CN102618505B - 人轮状病毒毒种ztr-68毒株及其分离，培养与鉴定 - Google Patents
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Abstract
一种人轮状病毒（RotavirusA）ZTR-68毒株，于2011年09月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：CGMCCNo.5265。该毒株是一种人源性轮状病毒野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性好；该毒种可应用于开发人用轮状病毒疫苗的生产毒种，适用包括减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗；本发明提供上述毒株的分离、培养及鉴定方法。
Description
技术领域
本发明涉及轮状病毒，尤其是人轮状病毒毒种毒株的分离、鉴定及毒株的免疫学效果评价。
背景技术
人轮状病毒（human rotavirus）是世界范围内引起婴幼儿腹泻最主要的病原体之一。在全球5岁以下的婴幼儿中，每年因轮状病毒感染导致的急性胃肠炎达1700万例，引起约4万名婴幼儿死亡，这些死亡病例中的80%发生在亚洲和非洲的低收入发展中国家。在我国，因腹泻住院的5岁以下的婴幼儿轮状病毒检测阳性率约为50%。轮状病毒感染在婴幼儿主要表现为突然发病、水样便、呕吐、发热和脱水，最终重症婴幼儿因严重脱水、电解质紊乱等导致死亡。目前尚没有治疗轮状病毒感染的特效药，多采用对症治疗，如静脉或口服补液，以纠正脱水和电解质紊乱。
灭活轮状病毒疫苗是一种安全有效地预防儿童因感染轮状病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有灭活轮状病毒疫苗产品上市。目前临床前研究或投放市场的轮状病毒疫苗均为口服减毒活疫苗，减毒活疫苗尽管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引发肠套叠和毒力回复突变及产生新的变异株的风险；以及冷链保存系统要求费用高，因此，研制安全、有效的灭活轮状病毒疫苗不仅在避免减毒活疫苗使用中存在的问题方面具有优势，也为未来研制联合疫苗提供基础。综上所述，研制灭活轮状病毒疫苗具有重要意义及应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人源性轮状病毒野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性好；该毒种可应用于开发人用轮状病毒疫苗的生产毒种，适用包括减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗；并提供上述毒株的分离、鉴定方法以及免疫学效果评价。
本发明公开了一种人轮状病毒毒种毒株ZTR-68于2011年09月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：5265；
本发明所涉及ZTR-68毒株的分离方法：
（1）获取病毒样本
收集医院儿科一腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01 M PBS，pH 7.2溶液中，12000 g离心20分钟取上清液，并使用0.22 μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；
（2）ZTR-68毒株病毒在MA104细胞上的适应
采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P 29 代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8% BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml，按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200 μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用。
在本发明的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用12000×g离心20分钟取上清液，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，并采用不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。
本发明所涉及ZTR-68毒株的培养方法：
（1）ZTR-68毒株病毒在Vero细胞上的适应：
采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P 136代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1 ml，接种量约为104.0～105.5 CCID50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用；
（2）病毒毒株ZTR-68的克隆纯化：
在Vero细胞上已适应传代到第7代次的轮状病毒收获液，稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度，接种于已形成单层的Vero细胞六孔培养板，37℃吸附2小时，加入不含小牛血清的DMEM维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-DMEM，待琼脂固化后，反置培养于37℃，3天后于镜下观察蚀斑形成，用巴氏管吸取出蚀斑，置于1.5 ml离心管，加入0.5 ml DMEM维持液，漩涡振荡至均匀，随即接种于Vero细胞单层，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，收获病毒继续接种于Vero细胞生长传代；
本发明涉及的轮状病毒培养及制备方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于人轮状病毒的改良。
本发明所涉及ZTR-68毒种的鉴定方法：
（1）ZTR-68毒株病毒滴度测定：
取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒FFA滴定，按104.0细胞/100 μl/孔 加入MA104细胞，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度10个孔，37℃吸附2小时后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16小时，采用50% 甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，洗净甲醛，随后加入含1：500稀释由中国医学科学院医学生物学研究所制备的抗轮状病毒豚鼠血清的5%BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的Millipore公司制造的羊抗豚鼠FITC抗体的5% BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果，结果计算按Reed-Muench Method公式计算： 
，Log ID50（FFA）= (log dilution above 50%) + (Proportionate distance × log dilution factor)。
（2）ZTR-68毒株病毒中和鉴别实验：
将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100 μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃ CO2孵箱中和1小时后，按104细胞/100 μl/孔加入经消化悬浮的Vero细胞，37℃ CO2孵箱中培养8～10天，观察结果；
（3）ZTR-68毒株病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建：
病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，并根据A组轮状病毒G1型基因型全基因序列设计合成针对11个RNA片段的11对引物，并分段以RT-PCR方法获得11个cDNA基因片段，克隆入pMD19-T载体中，逐一进行测序；
（4）不同代次ZTR-68毒株病毒基因组稳定性及序列比较：
病毒通过在Vero细胞传代培养，收获P1代次至P10代次的病毒收获液，病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，非变性PAGE凝胶电泳11小时，硝酸银染显色后于凝胶成像仪记录图像，根据轮状病毒基因序列设计合成针对VP4基因和VP7基因的2对引物，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，通过克隆测序后，使用MEGA软件对不同代次的病毒VP4和VP7基因序列进行比较，其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种Vero传代至第2代所获取的基因，共比较1～10代病毒的VP4和VP7基因序列。
本发明涉及的轮状病毒毒种鉴定方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于人轮状病毒的改良。其中病毒滴度的检测方法改良传统TCID50检测方法，采用FITC免疫荧光方法测定病毒感染性滴度CCID50。
附图说明
图1 电子显微镜下的轮状病毒形态。
图2 轮状病毒ZTR-68株在Vero细胞产生病变形态（培养4天）。
图3 轮状病毒ZTR-68株在MA104细胞免疫荧光试验。
图4轮状病毒特异性VP4，VP7基因RT-PCR快速检测。
图5 轮状病毒ZTR-68毒株免疫荧光定位方法测定CCID50荧光结果。
具体实施方式
实施例1、本发明所涉及ZTR-68毒株的分离方法：
（1）获取病毒样本
收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01 M PBS，pH 7.2溶液中，12000 g离心20分钟取上清液，并使用0.22 μm滤器（购自Millipore公司）除菌过滤，-20℃保存备用。
（2）病毒在MA104细胞上的适应
采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P 29代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8% BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml。按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200 μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变。至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用。
该轮状病毒分离方法通过改良传统轮状病毒分离方法，采用12000 g离心20分钟取上清液，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，并采用不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变。改善了轮状病毒初代培养效率。
ZTR-68毒株的培养及疫苗制备方法：
（1）病毒在Vero细胞上的适应
采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P 134代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1 ml，约为104.0～105.5 FFA/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变。收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用
（2）病毒滴度测定
取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒FFA滴定。按104.0细胞/100 μl/孔 加入MA104细胞，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度10个孔，37℃吸附2小时后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16小时，采用50%（v/v）甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，洗净甲醛，随后加入含1：500稀释抗轮状病毒豚鼠血清（中国医学科学院医学生物学研究所制备）的5%BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的羊抗豚鼠FITC抗体(Millipore公司)的5%BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果，结果计算按Reed-Muench Method公式计算：
，Log ID50（FFA）= (log dilution above 50%) + (Proportionate distance × log dilution factor)。
（3）毒的克隆纯化
在Vero细胞上已适应传代到第7代次的轮状病毒ZTR-68株收获液，稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度，接种于已形成单层的Vero细胞（六孔板），37℃吸附2小时，加入不含小牛血清的DMEM维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-DMEM，待琼脂固化后，反置培养于37℃，3天后于镜下观察蚀斑形成。用巴氏管吸取出蚀斑，置于1.5 ml离心管，加入0.5 ml DMEM维持液，漩涡振荡至均匀，随即接种于Vero细胞单层，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒。收获病毒继续接种于Vero细胞生长传代。
（4）病毒纯化
采用超滤—CsCl2密度梯度离心方案进行病毒的纯化。具体方法如下：轮状病毒收获液经过室温- -20反复冻融3次，经过8000 rpm 离心处理30分钟去除病毒液中较大的细胞碎片及其它成分，使病毒液进一步澄清。采用超滤膜堆设备（ultrafiltrate, Millipore公司）超滤浓缩病毒液，获得浓缩的病毒，同时也清除病毒液中小于病毒颗粒的降解片段及其它杂质成分。将初步纯化浓缩的病毒液经CsCl2密度梯度离心方法纯化病毒，作为实验对照，具体方法如下：取经离心初步澄清的轮状病毒液，加入7% PEG6000，在4℃持续搅拌15小时左右，10000rpm离心30min，弃上清，将沉淀用TNMC（50mM TrisCl, 100mM NaCl, 10mM CaCl2，1mM MgCl2，pH值7.4）重悬，再8000rpm离心，收集上清液，获得初步纯化的浓缩病毒液。浓缩病毒液中加入56%的CsCl2，18℃， 200 000×g，离心22小时获得纯化轮状病毒颗粒。
（5）病毒灭活及灭活效果检测
将纯化的轮状病毒液用0.22 μm滤器过滤除菌，盛于50 ml灭菌离心管中，加入终浓度0.00925%甲醛，先于56℃摇床振荡30min，再于37℃摇床振荡72小时进行灭活。其中灭活24小时，将病毒液换至新的灭菌离心管，再继续在37℃振荡至72小时。灭活后病毒液加入亚硫酸氢钠中和残余的甲醛。用培养轮状病毒的Vero细胞对灭活轮状病毒进行3代盲传，观察细胞病变情况，检测灭活效果。
ZTR-68毒种的鉴定方法：
（1）无菌检测及支原体检测实验
取硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面及改良马丁培养基各4管，每管10 ml培养基接种0.5 ml病毒收获物。接种后的硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面各2管置30～35℃培养，余各2管置于20～25℃；改良马丁培养基置20～25℃培养；同时以0.9%无菌氯化钠溶液同法操作作为阴性对照。培养14天后判定结果。取支原体检查用半固体培养基及肉汤培养基各4支，半固体培养基煮沸融化，冷却至56℃.两种培养基每支均加入预先以4：1比例混合的灭能小牛血清和双抗混合液2.5 ml，迅速摇匀，然后每支培养基各加入待检样本0.5 ml作原代培养，于35℃培养观察。至第7天时，两种原代培养基各取出2支转种，每支培养基各转种同种培养基2支，0.5 ml/支，于35℃培养观察至21天；原代继续培养观察至21天。
（2）灭活病毒疫苗致病性观察
取灭活纯化的轮状病毒疫苗样品，按200 E.U./ 100 μl（Rotavirus ELISA Unit剂量，肌内注射6只小鼠（BALB/c品系，体重约16g，年龄约3个月，公母个半）。注射病毒后，观察动物临床体征，于14天时，活体取动物肝、心、脑组织进行病理检查。
（3）中和鉴别实验
将分离毒株病毒抗血清（中国医学科学院医学生物学研究所制备）按梯度稀释后，100 μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃ CO2孵箱中和1小时后，按104细胞/100 μl/孔加入经消化悬浮的Vero细胞，37℃ CO2孵箱中培养8～10天，观察结果。
（4）病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建
病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行。病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行。并根据A组轮状病毒G1型基因型全基因序列设计合成针对11个RNA片段的11对引物，并分段以RT-PCR方法获得11个cDNA基因片段，克隆入pMD19-T载体中，逐一进行测序。
（5）不同代次病毒基因组稳定性及序列比较
病毒通过在Vero细胞传代培养，收获P1代次至P10代次的病毒收获液。病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行。非变性PAGE凝胶电泳11小时，硝酸银染显色后于凝胶成像仪记录图像。根据轮状病毒ZTR-68基因序列设计合成针对VP4基因和VP7基因的2对引物，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行。通过克隆测序后，使用MEGA软件对不同代次的病毒VP4和VP7基因序列进行比较。其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种Vero传代至第2代所获取的基因。共比较1～10代病毒的VP4和VP7基因序列。
ZTR-68毒种的免疫效力评价方法：
（1）灭活轮状病毒疫苗样品免疫原性分析
为了解灭后轮状病毒疫苗样品免疫原性的变化情况，选取第5代病毒收获液，经纯化灭活制备为免疫用疫苗样品后，以40 E.U./ 100 μl、80 E.U./ 100 μl、160 E.U./ 100 μl（Rotavirus ELISA Unit）三个剂量，每个剂量肌内注射6只小鼠（BALB/c品系，体重约16g，年龄约3个月，公母个半），阴性对照6只注射PBS 100 μl。免疫后2、4、6、8周取血分离血清进行血清抗体ELISA效价分析。
（2）灭后轮状病毒疫苗样品免疫效力分析
为了解灭活轮状病毒疫苗样品免疫原性的变化情况，选取第5代病毒收获液，经纯化灭活制备为免疫用疫苗样品后，以40 E.U./ 100 μl、80 E.U./ 100 μl、160 E.U./ 100 μl（Rotavirus ELISA Unit）三个剂量，每个剂量肌内注射6只小鼠（BALB/c品系，体重约16g，年龄约3个月，公母个半），阴性对照6只注射PBS 100 μl。免疫后2、4、6、8周取血分离血清进行中和抗体效价测定。免疫后4、8周取血进行基于流式细胞技术的细胞免疫分析。
（3）免疫血清特异性轮状病毒抗体ELISA效价评价实验
将羊抗轮状病毒免疫多克隆抗体（Millipore公司）用碳酸盐缓冲液(pH值9.6)按1：1000稀释，每孔100 μl在96孔ELISA板4℃包被过夜；之后去除包被液，用含0.5%Tween-20的PBS溶液（PBST溶液）洗板3次，每次3min；用含有3%牛血清白蛋白的PBST溶液，100μl/孔，37℃封闭2小时；去除，PBST洗板，将纯化轮状病毒抗原每孔500 FFA(CCID50)/100 μl加入ELISA板，37℃温育1h；洗板后，2倍梯度稀释待测小鼠免疫血清，100μl/孔加入ELISA板，37℃结合1h； PBST洗板，加入用PBST缓冲液1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠抗体（Millipore公司），100μl/孔，37℃结合1h； PBST洗板，用TMB，100μl/孔，在室温显色15min，再用2M H2SO4终止显色；用酶标仪在450nm检测光密度值。当待测血清的光密度值是阴性血清的2.1倍时，认为该待测血清为阳性，血清抗体的滴度用血清稀释度的倒数表示。
检测体系采用经纯化的灭活轮状病毒免疫豚鼠血清作为阳性参考品，无轮状病毒PBS免疫豚鼠血清作为阴性参考品，PBST缓冲液1：5000稀释的HRP标记的山羊抗豚鼠抗体（Millipore公司）作为酶标二抗标定检测系统的有效性。
（4）免疫血清轮状病毒中和抗体效价评价实验
将免疫血清按2被梯度稀释后，按 100 μl/孔加入96孔平底组织培养板，每孔按 100 CCID50/100μl/孔加入稀释后的收获病毒液，37℃ CO2孵箱中和2小时后，加入已用不含小牛血清的DMEM维持溶液37℃，5% CO2处理1小时的培养成致密单层的96孔平底组织培养板，37℃，5% CO2孵箱培养24小时，吸出溶液，加入不含小牛血清的DMEM维持溶液37℃，5% CO2培养16小时后，用50%（v/v）甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，除净甲醛，随后加入含1：500稀释抗轮状病毒豚鼠血清（中国医学科学院医学生物学研究所制备）的5% BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的羊抗豚鼠FITC标记抗体(Millipore公司)的5%BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果。记录无荧光信号标记细胞的最高血清稀释度，血清中和抗体的滴度用血清稀释度的倒数表示。
VP1
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VP3
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VP4
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VP6
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VP7
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NSP1
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NPSP2
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NSP3
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NSP4
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NSP5/6
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Claims (3)
1.一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于该毒株为轮状病毒（Rotavirus A）ZTR-68毒株，于2011年09月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：CGMCC No. 5265。
2.如权利要求1所述的人轮状病毒毒种毒株的培养方法，其特征在于具体如下：
（1）ZTR-68毒株病毒在Vero细胞上的适应：
采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P 136代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1 ml，接种量为104.0～105.5 CCID50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用，所述原MA104细胞收获的病毒液为ZTR-68毒株病毒在MA104细胞上的适应得到，具体为采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P 29 代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8% BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml，按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将权利要求1所述轮状病毒ZTR-68感染的患儿腹泻样本稀释液200 μL接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物既得；
（2）病毒毒株ZTR-68的克隆纯化：
在Vero细胞上已适应传代到第7代次的轮状病毒收获液，稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度，接种于已形成单层的Vero细胞六孔培养板，37℃吸附2小时，加入不含小牛血清的DMEM维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-DMEM，待琼脂固化后，反置培养于37℃，3天后于镜下观察蚀斑形成，用巴氏管吸取出蚀斑，置于1.5 ml离心管，加入0.5 ml DMEM维持液，漩涡振荡至均匀，随即接种于Vero细胞单层，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，收获病毒继续接种于Vero细胞生长传代。
3.如权利要求1所述的人轮状病毒毒种毒株的鉴定方法，其特征在于具体如下：
（1）ZTR-68毒株病毒滴度测定：
取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒FFA滴定，按104.0细胞/100 μl/孔 加入MA104细胞，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度10个孔，37℃吸附2小时后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16小时，采用50% 甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，洗净甲醛，随后加入含1：500稀释由中国医学科学院医学生物学研究所制备的抗轮状病毒豚鼠血清的pH为7.2的5%BSA-PBS溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的Millipore公司制造的羊抗豚鼠FITC抗体的pH为7.2的5% BSA-PBS溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果，结果计算按Reed-Muench Method公式计算： 
，Log ID50（FFA）= (log dilution above 50%) + (Proportionate distance × log dilution factor)；
（2）ZTR-68毒株病毒中和鉴别实验：
将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100 μL/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃ CO2孵箱中和1小时后，按104细胞/100 μL/孔加入经消化悬浮的Vero细胞，37℃ CO2孵箱中培养8～10天，观察结果；
（3）ZTR-68毒株病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建：
病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，并根据A组轮状病毒G1型基因型全基因序列设计合成针对11个RNA片段的11对引物，并分段以RT-PCR方法获得11个cDNA基因片段，克隆入pMD19-T载体中，逐一进行测序；
（4）不同代次ZTR-68毒株病毒基因组稳定性及序列比较：
病毒通过在Vero细胞传代培养，收获P1代次至P10代次的病毒收获液，病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，非变性PAGE凝胶电泳11小时，硝酸银染显色后于凝胶成像仪记录图像，根据轮状病毒基因序列设计合成针对VP4基因和VP7基因的2对引物，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，通过克隆测序后，使用MEGA软件对不同代次的病毒VP4和VP7基因序列进行比较，其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种Vero传代至第2代所获取的基因，共比较1～10代病毒的VP4和VP7基因序列。
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