KR20130109220A - 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법 - Google Patents

1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20130109220A
KR20130109220A KR1020137019872A KR20137019872A KR20130109220A KR 20130109220 A KR20130109220 A KR 20130109220A KR 1020137019872 A KR1020137019872 A KR 1020137019872A KR 20137019872 A KR20137019872 A KR 20137019872A KR 20130109220 A KR20130109220 A KR 20130109220A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bvdv
virus
challenge
bovine
calves
Prior art date
Application number
KR1020137019872A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101554080B1 (ko
Inventor
데일 웨이드 와이즈
제임스 로버트 해리스
Original Assignee
일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45531546&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20130109220(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 일라이 릴리 앤드 캄파니 filed Critical 일라이 릴리 앤드 캄파니
Publication of KR20130109220A publication Critical patent/KR20130109220A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101554080B1 publication Critical patent/KR101554080B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

변형된 생 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV-1b)를 포함하는 면역원성 조성물, 및 치료 및 예방 약제의 제제화 및 투여에서의 이의 사용 방법이 개시된다. 특히, 본 발명은 예를 들어 수송열, 소 복합성 호흡기 질환, 및/또는 소 바이러스성 설사를 일으키는 감염이 포함되는 바이러스 또는 미생물 감염 또는 이의 하나 이상의 증상을, 특히 감수성 동물 또는 감염된 동물에서 예방, 치료, 관리 및/또는 호전시키기 위한 면역원성 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

1B형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법 {BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS TYPE 1B VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS}
발명의 배경
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 발명의 명칭이 "다가 수송열 백신의 바이러스성 성분을 확인 및 구별하기 위한 조성물 및 방법 {Compositions and Methods for Identifying and Differentiating Viral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines}"인 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 일련 번호 61/427,404 (본 출원과 함께 2010년 12월 27일에 출원되었고, 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함됨)에 관련된다.
연방 정부의 후원을 받은 연구 또는 개발에 관한 언급
적용가능하지 않음.
공동 연구 협정에 대한 관계자의 성명
적용가능하지 않음.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 수의학 및 동물 백신 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 면역원성 조성물, 이같은 조성물의 제조 방법, 및 미생물 또는 바이러스 감염 또는 이의 증상, 특히 소 복합성 호흡기 질환 (BRDC)과 같은 다인성 질환이 포함되는 포유동물 가축에서의 호흡기 감염의 예방, 치료, 호전 및/또는 관리 방법에 관한 것이다. 항원성 조성물, 및 페스티바이러스 감염, 특히 감수성 동물 또는 감염된 동물에서의 수송열, BRDC 및 소 바이러스성 설사를 초래하거나 이에 연루된 페스티바이러스의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 호전을 위한 예방제 및 치료제의 제제화 및 투여에서의 상기 조성물의 사용 방법이 개시된다.
관련 기술의 설명
BRDC는 거래 경로 및 목적 방목장 또는 사육장에서 육성우(stocker)/비육우(feeder) 송아지를 빈번하게 괴롭히는 복합성 다인성 질환이다. 이러한 질환의 주요 박테리아 병인체는 만헤이미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 히스토필루스 솜니(Histophilus somni) (기존의 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus)) 및 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis)이다. 수송열과 연관된 바이러스 병인체는 1형 소 헤르페스바이러스 1 (BHV-1), 파라인플루엔자 3 (PI3), 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV) 및 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)이다.
소 바이러스성 설사 바이러스 ( BVDV )
현재 BVDV는 복합성 소 호흡기 질환 (BRDC) (종종 통상적으로 "수송열"로서 지칭됨)에서 중요한 병인체로서 인식된다. 모든 연령의 소 (수유 중인 송아지 포함)을 감염시키는 이러한 질환은 가쁜 호흡, 기침, 우울증, 식욕 상실, 눈 및 코 배출물, 및 체온 상승을 특징으로 한다. 급성 돌발 시에, 증상 개시로부터 24시간 이내에 사망이 이어질 수 있다. 항바이러스 치료학의 부재를 고려할 때 BVDV 치료는 문제가 있고, 페스티바이러스 감염으로부터의 사망률이 높다. 더욱이, BRDC에서 수반되는 박테리아 병원체의 치료는 치료 약물에 대한 항미생물 저항성으로 인해 다수의 경우에 또한 복합적이다.
소 바이러스성 설사 바이러스는 표현형 (예를 들어, 문헌 [Baker, 1995] 참조) (세포변성 또는 비-세포변성), 및 유전자형 (예를 들어, 문헌 [Ridpath et al., 1994]; [Vilcek et al., 2001]; 및 [Flores et al., 2002] 참조) 양쪽 면에서 분류될 수 있는 여러 바이러스들로 이루어진 군이다. 가축에서 BVDV에 대한 방어 면역을 확립하는 것은 수많은 이유로 문제가 있었다. 바이러스에 의해 매개되는 일부 다른 질환에서와 같이, BVDV에 대한 혈청 항체의 수준이 질환에 대한 보호와 반드시 상관되지는 않는다. 수유 중인 송아지에서 방어 면역을 확립하는 것은 추가적인 장애물을 제시하는데, BVDV에 대한 모체 항체가 주사된 면역원을 고갈시켜 백신을 효과적으로 중화시킬 수 있기 때문이다.
문헌 [Fulton et al. (2006)]의 연구에서, 미국 사육장에 진입한 21,743마리의 송아지가 평가되었고, 88마리의 송아지가 BVDV로 지속적으로 감염된 것 (PI)으로 결정되었다. 88마리의 PI 송아지 중에서, 77.9％는 BVDV-1b로 감염되었고, 11.6％만 BVDV-1a로 감염되었으며, 10.5％만 BVDV-2a로 감염되었다. 불행하게도, 이러한 데이터는 BVDV-1b가 국내 사육장에 진입하는 PI 소의 우세한 아유형임을 명백하게 입증하지만, 현재 BVDV-1b 감염에 대해 특이적인 USDA-인가 백신이 없다.
따라서, 이러한 이유 및 종래 기술에서 본질적인 기타 이유를 위해, 강력하고 다방면인 면역 반응을 유발하는 BVDV 백신 제제, 특히 1b형 형태의 BVDV에 대한 면역 반응을 유발하는 것이 요구된다. 백신접종되지 않은 무리에서의 막대한 경제적 손실 가능성으로 인해, 포유동물 가축 집단에서 BVDV 감염에 대한 예방을 유도하는, 변형된 생 BVDV-1b 바이러스를 함유하는 비용-효과적인 (그리고 바람직하게는 단일-용량인) 백신이 요구된다.
유사하게, BRDC 및 관련된 수송열 질환과 같은 다인성 질환에 대한 현대의 다가 백신이 BVDV-1b에 의한 감염을 예방하는 것에서 크게 비효과적이기 때문에, BVDV-1b-감수성 가축에서의 질환 돌발의 예방 및 제어를 더 양호하게 달성하기 위해 개선된 백신접종 양식이 또한 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 예방제 및/또는 치료제를 이를 필요로 하는 동물에게 전달하는 것을 유리하게 개선할 수 있는 새롭고 유용한 조성물, 뿐만 아니라 이를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 통상적인 제제를 넘어서는 장점을 제공하고, 구체적으로는 하나 이상의 페스티바이러스에 의해 야기되는 질환, 특히 BVDV 바이러스 (1b형 아유전자형(subgenotype) (즉, BVDV-1b)의 바이러스 포함)에 의해 야기되는 것을 예방 또는 제어하는 방식을 제공하는 백신 조성물을 제공한다.
종합적이고 일반적인 의미에서, 본 발명은 바이러스 및/또는 미생물 감염, 발병기전 및 질환의 예방, 치료 및/또는 관리에서의 조성물, 이같은 조성물의 제조 방법, 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본원에 개시된 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 이를 사용하는 방법은 수의학 업계에서 현재 이용가능한 통상적인 수송열 예방제/치료제보다 우월한 본 발명의 백신 조성물 및 이를 사용하는 방법을 이용하여 감수성 포유동물에서 수송열/BRDC의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는 것에서 특히 용도가 발견된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 변형된 생 BVDV-1b 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 이를 함유하는 제약 제제, 및 다양한 예방 및/또는 치료 요법에서 이같은 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 이같은 조성물 및 방법은 BVDV 감염에 대해 감수성인 포유동물 가축과 같은 동물에서의 바이러스성 및 다인성 질환의 예방에서 특히 용도가 발견된다.
관련 실시양태에서, 본 발명은 개시된 백신 조성물을 동물에서 바이러스-특이적 면역학적 반응을 유발하기 위해 사용하는 방법을 또한 제공한다. 종합적이고 일반적인 의미에서, 일반적으로 이같은 방법은 선택된 동물에게 본원에 개시된 면역원성 조성물 중 하나 이상을 동물에서 바이러스-특이적 면역학적 반응, 특히 BVDV-특이적 면역학적 반응을 유발하는데 효과적인 양(들) 및 시간으로 제공하는 것을 수반한다. 이같은 실시양태에서, 동물은 바람직하게는 발굽이 갈라진 동물, 더욱 바람직하게는 소과(Bovidae)의 구성원이다.
본 발명은 하나 이상의 선택된 포유동물 집단에서 바이러스 및/또는 미생물 감염(들) (특히 BVDV 및 관련 종에 의해 야기되는 페스티바이러스 감염)의 돌발을 예방 또는 제어하는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로 이러한 방법은 이같은 집단의 감수성 구성원 또는 위험에 처한 구성원에게 유효량의 개시된 면역원성 또는 백신 조성물 중 하나 이상을 일반적인 집단에서의 이같은 감염의 돌발의 지연, 축소, 감소, 억제 및/또는 예방에 충분한 시간 동안 제공하는 것을 수반한다. 예시적인 포유동물 집단에는, 비제한적으로, 소아과(Bovinae) 및 염소아과(Caprinae)의 구성원, 특히 바이슨(Bison), 보스(Bos), 부발루스(Bubalus), 카프라(Capra), 오레암노스(Oreamnos), 오비보스(Ovibos), 오비스(Ovis), 신세루스(Syncerus) 등의 속의 구성원이 포함된다. 예시적인 실시양태에서, 이러한 방법들은 바이슨 바이슨(Bison bison), 보스 타우루스(Bos taurus), 카프라 히르쿠스(Capra hircus) 및 오비스 아리에스(Ovis aries)가 비제한적으로 포함되는 바이슨, 보스, 카프라 및 오비스 속의 상업용 가축의 치료에서 특히 바람직하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염, 특히 소과-독성 페스티바이러스 감염에 대한 방어 면역 반응을 일으키도록 동물의 면역계를 자극하는 방법을 제공한다. 일반적으로 이같은 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 면역학적 및 예방적 유효량의 개시된 백신 조성물 중 하나 이상을 동물의 면역계를 자극하는데 충분한 양 및 시간으로 투여하는 것을 적어도 수반한다. 한 실시양태에서의 이러한 방법의 통상적인 실행에서, 개시된 면역학적- 및 예방적-활성 백신 조성물 중 하나 이상의 투여는 바람직하게는 적어도 동물에서 검출가능한 제1 양의 항-페스티바이러스 항체를 유도하고, 더욱 바람직하게는 적어도 동물에서 검출가능한 제1 양의 항-BVDV-1b 항체를 유도한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물의 투여는 바람직하게는 BVDV-1b 바이러스에 의한 초기 감염, 후속 감염 및/또는 재발 감염에 대해 동물을 면역화시키고, 특정 실시양태에서는, 또한 바람직하게는 BVDV 바이러스 (비제한적으로 BVDV-1a, BVDV-2가 포함됨)의 하나 이상의 유형, 균주 및 아유형, 및 기타 유전학적으로 유사한 페스티바이러스가 예를 들어 포함되는 하나 이상의 유전학적으로 유사하거나 에피토프 면에서 관련된 바이러스에 의한 초기 감염, 후속 감염 및/또는 재발 감염에 대해 동물을 면역화시킨다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동물에서 페스티바이러스에 대한 방어 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다. 일반적으로 이같은 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 면역학적 및 예방적 유효량의 개시된 BVDV-1b 면역원성 조성물 중 하나 이상을 하나 이상의 페스티바이러스 종, 아종, 또는 균주에 대해, 바람직하게는 하나 이상의 BVDV 종, 균주, 아유형 또는 혈청형에 대해 이같은 방어 면역 반응을 일으키는데 충분한 조건 및 시간으로 제공하는 것을 포함한다.
유사하게, 본 발명은 포유동물 숙주 내의 제1 세포에 예방 또는 치료 조성물을 제공하는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로 이러한 방법은 이를 필요로 하는 포유동물에게 예방적 또는 치료적 유효량의 본원에 개시된 BVDV-특이적 면역원성 조성물 중 하나 이상을 적어도 이같은 포유동물 내의 제1 세포, 조직, 기관, 또는 기관계에 제공하는데 효과적인 조건 및 시간으로 제공하는 것을 수반한다.
본 발명은 포유동물에서 BVDV 감염의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로 이같은 방법은 이를 필요로 하는 포유동물에게 면역학적 및 예방적 유효량의 개시된 BVDV-1b 면역원성 조성물 중 하나 이상을 포유동물에서 BVDV 감염의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는데 충분한 조건 및 시간으로 제공하는 것을 포함한다.
유사하게, 본 발명은 포유동물에서 BRDC와 같은 다인성 질환, 특히 적어도 제1 BVDV에 의한 감염이 질환의 원인제 또는 기여제로서 연루되는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로 이같은 방법은 선택된 포유동물에게 적어도 제1 면역학적 또는 예방적 유효량의 적어도 제1 항-BVDV-1b 백신 조성물을 포유동물에서 질환의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는데 충분한 조건 및 시간으로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 소과 구성원에서 수송열의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로 이같은 방법은 소과 동물에게 변형된 생 BVDV-1b 바이러스들의 집단을 포함하는 적어도 제1 면역학적 또는 예방적 유효량의 제1 조성물을 소과 동물에서 수송열의 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 호전시키는데 충분한 조건 및 시간으로 제공하는 것을 포함한다.
면역원성 조성물
하나 이상의 페스티바이러스, 특히 소과 구성원에서의 BRDC 및 수송열에서 연루되는 바이러스성 인자 중 하나 이상에 대한 더 광범위한 보호를 제공하기 위해, 본 발명가들은 하나 이상의 BVDV-1b-특이적 항원을 포함하는 안전하고 효과적인 백신 제제를 개발하였다. 1가 및 다가 백신 제제 양쪽 모두가 기술되었고, 여기에는 1가 백신의 경우에 BVDV 단독에 대해 특이적인 면역 반응을 유발하는 하나 이상의 항원, 에피토프 또는 변형된 생 바이러스를 함유하는 것, 또는 다가 백신의 경우에 BVDV에 대해서뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 병원체에 대해서도 특이적인 면역 반응을 유발하는 하나 이상의 항원, 에피토프 또는 변형된 생 바이러스를 함유하는 것이 포함된다.
예시적인 실시양태에서, 변형된 생 BVDV-1b를 포함하는 1가 면역원성 조성물이 BVDV-1b 감염으로부터 가축을 보호하기 위해 개발되었다. 추가적으로, BRDC 및 관련된 수송열에 대해 특이적인 다가 면역원성 조성물을 본 발명이 또한 제공하고, 여기에는 동물에서 BHV-1, PI3, BRSV, 1형 BVDV의 2가지 아유전자형 (1a 및 1b), 및 2형 BVDV 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상에 대해 면역 반응을 특이적으로 유도하기 위한 항원성 성분들을 포함하는 예시적인 6-방식 (즉, "6가")의 변형된 생 소 바이러스성 제제가 포함된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 제제는 상기의 것들 각각에 대해, 전형적으로는 다양한 수준으로, 면역 반응을 유도한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 상기 언급된 면역원을 함유하는 백신 제제, 및 동물에서의 페스티바이러스 감염, 특히 포유동물 가축에서의 BVDV-1b 감염의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 호전에서의 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 소과 동물 및 기타 관련된 포유동물 종에서의 수송열, 예컨대 BRDC의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 호전에서의 백신 제제 및 이를 사용하는 방법을 추가로 포함한다.　　　
백신 제제
본 발명은 하나 이상의 바이러스 감염의 예방에서 사용하기 위한 면역원성 조성물 및 이의 백신 제제, 뿐만 아니라 선택된 포유동물에서의 하나 이상의 복합성 다인성 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 방지, 예방 또는 치료를 위한, 특히 포유동물에서의 하나 이상의 질환 또는 이같은 질환의 하나 이상의 증상, 예컨대 가축에서의 BVDV 감염의 예방, 관리, 호전 및/또는 치료를 위한 수의학상 허용되는 의약의 제조에서 사용하기 위한 백신 의약의 제조에서의 개시된 면역원성 조성물 중 하나 이상의 용도를 제공한다.
본 발명의 백신은 당업자가 이용가능한 선택된 포유동물에 대한 임의의 적절한 투여 경로에 의해, 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사에 의해 또는 비강내, 경구, 피부, 경피 또는 피내 투여를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, BVDV-1b에 대한 백신의 경우에, 피하 투여로, 또는 근육내 또는 비강내 경로에 의해 백신접종이 투여되고, 피하 투여가 가장 바람직하다. 전형적으로 백신은 젖떼기 전에, 젖을 뗄 때, 또는 방목장 또는 사육장에 들어가는 시점에 투여된다. 진행 중인 성체 소 조작의 일부로서, 1회 이상의 "부스터(booster)" 용량의 이같은 백신이 또한 일상적으로 사용될 수 있고, 예를 들어 연 1회의 재-백신접종/유지 일정의 일부로서가 이에 포함된다.
본 발명의 제약 제제 및 백신이 임의의 적절한, 수의학상 허용되는 제제로 제조될 수 있지만, 특정 실시양태에서, 본 발명은 수의학 업계의 당업자에게 공지된 바와 같이, 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전의 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동-건조, 또는 냉동 제제 형태인 백신을 제공한다.
변형된 생 페스티바이러스 조성물의 제조, 및 본 발명의 조성물 및 백신을 다른 면역원과 함께 제제화하는 것 (하나 이상의 아주반트가 존재 또는 부재함) 양쪽 모두 통상적으로 본원의 지침을 기초로 하고, 약독화된 생 페스티바이러스를 제약상 허용되는 담체 또는 부형제, 및 임의로 다른 면역원 및 임의로 아주반트와 혼합하는 것을 포함한다.
제약 제제 및 백신의 담체, 희석제 또는 기타 불활성 또는 비활성 성분은 수의학 업계에서 사용될 수 있는 바와 같은 하나 이상의 안정화제, 방부제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 예시적인 안정화제에는, 비제한적으로, SPGA, 및 하기의 것들 중 하나 이상이 포함된다: 탄수화물 (소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코스가 포함되지만, 이에 한정되지는 않음), 단백질 (분유, 혈청 알부민, 카세인, 또는 식물 또는 미생물과 같은 기타 공급원으로부터의 단백질이 포함되지만, 이에 한정되지는 않음) 등. 적절한 완충제에는, 비제한적으로, 하나 이상의 알칼리 금속 인산염이 포함된다. 개시된 제약 조성물 및 백신을 제제화하는데 유용한 예시적인 방부제에는, 비제한적으로, 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B, 및 이들의 임의의 조합이 포함된다. 예시적인 희석제에는, 비제한적으로, 멸균수, 하나 이상의 수성 완충제 (예컨대 완충 염수 등), 하나 이상의 알콜 (폴리올, 예를 들어, 글리세롤 등이 포함됨), 및 이들의 임의의 조합이 포함된다.
원하는 경우, 임의로 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 아주반트를 또한 추가로 포함할 수 있다. 아주반트 활성이 있는 적절한 화합물 및 조성물의 비제한적인 예로는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 미네랄 오일, 예컨대 비제한적으로 드라케올(Drakeol)®, 바욜(Bayol)®, 또는 마르콜(Marcol)®; 식물성 오일, 예컨대 비제한적으로 면실유, 땅콩유 또는 옥수수유; 비타민 E 아세테이트; 사포닌; 어유, 예컨대 비제한적으로 스쿠알렌 또는 스쿠알란; 또는 이들의 임의의 조합을 예를 들어 기초로 하는 수중유, 유중수, 수중유중수 에멀젼이 포함된다.
본 발명에 따른 BVDV-특이적 백신 제제는 면역화되는 동물에게 또한 잠재적으로 병원성인 하나 이상의 추가적인 바이러스 및/또는 미생물에 대해 특이적인 하나 이상의 다른 면역원을 또한 추가로 임의로 함유할 수 있다. 예를 들어 소 및 관련된 소과 동물에서, 조성물 내에 존재할 수 있는 추가적인 면역원은 로타바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 헤르페스바이러스 (1형 포함), 소 코로나바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 (3형 포함), 소 파라믹소 바이러스 등이 비제한적으로 포함되는 소-병원성 바이러스 중 하나 이상의 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 별법으로는 하나 이상의 소-병원성 미생물 종, 예컨대 비제한적으로 파스테우렐라 물토시다, 만헤이미아 헤몰리티카 (기존의 파스테우렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica)), 히스토필루스 솜니 (기존의 헤모필루스 솜누스), 마이코플라즈마 보비스 등으로부터 유래되는 것, 또는 상기의 것들 중 임의의 것의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관련되는 경우에, 당업자가 이해할 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 단일 용량을 동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있거나, 또는 별법으로 다중 및/또는 연속 용량을 동물에게 경시적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 면역원성 조성물은, 단독으로 또는 추가로 하나 이상의 별개의 미생물-특이적 면역원 또는 백신 제제의 투여와 조합되어, 하나 이상의 항-바이러스 또는 항-미생물 화합물과 공동-투여될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물에서 감염 또는 질환의 하나 이상의 증상(들)을 치료하거나 호전시키기 위해 하나 이상의 치료제를 전달하도록 개시된 면역원성 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 이같은 방법은 이를 필요로 하는 포유동물에게 하나 이상의 개시된 면역원성 조성물을 이같은 포유동물에서 이같은 질환 또는 감염을 치료하거나, 호전시키거나, 또는 이의 중증도, 기간 또는 정도를 축소시키는데 충분한 양 및 시간으로 투여하는 것을 수반한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 진단, 또는 질환의 하나 이상의 임상 증상의 개시, 또는 이의 하나 이상의 증상의 출현 전, 동안 또는 후에 하나 이상의 감염 및/또는 질환에 걸렸거나, 하나 이상의 감염 및/또는 질환에 걸린 것으로 추정되거나, 하나 이상의 감염 및/또는 질환이 발달될 위험에 처해 있거나, 하나 이상의 감염 및/또는 질환으로 진단된 동물의 예방, 방지 및/또는 백신접종에서 또한 사용될 수 있다.
면역 반응을 유도하는 방법
본 발명은 감수성 동물에서 하나 이상의 바이러스성 병원체에 대한 검출가능한 면역 반응을 유도하는 방법을 추가로 포함한다. 한 바람직한 방법은 이를 필요로 하거나 또는 예를 들어 소정의 질환 또는 감염에 대한 공지된 위험 인자를 기초로 잠재적으로 이를 필요로 하는 동물에게 동물에서 검출가능한 면역 반응을 유도하는데 충분한 양의 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 페스티바이러스 감염, 예컨대 BVDV에 대해 또는 다인성 질환, 예컨대 BRDC에 대해 대상체를 백신접종하는 방법을 포함하고, 이때 페스티바이러스 감염은 연루성 또는 원인성이다. 일반적으로 이같은 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 예방적 및/또는 치료적 유효량의 페스티바이러스-특이적 백신 조성물 및 하나 이상의 제약상 또는 수의학상 허용되는 담체, 완충제, 희석제, 비히클 등을 투여하여 페스티바이러스 감염 또는 이같은 페스티바이러스 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환에 대해 동물에서의 검출가능한 면역 반응을 제공하는 것을 수반한다.
이를 위해, 본 발명은 동물에서의 하나 이상의 바이러스 또는 미생물 질환 또는 감염 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 호전 또는 관리를 위해 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 동물에서 페스티바이러스 감염 (예를 들어, BVDV 포함)의 하나 이상의 증상을 예방하거나 호전시키기 위한 예방적 투여에 적절한 하나 이상의 백신의 제조에서의 용도를 포함하여, 질환 방지 또는 예방을 위한 수의학 의약 또는 백신의 제조에서의 개시된 면역원성 조성물 중 하나 이상의 용도를 또한 제공한다.
본 발명은 치료적 또는 예방적 면역원성 화합물을 포유동물 내의 제1 세포에 제공하는 방법을 또한 제공하고, 이때 일반적으로 이러한 방법은 이를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의, 다수의 변형된 생 바이러스 입자를 활성 성분으로 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 BVDV 면역원성 조성물을 면역화되거나 치료된 포유동물에서 원하는 치료 및/또는 예방을 제공하는데 효과적인 시간 동안 제공하는 것을 포함한다.
치료 및 예방 키트
개시된 면역원성 조성물 또는 이를 포함하는 제약 제제 중 하나 이상; 및 하나 이상의 예방 또는 치료 요법에서 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본 개시내용의 설명적인 측면을 또한 나타낸다. 바람직하게는 이같은 키트는 개시된 면역원성 조성물 또는 백신 중 하나 이상을 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 치료 화합물, 제약 등과 조합하여 포함하고, 동물에서의 질환 예방 또는 치료에서의 성분들의 사용을 위한 설명서를 포함한다. 본 발명에 따른 키트는 상업적인 배포용으로 포장될 수 있고, 조성물(들)을 선택된 동물에게 투여하기 위해 하나 이상의 전달 비히클 (예를 들어, 주사기, 바이알, 주사가능 물질 등)을 또한 추가로 임의로 포함할 수 있다.
전형적으로 이같은 키트용 컨테이너(들)는 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 컨테이너를 포함할 수 있고, 이들 내로 면역원성 조성물(들) 또는 백신 제제(들)이 놓일 수 있고, 바람직하게는 동물 투여를 위해 하나 이상의 분취량(들)으로 적절하게 분배될 수 있다. 제2 면역원성 조성물 또는 제1 항바이러스 또는 항미생물 화합물을 또한 원하는 경우, 키트는 제2 면역원성 조성물 또는 제1 항바이러스 또는 항미생물 화합물을 별개의 제2 컨테이너 내에 또는 투여용으로 제조할 때까지 2개의 성분을 단리하기 위한 파손성 또는 비-파손성 장벽이 있는 단일 컨테이너 내에 또한 함유할 수 있다. 별법으로, 다수의 별개의 면역원성 조성물(들) 및/또는 별개의 항바이러스 또는 항미생물 화합물(들)이 단일 제제로 제조될 수 있고, 단일 컨테이너, 바이알, 플라스크, 주사기, 카테터, 캐뉼라, 병, 시험관, 앰풀, 또는 기타 적절한 컨테이너 내에 포장될 수 있다. 키트는 상기 언급된 컨테이너들을 다른 설비 등과 함께 포함하는 더 큰 컨테이너, 예컨대 케이스를 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는 필요에 따라 미리 선택된 용량을 계량하기 위한 임의의 적절한 중량 또는 부피-측정 장치와 함께, 원한다면, 다중 용량이 컨테이너 내의 적절한 용기 내에 함유될 수 있다.
의약 제조에서 사용하기 위한 조성물
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 동물, 예컨대 척추 포유동물에서 질환 또는 이의 증상을 예방하거나, 치료하거나 호전시키기 위한 의약의 제조에서 개시된 면역원성 조성물 (뿐만 아니라 이를 포함하는 제제)을 사용하는 방법에 관한 것이다. 미생물 또는 바이러스 기원의 하나 이상의 질환의 치료 및/또는 예방에서 개시된 면역원성 조성물의 용도가 또한 구현된다.
일반적으로 이같은 용도는 이를 필요로 하는 동물에게 개시된 면역원성 조성물 중 하나 이상을 이환 동물에서 하나 이상의 질환 또는 이의 증상을 예방, 치료 또는 관리하는데 충분한 양 및 시간으로 투여하는 것을 수반한다. 개시된 면역원성 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 특히 바이러스 및/또는 미생물 기원의 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 적어도 제1 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물이 본 발명의 일부를 또한 형성한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 단가 (즉, 1가) 백신으로서, 또는 별법으로 2가, 3가 또는 심지어 다가(multivalent) (즉, 다가(polyvalent)) 백신으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 1가 백신은 선택된 수용자 포유동물, 특히 BVDV 감염에 대해 감수성인 포유동물의 신체 내로 도입되었을 때, 특이적 항-BVDV 면역 반응을 유발할 수 있는 단일한 본 발명의 면역원성 조성물 (예를 들어, 변형된 생 BVDV-1b 바이러스들의 집단)을 포함할 것이다.
유사하게, 바람직하게는 2가 백신 조성물은 적어도 제1 BVDV-1b-특이적 조성물, 및 적어도 제2 바이러스- 또는 미생물-특이적 면역원을 포함할 것이고, 이들 각각은 포유동물에서 특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 다가(multivalent) (3가 또는 다가(polyvalent) 포함) 백신 조성물은 바람직하게는 각각 3개 이상의 바이러스- 또는 미생물-특이적 면역원을 포함할 것이다. 본원에서 설명된 실시양태에서, 본 발명가들은 포유동물 집단, 특히 내수용 가축에서 BRDC 감염을 제어하기 위한 BVDV-1b, 1a형 BVDV (BVDV-1a), 2형 BVDV (BVDV-2), PI3, 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV), 및 BHV-1 (감염성 소 비기관염 (IBR)의 원인 인자)에 대해 특이적인 면역원을 포함하는 놀랍고 뜻밖에 유리한 6가 (6-방식)의 변형된 생 백신 제제를 개발하였다.
예시적인 실시양태의 설명
본 발명의 예시적인 실시양태들이 하기에서 기술된다. 명확성을 위해, 이러한 명세서에서 실제 실행의 모든 특색이 기술되지는 않는다. 임의의 이같은 실제 실시양태의 개발에서, 개발자의 특정 목표, 예컨대 시스템-관련 및 비지니스-관련 제약에 따르는 것을 달성하기 위해 수많은 실행-특이적 결정이 이루어져야 하고, 이는 실행마다 변할 것임이 물론 이해될 것이다. 또한, 이같은 개발 노력이 복잡하고 시간-소비적일 수 있지만, 이러한 개시내용을 이용하면 당업자에게 일상적인 업무일 것임이 이해될 것이다.
" 수송열 "
"수송열"은 임상적으로 열, 급성 기도 염증, 코 분비물, 식욕부진, 우울증, 섬유소성 폐렴, 및 감염 조직의 괴사를 특징으로 하는 소 및 양의 고도로 전염성인 급성 패혈성 증후군에게 주어지는 용어이다. 수송 후에 사육장에서 가장 빈번하게 마주치게 되면서, 수송열은 어린 소의 주요 사망 원인이고, 5억 달러를 초과하는 연간 예상 산업 손실의 원인이 된다. 1991년에만, 수송열은 미국 소 산업이 주로 치료 비용, 생산 손실 및 사망으로 인해 약 6억 2천 4백만 달러를 쓰게 한 것으로 추정되었다.
일반적으로 수송열의 발병기전은 동물을 초기 바이러스 호흡 감염에 걸리기 쉽게 하는 불리한 외부 영향을 수반하는 것으로 간주되고, 차례로 이러한 감염은 하나 이상의 2차 박테리아 감염의 증식에 호의적인 컨디션을 일으킨다.
복합성 소 호흡기 질환 ( BRD ) ( BRDC )
수송열의 1차 원인 인자는 소 호흡기 질환 (BRD) 또는 소 복합성 호흡기 질환 (BRDC)으로 공지된 다인성 용태이다. 쇠고기 가축 산업에서의 경제적 손실의 주요 원인인 BRDC는 바이러스성 및 박테리아성 병원체 양쪽 모두에 의한 동반적인 후속 또는 동시 감염을 특징으로 한다. BRDC에서 연루되는 바이러스성 병원체에는 소 헤르페스 바이러스 1 (BHV-1), 소 PI3, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 및 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV)가 포함된다.
바이러스 감염 후에, 이환 동물에서 하나 이상의 후속 박테리아 감염 (예를 들어, 만헤이미아 [기존의 파스테우렐라] 헤몰리티카, 파스테우렐라 물토시다, 히스토필루스 솜니 [기존의 헤모필루스 솜누스], 악티노마이세스 피오제네스(Actinomyces pyogenes), 및 다양한 마이코플라즈마(Mycoplasma) 아종)이 발현되고, 이는 종종 급성 폐렴으로 나타난다.
폐렴의 가장 통상적이고 가장 빨리 인식가능한 임상 징후는 우울증이다. 우울증을 나타내는 송아지는 늘어진 귀, 쭉 뻗은 머리, 새우등이 있을 것이고/이거나 종종 자신을 다른 소 무리에서 분리시킬 것이다. 송아지의 건강이 점진적으로 악회됨에 따라, 이는 급식을 멈추고, 증가된 호흡률을 나타내며, 현저한 열이 나타난다 (전형적으로, 104℉-108℉ 범위).
페스티바이러스
페스티바이러스는 세계적으로 동물에서 경제적으로 중요한 질환을 야기한다. 플라비바이러스과(Flaviviridae)의 페스티바이러스 속은 3가지 종의 단일-가닥 양성-센스 RNA 바이러스를 포함한다: 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 고전적인 돼지열 바이러스 (CSFV), 보더병(border disease) 바이러스 (BDV). 최근, 유전학적으로 BVDV에 관련되고 문헌에서 2형 소 바이러스성 설사 바이러스 2 (BVDV-2)로 지칭되는 페스티바이러스의 별개의 네번째 군이 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Thiel et al., 1996]; 및 [Becher et al., 1995]을 참조하고, 이들 각각은 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다). 결과적으로, 현대 문헌은 이제 원래의 BVDV 종을 "BVDV-1"로 지칭하여 2가지 종을 구별한다.
소 바이러스성 설사 바이러스 ( BVDV )
페스티바이러스의 표준 균종은 1형 BVDV (BDVD-1)이고, 이의 게놈은 길이가 약 12.5-kb이며 1개의 대형 오픈 리딩 프레임(open reading frame) (ORF)을 함유한다 (이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함되는 문헌 [Collett et al., 1988]). ORF는 숙주 또는 바이러스 프로테아제(protease)에 의해 번역과 동시에, 그리고 번역 후에 프로세싱되는 약 450 kDa의 대형 다기능단백질을 코딩한다. 표준 BVDV 다기능단백질의 N-말단 끝부분은 비-구조 단백질 p20 (Npro), 캡시드(capsid) 단백질 p14 (C); 껍질 당단백질 gp48 (E0), gp25 (E1), gp53 (E2); 비-구조 단백질 p125 (NS23), p10 (NS4A), p32 (NS4B), p58 (NS5A) 및 p75 (NS5B)로 귀착된다 (예를 들어, 문헌 [Tautz et al., 1997]; [Xu et al., 1997]; [Elbers et al., 1996]; 및 [Wiskerchen et al., 1991]을 참조하고, 이들 각각은 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다). BVDV-1은 세포변성 ("cp"로 명시됨) 또는 비-세포변성 ("ncp")의 2가지 생물형으로 존재하고, 이들은 세포변성 변이체에서의 단일한 80-kDa 폴리펩티드 (비-구조 단백질 p80, NS3)의 생산에 의해 상이하다 (예를 들어, 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함되는 문헌 [Gillespie et al., 1960] 참조).
다수의 BVDV 단리물의 계통발생학적 분석을 기초로, BVDV-1은 적어도 13개의 별개의 아유전자형 (BVDV-1a 내지 BVDV-1l로 명시됨)을 포함하는 것으로 나타난 반면, BVDV-2에 대해서는 2개의 아유전자형 (BVDV-2a 및 BVDV-2b)이 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Pellerin et al., 1994]; [Ridpath et al., 1994], 및 [Xue et al., 2010]을 참조하고, 이들 각각은 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다).
BVDV-1 및 BVDV-2 양쪽 모두 소에서 급성 감염을 야기하고 (설사, 열, 출혈성 증후군), 감염이 임신 동안 발생하면, 유산, 태아 기형 및 송아지의 지속 감염을 야기한다. 지속 감염 동물은 바이러스의 주요 저장소를 나타내고, 이같은 동물은 치명적인 점막 질환 (MD)에 걸릴 수 있다.
BVDV는 양에서의 보더병 및 돼지에서의 고전적인 돼지열에 밀접하게 관련된다. 감염된 소는 일반화된 "점막 질환"을 전형적으로 나타내고, 이는 체온 상승, 설사, 기침 및 소화 점막의 궤양을 특징으로 한다 (예를 들어, 문헌 [Olafson et al., 1946]; 및 [Ramsey et al., 1953]을 참조하고, 이들 각각은 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다).
BVD 바이러스는 임신한 소의 태반을 가로지를 수 있고, 이러한 바이러스에 대해 면역내성이고 나머지 일생 동안 지속적으로 바이러스혈증성인 지속 감염 (PI) 송아지의 출생을 초래할 수 있다. 폐렴 또는 장 질환을 야기하는 미생물로 감염될 경향이 높은 이러한 PI 소는 소에서 MD 질환의 돌발을 위한 불가피한 바이러스 저장소를 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Liess et al., 1974]; [Barber et al., 1985]; [Malmquist, 1968]; 및 [Ross et al., 1986]을 참조하고, 이들 각각은 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다).
BVDV는 대소변-구강 방식으로 무리를 통해 확산되고, 바이러스 제어를 위한 전략은 단순히 경제 손실을 감소시키기 위한 노력의 더 엄격한 관리 관행에서 효과적인 반면에 전형적으로는 허용되지 않는 수준의 비용을 과하는, 감염된 동물을 확인하기 위한 정교한 테스트 절차까지의 범위에 이른다.
지난 30년 동안, BVDV에 대한 약 150개의 백신 (변형된 생 바이러스 (MLV) 및 불활성화된 약독화 바이러스 또는 바이러스 입자 양쪽 모두)이 가축 산업에 판매되었고, 성공 정도는 다양할 것이다; 상업적인 백신 제제의 광범위한 입수가능성 및 사용에도 불구하고 연간 기준으로 BVDV의 돌발이 여전히 보고된다. 질환 관리에 대한 현재의 접근법은 소에 백신을 반복적으로 매년 접종하는 것을 수반하고, 송아지가 PI 보균자로서 태어나지 않는 것을 확실히 하기 위한 시도로 추가적인 단계가 일반적으로 취해진다. BVDV의 검출, 및/또는 BVDV-감염 동물의 검출을 위해 여러 상이한 테스트 방법이 개발되었고, 여기에는 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 효소-결합 면역검정법 (ELISA), 표준 바이러스 단리 기술, 및 다양한 면역조직화학 검정법이 포함된다.
전형적인 정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략적으로"는 상호교환가능하고, 소정의 숫자, 뿐만 아니라 열거된 숫자 범위 내의 모든 숫자 주위의 숫자 범위를 지칭하는 것으로 일반적으로 이해되어야 한다 (예를 들어, "약 5 내지 15"는 달리 언급되지 않는 한 "약 5 내지 약 15"를 의미한다). 또한, 본원에서의 모든 숫자 범위는 범위 내의 각각의 모든 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항원" 또는 "면역원"이라는 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사망했거나, 약독화되었거나 또는 살아 있는 전체 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원성 성질이 있는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에게 제시되는 경우에 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 조각 또는 단편; 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 별법으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다. 일반적으로 항원은 임의의 면역원성 물질, 즉 감수성 동물의 조직 내로 도입되었을 때 면역 반응 (예를 들어, 특이적 항체 분자의 생산)을 유발하고 항원 도입에 반응하여 생산된 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 항원은 면역계에 의해 인식되고/되거나, 체액성 면역 반응을 유도하고/하거나, B-및/또는 T-림프구 활성화에 이르는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 단일 에피토프, 또는 2개 이상의 에피토프를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 각각 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인인 VH 및 VL을 통해 다른 분자 (항원)에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항체"라는 용어는 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이의 임의의 서브클래스 또는 이의 조합이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 임의의 면역글로불린 분자를 지칭한다. "항체"라는 용어는 달리 명백하게 언급되지 않는 한 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv 단편이 예를 들어 포함되지만 이에 한정되지는 않는 면역글로불린 분자의 기능성 단편을 또한 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 폴리펩티드"는 척추동물에게 도입되는 경우에 척추동물의 면역계 분자와 반응하고, 즉 항원성이고/이거나, 척추동물에서 면역 반응을 유도하는, 즉 면역원성인 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것들에 더하여 본 발명의 단리된 항원성 및 면역원성 폴리펩티드는 재조합 단백질, 정제된 서브유닛, 단백질을 발현하는 바이러스성 벡터로서 제공될 수 있거나, 또는 불활성화 바이러스 백신, 예를 들어, 생-약독화 바이러스 백신, 열-사망 바이러스 백신 등의 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 생 백신"은, 전형적으로는 조직 배양 세포에서 계대되는 것에 의해, 질환을 야기하는 능력이 약독화되도록 변경되었지만, 후속하여 동물에게 투여되는 경우에 질환 또는 감염에 대해 보호하는 능력은 보유하는 바이러스를 포함하는 백신이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아주반트"는 바이러스들의 집단 또는 다수의 항원을 함유하는 백신 조성물 내에 존재할 때, 변형된 생 바이러스 또는 항원의 면역원성 및 효능을 강화하는 하나 이상의 물질로 이루어진 조성물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스의 "감염유발 단위"는 TCID50, 또는 감수성 세포의 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사망시키는데 필요한 양으로 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 관련 동물에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(들), 분산 매질, 코팅제(들), 희석제(들), 완충제(들), 등장성 작용제(들), 용액(들), 현탁액(들), 콜로이드(들), 삽입물(들) 등 또는 이들의 조합을 포함하도록 의도된다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 하나 이상의 전달 비히클의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 하나 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 하나 이상 내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역화시킨다" 또는 "면역화"라는 용어 또는 유사 용어는 특이적인 항원성 에피토프 또는 면역원에 대한 검출가능한, 바람직하게는 실질적인 면역 반응을 개시하는 능력을 부여하는 것을 지칭한다. 이러한 용어들은 반드시 완전한 면역을 의미하지는 않고, 그보다는 기준선, 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물이 투여되지 않은 경우 또는 통상적인 백신이 투여된 경우보다 실질적으로 더 큰 면역 반응이 일어난다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 개시된 백신 조성물의 투여 후에 표적 면역원(들)에 대한 세포성 및/또는 체액성 면역 반응 (바람직하게는 실질적인 면역 반응)이 발생하면 포유동물이 하나 이상의 표적 면역원에 대해 면역화된 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"이라는 용어는 숙주 동물에서의 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 발달을 가리킨다. 일반적으로, 면역학적 반응에는 하기 효과 중 하나 이상이 포함된다 (그러나, 이에 제한되지는 않는다): (a) 항체 생산; (b) B 세포 생산; (c) 헬퍼 T 세포 생산; 및/또는 (d) 세포독성 T 세포 생산 (소정의 항원 또는 합텐에 대해 특이적으로 지시됨).
본원에서 사용된 바와 같이, "면역원성"이라는 용어는 본원에서 사용된 바와 같이 숙주 동물에서 면역학적 반응을 유발하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 아미노산 서열, 아미노산 서열의 일부분, 또는 변형되거나 약독화된 사 또는 생 바이러스와 같은 물질을 또한 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역원성 단백질", "면역원성 펩티드", 또는 "면역원성 폴리펩티드"라는 용어는 일단 숙주에게 투여되면 단백질에 대해 지시된 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 일으킬 수 있다는 점에서 면역학적으로 활성인 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드를 지칭한다. 에피토프라는 용어는 체액성 유형 (B 세포) 및/또는 세포성 유형 (T 세포)의 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질 부위에 관련된다.
"병원체"라는 용어는 바이러스, 프리온, 원생동물, 기생충, 뿐만 아니라 미생물 예컨대 박테리아, 효모, 곰팡이, 진균 등이 예를 들어 포함되는 임의 종류의 감염체로 본원에서 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체" (상호교환가능하게 "숙주", "대상체", "수용자", "환자" 등으로도 지칭됨)라는 용어는 본원에 개시된 제약 조성물 또는 백신 제제 중 하나 이상을 받을 수 있는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 척추동물이고, 이는 임의의 동물 종 (바람직하게는, 포유동물 종)을 가리키도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 바람직하게는 개체는 비-인간 영장류, 소, 개, 염소, 기니 피그, 까마귀, 농어, 말, 고양이, 염소, 산토끼, 토끼, 이리, 양, 돼지, 개구리, 여우 등 (가축, 동물원 종, 외래종, 뿐만 아니라 반려 동물, 애완 동물, 및 수의사의 관리 하에 있는 임의의 동물이 포함됨)이 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유동물 숙주이다.
"수의학상 허용되는" 및 "제약상 허용되는"이라는 구절은 포유동물에게 투여되었을 때 알러지 반응 또는 유사한 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 원치 않는 독성학적 효과도 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이같은 염의 예로는 무기 산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가염; 및 유기 산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄산, 파모산 (엠본산), 알긴산, 나프토산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산으로 형성된 염; 다가 금속 양이온 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과의 염; N,N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염; 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보호 면역 반응" 또는 "치료적 면역 반응"은 항원에 대한 CTL 및/또는 HTL 반응을 지칭하고, 이는 어떤 방식으로든 질환, 또는 이의 증상, 부작용 또는 진행을 예방하거나 적어도 부분적으로 정지시킨다. 면역 반응은 헬퍼 T 세포의 자극에 의해 촉진된 항체 반응을 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물과 같은 동물에 투여될 수 있는 형태의 본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 백신은 이를 필요로 하는 동물에 투여하기 위해 제제화된, 본원에 개시된 면역원성 조성물 (하나 이상의 변형된 생 바이러스 입자 또는 이들 다수를 포함함) 중 하나 이상을 포함할 것이다. 이같은 조성물은 수성 비히클에서 제조된 것, 뿐만 아니라 냉동, 냉동-건조, 동결건조 또는 탈수 형태인 것 (그 후에, 투여 전에 통상적인 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 멸균 염수 또는 유사한 완충 수성 용액) 내에 재수화 또는 현탁됨)이 비제한적으로 포함되는, 임의의 적절한 제제의 조성물일 수 있다. 이같은 형태에서, 본 발명의 백신 조성물은 감수성 동물에서 바이러스 및/또는 미생물 감염의 하나 이상의 용태 또는 하나 이상의 증상을 예방하거나, 관리하거나 또는 다르게는 치료하기 위해 본원에 개시된 방법 또는 백신접종 요법 중 하나 이상에서 쉽게 사용될 수 있는 편리한 단일 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있다.
동물 숙주에 도입 시, 면역원성 조성물 및 이를 포함하는 백신은 면역 반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역 반응을 일으킬 수 있어, 생성된 면역 반응이 백신접종된 동물의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화를 검출하는 검정법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출가능하다. 본 발명의 백신 조성물은 단독적인 또는 하나 이상의 추가적인 항원(들) 등과 조합된 하나 이상의 아주반트를 포함할 수 있거나, 또는 이러한 아주반트 내에서 또는 이러한 아주반트와 동반적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 면역화 후 동물에 면역 반응을 부여한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역 반응"이라는 용어는 B- 및/또는 T-림프구의 활성화 또는 증식에 이르는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 지칭한다. 그러나, 일부 예에서, 면역 반응은 강도가 낮을 수 있고 본 발명에 따른 하나 이상의 물질을 사용하는 경우에만 검출할 수 있는 한편, 다른 것은 반복 투여, 아주반트, 제2 또는 추가적인 활성 작용제, 또는 이들의 하나 이상의 조합을 필요로 할 수 있다. "아주반트"라는 용어는 면역계의 하나 이상의 기능이 이러한 면역원성 작용제에 대해 지시되고 증가되도록 살아 있는 유기체의 면역계를 자극하는데 사용되는 작용제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료", "치료하다", "치료된", 또는 "치료하기"라는 용어들은 질환의 발달이 감수성 동물을 괴롭히기 전이든지 또는 후든지 질환의 하나 이상의 증상의 치료 또는 호전, 또는 질환 또는 이의 증상의 정도 또는 중증도의 감소를 지칭한다. 감염성 질환에 관하여 사용될 때, 예를 들어, 이러한 용어는 감염의 중증도를 감소시키거나 또는 감염에 기인하는 병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 축소시키거나 지연시키는 치료 또는 치료 요법, 뿐만 아니라 치료된 개체의 신체로부터의 감염 감소 및/또는 제거가 예를 들어 포함되는, 감염된 동물의 감염에 대항하는 능력을 증가시키는 것, 또는 질환이 악화되거나 이환된 동물과 접촉하는 다른 동물로 확산되는 것을 축소시키거나 예방하는 것을 지칭한다.
"면역원성 유효량"이라는 용어의 의미는 당업계에서의 이의 일반적인 의미이고, 즉, 면역원과 면역학적 특색을 공유하는 병원체와 유의하게 교전하는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원의 양을 의미한다. 이러한 용어는 치료적 유효량 또는 예방적 유효량 또는 양쪽 모두를 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방", "예방하다", "예방되는", "예방하기", "백신접종하기" 및 "백신접종"이라는 용어는 하나 이상의 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 이에 노출되지 않았거나 또는 이에 걸린 것으로 진단되지 않은 동물에서, 하나 이상의 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 또는 이의 개시를 지연시키는 것, 또는 감염을 예방하거나 또는 부분적이거나 완전하게 억제하는 것을 지칭한다. 감염성 질환에 관하여 사용될 때, 예를 들어, 이러한 용어는 하나 이상의 바이러스 또는 미생물 병원체로의 감염에 대한 동물의 저항성을 증가시키는 경향이 있거나, 달리 말하면 대상체가 병원체(들)에 감염될 가능성을 감소시키거나 또는 감염된 경우에는 감염된 동물에서 증상 지연, 감염 중증도 감소 또는 감염에 기인하는 병의 증상의 감소 또는 이들의 임의의 조합을 일으킬, 본 발명의 면역원성 조성물 중 하나 이상의 예방적 투여를 지칭한다.
"예방하기" 및 "치료하기" 각각은 동물에서 특정 감염, 질환, 용태 또는 이의 증상을 관리하는 것, 뿐만 아니라 질환 또는 용태의 후보 상태 또는 경과 또는 이의 임의의 증상의 임의의 이로운 변형을 포함한다. 관리하기는 이의 증상 중 일부 또는 모두를 기저 감염 또는 이로부터 초래되는 임의의 질환 또는 용태에 실제로 영향을 미치면서 또는 그렇지 않으면서 다룰 수 있다.
"예를 들어"라는 용어는, 본원에서 사용된 바와 같이, 제한을 의도하지 않으면서 단지 예로써 사용되고, 명세서에서 명시적으로 열거된 아이템들만 지칭하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
예전부터의 특허법 협약에 따라, 청구항이 포함되는 본 출원에서 사용될 때의 단수형 부정관사 ("a" 및 "an")는 "하나 이상"을 가리킨다.
실시예
하기의 실시예들은 본 발명의 예시적인 실시양태들을 입증하도록 포함된다. 당업자는 하기의 실시예에서 개시된 기술들이 본 발명의 실행에서 잘 기능하는 것으로 발견된 기술들을 나타내고 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 양식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 개시되고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득하는 특정 실시양태에서 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 많은 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1 - 변형된 생 BVDV 바이러스의 생산
본 실시예는 BVDV-1b의 변형된 생 바이러스 (MLV)의 대규모 생산을 위한 예시적인 방법을 제공한다.
물질 및 방법
바이러스 및 미생물
BVDV-1b의 TGAC 균주를 미국 농무부 (USDA: The United States Department of Agricultur) 산하의 동물 및 식물 검역소 (APHIS: Animal and Plant Health Inspection Service)의 수의 생물학제제 센터 실험실 (CVB-L: Center for Veterinary Biologics Laboratory) (미국 아이오와주 에임스)로부터 수득하였다. 이어서 마스터 시드 (MS: Master Seed)를 "TVL - BVDV1b MS 04/27/2007 DW3 -095"로 명명하였고, 출원인의 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 번호 61/427,404 (현재 본 출원과 함께 출원됨)에 언급된 바와 같이, 37 C.F.R. § 1.14 및 35 U.S.C. § 122 하에 특허청장이 이에 대한 자격을 인정하는 자에게 본 특허 출원의 계류 동안 배양물 입수가 가능할 것임을 보장하는 조건 하에 기탁하였다. 본 출원의 대응물 또는 이의 소산물이 출원된 국가에서 외국 특허법이 요구하는 바에 따라 기탁물이 이용가능하다. 그러나, 기탁물의 이용가능성이 정부 결정에 의해 허여된 특허 권리를 손상시키면서 본 발명을 실행할 라이센스를 구성하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 본 발명의 배양물 기탁물이 보관될 것이고 공개적으로 이용가능해질 것이며, 즉 기탁물 샘플의 마무리에 대한 가장 최근의 요청 이후의 5년 이상의 기간 동안, 그리고 임의의 경우에는 기탁일 이후의 30년 이상의 기간 동안 또는 기탁된 배양물의 개시를 허여할 수 있는 임의의 특허의 실행가능 기간(enforceable life) 동안 이를 생육성이고 오염되지 않게 유지하는데 필요한 모든 관리를 받으면서 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태로 인해 요청 시 기탁기관이 샘플을 공급할 수 없으면 기탁물을 교체할 의무를 인정한다. 공공에 대한 배양물 기탁물의 이용가능성에 대한 모든 제한은 이를 개시하는 특허 승인 시 취소불가능하게 제거될 것이다. TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095 바이러스의 기탁물은 부다페스트 조약의 조건 하에 2010년 12월 21일에 미국 20110-2209 버지니아주 머내서스 유니버시티 대로 10801에 위치하는 아메리칸 타입 컬처 래버러토리(American Type Culture Laboratory) 특허 기탁기관의 영구 수집물이 되었고, 이때 저장소에서 접속 번호 ATCC PTA-11553이 할당되었다.
MS 바이러스 (MSV)의 확인을 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 검정법을 사용하여 수행하여, MS 바이러스가 BVDV-1b로 양성적으로 확인되었다. PCR에 의한 BVDV의 구별에 대한 프로토콜이 문헌 [Ridpath and Bolin, 1998] (이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함됨)에서 개발되었다. 면역형광 검정법 (IFA) (문헌 [McNulty et al., 1984])을 사용하여 양성 확인이 수행되었다. 텍사스 베트 랩 소 신장 (TVL-BK: Texas Vet Lab Bovine Kidney) 세포에서의 이러한 바이러스들의 복제로 쉽게 인식가능한 세포병리학적 변화가 생산되었다.
미생물 확인 빈도
TVL-BK 세포에 생산 시드 바이러스를 접종하기 전에, 세포를 현미경으로 가시화하여 세포가 이전에 기술된 형태학을 나타내는지를 확인하였다. 생산 바이러스의 각각의 뱃치(batch)를 수확하기 전에, TVL-BK 세포를 관찰하여 이들이 이러한 바이러스와 연관된 전형적인 세포병리학적 효과 (CPE)를 나타내는지를 확인하였다.
배양물 또는 하위배양물의 독력 , 유지 및 범위
동결건조 또는 냉동 조건에서의 보관, 및 계대 또는 하위배양 횟수에 대한 제한에 의해 이러한 백신에서 사용되는 BVDV-1b의 독력, 효능 및 항원성의 일관성이 조장되었다.
범위: 생산 바이러스 = MSV+10 (효능 연속 계대), 그러나 5 내지 10 사이의 임의의 계대일 수 있음. 생산 세포 스톡(stock) = MCS+20 (효능 연속 계대), 그러나 또한 20 미만의 임의의 계대일 수 있음.
시드 및 생산 배양물에서 사용된 배지의 조성 및 반응
시드 및 생산 배양물에서 사용된 배지의 조성 및 반응은 하기와 같았다: 제조용 바이러스 접종원 (MSV+1 내지 MSV+8) 및 생산 바이러스 접종원 (배타적이지는 않지만 전형적으로 MSV+9 단계임)을 TVL-BK 세포에서 증식시켰다; 단, 바이러스 증식을 위한 TVL-BK 세포의 계대 횟수는 MCS로부터 20회의 계대를 초과하지 않는다. 성장 배지 (제조용 세포 제제 및 생산 세포 제제 양쪽 모두)는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)였다.
생성된 MSV를 액체 질소에서 보관되는 저온보존 배지에서 또는 -70 내지 -85℃에서 보관되는 저온보존 배지에서 동결건조로 보관할 수 있었다. 저온보존 배지 (액체 질소 내)에서 또는 -70 내지 -85℃에서 보관되는 저온보존 배지에서 MCS를 보관할 수 있었다.
시딩 및 접종용 현탁액의 제조 방법
냉동된 TVL-BK 세포를 함유하는 냉동바이알(cryovial)을 급속히 해동시켰다. 배양 플라스크에 배지를 권장 용량으로 충전하고, 현탁된 세포를 무균 상태에서 냉동 바이알에서 배양 플라스크로 옮겼다. 활발하게 증식 중인 배양물을 1:3 내지 1:6 (㎠:㎠) 범위의 비로 분할함으로써 배양 용기에 또한 시딩하였다. 무균 상태에서 성장 배지를 제거하고 1× 트립신-EDTA 용액을 첨가함으로써, 하위배양용으로 의도되는 플라스크 또는 롤러 병 내의 TVL-BK를 배양 표면으로부터 방출시켰다. 인큐베이션 (35 내지 39℃에서 5분) 후, 단층이 분산되었다. 분산된 세포를 성장 배지가 있는 배양 용기 내로 첨가함으로써 트립신을 불활성화시켰다. 시드가 동결건조된 경우에는 냉동된 분취량의 바이러스를 급속히 해동시키거나 또는 배지에 재현탁시켰다. TVL-BK 세포 (+20 이하)에 바이러스를 접종하였다. 적합한 인큐베이션 시간 후 및/또는 CPE가 관찰된 후, 하위배양용으로 의도되는 플라스크 또는 롤러 병에서 복제되고 있는 바이러스를 수집하였다. 그 후, 바이러스액을 6 내지 -80℃에서 보관하거나, 또는 즉각적으로 다른 배양 용기에 접종하는데 사용하였다.
표준 세포 배양 기술을 사용하여 시드 배지 및 생산 배지 양쪽에 접종하였다. 계대 20 이하의 TVL-BK 세포에 접종하였다. 전형적으로 MSV+9인, 냉동된 생산 바이러스 접종원을 급속히 해동시켰다. 바이러스 접종원의 부피는 세포 당 0.01 내지 1.0개 바이러스 범위의 다중 감염을 달성하도록 배양 면적 1600 ㎠ 당 1 내지 25 ㎖ 범위였다. 최소 접종원 역가는 하기와 같았다: BVDV-1b에 대해 105.0 TCID50. 접종된 배양물을 37±2℃ 및 5±1％ CO2에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다.
수확
수확일에, 배양물을 바이러스-특이적 CPE 및 무균성에 대해 시험하였다. 전형적인 최소 인큐베이션 시간은 BVDV-1b 접종 후 2일이었다. 전형적인 최대 인큐베이션 시간은 BVDV-1b 접종 후 4일이었다. 바이러스 현탁액을 생산 용기로부터 무균 상태에서 수확하였다. 샘플을 수집하여 수확물의 TCID50을 결정하였다. 수확 물질을 6 내지 -80℃에서 보관하였다. 최종 생성물 제작 전에 수확 물질을 1개월까지 어는 점 이상에서 보관할 수 있었고, 6개월까지 냉동할 수 있었다.
비정형 CPE 또는 오염 증거를 나타내는 수확액은 폐기하였다. 전형적인 CPE를 나타내고 오염이 없는 수확액만 추가적인 생산 용도에 적격이었다. 허용가능한 최소 수확 바이러스 역가는 106 TCID50/㎖였다.
하기와 같이 수확액의 순도가 확증되었다: 수확액의 2 ㎖ 샘플을 무균 상태에서 38 ㎖의 SCDB에 첨가하고, 35 내지 39℃에서 음성 대조군 (배지 단독) 및 양성 대조군과 함께 46 내지 50시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물, 뿐만 아니라 음성 대조군에서의 육안으로 보이는 성장의 부재로 수확액이 순수하고 추가적인 생산 용도에 만족스럽다는 것이 확립되었다. 순수하지 않은 것으로 확인된 수확액은 폐기하였다.
변형된 생 BVDV 바이러스의 예시적인 제제
모든 조작을 무균 기술을 사용하여 수행하였다. 적절한 항생제, 예컨대 네오마이신 및 니스타틴(Nystatin) (마이코스타틴(Mycostatin))을 연속 또는 하위연속 백신의 어셈블리 동안 각각 15 ㎍ 및 15 유닛/용량의 비율로 첨가하였다. 수확액을 필요에 따라 DMEM으로 희석하여 농도를 조정하였고, 0.2 ㎛ 여과 수크로스 용액의 첨가로 안정화시켜, 20±1％의 최종 수크로스 농도가 초래되었다.
임의로, 10-kDa 분자량 차단값 필터를 사용하는 무균 초여과에 의해 바이러스 수확액을 농축시켰다. 농축 정도는 전형적으로 50배를 초과하지 않았다.
수확된 바이러스액의 각각의 뱃치를 분석하여 TCID50을 결정하였다. 간략하게, 수확 물질의 로그 희석물 (10-1 내지 10-8)을 사용하여 96웰 플레이트 상의 TVL-BK 세포에 접종하였다. 플레이트를 37±2℃ 및 5±1％ CO2에서 96±6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 100× 배율에서 판독하고, CPE에 대해 시험하였다. 문헌 [Finney (1978)]에 의해 변형된 바와 같이, 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법에 의해 역가를 결정하였다.
사전에 멸균된 최종 컨테이너를 무균 상태에서 충전시켰다. 무균성 내부 밀봉 마개로 최종 컨테이너를 부분적으로 뚜겅을 덮었다. 최종 생성물 바이알을 냉동 건조기로 옮기고, 건조시켰다. 건조 주기 시간은 24 내지 72시간 범위였고, 이때 최대 생성물 온도는 22℃였다. 건조된 최종 생성물의 수분 함량은 전형적으로 5％를 초과하지 않았고, 최종 컨테이너 내의 용량 당 항원성 물질의 최소량은 바람직하게는 용량 당 8×103 TCID50이었다.
실시예 2 - BVDV -1B 1가 백신 송아지 챌린지 연구
본 실시예는 백신접종된 동물에서 감염을 예방하는 것에서의 BVDV-1b 1가 백신의 효능을 입증한다.
물질 및 방법
동물
건강한 4 내지 5개월령 잡종 암송아지를 시판원으로부터 구입하였고, 무작위로 뽑은 귀 태그로 이들을 확인하였으며, BVDV에 대한 감수성에 대해 혈청학적으로 스크리닝하였다. 도착 시 모든 송아지에게 1회 용량의 세프티오푸르(ceftiofur) 결정질 유리산 (엑세드(Excede)®, 미국 뉴욕주 뉴욕의 화이자 애니멀 헬스(Pfizer Animal Health))을 제공하였다. 송아지는 물, 건초 및 펠릿화 사료에 자유롭게 접근하였다.
백신
BVDV-1b 백신, 변형된 생 바이러스를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, BVDV-1b 마스터 시드 바이러스를 TVL-BK 세포주 (20번째 계대)에서 증식시키고, 10번째 계대에서 수확하고, 생산 개요도에 따라 안정화시키고, 병에 충전시키고, 냉동-건조시켰다. BVDV 농도는 스피어만-카버 방법 (예를 들어, 문헌 [Finney, 1978] 참조)에 의해 결정했을 때 용량 당 8×103 TCID50이었다. 멸균수를 희석제로 사용하여 백신을 재수화시켰다.
송아지 백신접종 및 챌린지
19마리의 BVDV-음성 송아지가 분류 앨리(sorting ally)에서 합쳐졌다. CVB-바이오메트릭스(CVB-Biometrics) (미국 아이오와주 에임스)가 제공하는 매칭-세트(matched-set) 랜덤화 체계 (표 1)를 사용함으로써 각각의 송아지를 2개의 군 (백신접종 군 또는 비-백신접종 대조군) 중 하나에 집어 넣었다.
<표 1>
Figure pct00001
혈청학적으로 음성인 송아지 10마리에 1회 용량의 BVDV-1b 백신을 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물이 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공되었다. 나머지 송아지에게는 어떠한 바이러스 백신도 제공되지 않았다. 백신접종 후, 챌린지하기 2일 전까지 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다.
혈액 샘플을 도착일에 수집하여 BVDV 역가에 대해 테스트하였다. 백신접종일 및 챌린지한 날에 혈액 샘플을 또한 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법 (문헌 [Schefers et al., 2008])에 의해 BVDV-1b 항체 역가를 결정하였다. 챌린지 2일 전에 백신접종 군 및 비-백신접종 대조군 양쪽 모두를 챌린지-전 임상 관찰 목적으로 합쳤다. 백신접종 14일 후, 백신접종 군 및 대조군 송아지에 우리에서 죽은 송아지의 폐로부터 수득된 BVDV-1b의 독성 단리물을 챌린지하였다. 10％ 말 혈청을 함유하는 DMEM을 사용하여 TVL-BK 세포 상에서 바이러스가 시험관 내에서 계대되었다. 4 ㎖ 내의 8×107 TCID50의 챌린지 용량을 각각의 송아지에 투여하였고, 이때 2 ㎖를 흡기 동안 각각의 비도 내로 투여하였다.
챌린지 전 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지의 직장 온도를 매일 기록하였다.
챌린지 전 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 백혈구 (WBC) 수를 결정하였다. 샘플을 EDTA 배큐테이너(Vacutainer)® 튜브에서 수집하고, 드루 사이언티픽(Drew Scientific) (미국 코네티컷주 워터베리)의 헤마베트(Hemavet) 950™ 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다.
BVDV 단리 목적을 위해 코 면봉채취물 및 백혈구연층을 각각의 송아지로부터 챌린지 2일 전, 챌린지 한 날, 및 챌린지 후 연속적인 14일에 수집하였다. BBL 컬쳐 스왑(Culture Swab) + 리퀴드 스튜어트 배지(Liquid Stuart Media) (벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company), 미국 메릴랜드주 스팍스)를 사용하여 코 면봉채취물을 수집하였다. 샘플로부터의 배지를 멸균 여과하고, 배양 중인 80％ 조밀도의 TVL-BK 세포에 접종하는데 사용하였다. 백혈구연층을 EDTA 배큐테이너 튜브로부터 수집하고, 배양 중인 80％ 조밀도의 TVL-BK 세포에 접종하는데 사용하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 백혈구연층을 제거하였다. 배양물을 4 내지 5일 동안 5±2％ CO2, 37±3℃에서 인큐베이션하였다. 모든 배양 샘플로부터의 상청액을 적절한 검출 프로브가 있는 본 발명가들에 의해 개발된 BVDV-1b-특이적 프라이머 세트 (BVDV-1b (제1))를 사용하여 RT-PCR에 의해 BVDV-1b의 존재에 대해 검정하였다.:
BVDV -1b (제1):
전방향 프라이머: 5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' (서열 1);
역방향 프라이머: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (서열 2); 및
BVDV-1b 검출 프로브: 5'-TCACCTGGACGACCC-3' (서열 3).
BVDV -1b (제2):
제2 전방향 프라이머: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 19);
제2 역방향 프라이머: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 20); 및
제2 BVDV-1b 검출 프로브: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 21).
BVDV-1b (제1)는 허용가능한 결과를 제공하는 반면, BVDV-1b (제2)는 더 양호한 결과를 나타냈다.
모든 임상 관찰은 독립적으로 이루어졌고, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 임상 평가가 종결될 때까지 관찰자가 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다.
통계 분석
백혈구감소증: 제-2일 내지 제0일에 대한 백혈구 수를 평균함으로써 챌린지 전의 백혈구 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 일일 백혈구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 백혈구 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 각각에 대해 계산하였다. 이러한 비율 데이터를 분석하여, 기준선으로부터의 백혈구 수의 25％ 감소로 정의되는 바와 같은 백혈구감소증이 개별적인 동물들에서 발달되었는지 여부를 결정하였다. 예방가능 분율(preventable fraction)을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 의해 기술된 바와 같이 계산하여, 백신접종이 이러한 연구에서 백혈구감소증의 발달을 예방하였는지 여부를 결정하였다.
코 배출: 코 면봉채취물 분석으로부터의 바이러스 단리 데이터는 챌린지 후 BVDV가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다. BVDV-1b 배출에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
바이러스혈증: 챌린지 후 BVDV-1b가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV-1b가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 혈액 샘플의 백혈구연층으로부터의 바이러스 단리 데이터를 분석하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
항체 역가: 맨-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트로 순서 척도 역가의 군 비교를 분석하였다.
직장 온도: 챌린지 전의 평균 직장 온도를 각각의 동물에 대해 결정하였다. 이러한 평균을 군, 일수 및 군*일수 상호작용에 대한 항을 포함한 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)에서 공변량으로 사용하였다.
모든 통계 분석을 마이크로소프트 윈도우®용 SAS 러닝 에디션(SAS Learning Edition) v2.0 (SAS 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute, Inc.), 미국 노스캐롤라이나주 캐리)을 사용하여 수행하였다.
결과
10마리의 백신접종 군 중 1마리 및 9마리의 대조군 중 8마리에서 백혈구감소증이 검출되어, 87％의 예방가능 분율이 초래되었다. 미가공(raw) 백혈구 데이터가 표 2에 기록된다.
<표 2a>
Figure pct00002
<표 2b>
Figure pct00003
<표 2c>
Figure pct00004
<표 2d>
Figure pct00005
각각의 개별적인 송아지에 대한 챌린지 전의 평균의 일일 비율이 표 3에서 제시된다.
<표 3a>
Figure pct00006
<표 3b>
Figure pct00007
<표 3c>
Figure pct00008
<표 3d>
Figure pct00009
10 마리의 백신접종 군 중 1마리 및 9마리의 대조군 중 8마리의 코 분비물로부터 BVDV-1b가 단리되어, 90％의 예방가능 분율이 초래되었다. 이러한 데이터가 표 4에서 제시된다.
<표 4a>
Figure pct00010
<표 4b>
Figure pct00011
<표 4c>
Figure pct00012
<표 4d>
Figure pct00013
+는 양성 결과를 가리키고, -는 음성 결과를 가리킨다.
BVDV-1b가 2마리의 백신접종 송아지 및 9마리 모두의 대조군 송아지의 백혈구연층으로부터 단리되어, 80％의 예방가능 분율이 초래되었다. 이러한 데이터가 표 5에서 제시된다.
<표 5a>
Figure pct00014
<표 5b>
Figure pct00015
<표 5c>
Figure pct00016
<표 5d>
Figure pct00017
백신접종이 BVDV-1b SN 항체 역가에서 통계적으로 유의한 (P<0.05) 증가를 유도하였다. 백신은 BVDV-1a 또는 BVDV-2 SN 역가에서의 유의한 증가를 야기하지 않았다. 개별적인 SN 항체 역가가 표 6에서 제시된다.
<표 6a>
Figure pct00018
<표 6b>
Figure pct00019
직장 온도 데이터의 분석에서 백신접종의 어떠한 통계적으로 유의한 효과도 드러나지 않았다. 직장 온도 데이터가 표 7에서 제시된다.
<표 7a>
Figure pct00020
<표 7b>
Figure pct00021
<표 7c>
Figure pct00022
<표 7d>
Figure pct00023
이러한 연구 과정 동안 어떠한 송아지에서도 BVDV 감염의 임상 징후가 관찰되지 않았다.
건강한 4 내지 5개월령 잡종 암송아지에 1회 용량의 BVBV-1b 백신 (변형된 생 바이러스)을 백신접종하는 것으로 백혈구 감소증에 대해 87％, BVDV-1b의 코 배출에 대해 90％ 및 바이러스혈증에 대해 80％의 조정된 백신 효능 추정값이 산출되었다. 백신접종된 송아지에서의 항원성 반응이 혈청학적 분석에서 또한 드러났다.
실시예 3 - BVDV -1B 바이러스 역계대 평가
본 실시예는 TVL-BVDV-1b MSV의 안정성을 평가하여, 동물에게 투여되었을 때 이의 독력이 되돌아오지 않았음을 확실히 하였다.
1개의 바이러스 앰풀을 해동시키고, TVL-BK 세포에 접종하는데 사용하여, TVL-BVDV-1b+1 (5×107 TCID50/㎖)이 생산되었다. 이러한 바이러스를 사용하여 송아지 당 1×106 TCID50의 비율로 초유를 먹이지 않은 젖소 송아지 10마리의 제1 세트에 비강 내로 접종하였다. 세트 2 내지 5의 송아지에는 선행하는 송아지 세트로부터의 풀링된(pooled) 코 분비물을 비강 내로 접종하였다.
세트 1은 송아지 10마리로 이루어졌고, 세트 2 내지 5의 송아지의 숫자는 이러한 10마리의 제1 세트로부터의 바이러스가 배출된 송아지의 숫자에 따라 송아지 2마리 내지 5마리 범위였다. 각각의 송아지는 단리된 우리에서 유지되었고, 연구의 1차 결과는 송아지에서의 BVDV의 임상 징후의 결여 및 5회 이상의 연속적인 생체내 계대에서의 MS의 유전적 안정성이었다.
바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 결정된 바와 같이 스크리닝 시점에 BVDV-1a, BVDV-1b 또는 BVDV-2 역가가 ≥2이면 실험 단위가 연구에서 배제되었다.
스크리닝 프로세스 동안, 접종일 (제0일)에, 그리고 연구 종결 시에 송아지로부터 혈청학용 혈액 샘플을 수집하였다. 접종 후 제2일 내지 제8일에 세트 1의 각각의 개별적인 송아지로부터 코 분비물을 수집하였다. 이러한 날들 각각에 대한 각각의 개별적인 송아지로부터의 코 분비물의 분취량을 바이러스 단리에 대해 검정하고, 냉동 보관하였다. BVDV-1b를 배출하는 개별적인 송아지의 숫자가 가장 큰 날 (즉, 최대 배출일)을 결정하였고, 이러한 날로부터의 코 분비물 샘플 모두를 풀링하고, 세트 2의 송아지를 접종하는데 사용하였다. 이러한 미리 결정된 최대 배출일에 후속 군의 송아지에서 코 분비물을 수확하였다. 그 후, 이러한 샘플을 바이러스 단리에 대해 검정하고, 바이러스의 존재가 확증될 때까지 냉동 보관하고, 샘플을 풀링하여, 다음 세트의 송아지를 접종하는데 사용하거나, 또는 추가적인 바이러스가 단리되지 않았다.
귀 태그로 송아지를 확인하였고, 이러한 품종에 대한 일반적인 축산 및 관리 관습을 사용하여 6일 내지 8일 동안 우유 대용물에 놓았다.
결과 변수에는 BVDV의 임상 징후, 코 샘플로부터의 바이러스 배출 및 5회의 연속적인 생체내 계대에 걸친 바이러스의 유전적 안정성이 포함되었다. 모든 송아지를 BVDV 감염의 임상 징후에 대해 관찰하였고, 최종 역계대 군은 회수된 바이러스의 투여 후 21일 동안 관찰하였다. 모든 임상 징후를 기록하였고, 임상 질환의 병인학에 대해 결정을 내렸다.
코 분비물 검체를 송아지로부터 취하였다; 각각의 샘플의 개별적인 분취량을 바이러스 단리 및 분석용으로 유지시켰다. 0.2 ㎛ 필터를 통한 멸균 여과에 의해 샘플을 프로세싱하였다. 그 후, TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 샘플을 접종하였다. 플레이트 당 1개의 웰은 미접종으로 유지시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트의 웰 1개에 MS 희석물을 접종하였고, 이는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 3-7％ CO2, 35-39℃의 온도에서 5 내지 7일 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 추가로 5일 내지 7일 동안 제2 플레이트로 하위배양하였다. 전형적인 BVDV-1b 세포변성 형태학을 나타내는 웰로부터의 배지를 추가로 프로세싱하여, PCR 검정법에 의해 감염체의 신원을 결정하였다.
송아지로부터 회수된 최고 계대의 BVDV를 마스터 시드에 비교함으로써 마스터 시드의 유전적 안정성을 분석하였다. 연구의 세트 1의 송아지 10마리 모두로부터의 배출 결여, 또는 독력을 회복하지 않은 바이러스의 단리 (BVDV의 결정적인 임상 징후의 결여로 입증되는 바와 같음)는 성공적인 역계대 연구, 및 MS의 유전적 안정성을 가리켰다.
실시예 4 - 6가 BRDC 백신 (변형된 생 바이러스)의 제조
본 실시예는 상기 기술된 BVDV-1b MS가 혼입된 다가 (6-방식) BRDC 백신의 제조를 기술한다.
물질 및 방법
사용된 미생물
BHV-1: BHV의 쿠퍼(Cooper) (콜로라도(Colorado)) 단리물이 1956년에 상기도 질환에 걸린 소과 동물의 폐로부터 단리되었다 (문헌 [York et al., 1957]). 이러한 마스터 시드 바이러스는 TVL - BHV ( 쿠퍼 ) PO , 1997년 8월 5일 DW -1-21-W로 확인되었다.
BVDV-1a: BVDV-1a의 싱어(Singer) 균주를 APHIS로부터 수득하였다. 이러한 마스터 시드는 TVL - BVD ( 싱어 ) P0 , 1998년 12월 DW4 -29로 확인되었다.
BVDV-1b: BVDV-1b의 TGAC 균주를 APHIS로부터 수득하였다. 이러한 마스터 시드는 TVL-BVDV 1b MS 04/27/2007 DW3 -095로 확인되었다.
BVDV-2: BVDV-2의 125 균주를 APHIS로부터 수득하였다. 이러한 마스터 시드는 TVL - BVDV 2 균주 125 P0 11/01/01 DW3 -90으로 확인되었다.
PI3: PI3의 레이싱어(Reisinger) SF4 균주를 APHIS로부터 수득하였다. 이러한 마스터 시드는 TVL - PI 3 ( 레이싱어 SF -4 P0 , 2001년 4월 2일 ( SM -83)로 확인되었다.
BRSV: BRSV의 N375 균주를 APHIS로부터 수득하였다. 이러한 마스터 시드는 TVL-BRSV P0 2001년 7월 20일 DW3 -87로 확인되었다.
프로토콜
TVL-BK 세포에 생산 시드 바이러스를 접종하기 전에, 세포를 현미경으로 가시화하여 세포가 이전에 기술된 형태학을 나타내고 있었음을 확증하였다. 각각의 생산 바이러스 뱃치를 수확하기 전에, TVL-BK 세포를 관찰하여, 이들이 바이러스와 연관된 전형적인 세포병리학적 효과 (CPE)를 나타내고 있음을 확증하였다.
동결건조 또는 냉동 조건에서의 보관, 및 계대 또는 하위배양 횟수에 대한 제한에 의해 이러한 백신에서 사용된 BHV-1, BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, PI3, 및 BRSV의 독력, 효능, 및 항원성의 일관성이 조장되었다.
생산 바이러스 = MSV+10 (효능 연속 계대), 그러나 5 내지 10 사이의 임의의 계대일 수 있음. 생산 세포 스톡 = MCS+20 (효능 연속 계대), 그러나 또한 20 미만의 임의의 계대일 수 있음.
전형적으로 제조용 바이러스 접종원 (MSV+1 내지 MSV+8) 및 생산 바이러스 접종원 (배타적이지는 않지만 전형적으로 MSV+9 단계임)을 TVL-BK 세포에서 증식시켰다; 단, 바이러스 증식을 위한 TVL-BK 세포의 계대 횟수는 MCS로부터 약 20회의 계대를 초과하지 않는다.
제조용 세포 제제 및 생산 세포 제제에 대한 성장 배지는 5-10％ 말 혈청을 함유하는 DMEM이었다. 상기 기술된 바와 같이 MSV를 제조 및 보관하였다.
활발하게 증식 중인 배양물을 1:3 내지 1:6 (㎠:㎠) 범위의 비로 분할함으로써 배양 용기에 시딩하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 무균 상태에서 성장 배지를 제거하고 1× 트립신-EDTA 용액을 첨가함으로써, 플라스크 또는 롤러 병 (하위배양용으로 의도됨) 내의 TVL-BK를 배양 표면으로부터 방출시켰다. 35 내지 39℃에서 약 5분 동안 인큐베이션한 후, 단층이 분산되었다. 분산된 세포를 성장 배지가 있는 배양 용기 내로 첨가함으로써 트립신을 불활성화시켰다. 시드가 동결건조된 경우에는 냉동된 분취량의 바이러스를 급속히 해동시키거나 또는 배지에 재현탁시켰다. TVL-BK 세포 (+20 이하)에 바이러스를 접종하였다.
적합한 인큐베이션 시간 후 및/또는 CPE가 관찰된 후, 하위배양용으로 의도되는 플라스크 또는 롤러 병에서 복제되고 있는 바이러스를 수집하였다. 바이러스액을 6 내지 -80℃에서 보관하거나, 또는 즉각적으로 다른 배양 용기에 접종하는데 사용할 수 있었다. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 시드 배지 및 생산 배지 양쪽에 접종하였다. 계대 20 이하의 TVL-BK 세포에 접종하였다. 전형적으로 MSV+9인, 냉동된 생산 바이러스 접종원을 급속히 해동시켰다. 전형적으로 바이러스 접종원의 부피는 세포 당 0.01 내지 1.0개 바이러스 범위의 다중 감염을 달성하도록 배양 면적 1600 ㎠ 당 1 내지 25 ㎖ 범위였다.
최소 접종원 역가는 하기와 같았다: BHV에 대해 105.5 TCID50/㎖, BVDV-1a에 대해 105.0 TCID50/㎖, BVDV-1b에 대해 105.0 TCID50/㎖, BVDV-2에 대해 105.0 TCID50/㎖, PI3 바이러스에 대해 106.0 TCID50/㎖, 및 BRSV에 대해 104.5 TCID50/㎖. 접종된 배양물을 37±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. BHV 및 PI3은 2일 내지 4일 동안, BVDV-1a, BVDV-1b, 및 BVDV-2는 4일 내지 6일 동안, BRSV는 5일 내지 8일 동안 인큐베이션하였다.
수확
수확일에, 배양물을 바이러스-특이적 CPE 및 무균성에 대해 시험하였다. 최소 인큐베이션 시간은 BHV 또는 PI3 접종 후 2일, BVDV-1a, BVDV-1b 또는 BVDV-2 접종 후 4일 및 BRSV 접종 후 5일이었다. 최대 인큐베이션 시간은 BHV 또는 PI3 접종 후 4일, BVDV-1a, BVDV-1b 또는 BVDV-2 접종 후 6일 및 BRSV 접종 후 8일이었다.
바이러스 현탁액을 생산 용기로부터 무균 상태에서 수확하였다. 샘플을 수집하여 수확물의 TCID50을 결정하였다. 수확 물질을 6 내지 -80℃의 온도에서 보관하였다. 최종 생성물 제작 전에 수확 물질을 1개월까지 어는 점 이상에서 보관할 수 있었고, 6개월까지 냉동할 수 있었다.
모든 조작을 무균 기술을 사용하여 수행하였다. 네오마이신 및 니스타틴 (마이코스타틴®, 미국 뉴욕주 뉴욕의 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))을 연속 또는 하위연속 백신의 어셈블리 동안 각각 15 ㎍ 및 15 유닛/용량의 비율로 첨가하였다.
수확액을 DMEM으로 희석하고, 0.2 ㎛ 여과 수크로스 용액의 첨가로 안정화시켜, 10±1％의 최종 수크로스 농도가 초래되었다.
10-kDa 분자량 차단값 필터를 사용하는 무균 초여과에 의해 바이러스 수확액을 농축할 수 있었다. 농축 정도는 전형적으로 50배를 초과하지 않았다.
수확된 바이러스액의 뱃치를 분석하여 TCID50을 결정하였다 (예를 들어, 스피어만-카버 방법).
실시예 5 - 6가 BRDC 백신 (변형된 생 바이러스)에 대한 효능 연구
실시예 5 내지 10은 변형된 생 6가 BRDC 백신의 이러한 백신에 함유된 바이러스 각각에 의해 야기되는 질환을 예방하는 것에서의 효과를 입증한다. 이러한 첫번째 실시예에서, 백신은 BVDV-1b에 의해 야기되는 질환을 예방하는데 효과적인 것으로 나타났다.
물질
6가 백신 (변형된 생 바이러스)을 상기 기술된 생산 방법에 따라 제조하였다. 간략하게, BHV-1 (쿠퍼 균주), BVDV-1a (싱어 균주), BVDV-1b (TGAC 균주), BVDV-2 (125), PI3 (레이싱어 SF-4), 및 BRSV (N375)를 TVL-BK 세포주 (20번째 계대)에서 증식시켰다. 개별적인 분획들을 10번째 계대에서 수확하고, 6-방식 생성물로 함께 블렌딩하였다.
결실 위약을 각각의 효능 연속물과 함께 만들었다. 예를 들어, BVDV-결실 위약은 상응하는 효능 연속물과 동일한 BRSV, BHV, 및 PI3 수확물 뱃치를 함유하였다. 배양 배지로 BVDV 성분을 대체하여, 효능 연속물과 BVDV 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하였다. 유사한 결실 위약이 6가 백신 MLV의 각각의 성분에 대해 구축되었다.
실험 방법
각각의 연구에 대해, 약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 취득하고, 랜덤화하고, 귀 태그에 의해 확인하였다. 이러한 송아지들을 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 백신접종 군 및 대조군의 송아지들을 분리된, 인접하지 않았지만 등가인 우리에서 챌린지 2일전 (제-2일)까지 유지시켰고, 이러한 시점에 하나의 우리에서 합쳤다. 모든 송아지에게 제0일에 관심 바이러스의 독성 단리물을 챌린지하였다. 예를 들어, 독성 BVDV-1b (포키 피더스(Poky Feeders) (미국 캔자스주 스캇 시티)에서 우리에서 죽은 송아지의 폐로부터 수득됨)를 10％ 말 혈청이 있는 DMEM을 사용하여 시험관 내에서 TVL-BK 세포 상에서 계대시켰다. 4 ㎖ 내의 약 8×107 TCID50의 챌린지 용량을 각각의 송아지에 투여하였고, 이때 2 ㎖를 흡기 동안 각각의 비도 내로 투여하였다. 송아지는 물, 코스틀 버뮤다(coastal Bermuda) 건초, 및 콕시디오스탯(coccidiostat)을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다.
랜덤화
매칭 랜덤화 계획을 사용하여, 송아지들을 CVB-바이오메트릭스가 제공하는 랜덤화 표 (표 1 참조)를 사용하여 2개의 치료 군 (백신접종 군 또는 위약-백신접종 대조군)에 할당하였다. 슈트에 들어가는 일련의 송아지 3마리를 2:1 비로 2개의 치료 군에 랜덤화하였다. 혈청학적 평가를 위한 최초의 채혈 시점에 양동이에서 무작위로 뽑은 귀 태그로 송아지가 확인되었다. 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다. 챌린지 2일 전 (제-2일)에, 송아지들을 하나의 우리에서 합쳤다.
맹검
맹검 직원은 대조군 또는 백신접종 군의 신원을 알지 못했다. 기록 관리자를 제외하고는, 모든 현장 및 실험실 직원이 연구에 대해 맹검이었다.
결과
선택된 1차 결과는 챌린지 후의 백혈구감소증이었다. 백혈구감소증은 기준선 WBC 수로부터의 25％ 감소로 정의되었다. 백신 효능을 지지하는 기타 결과에는 코 배출물, 바이러스혈증, 발열, 항체 생산 및 바이러스 감염의 임상 징후가 포함되었다.
추정량
개별적인 백혈구 (WBC) 수를 챌린지 전의 평균의 백분율로 변환하고, 연속 간격 척도로 측정하였다. 이러한 변환된 WBC 수 백분율을 챌린지 후 적어도 14일 동안 매일 결정하였고, 이는 평가를 위한 1차 기준으로서의 역할을 하였다. 백혈구감소증의 검출이 챌린지에 대한 저항성 (이환되지 않음) 또는 감수성 (이환됨)을 결정하기 위한 1차 기준으로서의 역할을 하였다. 이환된 군 및 이환되지 않은 군을 비교하여, 백신접종이 바이러스 챌린지 노출 후의 백혈구감소증을 예방하였는지 여부를 결정하였다. 호흡기 질환의 임상 징후, 및 코/백혈구연층 샘플로부터의 바이러스 검출이 챌린지에 대한 감수성을 결정하기 위한 2차 기준으로서의 역할을 하였다. 백혈구감소증 기간 및 배출 기간 (개별적인 송아지로부터 바이러스가 검출된 일수)을 분석하여, 백신접종이 이러한 파라미터들에 대한 경감 효과가 있는지를 결정하였다. 챌린지-전 평균 온도 (기준선)를 공변량으로 사용하여 모든 개별적인 일일 직장 온도를 분석하였다. 연구를 시작할 때 바이러스 역가가 ≥2이면 실험 단위가 연구에서 배제되었다.
샘플 추출 틀 및 방법
효능 연속물 또는 상응하는 결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 챌린지 직전 (제0일)에, 그리고 챌린지 14일 후 (제14일)에 또다시 혈액 샘플을 또한 수집하였다. 감별 WBC 계수 및 바이러스 단리용 혈액 샘플을 제-2일 내지 적어도 제14일까지 수집하였다. 샘플을 EDTA 배큐테이너® (벡톤-디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton-Dickinson and Co.), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크) 튜브에서 수집하고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다. 제-2일 내지 적어도 제14일까지 코 면봉채취물을 바이러스 단리용으로 취하였다.
관찰 및 데이터 수집
제2일 내지 제14일에, 코 샘플 및 혈액 샘플을 수집하고, 바이러스 감염의 임상 징후에 대해 송아지를 관찰하였다. 제-2일 내지 제14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 결정하였다.
WBC 수 데이터를 분석하여, 챌린지 후의 수에서의 감소를 결정하였다. 제-2일 내지 제0일에 대한 WBC 수를 평균함으로써 챌린지 전의 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 일일 백혈구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 WBC 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 또는 관찰자의 재량에 따라 그 이상 각각에 대해 계산하였다. 비율이 25％ 만큼 감소했으면, 개체를 백혈구감소증으로 분류하였다. BBL 컬쳐 스왑® + 리퀴드 스튜어트 배지로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 각각의 송아지로부터 취하였다. 수집일에, 0.2 ㎛ 필터를 통한 멸균 여과에 의해 샘플을 프로세싱하였다. 그 후, TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 샘플을 접종하였다. 플레이트 당 1개의 웰은 미접종으로 유지시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트의 웰 1개에 챌린지 바이러스의 희석물을 접종하였고, 이는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 3-7％ CO2, 35-39℃의 온도에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 배지를 수확하고, -18℃ 내지 -22℃에서 보관하였다. 모든 웰로부터의 배지를 RT-PCR (문헌 [Ridpath and Bolin 1998])로 검정하여, 특정 바이러스가 배양물에 존재하는지를 결정하였다. 바이러스에 대해 배양물-양성인 개체를 "배출"로 분류하였다.
혈액 샘플로부터의 백혈구연층을 사용하여, TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 접종하였다. 플레이트 당 1개의 웰은 미접종으로 유지시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트의 웰 1개에 챌린지 바이러스의 희석물을 접종하였고, 이는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 3-7％ CO2, 35-39℃의 온도에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 배지를 수확하고, -18℃ 내지 -22℃에서 보관하였다. 모든 웰로부터의 배지를 RT-PCR (문헌 [Ridpath and Bolin 1998])로 검정하여, 바이러스가 배양물에 존재하는지를 결정하였다. 특정 바이러스에 대해 양성으로 배양된 개체를 "바이러스혈증성"으로 분류하였다.
각각의 동물에 대한 일일 직장 온도를 연구 중 제-2일과 제14일 사이 (챌린지 2일 전, 챌린지한 날, 및 챌린지 14일 후)에 기록하였다. 제-2일 내지 제0일에 대한 온도를 평균함으로써 챌린지 전의 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 기준선을 공변량으로 사용하여 일일 온도를 분석하였다.
BVDV -1b 항체 역가 : BVDV-1b 효능의 경우, BVDV-1b에 대한 혈청 중화 항체 역가를 최초 백신접종일 (제-21일), 챌린지한 날 (제0일) 및 연구 종결 시에 각각의 동물에 대해 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 방법에 의해 결정하였다. <Special Outline A-17, Titration of Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1 Neutralizing Antibody>의 변형을 사용하여 항체 역가를 결정하였다. 변형된 검정법은 지표물 바이러스로서 BVDV-1a 단리물 대신 세포변성 BVDV-1b 단리물을 사용하였다. ≥8의 항체 역가가 발달된 동물이 BVDV-1b로 혈청-전환된 것으로 간주되었다.
백신접종 군과 대조군 사이의 백혈구감소증, 배출 및 바이러스혈증 기간에서의 차이를 추정하였다 (경감 분율). 챌린지-전 평균 온도 (기준선)를 공변량으로 하여 직장 온도를 분석하였다. 선택된 신뢰도 구간은 95%였다.
백혈구감소증: 백혈구감소증 데이터의 분석은 바이러스 챌린지 후 백혈구감소성인 위약-백신접종 대조군에 비교된 백혈구감소성인 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다. 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 예방가능 분율을 결정함으로써 이를 평가하였다.
배출 및 바이러스혈증 : 배출 및 바이러스혈증 데이터의 분석은 바이러스 챌린지 후 바이러스를 배출하였거나 바이러스혈증성인 위약-백신접종 대조군의 비율에 비교된 바이러스를 배출하였거나 또는 바이러스혈증인 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다. 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 예방가능 분율을 결정함으로써 이를 평가하였다.
문헌 [Fergen (2004)]에 따라 2개의 군 사이의 백혈구감소증 기간에서의 중앙값 차이를 추정하고 경감 분율을 계산하였다. 문헌 [Fergen (2004)]에 따라 2개의 군 사이에서 배출 기간에서의 중앙값 차이 및 바이러스혈증 기간에서의 중앙값 차이를 추정하고 경감 분율을 계산하였다.
임상 관찰: 기준선을 공변량으로 사용하여 군, 일수 및 군*일수 상호작용에 대한 항을 포함하는 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)으로 제1일-제14일에 대한 직장 온도의 분석을 수행하였다. 군*일수 상호작용이 유의한 경우에 (p<0.5), 각각의 시점에 대한 군의 단순 효과를 통해 백신접종 군이 대조군에 비교되었다. 군*일수 상호작용으로부터 이러한 단순 효과 비교를 수득하였다.
통계 분석: 항체 역가의 군 비교를 맨-휘트니 U 테스트로 분석하였다. 모든 통계 분석을 상기 기술된 바와 같이 MS-윈도우®용 SAS 러닝 에디션 v2.0을 사용하여 수행하였다.
실시예 5A - 6가 BRDC 백신에 대한 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 1b (BVDV1b)가 항원성이고 BVDV1b에 의해 야기되는 질환의 예방에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 1회 용량의 백신을 21마리의 BVDV 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 10마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 1회 용량의 생성물 매칭-위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 BVDV1b를 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 BVDV1b 항체 역가를 초래하였고, BVDV1b가 유도하는 바이러스혈증, 코 배출물, 발열, 질환의 임상 징후 및 백혈구감소증을 예방하거나 감소시켰다. 결과적으로, 용량 당 2×103의 최소 BVDV1b-TCID50이 이러한 백신의 BVDV1b 분획에 대해 확립되었다. 이러한 백신은 BHV-1, PI3, BRSV, 1형 BVDV의 2개의 아유전자형 (1a 및 1b) 및 2형 BVDV를 함유하였다.
백신접종, 챌린지 및 샘플 수집: 31마리의 BVDV 음성 송아지를 분류 앨리에서 합쳤다. 각각의 송아지를 이들을 무작위로 무리지어 이동시킬 때, 매칭-세트 랜덤화 체계를 사용함으로써, 앨리를 통과하여 2개의 군 (A군 - 백신접종 군 또는 B군 - 위약 백신접종 대조군) 중 하나로, 한번에 송아지 3마리를 문에서 차단하였다.
21마리의 송아지에 1회 용량의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 백신, 변형된 생 바이러스를 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물을 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공하였다. 10마리의 송아지에게 생성물-매칭 위약 백신 (BVDV 결실)을 백신접종하였다. 챌린지하기 2일 전에, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두를 챌린지 전의 임상 관찰의 목적으로, 그리고 기준선 체온 및 WBC 판독값을 취득하기 위해 합쳤다. 백신접종 21일 후에 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 우리에서 죽은 송아지의 폐로부터 수득된 BVDV1b의 독성 단리물을 챌린지하였다. 둘베코 변형 이글 배지 + 10％ 말 혈청을 사용하여 TVL-BK 세포 상에서 바이러스가 시험관 내에서 계대되었다. 4 ㎖ 내의 4×107 TCID50의 챌린지 용량을 각각의 송아지에 투여하였고, 이때 2 ㎖를 흡기 동안 각각의 비도 내로 투여하였다.
항체 역가를 결정하기 위한 혈액 샘플을 백신접종 전, 챌린지한 날 (백신접종 21일 후), 및 챌린지 14일 후에 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 소 바이러스성 설사 바이러스 항체 역가를 결정하였다.
리퀴드 스튜어트 배지 내의 BBL 컬쳐 스왑®로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 바이러스 단리용 코 면봉채취물을 수집하였다.
EDTA 베큐테이너 튜브 내로의 정맥천자에 의해 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 백혈구연층 바이러스 단리용 혈액 샘플을 각각의 송아지로부터 수집하였다.
챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 매일 기록하였다.
각각의 송아지에 대해 임상 관찰을 행하고 기록하였다. 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 관찰자는 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다. 실험실 직원은 송아지의 백신접종 상태를 알지 못했다.
챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후의 연속적인 14일에 감별 WBC 수를 결정하기 위한 혈액 샘플을 수집하였다. EDTA 배큐테이너 튜브에서 샘플을 수집하였고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다.
BVDV 검출: 세포 배양물-강화 PCR 기술을 이용하여, 수집된 샘플 내의 BVDV1b를 검출하였다. 간략하게, 코 샘플을 배양 중인 TVL-BK 세포 상으로 멸균 여과 (0.2 ㎛)에 의해 프로세싱하였다. 백혈구연층을 45-75분 동안 배양 중인 TVL-BK 세포 상에 직접 놓은 후, 세포를 세정하여 제거하였다. 배양물을 4일 동안 37℃±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. 모든 배양 샘플로부터의 상청액을 통상적인 RT qPCR 방법론 및 하기의 프로브/프라이머 세트를 사용하여 BVDV1b의 존재에 대해 개별적으로 검정하였다:
전방향 프라이머 : CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC (서열 1)
역방향 프라이머: TGCCCACAGCACATCTTAACC (서열 2)
택맨(TaqMan) MGB 프로브: TCACCTGGACGACCC (서열 3)
이러한 방법은 문헌 [Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhea virus (BVDV) by PCR, Julia F. Ridpath and Steven R. Bolin, Molecular and Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148]을 기초로 개발되었다. 이러한 방법은 문헌 [Center for Veterinary Biologics and National Veterinary Services Laboratories Test Protocol - Genotyping Bovine Viral Diarrhea Virus, Number BPPR02010.01]을 또한 기초로 하였다. BVDV의 유전자형 및 및 아유전자형을 구별하는 이러한 방법들 양쪽 모두는 게놈의 5' 비번역 영역 (UTR)에 존재하는 유전적 차이를 이용한다. 이러한 프로브/프라이머 세트는 독특한 BVDV1b 서열이 고도로 특이적인 프로브에 의해 검출될 수 있는 5' UTR의 절편을 증폭시키도록 특이적으로 디자인되었다. 프로브/프라이머 세트의 특이성이 사내에서 확증되었고, 이는 BHV, PI3, BRSV, BVDV1a, 또는 BVDV2와 교차 반응하지 않았다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7500 상에서 택맨® 기반 검정법을 사용하여 RT qPCR 검정법을 수행하였다.
통계 분석: 항체 역가: 맨-휘트니 U 테스트로 순서 척도 역가의 군 비교를 분석하였다.
바이러스혈증 : 챌린지 후 BVDV1b가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV1b가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 혈액 샘플의 백혈구연층으로부터의 바이러스 단리 데이터를 분석하였다. BVDV1b 바이러스혈증에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
코 배출: 코 면봉채취물 분석으로부터의 바이러스 단리 데이터는 챌린지 후 BVDV1b가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV1b가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다. BVDV1b 배출에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
직장 온도: 챌린지 전의 평균 직장 온도를 각각의 동물에 대해 결정하였다. 이러한 평균을 군, 일수 및 군*일수 상호작용에 대한 항을 포함한 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)에서 공변량으로 사용하였다.
질환의 임상 징후: 질환의 임상 징후를 각각의 관찰자가 독립적으로 매일 기록하였다. 1일 이상의 챌린지 후의 관찰일에 대해 징후를 나타내는 임의의 송아지가 "이환된" 것으로 간주되었다. 임상 징후에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
백혈구감소증: 제-2일 내지 제0일에 대한 백혈구 수를 평균함으로써 챌린지 전의 백혈구 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 일일 백혈구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 백혈구 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 각각에 대해 계산하였다. 이러한 비율 데이터를 분석하여, 기준선으로부터의 백혈구 수의 40％ 감소로 정의되는 바와 같은 백혈구감소증이 개별적인 동물들에서 발달되었는지 여부를 결정하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 의해 기술된 바와 같이 계산하여, 백신접종이 이러한 연구에서 백혈구감소증의 발달을 예방하였는지를 결정하였다.
모든 통계 분석을 윈도우용 SPSS 버전 16을 사용하여 수행하였다.
결과
혈청 중화 항체 역가 : 이러한 연구의 송아지 모두가 백신접종 전의 BVDV (BVDV1a, BVDV1b 및 BVDV2) 혈청 중화 항체 역가가 <1:2였다. 챌린지한 날에 (제21일), 백신접종 군의 평균 BVDV1b 역가는 1:83이었고, 이는 대조군의 것 <1:2보다 유의하게 (p≤0.05) 더 컸다. BVDV1b 항체 역가가 대조군 및 백신접종 군 송아지 양쪽 모두에서 챌린지 14일 후에 증가하였고, 이는 송아지가 BVDV1b로 챌린지되었음을 가리킨다.
백혈구연층으로부터의 BVDV1b 단리: 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 모두가 이러한 연구의 챌린지 후의 단계 동안 바이러스혈증성이었다. 그러나, 대조군 송아지 중 7마리가 BVDV 챌린지-후 바이러스혈증이 전형적으로 관찰되는 임계 시간틀 동안 바이러스혈증성이었다. 3마리의 대조군 송아지 (1, 14, 30)가 챌린지한 날에 바이러스혈증성이었다. 챌린지 다음날 이러한 송아지 3마리가 송아지 26과 함께 바이러스혈증성이었다. 이러한 관찰은 혈청학적 데이터, 코 면봉채취물 단리 데이터 및 직장 온도 데이터와 함께 이러한 송아지들이 연구의 백신접종 단계에서 후기에 천연적으로 감염되었고, 바이러스혈증성이 되었으며, 이러한 연구의 챌린지 단계에서 초기에 배출을 시작하였음을 시사한다. 이러한 송아지 4마리 중 1마리 (송아지 30)가 전형적인 챌린지-후 바이러스혈증/배출 기간 동안 바이러스혈증성이 되었고 바이러스를 배출하였다. 21마리의 백신접종 군은 챌린지-후 기간 동안 바이러스혈증성이 아니었다. 천연적으로 보호된 3/10 대조군 및 보호된 21/21 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 1.0의 예방가능 분율을 초래하였다.
코 면봉채취물로부터의 BVDV1b 단리: 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 모두가 이러한 연구의 챌린지-후 단계 동안 BVDV1b를 배출하였다. 그러나, 대조군 송아리 중 7마리가 BVDV 챌린지-후 배출이 전형적으로 관찰되는 임계 시간틀 동안 배출성이었다. 대조군 송아지 2마리 (26 및 30)가 챌린지한 날에 배출성이었다. 대조군 송아지 3마리 (1, 14 및 30)가 챌린지 다음 날 배출성이었다. 이러한 관찰은 혈청학적 데이터, 코 면봉채취물 단리 데이터 및 직장 온도 데이터와 함께 이러한 송아지들이 연구의 백신접종 단계에서 후기에 천연적으로 감염되었고, 바이러스혈증성이 되었으며, 이러한 연구의 챌린지 단계에서 초기에 배출을 시작하였음을 시사한다. 이러한 송아지 4마리 중 1마리 (송아지 30)가 전형적인 챌린지-후 바이러스혈증/배출 기간 동안 바이러스혈증성이 되었고 바이러스를 배출하였다. 21마리의 백신접종 군 중 1마리만 챌린지-후 기간 동안 BVDV1b를 배출하였다. 천연적으로 보호된 3/10 대조군 및 보호된 20/21 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 0.93의 예방가능 분율을 초래하였다.
직장 온도: 데이터 분석은 유의한 군*일수 상호작용을 가리켰다 (p=0.034). 일수에 의한 분석은 대조군에서의 온도가 챌린지 후 제1일, 제4일, 제7일 및 제8일에 백신접종 군의 온도보다 유의하게 (p<0.05) 더 높았음을 가리켰다. 제12일에, 대조군의 직장 온도가 떨어졌고, 백신접종 군의 것보다 유의하게 (p<0.05) 낮았다.
BVDV1b 의 임상 징후: 대조군의 송아지 10마리 중 8마리 (8/10 이환)가 BVDV1b 감염에 기인할 수 있는 임상 징후를 나타냈다. 임상 징후에는 설사, 다량의 맑은 코 분비물, 가쁜 호흡 및 눈 분비물이 포함되었다. 백신접종 군의 송아지는 연구의 챌린지-후 단계 동안 이러한 임상 징후 중 어떤 것도 나타내지 않았다 (0/21 이환). 천연적으로 보호된 2/10 대조군 및 보호된 21/21 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 1.0의 예방가능 분율을 초래하였다. 어떠한 송아지에서도 유해한 백신접종-후 반응이 관찰되지 않았다.
백혈구감소증: 백신접종 군 21마리 중 4마리 및 대조군 10마리 중 5마리에서 백혈구감소증이 검출되어, 62％의 예방가능 분율이 초래되었다.
결론
선행 보고는 BVDV1b에 의해 야기되는 질환의 예방에서의 보조물로서의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 BVDV1b 분획의 항원성 및 효능을 입증한다.
이러한 조합 생성물의 BVDV1b 분획의 항원성 및 효능이 하기에 의해 입증되었다:
1) 대조군과 비교하여 백신접종 군에서의 BVDV1b에 대한 항체 역가의 유의한 증가. 백신접종 군의 모든 송아지에서 1회의 2 ㎖ 용량의 투여 후 ≥ 1:8의 BVDV1b 역가가 발달되어, 9CFR 113.311 (c) (5)에서 정의된 요건을 충족시켰다.
2) 바이러스 단리 연구에서, 1회 용량의 투여가 챌린지 후의 BVDV1b-유도 바이러스혈증 및 코 배출의 유의한 감소를 초래하였음이 드러났다.
3) 백신접종된 송아지가 대조군 송아지에 비교하여 유의하게 더 낮은 열을 나타냈고, 질환의 임상 징후를 나타내지 않았다.
4) 백신접종이 BVDV1b-유도 백혈구감소증이 발달될 가능성을 또한 감소시켰다.
이러한 연구는 대조군의 송아지 중 3마리 이상이 챌린지 직전에 BVDV1b에 감염되었다는 사실에 약간 영향을 받았다. 감염된 송아지를 포함하여 모든 대조군 송아지가 챌린지 시점에 여전히 혈청-음성이었다는 사실로 인해, 연구의 백신접종 단계에서 후기에 천연 노출이 일어난 것으로 결론지어졌다. 백신접종 군에서는 천연 노출의 임상 증거가 없었고, 이는 챌린지하기 2일 전까지 대조군과 별도로 유지되었기 때문일 것이다. 전형적인 육성우/비육우 송아지 환경에서의 챌린지 연구를 수행할 때 천연 노출 가능성이 필연적이다. 문헌 [Tanner and Morgan]에 따르면, 예방가능 분율에 의해 결정되는 바와 같은 백신 효능의 추정치는 여러 수준의 자연 면역에 대해 관찰된 보호와 백신 유효성 사이의 관계를 고려한다.
이러한 연구의 결과는 통계적으로 유의하고 임상적으로 관련이 있어서, 백신 내에 함유된 BVDV1b 분획의 효능을 입증한다.
실시예 6 - BRSV 효능 프로토콜
이러한 실시예는 6가 MLV 백신의 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV) 분획이 BRSV에 의해 야기되는 질환의 예방에서 도움이 된다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
BVDV-1b에 대해 실시예 5에 기술된 것과 유사한 방식으로 효능 연속물과 함께 BRSV 결실 위약을 제조하여 사용하였다. 이러한 BRSV 결실 위약은 효능 연속물과 동일한 BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, BHV 및 PI3 수확물 뱃치를 함유하였고, 이때 효능 연속물과 BRSV 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하기 위해 배양 배지로 BRSV 성분을 대체하였다. 본원에 기술된 바와 같이 멸균 희석제를 사용하여 6가 MLV 백신 및 BRSV 결실 위약 양쪽 모두를 재수화시켰다.
실험 방법
출처, 유형, 체중 및 연령이 대략적으로 동일한 비교적 균질한 집단으로부터의 약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 사용하였다. 송아지들을 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 이러한 프로토콜에서 동일한 마릿수의 백신접종 군 및 대조군 송아지를 사용하였다; 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리된, 인접하지 않았지만 등가인 우리에서 유지시켰고, 챌린지하기 2일 전 (제-2일)에 하나의 우리에서 합쳤다. 송아지는 물, 코스틀 버뮤다 건초, 및 콕시디오스탯을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다.
랜덤화
매칭 랜덤화 계획을 사용하여, 송아지들을 CVB-바이오메트릭스 랜덤화 표를 사용하여 2개의 치료 군 (백신접종 군 또는 위약-백신접종 대조군)에 할당하였고, 이때 슈트에 들어가는 일련의 송아지 3마리를 2:1 비로 2개의 치료 군에 랜덤화하였다. 혈청학적 평가를 위한 최초의 채혈 시점에 양동이에서 무작위로 뽑은 귀 태그로 송아지가 확인되었다.
맹검
모든 직원은 연구에 대해 맹검이었고 (기록 관리자 제외), 대조군 또는 백신접종 군의 신원을 알지 못했다.
결과
1차 결과는 챌린지 후의 BRSV 바이러스의 코 배출의 예방였고, 이는 프로토콜 동안 모든 송아지의 콧구멍에서 매일 수집된 코 샘플 내의 BRSV의 존재 또는 부재에 의해 결정되었다. 기타 2차 결과에는 BRSV 감염의 하나 이상의 임상 징후의 감소, 발열 감소, 및/또는 BRSV를 배출하는 송아지에서의 배출 기간의 감소가 포함될 수 있었다.
백신접종 군 및 대조군의 BRSV 배출을 챌린지 후 14일 동안 매일 결정하였고, 이때 BRSV 검출이 챌린지에 대한 저항성 (이환되지 않음) 또는 감수성 (이환됨)을 결정하기 위한 1차 기준으로서의 역할을 하였다. 이환된 군 및 이환되지 않은 군을 비교하여, 백신접종이 BRSV 챌린지 노출 후의 BRSV 배출을 예방하였는지를 결정하였다. 호흡기 질환의 임상 징후가 챌린지에 대한 감수성 또는 저항성을 결정하기 위한 2차 기준으로서의 역할을 하였다. 배출 기간 (개별적인 송아지로부터 BRSV가 검출된 일수)을 분석하여, 백신접종이 이러한 파라미터에 대한 경감 효과가 있는지를 결정하였다. 챌린지-전 평균 온도 (기준선) 공변량에 대해 모든 개별적인 일일 직장 온도를 분석하였다. 연구를 시작할 때 BRSV SN 역가가 >2이면 실험 단위가 배제되었다.
샘플 추출 틀 및 방법
효능 연속물 또는 BRSV-결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였고, 챌린지 직전 (제0일)에 또다시, 그리고 챌린지 14일 후 (제14일)에 또다시 수집하였다.
관찰 및 데이터 수집
BBL 컬쳐 스왑® + 리퀴드 스튜어트 배지로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 각각의 송아지로부터 취하였다. 샘플로부터의 배지를 BRSV를 특이적으로 검출하기 위한 프로브/프라이머 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 BRSV의 존재에 대해 검정하였다.
전방향 프라이머: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (서열 4);
역방향 프라이머: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (서열 5); 및
BRSV 택맨® MGB 프로브: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (서열 6).
기간 데이터를 분석하여, 백신접종이 BRSV가 코 샘플에서 검출된 기간에 대한 경감 효과가 있는지를 입증하였다.
임상 관찰: 각각의 동물에 대한 일일 직장 온도를 제-2일과 제14일 사이 (챌린지 2일 전, 챌린지한 날, 및 챌린지 14일 후)에 기록하였고, 이때 제-2일 내지 제0일에 대한 온도 값을 평균함으로써 챌린지 전의 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 그 후, 기준선을 공변량으로 사용하여 일일 온도를 분석하였다.
연구 중 백신접종일, 제0일 및 제14일에 각각의 동물에 대해 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 방법 (문헌 [Schefers et al., 2008])에 의해 혈청-중화 항체 역가를 결정하였다.
육우 송아지에서의 BRSV의 임상 징후가 기존에 문헌 [Baker (1986)]에서 기술되었다. 임상 징후에는 코 분비물 및 눈 분비물, 호흡율 증가, 직장 온도 상승, 가벼운 우울증, 먹이 섭취 감소, 과다침분비 및 호흡곤란이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 챌린지에서 사용된 바이러스가 시험관 내에서의 증식에 의해 약독화되었기 때문에 전통적인 챌린지 모델에서 BRSV 감염의 임상 징후가 덜 명백하고, 이러한 모델에서 평가하는 것에서의 유일한 중요한 파라미터는 바이러스 배출이다 (문헌 [Wren, 2001]). 결과적으로, 챌린지 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 14일 동안에 임상 징후를 기록하였다. BRSV의 임상 징후의 관찰이 데이터 분석 동안 고려되었지만, 1차 결과로서는 고려되지 않았는데, 이러한 징후들이 상업용 가축에서 통상적으로 발견되는 다수의 호흡기 질환을 가리킬 수 있기 때문이다.
이환됨 또는 이환되지 않음으로 분류되는 백신접종 군 및 위약 백신접종 대조군의 비율을 추정하였고 (예방 분율), 백신접종 군과 대조군 사이의 배출 기간의 차이도 추정하였다 (경감 분율).
6가 MLV 백신의 BRSV 바이러스 분획의 효능을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 예방가능 분율을 결정함으로써 쉽게 평가할 수 있다. 이러한 분석은 BRSV 챌린지에 대해 저항성인 위약 백신접종 대조군의 비율에 비교된 바와 같은 저항성인 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다.
통계 분석: 문헌 [Fergen (2004)]의 방법에 따라 2개의 군 사이의 배출 기간에서의 중앙값 차이를 추정하고 경감 분율을 계산할 수 있었다. 항체 역가의 군 비교를 맨-휘트니 U 테스트로 분석할 수 있었다. 모든 통계 분석을 상기 기술된 바와 같이 마이크로소프트 윈도우®용 SAS 러닝 에디션 2.0을 사용하여 수행하였다.
실시예 6A - BRSV 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV) 분획이 항원성이고 육성우/비육우 송아지에서의 소 호흡기 세포융합 바이러스의 배출 예방에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 1회 용량의 백신을 22마리의 BRSV 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 11마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 1회 용량의 생성물 매칭-위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 BRSV를 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 BRSV 항체 역가를 초래하였고, 챌린지 후의 BRSV 배출을 예방하였다. 결과적으로, 용량 당 7×102의 최소 BRSV-TCID50이 이러한 백신의 BRSV 분획에 대해 확립되었다.
물질 및 방법
송아지 백신접종 및 챌린지 : 33마리의 BRSV 음성 송아지를 분류 앨리에서 합쳤다. 각각의 송아지를 이들을 무작위로 무리지어 이동시킬 때, CVB-바이오메트릭스가 제공하는 매칭-세트 랜덤화 체계를 사용함으로써, 앨리를 통과하여 2개의 군 (A군 - 백신접종 군 또는 B군 - 위약 백신접종 대조군) 중 하나로, 한번에 송아지 3마리를 문에서 차단하였다.
22마리의 혈청학적으로 음성인 송아지에 1회 용량의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 백신, 변형된 생 바이러스를 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물을 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공하였다. 11마리의 송아지에게 생성물-매칭 위약 백신 (BRSV 결실)을 백신접종하였다. 코 면봉채취물을 수집하고, 송아지에서 채혈하고, 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 BRSV에 대한 감수성을 확증하기 위해 혈청학적으로 스크리닝하였다. 챌린지하기 2일 전에, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두를 챌린지 전의 임상 관찰의 목적으로 합쳤다. 백신접종 32일 후에 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 4 ㎖ (콧구멍 당 2 ㎖)의 TVL-BRSV, N375 단리물을 챌린지하였다. 챌린지 바이러스를 챌린지 직전에 적정하였고 (106.6/㎖의 TCID50), 다시 챌린지 직후에 적정하였다 (106.2/㎖의 TCID50). 챌린지 프로세스 전반에 걸쳐 챌린지 바이러스를 냉각 상태로 유지시켰다.
혈액 샘플을 백신접종일, 챌린지한 날, 및 챌린지 14일 후에 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 소 호흡기 세포융합 바이러스 항체 역가를 결정하였다.
백신접종일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 수집하였다.
챌린지 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 매일 기록하였다.
임상 관찰을 행하였다. 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 관찰자는 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다. 실험실 직원은 송아지의 백신접종 상태를 알지 못했다.
BRSV 검출: 리퀴드 스튜어트 배지 내의 BBL 컬쳐 스왑®으로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해 코 면봉채취물을 수집하였다. 세포 배양물-강화 PCR 기술과 함께 BRSV 특이적 CPE의 시각 관찰을 이용하여, 수집된 샘플 내의 BRSV를 검출하였다. 간략하게, 샘플을 배양 중인 TVL-BK 세포 상으로 멸균 여과 (0.2 ㎛)에 의해 프로세싱하였다. 배양물을 5일 동안 37℃±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. 배양물을 BRSV 특이적 CPE에 대해 관찰하고, 결과를 기록하였다. 모든 배양 샘플 (+ CPE 및 - CPE 양쪽 모두)로부터의 상청액을 문헌 [M. Boxus et al., Real Time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus, M. Boxus, C. Letellier, P. Kerkhofs, Journal of Virological Methods, 125 (2005) 125-130]에 기술된 프로브/프라이머 세트를 사용하여 BRSV의 존재/부재에 대해 개별적으로 검정하였다. 프로브/프라이머 세트의 특이성이 사내에서 확증되었고, 이는 BHV, PI3, BVDV1a, BVDV1b 또는 BVDV2와 교차 반응하지 않았다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 상에서 택맨® 기반 검정법을 사용하여 RT qPCR 검정법을 수행하였다.
BRSV 특이적 CPE 양성인 샘플 모두가 또한 PCR 양성이었다. BRSV 특이적 CPE에 대해 음성이고 PCR 검정법에 의해 BRSV에 대해 양성인 샘플이 10개 있었다. 이는 BRSV 특이적 CPE의 관찰을 기초로 하는 검정법보다 PCR을 기초로 하는 검정법이 더욱 민감하다는 것을 가리키는 사내 연구와 일치하였다. 1차 배양 후에 BRSV에 대해 음성인 샘플을 하위배양하였고, 하위배양된 유체로부터의 상청액을 동일한 방법에 따라 BRSV의 존재/부재에 대해 검정하였다.
통계 분석: 이러한 백신의 BRSV 분획의 효능은 챌린지 후 BRSV를 배출한 대조군의 비율에 비교된 바와 같은 BRSV를 배출한 백신접종 군의 비율을 주로 기초로 하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다. 연구에서 개별적인 송아지로부터 BRSV가 단리된 챌린지 후의 일수를 평가하였다. 군들을 비교하여, BRSV 챌린지 후에 대조군에 비교하여 백신접종 군에서 BRSV 단리 (배출) 빈도가 유의하게 감소되었는지를 결정하였다.
맨-휘트니 U 테스트로 순서 척도 역가 데이터의 군 비교를 비교하였다. 챌린지 전의 온도 평균을 공변량으로 사용하여 직장 온도를 분석하였다. 제1일-제14일에 대한 챌린지-후 온도의 분석을 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)으로 수행하였다. 모든 통계 분석을 윈도우용 SAS를 사용하여 수행하였다.
결과
혈청 중화 항체 역가 : 이러한 연구의 송아지 모두가 백신접종 전의 혈청 중화 항체 역가가 <1:2였다. 백신접종 후의 혈청 중화 항체 역가가 대조군의 것과 비교하여 백신접종 군에서 유의하게 (p≤0.05) 더 컸다. 22마리의 백신접종 송아지 중 21마리가 백신접종 후 BRSV 역가의 증가를 나타낸 반면, 위약-백신접종 대조군의 11마리 모두는 백신접종 기간에 걸쳐 챌린지 전까지 음성으로 유지되었다. 백신접종 군의 평균 항체 역가는 8.5인 한편, 대조군의 평균 역가는 <2였다.
BRSV 단리: 이러한 연구의 대조군 송아지 11마리 모두가 이러한 연구의 챌린지 후의 단계 동안 BRSV를 배출하였다. 이러한 시간 동안 22마리의 백신접종 군 중 3마리만 BRSV를 배출하였다. 이는 0.8636의 예방가능 분율을 초래하였다. 배출 빈도에서의 차이 또한 유의하였다 (p<0.05). 대조군은 평균 6.00일 동안 BRSV를 배출한 한편, 백신접종군은 0.227일 동안만 배출하였다. 이는 5.773일 차이였다.
직장 온도: 챌린지-전 평균 온도를 공변량으로 사용하는 챌린지-후 직장 온도 분석에서 군들 간에 통계적으로 유의한 차이가 드러나지 않았다. 이러한 데이터의 추가적인 분석을 추진하지 않았다.
BRSV 의 임상 징후: 각각의 동물을 챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날, 및 챌린지 후의 연속적인 14일에 호흡기 질환의 임상 징후에 대해 시험하였다. 확정적으로 BRSV 감염에 기인할 수 있는 임상 징후가 관찰되지 않았다. 그러나, 송아지가 활발하게 BRSV를 배출하는 기간과 동일한 기간 동안 과도한 맑은 코 분비물이 11마리의 대조군 중 7마리에 대해 임상 징후로서 기록되었다. 연구 동안 백신접종 군에 대해서는 임상 징후가 기록되지 않았다. 어떠한 송아지에서도 유해한 백신접종-후 반응이 관찰되지 않았다.
결론
선행 보고는 육성우/비육우 송아지에서 BRSV의 배출 예방에서의 보조물로서 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 BRSV 분획의 효능을 입증한다.
이러한 조합 생성물의 BRSV 분획의 효능 및 항원성이 하기에 의해 입증되었다:
1) 바이러스 (BRSV) 단리 연구에서, 1회 용량 백신의 투여가 대조군에서의 100％ (11/11) 감수성에 비교하여 백신접종 송아지에서의 86％ (19/22) 보호를 제공하였음이 드러났다 (예방가능 분율 = 0.8636).
2) 대조군과 비교하여 백신접종 군에서의 배출 빈도의 유의한 감소. 대조군 송아지는 백신접종 군보다 5.773 일 더 길게 BRSV를 배출하였다.
3) 대조군과 비교하여 백신접종 군에서의 BRSV에 대한 항체 역가의 유의한 증가.
실시예 7 - IBR ( HBV -1) 효능 프로토콜
이러한 실시예는 6가 MLV 백신의 BHV-1 바이러스 분획이 IBR의 예방에서 도움이 된다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
변형된 6가 생 바이러스 백신을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, BHV-1 (쿠퍼 균주), BVDV-1a (싱어 균주), BVDV-1b (TGAC 균주), BVDV-2 (125), PI3 (레이싱어 SF-4), 및 BRSV (N375)를 TVL-BK 세포주 (20번째 계대)에서 증식시켰다. 개별적인 분획들을 10번째 계대에서 수확하고, 6-방식 생성물로 함께 블렌딩하였다.
BHV-1-결실 위약을 효능 연속물과 함께 만들었다. BHV-1 결실 위약은 효능 연속물과 동일한 BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, PI3 및 BRSV 수확물 뱃치를 함유하였다. 배양 배지로 BHV-1 성분을 대체하여, 효능 연속물과 BHV-1 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하였다. 멸균 희석제를 사용하여 백신 및 BHV-1 결실 위약 양쪽 모두를 재수화시켰다.
약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 상기 기술된 바와 같이 랜덤화시킨 후, 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 모든 송아지는 물, 코스틀 버뮤다 건초, 및 콕시디오스탯을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다. 송아지에 사료가 공급된 후에는, 이어서 건초 이용가능성이 제한될 수도 있었다.
대략적으로 20마리 이상의 백신접종 군 송아지 및 10마리 이상의 대조군 송아지가 이러한 단일 수준 연구에서 사용되었다. 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다. 그 후, 챌린지 2일 전 (제-2일)에 송아지들을 하나의 우리에서 합쳤다.
랜덤화
송아지의 매칭 랜덤화 계획을 사용하여, 송아지들을 2개의 치료 군 (백신접종 군 또는 위약-백신접종 대조군)에 할당할 수 있었다. 예를 들어, 슈트에 들어가는 일련의 송아지 3마리를 2:1 비로 2개의 치료 군에 랜덤화할 수 있었다. 혈청학적 평가를 위한 최초의 채혈 시점에 양동이에서 무작위로 뽑은 귀 태그를 사용하여 송아지를 확인하였다.
맹검
맹검 직원은 대조군 또는 백신접종 군의 신원을 알지 못했고, 모든 현장 및 실험실 직원 (기록 관리자 제외)이 연구 기간 동안 맹검이었다.
결과
이러한 연구의 1차 결과는 IBR과 연관된 코 병변에서의 차이였다. 이는 코 병변의 존재 또는 부재로 정의된다. 코 병변의 기간 및 중증도, 콧구멍으로부터의 BHV-1 단리 및 체온이 포함되는 IBR의 기타 임상 징후가 모두 2차 결과로서 고려되었다.
코 병변 점수 자체는 순서 카테고리로서 추정되었다. IBR에 특징적인 가시적인 코 점막에서의 병변의 기간 및 중증도 양쪽 모두가 평가용 기준으로서의 역할을 하였다. 호흡기 질환의 임상 징후 및 코 배출 또한 챌린지에 대한 저항성 (이환되지 않음) 또는 감수성 (이환됨)을 결정하기 위한 기준으로서 사용될 수 있었다. 챌린지 전-평균 온도 (기준선)를 공변량으로 사용하여 개별적인 일일 직장 온도를 일상적으로 분석하였다.
연구를 시작할 때 BHV-1 SN 역가가 ≥2이면 실험 단위가 연구에서 배제되었다.
효능 연속물 또는 BHV-1 결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 챌린지 직전 (제0일)에, 그리고 챌린지 14일 후 (제14일)에 또다시 혈액 샘플을 또한 수집하였다.
샘플 추출 틀, 데이터 수집, 및 임상 관찰
제0일 내지 제14일에, 코 샘플을 수집하고, 시각적인 코 점막에서의 병변 및 IBR의 임상 징후에 대해 송아지를 관찰하였다. 제-2일 내지 제14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 결정하였다.
결과 변수에는 IBR과 일관되는 시각적인 코 점막의 병변, 직장 온도, 바이러스 단리, 항체 역가 및 IBR의 임상 징후가 포함되었다.
IBR의 총체적인 코 병변이 문헌 [Rosner (1968)]에서 기술되었다. 관찰된 전형적인 병변에는 비도의 염증 및 부종 + 출혈 및 점막 내층에 부착된 섬유괴사성 삼출물이 포함되었다. 로스너(Rosner)는 때때로 괴사성 삼출물이 비도에서 매우 광범위하여, 기저 조직으로부터 분리되는 위막성 삼출물을 형성한다는 것을 보고하였다. 로스너는 이러한 병리학적 발견이 IBR의 추정 진단을 내리는 것에서 고도의 일관성을 제공한다는 것을 또한 보고하였다. 확립된 기준에 따라 코 병변 점수를 할당할 수 있었고, 기간 데이터를 분석하여 백신접종이 이러한 병변이 관찰되는 기간에 대한 경감 효과가 있는지 여부를 입증할 수 있었다.
직장 온도 평가, 바이러스 단리, 항체 역가, 및 통계 방법은 이전의 실시예에 기술된 바와 같았다. IBR의 임상 징후는 문헌 [Rosner (1968)]에 기술되어 있고, 가쁜 호흡, 식욕부진, 발열, 기침, 코 분비물, 체중 감소 및 컨디션 상실을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 챌린지 2일 전, 챌린지한 날, 및 챌린지 후 14일 동안 임상 징후를 기록하였다. IBR의 임상 징후의 관찰을 데이터 분석 동안 고려할 수 있지만, 이를 1차 결과로 고려하지는 않았는데, 이는 이러한 징후들이 상업용 가축에서 통상적으로 발견되는 다수의 다른 호흡기 질환을 또한 가리킬 수 있기 때문이었다.
통계 분석: 항체 역가의 군 비교를 맨-휘트니 U 테스트로 분석하였다. 모든 통계 분석을 상기 기술된 바와 같이 MS-윈도우®용 SAS 러닝 에디션 v2.0을 사용하여 수행하였다.
실시예 7a - IBR (HBV-1) 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 소 헤르페스 바이러스-1 (BHV-1) 분획이 항원성이고 감염성 소 비기관염 (IBR)의 감소에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 2회 용량의 백신을 22마리의 BHV-1 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 12마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 2회 용량의 생성물-매칭 위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 BHV-1을 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 BHV-1 항체 역가 및 IBR과 연관된 코 병변의 기간 및 중증도 양쪽에서의 감소를 초래하였다. 백신접종은 송아지에서 BHV 챌린지에 전형적으로 뒤따르는 배출 및 발열 반응의 기간을 또한 감소시켰다. 결과적으로, 이러한 백신의 BHV-1 분획에 대해 용량 당 5×103의 최소 BHV-1 TCID50이 확립되었다.
물질 및 방법
송아지 백신접종 및 챌린지 : 34마리의 BHV-1 음성 송아지를 분류 앨리에서 합쳤다. 각각의 송아지를 이들을 무작위로 무리지어 이동시킬 때, CVB-바이오메트릭스가 제공하는 매칭-세트 랜덤화 체계를 사용함으로써, 앨리를 통과하여 2개의 군 (A군 - 백신접종 군 또는 B군 - 위약 백신접종 대조군) 중 하나로, 한번에 송아지 3마리를 문에서 차단하였다.
22마리의 송아지에 1회 용량의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 백신, 변형된 생 바이러스를 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물을 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공하였다. 12마리의 송아지에게 생성물-매칭 위약 백신 (BHV-1 결실)을 백신접종하였다. BHV-1 바이러스 단리를 위해 코 면봉채취물을 수집하였고, BHV-1에 대한 감수성의 혈청학적 확증을 위해 모든 송아지에서 채혈하였다. 제13일에, 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 제2의 2 ㎖ 용량의 효능 연속물 및 생성물 매칭 위약을 목의 오른쪽 측면에 피하로 제공하였다. 챌린지하기 2일 전에, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두를 챌린지 전의 임상 관찰의 목적으로, 그리고 기준선 체온 판독값을 취득하기 위해 합쳤다. 제2 백신접종 15일 후에 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 4 ㎖ (콧구멍 당 2 ㎖)의 USDA-APHIS-CVB가 제공하는 BHV-1 챌린지 바이러스 (쿠퍼 균주, 로트 번호 05-08, 충전일 - 2005년 10월 26일)를 챌린지하였다. CVB에 의해 챌린지 바이러스 역가가 108.2 TCID50/2 ㎖인 것으로 결정되었다. 챌린지 바이러스를 챌린지 직전에 적정하였고, 108.0 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었으며, 챌린지 직후에 또다시 적정하였고, 107.4 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었다. 챌린지 프로세스 전반에 걸쳐 챌린지 바이러스를 냉각 상태로 유지시켰다.
혈액 샘플을 백신접종일, 챌린지한 날, 및 챌린지 14일 후에 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 소 헤르페스바이러스 항체 역가를 결정하였다.
백신접종일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 수집하였다.
챌린지 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 매일 기록하였다.
임상 관찰을 행하였고, 코 병변 점수를 할당하였다. BHV에 의해 야기되는 총체적인 코 병변이 문헌 [S.F. Rosner, JAVMA Vol 153, No.12, December 1968, p. 1631-1638]에서 기술되었다. 관찰된 전형적인 병변에는 비도의 염증 및 부종 + 출혈 및 점막 내층에 부착된 섬유괴사성 삼출물이 포함되었다. 로스너는 때때로 괴사성 삼출물이 비도에서 매우 광범위하여, 기저 조직으로부터 분리되는 위막성 삼출물을 형성한다는 것을 보고하였다. 로스너는 이러한 병리학적 발견이 IBR의 추정 진단을 내리는 것에서 고도의 일관성을 제공한다는 것을 또한 보고하였다.
코 병변 점수를 하기에 열거된 기준에 따라 할당하였다:
Figure pct00024
백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 관찰자는 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다. 실험실 직원은 송아지의 백신접종 상태를 알지 못했다.
BHV -1 검출: 리퀴드 스튜어트 배지 내의 BBL 컬쳐 스왑®으로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해 코 면봉채취물을 수집하였다. 세포 배양물-강화 PCR 기술과 함께 BHV-1 특이적 CPE의 시각 관찰을 이용하여, 수집된 샘플 내의 BHV-1을 검출하였다. 간략하게, 샘플을 배양 중인 TVL-BK 세포 상으로 멸균 여과 (0.2 ㎛)에 의해 프로세싱하였다. 배양물을 4일 동안 37℃±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. 배양물을 BHV-1 특이적 CPE에 대해 관찰하고, 결과를 기록하였다. 모든 배양 샘플 (+ CPE 및 - CPE 양쪽 모두)로부터의 상청액을 통상적인 RT qPCR 방법론 및 하기의 프로브/프라이머 세트를 사용하여 BHV-1의 존재/부재에 대해 개별적으로 검정하였다:
전방향 프라이머 : CCATGTTAGCGCTCTGGAACC (서열 16)
역방향 프라이머: CGTCTTTACGGTCGACGACTCC (서열 17)
택맨 MGB 프로브: ACGGACGTGCGCGAA (서열 18)
프로브/프라이머 세트의 특이성이 사내에서 확증되었고, 이는 PI3, BRSV, BVDV1a, BVDV1b 또는 BVDV2와 교차 반응하지 않았다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 상에서 택맨® 기반 검정법을 사용하여 RT qPCR 검정법을 수행하였다. BHV-1 특이적 CPE 양성인 샘플 모두가 또한 PCR 양성이었다. BHV-1 특이적 CPE에 대해 음성이고 PCR 검정법에 의해 BHV에 대해 양성인 샘플이 8개 있었다. 이는 BHV-1 특이적 CPE의 관찰을 기초로 하는 검정법보다 PCR을 기초로 하는 검정법이 약간 더 민감하다는 것을 가리키는 사내 연구와 일치하였다. 초기 배양 후에 BHV-1에 대해 음성인 샘플을 하위배양하였고, CPE에 대해 관찰하였다. 하위배양된 유체로부터의 상청액을 동일한 방법에 따라 BHV-1의 존재/부재에 대해 검정하였다.
코 병변: 연구의 1차 결과는 BHV-1과 연관된 코 병변에서의 차이였다. 개별적인 송아지에서의 병변의 존재 또는 부재를 기초로 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 예방 분율을 계산하였다. 이환된 송아지에서의 병변의 중증도의 추정 조건부 경감 분율을 문헌 [B.J. Fergen, Estimating an Intervention Effect on Outcome Severity, USDA, CVB]에 따라 결정하였다. 각각의 이환된 송아지에 대해 병변 기간 (병변이 관찰된 첫날에서 마지막 날까지의 일수)을 결정하였고, 2개의 군 사이의 병변 기간의 차이를 추정하였다.
체온: 연구의 2차 결과는 백신접종 군 송아지와 대조군 송아지 사이의 체온에서의 차이였다. 제1일-제14일에 대한 직장 온도 분석을 군, 일수 및 군*일수 상호작용에 대한 항을 포함한 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)으로, 그리고 기준선 온도를 공변량으로 사용하여 수행하였다. 군*일수 상호작용이 유의하였기 때문에 (p<0.5), 각각의 시점에 대한 군의 단순 효과를 통해 백신접종 군이 대조군에 비교되었다. 군*일수 상호작용으로부터 이러한 단순 효과 비교를 수득하였다.
바이러스 배출: 연구의 또 다른 2차 결과는 백신접종 군 송아지와 대조군 송아지 사이의 챌린지-후 BHV 배출에서의 차이였다. 개별적인 송아지로부터의 코 샘플에서의 BHV 단리 및 확인을 기초로 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 예방 분율을 계산하였다. 각각의 이환된 송아지에 대해 배출 기간 (BHV-1이 검출된 첫날에서 마지막 날까지의 일수)을 결정하였고, 2개의 군 사이의 배출 기간의 차이를 추정하였다.
모든 통계 분석을 윈도우용 SPSS 버전 17을 사용하여 수행하였다.
결과
혈청 중화 항체 역가 : 이러한 연구의 송아지 모두가 백신접종 전의 BHV-1 혈청 중화 항체 역가가 <1:2였다. 대조군의 송아지 12마리 모두는 챌린지한 날에 여전히 혈청-음성이었다 (항체 역가 <1:2). 백신접종 군의 송아지 22마리 중 21마리가 챌린지한 날에 혈청-전환되어 있었고, 이때 역가가 ≥ 1:2였다 (군 중앙값 역가 1:4). 챌린지 후 제14일에, 모든 송아지가 BHV-1로 혈청-전환되었다 (중앙값 백신접종 군 역가 > 256, 중앙값 대조군 역가 128).
코 병변: 코 병변이 대조군 송아지 12마리 모두 (100％) 및 백신접종 군 송아지 22마리 중 20마리 (91％)에서 관찰되었다. 관찰된 코 병변에 대한 추정된 예방 분율은 9％였다. 이환된 송아지의 중증도에 대한 추정된 경감 분율은 90％였다 (95％ CI: 72％, 100％). 이환된 대조군에서의 병변이 이환된 백신접종 군에서보다 더욱 중증이었다. 코 병변이 관찰된 중앙값 기간은 백신접종 군에 대해 6일, 대조군에 대해 10.5일이었다. 2개의 군 사이의 기간에서의 추정된 변이는 4.5일이었다.
직장 온도: 챌린지 전-평균 온도를 공변량으로 사용하는 챌린지-후 직장 온도 분석에서, 통계적으로 유의한 (p<0.05) 군 및 군*일수 효과가 드러났다. 이러한 분석은 대조군의 온도가 챌린지 후 제3일 내지 제9일 및 제11일에 백신접종 군과 비교하여 기준선으로부터 유의하게 (p<0.05) 증가되었음을 드러냈다.
BHV -1 단리: 대조군 및 백신접종 군 송아지 모두가 이러한 연구의 챌린지-후 기간 동안 BHV-1을 배출하였다. 백신접종 군으로부터의 BHV-1 단리의 중앙값 기간은 6일이었고, 대조군에 대해서는 10.5일이었다. 배출 기간에서의 추정된 변이는 4.5일이었다. BHV 특이적 CPE를 나타내는 모든 샘플을 PCR에 의해 확증하였다. 그러나, CPE가 관찰되지 않았지만 약한 양성 PCR 신호가 있는 샘플이 8개 있었다. 이러한 8개의 샘플은 이러한 분석에 대해 양성으로서 포함되지 않았다.
BHV -1의 임상 징후: 챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후의 연속적인 14일에 각각의 동물을 호흡기 질환의 임상 징후에 대해 시험하였다. BHV-1 감염에 기인할 수 있는 임상 징후를 관찰하고 기록하였다. 어떠한 송아지에서도 유해한 백신접종-후 반응이 관찰되지 않았다.
결론
선행 보고는 육성우/비육우 송아지에서 BHV-1로 인한 질환의 감소에서의 보조물로서의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 BHV-1 분획의 효능을 입증한다. 이러한 조합 생성물의 BHV-1 분획의 효능 및 항원성이 하기에 의해 입증되었다:
1) 대조군과 비교했을 때 백신접종 군에서의 코 병변의 중증도 및 기간의 감소.
2) 대조군과 비교했을 때 백신접종 군에서의 발열 감소.
3) 대조군과 비교했을 때 백신접종 군의 BHV-1로의 혈청-전환.
실시예 8 - PI 3 효능 프로토콜
이러한 실시예는 6가 MLV 백신의 PI3 분획이 PI3에 의해 야기되는 질환의 예방에서 도움이 된다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
변형된 6가 생 바이러스 백신을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. PI3-결실 위약을 효능 연속물과 함께 만들었다. PI3 결실 위약은 효능 연속물과 동일한 BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, BVDV-1a, 및 BRSV 수확물 뱃치를 함유하였다. 배양 배지로 PI3 성분을 대체하여, 효능 연속물과 PI3 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하였다. 멸균 희석제를 사용하여 백신 및 PI3 결실 위약 양쪽 모두를 재수화시켰다.
약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 상기 기술된 바와 같이 랜덤화시킨 후, 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 모든 송아지는 물, 코스틀 버뮤다 건초, 및 콕시디오스탯을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다. 송아지에 사료가 공급된 후에는, 이어서 건초 이용가능성이 제한될 수도 있었다.
대략적으로 20마리 이상의 백신접종 군 송아지 및 10마리 이상의 대조군 송아지가 이러한 단일 수준 연구에서 사용되었다. 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다. 그 후, 챌린지 2일 전 (제-2일)에 송아지들을 하나의 우리에서 합쳤다.
랜덤화
송아지의 매칭 랜덤화 계획을 사용하여, 송아지들을 2개의 치료 군 (백신접종 군 또는 위약-백신접종 대조군)에 할당할 수 있었다. 예를 들어, 슈트에 들어가는 일련의 송아지 3마리를 2:1 비로 2개의 치료 군에 랜덤화할 수 있었다. 혈청학적 평가를 위한 최초의 채혈 시점에 양동이에서 무작위로 뽑은 귀 태그를 사용하여 송아지를 확인하였다.
맹검
맹검 직원은 대조군 또는 백신접종 군의 신원을 알지 못했다. 기록 관리자를 제외하고는, 모든 현장 및 실험실 직원이 연구 기간 동안 맹검이었다.
결과
이러한 연구의 1차 결과는 챌린지 후의 PI3 바이러스의 코 배출의 예방이었다. 이는 연구 과정 동안 모든 송아지의 콧구멍에서 매일 수집된 코 샘플 내의 PI3의 존재 또는 부재에 의해 결정되었다. 기타 예상되는 2차 결과에는 PI3 감염의 임상 징후 감소, 발열 감소, 및 PI3을 배출하는 송아지에서의 배출 기간의 감소가 포함되었다. 연구를 시작할 때 PI3 역가가 ≥2이면 실험 단위가 연구에서 배제되었다.
샘플 추출 틀, 데이터 수집, 및 임상 관찰
효능 연속물 또는 PI3 결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 챌린지 직전 (제0일)에, 그리고 또다시 챌린지 14일 후 (제14일)에 또한 수집하였다.
감별 WBC 계수용 혈액 샘플을 제-2일 내지 적어도 제14일까지 수집하였다. 모든 샘플을 EDTA 배큐테이너® 튜브에서 수집하고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다. 제-2일 내지 적어도 제14일까지 코 면봉채취물을 바이러스 단리용으로 취하였다.
백신접종 군 및 대조군에 의한 PI3 배출을 챌린지 후 14일 동안 매일 결정하였다. PI3 검출은 챌린지에 대한 저항성 (이환되지 않음) 또는 감수성 (이환됨)을 결정하기 위한 1차 기준으로서의 역할을 하였다. 이환된 군 및 이환되지 않은 군을 비교하여, 백신접종이 PI3 챌린지 노출 후의 PI3 배출을 예방하였는지 여부를 결정하였다. 호흡기 질환의 임상 징후가 챌린지에 대한 감수성 또는 저항성을 결정하기 위한 2차 기준으로서의 역할을 하였다. 배출 기간 (개별적인 송아지로부터 PI3이 검출된 일수)을 분석하여, 백신접종이 이러한 파라미터에 대한 경감 효과가 있는지를 결정하였다. 챌린지-전 평균 온도 (기준선)를 공변량으로 사용하여 모든 개별적인 일일 직장 온도를 분석하였다.
PI 3 검출: BBL 컬쳐 스왑® + 리퀴드 스튜어트 배지로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 각각의 송아지로부터 취하였다. 샘플로부터의 배지를 본원에 기술된 PI3-특이적 프로브/프라이머 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 PI3의 존재에 대해 검정하였다.
배출 기간 : 배출 기간은 개별적인 송아지의 코 면봉채취물에서 PI3이 검출되는 일수로서 정의되었다. 수집된 기간 데이터를 분석하여, 백신접종이 PI3이 코 샘플에서 검출된 기간에 대한 경감 효과가 있는지를 결정하였다.
직장 온도: 각각의 동물에 대한 일일 직장 온도를 제-2일과 제14일 사이 (챌린지 2일 전, 챌린지한 날, 및 챌린지 14일 후)에 기록하였다. 제-2일 내지 제0일에 대한 온도 값을 평균함으로써 챌린지 전의 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 기준선을 공변량으로 사용하여 일일 온도를 분석하였다.
항체 역가 : 연구 중 백신접종일, 제0일 및 제14일에 각각의 동물에 대해 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 방법에 의해 혈청 중화 항체 역가를 결정하였다.
임상 징후: PI3의 임상 징후가 문헌 [Bryson et al. (1989)]에서 기술되었다. 임상 징후에는 둔함, 가쁜 호흡, 발열, 기침, 우발성이고/이거나 거친 폐음이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 챌린지하기 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 14일 동안에 임상 징후를 기록하였다. PI3의 임상 징후의 관찰을 데이터 분석 동안 고려하였지만, 이러한 징후들이 상업용 가축에서 통상적으로 발견되는 다수의 호흡기 질환을 가리킬 수 있다는 사실로 인해 1차 결과로서는 고려하지 않았다.
실시예 8a - PI3 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 소 파라인플루엔자3 바이러스 (PI3) 분획이 항원성이고 육성우/비육우 송아지에서의 소 파라인플루엔자3 바이러스의 배출 예방에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 2회 용량의 백신을 20마리의 PI3 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 10마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 2회 용량의 생성물 매칭-위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 PI3을 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 PI3 항체 역가를 초래하였고, 챌린지 후의 PI3 배출을 예방하였다. 결과적으로, 용량 당 6×104의 최소 PI3-TCID50이 이러한 백신의 PI3 분획에 대해 확립되었다.
물질 및 방법
송아지 백신접종 및 챌린지 : 30마리의 PI3 음성 송아지를 분류 앨리에서 합쳤다. 각각의 송아지를 이들을 무작위로 무리지어 이동시킬 때, CVB-바이오메트릭스가 제공하는 매칭-세트 랜덤화 체계를 사용함으로써, 앨리를 통과하여 2개의 군 (A군 - 백신접종 군 또는 B군 - 위약 백신접종 대조군) 중 하나로, 한번에 송아지 3마리를 문에서 차단하였다.
20마리의 송아지에 1회 용량의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 백신, 변형된 생 바이러스를 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물을 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공하였다. 10마리의 송아지에게 생성물-매칭 위약 백신 (PI3 결실)을 백신접종하였다. PI3 바이러스 단리용으로 코 면봉채취물을 수집하고, PI3에 대한 감수성의 혈청학적 확증을 위해 모든 송아지에서 채혈하였다. 제25일에, 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 제2의 2 ㎖ 용량의 효능 연속물 및 생성물 매칭 위약을 목의 오른쪽 측면에 피하로 제공하였다. 챌린지하기 2일 전에, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두를 챌린지 전의 임상 관찰의 목적으로, 그리고 기준선 체온 판독값을 취득하기 위해 합쳤다. 제2 백신접종 15일 후에 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 4 ㎖ (콧구멍 당 2 ㎖)의 USDA-APHIS-CVB가 제공하는 PI3 챌린지 바이러스 (레이싱어 균주, 로트 번호 05-07, 충전일 - 2005년 7월 26일)를 챌린지하였다. CVB에 의해 챌린지 바이러스 역가가 108.2 TCID50/2 ㎖인 것으로 결정되었다. 챌린지 바이러스를 챌린지 직전에 적정하였고, 108.3 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었으며, 챌린지 직후에 또다시 적정하였고, 108.2 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었다. 챌린지 프로세스 전반에 걸쳐 챌린지 바이러스를 냉각 상태로 유지시켰다.
혈액 샘플을 백신접종일, 백신접종 6일 후, 챌린지한 날, 챌린지 6일 후, 및 챌린지 14일 후에 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 소 파라인플루엔자3 바이러스 항체 역가를 결정하였다.
백신접종일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 10일에 코 면봉채취물을 수집하였다.
챌린지 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 매일 기록하였다.
임상 관찰을 행하였다. 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 관찰자는 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다. 실험실 직원은 송아지의 백신접종 상태를 알지 못했다.
PI3 검출: 리퀴드 스튜어트 배지 내의 BBL 컬쳐 스왑®으로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해 코 면봉채취물을 수집하였다. 세포 배양물-강화 PCR 기술과 함께 PI3 특이적 CPE의 시각 관찰을 이용하여, 수집된 샘플 내의 PI3을 검출하였다. 간략하게, 샘플을 배양 중인 TVL-BK 세포 상으로 멸균 여과 (0.2 ㎛)에 의해 프로세싱하였다. 배양물을 4일 동안 37℃±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. 배양물을 PI3 특이적 CPE에 대해 관찰하고, 결과를 기록하였다. 모든 배양 샘플 (+ CPE 및 - CPE 양쪽 모두)로부터의 상청액을 통상적인 RT qPCR 방법론 및 하기의 프로브/프라이머 세트를 사용하여 PI3의 존재/부재에 대해 개별적으로 검정하였다:
전방향 프라이머 : GGAGACCAAGACCAAGGAGATG (서열 13)
역방향 프라이머: CGTCTGCCCATGCATAAGG (서열 14)
택맨 MGB 프로브: ACCTCGGTCATCCATAG (서열 15)
이러한 방법은 문헌 [Development of a real-time RT-PCR assay for detection and quantitation of parainfluenza virus 3. A. Hu, M. Colella, P. Zhao, F. Li, J.S. Tam, R. Rappaport, S.M. Cheng. Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148]의 작업을 기초로 개발되었다. 프로브/프라이머 세트의 특이성이 사내에서 확증되었고, 이는 BHV, BRSV, BVDV1a, BVDV1b 또는 BVDV2와 교차 반응하지 않았다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 상에서 택맨® 기반 검정법을 사용하여 RT qPCR 검정법을 수행하였다.
PI3 특이적 CPE 양성인 샘플 모두가 또한 PCR 양성이었다. PI3 특이적 CPE에 대해 음성이고 PCR 검정법에 의해 PI3에 대해 양성인 샘플이 17개 있었다. 이는 PI3 특이적 CPE의 관찰을 기초로 하는 검정법보다 PCR을 기초로 하는 검정법이 더욱 민감하다는 것을 가리키는 사내 연구와 일치하였다. 초기 배양 후에 PI3에 대해 음성인 샘플을 하위배양하였고, CPE에 대해 관찰하였다. 하위배양된 유체로부터의 상청액을 동일한 방법에 따라 PI3의 존재/부재에 대해 검정하였다.
통계 분석: 이러한 백신의 PI3 분획의 효능은 챌린지 후 PI3를 배출한 대조군의 비율에 비교된 바와 같은 PI3를 배출한 백신접종 군의 비율을 주로 기초로 하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다. 맨-휘트니 U 테스트로 순서 척도 역가 데이터의 군 비교를 비교하였다. 챌린지 전의 온도 평균을 공변량으로 사용하여 직장 온도를 분석하였다. 제1일-제14일에 대한 챌린지-후 온도의 분석을 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)으로 수행하였다. 모든 통계 분석을 윈도우용 SAS를 사용하여 수행하였다.
결과
혈청 중화 항체 역가 : 이러한 연구의 송아지 모두가 백신접종 전의 PI3 혈청 중화 항체 역가가 <1:2였다. 백신접종된 송아지는 백신에 대한 기억성 면역 반응을 나타내지 않았다. 챌린지한 날에, 백신접종 군은 평균 PI3 역가가 1:16이었고, 이는 1:3인 대조군의 것보다 유의하게 (p≤0.05) 더 컸다. 대조군의 송아지 1마리인 송아지 7에서는 연구 과정 동안 1:16의 역가가 발달되었다. 이러한 송아지는 챌린지에 대한 기억성 반응을 또한 나타냈고, 챌린지 6일 후에 역가가 1:128이었다. 나머지 9마리의 대조군 송아지는 챌린지한 날에 혈청-음성이었고, 챌린지에 대한 기억성 반응을 나타내지 않았다.
PI3 단리: 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 모두가 이러한 연구의 챌린지 후의 단계 동안 PI3을 배출하였다. 이러한 시간 동안 20마리의 백신접종 군 중 4마리만 PI3을 배출하였다. 이는 0.80의 예방가능 분율을 초래하였다. PI3 특이적 CPE를 나타내는 모든 샘플을 PCR에 의해 확증하였다. 그러나, CPE가 관찰되지 않았지만 약한 양성 PCR 신호가 있는 샘플이 17개 있었다. 이러한 17개의 샘플은 이러한 분석에 대해 PI3 양성으로서 포함되었다.
직장 온도: 챌린지-전 평균 온도를 공변량으로 사용하는 챌린지-후 직장 온도 분석에서 군들 간에 통계적으로 유의한 차이가 드러나지 않았다. 이러한 데이터의 추가적인 분석을 추진하지 않았다.
PI3 의 임상 징후: 각각의 동물을 챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날, 및 챌린지 후의 연속적인 14일에 호흡기 질환의 임상 징후에 대해 시험하였다. 확정적으로 PI3 감염에 기인할 수 있는 임상 징후가 관찰되지 않았다. 어떠한 송아지에서도 유해한 백신접종-후 반응이 관찰되지 않았다.
결론
선행 보고는 육성우/비육우 송아지에서 PI3의 배출 예방에서의 보조물로서 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 PI3 분획의 효능을 입증한다.
이러한 조합 생성물의 PI3 분획의 효능 및 항원성이 하기에 의해 입증되었다:
1) 바이러스 (PI3) 단리 연구에서, 2회 용량의 백신의 투여가 대조군에서의 100％ (10/10) 감수성에 비교하여 백신접종된 송아지에서의 80％ (16/20) 보호를 제공하였음이 드러났다 (예방가능 분율 = 0.80).
2) 대조군과 비교하여 백신접종 군에서의 PI3에 대한 항체 역가의 유의한 증가.
실시예 9 - BVDV -2 효능 프로토콜
이러한 실시예는 6가 MLV 백신의 2형 BVDV 분획이 BVDV-2에 의해 야기되는 질환의 예방에서 도움이 된다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
변형된 6가 생 바이러스 백신을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. BVDV-2 결실 위약을 효능 연속물과 함께 만들었다. BVDV-2 결실 위약은 효능 연속물과 동일한 BHV-1, BVDV-1b, BVDV-1a, PI3 및 BRSV 수확물 뱃치를 함유하였다. 배양 배지로 BVDV-2 성분을 대체하여, 효능 연속물과 BVDV-2 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하였다. 멸균 희석제를 사용하여 백신 및 BVDV-2 결실 위약 양쪽 모두를 재수화시켰다.
약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 상기 기술된 바와 같이 랜덤화시킨 후, 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 모든 송아지는 물, 코스틀 버뮤다 건초, 및 콕시디오스탯을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다. 송아지에 사료가 공급된 후에는, 이어서 건초 이용가능성이 제한될 수도 있었다.
대략적으로 20마리 이상의 백신접종 군 송아지 및 10마리 이상의 대조군 송아지가 이러한 단일 수준 연구에서 사용되었다. 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다. 그 후, 챌린지 2일 전 (제-2일)에 송아지들을 하나의 우리에서 합쳤다.
랜덤화 , 맹검 및 결과
랜덤화, 맹검 및 결과는 실시예 10에 기술된 바와 같았다.
샘플 추출 틀, 데이터 수집, 및 임상 관찰
효능 연속물 또는 BVDV-2 결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 챌린지 직전 (제0일)에, 그리고 또다시 챌린지 14일 후 (제14일)에 또한 수집하였다.
감별 WBC 계수용 혈액 샘플을 제-2일 내지 적어도 제14일까지 수집하였다. 모든 샘플을 EDTA 배큐테이너® 튜브에서 수집하고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다. 제-2일 내지 적어도 제14일까지 코 면봉채취물을 바이러스 단리용으로 취하였다.
결과 변수에는 백혈구감소증, 발열, 코 바이러스 배출, 바이러스혈증, 중화 항체 생산 및 임상 징후가 포함되었다. 1차 결과는 BVDV-2 챌린지 후에 대조군에 비교된 바와 같은 백신접종 군에서의 BVDV-2 유도 백혈구감소증의 예방이었다.
백혈구감소증: WBC 수 데이터를 분석하여, 챌린지 후의 수에서의 감소가 있는지를 결정하였다. 제-2일 내지 제0일에 대한 WBC 수를 평균함으로써 챌린지 전의 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 일일 백혈구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 WBC 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 또는 관찰자의 재량에 따라 그 이상 각각에 대해 계산하였다. 비율이 25％ 만큼 감소했으면, 개체를 백혈구감소증으로 분류하였다.
배출: BBL 컬쳐 스왑® + 리퀴드 스튜어트 배지로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 각각의 송아지로부터 취하였다. 수집일에, 0.2 ㎛ 필터를 통한 멸균 여과에 의해 샘플을 프로세싱하였다. 그 후, TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 샘플을 접종하였다. 플레이트 당 1개의 웰은 미접종으로 유지시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트의 웰 1개에 챌린지 바이러스의 희석물을 접종하였고, 이는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 3-7％ CO2, 35-39℃의 온도에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 배지를 수확하고, -18℃ 내지 -22℃에서 보관하였다. 전형적인 BVDV-1a 세포변성 형태학을 나타내는 웰로부터의 배지를 추가로 프로세싱하여, 감염체의 신원을 결정하였다. 배양물-양성인 개체를 "배출"로 분류하였다.
바이러스혈증 : 혈액 샘플로부터의 백혈구연층을 사용하여, TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 접종하였다. 플레이트 당 1개의 웰은 미접종으로 유지시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트의 웰 1개에 챌린지 바이러스의 희석물을 접종하였고, 이는 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 3-7％ CO2, 35-39℃의 온도에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 배지를 수확하고, -18℃ 내지 -22℃에서 보관하였다. 전형적인 BVDV-2 세포변성 형태학을 나타내는 웰로부터의 배지를 추가로 프로세싱하여, 감염체의 신원을 결정하였다. BVDV-2에 대해 배양물-양성인 개체를 "바이러스혈증성"으로 분류하였다.
항체 역가 : BVDV-2에 대한 혈청 중화 항체 역가를 최초 백신접종일 (제-21일), 챌린지한 날 (제0일) 및 연구 종결 시에 각각의 동물에 대해 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 방법에 의해 결정하였다. <Special Outline A-17, Titration of Bovine Viral Diarrhea Virus Type 2 Neutralizing Antibody>에 따라 항체 역가를 결정하였다. ≥8의 항체 역가가 발달된 동물이 BVDV-2로 혈청-전환된 것으로 간주되었다.
임상 징후: BVDV-2의 임상 징후에는 발열, 백혈구감소증, 호흡 곤란, 코 분비물 및 묽은 변이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. BVDV 감염의 모든 관련된 임상 징후를 챌린지하기 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 14일 동안에 기록하였다. BVDV-2의 임상 징후의 관찰을 데이터 분석 동안 고려하였지만, 1차 결과로서는 고려하지 않았는데, 이는 이러한 징후들이 이러한 가축 부류에서 통상적으로 마주치는 다른 질환을 가리킬 수 있기 때문이다.
실시예 9A - BVDV -2 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 2형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV2) 분획이 항원성이고 BVDV2에 의해 야기되는 질환의 예방에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 1회 용량을 20마리의 BVDV 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 10마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 1회 용량의 생성물 매칭-위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 BVDV2 (균주 1373)를 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 BVDV2 항체 역가를 초래하였고 (평균 <2에서 24로), 챌린지 후의 사망률을 감소시켰다 (7/10 대조군 사망, 0/20 백신접종 군 사망). 결과적으로, 용량 당 3×103 TCID50의 최소 BVDV2-TCID50이 이러한 백신의 BVDV2 분획에 대해 확립되었다.
실시예 10 - BVDV -1A 효능 프로토콜
이러한 실시예는 6가 MLV 백신의 1a형 BVDV 분획이 BVDV-1a에 의해 야기되는 질환의 예방에서 도움이 된다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
변형된 6가 생 바이러스 백신을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
BVDV-1a 결실 위약을 효능 연속물과 함께 만들었다. BVDV-1a 결실 위약은 효능 연속물과 동일한 BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, PI3 및 BRSV 수확물 뱃치를 함유하였다. 배양 배지로 BVDV-1a 성분을 대체하여, 효능 연속물과 BVDV-1a 결실 위약 사이의 등가의 부피를 유지하였다. 멸균 희석제를 사용하여 백신 및 BVDV-1a 결실 위약 양쪽 모두를 재수화시켰다.
약 3-4개월령의 상업용 육성우/비육우 송아지를 상기 기술된 바와 같이 랜덤화시킨 후, 구충하고, 파스퇴렐라증, 마이코플라즈마증 및 흑각증에 대해 백신접종하였다. 모든 송아지는 물, 코스틀 버뮤다 건초, 및 콕시디오스탯을 함유하지만 항생제는 함유하지 않는 혼합 사료에 자유롭게 접근하였다. 송아지에 사료가 공급된 후에는, 이어서 건초 이용가능성이 제한될 수도 있었다.
대략적으로 20마리 이상의 백신접종 군 송아지 및 10마리 이상의 대조군 송아지가 이러한 단일 수준 연구에서 사용되었다. 챌린지 전에 2개의 송아지 군을 분리되었지만 등가인 우리에서 유지시켰다. 그 후, 챌린지 2일 전 (제-2일)에 송아지들을 하나의 우리에서 합쳤다.
랜덤화
송아지의 매칭 랜덤화 계획을 사용하여, 송아지들을 2개의 치료 군 (백신접종 군 또는 위약-백신접종 대조군)에 할당할 수 있었다. 예를 들어, 슈트에 들어가는 일련의 송아지 3마리를 2:1 비로 2개의 치료 군에 랜덤화할 수 있었다. 혈청학적 평가를 위한 최초의 채혈 시점에 양동이에서 무작위로 뽑은 귀 태그를 사용하여 송아지를 확인하였다.
맹검
맹검 직원은 대조군 또는 백신접종 군의 신원을 알지 못했다; 모든 현장 및 실험실 직원 (기록 관리자 제외)이 연구 기간 동안 맹검이었다.
결과
1차 결과는 챌린지 후의 백혈구감소증이었다. 백혈구감소증은 기준선 WBC 수로부터의 25％ 감소로 정의되었다. 백신 효능을 추가로 지지할 기타 결과에는 코 배출, 바이러스혈증, 발열, 항체 생산 및 BVDV의 임상 징후가 포함되었다.
연구를 시작할 때 BVDV-1 역가가 ≥2이면 실험 단위가 연구에서 배제되었다.
샘플 추출 틀, 데이터 수집, 및 임상 관찰
효능 연속물 또는 BVDV 결실 위약의 백신접종 직전 (제-28일 내지 제-21일)에 송아지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 챌린지 직전 (제0일)에, 그리고 또다시 챌린지 14일 후 (제14일)에 또한 수집하였다.
감별 WBC 계수용 혈액 샘플을 제-2일 내지 적어도 제14일까지 수집하였다. 모든 샘플을 EDTA 배큐테이너® 튜브에서 수집하고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다. 제-2일 내지 적어도 제14일까지 코 면봉채취물을 바이러스 단리용으로 취하였다.
결과 변수에는 백혈구감소증, 발열, 코 바이러스 배출, 바이러스혈증, 중화 항체 생산 및 임상 징후가 포함되었다. 1차 결과는 BVDV-1a 챌린지 후에 대조군에 비교된 바와 같은 백신접종 군에서의 BVDV 유도 백혈구감소증의 예방이었다.
백혈구감소증, 배출, 및 바이러스혈증 : WBC 수 데이터를 실시예 9에 기술된 바와 같이 분석하였다; 또한 실시예 9에 기술된 바와 같이, BBL 컬쳐 스왑® + 리퀴드 스튜어트 배지로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 코 면봉채취물을 각각의 송아지로부터 취하여, 배출을 결정하였다. 실시예 9에 기술된 바와 같이, 혈액 샘플로부터의 백혈구연층을 사용하여 TVL-MDBK를 함유하는 12웰 플레이트의 각각의 웰 (~80％ 조밀도)에 접종하고, 검정하였다.
항체 역가 : BVDV-1a에 대한 혈청 중화 항체 역가를 최초 백신접종일 (제-21일), 챌린지한 날 (제0일) 및 연구 종결 시에 각각의 동물에 대해 "바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는" 방법에 의해 결정하였다. <Special Outline A-17, Titration of Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1a Neutralizing Antibody>에 따라 항체 역가를 결정하였다. ≥8의 항체 역가가 발달된 동물이 BVDV-1a로 혈청-전환된 것으로 간주되었다.
임상 징후: BVDV-1a의 임상 징후에는 발열, 백혈구감소증, 호흡 곤란, 코 분비물 및 묽은 변이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. BVDV 감염의 모든 관련된 임상 징후를 챌린지하기 2일 전, 챌린지한 날 및 챌린지 후 14일 동안에 기록하였다. BVDV-1의 임상 징후의 관찰을 데이터 분석 동안 고려하였지만, 1차 결과로서는 고려하지 않았는데, 이는 이러한 징후들이 이러한 가축 부류에서 통상적으로 마주치는 다른 질환을 가리킬 수 있기 때문이다.
실시예 10A - BVDV -1A 효능 연구
이러한 연구의 결과는 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 변형된 생 1a형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV1a) 분획이 항원성이고, BVDV1a에 의해 야기되는 감염의 예방에서 보조물로서 효과가 있다는 것을 입증한다. 1회 용량의 백신을 20마리의 BVDV 혈청-음성 송아지에 투여하였다. 10마리의 혈청-음성 대조군 송아지에 1회 용량의 생성물 매칭-위약 백신을 백신접종하였다. 모든 송아지에 BVDV1a를 비강 내로 챌린지하였다. 백신접종이 증가된 BVDV1a 항체 역가를 초래하였고, BVDV1a 유도 바이러스혈증, 코 배출, 발열, 림프구감소증 및 백혈구감소증을 예방하거나 감소시켰다. 결과적으로, 용량 당 5×103 TCID50의 최소 BVDV1a-TCID50이 이러한 백신의 BVDV1a 분획에 대해 확립되었다.
물질 및 방법
백신접종, 챌린지 및 샘플 수집: 30마리의 BVDV 음성 송아지를 분류 앨리에서 합쳤다. 각각의 송아지를 이들을 무작위로 무리지어 이동시킬 때, CVB-바이오메트릭스가 제공하는 매칭-세트 랜덤화 체계를 사용함으로써, 앨리를 통과하여 2개의 군 (A군 - 백신접종 군 또는 B군 - 위약 백신접종 대조군) 중 하나로, 한번에 송아지 3마리를 문에서 차단하였다.
20마리의 송아지에 1회 용량의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 백신, 변형된 생 바이러스를 백신접종하였다. 각각의 백신접종 군에 2 ㎖ 용량의 생성물을 피하 주사에 의해 제0일에 목의 왼쪽 측면에 제공하였다. 10마리의 송아지에게 생성물-매칭 위약 백신 (BVDV 결실)을 백신접종하였다. 챌린지하기 2일 전에, 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두를 챌린지 전의 임상 관찰의 목적으로, 그리고 기준선 체온 및 WBC 판독값을 취득하기 위해 합쳤다. 백신접종 21일 후에 백신접종 군 및 대조군 송아지에게 캔자스주 한스톤의 러프 팜스(Ruff Farms)에서 우리에서 죽은 송아지의 폐로부터 수득된 BVDV1a의 독성 단리물을 챌린지하였다. 둘베코 변형 이글 배지 + 10％ 말 혈청을 사용하여 TVL-BK 세포 상에서 바이러스가 시험관 내에서 계대되었다. 챌린지 바이러스를 챌린지 직전에 적정하였고, 107.8 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었으며, 챌린지 직후에 적정하였고, 107.3 TCID50/4 ㎖인 것으로 결정되었다. 2 ㎖의 챌린지 바이러스를 흡기 동안 각각의 비도 내로 투여하였다. 챌린지 프로세스 전반에 걸쳐 챌린지 바이러스를 냉각 상태로 유지시켰다.
항체 역가를 결정하기 위한 혈액 샘플을 백신접종일, 챌린지한 날 (백신접종 21일 후), 및 챌린지 14일 후에 수집하였다. 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 중화 방법에 의해 소 바이러스성 설사 바이러스 항체 역가를 결정하였다.
리퀴드 스튜어트 배지 내의 BBL 컬쳐 스왑®로 양쪽 콧구멍을 면봉으로 긁는 것에 의해, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 바이러스 단리용 코 면봉채취물을 수집하였다.
EDTA 베큐테이너 튜브 내로의 정맥천자에 의해 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 백혈구연층 바이러스 단리용 혈액 샘플을 각각의 송아지로부터 수집하였다.
챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후 연속적인 14일에 각각의 송아지에 대해 직장 온도를 매일 기록하였다.
각각의 송아지에 대해 임상 관찰을 행하고 기록하였다. 백신접종 군 및 대조군 양쪽 모두가 귀 태그 번호가 유일한 구별 특색인 상태로 합쳐져 있기 때문에 관찰자들은 맹검이었다. 연구 과정에 걸친 어느 시점에도, 관찰자는 개별적인 테스트 동물의 백신접종 상태를 알지 못했다. 실험실 직원은 송아지의 백신접종 상태를 알지 못했다.
챌린지 전의 연속적인 2일, 챌린지한 날 및 챌린지 후의 연속적인 14일에 감별 WBC 수를 결정하기 위한 혈액 샘플을 수집하였다. EDTA 배큐테이너 튜브에서 샘플을 수집하였고, 드루 사이언티픽의 헤마베트 950 감별 WBC 계수기를 사용하여 계수하였다.
BVDV 검출: CPE 관찰 및 세포 배양물-강화 PCR 기술을 이용하여, 수집된 샘플 내의 BVDV1a를 검출하였다. 간략하게, 코 샘플을 배양 중인 TVL-BK 세포 상으로 멸균 여과 (0.2 ㎛)에 의해 프로세싱하였다. 백혈구연층을 45-75분 동안 배양 중인 TVL-BK 세포 상에 직접 놓은 후, 세포를 세정하여 제거하였다. 배양물을 4일 동안 37℃±2℃ 및 5±1％ CO2에서 인큐베이션하였다. 각각의 배양물을 BVDV 특이적 CPE의 존재/부재에 대해 관찰하였고, 각각의 배양물로부터의 상청액을 통상적인 RT qPCR 방법론 및 하기의 프로브/프라이머 세트를 사용하여 BVDV1a의 존재에 대해 개별적으로 검정하였다:
전방향 프라이머 : GGTCGCCCAGGTAAAAGCA (서열 7)
역방향 프라이머: GCCTCTGCAGCACCCTATCA (서열 8)
택맨 MGB 프로브: AACCGACTGTTACGAATAC (서열 9)
이러한 방법은 문헌 [Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhea virus (BVDV) by PCR, Julia F. Ridpath and Steven R. Bolin, Molecular and Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148]을 기초로 개발되었다. 이러한 방법은 문헌 [Center for Veterinary Biologics and National Veterinary Services Laboratories Test Protocol - Genotyping Bovine Viral Diarrhea Virus, Number BPPR02010.01]을 또한 기초로 하였다. BVDV의 유전자형 및 및 아유전자형을 구별하는 이러한 방법들 양쪽 모두는 게놈의 5' 비번역 영역 (UTR)에 존재하는 유전적 차이를 이용한다. 이러한 프로브/프라이머 세트는 독특한 BVDV1a 서열이 고도로 특이적인 프로브에 의해 검출될 수 있는 5' UTR의 절편을 증폭시키도록 특이적으로 디자인되었다. 프로브/프라이머 세트의 특이성이 사내에서 확증되었고, 이는 BHV, PI3, BRSV, BVDV1b, 또는 BVDV2와 교차 반응하지 않았다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 상에서 택맨® 기반 검정법을 사용하여 RT qPCR 검정법을 수행하였다.
통계 분석: 항체 역가: 맨-휘트니 U 테스트로 순서 척도 역가의 군 비교를 분석하였다.
코 배출: 코 면봉채취물 분석으로부터의 바이러스 단리 데이터는 챌린지 후 BVDV1a가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV1a가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 하였다. CPE 관찰 및 PCR에 의한 검출을 독립적으로 기초로 하여 예방가능 분율을 계산하였다. BVDV1a 배출에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
바이러스혈증 : 챌린지 후 BVDV1a가 단리된 대조군의 비율에 비교된 BVDV1a가 단리된 백신접종 군의 비율을 기초로 혈액 샘플의 백혈구연층으로부터의 바이러스 단리 데이터를 분석하였다. CPE 관찰 및 PCR에 의한 검출을 독립적으로 기초로 하여 예방가능 분율을 계산하였다. BVDV1a 바이러스혈증에 대한 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 기술된 바와 같이 계산하였다.
직장 온도: 챌린지 전의 평균 직장 온도를 각각의 동물에 대해 결정하였다. 이러한 평균을 군, 일수 및 군*일수 상호작용에 대한 항을 포함한 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)에서 공변량으로 사용하였다.
질환의 임상 징후: 질환의 임상 징후를 각각의 관찰자가 독립적으로 매일 기록하였다.
림프구감소증 : 제-2일 내지 제0일에 대한 림프구 수를 평균함으로써 각각의 동물에 대해 챌린지 전의 림프구 평균을 계산하였다. 일일 림프구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 림프구 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 각각에 대해 계산하였다. 이러한 비율 데이터를 분석하여, 기준선으로부터의 림프구 수의 25％ 감소로 정의되는 바와 같은 림프구감소증이 개별적인 동물들에서 발달되었는지를 결정하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 의해 기술된 바와 같이 계산하여, 백신접종이 이러한 연구에서 림프구감소증의 발달을 예방하였는지를 결정하였다.
백혈구감소증: 제-2일 내지 제0일에 대한 백혈구 수를 평균함으로써 챌린지 전의 백혈구 평균을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 일일 백혈구 수 대 챌린지 전의 평균의 비 (챌린지 전의 비율로서의 백혈구 수)를 챌린지 후 제1일 내지 제14일 각각에 대해 계산하였다. 이러한 비율 데이터를 분석하여, 기준선으로부터의 백혈구 수의 25％ 감소로 정의되는 바와 같은 백혈구감소증이 개별적인 동물들에서 발달되었는지를 결정하였다. 예방가능 분율을 문헌 [Tanner and Morgan (1993)]에 의해 기술된 바와 같이 계산하여, 백신접종이 이러한 연구에서 백혈구감소증의 발달을 예방하였는지를 결정하였다.
모든 통계 분석을 윈도우용 SPSS 버전 16을 사용하여 수행하였다.
결과
혈청 중화 항체 역가 : 이러한 연구의 송아지 모두가 백신접종 전의 BVDV (BVDV1a, BVDV1b 및 BVDV2) 혈청 중화 항체 역가가 <1:2였다. 챌린지한 날 (제21일)에, 백신접종 군의 평균 BVDV1a 역가는 1:21이었고, 이는 대조군의 것 <1:2보다 유의하게 (p≤0.05) 더 컸다. BVDV1a 항체 역가가 대조군 및 백신접종 군 송아지 양쪽 모두에서 챌린지 14일 후에 증가하였고, 이는 송아지가 BVDV1a로 챌린지되었음을 가리킨다.
코 면봉채취물로부터의 BVDV1a 단리: BVDV 특이적 CPE의 관찰을 기초로, 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 모두가 이러한 연구의 챌린지-후 단계 동안 BVDV1a를 배출하였다. 20마리의 백신접종 군 중 3마리만 챌린지-후 단계 동안 BVDV1a를 배출하였다. 천연적으로 보호된 0/10 대조군 및 보호된 17/20 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 0.85의 예방가능 분율을 초래하였다.
BVDV1a의 세포 배양물 강화 PCR 검출을 기초로, 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 모두가 이러한 연구의 챌린지-후 단계 동안 BVDV1b를 배출하였다. 20마리의 백신접종 군 중 5마리만 챌린지-후 단계 동안 BVDV1a를 배출하였다. 천연적으로 보호된 0/10 대조군 및 보호된 15/20 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 0.75의 예방가능 분율을 초래하였다.
백혈구연층으로부터의 BVDV1a 단리: BVDV 특이적 CPE의 관찰을 기초로, 이러한 연구의 대조군 송아지 10마리 중 6마리가 이러한 연구의 챌린지-후 단계 동안 바이러스혈증성이었다. 20마리의 백신접종 군은 챌린지-후 단계 동안 바이러스혈증성이 아니었다. 천연적으로 보호된 4/10 대조군 및 보호된 20/20 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 1.0의 예방가능 분율을 초래하였다.
BVDV1a의 세포 배양물 강화 PCR 검출을 기초로, 이러한 연구의 대조군 10마리 중 7마리가 이러한 연구의 챌린지-후 단계 동안 바이러스혈증성이었다. 20마리의 백신접종 군 중 2마리가 챌린지-후 단계 동안 바이러스혈증성이었다. 천연적으로 보호된 3/10 대조군 및 보호된 18/20 백신접종 군의 비를 사용하여 예방 분율을 계산하였다. 이는 0.86의 예방가능 분율을 초래하였다.
직장 온도: 챌린지 전-평균 온도를 공변량으로 사용하는 챌린지-후 직장 온도 분석에서, 통계적으로 유의한 (p<0.05) 군 및 군*일수 효과가 드러났다. 이러한 분석은 대조군의 온도가 제6일, 제8일 및 제14일에 백신접종 군의 것과 비교하여 유의하게 더 높았고, 제5일 및 제11일에 유의성에 육박하였음을 드러냈다.
BVDV1a 의 임상 징후: 대조군의 송아지 1마리가 BVDV1a 감염에 기인할 수 있는 임상 징후를 나타냈다. 송아지 21에서 관찰된 임상 징후는 다량의 점액녹성 코 분비물이었다. 백신접종 군의 송아지는 연구의 챌린지-후 단계 동안 BVDV1a 감염의 어떠한 임상 징후도 나타내지 않았다. 어떠한 송아지에서도 유해한 백신접종-후 반응이 관찰되지 않았다.
림프구감소증 : 20마리의 백신접종 군 중 2마리 및 10마리의 대조군 중 5마리에서 림프구감소증이 검출되어, 80％의 예방가능 분율이 초래되었다. 비율 데이터의 일일 평균은 BVDV 챌린지에 대한 대조군 송아지의 전형적인 반응을 드러냈다 (림프구감소증에 반동 스파이크(spike)가 이어짐). 백신접종된 송아지는 유사한 방식으로 반응하지 않았다.
백혈구감소증: 20마리의 백신접종 군 중 5마리 및 10마리의 대조군 중 4마리에서 백혈구감소증이 검출되어, 37％의 예방가능 분율이 초래되었다. 비율 데이터의 일일 평균이 도 3에서 그래프로 제시된다.
결론
선행 보고는 BVDV1a에 의해 야기되는 감염의 예방에서 보조물로서의 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스의 BVDV1a 분획의 항원성 및 효능을 입증한다.
이러한 조합 생성물의 BVDV1a 분획의 효능 및 항원성이 하기에 의해 입증되었다:
1) 대조군과 비교하여 백신접종 군에서의 BVDV1a에 대한 항체 역가의 유의한 증가. 백신접종 군의 송아지 20마리 중 19마리에서 1회의 2 ㎖ 용량의 투여 후 ≥ 1:8의 BVDV1a 역가가 발달되어, 9CFR 113.311 (c) (5)에서 정의된 요건을 충족시켰다.
2) 바이러스 단리 연구에서, 1회 용량의 투여가 챌린지-후 송아지에서 BVDV1a-유도 코 배출 및 바이러스혈증을 감소시켰음이 드러났다.
3) 백신접종된 송아지가 대조군 송아지에 비교하여 유의하게 더 낮은 열을 나타냈다.
4) 백신접종이 챌린지-후 송아지에서 BVDV1a-유도 림프구감소증 및 백혈구감소증을 또한 감소시켰다.
이러한 연구의 발견은 통계적으로 유의하고 임상적으로 관련이 있어서, 소 비기관염 - 바이러스성 설사 - 파라인플루엔자3 - 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 변형된 생 바이러스 내에 함유된 BVDV1a 분획의 효능을 입증한다.
실시예 11 - 수송열 백신에 대한 효능 검정법 프로토콜
발명의 명칭이 "다가 수송열 백신의 바이러스성 성분을 확인 및 구별하기 위한 조성물 및 방법 {Compositions and Methods for Identifying and Differentiating Viral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines}"인 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 일련 번호 61/427,404 (본 출원과 함께 2010년 12월 27일에 출원되었고, 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함됨)에서, 본 발명가들은 다가 백신 내의 각각의 개별적인 바이러스 성분의 직접적인 바이러스 정량 (즉, "효능")을 수득하는 것에서 유용한, 변형된 유전학-기반 프로토콜의 개발을 보고하였다. 본 발명은 통상적인 FA/IFA 검정법 (예컨대 현행 SAM 101 검정법에 기술된 것들)을 RT-qPCR 검정법으로 교체하여, 개별적인 검정법 웰 (즉, 희석물) 내의 특정 바이러스 종, 유형 또는 아유형의 존재 또는 부재를 결정하였다.
개별적인 웰의 RT-qPCR/qPCR 분석으로 시각적인 CPE 관찰을 대체함으로써 다가 백신, 예컨대 본원에 기술된 6가 MLV 백신의 개별적인 성분들에 대한 효능 테스트를 또한 더욱 객관적이게 할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 적정 검정법에서의 CPE 관찰은 다소 주관적일 수 있고, 종종 테스트 설비 간의 MLV 백신 역가에서의 차이의 원인인 것으로 간주된다. 그러나, 검정법의 객관성을 증가시킴으로써, 실험실 간의 재현성이 또한 증가될 것이다.
PI3에 대한 효능 테스트를 변형된, 파라인플루엔자 3 바이러스 백신의 적정을 위한 보충 검정 방법 (MVSAM102.01)을 사용하여 수행할 수 있었다. BRSV에 대한 효능 테스트를 변형된, 백신 내의 소 호흡기 세포융합바이러스의 적정을 위한 보충 검정 방법 (MVSAM0129.01)을 사용하여 수행할 수 있었다. 이러한 검정법들은 시각적인 CPE 관찰을 개별적인 웰의 실시간 qPCR 분석으로 교체함으로써 변형되었다. BHV 분획의 적정을 변형된, 백신 내의 감염성 소 비기관염 바이러스의 적정을 위한 보충 검정 방법 (MVSAM0105.01)을 사용하여 수행할 수 있었다. 이러한 검정법에서, 검정법을 다가 백신 분석에 표준화하기 위해, 표준 6웰 양식 대신에 96웰 양식을 사용할 수 있었다. 중요하게, 이러한 프로토콜은 BHV 플라크의 시각적 관찰 및 계수를 개별적인 웰의 qPCR 분석으로 교체하여, 더욱 정확하고 강건한 검정법을 제공하는 것을 포함하였다.
본 실시예는 본원에 기술된 6가 MLV 백신의 6개의 개별적인 바이러스 성분 각각의 효능을 성공적으로 결정하기 위해 본 발명가들의 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 번호 61/427,404에 기재된 정량적 (실시간) 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 기술을 사용하는 것을 입증한다. 본 발명가들은 이러한 검정법이 다가 예에서 유전적으로 관련된 균주들의 개별적인 효능을 결정하는 것에서 기존의 방법에 비해 특히 유리하다는 것을 나타낸다. 6가 MLV BRDC 백신을 모델로 사용하여, 이러한 검정법은 백신 내에 함유된 BVDV-1a, BVDV-1b, 및 BVDV-2의 3가지 유전학적 아유전자형의 개별적인 효능을 효과적으로 정량하도록 입증되었다.
물질 및 방법
세포 배양
모든 배양물은 통상적인 기술을 사용하여 제조되었고, 문헌 [Freshney (1987)]에 기술된 바와 같이 공급되었다. 배양물에서 전형적인 상피 유사 형태학을 나타내는 TVL-소 신장 세포주가 모든 배양 검정법에서 사용되었다.
프라이머 / 프로브 세트의 특이성
하기의 미국 농무부 (USDA)-허가 바이러스 시드 각각으로부터의 바이러스액으로부터 RNA를 추출하였다: BVDV-1a (싱어 균주), BVDV-1b (TGAC 균주), BVDV-2 (125), PI3 (레이싱어 SF-4), 및 BRSV (N375) (DNA 바이러스이기 때문에 BHV-1 [쿠퍼 균주]에 대해서는 추출 프로세스를 수행하지 않았다). RNAqueous®-4PCR (앰비온(Ambion), 미국 텍사스주 오스틴)을 사용하여 추출을 수행하였다.
각각의 RNA 바이러스 샘플을 택맨® 1-단계 RT-PCR 화학을 사용하는 6개의 프라이머/프로브 세트 각각에 대한 별개의 RT-qPCR 반응에서 주형 (샘플)으로 사용하였다. DNA 바이러스 (BHV-1)도 상기 기술된 6개의 프라이머/프로브 세트 각각과 함께 별개의 qPCR 반응에서 주형 (샘플)으로 사용하였다. 6가 백신의 6개 모두의 바이러스 분획에 대한 BRSV 프라이머/프로브 세트의 분석은 프라이머/프로브 세트 각각에 대해 어떠한 다른 바이러스 분획과의 교차-반응성도 없었음을 가리켰다.
qPCR 검정법
qPCR 검정법을 어플라이드 바이오시스템즈 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 및 표지된 분자 프로브
어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)에서 하기의 맞춤 택맨® 프로브 및 바이러스-특이적 전방향 및 역방향 프라이머 쌍이 제작되었다.
BVDV -1b (제1):
전방향 프라이머: 5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' (서열 1);
역방향 프라이머: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (서열 2); 및
BVDV-1b 택맨® MGB 프로브: 5'-TCACCTGGACGACCC-3' (서열 3).
BVDV -1b (제2):
제2 전방향 프라이머: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 19);
제2 역방향 프라이머: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 20); 및
제2 BVDV-1b 검출 프로브: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (서열 21).
BRSV :
전방향 프라이머: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (서열 4);
역방향 프라이머: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (서열 5); 및
BRSV 택맨® MGB 프로브: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (서열 6).
BVDV -1a:
전방향 프라이머: 5'-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3' (서열 7);
역방향 프라이머: 5'-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3' (서열 8); 및
BVDV-1a 택맨® MGB 프로브: 5'-AACCGACTGTTACGAATAC-3' (서열 9).
BVDV -2:
전방향 프라이머: 5'-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3' (서열 10);
역방향 프라이머: 5'-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3' (서열 11); 및
BVDV-2 택맨® MGB 프로브: 5'-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3' (서열 12).
PI 3 :
전방향 프라이머: 5'-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3' (서열 13);
역방향 프라이머: 5'-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3' (서열 14); 및
PI3 택맨® MGB 프로브: 5'-ACCTCGGTCATCCATAG-3' (서열 15).
BHV -1:
전방향 프라이머: 5'-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3' (서열 16);
역방향 프라이머: 5'-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3' (서열 17); 및
BHV-1 택맨® MGB 프로브: 5'-ACGGACGTGCGCGAA-3' (서열 18).　　　
1가 백신에 대한 효능 검정법
하기의 검정법 각각에 대한 프로토콜은 어플라이드 바이오시스템즈 7500 상대적 역치 사이클(Comparative Threshold Cycle) (CT) 방법을 이용하여 적정 플레이트의 개별적인 웰이 등가의 기준 웰보다 더 많은 양의 바이러스를 함유하는지를 결정하였다. 대부분의 바이러스 샘플은 PCR에 의해 검출될 수 있는 약간의 비-생육성 바이러스 입자를 함유하였고, 따라서 잠재적으로 거짓-양성 결과를 제공하였다. 이러한 문제점은 세포가 없는 기준 플레이트를 사용함으로써 해소되었다. 기준 플레이트에서 샘플을 정확하게 검정법 플레이트에서와 같이 희석하였지만, 바이러스 복제에 대한 가능성을 없애도록 세포가 없었다. 기준 플레이트를 사용하여 각각의 검정법 내의 각각의 웰에 대한 기준선 또는 배경 CT 값이 생성되었다. 검정법 플레이트 상의 웰의 CT 값이 상응하는 배경 웰보다 크면, 바이러스 복제가 일어난 것이었고, 웰을 양성으로 간주하였다. 웰에 대해 CT 값이 결정되지 않거나 또는 CT 값이 배경 CT 값과 등가이면, 웰을 음성으로 간주하였다.
다가 백신에 대한 효능 검정법
IBR/BVDV-1a, -1b, -2/PI3/RSV 6가 백신, 변형된 생 바이러스의 파일럿(pilot) 연속물을 본원에 기술된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, BHV-1 (쿠퍼 균주), BVDV-1a (싱어 균주), BVDV-1b (TGAC 균주), BVDV-2 (125), PI3 (레이싱어 SF-4), 및 BRSV (N375)를 TVL-BK 세포주 (20번째 계대)에서 증식시켰다. 개별적인 분획들을 10번째 계대에서 수확하고, 6-방식 생성물로 함께 블렌딩하였다. 적합한 중화 항혈청을 첨가하면서 본원에 기술된 바와 같이 6-방식 백신의 각각의 분획의 효능 테스트를 수행할 수 있었다. 각각의 바이러스 분획의 TCID50을 CPE/FA/IFA 결과를 기초로 결정하였고, RT-qPCR/qPCR을 기초로 하는 것과 비교하였다.
BVDV -1A, -1B 및 -2 효능 테스트
1가 BVDV-1a, BVDV-1b 및 BVDV-2 샘플을 백신 내의 소 바이러스성 설사 바이러스의 적정을 위한 보충 검정 방법 (SAM 101)에 따라 따로따로 적정할 수 있다. 간략하게, 이러한 검정법을 이중으로 수행하였고, 이때 플레이트 중 하나는 기술된 바와 같은 CPE 및/또는 FA/IFA를 기초로 하는 역가 계산에 사용하였다. 다른 플레이트는 RT-qPCR을 기초로 역가를 결정하는데 사용하였다. 각각의 바이러스에 대해 상기 기술된 바와 같이 세포-결핍 기준 플레이트가 포함되었다.　　　
PI 3 효능 테스트
PI3에 대한 효능 테스트를 이중으로 수행하였고, 이때 플레이트 중 하나는 CPE를 기초로 하는 역가 계산에 사용하였다. 다른 플레이트는 RT-qPCR에 의해 결정된 바와 같은 PI3의 상대적인 CT 값을 기초로 역가를 결정하는데 사용하였다. 상기 기술된 바와 같이 세포-결핍 기준 플레이트가 포함되었다.
BRSV 효능 테스트
BRSV에 대한 효능 테스트를 이중으로 수행하였고, 이때 플레이트 중 하나는 상기 기술된 바와 같이 CPE를 기초로 하는 역가 계산에 사용하였고, 나머지 플레이트는 RT-qPCR에 의해 결정된 바와 같은 BRSV의 상대적인 CT 값을 기초로 역가를 결정하는데 사용하였다. 상기 논의된 바와 같이, 세포-결핍 기준 플레이트가 또한 검정법에 포함되었다.
BHV 효능 테스트
플라크의 통상적인 시각적 관찰 및 계수를 개별적인 웰의 qPCR 분석으로 교체함으로써 BHV에 대한 효능 테스트를 96웰 양식으로 수행하였다. 검정법을 이중으로 수행하였고, 이때 플레이트 중 하나는 개별적인 웰 (희석물) 내의 CPE의 존재 또는 부재를 기초로 하는 역가 계산에 사용한 한편, 나머지 플레이트는 QPCR에 의해 결정된 바와 같은 BHV의 상대적인 CT 값을 기초로 역가를 계산하는데 사용하였다. 상기 논의된 바와 같이 세포-결핍 기준 플레이트가 포함되었다.
참고문헌
하기의 참고문헌은, 본원에 기재된 것들에 대해 보충적인, 예시적인 절차상 상세사항 또는 기타 상세사항을 제공한다는 점에서, 이에 대한 명백한 참조에 의해 전문에 본원에 명확하게 포함된다:
카루터스(Caruthers) 등의 미국 특허 번호 4,415,732
카루터스 등의 미국 특허 번호 4,458,066
멀리스(Mullis) 등의 미국 특허 번호 4,683,195
멀리스 등의 미국 특허 번호 4,683,202
코스터(Koster) 등의 미국 특허 번호 4,725,677
카루터스 등의 미국 특허 번호 4,973,679
몰코(Molko) 등의 미국 특허 번호 4,980,460
피콘(Picone) 등의 미국 특허 번호 5,614,388
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
본원에서 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용의 견지에서 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 예시적인 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 조성물에, 방법에, 그리고 본원에 기술된 방법의 단계들의 순서에서 변형이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적 및 생리학적 양쪽 모두로 관련된 특정 작용제가 본원에 기술된 작용제를 대체하면서 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이같은 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다. 따라서, 특허가 추구되는 독점권은 하기 청구항에 기술된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company Weise, Dale W Harris, James R <120> BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS TYPE 1B VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS <130> X19557 <150> 61/427361 <151> 2010-12-27 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 1 caccctatca ggctgtattc atagc 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 2 tgcccacagc acatcttaac c 21 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 3 tcacctggac gaccc 15 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 4 gcaatgctgc aggactaggt ataat 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 5 acactgtaat tgatgacccc attct 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 6 aagacttgta tgatgctgcc aa 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 7 ggtcgcccag gtaaaagca 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 8 gcctctgcag caccctatca 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 9 aaccgactgt tacgaatac 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 10 gctagccatg cccttagtag gac 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 11 gacgagtccc ctgtactcag g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 12 cagtgagtcc attggatgg 19 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 13 ggagaccaag accaaggaga tg 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 14 cgtctgccca tgcataagg 19 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 15 acctcggtca tccatag 17 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 16 ccatgttagc gctctggaac c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 17 cgtctttacg gtcgacgact cc 22 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 18 acggacgtgc gcgaa 15 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 19 gtcgtccagg tgaaaacggt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 20 gtcgtccagg tgaaaacggt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct - primer <400> 21 gtcgtccagg tgaaaacggt 20

Claims (30)

  1. 변형된 생 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV-1b) 및 수의학상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 생 소 바이러스성 설사 바이러스가 세포변성 BVDV-1b 바이러스인 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 3형 파라인플루엔자 바이러스 (PI3), 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV), 소 헤르페스 바이러스 (BHV-1), 1a형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV-1a), 2형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV-2), 또는 감염성 소 비기관염 (IBR) 바이러스, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상; 또는 이들로부터 수득된 하나 이상의 바이러스-특이적 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 변형된 생 IBRV, 변형된 생 BRSV, 변형된 생 BHV-1, 변형된 생 1a형 BVDV, 변형된 생 2형 BVDV, 또는 변형된 생 PI3, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 아주반트(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 제1 항원을 면역학적 유효량으로 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 제1 항원이 악티노바실루스(Actinobacillus), 악티노마이세스(Actinomyces), 바실루스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 브라키스피라(Brachyspira), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에를리키아(Ehrlichia), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 에쉐리키아(Escherichia), 히스토필루스(Histophilus), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 만헤이미아(Mannheimia), 모락셀라(Moraxella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 파스테우렐라(Pasteurella), 살모넬라(Salmonella), 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체에 대해 특이적인 면역원성 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 적어도 제1 항원이 불활성화된 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 포유동물 백신으로서 제제화된 면역원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 소 백신으로서 제제화된 면역원성 조성물.
  11. 예방적 유효량의 제1항의 면역원성 조성물 및 아주반트를 포함하는 백신.
  12. 제11항에 있어서, 면역학적 유효량의 하나 이상의 미생물 병원체-특이적 항원을 추가로 포함하는 백신.
  13. 포유동물에게 다수의 변형된 생 1b형 BVDV 바이러스 및 수의학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 면역학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV-1b)-특이적 면역 반응을 유도하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 조성물을 예방적으로 포유동물에게 투여하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 조성물의 투여가 포유동물에서 치료 효과를 제공하는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 조성물을 경구, 피하, 비경구, 근육내, 또는 비강내, 또는 이들의 조합으로 투여하는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 조성물이 용량 당 약 102 내지 약 1010 TCID50의 변형된 생 바이러스를 함유하는 것인 방법.
  18. 동물에게 변형된 생 BVDV-1b 바이러스 및 수의학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 수송열을 예방하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 조성물이 아주반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 동물이 페스티바이러스에 감염되었거나, 또는 페스티바이러스로부터의 감염에 감수성인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 동물이 소과동물인 방법.
  22. 페스티바이러스 감염에 대해 감수성인 동물에게 변형된 생 BVDV-1b 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 예방적 또는 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 페스티바이러스에 의해 야기되는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 관리하거나, 또는 호전시키는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 조성물이 아주반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 조성물이 소 로타바이러스, BRSV, BHV-1, 소 코로나바이러스, PI3, 소 파라믹소바이러스, 구제역 바이러스, BRV, BVDV-1a, BVDV-2, A1형 만헤이미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica), A6형 만헤이미아 헤몰리티카, 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 히스토필루스 솜니(Histophilus somni), 및 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis) 중 하나 이상으로부터 유래된 면역원을 추가로 포함하는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 동물이 소과동물인 방법.
  26. 동물에게 변형된 생 BVDV-1b 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, BVDV-1b에 의해 야기되는 질환에 대해 동물을 보호하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 조성물이 용량 당 약 102 내지 약 1010 TCID50 유닛의 변형된 생 BVDV-1b 바이러스를 함유하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 동물에게 투여되는 조성물의 양이 용량 당 약 0.1 내지 약 5.0 ㎖인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 소 비기관염 바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 또는 파라인플루엔자 3 바이러스, 또는 이들의 조합의 공동 투여를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 질환이 수송열, 소 복합성 호흡기 질환, 또는 소 바이러스성 설사인 방법.
KR1020137019872A 2010-12-27 2011-12-21 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법 KR101554080B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061427361P 2010-12-27 2010-12-27
US61/427,361 2010-12-27
PCT/US2011/066384 WO2012092053A1 (en) 2010-12-27 2011-12-21 Bovine viral diarrhea virus type 1b vaccine compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130109220A true KR20130109220A (ko) 2013-10-07
KR101554080B1 KR101554080B1 (ko) 2015-09-17

Family

ID=45531546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137019872A KR101554080B1 (ko) 2010-12-27 2011-12-21 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20130280294A1 (ko)
EP (1) EP2658570B1 (ko)
JP (1) JP6053036B2 (ko)
KR (1) KR101554080B1 (ko)
CN (1) CN103347534B (ko)
AU (1) AU2011352800B2 (ko)
BR (1) BR112013016503A2 (ko)
CA (1) CA2822825C (ko)
CL (1) CL2013001877A1 (ko)
CO (1) CO6761399A2 (ko)
ES (1) ES2709190T3 (ko)
MX (1) MX351380B (ko)
NZ (1) NZ611531A (ko)
PE (1) PE20140871A1 (ko)
PL (1) PL2658570T3 (ko)
PT (1) PT2658570T (ko)
RU (1) RU2595873C2 (ko)
SG (1) SG191396A1 (ko)
WO (1) WO2012092053A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101960016B1 (ko) * 2018-04-09 2019-07-15 전북대학교 산학협력단 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
KR101960017B1 (ko) * 2018-04-09 2019-07-15 전북대학교 산학협력단 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
KR102101208B1 (ko) 2019-10-16 2020-04-17 주식회사 모투스 비산먼지 제거 기능이 있는 런닝머신

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR084358A1 (es) * 2010-12-27 2013-05-08 Lilly Co Eli Composiciones y metodos para identificar y diferenciar componentes virales de vacunas multivalentes de la “fiebre de embarque” (complejo de enfermedad respiratoria bovina (brdc))
US9480739B2 (en) * 2013-03-15 2016-11-01 Intervet Inc. Bovine virus vaccines that are liquid stable
CN107970443A (zh) * 2016-12-28 2018-05-01 浙江海隆生物科技有限公司 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用
CN107823639B (zh) * 2017-11-10 2020-10-02 齐鲁动物保健品有限公司 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
CN112034169A (zh) * 2020-08-27 2020-12-04 华威特（江苏）生物制药有限公司 用于检测牛病毒性腹泻病毒1型的直接免疫荧光试剂及其试剂盒
CN113207733B (zh) * 2021-05-28 2022-09-09 杨国胜 一种具有麻醉作用的畜牧用耳标
CN114634996B (zh) * 2022-02-28 2024-05-07 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
FR2596761B1 (fr) 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
US5491225A (en) 1991-12-19 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. PCR primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
DE69535520T2 (de) * 1994-05-10 2008-02-07 Wyeth Abgeänderter, verbesserter BRSV Lebend- Impfstoff
US7563449B2 (en) * 2003-04-21 2009-07-21 Pfizer Inc, Methods for reducing cattle reproductive diseases
US7361357B2 (en) * 2003-07-29 2008-04-22 Pfizer Inc. Safe mutant viral vaccines
PL1727562T3 (pl) * 2004-03-17 2008-10-31 Pharmacia & Upjohn Co Llc Sposób szczepienia przeciw zakażeniu jąder wirusem BVD
AU2006278654A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 Wyeth Stabilizers for veterinary vaccines
UY29915A1 (es) * 2005-11-15 2007-06-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna combinada que comprende un virus atenuado de la diarrea viral bovina
EP2026839A4 (en) * 2005-12-14 2009-04-01 Univ Oklahoma RNA VIRUS VACCINE AND METHODS

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101960016B1 (ko) * 2018-04-09 2019-07-15 전북대학교 산학협력단 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
KR101960017B1 (ko) * 2018-04-09 2019-07-15 전북대학교 산학협력단 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
KR102101208B1 (ko) 2019-10-16 2020-04-17 주식회사 모투스 비산먼지 제거 기능이 있는 런닝머신

Also Published As

Publication number Publication date
ES2709190T3 (es) 2019-04-15
RU2595873C2 (ru) 2016-08-27
PT2658570T (pt) 2019-02-08
AU2011352800A1 (en) 2013-06-20
CA2822825C (en) 2016-02-09
NZ611531A (en) 2015-04-24
MX351380B (es) 2017-10-12
CN103347534B (zh) 2018-09-11
EP2658570A1 (en) 2013-11-06
PL2658570T3 (pl) 2019-05-31
SG191396A1 (en) 2013-08-30
AU2011352800B2 (en) 2015-09-03
KR101554080B1 (ko) 2015-09-17
US20130280294A1 (en) 2013-10-24
CA2822825A1 (en) 2012-07-05
CN103347534A (zh) 2013-10-09
JP6053036B2 (ja) 2016-12-27
BR112013016503A2 (pt) 2018-05-22
EP2658570B1 (en) 2018-11-28
CL2013001877A1 (es) 2014-03-07
MX2013007584A (es) 2013-10-17
RU2013128921A (ru) 2015-02-10
PE20140871A1 (es) 2014-07-19
CO6761399A2 (es) 2013-09-30
JP2014502619A (ja) 2014-02-03
WO2012092053A1 (en) 2012-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101554080B1 (ko) 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법
KR20140108603A (ko) 약독화된 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 복합 백신
US7309493B2 (en) Inactivated bovine scours vaccines, process and method of preventing bovine scours
KR20080038272A (ko) 로소니아 인트라셀룰라리스를 포함하는 면역원성 조성물
JP2009215309A (ja) 家畜の呼吸系と生殖系の感染症に対するワクチン
US8846054B2 (en) Method of treating pregnant cows and/or heifers
JP5833145B2 (ja) 免疫原性ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ組成物
JP4105220B2 (ja) 精巣ｂｖｄｖ感染に対するワクチン接種方法
Bittar et al. Effects of injectable trace minerals administered concurrently with a modified live virus vaccine on long-term protection against bovine viral diarrhea virus acute infection in dairy calves
EA032284B1 (ru) Вакцинация респираторным коронавирусом собак для защиты от инфекций в. bronchiseptica
TW201731526A (zh) 混成核心之貓科動物疫苗
JP5833144B2 (ja) イヌ呼吸器病症候群のための組成物
KR20200061508A (ko) 약독화된 조류메타뉴모바이러스 주 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR102615970B1 (ko) 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법
Hoyos-Jaramillo et al. Clinical status and endoscopy of the upper respiratory tract of dairy calves infected with Bovine viral diarrhea virus 2 and Bovine herpes virus 1 after vaccination and trace minerals injection
KR101191518B1 (ko) 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물
RU2395297C1 (ru) Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота
CA2648602C (en) Method of treating pregnant cows and/or heifers
MXPA06010631A (en) Method of vaccination against testicular bvdv infection

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180628

Year of fee payment: 4