CN107987135A - Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了Ι群4型禽腺病毒具有免疫保护功能的亚单位蛋白，其为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列，具有较好的抗原性和免疫原性。该Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白及药学上可以接受佐剂制成疫苗，该疫苗制备方法主要包括先将密码子优化后的Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白核苷酸序列克隆到载体中，再将重组载体转化、诱导表达、纯化后得到抗原蛋白，最后将抗原蛋白与佐剂乳化后得到疫苗。该疫苗安全、有效；且制备该亚单位疫苗的方法简单、成本低、易于放大。

Description

Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及其用于制备疫苗的应用。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是禽类常见的传染性病原，多数在禽体内复制却不致病或只是引起轻微的病症。但是当有其它诱因或是发生混合感染时，也会影响禽群健康。某些禽腺病毒本身具有致病性，如火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagic enteritisvirus，HEV)、鹌鹑支气管炎病毒(Quil bronchitis virus，QBV)、产蛋下降综合征病毒(Eggdrop syndrome virus，EDSV)等。多数禽腺病毒可在禽的肝或肾细胞上增殖。根据血清型差异将其分为三个亚群：来源于鸡、火鸡、鹅的多数禽腺病毒属于I群，如，禽7型腺病毒(FAdV-7)、禽10型腺病毒(FAdV-10)、包涵体性肝炎病毒(Inclusion body hepatitis，IBH)等，代表种为FAdV-1；HEV为禽腺病毒II群；而EDSV与禽腺病毒I群没有共同的型特异性抗原，在分子水平上也与I群存在实质性的差异而被归为禽腺病毒Ⅲ群。
I群禽腺病毒呈世界性分布，各日龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。I群禽腺病毒的发病给饲养业造成了严重的经济损失。2015年以来，我国多地区鸡群暴发由I群FAdV引起的心包积液综合征和鸡包涵体肝炎疫情，从高发地区血清型和临床症状看，主要为FAdV-4型。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。
I群禽腺病毒为二十面体对称，包括240个六邻体和12个五邻体。五邻体由两种蛋白构成，一个锚定在衣壳上的五邻体基体蛋白(penton)和一个伸向外侧的纤细的纤突蛋白(fiber)。但是，I群禽腺病毒的五邻体呈现出一种不同的形态特征，即每个五聚基体连有两个纤突(如图1所示)，分为长纤突蛋白(fiber-1)和短纤突蛋白(fiber-2)，两纤突受体结合部基因序列不同，可能与受体结合相关。纤突蛋白可分为尾(tail)、杆(shaf)及球形区(knob)3部分，尾区与五邻体基底相连；杆端一般由22个重复亚单位构成，球形区为功能区，可与宿主细胞受体结合，纤维蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇，能诱导产生保护性抗体。
目前，主要使用FAdV-4接种鸡胚、原代鸡肾脏细胞或鸡胚肝癌细胞来制备疫苗。鸡胚繁殖病毒含量低；而原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作；另外，灭活疫苗还存在灭活不彻底的隐患。所以亟需研究新的、安全性更好的抗原及其制备的疫苗。
现有申请号为201610777561.1的中国发明专利申请中提出了一种Ι群4型禽腺病毒亚单位疫苗，该亚单位疫苗中抗原是纤维蛋白C末端的248个氨基酸序列，该抗原使用大肠杆菌表达时是包涵体表达，包涵体在纯化时需要经过复性的步骤，在工业化生产时不容易放大，成本相对较高。这有可能是因为截短体太长，含有大量的纤突蛋白的杆状(shaf)部分，截短位置不合适导致表达出来的蛋白可溶性低且产量不高。
发明内容
为解决现有技术的上述技术问题，本发明提供Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白。本发明还提供一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法。本发明还提供了一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白用于预防I群禽腺病毒引起的包涵体肝炎等的疫苗。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
也就是说，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列。
用于编码如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的基因，优选地，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1)将编码Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列克隆到原核表达载体上，得到重组表达载体；
2)将1)中重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；
3)将2)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白。
如上所述的制备方法，优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
如上所述的制备方法，优选地，所述步骤(1)的操作步骤为：采用如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列对SEQ ID NO.2所示核苷酸进行PCR扩增，将扩增产物用Nco I和Xho I双酶切后，用连接酶与pET28a原核表达载体连接，得到重组表达载体。
一种Ι群4型禽腺病毒亚单位疫苗，其含有如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白和药学上可以接受的佐剂。
如上所述的疫苗，优选地，所述佐剂为ISA 201VG佐剂或Marcol 52白油佐剂。
本发明还提供了如上所述疫苗的应用，优选地，所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为0.5～50μg/羽份。
最优选地，所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为2.5～40μg/羽份。
本发明还提供了如上所述疫苗的应用，优选地，所述疫苗用于在预防Ι群4型禽腺病毒感染中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，具体为截短体蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列，共197个氨基酸。其具有良好的免疫原性，能够保护鸡免受强毒的攻击，且最低免疫剂量能达到2.5μg/只。本发明提供的制备抗原蛋白的方法简单，容易操作，其表达的目的蛋白即Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白有利于纯化的可溶性表达，只需要一步镍柱层析，纯度就能达到90％以上，远远满足疫苗制备的需求，而且成本低，易放大，如使用大肠杆菌表达，且目的蛋白表达量在没有优化发酵条件前能达到600mg/L。利用本发明制备的Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白和佐剂制备疫苗，安全性高、不存在灭活不彻底的问题(使用蛋白制备疫苗，不需要灭活)，而且免疫剂量小，制备的疫苗可用于在预防Ι群4型禽腺病毒感染措施中的应用。
附图说明
图1为Ι群4型禽腺病毒病毒粒子模式图。
图2为密码子优化前后的Fiber-2(knob)蛋白核苷酸序列比对结果：Fiber-2(knob)表示优化前的核苷酸序列，OPTI-Fiber-2(knob)表示优化后的核苷酸序列。
图3为pET28a(+)-fiber-2(knob)质粒双酶切鉴定结果，其中1、2为pET28a(+)-fiber-2(knob)质粒EcoRI/EcoRV双酶切，条带大小约4191bp，1660bp，质粒酶切正确；M为DL10000marker。
图4为Fiber-2(knob)蛋白小量诱导表达后SDS-PAGE检测结果；其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，4是诱导后沉淀，其中箭头指向为Fiber-2(knob)蛋白。
图5为Fiber-2(knob)蛋白纯化后SDS-PAGE检测结果。
图6为Fiber-2(knob)蛋白三维结构模式图，chain A,B,C分别为Fiber-2(knob)单体，共同组成三聚体。
图7A为superdex 200PG柱标准品层析图谱，其中ferritin出峰体积为54.1ml，分子量为440kDa，aldolase出峰体积为65.4ml，分子量为158kDa，conalbumin出峰体积为73.0ml，分子量为75kDa，ovalbumin出峰体积为80.0ml，分子量为43kDa，carbonicanhydrase出峰体积为87.9ml，分子量为29kDa，ribonuclease A出峰体积为95.7ml，分子量为13.7kDa，aprotinin出峰体积为104.3ml，分子量为6.5kDa；图7B为Fiber-2(knob)分子筛检测结果。
具体实施方式
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷，如灭活疫苗制备时存在的操作困难、成本高，灭活疫苗存在灭活不彻底，现有亚单位疫苗纯化时较复杂、成本相对较高等缺陷，提供一种Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白抗原，该截短体蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位的抗原决定簇氨基酸序列，共197个氨基酸。比现有技术中，如申请号为201610777561.1的中国发明专利申请，亚单位疫苗的抗原短了51个氨基酸序列。而且，本发明人发明的抗原蛋白经过试验验证，证明其也具有良好的免疫原性，且最低免疫剂量能达到2.5μg/羽，这说明缺少这51个氨基酸并不影响该抗原的免疫原性，也从另外一个方面说明了现有技术选择的截短位置并不是最优的，因201610777561.1中的抗原蛋白含有大量的纤突蛋白的杆状部分，大大影响截短蛋白的空间结构和稳定性，也会导致表达产量不高(现有技术中虽未提供表达产量的数据)和增加下游工艺的难度，如现有技术中表达的抗原为包涵体，这显著增加纯化难度和工艺放大的难度；另外，本发明人在充分分析和实验的基础上，选择的抗原更适合作为市场化亚单位疫苗的抗原，这是因为制备该抗原的方法更加简单(表达的目的蛋白均是有利于纯化的可溶性表达，只需要过一步镍柱层析，纯度就能达到90％以上，远远满足疫苗制备的需求)且产量很高，如本发明中使用大肠杆菌表达，且目的蛋白表达量在没有优化发酵条件前能达到600mg/L，因此，总体成本远远低于现有技术中的产品，这在竞争激烈的动物疫苗行业中，特别是在禽苗中(因为禽苗单价太低)，高质量、低成本的产品更具有市场潜力和竞争力。
下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，下面实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用试剂、菌株未明确指出可采用商购试剂、菌株。其中，Fiber-2(knob)表示Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白。
实施例1禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白的制备
1.1禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白的选择
禽腺病毒纤突蛋白可分为尾(tail)、杆(shaf)及球形区(knob)3部分，尾区与五邻体基底相连；杆端一般由22个重复亚单位构成，这两部分不能产生中和表位。球形区为功能区，可与宿主细胞受体结合，纤维蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇，能诱导产生保护性抗体，但在自然状态下，球形区为三聚体形态(van Raaij,M.J.,A.Mitraki,G.Lavigne andS.Cusack(1999)."A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals anew structural motif for a fibrous protein."Nature 401(6756):935-938.)。因此，理论上选择表达Fiber-2(knob)蛋白并能形成三聚体，免疫后能产生很好的保护，由于I群腺病毒4型Fiber-2结构尚未解析，我们通过Swiss-Model同源预测分析，最后选择的Fiber-2蛋白从氨基酸283位到氨基酸479位，即包含Fiber-2(knob)抗原决定簇氨基酸序列，如SEQID NO.1所示，我们预测该段氨基酸序列在一定条件下能够自动形成三聚体，如图6所示。
1.2禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白密码子优化
通过对浙江海隆生物科技有限公司的实验室从FAdV-4BP毒株中扩增出来的禽腺病毒fiber-2的核苷酸序列进行密码子优化，得到优化后的OPTI-Fiber-2(knob)序列，如SEQ ID NO.2所示，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成SEQ ID NO.2所示序列，记为OPTI-Fiber-2(knob)。如图2所示，优化前后有131/591＝22.2％的核苷酸序列不同。其中优化前的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
1.3表达载体构建及验证
1.3.1PCR扩增目的片段
1.3.1.1PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物(SEQ ID NO.4)：5’-CAGCCATGGGCATTGCGACCTTCGT TAGC-3’；
下游引物(SEQ ID NO.5)：5’-GTGCTCGAGTTAGTGGTGGTG-3’。
(2)加样体系50μL，如下表所示：
1.3.1.2PCR扩增程序：
1.3.1.3PCR产物进行胶回收(可使用天根生化科技有限公司的普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)，具体操作步骤如下：)
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，65℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置5min，10,000rpm/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW buffer，静置5min，离心10,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
1.3.2PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的200μL PCR管，在PCR管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
(2)将步骤(1)中的PCR管置于相应酶最适温度如37℃恒温水浴锅中，水浴1-2h。
双酶切产物胶回收：取出上述Nco I和Xho I双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.3.1.3中PCR产物胶回收。
1.3.3连接反应
(1)准备洁净的200μL PCR管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在200μL PCR管按照下表进行加样、混匀。
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μL反应体系置于PCR仪16℃反应2h；
(4)取出步骤(3)中的EP管，置于4℃保存。
1.3.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞E.coli JM109中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
1.3.5质粒抽提与双酶切鉴定
1.3.5.1质粒抽提(可采用Plasmid Mini Kit I，OMEGA，D6943-01)
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入50μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液，即为提取的质粒溶液。
1.3.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的200μL PCR管，按照下表进行加样：10μL反应体系
(2)将步骤(1)中的200μL PCR管10μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴1h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果如图3所示，其中，1、2为
pET28a(+)-fiber-2(knob)质粒进行EcoRI/EcoRV双酶切，条带大小约4191bp，1660bp，质粒酶切正确，M为DL10000marker。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。
1.4禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白表达
1.4.1转化大肠杆菌BL21
吸取1μL质粒(1.3.5.1中提取的质粒)加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；
42℃热激90s；
冰浴2min；
在超净台内加入500μL无抗性的LB培养液；
37℃220rpm摇1h；
吸取100μL菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆(E.coliBL21pET28a(+)-fiber-2(knob))并加入甘油于-80℃保存备用。
1.4.2小量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取E.coli BL21pET28a(+)-fiber-2(knob)菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那抗性平板(50μg/mL)上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)发酵接种：将活化好的菌悬液取150μL接种至15mL卡那抗性LB培养基中，37℃，220r/min培养；
(4)降温诱导：当OD600达到0.6-0.8时，取出5mL菌液，12,000rpm离心5min，将菌体置于-20℃保存，即为“诱导前”。剩余菌液置于冰水浴10min，加入2μL 1M IPTG，终浓度0.2mM IPTG。将摇床温度降至20℃，诱导9h；
(5)菌体收集：发酵结束后，测量OD600，收集与“诱导前”等量菌体，12,000r/min离心5min，收集菌体置于-20℃保存，即为“诱导后”。
诱导表达SDS-PAGE检测结果如图4所示，其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，4是诱导后沉淀，箭头指向为Fiber-2(knob)蛋白。从图中可以看出，制备的Fiber-2(knob)为可溶性表达，不是包涵体表达。
1.4.3大量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取E.coli BL21pET28a(+)-fiber-2(knob)菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那抗性平板上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)种子液培养：将活化好的菌悬液取150μL接种至150mL卡那抗性LB培养基中，37℃220r/min培养9～10h；
(4)发酵培养基配制：按照发酵培养基配方配制发酵培养基组分1于5L发酵罐中，安装组联发酵罐，发酵培养基组分2及补料培养基配制于蓝口瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(5)发酵参数设置：Agit 400r/min；Tempreture 37℃；pH 7.00；DO 40；Air100％；Gasflow 2.0；
(6)发酵接种：于接种口将450mL发酵培养基组分2，1mL发酵培养基组分3，200μL消泡剂，3mL卡那抗生素(50mg/mL)补加到发酵罐中；将培养好的150mL种子液接种至3L发酵培养基中进行发酵罐放大培养，培养5～6h至OD600值到12～14；
(7)降温诱导：设置温度参数，将发酵罐温度降至20℃，取样，加入0.9mL IPTG(1M)至IPTG终浓度为0.3mM，20℃诱导培养8h；
(8)发酵补料：待发酵培养至OD600达到17～19时，按5％的速度连续补加补料培养基(先将补料培养基组分1和2混匀)。
(9)菌体收集：发酵结束后，收集发酵液在8000r/min离心10min，收集菌体置于-20℃保存。
其中，上述过程中所用培养基如下：
发酵培养基组分1:酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，KH2PO4 1.14g/L，K2HPO4 0.9g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至2.4L)；
发酵培养基组分2：甘油30g/L；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至450mL)；
发酵培养基组分3：VB1 2mg/L；(配制6mg/mL的VB1 0.22μm过滤除菌)；
补料培养基组分1：酵母粉16.67g/L；胰蛋白胨33.33g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至300mL)；
补料培养基组分2：甘油100g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至150mL)。
1.5禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白纯化
1.5.1蛋白纯化所需溶液如下：
(1)菌液裂解液：组分为50mM NaH2PO4(pH 8.0)，500mM NaCl，0.2％TritonX-114，0.05％Tween-20，1最后用NaOH溶液调节pH至8.0。
(2)清洗缓冲液1(Washing buffer 1)：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，0.2％TritonX-114，0.05％吐温-20，最后用NaOH溶液调节pH至7.4。
(3)洗脱缓冲液组分1(Elution buffer 1)：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，0.5％Tween-20；
(4)洗脱缓冲液组分2(Elution buffer 2,咪唑母液)：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，0.5％Tween-20，500mM咪唑；
1.5.2菌体破碎
向菌体中加入裂解液(10mL/g湿重)，搅拌均匀；将菌体样品倒入到细胞均质仪样品槽中，出样口用烧杯准备收集样品；以样品的90％流出出样口为一个循环，一个循环完成后，将出样口烧杯收集的样品倒回样品槽，共进行4个循环。
1.5.3离心
将步骤1.5.2中破碎完全的样品分装到250mL Beckman离心管中，12,000rpm，4℃离心30min，上清作为上样样品。
1.5.4镍柱平衡
用超纯水平衡2～3柱体积(CV)，排出20％的乙醇保存液；然后用裂解液平衡2～3柱体积(CV)。
1.5.5上样
取菌体破碎后上清作为样品与镍柱填料混合，于滚瓶机上混匀1h后进行流穿，并收集流穿液。
1.5.6去除内毒素
用20倍柱体积(CV)的清洗缓冲液组分1(washing buffer 1)洗柱，用于去除内毒素。
1.5.7去除TritonX-114
用10倍柱体积(CV)的洗脱缓冲液组分1(elution buffer 1)(不含Triton X-114)洗柱，减少Triton X-114的残留。
1.5.8洗脱
150mM咪唑洗脱缓冲液洗杂，至考马斯亮蓝G250检测无蓝色；500mM咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，至考马斯亮蓝G250检测无蓝色，收集目的蛋白。
1.5.9透析
将收集的的目的蛋白置于3kD透析袋中，置于洗脱缓冲液组分1(elution buffer1)中进行透析，去除咪唑。
纯化结果如图5所示：纯化后的Fiber-2(knob)蛋白的SDS-PAGE纯度均能达到90％以上；经过计算，在没有优化发酵培养条件的情况下，表达量能达到600mg/L以上。
1.6分子筛柱层析
1.6.1superdex 200PG柱平衡
用超纯水平衡2个柱体积，排出乙醇保存液；然后用流动相平衡2个柱体积，流速为1mL/min，压力控制在0.5MPa以内。
1.6.2进样
用进样环进样Fiber-2(knob)蛋白2mL(浓度3.153mg/mL)，流速为1mL/min，控制压力为0.5MPa。
1.6.3运行
进样完成后，改inject状态为load状态，运行，流速为1mL/min，出峰后进行样品收集，0.5mL/管。
分子筛结果如图7B所示：从Fiber-2(knob)蛋白分子筛出峰结果与标准品柱层析图谱(图7A)对比，可以看出，峰1的出峰体积46.34ml，分子量大于440kDa，为纯化后的Fiber-2(knob)蛋白中的杂蛋白；峰2的出峰体积为74.32ml，分子量在43kDa与75kDa之间，为Fiber-2(knob)蛋白三聚体(Fiber-2(knob)蛋白三聚体分子量约66kDa)；峰3的出峰体积为84.72ml，分子量在29kDa与43kDa之间，可能是Fiber-2(knob)蛋白的单体(Fiber-2(knob)蛋白单体分子量约22kDa)。由于superdex 200PG柱子分辨率较低，且Fiber-2(knob)蛋白单体三维结构与标准蛋白可能存在一定的差异，导致分子量分析的结果与标准蛋白存在一定的差异。
从图中可以看出，峰2面积(756.4421)占总面积(1179.2059)的百分比为64.1％，这说明纯化后的Fiber-2(knob)蛋白在未进一步优化缓冲体系前就有64.1％为三聚体，这符合预测分析。
实施例2禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白亚单位疫苗制备
2.1 ISA 201 VG佐剂(购自法国SEPPIC公司)疫苗制备
水相准备：根据疫苗中Fiber-2(knob)蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将实施例1中制备的Fiber-2(knob)蛋白稀释适当浓度，即为水相；
油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA 201 VG佐剂；
乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200-500rpm搅拌20-30min，于20℃静置1h后置于4℃过夜；
分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。
2.2Marcol 52白油佐剂(购自埃索公司)疫苗制备
水相制备：按照重量比为4％的比例在稀释好的抗原液中加入灭菌吐温-80，升温至33℃搅拌，吐温完全溶解后作为水相抗原；
油佐剂制备：分别按照2％和6％的比例，在Marcol 52白油中加入硬脂酸铝和司本-80，将司本-80、硬脂酸铝和Marcol 52白油佐剂混合，在260℃条件下搅拌，混合均匀，佐剂高压灭菌后备用；
乳化：按照抗原和油佐剂体积比为1:3的比例，取油相3份全部倒入适合的容器内，低转速下缓慢加入1份抗原，慢速搅拌1min，充分搅拌混匀后，停机1min。高转速下充分搅拌90s，出现小气泡后再搅拌30s，乳化完成，乳化后分装；
疫苗检验：
物理性状采用眼观的方法观察外观(是否是乳白色乳剂)；
采用清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，观察(除第1滴外)，其中，2.1制备的疫苗应为云雾状扩散，判定为水包油包水剂型，2.2制备的疫苗应不扩散，判定为油包水型剂型；
将疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.5mL，判为稳定；
使用粘度仪对2.1制备的疫苗进行粘度检测，应在20-50cp，判为合格；
用1mL吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右的2.2制备的疫苗1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，在8s以内判为合格。
实施例3鸡免疫攻毒实验
3.1预攻毒实验
为了验证Fiber-2(knob)蛋白的免疫原性，使用ISA 201 VG佐剂和Marcol52白油佐剂分别制备了2批疫苗(具体制备方法参见实施例2)，每批疫苗中Fiber-2(knob)蛋白浓度均为100μg/mL(每只免疫0.5ml，故为50μg/羽份)。
15只21日龄SPF鸡，随机分成3组，每组5只。组1免疫ISA 201 VG佐剂制备的疫苗，组2免疫Marcol 52白油佐剂制备的疫苗，组3不免疫作为对照组，经颈部皮下注射0.5mL疫苗。免疫后观察鸡的状态，并在免疫后第14天攻毒，每只鸡胸肌注射0.2mLΙ群4型禽腺病毒病毒液(约含105.5TCID50/0.1mL)，连续观察14天。
在免疫后的14天内，所有鸡都正常，未出现任何异常情况，这说明这2批疫苗均是安全的。在攻毒后观察的14天内，2组免疫组鸡均正常，未出现任何异常情况，对照组5只鸡在攻毒后的3天内全部死亡，这说明，这2组疫苗均能保护鸡免受强度攻击，具有良好的免疫原性。
3.2不同剂量攻毒实验
为了摸索合适的抗原含量，使用Marcol 52白油佐剂做了不同抗原的疫苗(具体制备方法参加实施例2)，具体疫苗信息如下表所示：
35只21日龄SPF鸡，随机分成7组，每组5只。组1～组5分别免疫疫苗1～疫苗5，组6免疫不含目的蛋白的大肠杆菌裂解液制备的疫苗，组7不免疫作为对照组，颈部皮下注射0.5mL疫苗。在免疫后第14天攻毒，每只鸡胸肌注射0.2mLΙ群4型禽腺病毒病毒液(约含105.5TCID50/0.1mL)，连续观察14天。
在攻毒后观察的14天内，5组免疫组鸡均正常，未出现任何异常情况。大肠杆菌对照组疫苗免疫组和对照组5只鸡在攻毒后的3天内全部死亡，这说明，这5组疫苗均能保护鸡免受强度攻击，且免疫剂量最低能达到每只仅仅免疫2.5μg Fiber-2(knob)蛋白。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
序列表
<110> 北京市农林科学院
浙江海隆生物科技有限公司
<120> Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白、其制备方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> PRT
<213> 禽腺病毒Fiber-2(knob蛋白Avian adenovirus Fiber-2 knob protein)
<400> 1
Ile Ala Thr Pro Val Ser Gly Ser Pro Ser Leu Ala Thr Thr Ala Ala
1 5 10 15
Thr Thr Val Ala Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ser Cys Ala Thr Thr Leu
20 25 30
Gly Gly Thr Ala Ile Gly Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Thr Leu Leu
35 40 45
Leu Ala Ser Ala Thr Met Gly Ala Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ser Ala
50 55 60
Ala Ala Leu Thr Pro Thr Pro Thr Val Ser Ala Thr Leu Gly Gly Cys
65 70 75 80
Ala Pro Ser Gly Ile Gly Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Leu Thr Ala Pro Gly Pro Met Ala Ala Ala Ser Val Thr Ser Pro Thr
100 105 110
Thr Thr Ser Ala Ala Gly Thr Thr Gly Pro Ser Ile Gly Gly Pro Gly
115 120 125
Val Pro Ser Pro Val Val Thr Gly Ala Thr Ala Pro Gly Ala Ile Gly
130 135 140
Ile Ala Val Leu Pro Val Pro Val Ser Ala Ser Gly Gly Ala Thr Thr
145 150 155 160
Leu Leu Cys Thr Ser Leu Gly Cys Thr Ala Ala Ser Ile Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Thr Met Ile Val Gly Pro Val Leu Thr Ser Cys Pro
180 185 190
Ala Ala Ser Leu Pro
195
<210> 2
<211> 591
<212> DNA
<213> 密码子优化后的禽腺病毒Fiber-2(knob蛋白核苷酸序列Nucleotidesequence of codon optimized Fiber-2 knob protein of avian adenovirus)
<400> 2
atcgctactt ttgtctcggg aagtcccagc ctcaacacct acaatgccac gaccgtcaat 60
tccagcgcga acgccttctc ttgcgcctac taccttcaac agtggaacat acaggggctc 120
cttgttacct ccctctactt gaaattggac agcgccacca tggggaatcg ccctggggac 180
ctcaactccg ccaatgccaa atggttcacc ttttgggtgt ccgcctatct ccagcaatgc 240
aacccctccg ggattcaagc gggaacggtc agcccctcca ccgccaccct cacggacttt 300
gaacccatgg ccaataggag cgtgaccagc ccatggacgt actcggccaa tggatactat 360
gaaccatcca tcggggaatt ccaagtgttc agcccggtgg taacaggtgc ctggaacccg 420
ggaaacatag ggatccgcgt cctccccgtg ccggtttcgg cctccggaga gcgatacacc 480
cttctatgct atagtctgca gtgcacgaac gcgagcattt ttaatccaaa caacagcgga 540
accatgatcg tgggacccgt gctctacagc tgtccagcgg cctccctccc g 591
<210> 3
<211> 591
<212> DNA
<213> 密码子优化前的禽腺病毒Fiber-2(knob蛋白核苷酸序列Nucleotidesequence of Fiber-2 knob protein of avian adenovirus before codonoptimization)
<400> 3
attgcgacct tcgttagcgg tagcccgagc ctgaacacct ataacgcgac caccgtgaac 60
agcagcgcga acgcgtttag ctgcgcgtac tatctgcagc aatggaacat ccagggtctg 120
ctggttacca gcctgtacct gaagctggat agcgcgacga tgggtaaccg tccgggtgac 180
ctgaacagcg cgaacgcgaa atggttcacc ttttgggtta gcgcgtatct gcagcaatgc 240
aacccgagcg gcattcaagc gggtaccgtt agcccgagca ccgcgaccct gaccgacttc 300
gagccgatgg cgaaccgtag cgttaccagc ccgtggacct acagcgcgaa cggctactat 360
gagccgagca tcggtgaatt ccaggtgttt agcccggtgg ttaccggtgc gtggaacccg 420
ggcaacattg gtatccgtgt tctgccggtg ccggttagcg cgagcggtga acgttacacc 480
ctgctgtgct atagcctgca atgcaccaac gcgagcattt ttaacccgaa caacagcggc 540
accatgatcg tgggtccggt tctgtatagc tgcccggcgg cgagcctgcc g 591
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagccatggg cattgcgacc ttcgttagc 29
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgctcgagt tagtggtggt g 21

Claims (10)

1.一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白，所述蛋白为Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.用于编码如上所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将编码Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列克隆到原核表达载体上，得到重组表达载体；
2)将1)中重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；
3)将2)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化Ι群4型禽腺病毒短纤突蛋白球形区截短体蛋白。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的操作步骤为：采用如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列对SEQ ID NO.2所示核苷酸进行PCR扩增，将扩增产物用Nco I和Xho I双酶切后，用连接酶与pET28a原核表达载体连接，得到重组表达载体。
6.一种Ι群4型禽腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，其含有如上权利要求1所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白和佐剂。
7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为ISA 201VG佐剂或Marcol 52白油佐剂。
8.如权利要求6或7所述疫苗的应用，其特征在于，所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为0.5～50μg/羽份。
9.如权利要求8所述疫苗的应用，其特征在于，在所述Ι群4型禽腺病毒亚单位蛋白的用量为2.5～40μg/羽份。
10.如权利要求6或7所述疫苗的应用，其特征在于，所述疫苗用于在预防Ι群4型禽腺病毒感染中的应用。
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