브릴(31 mg)의 현탁액에 N6-[아미노 헥실]카바모일메틸)-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 리튬염 용액(5 ㎖ 나트륨 비카보네이트 용액 중의 Sigma의 25 mg)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 산물 피브릴을 물, N,N-디메틸포름아미드 및 메틸로 광범위하게 세척한다. 원소 분석 데이터는 산물 피브릴이 질소 분석에 의해서 피브릴 g당 NAD 분자 130 mmol을, 인 분석에 의해서 피브릴 g당 NAD 분자 147 mmol을 함유함을 나타낸다. 아미노 그룹에서 종결하는 링커를 갖는 NAD+ 기타 동족체를 NAD+ 피브릴 제조를 위해 사용할 수 있다.
친화성 분리
NAD+ 부동화 피브릴(0.26 mg) 및 평이한 피브릴(0.37 mg)을 40℃에서 30분 동안 나트륨 포스페이트(1 ㎖, 0.1 M, pH 7.1에서) 중의 0.1% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 분자량 1000)로 초음파처리한다. 피브릴 현탁액을 원심분리하고 상등액을 제거한다. 피브릴을 4℃에서 90분 동안 0.1% PEG (1000) 나트륨 포스페이트 완충제(250 ㎕, LDH 용액과 0.1% PEG 완충제의 비는 1:1) 중의 L-락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 혼합물로 배양한다. 이어서 혼합물을 실온에서 30분동안 평형시킨다. 피브릴을 LDH로 배양한 후, 피브릴을 나트륨 포스페이트 완충제(5 X 1000 ㎕) 중의 0.1% PEG (1000)으로 세척하고 매 세척은 회전과 함께 15분 걸린다. LDH를 0.1% PEG (1000) 나트륨 포스페이트 완충제(5 mM 3X1000 ㎕) 중의 NADH의 5 mM 용액으로 용출한다. 각 용출 세척 동안 피브릴을 15분 동안 회전시킨다. 용출제내 LDH 활성을 피루베이트의 환원동안 340 nm에서의 흡광도 변화를 측정함으로써 분석한다. 분석 혼합물은 나트륨 포스페이트 완충제(980 ㎕) 중의 0.1% PEG(1000), 피루베이트(3.3 ㎕, 100 mM 원액), 및 각각의 용출 분획(16.7 ㎕)을 함유한다. 효소 반응은 하기와 같이 예시된다.
LDH
피루베이트 + NADH ----→ 락테이트 디하이드로게나제 + NAD+
결과는 NAD+ 부동화 피브릴 상의 LDH의 용량이 피브릴 g당 484 nmol이고 평이한 피브릴 상의 LDH의 용량이 피브릴 g당 3.68 nmol임을 나타낸다. LDH의 비특이 결합은 5.6%이다.
4. 단백질 합성을 위한 고체 지지체로서 작용화된 나노튜브
실시예 48
펩타이드 합성을 위한 고체 지지체로서 작용화된 피브릴의 사용
메틸렌 클로라이드(20 ㎖) 중의 아미노 피브릴(400 mg)과 4-(하이드록시메틸)-페녹시아세트산 현탁액(255 mg, 1.4 mmol)의 혼합물에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC, 268 mg, 1.40 mmol)와 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT, 189 mg, 1.4 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 아르곤 대기하에서 실온에서 밤새 교반한다. 산물 피브릴을 메틸렌 클로라이드, 메탄올 및 물로 세척한 다음, 피브릴을 수득하기 위해서 진공하에서 건조한다. N,N-디메틸포름아미드(DMF, 2 ㎖) 중의 피브릴 현탁액 및 메틸렌 클로라이드(8 ㎖)에 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-O-부틸-L-세린(215 mg, 0.56 mmol), 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC, 115 mg, 0.56 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 3.4 mg, 0.028 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 산물 피브릴을 DMF(5 X 40 ㎖, 각 회당 1분 침지) 중의 20% 피페리딘으로 처리한다. 이어서 산물 피브릴을 DMF, 물, 나트륨 하이드록사이드(1N), 메탄올 및 메틸렌 클로라이드로 세척한다. 산물 Fib-Handle-Ser(0+)-COOH(닌히드린 시험은 양성)을 진공하에서 건조한다. 디펩타이드 함성을 위해서, 동일한 절차를 아르기닌을 첨가하기 위해서 수행한다. Fib-Handle-Ser(0+)-Arg(Nε-2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐)의 아미노산 분석 데이터는 이것이 피브릴 g당 6.5 μmol 세린과 피브릴 g당 7.6 μmol 아르기닌을 함유함을 나타낸다. 일부 다른 펩타이드를 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
5. 바이오티닐화 피브릴 및 바이오티닐화 알킬 피브릴
피브릴 표면이 바이오티닐화에 의해서 또는 알킬화와 바이오티닐화에 의해서 작용화될 수 있음이 밝혀졌다. 이어서 이러한 개질을 함유하는 피브릴은 스트렙타비딘 비드 및 스트렙타비딘 효소와 같은 스트렙타비딘 접합 물질을 결합시킬 수 있다.
피브릴은 이의 높은 표면적으로 인하여 고체 담체로서 대단한 장점을 제공한다. 강한 자성일 수 있는 비드가 분리 분석에 매우 유용하다. 본원에 기재된 바이오티닐화 피브릴은 피브릴 및 비드의 장점을 겸비한다. 바이오티닐화 알킬 피브릴은 동일한 개념의 확장이지만 알킬 피브릴의 추가의 단백질 흡착성을 나타낸다.
스트렙타비딘- 및 바이오틴-코팅 피브릴을 진단에 사용할 수 있고 전기화학 발광 분석과 같은 분석을 위한 포획제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 신규 특성은 이작용성 피브릴을 생성하기 위한 한 피브릴 상의 두 고체 담체의 조합이다. 또한, 기재된 과정은 비드를 위한 표면적을 증가시키고 피브릴 자화를 중대시킨다.
실시예 49
바이오티닐화 피브릴의 제조
바이오티닐화 피브릴을 pH 8.15에서 0.2 M NaHCO3 중의 실시예 16에 기재된 바와 같이 제조된 아미노 피브릴 2.4 mg과 NHS 에스테르 장쇄 바이오틴 9 mg을 혼합함으로써 제조한다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 회전시키고 동일한 완충제로 2회 세척한다.
실시예 50
바이오티닐화 알킬 피브릴의 제조
바이오티닐화 알킬 피브릴을 2 단계 반응에 의해서 제조한다. 먼저, 이작용성 피브릴(아미노와 카복실 모두를 함유) 4.25 mg과 NHS 에스테르 장쇄 바이오틴 25 mg을 혼합한다. 피브릴을 세척하고 진공하에서 건조한다.
두번째 반응을 DMF 0.5 ㎖ 중에서 EDC (1-에틸-3-3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) 11 mg을 갖는 바이오티닐화 이작용성 피브릴 4 mg, DMAP(4-디메틸아미노피리딘) 7.5 mg 및 NH2(CH2)7CH3 10 ㎕를 혼합함으로써 수행한다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 최종 바이오티닐화 알킬 피브릴을 CH2Cl2, MeOH 및 dH2O에 의해서 세척한다.
실시예 51
분석시 고체 지지체로서 바이오티닐화 피브릴
바이오티닐화 피브릴을 스트렙타비딘-바이오틴 또는 아비딘-바이오틴 상호작용을 요하는 포맷을 수반하는 분석에 사용할 수 있다. 바이오티닐화 피브릴을 예를 들면, 스트렙타비딘으로 추가로 유도할 수 있다. 피브릴에 공유결합된 바이오틴(실시예 50 참조)은 스트렙타비딘과 강한 비-공유결합 상호작용을 형성할 수 있다. 스트렙타비딘이 4 당량 결합 부위를 갖는 삼량체 단백질이므로, 바이오티닐화 피브릴에 결합된 스트렙타비딘은 거의 확실히 추가의 바이오티닐화 제제가 결합할 수 있는 비점유 결합 부위를 지닐 것이다. 따라서, 바이오티닐화 피브릴은 스트렙타비딘-코팅 피브릴로 전환될 것이다.
이러한 피브릴-바이오틴-스트렙타비딘(FBS) 지지체로 수행할 수 있는 다수의 분석 시험이 있다. 예를 들면, 바이오티닐화 항-분석물 항체는 FBS 지지체 상에 포획될 수 있다(항체가 분석물로 복합되기 전후에). 바이오티닐화 항-분석물 항체를 사용하는 분석이 잘 설정된다. 이러한 분석은 해당 분석물이 항-분석물 항체에 결합하기 위해 표지된 분석물과 경쟁하는 경쟁 분석을 포함한다. 유리(비결합) 분석물 및 유리(비결합) 표지 분석물은 피브릴 부동화 항체로부터 세척될 수 있다. 세척 단계는 원심분리, 여과의 통상적인 실행에 의해서, 또는 자석에의 인력에 의해서 용액 상으로부터 물리적으로 분리되는 피브릴에 달려 있다.
경쟁 분석 외에도 샌드위치 유형 면역분석을 FBS 지지체 상에서 수행 할 수 있다. 샌드위치 면역분석은 진단 분야에 익히 공지되어 있다. 이 분석은 두 항체; 예를 들면, 바이오틴으로 표지됨으로써 고체 표면상에 포획되는 첫번째 "1차" 항체와 고체 표면에 의해 포획되지 않지만 리포터 그룹으로 표지되는 "2차" 항체에 의해서 동시에 결합되는 분석물을 포함한다. 이러한 샌드위치 분석은 고체 포획 지지체로서 피브릴을 사용하여 수행되고, 이렵게하여 피브릴은 전 단락에 기재된 바와 같이 포획된다. 따라서, 이러한 분석에서, 피브릴은 이것에 바이오틴을 공유결합시키고, 스트렙타비딘에 결합되고, 차례로 바이오티닐화 1차 항체에 결합되고, 분석물(존재시)에 결합되고, 표지된 2차 항체에 결합된다.
유사하게는, DNA 탐침 분석을 FBS 지지체를 사용하여 수행할 수 있다. 바이오티닐화 일본쇄 DNA가 FBS 지지체에 결합될 수 있고 경쟁성 하이브리드화가 상보적인 일본쇄 분석물 DNA 분자와 상보적인 표지 올리고뉴클레오타이드 사이에서 발생할 수 있다.
다른 유형의 바이오티닐화 피브릴, 바이오티닐화 아릴화 피브릴을 면역분석 및 DNA 탐침 분석에 사용할 수 있다. 실시예 51에 기재된 바와 같이, 이작용성 피브릴을 바이오틴의 한 유형의 작용성 그룹으로의 공유 부착 및 알킬쇄의 다른 유형의 작용성 그룹으로의 공유 부착에 의해서 개질시킬 수 있다. 생성된 알킬화, 바이오티닐화 피브릴을 스트렙타비딘 또는 아비딘과의 특이 결합에(바이오틴에 의해서), 또한 단백질의 흡착을 위해서(알킬쇄에 의해서) 사용할 수 있다.
알킬 피브릴을 스트렙타비딘-코팅 마그네틱 비드와 같은 기타 고체 지지체와 접합하여 사용할 수 있다. 이러한 비드에 대한 피브릴의 하나의 장점은 이들이 훨씬 더 높은 표면적(단위 중량당)을 갖는다는 점이다. 따라서, 피브릴이 마그네틱 비드의 외부 표면에 부착될 수 있는 경우, 이는 표면적, 이에 따라 비드의 결합능을 현저히 증가시킨다. 알킬화, 바이오티닐화 피브릴을 높은 친화성 스트렙타비딘(비드)-바이오틴(피브릴) 상호작용과 이에 따라 매우 높은 표면적을 갖는 피브릴-코팅 비드를 생성하는 스트렙타비딘-코팅 비드와 혼합할 수 있음이 추측된다. 알킬 피브릴은 흡착에 의해 단백질을 결합시킬 수 있으므로, 피브릴-코팅 비드를 스트렙타비딘과 항체를 포함하는 흡수 단백질로 추가로 유도할 수 있다. 상술된 바와 같이, 스트렙타비딘 또는 항체 코팅 피브릴을 면역분석 및 DNA 탐침 분석에 사용할 수 있다. 따라서, 피브릴-코팅 비드는 더 적은 비드가 동일한 결과를 제공하는 데에 해당 분석에 요구되도록 이의 표면적을 현저히 증가시킴으로써 비드의 성질을 개선할 수 있다.
6. 3-차원 구조
산화된 피브릴은 비산화 피브릴보다 좀더 쉽게 수성 매질에 분산된다. 메조- 및 마크로포어(포어 > 2 nm)를 갖는 안정한 다공성 3-차원 구조가 촉매 또는 크로마토그래피 지지체로서 매우 유용하다. 피브릴이 개별화된 기준으로 분산될 수 있으므로, 가교-결합에 의해서 안정화된 잘 분산된 샘플은 이러한 지지체를 구성하도록 한다. 작용화된 피브릴은 이들이 수성 또는 극성 매질에 쉽게 분산되고 작용성이 가교결합점을 제공함으로 이러한 적용에 이상적이다. 또한, 작용성은 촉매 또는 크로마토그래피 부위를 지지하는 지점을 제공한다. 최종 결과는 활성제를 지지하는 적용성 부위와 접근하기 쉬운 총 표면적을 갖는 경질, 3-차원 구조이다.
촉매작용에서 이 지지체에 대한 전형적인 적용은 액침, 예를 들면, 귀금속 수소화 촉매에 의해 제공된 금속 촉매를 위한 매우 다공성 지지체로서의 용도를 포함한다. 또한, 구조의 매우 높은 다공성과 조합된 작용성에 의해서 지지하기 위한 속박에 의한 분자 촉매 부동화능은 이질적 방법으로 균질 반응을 수행하게 한다. 속박된 분자 촉매는 본질적으로 균질 반응과 함께 진행하는 선택도 및 속도에 있어서의 장점을 사용할 수 있는 균질 반응기에 유사한 연속 액상에 매달려 있다. 그러나, 고체 지지체에 속박됨은 활성, 다수의 경우에 매우 고가의 촉매의 쉬운 분리 및 회수를 허용한다.
이 안정한 경질 구조는 또한 적합한 에난티오머 촉매 또는 선택적 기질을 지지체에 부착시킴으로써 비대칭 합성 또는 친화성 크로마토그래피과 같은 매우 어려운 반응을 수행하도록 한다. 메탈로-Pc 또는 메탈로-포피린 착물을 통한 유도화는 또한 금속 이온에 결합된 리간드 및 또한 2차 유도체를 통하여 리간드에 결합된 분자의 복구를 허용한다. 예를 들면, 작용화된 피브릴의 3-차원 구조가 전극 또는 전극의 일부이고 작용화가 Co(II)Pc의 흡착으로부터 유발된 경우에, 니코틴산 존재시 Co(II)의 Co(III)로의 전기 화학적 산화는 펜던트 그룹으로서 카복실산을 갖는 비-불안정 Co(III)-피리딜 착물을 생성할 것이다. 적합한 항원, 항체, 촉매 항체 또는 기타 부위-특이적 트래핑제를 부착함은 이와 달리 매우 달성하기 어려운 분자의 선택적 분리(친화성 크로마토그래피)를 허용할 것이다. 흡장된 물질을 제거하기 위해서 전극을 세척한 후, 표적 분자를 함유하는 Co(III) 착물을 불안정한 Co(III) 착물을 회수하기 위해서 전기화학적으로 환원할 수 있다. 이어서 표적 분자를 함유하는 Co(II) 상의 리간드를 불안정 Co(II) 리간드의 질량 작용 치환에 의해서 회수하고 이렇게하여 이와 달리 수행하기에 매우 어렵고 고가인 분자(예를 들면, 키랄 약물)의 분리 및 회수를 실행할 수 있다.
이전에, 작용화된 탄소 피브릴 매트내의 세공은 현저한 유동을 허용하기에 너무 작고 따라서 전극을 통한 유동으로서 유용하지 않다고 여겨졌다. 또한 전극 물질로서 입상 탄소 또는 기타 탄소 기제 물질(예를 들면, 망상화 유리질 탄소(RVC))의 사용과 연관된 문제가 존재한다. 예를 들면, 다공성 전극 물질은 그 자체로 형성되고 매우 조밀하게 패킹되며 공간 또는 채널을 형성할 수 없고, 용매 및 유동 조건의 변화 동안 크기 불안정성으로 되며, 매우 얇은 전극을 형성할 수 없다. 유동 셀 내의 전극으로서 작용화된 탄소 피브릴의 사용은 이러한 문제를 해결한다.
유동 셀 내의 전극으로서 사용되는 작용화 탄소 피브릴을 전극활성제로의 표면 처리에 의해서 개질할 수 있다. 피브릴을 또한 촉매 또는 전기촉매 작용을 제공하거나 원하지 않는 반응 또는 유동 스트림으로부터 물질의 흡착을 억제하도록 할 수 있는 비-전기활성 물질로 전환할 수 있다.
전극을 통한 이러한 유동은 전기크로마토그래피, 전기화학적으로 변조된 친화성 크로마토그래피, 전기합성 또는 전기화학적으로 변조된 이온 교환 크로마토그래피와 같은 분리 기술에 유용하다. 이들을 또한 탄소 피브릴 매트 상에 트래핑된 물질을 분리하고/하거나 분석하는 진단 장치에 사용할 수 있다.
작용화된 탄소 피브릴 및 기타 섬유 또는 입상으로 이루어진 복합재를 또한 사용할 수 있다. 이러한 섬유 또는 입상을 탄소 피브릴 매트의 최종 다공성 또는 전도성을 변경하기 위해서 현탁액에 첨가할 수 있다.
실시예 52
유동 셀 내의 전극으로서 철 프탈로사이아닌 작용화된 피브릴의 사용
흑연 피브릴을 철(III)프탈로사이아닌-비스-피리딘(FePc-2Py) (Aldrich 41,016-0)을 흡착시킴으로써 개질한다. 피브릴 0.403 g과 FePc-2Py 0.130 g을 순수한 EtOH 150 ㎖에 첨가하고 5분 동안 450 와트 브랜슨(Branson) 탐침 초음파처리기로 초음파처리한다. 생성된 슬러리를 47 mm Millipore 막 진공 필터 매니폴드에서 0.45 ㎛ MSI 나일론 필터로 여과하고, 물로 세정하고 진공 오븐에서 35℃에서 밤새 건조한다. 최종 중량은 0.528 g이고 실질적인 흡착을 나타낸다. 여과물의 분광광도계 분석은 잔류 FeP-2Py를 설명한다.
FePc-2Py 개질 피브릴 5 mg을 초음파처리하면서 탈이온수 10 ㎖에 분산시킨다. 분산액을 25 mm 막 필터 매니폴드에 부동화된 200 메쉬 스테인레스 강(SS) 편직 스크린에 침착시키고 실온에서 건조하도록 한다. SS 스크린의 0.5 인치 직경 디스크 지지 피브릴 매트를 아치 펀치를 사용하여 절단한다.
전기화학 운동 셀을 금 메쉬 (400 메쉬, Ladd Industries)의 13 mm 직경 디스크를 막 지지체의 상단에 배치하고 3개의 전극 일정전위기 회로의 작동 전극으로서 외부 연결을 위해 필터 홀더의 벽을 통하여 공급되는 Teflon 열 수축관으로 절연된 백금 와이어와의 전기 접촉을 스크린에 제공함으로써 13 mm 플라스틱 스위니(Swinney) 유형 막 필터 홀더로부터 제작한다. 금 메쉬를 외부 엣지 주위에 최소량의 에폭시로 적절히 부동화한다. 금박의 스트립을 환으로 성형하고 필터 홀더의 하단, 하류 섹션에 배치하고 3개의 전극 일정전위기 회로의 카운터 전극으로서 연결을 위해 절연된 Pt 와이어 납으로 연결한다. 1 M HCl에서 전기화학적으로 산화된 0.5 mm 직경의 은 와이어의 환을 기준 전극으로서 연결을 위해 절연된 납으로 필터 홀더의 상단부에 배치한다.
FePc-2Py 개질 CN의 0.5 인치 직경 디스크를 유동 셀에 배치한 다음, EG & G PAR 273 일정전위기의 적당한 납에 연결시킨다. 유동 셀을 pH 7.0의 0.1 M 칼륨 포스페이트 완충제 중의 0.1 M KCl로 충진된 세이지(Sage) 주사기 펌프로 연결한다. 사이클릭 볼타모그램(CV)를 20 mv/초의 전위 스캔율에서 비유동(정지) 및 유동(0.4 ㎖/분) 하에서 기록한다. CV는 유동시 및 비유동시에 거의 동일하고 표면 한정된 FePc-2Py와 일치하는 두 영구적, 가역적 산화 및 환원을 나타낸다. 유체 유동 조건하에서 산화환원 피크의 영구성은 FePc-2Py가 탄소 피브릴에 강하게 결합되고 철 프탈로사이아닌 개질 피브릴의 사용이 전극 물질을 통한 유동으로서 잘 작용함을 설명한다.
3-차원 구조의 다른 예는 피브릴-세라믹 복합재이다.
실시예 53
알루미나-피브릴 복합재(185-02-01)의 제조
질산 산화 피브릴 (185-01-02) 1 g을 U/S 분해기를 사용하여 100 cc 탈이온수에 잘 분산시킨다. 피브릴 슬러리를 90℃로 가열하고 20 cc 프로판에 용해된 0.04 mol 알루미늄 트리부톡사이드 용액을 서서히 첨가한다. 알콜을 도출하기 위해서 응축기를 제거한 후, 환류를 4시간 동안 계속한다. 30분 후 응축기를 다시 놓고 슬러리를 100℃에서 밤새 환류시킨다. 균일한 외양의 흑색 졸이 수득된다.
졸을 실온으로 냉각하고 1주일 후, 매끄러운 표면을 갖는 흑색 겔을 형성한다. 겔을 300℃, 공기 중에서 12시간 동안 가열한다.
알루미나-피브릴 복합재를 SEM에 의해서 검사한다. 균열 표면의 현미경 사진은 겔내 피브릴의 균질 분산을 나타낸다.
실시예 54
실리카-피브릴 복합재(173-85-03)의 제조
질산 산화 피브릴 (173-85-03) 2 g을 초음파처리기를 사용하여 200 cc 에탄올에 잘 분산시킨다. 50 cc 에탄올에 용해된 0.1 mol 테트라에톡시실란 용액을 실온에서 슬러리에 서서히 첨가한 다음 3 cc 농도 HCl을 첨가한다. 혼합물을 85 ℃로 가열하고 용적이 100 cc로 감소할 때까지 그 온도를 유지한다. 혼합물을 냉각하고 흑색 고체 겔을 형성할 때까지 저장한다. 겔을 300℃ 공기 중에서 가열한다.
실리카-피브릴 복합재를 SEM에 의해서 검사한다. 균열 표면의 마이크로그래프는 겔내 피브릴의 균질 분산을 나타낸다.
지르코니아, 티타니아, 희토류 옥사이드 및 3급 옥사이드와 같은 기타 세라믹으로의 유사 제조물이 제조될 수 있다.
7. 흑연 나노튜브의 중합체 비드로의 혼입
Dynal 등에 의해서 제조된 바와 같은 중합체 비드, 특히 Fe3O4코어를 함유하는 마그네틱 중합체 비드는 진단에 다수의 용도를 지닌다. 그러나, 이러한 비드는 나노튜브로부터 입수되는 것들에 비해 낮은 표면적을 지님으로부터 난점을 지닌다. 작용화된 피브릴을 비드의 표면으로 혼입할 수 있고 이는 중합체/피브릴 복합재를 분리 및 분석 적용(예를 들면, 전기화학발광 분석, 효소 부동화화)을 위한 고체 지지체로서 사용되도록 한다.
실시예 55
작용화된 피브릴의 작용화된 비드로의 부착
마그네틱 토실-활성화 Dynabeads M-450(30 mg/㎖) 비드(노르웨이 오슬로의 Dynal)를 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충제(pH 7.5)로 3회 세척한다. 이어서 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충제(pH 8.4) 0.9 ㎖를 비드에 첨가하고 아민 피브릴 0.1 ㎖를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 16 내지 24시간 동안 회전시키도록 한다.
현미경 하에서 볼때, 피브릴 표면상에 비드를 갖는 피브릴의 클럼프가 분명하다.
상기의 기재 및 실시예에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 매우 다양한 작용화된 나노튜브의 제형 및 이의 용도에 있어서의 적용을 지닌다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 기재의 의미로서 사용되는 것이고, 일부로서 예시되고 기재된 동량의 특성을 제외한 용어 또는 표현을 사용할 의도는 없으며, 다양한 변형은 본 발명의 범주내에서 가능한 것으로 인식된다.

Claims (40)

  1. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  2. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 피브릴의 표면탄소이고, 피브릴 상의 흑연층의 돌기는 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장되며,
    n은 정수이고,
    L은 0.1n 이하의 수이며,
    m은 0.5n 이하의 수이고,
    각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  3. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 피쉬본 피브릴의 표면 원자이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  4. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R은 동일하거나 상이하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    단, 각각의 R이 산소-함유 그룹일 경우, COOH는 존재하지 않는다.
  5. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 피브릴의 표면탄소이고, 피브릴 상의 흑연층의 돌기는 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장되며,
    n은 정수이고,
    L은 0.1n 이하의 수이며,
    m은 0.5n 이하의 수이고,
    각각의 R은 동일하거나 상이하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    단, 각각의 R이 산소-함유 그룹일 경우, COOH는 존재하지 않는다.
  6. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 피쉬본 피브릴의 표면원자이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R은 동일하거나 상이하고 SO3H, COOH, NH2, OH, R'CHOH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    단, 각각의 R이 산소-함유 그룹일 경우, COOH는 존재하지 않는다.
  7. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.1μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  8. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 피브릴의 표면탄소이고, 피브릴 상의 흑연층의 돌기는 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장되며,
    n은 정수이고,
    L은 0.1n 이하의 수이며,
    m은 0.5n 이하의 수이고,
    각각의 A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'x, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R'및 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  9. 제 8 항에 있어서,
    R'이 H이며,
    Y가 라이신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 조성물.
  10. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 피쉬본 피브릴의 표면원자이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R'및 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  11. 제 10 항에 있어서,
    R'이 H이며,
    Y가 라이신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 조성물.
  12. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][R'-A]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R'및 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  13. 제 12 항에 있어서,
    R'이 H이며,
    Y가 라이신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 조성물.
  14. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][R'-A]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 피브릴의 표면탄소이고, 피브릴 상의 흑연층의 돌기는 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장되며,
    n은 정수이고,
    L은 0.1n 이하의 수이며,
    m은 0.5n 이하의 수이고,
    각각의 R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이며,
    A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 효소, 아미노산, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R'및 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  15. 제 14 항에 있어서,
    R'이 H이며,
    Y가 라이신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 조성물.
  16. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][R'-A]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 피쉬본 피브릴의 표면원자이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  17. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][X'-Aa]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    a는 10 이하의 정수이고,
    각각의 A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    X'은 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  18. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][X'-Aa]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 피브릴의 표면탄소이고, 피브릴 상의 흑연층의 돌기는 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장되며,
    n은 정수이고,
    L은 0.1n 이하의 수이며,
    m은 0.5n 이하의 수이고,
    a는 10 이하의 정수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    X'은 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  19. 하기 화학식 물질의 조성물.
    화학식
    [CnHL][X'-Aa]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 피쉬본 피브릴의 표면원자이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    a는 10 이하의 정수이고,
    각각은 A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N+(R')3X-, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    X'은 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이며,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이고,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  20. 유리 라디칼 개시제의 존재하, 화학식 [CnHL][CH(R')OH]m의 작용화된 나노튜브를 형성시키기에 충분한 조건하에서, 표면 탄소를 화학식 R'CH2OH의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL][CH(R')OH]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴, 또는 폴리(알킬에테르)이다.
  21. (a) 화학식 [CnHL]Rm(여기에서, 각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 치환된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 표면탄소를 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계; 및
    (b) 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을, 화학식[CnHL]Am의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에서 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-NR'2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  22. (a) 화학식 [CnHL]Rm(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 치환된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 표면탄소를 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계; 및
    (b) 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을, 화학식[CnHL]Am의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에서, 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.1μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  23. (a) 화학식 [CnHL]Rm(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 치환된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 표면탄소를 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계; 및
    (b) 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을, 화학식[CnHL]Am의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에서 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  24. 화학식 [CnHL]Am(여기에서, 각각의 R은 동일하고, SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  25. 화학식 [CnHL]Am(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 탄소원자, Cn은 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.1μ 이하인 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R", R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  26. 화학식 [CnHL]Am(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 치환된 나노튜브 [CnHL]Rm을 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Am
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 열분해 침착된 탄소를 함유하지 않는 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-N(R')2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-N+(R')3X-, R'-R", R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  27. 화학식 [CnHL][R'-A]m(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 화학식 [CnHL][R'-R]m의 치환된 나노튜브를 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL][R'-A]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬, 사이클로아릴 또는 폴리(알킬에테르)이고,
    X는 할라이드이며,
    각각의 A는 중에서 선택되고,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-NH2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-R", R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  28. 화학식 [CnHL][X'-Ra]m의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 적어도 하나의 마크로사이클릭 화합물을 흑연 나노튜브의 표면상에 흡착시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL][X'-Ra]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    a는 0 또는 10 이하의 정수이고,
    각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
    y는 3 이하의 정수이고,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    X는 할라이드이고,
    X'는 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  29. (a) 화학식 [CnHL][X'-Ra]m(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 치환된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 적어도 하나의 마크로사이클릭 화합물을 흑연 나노튜브의 표면상에 흡착시키는 단계; 및
    (b) 치환된 나노튜브 [CnHL][X'-Ra]m을, 화학식[CnHL][X'-Aa]m의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에서 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL][X'-Aa]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    a는 10 이하의 정수이고,
    각각의 A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-NH2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-R", R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되고,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    X'는 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  30. 화학식 [CnHL][X'-Aa]m(여기에서, 각각의 R은 SO3H, COOH, NH2, OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며, y는 3 이하의 정수이다)의 작용화된 나노튜브를 형성하기에 충분한 조건하에, 치환된 나노튜브 [CnHL][X'-Ra]m를 적어도 하나의 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL][X'-Aa]m
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    a는 10 이하의 정수이고,
    각각의 A는 중에서 선택되며,
    Y는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 항체, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 작용그룹이거나, R'-OH, R'-NH2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'-R", R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R', R' 및 중에서 선택되고,
    R'은 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이고,
    X는 할라이드이며,
    X'는 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이며,
    w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
  31. 기질로서 나노튜브를 수용할 수 있고 반응을 수행하기 위해 적어도 하나의 효소를 허용할 수 있는 조건하에 수성 현탁액 중 화학식 [CnHL]Rm 물질의 조성물을 생성하는 화학반응을 수행할 수 있는 적어도 하나의 효소와 표면탄소를 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 물질의 조성물 형성방법.
    화학식
    [CnHL]Rm
    상기 식에서,
    탄소원자, Cn은 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이고,
    n은 정수이며,
    L은 0.1n 이하의 수이고,
    m은 0.5n 이하의 수이며,
    각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, CH(R')OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si(OR')yR'3-y, Si(O-SiR'2)OR', R", Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되고,
    y는 3 이하의 정수이며,
    R'은 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 아랄킬 또는 사이클로아릴이고,
    R"은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬 또는 플루오로아랄킬이며,
    X는 할라이드이고,
    Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
  32. 작용그룹을 탄소 나노튜브의 표면상으로 균일하게 치환시킬 수 있는 유효량의 반응물과 탄소 나노튜브를 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄소 나노튜브의 표면을 작용그룹으로 균일하게 치환시키는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 반응물이 프탈로사이아닌인 방법.
  34. 작용그룹을 탄소 나노튜브의 표면상으로 치환시키기 위한 유효량의 반응물과 탄소 나노튜브를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 표면-개질된 탄소 나노튜브.
  35. 제 34 항에 있어서, 반응물이 프탈로사이아닌인 표면-개질된 탄소 나노튜브.
  36. N-하이드록시석시나밀 에스테르(N-hydroxysuccinamyl ester, NHS ester)와 단백질의 아민 그룹간의 공유결합을 형성시키기에 충분한 조건하에서, NHS 에스테르 그룹을 갖는 나노튜브를 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 단백질을 나노튜브에 결합시키는 방법.
  37. 작용화된 나노튜브를 포함하는 전극.
  38. 제 37 항에 있어서, 전극이 다공질 병류유동 전극인 전극.
  39. 제 38 항에 있어서, 작용화된 나노튜브가 프탈로사이아닌 치환된 나노튜브인 전극.
  40. 다수의 작용화된 나노튜브 네트워크를 포함하고, 작용화된 나노튜브 네트워크가 적어도 하나의 링커 잔기에 의해 작용그룹에 결합된 적어도 2 개의 작용성 피브릴을 포함하며, 링커잔기가 이작용성 또는 다작용성인 다공질 물질.
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