CN115869392A - 牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 - Google Patents
牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115869392A CN115869392A CN202211589445.9A CN202211589445A CN115869392A CN 115869392 A CN115869392 A CN 115869392A CN 202211589445 A CN202211589445 A CN 202211589445A CN 115869392 A CN115869392 A CN 115869392A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- bovine
- inactivated
- strain
- viral diarrhea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒和支原体四联灭活疫苗。该四联灭活疫苗的活性成分为灭活的牛病毒性腹泻病毒、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒、灭活的牛副流感病毒3型和灭活的牛支原体。该四联灭活疫苗是采用MDBK细胞悬浮培养的方法繁殖BVDV HH03株病毒、IBRV TY01株病毒、BPIV3LH01株病毒;采用Hayflick液体培养基培养牛支原体CHF01株。该方法能够很好的在悬浮培养细胞上培养病毒,解决贴壁细胞繁殖病毒过程岀现的接毒不均匀甚至难以获得较高效价的病毒液的问题,其TCID50大于8.0,降低了生产成本,细胞生长均匀,是一个值得推广应用的方法。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域的一种牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)属于黄病毒科瘟病毒属牛病毒性腹泻病毒/黏膜病病毒(Bovine viral diarrheaVirus,BVDV)引起牛的亚临床感染、急性感染、粘膜病和持续性感染等,急性感染表现常为腹泻、流产与呼吸系统疾病引起的以腹泻为主要症状的重要传染病,各年龄牛均易感。牛病毒性腹泻的主要症状为:腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染与免疫耐受,母畜流产、死胎和畸形。除感染牛外,还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生动物。
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhino tracheitis,IBR)俗称“红鼻病”或“坏死性鼻炎”,是由牛疱疹病毒I型(BHV-1)牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovinerhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种急性、热性、接触性烈性传染病,世界卫生组织0IE将其列为必须上报的疫病之一,我国将其列为二类传染病。牛和猪是易感动物和带毒动物,也可感染猪和山羊等动物。该病毒感染呼吸系统、生殖系统、神经系统、眼结膜和胎儿,且病毒感染牛体后,可潜伏于神经系统,使感染变得呈间歇性、持续性,而且病牛会长期或终身带毒。病毒感染还能够诱发产奶量下降和流产,并导致肉用牛和康复牛的生长缓慢,给养牛业造成极大的损失。
牛副流感(Bovine parainfluenza,BPI)是由属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的牛副流感3型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)引起的一种急性呼吸道疾病,病症为牛副流行性感冒,又称“运输热”,是一种急性接触性传染病,BPIV3对牛的致病力不强,单纯感染仅引起轻微的临床症状,但在继发细菌、支原体及外界诱因的联合作用下,则可产生严重呼吸道症状,甚至可引起病牛的死亡。BPI与BVD、IBR一起构成了牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的主要病原。目前,BRDC是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因,严重危害养牛业的健康发展。牛支原体在世界范围内普遍存在,是引起牛肺炎、关节炎、乳房炎、流产与不孕等多种疾病的主要病原之一。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何更好的繁殖病毒并获得较高效价的病毒液的问题,和/或一针四防,简化免疫程序,降低使用四联疫苗的免疫牛局部和全身不良反应。
本发明的第一个目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗。
本发明所提供的牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗的活性成分为灭活的牛病毒性腹泻病毒、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒、灭活的牛副流感病毒3型和灭活的牛支原体。
上述四联灭活疫苗中,牛病毒性腹泻病毒可为牛病毒性腹泻病毒HH03株。
上述四联灭活疫苗中,牛传染性鼻气管炎病毒可为牛传染性鼻气管炎病毒TY01株。
上述四联灭活疫苗中,牛副流感病毒3型可为牛副流感3型病毒LH01株。
上述四联灭活疫苗中,牛支原体可为牛支原体CHF01株。
上述四联灭活疫苗中,灭活的牛病毒性腹泻病毒、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒、灭活的牛副流感病毒3型和灭活的牛支原体的配比可为:所述灭活的牛病毒性腹泻病毒以灭活前的牛病毒性腹泻病毒计可为108.0TCID50/mL;所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒以灭活前的牛传染性鼻气管炎病毒计可为108.0TCID50/mL;所述灭活的牛副流感病毒3型以灭活前的牛副流感病毒3型计可为108.0TCID50/mL;所述灭活的牛支原体以灭活前的牛支原体计可为1.0×1010ccu/mL。
上述四联灭活疫苗可由活性成分和佐剂组成。
上述佐剂可为206佐剂。
本发明的第二个目的是提供了制备上述四联灭活疫苗的方法。
本发明所提供的制备上述四联灭活疫苗的方法,包括如下步骤:
1)用悬浮MDBK细胞分别培养牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型,分别得到牛病毒性腹泻病毒液、牛传染性鼻气管炎病毒液和牛副流感病毒3型液;将所述牛病毒性腹泻病毒液、所述牛传染性鼻气管炎病毒液和所述牛副流感病毒3型液分别进行灭活,分别得到灭活的牛病毒性腹泻病毒抗原液、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和灭活的牛副流感病毒3型抗原液;
用液体培养基培养牛支原体,得到牛支原体培养液,将所述牛支原体培养液进行灭活,得到灭活的牛支原体抗原液;
2)将上述灭活的牛病毒性腹泻病毒抗原液、上述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和上述灭活的牛副流感病毒3型抗原液和上述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分,得到牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗。
上述制备方法中,所述牛病毒性腹泻病毒具体可用HH03株、和/或所述牛传染性鼻气管炎病毒具体可用TY01株、和/或所述牛副流感3型具体可用LH01株,和/或牛支原体具体可用CHF01株。
上述制备方法中,所述抗原灭活是将制备的三种病毒抗原和支原体菌液使用甲醛进行灭活。
本发明提供了一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感病毒3型和牛支原体四联灭活疫苗及其制备方法。通过采用MDBK全悬浮细胞繁殖牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型以及在培养基上繁殖牛支原体,采用该方法可以很好的在悬浮培养细胞上培养病毒,解决贴壁细胞繁殖病毒过程岀现的接毒不均匀甚至难以获得较高效价的病毒液的问题,其TCID50大于8.0,降低了生产成本,细胞生长均匀,且本发明的四联疫苗安全可靠,简化免疫程序,可达到“一针四防”的目的。
附图说明
图1为悬浮细胞培养24h后的生长状况。
图2为悬浮细胞培养48h后的生长状况。
图3为悬浮细胞培养72h后的生长状况。
图4为悬浮细胞上接种BVDV收毒时的生长状况。
图5为悬浮细胞上接种IBRV收毒时的生长状况。
图6为悬浮细胞上接种BPIV3收毒时的生长状况。
图7为牛支原体在固体培养基的生长状况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中,牛病毒性腹泻病毒HH03株、牛传染性鼻气管炎病毒TY01株、牛副流感3型病毒LH01株和牛支原体CHF01株已记载于吴志强,石悦萌,寇曌婷,等.牛呼吸道疾病病原BVDV、IBRV、BPIV3和牛支原体的分离鉴定[J].当代畜禽养殖业,2022(5):12-16,公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
实施例1、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗的制备
1.BVDV-HH03株、IBRV-TY01株、BPIV3-LH01株、牛支原体CHF01株的分离鉴定
(1)牛病毒性腹泻病毒毒株HH03株,接种MDBK细胞后可产生细胞病变,引物根据BVDV国际标准株基因序列,在5’端非编码区序列设计合成一对引物,引物序列如下:
BVDV-F:5’-CATGCCCATAGTAGGAC-3’(序列1)
BVDV-R:5’-CCATGTGCCATGTACAG-3’(序列2)
RT-PCR后扩增出288bp特异性片段。
(2)牛传染性鼻气管炎病毒TY01株,接种MDBK细胞后可产生细胞病变,设计特异性引物,引物序列如下:
IBRV-F:5’-TGACGGTAGCCTGGGACTGG-3’(序列3)
IBRV-R:5’-CCGGAAGGCCACGACAAA-3’(序列4)
PCR可扩增出311bp特异性片段。
(3)牛副流感病毒3型LH01株,接种MDBK细胞能产生细胞病变,引物序列如下:
BPIV3-F:5'-GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3'(序列5)
BPIV3-R:5'-TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3'(序列6)
RT-PCR可扩增出425bp的特异性片段。
(4)牛支原体CHF01株,引物序列如下:
MB-F:5'-TATTGGATCAACTGCTGGAT-3'(序列7)
MB-R:5'-AGATGCTCCACTTATCTTAG-3'(序列8)
PCR可扩增出447bp的特异性片段。
纯净性检测显示以上三株毒株无菌、无支原体以及无外源病毒污染,纯净性良好,三株病毒株对MDBK细胞适应性好,TCID50稳定;牛支原体菌株具有良好的活菌滴度、毒力、免疫原性和交叉免疫保护性。
2.抗原制备
为解决BVDV、IBRV、BPIV3适应悬浮培养牛肾细胞系MDBK过程中出现的一系列问题,本发明提供了悬浮培养技术制备BVDV HH03株、IBRV TY01株、BPIV3 LH01株的方法;同时将牛支原体CHF01株接种于适宜培养基培养,收获培养物。
a利用全悬浮培养技术制备BVDV HH03株、IBRV TY01株、BPIV3 LH01株抗原
(1)细胞复苏及驯化:从液氮罐中取出牛肾细胞系MDBK(来自深圳壹生科生物)细胞,置37℃水浴锅内快速融化,用吸管取细胞液加入备好的10mL MDBK细胞全悬浮培养液(深圳壹生科生物,pH值在7.0~7.2之间)中,轻轻混匀。1000rpm、5min离心,弃上清。取15mL培养液重悬细胞,将细胞液转移至125mL摇瓶中,置于37℃、5.0%CO2培养箱中,以130r/min振荡悬浮培养。每间隔72h进行传代,连续传代多次,进行细胞驯化,定期观察,结果表明从第4代以后细胞增长数量基本能在72h增长至6×106个~7×106个/mL以上,且死亡率基本低于3%(存活率高于97%),生长状态稳定,无细胞结团现象,第4~10代细胞即为驯化好的MDBK细胞。
(2)反应器放大培养细胞:将驯化好的MDBK细胞接种至15L生物反应器,提高转速150r/min,充分悬浮细胞,降低转速至50~80r/min,加入消泡剂(体积比0.1%),培养24h,细胞密度达到2×106个细胞/mL,放大至1000升反应器。
(3)悬浮培养繁殖毒种、收毒:当MDBK细胞密度达到2.5×106个/mL时,将BVDVHH03株、IBRV TY01株、BPIV3 LH01株分别按照MOI=0.01~0.1的接毒量进行接种,加入MDBK细胞全悬浮培养液进行培养。控制反应器中培养条件:溶氧量为30~50%、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.2。每隔6h取样,检测细胞形态,48~72h收获病毒液,采用高压均质机将收获的病毒液进行物理破碎,释放病毒粒子。结果表明:在接种BVDV HH03株后72~96h,收获BVDV抗原液的病毒含量达到峰值为108.0TCID50/mL;接种IBRV TY01株后72~96h,收获IBRV抗原液的病毒含量达到峰值为108.0TCID50/mL;在接种BPIV3 LH01株72~96h,收获BPIV3抗原液的病毒含量达到峰值为108.0TCID50/mL。制备的抗原液按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净性检验,应无细菌、霉菌、支原体污染。结果表明收获的BVDV HH03株、IBRV TY01株、BPIV3 LH01株病毒液均无细菌、霉菌和支原体。
(4)病毒液灭活
分别向步骤(3)的BVDV HH03株、IBRV TY01株、BPIV3 LH01株抗原液加入经无菌过滤的终浓度为0.1%甲醛溶液,于室温下灭活48~72小时,分别得到灭活的BVDV HH03株抗原液、灭活的IBRV TY01株抗原液和灭活的BPIV3 LH01株抗原液。
将上述灭活的BVDV HH03株抗原液、灭活的IBRV TY01株抗原液和灭活的BPIV3LH01株抗原液稀释100倍,取样按10%接种量接种MDBK细胞,盲传三代,进行灭活检测。结果表明均未出现细胞病变(CPE)。
b利用平板培养法技术制备牛支原体抗原
(1)牛支原体培养:牛支原体CHF01株菌液均匀接种于Hayflick固体平板(PPLO琼脂、葡萄糖、丙酮酸钠、25%酵母浸粉、10万单位青霉素、胎牛血清;pH值为7.6~7.8),密闭条件下37℃培养4~5日,可见典型的“煎蛋状”菌落,菌落中央厚且致密、周边为薄的透明颗粒区、表面光滑、边缘整齐,呈圆形,嵌入培养基中生长,可见β溶血环(见附图7)。接种Hayflick液体培养基(PPLO Broth、葡萄糖、丙酮酸钠、25%酵母浸粉、10万单位青霉素、胎牛血清;pH值为7.6~7.8),在37℃培养3~4日,培养基清亮,晃动培养瓶可见底部有絮状物呈螺旋形飘起。
(2)接种与收获:将牛支原体CHF01株二级生产种子按5%比例接种于37℃预热的Hayflick液体培养基,37℃恒温培养,100r/min,72~120h收获发酵液,得到牛支原体抗原液。活菌计数测得抗原液中活菌含量不低于1.0×1010ccu/mL。
(3)牛支原体灭活:向步骤(2)的牛支原体抗原液中加入经无菌过滤的终浓度为0.2%的甲醛溶液,25℃灭活10h,灭活完成,取样进行无菌检验和灭活检验:取该灭活的牛支原体抗原液,接种于Hayflick液体培养基进行传代培养,连续盲传3代,均未发现牛支原体及细菌生长。
3.牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗四联灭活疫苗乳化配苗
将步骤2制备的灭活的灭活的BVDV HH03株、灭活的IBRV TY01株、灭活的BPIV3LH01株、灭活的牛支原体抗原液混合均匀即为水相,将206佐剂(购自Seppic公司,货号36022E)高压灭菌后使用。将灭活后的抗原液加入到灭菌降温至30℃左右的油佐剂中,按水相:油相体积比为46:54的比例进行混合乳化,搅拌30min,配制成牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体四联灭活疫苗。该牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体四联灭活疫苗中,BVDV抗原含量以灭活前的BVDV HH03株计为108.0TCID50/mL,IBRV抗原含量以灭活前的BRV TY01株计为108.0TCID50/mL,BPIV3抗原含量以灭活前的BPIV3 LH01株计为108.0TCID50/mL,牛支原体抗原含量以灭活前的牛支原体CHF01株计为1.0×1010ccu/mL。
4.牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体四联灭活疫苗的成品检验
4.1.物理性状
(1)外观应为乳白色或淡粉红色略带粘滞性均匀乳状液。
(2)剂型水包油包水型,取一清洁吸管,吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面,应呈云雾状扩散。
(3)稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中,以3000r/min离心15min,管底析出的水相应不超过0.5mL。
(4)黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验,应不超过200cP。
(5)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定。
4.2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行,应无菌生长。
牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗的物理性状和无菌检验结果如表1。
表1.物理性状和无菌检验结果
4.3.安全检验
(1)用小动物检验(替代动物法)试验选用体重350~400g的豚鼠6只,各经背部皮下一次性注射牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗共2mL,分两点注射,每点1mL;用体重18-22g的BALB/c小鼠5只,各经背部皮下一次性注射牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗1mL,分两点注射,每点注射0.5mL,连续观察7日,均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应。
(2)用牛检验(靶动物法)用4-6月龄的BVDV、IBRV、BPIV3、支原体抗原、抗体双阴性(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗体效价不高于1:2、间接血凝试验检测牛支原体抗体效价<1:4)的健康易感牛4头,每头颈部肌肉一次性注射4.0mL牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体四联灭活疫苗,连续观察14日,均应不出现因注射疫苗引起的明显局部或全身不良反应。
牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗的安全检验结果如表2所示。
表2.安全检验结果
4.4.免疫效力检验
(1)豚鼠中和抗体测定法:用体重350~400g的SPF级雌性豚鼠12只(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗体效价阴性;间接血凝检测牛支原体呈阴性),其中免疫组10只,对照组2只,免疫组豚鼠各经腿部肌肉注射牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗1.0mL,对照组豚鼠各经腿部肌肉注射PBS(NacCl 8g、KCl0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g,加水定容至1L)1.0mL,免疫3周后,以同样的方式和剂量进行加强免疫一次。二免后21天,连同对照组2只豚鼠一并采血,分离血清测定中和抗体水平(用含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液(购自Gibco公司)对灭活后待检样品、阳性对照血清和阴性对照血清在96孔U型板内进行2倍系列稀释。将稀释好的中和抗原液按每孔0.1mL加到含有血清的96孔U型板,置37℃、含5%CO2培养箱内中和1小时。取培养16~24小时的96孔培养板细胞,弃去生长液,将中和1小时的病毒与血清的混合物转移至96孔细胞培养板相应孔内,每孔0.1mL,置37℃、含5%CO2培养箱中培养并观察4日。用Reed-Muench法计算血清中和抗体效价),应至少8只豚鼠的BVDV中和抗体效价不低于1:64,至少8只豚鼠的IBRV中和抗体效价不低于1:64,至少8只豚鼠的BPIV3的中和抗体效价不低于1:64,阴性对照中和抗体效价均应小于1:2。牛支原体用ELISA方法检测血清抗体,计算相对效力(RP)值,RP值应≥1,且对照组全部为抗体阴性。
牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗的效力检验结果(豚鼠)如表3所示。
表3.效力检验结果(豚鼠)
(2)牛免疫攻毒法:用4-6月龄的BVDV、IBRV、BPIV3、支原体抗原、抗体双阴性(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗体效价不高于1:2、间接血凝试验检测牛支原体抗体效价<1:4)的健康易感牛(荷斯坦牛)40头,其中免疫组20头,攻毒对照组20头。免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2mL,3周后以同途径同一部位加强免疫一次,二免后21日将免疫组牛按免疫程序划分为BVDV、IBRV、BPIV3和支原体组,每组5头。BVDV组连同攻毒对照牛5头总计10头牛,用BVDV强毒攻毒,每头牛鼻内接种检验用强毒BVDV HH01株10.0mL(病毒含量为107.0TCID50/mL),其中3.0mL/鼻孔,口腔注射4.0mL;IBRV组连同攻毒对照牛5头总计10头牛,每头牛鼻内攻击IBRV强毒TY01株10.0mL(病毒含量为107.0TCID50/mL),分两次滴鼻攻击(上午和下午各1次),每次攻击时左右鼻孔各2.5mL;BPIV3组连同攻毒对照牛5头总计10头牛,用BPIV3强毒攻毒,每头牛鼻内攻击BPIV3强毒LH01株10.0mL(病毒含量为107.0TCID50/mL),分两次滴鼻攻击(上午和下午各1次),每次攻击时左右鼻孔各2.5mL;支原体组连同攻毒对照牛5头总计10头牛,每头牛气管注射牛支原体CHF01株新鲜菌液5mL(活菌含量为5.0×1010ccu),间隔2日后,以同样方式及剂量第二次攻毒。连续观察14日,并测定试验牛体温、排毒滴度、观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测。BVDV、IBRV、BPIV3及牛支原体攻毒后,对照组牛均应至少3头发病,免疫组牛均应至少保护4头。
表4.BVDV效力检验结果(牛)
注:符合体温升高连续3日、流涕、流泪、鼻拭子PCR阳性中的三项即判为发病。
表5.IBRV效力检验结果(牛)
注:符合体温升高连续3日、流涕、流泪、鼻拭子PCR阳性中的三项即判为发病。
表6.BPIV3效力检验结果(牛)
注:符合体温升高连续3日、流涕、流泪、鼻拭子PCR阳性中的三项即判为发病。
表7.牛支原体效力检验结果(牛)
注:符合体温升高连续3日、咳嗽、流涕、鼻拭子PCR阳性中的三项即判为发病。
试验结果(表4-表7)表明,牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗免疫牛后,二免后21日接种强毒株,对各强毒株的保护率分别为100%、80%、100%、80%,研制的牛四联灭活疫苗安全检验、效力检验合格。说明本研究建立的MDBK全悬浮培养技术制备BVDV、IBRV、BPIV3抗原液、采用Hayflick液体培养基接种牛支原体制备四联灭活疫苗工艺稳定、重复性强,减少了批间差,具有较好的推广应用的价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗,所述四联灭活疫苗的活性成分为灭活的牛病毒性腹泻病毒、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒、灭活的牛副流感病毒3型和灭活的牛支原体。
2.如权利要求1所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒HH03株。
3.如权利要求1或2所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述牛传染性鼻气管炎病毒为牛传染性鼻气管炎病毒TY01株。
4.如权利要求1、2或3所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述牛副流感病毒3型为牛副流感3型病毒LH01株。
5.如权利要求1-4中任一所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述牛支原体为牛支原体CHF01株。
6.如权利要求1-5中任一所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述四联灭活疫苗中,所述灭活的牛病毒性腹泻病毒、所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒、所述灭活的牛副流感病毒3型和所述灭活的牛支原体的配比满足:所述灭活的牛病毒性腹泻病毒以灭活前的牛病毒性腹泻病毒计为108.0TCID50/mL,所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒以灭活前的牛传染性鼻气管炎病毒计为108.0 TCID50/mL,所述灭活的牛副流感病毒3型以灭活前的牛副流感病毒3型计为108.0TCID50/mL,所述灭活的牛支原体以灭活前的牛支原体计为1.0×1010ccu/mL。
7.如权利要求1-6中任一所述的四联灭活疫苗,其特征在于:所述四联灭活疫苗由所述活性成分和佐剂组成。
8.制备权利要求1-7中任一所述的四联灭活疫苗的方法,所述方法包括:
1)用悬浮MDBK细胞分别培养牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型,分别得到牛病毒性腹泻病毒液、牛传染性鼻气管炎病毒液和牛副流感病毒3型液;将所述牛病毒性腹泻病毒液、所述牛传染性鼻气管炎病毒液和所述牛副流感病毒3型液分别进行灭活,分别得到灭活的牛病毒性腹泻病毒抗原液、灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和灭活的牛副流感病毒3型抗原液;
用液体培养基培养牛支原体,得到牛支原体培养液,将所述牛支原体培养液进行灭活,得到灭活的牛支原体抗原液;
2)将所述灭活的牛病毒性腹泻病毒抗原液、所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛副流感病毒3型抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分,得到牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛支原体的四联灭活疫苗。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:所述牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒HH03株,和/或所述牛传染性鼻气管炎病毒为牛传染性鼻气管炎病毒TY01株,和/或所述牛副流感病毒3型为牛副流感3型病毒LH01株,和/或所述牛支原体为牛支原体CHF01株。
10.如权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述灭活使用甲醛进行灭活。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211589445.9A CN115869392A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211589445.9A CN115869392A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115869392A true CN115869392A (zh) | 2023-03-31 |
Family
ID=85767056
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211589445.9A Pending CN115869392A (zh) | 2022-12-12 | 2022-12-12 | 牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115869392A (zh) |
-
2022
- 2022-12-12 CN CN202211589445.9A patent/CN115869392A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103347534B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒1b型疫苗组合物和方法 | |
CN105816868B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 | |
CN104946600B (zh) | 一种h9亚型禽流感病毒株 | |
CN111041002A (zh) | 猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法 | |
CN106729692B (zh) | 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法 | |
CN111035756B (zh) | 猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
CN104258389B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
CN107823639B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
CN108066758B (zh) | 貉犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途 | |
CN111808826B (zh) | 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用 | |
CN106929480B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 | |
CN109055320B (zh) | 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用 | |
CN108300703B (zh) | 鹿源牛病毒性腹泻灭活疫苗及其制备方法 | |
CN113957007B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 | |
CN115869392A (zh) | 牛病毒性腹泻病毒、传染性鼻气管炎病毒、副流感病毒3型和支原体四联灭活疫苗 | |
CN111686246B (zh) | 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 | |
CN111073863B (zh) | 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法 | |
CN112402599B (zh) | 一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 | |
CN112807424A (zh) | 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗及其制备方法 | |
CN107881154B (zh) | 貉细小病毒弱毒疫苗株及其在制备貉细小病毒弱毒疫苗中的用途 | |
CN111956798A (zh) | 用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂及其应用 | |
CN111551747A (zh) | 基于抗体检测用兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法 | |
CN113018426B (zh) | 用于制备副猪嗜血杆菌疫苗的组合菌株、八价灭活疫苗及其应用 | |
CN104415330A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法与应用 | |
KR102615970B1 (ko) | 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |