CN101874898A - 预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法 - Google Patents

预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于预防钩端螺旋体病的三价基因重组疫苗及其制备方法。目的是提供的疫苗及其制备方法能够有效预防不同血清群问号钩端螺旋体感染且制造成本较低。技术方案是：本发明提供的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，是从黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体基因组中克隆了lipL32/1、lipL21和ompL1/2三个基因，通过基因工程技术制备的融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2具有序列5所示的核苷酸序列和氨基酸序列，lipL32/1与lipL21、lipL21与ompL1/2基因之间用序列4所示的相同的两条柔性肽连接。

Description

预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种疫苗及其制备方法，尤其是用于预防钩端螺旋体病的三价基因重组疫苗及其制备方法。
背景技术
由致病的问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)感染所引起的钩端螺旋体病是全世界流行的自然疫源性人兽共患传染病，尤其好发于水稻种植地区，因而我国是钩端螺旋体病流行的主要疫区之一。
问号钩端螺旋体自然宿主动物众多，感染后无症状或症状轻微，通常不死亡，但可从尿液中排出问号钩端螺旋体，直接污染水源或经土壤污染水源(疫水)。由于问号钩端螺旋体在多种水系中能存活较长时间并可经疫水迅速传播，故钩端螺旋体病是洪涝、地震等自然灾害时重点防疫的传染病之一。我国地域辽阔，自然灾害频繁，因而始终存在着钩端螺旋体病暴发流行的危险。2005年，钩端螺旋体病被列为国家重点监测的13种重大传染病之一，最近又被列入国家计划免疫项目之中。
接种疫苗是预防和控制钩端螺旋体病最为经济和有效的措施。目前国际上有两种钩端螺旋体疫苗产品：多价全菌死疫苗和多价外膜疫苗，目前以前者应用为主。然而，上述疫苗在预防钩端螺旋体病中存在的问题是：①问号钩端螺旋体血清群众多，不同地区流行的钩端螺旋体血清群可有差别，多价全菌死疫苗或多价外膜疫苗对疫苗中不包含的问号钩端螺旋体血清群感染仅有微弱保护力甚至无保护力；②钩端螺旋体病病人主要是农民，由于多价钩端螺旋体全菌死疫苗、多价钩端螺旋体外膜疫苗均含脂多糖内毒素，故副作用很大，接种者数日内不能进行体力劳动，严重影响了免疫接种的积极性。因此，研制对不同血清群钩端螺旋体有广泛交叉保护作用通用型疫苗，对于钩端螺旋体病预防和控制具有极为重要的意义并有广阔的应用前景。
基因工程疫苗以人工重组表达的蛋白分子为抗原，免疫成分明确，无明显的毒副作用，因而是当今新型疫苗研制的主要方向。病毒的抗原构造十分简单，其基因工程疫苗的免疫保护效果较好，如乙型肝炎病毒的重组表面抗原疫苗。但细菌的抗原构造复杂，单一抗原的基因工程疫苗往往免疫保护效果不佳，这是目前尚无细菌单一抗原基因工程疫苗产品的主要原因，采用多抗原是提高基因工程疫苗免疫保护效果的有效途径之一。
属特异性抗原是所有钩端螺旋体血清群均含有的一类抗原。我们发现，外膜脂蛋白LipL32和LipL21及穿膜蛋白OmpL1是我国15群15型钩端螺旋体参考标准株、钩端螺旋体分离株均表达的外膜蛋白抗原，其中LipL21编码基因只有一个基因型，OmpL1和LipL32编码基因分别有3个(ompL1/1、ompL1/2和ompL1/3)和2个基因型(lipL32/1和lipL32/2)，但各基因型表达产物抗血清对我国15群15型问号钩端螺旋体参考标准株均有不同程度的交叉凝集，表明OmpL1和LipL32也是属特异性表面蛋白抗原。黄疸出血群是我国主要流行的问号钩端螺旋体血清群，70％钩端螺旋体病例均为感染问号钩端螺旋体黄疸出血群所致，其余30％钩端螺旋体病例为感染问号钩端螺旋体流感伤寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日热群等所致。上述问号钩端螺旋体各血清群lipL32基因型均为lipL32/1型，问号钩端螺旋体黄疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日热群ompL1基因型为ompL1/2型，流感伤寒群、秋季群为ompL1/1型。因此，我们采用黄疸出血群赖型赖株LipL32/1、LipL21和OmpL1/2作为问号钩端螺旋体通用性三价基因重组新疫苗的抗原。
发明内容
本发明的目的是要填补现有问号钩端螺旋体多价全菌死疫苗和多价外膜疫苗的缺陷，提供一种能有效预防不同血清群问号钩端螺旋体感染且制造成本较低的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法。
本发明提供的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，是一种同时含三种不同的问号钩端螺旋体属特异性外膜抗原LipL32/1、LipL21和OmpL1/2的基因重组疫苗；它从黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体基因组中克隆了lipL32/1、lipL21和ompL1/2三个基因，通过基因工程技术制备了上述三个基因的融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2(所述的融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2具有序列5所示的核苷酸序列和氨基酸序列)，为了保证融合基因原核重组表达产物中三个蛋白抗原有良好的空间构型，lipL32/1与lipL21、lipL21与ompL1/2基因之间用序列4所示的相同的两条柔性肽序列(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)连接，构建了lipL32/1-lipL21-ompL1/2融合基因原核表达载体pET42alipL32/1-lipL21-ompL1/2，转化入大肠杆菌E.coli BL21DE3中，建立了重组原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2，其表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2分子中同时含有rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2三种重组蛋白抗原，从而能对不同血清群问号钩端螺旋体感染具有免疫预防效果，不需要分别重组表达rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2，降低了生产成本，同时使制备方法更为简便可靠。
本发明预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制备方法及其效果鉴定步骤：1)黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆和测序及其原核表达系统构建；2)lipL32/1-lipL21-ompL1/2融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导目的重组蛋白抗原rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)利用lipL32/1-lipL21-ompL1/2融合基因3’端预先设置的His标签序列，其表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2可用Ni-NTA亲和层析柱一次性提纯，提纯的产物用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定纯度；5)提纯的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2直接与氢氧化铝混合制备成注射液；6)采用问号钩端螺旋体金地鼠感染模型、金地鼠血清特异性抗体显微镜凝集效价检测等方法，测定和确定问号钩端螺旋体通用型三价基因重组疫苗rLipL32-LipL21-OmpL1免疫保护作用及其特异性抗体产生情况。
本发明的有益效果是：1)本发明通过人工融合基因及其原核表达的三价融合重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2提供一种能预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的皮内注射多价抗原基因工程疫苗，并采用金地鼠感染模型、血清特异性抗体测定等方法，证实该基因重组疫苗皮下注射免疫后可使83.3％～91.7％金地鼠能抵抗三种不同血清群问号钩端螺旋体致死性感染而存活，存活金地鼠血清中含有能与我国15群15型问号钩端螺旋体参考标准株产生效价为1∶50～1∶400的显微镜交叉凝集抗体，因此能有效预防不同血清群问号钩端螺旋体感染而引起的钩端螺旋体病，从而解决了当今使用的问号钩端螺旋体多价全菌死疫苗和多价外膜疫苗无交叉保护的缺点；2)本发明方法制备的多价重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2是一种对人体无害的细菌融合蛋白，不仅制备方法安全可靠，同时也解决了当今使用的问号钩端螺旋体多价全菌死疫苗副作用大的缺点；3)本发明预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，是以基因工程技术一次性表达和提纯三种抗原融合的蛋白分子，故减少了制备环节而成本较低，有利于推广应用。
具体实施方式
序列表说明
序列1(SEQ ID NO：1)是问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1基因核苷酸和氨基酸序列(问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株购自北京中国药品生物制品检定所，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，lipL32/1基因去除信号肽序列及终止密码TAA)。
序列2(SEQ ID NO：2)是问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL21基因核苷酸和氨基酸序列(问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株购自北京中国药品生物制品检定所，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，lipL21基因去除信号肽序列及启动密码ATG和终止密码TAA)。
序列3(SEQ ID NO：3)是问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株ompL1/2基因核苷酸和氨基酸序列(问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株购自北京中国药品生物制品检定所，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，ompL1基因去除信号肽序列及及启动密码ATG)。
序列4(SEQ ID NO：4)是用于连接各目的基因的柔性肽序列(柔性肽序列为自行设计，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列)。
序列5(SEQ ID NO：5)是问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株人工融合lipL32/1-lip21-ompL1/2基因核苷酸和氨基酸序列(问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株购自北京中国药品生物制品检定所，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，下划横线区为柔性肽序列，有方框区为表达载体自行携带、用于Ni-NTA亲和层析提取重组融合抗原rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的8×His标签，*表示终止密码TAA)。
以下结合实施例进一步说明
实施例1、本实施例预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗是采用基因工程技术，首先分别获得lipL32/1、lipL21与ompL1/2基因克隆，然后采用相同的两条柔性肽序列分别连接问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1与lipL21基因、lipL21与ompL1/2基因，构建出同时含外膜脂蛋白LipL32/1、LipL21和穿膜蛋白OmpL1/2三种问号钩端螺旋体属特异性表面抗原的人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2，提纯的该表达系统的重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2作为疫苗抗原。
本发明预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗对抗原及其基因的选择依据：70％我国钩端螺旋体病例均为感染问号钩端螺旋体黄疸出血群所致，其余30％钩端螺旋体病例为感染问号钩端螺旋体流感伤寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日热群等所致。上述问号钩端螺旋体各血清群lipL32基因型均为lipL32/1型，问号钩端螺旋体黄疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日热群ompL1基因型为ompL1/2型，流感伤寒群、秋季群为ompL1/1型。然而，不同lipL32和ompL1基因型表达产物抗血清对我国15群15型问号钩端螺旋体参考标准株均有不同程度的交叉凝集。因此，黄疸出血群赖型赖株LipL32/1、LipL21和OmpL1/2可作为问号钩端螺旋体通用性三价基因重组新疫苗的抗原。
本发明预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗同时采用rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2三种蛋白抗原的理由是：增加抗原种类，更有效地刺激机体产生高效价抗体；增加抗体作用靶位，提高疫苗免疫保护效果。
本发明预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗采用rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合蛋白抗原的理由是：单一的rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2需分别构建相应的三个原核表达系统，分别三次诱导重组抗原表达和提纯，若将lipL32/1、lipL21和ompL1/2三个基因用柔性肽序列连接后成为一个lipL32/1-lipL21-ompL1/2融合基因，然后构建该融合基因原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2，可一次性表达和提纯同时含有rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2抗原的一个融合蛋白抗原分子rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2，减少了表达和提纯工序并由此降低了成本，同时抗原分子量增大可具有提高抗原性的效果。
本实施例预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗的抗原制备方法包含以下的步骤：1)问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因克隆和测序；2)lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)三价重组融合蛋白抗原rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达及提纯。
本实施例中的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株可从我国法定菌种保藏单位购得；本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。
上述问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆和测序的方法是：1)取用购自北京中国药品生物制品检定所的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株，问号钩端螺旋体拉丁文名是Leptospira interrogans(L.interrogans)；问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株接种于EMJH或含8％兔血清的柯氏液体培养基中，普通大气中28℃培养7～10天；12000转/分、4℃离心收集问号钩端螺旋体沉淀，悬浮于灭菌生理盐水问中，按上法反复离心、悬浮2次；2)分别取离心沉淀的问号钩端螺旋体，用苯酚(pH7.8-8.0)-氯仿(1∶1，V∶V)提取、0.1倍3mol乙酸钠和2倍体积无水乙醇沉淀获得基因组DNA；3)以问号钩端螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点Nde I和XhoI，PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒，30个循环；72℃10分钟；4)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；5)采用多家公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，根据其操作说明书，先提取目的DNA扩增条带；然后采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书，用T4DNA连接酶16℃作用12小时将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接，反应总体积20μl；6)取用可购自多家分子生物学试剂公司大肠杆菌DH5α株，大肠杆菌拉丁文名是Escherichia coli(E.coli)，该菌(E.coli DH5α)接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli DH5α；7)在上述100μl感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的X-gal溶液40μl、100mmol/L IPTG 20μl均匀涂布，37℃干燥30分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37℃培养24小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段lipL32/1、lipL21或ompL1/2后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2。
上述人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的制备方法是：1)上述含有重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2的E.coli DH5α分别在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，分别提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2；2)根据柔性肽(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser)核苷酸序列，设计分别扩增lipL32/1、lipL21或ompL1/2基因片段的引物，其中lipL32/1、lipL21基因下游引物含柔性肽正链序列，lipL21、ompL1/2基因上游引物含柔性肽负链序列，lipL32/1基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶Nde I位点，ompL1/2基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，各引物委托上海Invetrogen等专业公司合成，然后分别以重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因片段，PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒，30个循环；72℃10分钟；3)各PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认分别有lipL32/1、lipL21或ompL1/2基因扩增片段后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，按说明书操作，提纯各目的扩增片段后用紫外分光广度法测定各提取物DNA浓度；4)将100ng提纯的lipL32/1基因扩增片段和100ng提纯的lipL21基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数：94℃5分钟；94℃30秒、45℃30秒、72℃60秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成lipL32/1-lipL21复合模板，然后加入lipL32/1基因上游引物及lipL21基因下游引物进行PCR扩增(PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、50℃30秒、72℃120秒，30个循环；72℃10分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯lipL32/1-lipL21扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将100ng提纯的lipL32/1-lipL21扩增片段与100ng提纯的ompL1/2基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数：94℃5分钟；94℃30秒、45℃30秒、72℃60秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成lipL32/1-lipL21-ompL1/2复合模板，然后加入lipL32/1基因上游引物及ompL1/2基因下游引物进行PCR扩增(PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、50℃30秒、72℃150秒，30个循环；72℃15分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯lipL32/1-lipL21-ompL1/2扩增片段；6)采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书，用T4 DNA连接酶16℃作用12小时将提纯的lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段与克隆质粒如pUC-M-T连接，反应总体积20μl；6)E.coli DH5α接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli DH5α；7)在上述100μl感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的X-gal溶液40μl、100mmol/L IPTG 20μl均匀涂布，37℃干燥30分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37℃培养24小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为含人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段的重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2。
上述原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2的制备方法是：1)含有重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2的E.coli DH5α在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2；2)提取的质粒用8-16单位的限制性核酸内切酶Nde I和XhoI 37℃酶切12小时，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，切胶回收lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段；3)原核表达载体pET42a购自Novagen公司，用8-16单位的限制性核酸内切酶Nde I和XhoI 37℃酶切12小时，酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的pET42a，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，回收线性化pET42a片段；4)根据lipL32/1-lipL21-ompL1/2与线性化pET42a片段在琼脂糖凝胶中紫外线照射下的荧光强度估计其浓度，然后lipL32/1-lipL21-ompL1/2与线性化pET42a片段按3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶37℃连接12小时，反应总体积20μl；5)取用购自Novagen公司的大肠杆菌BL21DE3株(E.coli BL21DE3)，该菌接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli BL21DE3；6)在上述100μl感受态E.coli BL21DE3悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；7)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物，37℃培养24小时；8)挑取菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-ompL1。
上述重组表达产物rLipL32-LipL21-OmpL1的表达和提纯方法是：1)在LB液体培养液中接种E.coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-ompL1，30℃或37℃、300转/分旋转培养4小时，加入0.5mol/L的IPTG，按上述条件继续培养4～6小时；2)上述培养物5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀用超声破碎(电压300V，破碎3秒后间歇3秒，共200次)，采用多家公司均可提供的Ni-NTA亲和层析柱，根据说明书操作，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2羧基端8×His标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2。实验结果如下：1)E.coli BL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2能有效表达rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2，经SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测，rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量可达细菌总蛋白的36.5％；2)Ni-NTA亲和层析后rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2可达到电泳纯。
为证实目的重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的抗原性和免疫反应性，用rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原免疫家兔并检测其诱导血清特异性抗体产生情况；以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原，检测其与问号钩端螺旋体全菌兔抗血清(购自北京中国药品生物制品检定所)的免疫结合反应性。
目的重组表达产物rLipL32-LipL21-OmpL1的抗原性和免疫反应性佐剂活性实验分别描述如下：1)抗原性检测：选用体重2.5～3.0kg家兔，先将0.5ml含1mg rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与等量弗氏完全佐剂混合，背部皮内多点注射，间隔一周注射一次，共4次；末次注射后第10天，抽取免疫家兔心血、分离血清，以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原，用琼脂双扩散法鉴定血清中有无rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2特异性抗体及其效价；2)免疫反应性检测：以每孔50ng rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原、1∶500-10000稀释的问号钩端螺旋体全菌兔抗血清(购自北京中国药品生物制品检定所)为一抗、多家公司均可提供的1∶2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG为二抗，采用Western Blot检测rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫结合反应性。上述实验结果如下：1)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2免疫家兔后可产生特异性抗体，其琼脂双扩散法效价为1∶4；2)稀释度高达1∶5000的问号钩端螺旋体全菌抗体能识别rLipL32-LipL21-OmpL1并与之结合，形成明显的特异性黑褐色杂交条带。
实施例2、本实施例是将提纯的重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原与氢氧化铝为佐剂1∶10混合(W∶W)后成为预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗，通过金地鼠保护试验及免疫金地鼠血清特异性抗体检测，确定预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗通过皮下注射途径免疫金地鼠后，免疫金地鼠对抗不同血清群问号钩端螺旋体致死性感染的免疫保护效果及血清抗体效价。
本发明预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗中采用氢氧化铝作为佐剂的理由是：氢氧化铝是实际应用多年、安全而有明确效果的注射用佐剂。
本发明预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗采用皮下注射的理由是：问号钩端螺旋体侵入人体后引起钩端螺旋体血症，因此血清抗体是主要保护性抗体，采用皮下注射是诱导血清抗体产生的最为有效的途径。
本实施例预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗的金地鼠保护试验及血清特异性抗体检测包含以下的步骤：1)问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株对金地鼠(8～9周龄，120～150g体重)100％最低致死量的确定；2)预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗(rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝混合物)对金地鼠的免疫保护作用，即了解该疫苗免疫金地鼠对抗上述三种问号钩端螺旋体2倍100％最低致死量攻击后的存活率；3)攻击后存活的金地鼠血清抗体效价测定。
本实施例中的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株分别可从北京中国药品生物制品检定所及其它我国法定菌种保藏单位购得；实施例中所用的金地鼠可从多个国内大学、中国科学院、中国疾病预防控制中心、各省实验动物中心等单位购得，氢氧化铝和牛血清白蛋白等材料国内多家公司或国外公司国内代理商均可提供。在医学微生物学、实验动物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的实验方法并进行试用。
上述不同血清群问号钩端螺旋体对金地鼠100％最低致死量的测定方法是：1)问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株腹腔内接种金地鼠，感染2-3天后采集心血分离各群问号钩端螺旋体，在含8％兔血清的柯氏培养液中增菌，以达到问号钩端螺旋体增强毒力的效果；2)新鲜培养的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株15℃中12000转/分离心15分钟，收集沉淀的问号钩端螺旋体，用灭菌生理盐水悬浮，配制成不同浓度的问号钩端螺旋体悬液；3)每只金地鼠分别腹腔注射不同浓度不同问号钩端螺旋体悬液1ml，共6只，常规饲养条件下观察7天；4)以观察期限内所有金地鼠均死亡的最低问号钩端螺旋体浓度为该血清群问号钩端螺旋体100％最低致死剂量。上述实验结果如下：问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株100％最低致死剂量分别为1.5×108、3.0×109和1.5×109。
上述预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗对金地鼠免疫保护作用的测定方法是：1)按1∶10(W∶W)的比例，分别将rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝、牛血清白蛋白与氢氧化铝混合后形成两种混合物，一种混合物中含200μg/0.1ml的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2和2mg/0.1ml的氢氧化铝，另一种混合物含200μg/0.1ml的牛血清白蛋白和2mg/0.1ml的氢氧化铝；3)将金地鼠分成1-6组，每组12只，第1～3组于一侧腹股沟皮下注射rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝混合物0.1ml，第4～6组于一侧腹股沟皮下注射牛血清白蛋白与氢氧化铝混合物0.1ml；两周后第1～3组、第4～6组在另一侧腹股沟皮下注射与第一次成分、剂量完全相同的混合物；4)末次注射后第四周，第1和第4组金地鼠腹腔注射2倍100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株(3.0×108)悬液1ml，第2组和第5组金地鼠腹腔注射2倍100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体流感伤寒群临型临6株(6.0×109)悬液1ml，第3组和第6组金地鼠腹腔注射2倍100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体波摩那群波摩那型罗株(3.0×109/ml)悬液1ml；5)上述金地鼠常规饲养条件下观察7天，记录各组死亡情况。实验结果见表1。
表1钩端螺旋体病通用型三价基因重组疫苗金地鼠免疫保护试验结果
Figure BSA00000151696400101
上述预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗免疫金地鼠经问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群临型临6株、波摩那群波摩那型罗株1/2倍的100％最低致死剂量攻击后存活者的血清抗体效价测定方法是：1)按1∶10(W∶W)的比例，分别将rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝形成混合物，该混合物中含200μg/0.1ml的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2和2mg/0.1ml的氢氧化铝；2)将金地鼠分成3组，每组12只，各组于一侧腹股沟皮下注射rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝混合物0.1ml，两周后另一侧腹股沟皮下注射与第一次成分、剂量完全相同的混合物；3)末次注射后第四周，第1组金地鼠腹腔注射1/2倍的100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株(0.75×108)悬液1ml，第2组金地鼠腹腔注射1/2倍的100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体流感伤寒群临型临6株(1.5×109)悬液1ml，第3组金地鼠腹腔注射1/2倍的100％最低致死剂量的问号钩端螺旋体波摩那群波摩那型罗株(0.75×109/ml)悬液1ml；4)上述金地鼠常规饲养条件下观察7天，第8天采集各存活金地鼠心血2ml、分离血清；5)采用显微镜凝集试验检测血清中特异性凝集抗体，先将各血清用生理盐水进行对倍稀释(1∶50～1∶1600)，取0.1ml各稀释血清与0.1ml我国15群15型问号钩端螺旋体参考标准株新鲜培养物混合，37℃震荡孵育1小时，然后在400倍暗视野显微镜下观察问号钩端螺旋体凝集情况，以引起50％问号钩端螺旋体凝集的血清最高稀释度为效价判断标准。上述实验结果见表2。
表2问号钩端螺旋体通用型三价基因重组疫苗免疫金地鼠显微镜凝集试验结果
Figure BSA00000151696400111
序列表
<110>严杰
<120>预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>1
<211>核苷酸762，氨基酸254
<212>DNA/PRT
<213>问号钩端螺旋体种(Leptospira interrogans)
<220>
<221>黄疸出血群赖型赖株lipL32/1基因核苷酸序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(762)，氨基酸序列(1)…(254)
<400>1
 
ATG tgt ggt gct ttc ggt ggt ctg cca agc cta aaa agc tct ttt gtt 48
Met Cys Gly Ala Phe Gly Gly Leu Pro Ser Leu Lys Ser Ser Phe Val 16
1               5                   10                  15
ctg agc gag gac aca atc cca ggg aca aac gaa acc gta aaa acg tta 96
Leu Ser Glu Asp Thr Ile Pro Gly Thr Asn Glu Thr Val Lys Thr Leu 32
            20                  25                  30
ctt ccc tac gga tct gtg atc aac tat tac gga tac gta aag cca gga 144
Leu Pro Tyr Gly Ser Val Ile Asn Tyr Tyr Gly Tyr Val Lys Pro Gly 48
        35                  40                  45
caa gcg ccg gac ggt tta gtc gat gga aac aaa aaa gca tac tat ctc 192
Gln Ala Pro Asp Gly Leu Val Asp Gly Asn Lys Lys Ala Tyr Tyr Leu 64
50                  55                  60
tat gtt tgg att cct gcc gta atc gct gaa atg gga gtt cgt atg att 240
Tyr Val Trp Ile Pro Ala Val Ile Ala Glu Met Gly Val Arg Met Ile 80
65                  70                  75                  80
tcc cca aca ggc gaa atc ggt gaa cca ggc gac gga gac tta gta agc 288
Ser Pro Thr Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gly Asp Gly Asp Leu Val Ser 96
                85                  90                  95
gac gct ttc aaa gcg gct acc cca gaa gaa aaa tca atg cca cat tgg 336
Asp Ala Phe Lys Ala Ala Thr Pro Glu Glu Lys Ser Met Pro His Trp 112
            100                 105                 110
ttt gat act tgg atc cgt gta gaa aga atg tcg gcg att atg cct gac 384
Phe Asp Thr Trp Ile Arg Val Glu Arg Met Ser Ala Ile Met Pro Asp 128
        115                 120                 125
caa atc gCc aaa gct gcg aaa gca aaa ccA gtt caa aaa ttg gac gat 432
Gln Ile Ala Lys Ala Ala Lys Ala Lys Pro Val Gln Lys Leu Asp Asp 144
    130                 135                 140
GAT GAT GAT GGT GAC GAT ACT TAT AAA GAA GAG AGA CAC AAC AAG TAC 480
Asp Asp Asp Gly Asp Asp Thr Tyr Lys Glu Glu Arg His Asn Lys Tyr 160
145                 150                 155                 160
AAC TCT CTT ACT AGA ATC AAG ATC CCT AAT CCT CCA AAA TCT TTT GAC 528
Asn Ser Leu Thr Arg Ile Lys Ile Pro Asn Pro Pro Lys Ser Phe Asp 176
                165                 170                 175
GAT CTG AAA AAC ATC GAC ACT AAA AAA CTT TTA GTA AGA GGT CTT TAC 576
Asp Leu Lys Asn Ile Asp Thr Lys Lys Leu Leu Val Arg Gly Leu Tyr 192
            180                 185                 190
AGA ATT TCT TTC ACT ACC TAC AAA CCA GGT GAA GTG AAA GGA TCT TTC 624
Arg Ile Ser Phe Thr Thr Tyr Lys Pro Gly Glu Val Lys Gly Ser Phe 208
        195                 200                 205
GTT GCA TCT GTT GGT CTG CTT TTC CCA CCA GGT ATT CCA GGT GTG AGC 672
Val Ala Ser Val Gly Leu Leu Phe Pro Pro Gly Ile Pro Gly Val Ser 224
    210                 215                 220
CCG CTG ATC CAC TCA AAT CCT GAA GAA TTG CAA AAA CAA GCT ATC GCT 720
Pro Leu Ile His Ser Asn Pro Glu Glu Leu Gln Lys Gln Ala Ile Ala 240
225                 230                 235                 240
GCT GAA GAG TCA TTG AAA AAA GCT GCT TCT GAC GCG ACT AAG         762
Ala Glu Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ala Ser Asp Ala Thr Lys         254
                245                 250
 
<110>严杰
<120>预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>2
<211>核苷酸507，氨基酸169
<212>DNA/PRT
<213>问号钩端螺旋体种(Leptospira interrogans)
<220>
<221>黄疸出血群赖型赖株lipL21基因核苷酸序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(507)，氨基酸序列(1)…(169)
 
<400>1
TGC AGC AGC ACC GAT ACC GGC CAG AAA GAT GCG ACC ACC GTG GGC GAT 48
Cys Ser Ser Thr Asp Thr Gly Gln Lys Asp Ala Thr Thr Val Gly Asp 16
1               5                   10                  15
GGC GGC TGG ACC TTT GAA GGC TGG GGC GGC CCG CCG GAA CAG CGC AAC 96
Gly Gly Trp Thr Phe Glu Gly Trp Gly Gly Pro Pro Glu Gln Arg Asn 32
            20                  25                  30
GAT GGC AAA ACC CCG CGT GAT ACC AAC CCG AAA GAT TGG TAT TAT ATT 144
Asp Gly Lys Thr Pro Arg Asp Thr Asn Pro Lys Asp Trp Tyr Tyr Ile 48
        35                  40                  45
AAA TTT AGC AGC CGT GCG AGC GGC AAA GCG GTG GCG AAA AAA AGC CAG 192
Lys Phe Ser Ser Arg Ala Ser Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Ser Gln 64
    50                  55                  60
GCG ATG ATG CAG AGC ACC TGC CGC GAA GCG AGC CGC CTG CAG GGC GCG 240
Ala Met Met Gln Ser Thr Cys Arg Glu Ala Ser Arg Leu Gln Gly Ala 80
65                  70                  75                  80
AGC GAT GTG GTG AAA AAA ATG GTG GGC GAA ACC GTG GAA AGC GCG AGC 288
Ser Asp Val Val Lys Lys Met Val Gly Glu Thr Val Glu Ser Ala Ser 96
                85                  90                  95
GGC GTG AGC GAT GGC GAA GCG ACC GCG AGC GTG ATT GTG AGC CAG AGC 336
Gly Val Ser Asp Gly Glu Ala Thr Ala Ser Val lle Val Ser Gln Ser 112
            100                 105                 110
CAG GGC GTG GTG AAA GGC GTG GGC GTG TAT GAA TGC AAA GCG ACC GGC 384
Gln Gly Val Val Lys Gly Val Gly Val Tyr Glu Cys Lys Ala Thr Gly 128
        115                 120                 125
AGC GGC AGC GAT CCG AAA GAT GTG AGC AAA GAT AAC TGG GAA GAA TGC 432
Ser Gly Ser Asp Pro Lys Asp Val Ser Lys Asp Asn Trp Glu Glu Cys 144
    130                 135                 140
CAG TGC GTG ATT TAT GCG AAA TTT CCG GGC GGC AAA GAT GCG CTG GTG 480
Gln Cys Val Ile Tyr Ala Lys Phe Pro Gly Gly Lys Asp Ala Leu Val 160
145                 150                 155                 160
GCG AAA GCG CAG GAA GTG AGC AAA CAG                             507
Ala Lys Ala Gln Glu Val Ser Lys Gln                             169
                165
 
<110>严杰
<120>预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>3
<211>核苷酸888，氨基酸296
<212>DNA/PRT
<213>问号钩端螺旋体种(Leptospira interrogans)
<220>
<221>黄疸出血群赖型赖株ompL1/2基因核苷酸序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(888)，氨基酸序列(1)…(296)
 
<400>1
AAA ACA TAT GCA ATT GTA GGA TTT GGG TTA CAG TTA GAC CTA GGA CAA 48
Lys Thr Tyr Ala Ile Val Gly Phe Gly Leu Gln Leu Asp Leu Gly Gln 16
1               5                   10                  15
TTA GGA GGA ACC ATC ACC AAA GAC GGT TTA GAC GCT GCC ACT CAT TAT 96
Leu Gly Gly Thr Ile Thr Lys Asp Gly Leu Asp Ala Ala Thr His Tyr 32
            20                  25                  30
GGA CCA GTT CGA TCG TCC AAT ACC TGC ACC GTA GGT CCA AGT GAT CCT 144
Gly Pro Val Arg Ser Ser Asn Thr Cys Thr Val Gly Pro Ser Asp Pro 48
        35                  40                  45
GCT TGT TTT CAA AAC CCA GCA AAA CCT ACA GGT GAA GGA AAT TAT ATA 192
Ala Cys Phe Gln Asn Pro Ala Lys Pro Thr Gly Glu Gly Asn Tyr Ile 64
    50                  55                  60
GGA GTT GCT CCT AGA AAA GCG ATT CCT GCT GAA AAC AGA TTA ATC ACC 240
Gly Val Ala Pro Arg Lys Ala Ile Pro Ala Glu Asn Arg Leu Ile Thr 80
65                  70                  75                  80
CTT GAT AGA ACC ACT GGT GGT GCC ATC AAT GCA AGA AGC ACT AAA GGC 288
Leu Asp Arg Thr Thr Gly Gly Ala Ile Asn Ala Arg Ser Thr Lys Gly 96
                85                  90                  95
GCC ATG GTC GGA GGA AAT TTG ATG GTA GGT TAT GAG TCC GAC TTT GGT 336
Ala Met Val Gly Gly Asn Leu Met Val Gly Tyr Glu Ser Asp Phe Gly 112
            100                 105                 110
AAA TAT TTT TTC TGG AGA GTT GCT GCA GAA TAT ACT CAA AAA ATT TCC 384
Lys Tyr Phe Phe Trp Arg Val Ala Ala Glu Tyr Thr Gln Lys Ile Ser 128
        115                 120                 125
GGA GGC GTT ACA AAG GCG GAC ATC GCT GGT TAT AAT ATT GTA GAT ATG 432
Gly Gly Val Thr Lys Ala Asp Ile Ala Gly Tyr Asn Ile Val Asp Met 144
    130                 135                 140
ACC TGG GGT TTT AGT TCT ATC GTC ATT CCT GCA ACC GTT GGT ATC AAA 480
Thr Trp Gly Phe Ser Ser Ile Val Ile Pro Ala Thr Val Gly Ile Lys 160
145                 150                 155                 160
TTG AAT GTT ACT GAA GAC GCT GCA ATA TAT ATG GGA GCA GGT TTA AAC 528
Leu Asn Val Thr Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Met Gly Ala Gly Leu Asn 176
                165                 170                 175
TAT TTC AAT GGT GGA TGG AGT TTA AAT GGA TCT AAC AAT ATC AAA GGT 576
Tyr Phe Asn Gly Gly Trp Ser Leu Asn Gly Ser Asn Asn Ile Lys Gly 192
            180                 185                 190
GGT TAC GAT ATT TTA ACT GCA GCG GGA GCG GGA GCT GTT GCG AAT TTA 624
Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Ala Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Asn Leu 208
        195                 200                 205
CTG AGC GAT GGA ACC GAT CCA GTA ACT ACT CGT GAA CAC GTT CGA TTT 671
Leu Ser Asp Gly Thr Asp Pro Val Thr Thr Arg Glu His Val Arg Phe 224
    210                 215                 220
AGA ACT TCT GGA ATT GCT CCT AAC TTT TTA ATT GGA ACT CAG GCC AGA 720
Arg Thr Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Leu Ile Gly Thr Gln Ala Arg 240
225                 230                 235                 240
GTA ACC GAT AAA GGG CAC GTT TTC ATT GAA TTA GAA ACG ATC ATG TCT 768
Val Thr Asp Lys Gly His Val Phe Ile Glu Leu Glu Thr Ile Met Ser 256
                245                 250                 255
GCT GCG TAT GCA GTT GGT AAA ACT CAA TCT GTT GGA GGA GCT ACG AAC 816
Ala Ala Tyr Ala Val Gly Lys Thr Gln Ser Val Gly Gly Ala Thr Asn 272
            260                 265                 270
CTT TCT CCT TTT CCA GCA TAT CCG ATC GTT GTC GGT GGG CAA ATC TAC 864
Leu Ser Pro Phe Pro Ala Tyr Pro Ile Val Val Gly Gly Gln Ile Tyr 288
        275                 280                 285
AGA TTC GGT TAT AAA CAC GAA CTC                                 888
Arg Phe Gly Tyr Lys His Glu Leu                                 296
    290                 295
<110>严杰
<120>预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>4
<211>核苷酸45，氨基酸15
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列(1)…(45)，氨基酸序列(1)…(15)
<223>用于连接问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1基因、lipL21基因和ompL1/2基因的柔性肽核苷酸序列和氨基酸序列
 
<400>1
GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC     45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser     15
1               5                   10                  15
<110>严杰
<120>预防钩端螺旋体病的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>5
<211>核苷酸2271，氨基酸757
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列(1)…(2271)，氨基酸序列(1)…(757)
<223>用柔性肽序列连接而成的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株lipL32/1基因、lipL21基因和ompL1/2基因的人工融合基因核苷酸序列和氨基酸序列
 
<400>1
ATG TGT GGT GCT TTC GGT GGT CTG CCA AGC CTA AAA AGC TCT TTT GTT 48
Met Cys Gly Ala Phe Gly Gly Leu Pro Ser Leu Lys Ser Ser Phe Val 16
1               5                   10                  15
CTG AGC GAG GAC ACA ATC CCA GGG ACA AAC GAA ACC GTA AAA ACG TTA 96
Leu Ser Glu Asp Thr Ile Pro Gly Thr Asn Glu Thr Val Lys Thr Leu 32
            20                  25                  30
CTT CCC TAC GGA TCT GTG ATC AAC TAT TAC GGA TAC GTA AAG CCA GGA 144
Leu Pro Tyr Gly Ser Val Ile Asn Tyr Tyr Gly Tyr Val Lys Pro Gly 48
        35                  40                  45
CAA GCG CCG GAC GGT TTA GTC GAT GGA AAC AAA AAA GCA TAC TAT CTC 192
Gln Ala Pro Asp Gly Leu Val Asp Gly Asn Lys Lys Ala Tyr Tyr Leu 64
    50                  55                  60
TAT GTT TGG ATT CCT GCC GTA ATC GCT GAA ATG GGA GTT CGT ATG ATT 240
Tyr Val Trp Ile Pro Ala Val Ile Ala Glu Met Gly Val Arg Met Ile 80
65                  70                  75                  80
TCC CCA ACA GGC GAA ATC GGT GAA CCA GGC GAC GGA GAC TTA GTA AGC 288
Ser Pro Thr Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gly Asp Gly Asp Leu Val Ser 96
                85                  90                  95
GAC GCT TTC AAA GCG GCT ACC CCA GAA GAA AAA TCA ATG CCA CAT TGG 336
Asp Ala Phe Lys Ala Ala Thr Pro Glu Glu Lys Ser Met Pro His Trp 112
            100                 105                 110
TTT GAT ACT TGG ATC CGT GTA GAA AGA ATG TCG GCG ATT ATG CCT GAC 384
Phe Asp Thr Trp Ile Arg Val Glu Arg Met Ser Ala Ile Met Pro Asp 128
        115                 120                 125
CAA ATC GCC AAA GCT GCG AAA GCA AAA CCA GTT CAA AAA TTG GAC GAT 432
Gln Ile Ala Lys Ala Ala Lys Ala Lys Pro Val Gln Lys Leu Asp Asp 144
    130                 135                 140
GAT GAT GAT GGT GAC GAT ACT TAT AAA GAA GAG AGA CAC AAC AAG TAC 480
Asp Asp Asp Gly Asp Asp Thr Tyr Lys Glu Glu Arg His Asn Lys Tyr 160
145                 150                 155                 160
AAC TCT CTT ACT AGA ATC AAG ATC CCT AAT CCT CCA AAA TCT TTT GAC 528
Asn Ser Leu Thr Arg Ile Lys Ile Pro Asn Pro Pro Lys Ser Phe Asp 176
                165                 170                 175
GAT CTG AAA AAC ATC GAC ACT AAA AAA CTT TTA GTA AGA GGT CTT TAC 576
Asp Leu Lys Asn Ile Asp Thr Lys Lys Leu Leu Val Arg Gly Leu Tyr 192
            180                 185                 190
AGA ATT TCT TTC ACT ACC TAC AAA CCA GGT GAA GTG AAA GGA TCT TTC 624
Arg Ile Ser Phe Thr Thr Tyr Lys Pro Gly Glu Val Lys Gly Ser Phe 208
        195                 200                 205
GTT GCA TCT GTT GGT CTG CTT TTC CCA CCA GGT ATT CCA GGT GTG AGC 672
Val Ala Ser Val Gly Leu Leu Phe Pro Pro Gly Ile Pro Gly Val Ser 224
    210                 215                 220
CCG CTG ATC CAC TCA AAT CCT GAA GAA TTG CAA AAA CAA GCT ATC GCT 720
Pro Leu Ile His Ser Asn Pro Glu Glu Leu Gln Lys Gln Ala Ile Ala 240
225                 230                 235                 240
GCT GAA GAG TCA TTG AAA AAA GCT GCT TCT GAC GCG ACT AAG GGC GGC 768
Ala Glu Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ala Ser Asp Ala Thr Lys Gly Gly 256
                245                 250                 255
GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC TGC AGC AGC 816
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Ser 272
            260                 265                 270
ACC GAT ACC GGC CAG AAA GAT GCG ACC ACC GTG GGC GAT GGC GGC TGG 864
Thr Asp Thr Gly Gln Lys Asp Ala Thr Thr Val Gly Asp Gly Gly Trp 288
        275                 280                 285
ACC TTT GAA GGC TGG GGC GGC CCG CCG GAA CAG CGC AAC GAT GGC AAA 912
Thr Phe Glu Gly Trp Gly Gly Pro Pro Glu Gln Arg Asn Asp Gly Lys 304
    290                 295                 300
ACC CCG CGT GAT ACC AAC CCG AAA GAT TGG TAT TAT ATT AAA TTT AGC 960
Thr Pro Arg Asp Thr Asn Pro Lys Asp Trp Tyr Tyr Ile Lys Phe Ser 320
305                 310                 315                 320
AGC CGT GCG AGC GGC AAA GCG GTG GCG AAA AAA AGC CAG GCG ATG ATG 1008
Ser Arg Ala Ser Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Ser Gln Ala Met Met 336
                325                 330                 335
CAG AGC ACC TGC CGC GAA GCG AGC CGC CTG CAG GGC GCG AGC GAT GTG 1056
Gln Ser Thr Cys Arg Glu Ala Ser Arg Leu Gln Gly Ala Ser Asp Val 352
            340                 345                 350
GTG AAA AAA ATG GTG GGC GAA ACC GTG GAA AGC GCG AGC GGC GTG AGC 1104
Val Lys Lys Met Val Gly Glu Thr Val Glu Ser Ala Ser Gly Val Ser 368
        355                 360                 365
GAT GGC GAA GCG ACC GCG AGC GTG ATT GTG AGC CAG AGC CAG GGC GTG 1152
Asp Gly Glu Ala Thr Ala Ser Val Ile Val Ser Gln Ser Gln Gly Val 384
    370                 375                 380
GTG AAA GGC GTG GGC GTG TAT GAA TGC AAA GCG ACC GGC AGC GGC AGC 1200
Val Lys Gly Val Gly Val Tyr Glu Cys Lys Ala Thr Gly Ser Gly Ser 400
385                 390                 395                 400
GAT CCG AAA GAT GTG AGC AAA GAT AAC TGG GAA GAA TGC CAG TGC GTG 1248
Asp Pro Lys Asp Val Ser Lys Asp Asn Trp Glu Glu Cys Gln Cys Val 416
                405                 410                 415
ATT TAT GCG AAA TTT CCG GGC GGC AAA GAT GCG CTG GTG GCG AAA GCG 1296
Ile Tyr Ala Lys Phe Pro Gly Gly Lys Asp Ala Leu Val Ala Lys Ala 432
            420                 425                 430
CAG GAA GTG AGC AAA CAG GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC 1344
Gln Glu Val Ser Lys Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 448
        435                 440                 445
GGC GGC GGT GGC AGC AAA ACA TAT GCA ATT GTA GGA TTT GGG TTA CAG 1392
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Ile Val Gly Phe Gly Leu Gln 464
    450                 455                 460
TTA GAC CTA GGA CAA TTA GGA GGA ACC ATC ACC AAA GAC GGT TTA GAC 1440
Leu Asp Leu Gly Gln Leu Gly Gly Thr Ile Thr Lys Asp Gly Leu Asp 480
465                 470                 475                 480
GCT GCC ACT CAT TAT GGA CCA GTT CGA TCG TCC AAT ACC TGC ACC GTA 1488
Ala Ala Thr His Tyr Gly Pro Val Arg Ser Ser Asn Thr Cys Thr Val 496
                485                 490                 495
GGT CCA AGT GAT CCT GCT TGT TTT CAA AAC CCA GCA AAA CCT ACA GGT 1536
Gly Pro Ser Asp Pro Ala Cys Phe Gln Asn Pro Ala Lys Pro Thr Gly 512
            500                 505                 510
GAA GGA AAT TAT ATA GGA GTT GCT CCT AGA AAA GCG ATT CCT GCT GAA 1584
Glu Gly Asn Tyr Ile Gly Val Ala Pro Arg Lys Ala Ile Pro Ala Glu 528
        515                 520                 525
AAC AGA TTA ATC ACC CTT GAT AGA ACC ACT GGT GGT GCC ATC AAT GCA 1632
Asn Arg Leu Ile Thr Leu Asp Arg Thr Thr Gly Gly Ala Ile Asn Ala 544
    530                 535                 540
AGA AGC ACT AAA GGC GCC ATG GTC GGA GGA AAT TTG ATG GTA GGT TAT 1680
Arg Ser Thr Lys Gly Ala Met Val Gly Gly Asn Leu Met Val Gly Tyr 560
545                 550                 555                 560
GAG TCC GAC TTT GGT AAA TAT TTT TTC TGG AGA GTT GCT GCA GAA TAT 1728
Glu Ser Asp Phe Gly Lys Tyr Phe Phe Trp Arg Val Ala Ala Glu Tyr 576
                565                 570                 575
ACT CAA AAA ATT TCC GGA GGC GTT ACA AAG GCG GAC ATC GCT GGT TAT 1776
Thr Gln Lys Ile Ser Gly Gly Val Thr Lys Ala Asp Ile Ala Gly Tyr 592
            580                 585                 590
AAT ATT GTA GAT ATG ACC TGG GGT TTT AGT TCT ATC GTC ATT CCT GCA 1824
Asn Ile Val Asp Met Thr Trp Gly Phe Ser Ser Ile Val Ile Pro Ala 608
        595                 600                 605
ACC GTT GGT ATC AAA TTG AAT GTT ACT GAA GAC GCT GCA ATA TAT ATG 1872
Thr Val Gly Ile Lys Leu Asn Val Thr Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Met 624
    610                 615                 620
GGA GCA GGT TTA AAC TAT TTC AAT GGT GGA TGG AGT TTA AAT GGA TCT 1920
Gly Ala Gly Leu Asn Tyr Phe Asn Gly Gly Trp Ser Leu Asn Gly Ser 640
625                 630                 635                 640
AAC AAT ATC AAA GGT GGT TAC GAT ATT TTA ACT GCA GCG GGA GCG GGA 1968
Asn Asn Ile Lys Gly Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Ala Ala Gly Ala Gly 656
                645                 650                 655
GCT GTT GCG AAT TTA CTG AGC GAT GGA ACC GAT CCA GTA ACT ACT CGT 2016
Ala Val Ala Asn Leu Leu Ser Asp Gly Thr Asp Pro Val Thr Thr Arg 672
           660                 665                 670
GAA CAC GTT CGA TTT AGA ACT TCT GGA ATT GCT CCT AAC TTT TTA ATT 2064
Glu His Val Arg Phe Arg Thr Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Leu Ile 688
        675                 680                 685
GGA ACT CAG GCC AGA GTA ACC GAT AAA GGG CAC GTT TTC ATT GAA TTA 2112
Gly Thr Gln Ala Arg Val Thr Asp Lys Gly His Val Phe Ile Glu Leu 704
    690                 695                 700
GAA ACG ATC ATG TCT GCT GCG TAT GCA GTT GGT AAA ACT CAA TCT GTT 2160
Glu Thr Ile Met Ser Ala Ala Tyr Ala Val Gly Lys Thr Gln Ser Val 720
705                 710                 715                 720
GGA GGA GCT ACG AAC CTT TCT CCT TTT CCA GCA TAT CCG ATC GTT GTC 2208
Gly Gly Ala Thr Asn Leu Ser Pro Phe Pro Ala Tyr Pro Ile Val Val 736
                725                 730                 735
GGT GGG CAA ATC TAC AGA TTC GGT TAT AAA CAC GAA CTC CAC CAC CAC 2256
Gly Gly Gln Ile Tyr Arg Phe Gly Tyr Lys His Glu Leu His His His 752
            740                 745                 750
CAC CAC CAC CAC CAC                                             2271
His His His His His                                             757
        755

Claims (9)

1.预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的柔性肽序列如SEQ ID NO：4所示。
3.预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制备方法，以问号钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32/1、LipL21和穿膜蛋白OmpL1/2为抗原，采用基因工程技术构建lipL32/1、lipL21和ompL1/2的人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2及其原核表达系统，采用提纯的同时含三种不同蛋白分子重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原的问号钩端螺旋体基因工程疫苗。
4.根据权利要求3所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制备方法，包含以下的步骤：1)问号钩端螺旋体lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆和测序；2)lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导三价重组蛋白抗原分子rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2；5)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝(alum)混合后组成可注射疫苗剂型。
5.根据权利要求4所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于：所说的融合基因rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝混合液直接制备成注射液。
6.根据权利要求4或5所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于问号钩端螺旋体lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆方法是：1)取用问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株，将其接种、培养后离心收集问号钩端螺旋体沉淀；2)分别取离心沉淀的问号钩端螺旋体，用苯酚、-氯仿、提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA；3)以问号钩端螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点Nde I和XhoI；4)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；5)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4 DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；6)取用大肠杆菌DH5α株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；7)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；9)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行Nde I和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段lipL32/1、lipL21或ompL1/2后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2。
7.根据权利要求6所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于上述人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的制备方法是：1)上述含有重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2的E.coli DH5α分别在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，分别提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2；2)根据柔性肽核苷酸序列，设计分别扩增lipL32/1、lipL21或ompL1/2基因片段的引物，其中lipL32/1、lipL21基因下游引物含柔性肽正链序列，lipL21、ompL1/2基因上游引物含柔性肽负链序列，lipL32/1基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶Nde I位点，ompL1/2基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，然后分别以重组质粒pUC-M-TlipL32/1、pUC-M-TlipL21或pUC-M-TompL1/2为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因片段；3)各PCR产物经电泳分离后，在紫外线下确认分别有lipL32/1、lipL21或ompL1/2基因扩增片段后，采用PCR产物纯化试剂盒，提纯各目的扩增片段后测定各提取物DNA浓度；4)将提纯的lipL32/1基因扩增片段和提纯的lipL21基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成lipL32/1-lipL21复合模板，然后加入lipL32/1基因上游引物及lipL21基因下游引物进行PCR扩增；按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯lipL32/1-lipL21扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将提纯的lipL32/1-lipL21扩增片段与提纯的ompL1/2基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成lipL32/1-lipL21-ompL1/2复合模板，然后加入lipL32/1基因上游引物及ompL1/2基因下游引物进行PCR扩增，按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯lipL32/1-lipL21-ompL1/2扩增片段；6)采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段与重组质粒连接，获得连接产物；6)E.coli DH5α接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；7)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，混匀后加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上分别用X-gal溶液、IPTG均匀涂布，然后涂布接种上述SOC培养物培养、观察；9)选取SOC培养物上的白色菌落在LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2后，测定克隆片段的核苷酸序列；序列正确者即为含人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段的重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2。
8.根据权利要求7所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于上述原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2的制备方法是：1)含有重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2的E.coli DH5α在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TlipL32/1-lipL21-ompL1/2；2)提取的质粒用限制性核酸内切酶Nde I和XhoI酶切，酶切产物经电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2后，采用DNA胶回收试剂盒，切胶回收lipL32/1-lipL21-ompL1/2片段；3)原核表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和XhoI酶切，酶切产物用电泳分离线性化的pET42a，采用DNA胶回收试剂盒，回收线性化pET42a片段；4)根据lipL32/1-lipL21-ompL1/2与线性化pET42a片段估计浓度，然后lipL32/1-lipL21-ompL1/2与线性化pET42a片段按3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶连接，获得连接产物；5)取用大肠杆菌BL21DE3株，接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli BL21DE3悬液；6)在上述感受态悬液中加入上述连接产物，再加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物培养；8)挑取SOC培养物上的菌落在LB培养液中培养4-6，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段lipL32/1-lipL21-ompL1/2，测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-ompL1。
9.根据权利要求8所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于上述重组表达产物rLipL32-LipL21-OmpL1的表达和提纯方法是：1)在LB液体培养液中接种E.coliBL21DE3pET42a-lipL32-lipL21-ompL1培养，加入IPTG继续培养；2)上述培养物离心、收集细菌沉淀用超声破碎，采用Ni-NTA亲和层析柱，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2羧基端8×His标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2。
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