CN113637803A - 检测h5n8亚型禽流感病毒及其pb2-e627k突变的引物和探针及检测方法 - Google Patents

检测h5n8亚型禽流感病毒及其pb2-e627k突变的引物和探针及检测方法 Download PDF

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郭振东
张春茂
夏咸柱
高玉伟
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Abstract

本发明涉及一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2‑E627K突变的引物和探针及检测方法。所述引物和探针包括H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针，以及H5N8禽流感病毒PB2基因E627K突变检测引物和探针。使用本发明提供的特异性引物和探针，可以判断H5N8禽流感病毒PB2基因627位基因是否发生E‑K突变，对H5N8禽流感病毒致病性和传播风险进行预判，对于H5N8禽流感病毒防控具有重要意义。

Description

检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2-E627K突变的引物和探针 及检测方法
技术领域
本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2-E627K突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
H5亚型禽流感病毒严重威胁着家禽养殖业和人类健康。2021年之前H5N8禽流感病毒只在野鸟和家禽中流行和传播，2021年2月俄罗斯向世界卫生组织报告世界首例人感染H5N8禽流感病例，H5N8禽流感病毒对人类健康威胁进一步加大。
禽流感病毒的致病性和跨种传播与病毒的重组和变异密切相关，研究表明禽流感病毒PB2基因E627K突变可以影响病毒的致病性和跨种传播，PB2-E627K突变被认为是禽流感病毒的致病性增强和跨种传播的分子标记。因此检测H5N8禽流感病毒PB2-E627K突变，对于评估H5N8禽流感病毒致病性和跨种传播风险具有重大意义，但目前尚未有相关检测试剂报道。
本发明提供的引物和探针能够对H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变进行检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2-E627K突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。
第一方面，本发明提供一种检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针包括：
H5N8禽流感病毒HA基因(he5aggluti5i5，血凝素基因)检测引物和探针：
HA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1：5’-cgaattcatcagagtgccgg-3’
HA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5’-tccctggtatggacaagctg-3’
HA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3：5’-FAM-tccctggtatggacaagctg-BHQ1-3’
H5N8禽流感病毒NA基因(Neura5i5idase，神经氨酸酶基因)检测引物和探针：
NA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4：5’-tccctggtatggacaagctg-3’
NA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5:5’-aacccgaaaccttttacgcc-3’
NA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6:5’-ROX-aacccgaaaccttttacgcc-BHQ2-3’
H5N8禽流感病毒PB2基因E627K突变检测引物和探针：
PB2-627E正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7：5’-atttgcagcagccccatcag-3’
PB2-627K正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8：5’-atttgcagcagcccccctga-3’
PB2基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9:5’-agactccactcctgctgttc-3’
PB2基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10:5’-CY5-ggcgccttgacagaatatcc-BHQ3-3’。
第二方面，本发明提供上述检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针在制备检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针。
按上述方案，所述试剂盒包括独立包装的PCR反应A1液、PCR反应A2液，以及PCR反应B液；
所述PCR反应A1液包括用于检测H5N8 PB2-627E禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2-627E正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
所述PCR反应A2液包括用于检测H5N8 PB2-627K禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2-627K正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。
进一步的，所述PCR反应A1液、PCR反应A2液还包括dNTP Mixture和PCR buffer。
进一步地，所述试剂盒还包括：
阳性对照，阳性对照含有H5N8禽流感病毒HA基因、NA基因、PB2-627E和PB2-627K基因的扩增序列质粒的混合液；
阴性对照：RNase Free Water。
本发明的第四方面提供上述检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变病毒中的应用。
本发明的第五方面提供一种H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的荧光PCR检测方法，所述方法包括如下的步骤：
以所提取待检测样本的RNA为模板，配置扩增反应体系并进行荧光PCR扩增，每管PCR扩增同时检测FAM、ROX和CY5荧光信号，即同时检测H5N8禽流感病毒的HA基因、NA基因和PB2基因，实时记录所述PCR扩增过程中的Ct值和PCR扩增曲线，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断；
所述待检测样包括人或禽类鼻咽拭子、组织或者粪便拭子；
所述扩增反应体系包括上述检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针。
进一步地，所述扩增反应体系包括：模板、PCR反应B液、PCR反应A1液或PCR反应A2液或阴性对照或阳性对照；所述荧光PCR扩增程序为：50℃305i5；95℃55i5；94℃5sec、55℃45sec，45个循环；25℃10sec。
上述FAM为H5N8禽流感病毒HA基因扩增信号，ROX为H5N8禽流感病毒NA基因扩增信号，CY5为PB2基因扩增信号。
进一步地，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断的原则为：
阴性对照：FAM、ROX和CY5检测通道无扩增曲线；
阳性对照：FAM、ROX和CY5检测通道有扩增曲线，且CT值≤35；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行；
当FAM和ROX荧光通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒阳性；
当FAM和ROX荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为H5N8禽流感病毒阳性，否则判断样品为H5N8禽流感病毒阴性；
当判断检测样品为H5N8阳性时且样品检测通道加入的为PCR反应A1液时，如果CY5荧光通道中有扩增曲线时，且CY5通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627E；如果CY5荧光通道中无扩增曲线时，判断样品H5N8禽流感病毒PB2基因627位不是E；
当判断检测样品为H5N8阳性时且样品检测通道加入的为PCR反应A2液时，如果CY5荧光通道中有扩增曲线时，且CY5通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627K；如果CY5荧光通道中无扩增曲线时，判断样品H5N8禽流感病毒PB2基因627位不是K。
本发明的有益效果在于：
1、本发明可用于人或动物H5N8禽流感病毒进行检测，对于监测H5N8的流行风险具有重要意义；
2、使用本发明提供的特异性引物和探针，可以判断H5N8禽流感病毒PB2基因627位基因是否发生E-K突变，对H5N8禽流感病毒致病性和传播风险进行预判，对于H5N8禽流感病毒防控具有重要意义；
3、本发明提供的特异性引物及每个探针所用的荧光报告基团不一样，互不干扰，不会影响彼此的检测，检测准确率高；
4、本发明将引物对集、探针组、dNTP Mixture和PCR buffer放于PCR反应A1液或A2液，将热启动DNA聚合酶、逆转录酶、和RNA酶抑制剂放于PCR反应B液，降低了配置PCR反应体系过程中多次加样可能造成污染的风险；
5、本发明采用的是O5e Step RT-PCR反应，将RNA的反转录和荧光PCR反应置于同一个反应容器内进行，与先反转录RNA再转移到另外容器进行荧光PCR相比，污染的风险进一步降低。
附图说明
图1为本发明实施例2中阳性对照1、阳性对照2和阴性对照的扩增曲线；
图2为实施例2中H5N8禽流感病毒标本以及其它流感病毒检测曲线；
图3为实施例2中样品H5N8(PB2-627E)禽流感病毒利用PCR反应A1液和PCR反应B液检测曲线，以及样品H5N8(PB2-627K)禽流感病毒利用PCR反应A2液和PCR反应B液检测曲线；
图4为实施例2中样品H5N8(PB2-627E)禽流感病毒利用PCR反应A2液和PCR反应B液检测曲线，以及样品H5N8(PB2-627K)禽流感病毒利用PCR反应A1液和PCR反应B液检测曲线。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种H5N8禽流感病毒PB2-E627K突变检测试剂盒，试剂盒由独立包装的PCR扩增试剂和对照试剂组成，各试剂主要组成成分见表1：
表1
Figure BDA0003256445820000051
其中，PCR反应A1液、PCR反应A2液和PCR反应B液各组分含量见表2-4：
表2 PCR反应A1液各组分含量
Figure BDA0003256445820000052
Figure BDA0003256445820000061
表3 PCR反应A2液各组分含量
Figure BDA0003256445820000062
表4 PCR反应B液各组分含量
Figure BDA0003256445820000071
上述H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的试剂盒，其中用于检测HA基因的引物序列为：
正向引物SEQ ID NO.1：5’-cgaattcatcagagtgccgg-3’和反向引物SEQ ID NO.2:5’-tccctggtatggacaagctg-3’，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3:5’-FAM-gttacccagggagcctcaat-BHQ1-3’。
用于检测NA基因的引物序列为：
正向引物SEQ ID NO.4：5’-tccctggtatggacaagctg-3’和反向引物SEQ ID NO.5:5’-aacccgaaaccttttacgcc-3’，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6:5’-ROX-aacccgaaaccttttacgcc-BHQ2-3’。
用于检测PB2基因E627K突变的引物序列为：
PB2-627E正向引物SEQ ID NO.7：5’-atttgcagcagccccatcag-3’,PB2-627K正向引物SEQ ID NO.8：5’-atttgcagcagcccccctga-3’,和反向引物SEQ ID NO.9:5’-agactccactcctgctgttc-3’，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.10:5’-CY5-ggcgccttgacagaatatcc-BHQ3-3’。
检测H5N8禽流感病毒HA基因片段的核酸序列如下：
cgaattcatcagagtgccggaatggtcctacatagtggagagggctaatccagctaatgacctctgttacccagggagcctcaatgactatgaagaactgaaacacctgttgagcagaataaatcattttgagaagattctgatcatccccaagagttcctggccaaaccatgaaacatcactaggggtgagcgcagcttgtccataccaggga(SEQ IDNO.:11)
检测H5N8禽流感病毒NA基因片段的核酸序列如下：
ggatgggaactaacaggcctgtgctagttatctcgcctgacctctcttacagggttgggtatttatgtgcaggattgcccagtgacactccaagaggggaagatgcccaatttgtcggttcgtgcactagtcccatgggaaatcaggggtatggcgtaaaaggtttcgggtt(SEQ ID NO.:12)
检测H5N8禽流感病毒PB2-627E基因片段的核酸序列如下：
atttgcagcagccccaccggaacagagtaggatgcaattttcctctctgactgtgaacgtaagaggttcaggaatgagaatacttgtgaggggaaactcccctgtgttcaactataataaggccaccaagagactcacagttcttggaaaggatgcaggcgccttgacagaatatccagatgagggaacagcaggagtggagtct(SEQ ID NO.:13)
检测H5N8禽流感病毒PB2-627K基因片段的核酸序列如下：
atttgcagcagccccaccgaaacagagtaggatgcaattttcctctctgactgtgaacgtaagaggttcaggaatgagaatacttgtgaggggaaactcccctgtgttcaactataataaggccaccaagagactcacagttcttggaaaggatgcaggcgccttgacagaatatccagatgagggaacagcaggagtggagtct(SEQ ID NO.:14)
实施例2
试剂盒的使用和结果判定：
1.RNA样本的制备：取待测疑似禽流感病毒样本(禽类粪便拭子)，按照RNA提取试剂盒说明书提取样本中的RNA。
2.设置PCR反应，反应体系为50μL。按照组成配置PCR反应液(5为反应的管数)，PCR反应A1液为26μL×5，PCR反应A2液为26μL×5，PCR反应B液为4μL×5；将PCR反应液(PCR反应B液、PCR反应A1液或PCR反应A2液)震荡混匀并离心数秒，共30μL分装至PCR反应管，然后将提取的RNA样本20μL、阴性对照20μL、阳性对照20μL分别加入其中一份PCR反应管，盖好管盖，瞬时离心后进行PCR扩增反应。
3.PCR扩增检测
将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行扩增检测；
循环参数设定见表2：
表2
Figure BDA0003256445820000081
Figure BDA0003256445820000091
4.荧光定量PCR仪检测通道选择：FAM为H5N8禽流感病毒HA扩增信号，ROX为H5N8禽流感病毒NA基因扩增信号，CY5为H5N8禽流感病毒PB2基因的扩增信号。
5.质量控制
阴性对照：FAM、ROX和CY5检测通道无扩增曲线；
阳性对照：FAM、ROX和CY5检测通道有扩增曲线，且CT值≤35；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行。检测结果如图1所示。阳性对照1为检测通道加入了PCR反应A1液、PCR反应B液以及阳性对照的检测结果；阳性对照2为检测通道加入了PCR反应A2液、PCR反应B液以及阳性对照的检测结果；阴性对照为检测通道加入了PCR反应A1液或PCR反应A2液、PCR反应B液以及阴性对照的检测结果。
6.H5N8禽流感病毒检测：
用本实验室保存的H5N8禽流感病毒标本以及其它流感病毒如H1N1流感病毒，H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、阴性对照进行H5N8禽流感病毒的检测。结果发现本发明可以特异性检测H5N8禽流感病毒，检测结果如图2所示，显示H5N8禽流感病毒标本为阳性，其它流感病毒及阴性对照为阴性。
7.H5N8禽流感病毒PB2-E627K突变检测
样品H5N8(PB2-627E)与H5N8(PB2-627K)禽流感病毒(2株病毒由实验室通过SPF鸡胚扩增并保存)的检测结果分析(本发明以BioRad CFX96仪器为例)：
当检测样品为H5N8(PB2-627E)且样品检测通道加入的为PCR反应A1液和PCR反应B液，检测结果显示，FAM、ROX和CY5检测通道有扩增曲线，且CT值≤40，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627E；
当检测样品为H5N8(PB2-627K)且样品检测通道加入的为PCR反应A2液和PCR反应B液，检测结果显示，FAM、ROX和CY5检测通道有扩增曲线，且CT值≤40，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627K。检测结果如图3所示。
当检测样品为H5N8(PB2-627E)且样品检测通道加入的为PCR反应A2液和PCR反应B液，FAM和ROX检测通道有扩增曲线且CT值≤40，CY5检测通道无扩增曲线；
当检测样品为H5N8(PB2-627K)且样品检测通道加入的为PCR反应A1液和PCR反应B液，FAM和ROX检测通道有扩增曲线且CT值≤40，CY5检测通道无扩增曲线；检测结果如图4所示。说明本申请实施例1制备的试剂盒能够用于判断H5N8禽流感病毒的PB2-E627K突变。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2-E627K突变的引物和探针及检测方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaattcatc agagtgccgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccctggtat ggacaagctg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccctggtat ggacaagctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccctggtat ggacaagctg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacccgaaac cttttacgcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacccgaaac cttttacgcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atttgcagca gccccatcag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atttgcagca gcccccctga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agactccact cctgctgttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcgccttga cagaatatcc 20
<210> 11
<211> 214
<212> DNA
<213> H5N8禽流感病毒HA基因片段
<400> 11
cgaattcatc agagtgccgg aatggtccta catagtggag agggctaatc cagctaatga 60
cctctgttac ccagggagcc tcaatgacta tgaagaactg aaacacctgt tgagcagaat 120
aaatcatttt gagaagattc tgatcatccc caagagttcc tggccaaacc atgaaacatc 180
actaggggtg agcgcagctt gtccatacca ggga 214
<210> 12
<211> 172
<212> DNA
<213> H5N8禽流感病毒NA基因片段
<400> 12
ggatgggaac taacaggcct gtgctagtta tctcgcctga cctctcttac agggttgggt 60
atttatgtgc aggattgccc agtgacactc caagagggga agatgcccaa tttgtcggtt 120
cgtgcactag tcccatggga aatcaggggt atggcgtaaa aggtttcggg tt 172
<210> 13
<211> 205
<212> DNA
<213> H5N8禽流感病毒PB2-627E基因片段
<400> 13
atttgcagca gccccaccgg aacagagtag gatgcaattt tcctctctga ctgtgaacgt 60
aagaggttca ggaatgagaa tacttgtgag gggaaactcc cctgtgttca actataataa 120
ggccaccaag agactcacag ttcttggaaa ggatgcaggc gccttgacag aatatccaga 180
tgagggaaca gcaggagtgg agtct 205
<210> 14
<211> 205
<212> DNA
<213> H5N8禽流感病毒PB2-627K基因片段
<400> 14
atttgcagca gccccaccga aacagagtag gatgcaattt tcctctctga ctgtgaacgt 60
aagaggttca ggaatgagaa tacttgtgag gggaaactcc cctgtgttca actataataa 120
ggccaccaag agactcacag ttcttggaaa ggatgcaggc gccttgacag aatatccaga 180
tgagggaaca gcaggagtgg agtct 205

Claims (10)

1.一种检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针，其特征在于，所述特异性引物和探针包括：
H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针：
HA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1：5’-cgaattcatcagagtgccgg-3’
HA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5’-tccctggtatggacaagctg-3’
HA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3：5’-FAM-tccctggtatggacaagctg-BHQ1-3’
H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针：
NA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4：5’-tccctggtatggacaagctg-3’
NA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5:5’-aacccgaaaccttttacgcc-3’
NA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6:5’-ROX-aacccgaaaccttttacgcc-BHQ2-3’
H5N8禽流感病毒PB2基因E627K突变检测引物和探针：
PB2-627E正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7：5’-atttgcagcagccccatcag-3’
PB2-627K正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8：5’-atttgcagcagcccccctga-3’
PB2基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9:5’-agactccactcctgctgttc-3’
PB2基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10:5’-CY5-ggcgccttgacagaatatcc-BHQ3-3’。
2.一种权利要求1所述的检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针在制备检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒中的应用。
3.一种检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针。
4.根据权利要求3所述的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装的PCR反应A1液、PCR反应A2液，以及PCR反应B液；
所述PCR反应A1液包括用于检测H5N8 PB2-627E禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2-627E正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
所述PCR反应A2液包括用于检测H5N8 PB2-627K禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2-627K正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。
5.根据权利要求4所述的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应A1液、PCR反应A2液还包括dNTP Mixture和PCR buffer。
6.根据权利要求4所述的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
阳性对照，阳性对照含有H5N8禽流感病毒HA基因、NA基因、PB2-627E和PB2-627K基因的扩增序列质粒的混合液；
阴性对照：RNase Free Water。
7.一种权利要求3-6任一所述的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变病毒中的应用。
8.一种H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：
以所提取待检测样本的RNA为模板，配置扩增反应体系并进行荧光PCR扩增，每管PCR扩增同时检测FAM、ROX和CY5荧光信号，即同时检测H5N8禽流感病毒的HA基因、NA基因和PB2基因，实时记录所述PCR扩增过程中的Ct值和PCR扩增曲线，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断；
所述待检测样包括人或禽类鼻咽拭子、组织或者粪便拭子；
所述扩增反应体系包括权利要求1所述的检测H5N8禽流感病毒及其PB2-E627K突变的特异性引物和探针。
9.根据权利要求8所述的H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括：模板、PCR反应B液、PCR反应A1液或PCR反应A2液或阴性对照或阳性对照；所述荧光PCR扩增程序为：50℃305i5；95℃55i5；94℃5sec、55℃45sec，45个循环；25℃10sec。
10.根据权利要求8所述的H5N8禽流感病毒及PB2-E627K突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断的原则为：
阴性对照：FAM、ROX和CY5检测通道无扩增曲线；
阳性对照：FAM、ROX和CY5检测通道有扩增曲线，且CT值≤35；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行；
当FAM和ROX荧光通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒阳性；
当FAM和ROX荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为H5N8禽流感病毒阳性，否则判断样品为H5N8禽流感病毒阴性；
当判断检测样品为H5N8阳性时且样品检测通道加入的为PCR反应A1液时，如果CY5荧光通道中有扩增曲线时，且CY5通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627E；如果CY5荧光通道中无扩增曲线时，判断样品H5N8禽流感病毒PB2基因627位不是E；
当判断检测样品为H5N8阳性时且样品检测通道加入的为PCR反应A2液时，如果CY5荧光通道中有扩增曲线时，且CY5通道中Ct≤40时，判断样品为H5N8禽流感病毒PB2-627K；如果CY5荧光通道中无扩增曲线时，判断样品H5N8禽流感病毒PB2基因627位不是K。
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