CZ258996A3 - Process for preparing a great amount of virus - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby velkého množství virů v kultuře s buněk na mikronosičích (microcarrier cell culture). Jako příklad tohoto způsobu se uvádí promyté buňky MRC-5, kultivované na mikronosičích se skelným povlakem a infikované virem hepatitidy A.

Dosavadní stav techniky

Mnoho virů a terapeuticky významných proteinů se produkuje na buňkách, závislých na ukotvení, kdy pro růst buněk a správnou funkci buněčné linie je primárním požadavkem přichycení k povrchu. Pokud chceme připravit relativné malé množství, pro vytvoření požadované plochy povrchu se tradičně používají vícenásobné T-lahve a valivé (Roller) lahve. Podstatného zvětšení plochy povrchu a tím zvýšené produktivity na jednotku bioreaktoru bylo dosaženo jinými komerčně dostupnými systémy, jako NUNC CELL FACTORIES a COSTAR CUBES, Tyto systémy však pro velká množství vyžadují vícenásobné bioreaktory a tak je možnost jejich zvětšování pro komerční výrobu

2o omezena.

Byly rovněž vyvinuty různé systémy nosičů ve formě kolon (packed bed), včetně reaktorů s dutými vlákny (hollow fibre), kolonami kuliček, náhodně orientovaných vláken a porézních keramických monolitů. Tyto systémy ukázaly nesnáze se zachováním dodávky živin k buňkám v reaktoru kvůli uspořádání reaktoru a omezeným transportním cestám živin během buněčného růstu. Reaktory s dutými

- 2 vlákny se opírají při zajištění průtoku zásobního media buňkami o difúzi a Starlingúv tok (viz J.M. Piret (1939), B.c.D Thesis, Dept. of Chem. Eng., Mass. Inst. Technology, srpen 1989). Pronikání živin difúzí je dostatečné jen tehdy, jestliže hloubky buněk, akumulovaných s na vláknech, je řiditelná a stejná, což pro tyto reaktory neplatí.

Starlingúv tok klesá pří růstu buněk kvůli zvýšenému odporu průtoku při růstu buněk. To snižuje míchání uvnitř kultivačního prostoru. Lože kuliček nebo vláken s náhodným uspořádáním se opírají o nucené proudění, a oba způsoby jsou náchylné k vytváření kanálů cestami io nejmenšího hydraulického odporu, přičemž ponechávají stranou místa s největší hustotou plochy povrchu, a tím nejspíše obsahující buňky.

Porézní keramické monolity jsou v tomto ohledu lepší, ale jsou postihovány dalším faktorem, biologickým ucpáváním. Protože buňky rostou na povrchu, mohou zužovat a omezovat cesty, kterými protéká medium. (J.E. Putnám a další, Ann. Mtg. Soc. Ind. Microbiol., Orlando,

Florida, 1. srpna 1990). V případě keramických monolitů má růst za následek omezení kanálů, takže vzniká zvýšený hydraulický odpor. Medium tedy teče přednostně do jiných souběžných kanálů, takže výsledkem je, že kanály s největším nárůstem dostanou nejméně co media. Kvůli těmto heterogenitám v mikroprostředí buněk a omezené možnosti zvětšování mají tyto reaktory pouze omezený úspěch; není známo, že by se v těchto systémech produkovaly nějaké vakcíny nebo léčiva pro humánní použití, schválená v USA.

Je známo použití částí pevných nepohyblivých mixerů při 25 kultivaci buněk a virů; viz Grabner a Paul, US patent 4,296,204. Použití síta pro kultivaci primárních tkáňových kultur několika buněčných typů je možno nalézt v US patentu 4,963,489 a 5,160,490. Tkáň, kterou poskytne kultura stromálních fibroblastů na sítech, je chráněna patentem 4,963,489. Použití nepohyblivých mísících prvků jako povrchu pro růst buněk umožňuje stejnoměrný transport živin k buněčné populaci. Námitkou proti komerčnímu použití těchto

- 3 bioreaktorových systému zůstávají problémy se zvětšováním měřítka, čištěním a sterilizací. Navíc nemůže být biomasa v těchto systémech přímo při kultivaci sledována. Pro určení výkonnosti tohoto bioreaktoru se musí používat nepřímá měření buněčné hmoty. Ze stejných důvodů může být v takto uspořádaných reaktorech problematické získání produktů buněk.

Technologie mikronosičů poskytuje velké množství povrchové plochy pro růst buněk na malých, sférických nosičích (o průměru 90 až 250 pm), které jsou suspendovány v míchaném vsádkovém io bioreaktoru. Je možno dosáhnout vysokého poměru plochy k objemu, takže je možno dosáhnout vysoce účinného produkčního systému, vztaženo na objem bioreaktoru. Tato technologie poskytuje homogenní prostředí pro kultivaci buněk s možností kvantifikovat buněčnou hmotu a během kultivace získávat buněčný produkt. Protože bioreaktor je míchaný tank, poskytuje fermentační průmysl pro komerční použití zavedené čisticí a sterilizační postupy, stejně jako celkový návrh tanku. Možnosti zvětšování tohoto systému ilustruje komerční výroba vakcíny proti dětské obrně za použití mikronosičů v objemu 1000 1500 I. Prokázanou možnost zvětšování měřítka u této metody dále

2o ukazuje komerční výroba vakcíny proti vzteklině a slintavce a kulhavce s použitím kultury na mikronosičích.

Ačkoliv na mikronosičích bylo prováděno rozmnožování mnoha buněčných linií a virů, zůstává při zavádění této technologie v komerčním měřítku mnoho otázek. Může být nesnadné dosažení prostředí s nízkými střižnými silami během kultivace a udržení životaschopné kultury pro pokračování v tvorbě produktu během prodloužené doby kultivace. Při výrobě požadovaného produktu je často kritická volba vhodného mikronosiče a kultivačních podmínek. Dobrým příkladem takovýchto problémů je pomnožování hepatitidy A.

Junker, B. a další, („Evaluation of a Microcarrier Process for Large Scale Cultivation of Attenuated Hepatitis A,“ Cytotechnology, díl 9, 1- 4 3, 1992) popsali vyhodnocení mikronosičů CYTODEX 3 jako substrátu pro růst buněk MRC-5 a následnou infekci virem hepatitidy A. Hlavní příčina nízkých titrů hepatitidy A z kultur na mikronosičích byla připisována skutečnosti, že během infekční periody buňky z kuliček postupně vypadávaly. Na základě těchto výsledků byla technologie mikronosičů označena jako ne nejoptimálnější pro produkci viru hepatitidy A. Protože v popisu tohoto vynálezu se uvádí jako příklad kultivace viru hepatitidy A, je na místě krátký přehled způsobů, používaných při kultivaci tohoto viru.

ίο V roce 1973 (Feinstone a další, (Science 182, str. 1026)) byl s použitím imuno elektronové mikroskopie identifikován původce infekční hepatitidy, později známý jako virus hepatitidy A (HAV). Kultivaci viru hepatitidy A (HAV) in vitro poprvé hlásil Provost a další, (P.S.E.B.M. 160, str. 213, 1979) postupem, kdy jako inokulum pro jaterní (liver explant) kulturu a ledvinovou (fetal rhesus) buněčnou kulturu (FRhK6) (US patent 4,164,566) byla použita játra z kosmanů, infikovaných HAV. V pozdějším vynálezu byla úspěšně použita přímá inokulace HAV bez předchozí pasáže na nehumánním primátovi pro iniciaci in vitro pomnožení HAV (Provost a další, P.S.E.B.M 167, str.

201, (1981); US patent 5,021,343).

V této práci bylo ukázáno oslabení HAV kultivací in vitro. Navíc bylo ukázáno, že po opakovaném pasážování in vitro se staly kultury HAV produktivnější a rychlost replikace se zvýšila, protože se virus adaptoval na pěstované buňky. Dalším vývojem bylo ukázáno, že účinnost ochrany jak u živého zeslabeného viru (Provost a další, J. Med. Virol. 20, str. 165 (1986)), tak i u formalinem inaktivovaného viru HAV (US patent 4,164,566; US patent 5,021,348; Provost a další, Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 83-86, (1988) - Alan R. Liss, lne.). Z následující práce vyšlo najevo, že možnými kandidáty na vakcíny jsou jak zeslabené, tak i inaktivované imunogenní viry HAV. Jestliže však má být bezpečná vakcína proti HAV komerčně dostupná pro humánní

- 5 účely, je potřeba reprodukovatelného výrobního postupu pro výrobu vysoce čistého antigenu.

Pro kultivaci HAV pro výrobu vakcín byly popsány různé postupy. Provost a další, (US patent 5,021,343) popsal postup, při kterém se ve výhodném provedení infikuje kultura buněk MRC-5 virem HAV. Podle uvedeného popisu se vin/ a buňky pěstují obvyklým způsobem v monovrstvě. V US patentu 4,733,407 se pěstuje HAV na buňkách Věro (druh ledvinových buněk primátů). V US patentu 4,301,209 byla popsána produkce HAV s vysokým titrem na kapilární io jednotce s dutými vlákny. US patent 4,412,002 popisuje způsob, kdy byl HAV izolován z trvale infikovaných buněk. V EP 0 302 692 byla popsána kultura ve valivých lahvích. Ve všech těchto systémech nebyla příprava HAV ve velkém měřítku, potřebném pro komerční postupy, uskutečnitelná, nebo byla silně omezená plochou, dostupnou pro vrstvu buněk, nutnou pro infekci HAV.

V r. 1984 publikoval Widel, a další na téma pomnožování divokého typu hepatitidy A v buněčné kultuře opičí ledviny (fetal rhesus) (FRh-K) na mikronosiči CYTODEX 3 při 37 °C (Widel, A. a další, „A Microcarrier Cell Culture System for Large Scale Production of Hepatitis A Virus“, J. of Virological Methods, díl 8, 63-71, 1984). Nebyla zde zmínka o odírání buněk nebo agregaci mikronosičů při používání mikronosičů CYTODEX 3 jako povrchu pro růst buněk FRhK. Protože Junker a další zjistili, že stejný mikronosičový systém je nevhodný pro produkci oslabeného viru v buňkách MRC-5, jsou tyto

2s kultivační systémy jasně velmi odlišné. Proto nemůže být lidská diploidní buněčná linie MRC-5, která je pro produkci humánních vakcín výhodnější než buněčná linie FRh-K, odvozená od opic, úspěšně kultivována pro získání vakcíny proti viru hepatitidy A postupem podle Widela, neboť buňky MRC-5 mají tendenci ke tvorbě

3o agregátů (shluků) mikronosičů. Protože metodologie, kterou popisuje Widel, je omezena na buňky FRh-K, kterým není agregace a odírání

- 6 buněk vlastní, nebylo možno z této práce získat, jak předcházet problémům, spojených s použitím buněk MRC-5.

Shlukování (agregace) bunék v kultuře buněk na mikronosičích je zcela běžné a v publikacích jsou o ném zmínky od poloviny sedmdesátých let. Málo článků se však zvlášť zabývalo touto tématikou. Několik odpovídajících publikací se uvádí dále.

Varani, a další, (1933) porovnával růst diploidních buněk MRC5 a dvou transformovaných buněčných linií na mikronosičích s povlakem skla a nabitých DEAE-dextranových mikronosičích (Varani, io a další, „Growth of Three Established Cell Lines on Glass Microcarriers, Biotech. and Bioeng., díl 25, 1359-1372, 1983). Agregace mikronosičů se vyskytovala na sklem pokrytých mikronosičích u všech tří buněčných linií, zatímco u dextranových mikronosičů se agregovala pouze jediná kontinuální buněčná linie.

Analýza skanovací elektronovou mikroskopií (SEM) ukázala dramatický rozdíl ve způsobu, jak se buňky přichytávají k těmto dvěma povrchům. U skleněných mikronosičů se buňky přichytávají dlouhými filopodii, zatímco u mikronosičů z DEAE dextranu jsou buňky přichyceny celým svým okrajem. Tento rozdíl ve způsobu přichycení může být důležitým činitelem pro stabilitu systému MRC-5/sklem pokrytý SOLOHILL před systémy MRC-5/dextran.

Goetghbeur a Hu (1991) ukázali, že tvorba buněčných agregátů může být indukována u velkého počtu buněčných linií v přítomnosti malých nabitých mikrokuliček s průměrem přibližně 20 pm (typické mikronosiče mají průměr 90 - 250 pm); Goetghbeur, S. a Hu, W.S., „Cultivation of Anchorage-Dependent Animal Celíš in MicrosphereInduced Aggregate Culture,“ Appl. Microbiol. Biotech., díl 34, 735-741,

1991). Pro dvě buněčné linie, pěstované tímto způsobem, se zjistilo, že se neroztrušují, ale spíše existují ve shluknutých vícevrstevných

3o populacích. Na těchto kuličkách byla rovněž pěstována ve formě

- 7 agregátu diploidní buněčná linie, ale tvar buněk byl nepravidelný; viz US patent 5,114,355. Protože kuličky, které používá Hu, jsou mnohem menší než běžné mikronosiče, tvorba agregátu, popisovaná předmětnou patentovou přihláškou, do této oblasti nespadá. Je nepravděpodobné, že zmenšení velikosti do oblasti, které používá Hu, by bylo použitelné při výrobě viru hepatitidy A.

Borys a Papoutsakis (1992) zkoumali způsoby, jak inhibovat tvorbu agregátů u buněk K1 ovarií čínského křečka, rostoucích na mikronosičích CYTODEX 3 (Borys, M.C. a Papoutsakis, E.T., io „Formation of Bridges and Large Cellular Clumps in CHO-cell Microcarrier Cultures: Effects of Agitation, Dimethyl Sulfoxide, and Calf Sérum,“ Cytotechnology, díl 8, 237-248, 1992). Důraz v této práci byl kladen na přerůstání transformovaných buněčných linií během kultivace na mikronosičích a práce se nezaměřovala na růst diploidních buněk ve formě agregátů na mikronosičích. Bylo zjištěno, že zvýšené míchání snižuje agregaci a zvyšuje počet mrtvých buněk, způsobený rozbíjením buněčných můstků mezi mikronosiči.

Naše zde uváděné studie s buňkami MRC-5 a mikronosiči se skelným povlakem jsou ve shodě s těmito výsledky. Bylo zjištěno, že míchání snižuje agregaci buněk MRC-5 na sklem pokrytých mikronosičích a zvyšuje počet mrtvých buněk. Bylo rovněž zjištěno, že agregace je za podmínek kultivace nezvratným jevem.

Bylo provedeno velké množství práce, aby se podařilo indukovat růst kontinuálních buněčných linií v suspenzní buněčné kultuře ve formě agregátů. Tolbert, a další, (1980) publikoval prvotní zprávu na toto téma a citoval patent na „adaptaci buněčných linií na suspenzní kultivaci“ (Tolbert, W.R., a další, „Cell Aggregate Suspension Culture for Large Scale Production of Biomolecules,“ In Vitro, díl 16(6), 486490, 1980). Protože buňky MRC-5 jsou lidské diploidní buňky, vyžadují

- 3 pro biologickou aktivitu rozprostírání po povrchu a tento přístup na ně nelze aplikovat.

Zatímco tedy existují zprávy o tom, že buňky MRC-5 mohou být pěstovány na skleněných mikronosičích jako agregáty buňka5 mikronosič, a že virus hepatitidy A muže být produkován z kultury na mikronosičích CYTODEX 3, jak se uvádí výše, nestabilita systému buňky MRC-5/mikronosič CYTODEX 3 přivedla odborníky v oboru k názoru, že kulturu na mikronosičích nelze adaptovat na účinnou produkci HAV. Zde se popisuje jedinečně stabilní systém agregátů io mikronosiču, který odstraňuje předchozí problémy s produkcí viru hepatitidy A buňkami MRC-5 na mikronosičích. Vynález rovněž poskytuje metody, vyvinuté pro integraci mikronosičového postupu do existujícího následného postupu čištění HAV.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje způsob vytvoření kultury agregátů mikronosiču, které zadržují buněčné populace v celém průběhu prodloužené infekční fáze, pro výrobu virových vakcín. Bylo ukázáno, že produkce viru hepatitidy A v buňkách MRC-5 je problematická,

2o protože v průběhu infekční periody buňky odpadávají z nosičů. Použití systému mikronosiče, pokrytého sklem, a zde popsané metodologie, tomuto problému předchází použitím stabilního agregátu mikronosiču, schopného zadržet živé buňky pro maximální produkci viru v kultuře mikronosičů. Způsob je použitelný pro produkci jiných virů , kde může být produktivita viru zvýšena vytvořením stabilní kultury v průběhu prodloužené infekční periody. Naše zkušenosti s materiálem CYTODEX 3, což je kolagenem pokrytý mikronosič, souhlasí s dřívějšími zprávami, že v tomto systému byla tvorba agregátů nestálá a buněčná populace byla po vstupu do stacionární fáze nestabilní. V

- 9 ostrém protikladu s předchozími poznatky byl nalezen způsob, založený na sklem pokrytém mikronosiči, který podporuje prodlouženou, stabilní kultivaci bunék. Byl rovněž vyvinut způsob rozbití agregátů mikronosiéú a lyže buněk systémem detergent/pufr.

Jádra zůstávají při tomto způsobu intaktní a mohou být tedy před přivedením do purifikačního postupu odfiltrována. Lyzát je pak možno dále zpracovat zavedenými postupy pro purifikaci virů. Využití tohoto postupu pro vakcíny zahrnuje produkci jakéhokoliv viru, který může být pomnožen v kultuře agregátů mikronosičů a získán z bioreaktoru.

Buňky závislé na ukotvení, které mohou tvořit kultury agregátů, zahrnují buňky MRC-5, Věro a kuřecí embryonální fibroblasty. Viry, které mohou být pomnoženy v těchto hostitelských buňkách, zahrnují, ale nejsou omezeny na viry hepatitidy A, planých neštovic, spalniček, příušnic, zarděnek, dětské obrny, herpetického viru a rotaviru.

Postup poskytuje způsob pro využití výhod vyzkoušeného komerčního zvětšování měřítka mikronosičové technologie pro růst buněk při produkci virálních vakcín, jako je hepatitida A, které vyžadují prodloužené doby kultivace. Úspěšná aplikace technologie mikronosičů pro produkci viru hepatitidy A nebo jiných produktů, kde kultivace pokračují až do stacionární fáze, je zde důsledkem správné volby systému mikronosič/buňka, vytvářejícího agregáty, které poskytují mikroprostředí pro prodlouženou životnost buněk a tvorbu produktů. Vytváření agregátů, jak se zde popisuje, chrání buňky od střižných sil, produkovaných suspendováním mikronosičů. Agregáty mají přibližně 50 až 60 % mrtvého objemu, který umožňuje transport živin skrz agregát konvekcí a snižuje hustotu agregátu pro usnadnění suspendování částic. Tvorba agregátů také poskytuje těsný vzájemný kontakt buněk, který zvyšuje šíření virové infekce od buňky k buňce a poskytuje pro vytvoření produktu kontakt, podobný kontaktu ve tkáni.

3o Vynález se týká způsobu replikace a růstu virů v buněčné kultuře na mikronosičích. Použití tohoto způsobu pro výrobu vakcín

- 10 zahrnuje produkci jakéhokoliv viru, který může být pomnožován v kultuře agregátů mikronosičů a získán z bioreaktoru. Buňky závislé na ukotvení, které mohou vytvářet agregované kultury, zahrnují, ale nejsou omezeny na vin/ hepatitidy A, planých neštovic, spalniček, s příušnic, zarděnek, dětské obrny, herpetického viru a rotaviru. Podle tohoto způsobu buňky rostou do optimální hustoty na sklem pokrytých mikronosičích a jsou infikovány virem. Podle jednoho provedení tohoto způsobu se kultury promývají (perfuse) mediem v průběhu fází buněčného růstu a infekce virem. Na konci infekce se mikronosiče oddělí, Vyprodukovaný virus se získá buď ze supernatantu nebo lyžovaných buněk. V případě virů, které zůstávají v buňce a neuvolňují se do media, nebo virů, které pro uvolnění v dostatečné míře vyžadují další kroky (jako mrznutí/tání nebo střih v kapalině), může být použito způsobu, který se ve vynálezu popisuje pro uvolnění virů z kultury agregátů mikronosičů. Získání produktu muže zahrnovat střih v kapalině (fluid shear) nebo střih v kapalině za spolupůsobení detergentu pro permeabilizaci buněk.

Pro příklad způsobu podle vynálezu se uvádí buňky MRC-5, kultivované na sklem pokrytých mikronosičích a infikované virem hepatitidy A. Důležitým prvkem při produkci viru v promývané kultuře mikronosičů je stabilita buněčné populace v průběhu infekčního procesu. Sledování je zvláště důležité pro pomalu rostoucí viry, jako je virus hepatitidy A (HAV). Při produkci HAV je výhodné používat buněčné kultury MRC-5, ačkoliv může být použito podobných buněk, jako WI38 nebo VĚRO, přijatelných pro výrobu humánních vakcín. V případě kultury HAV a MRC-5 musí zůstat buněčná populace stabilní v průběhu 21 denního postupu infekce. Během této doby se buňky nacházejí ve stacionární fázi.

V průběhu přehledných studií, týkajících se mikronosičů od různých výrobců včetně: Pharmacia (CYTODEX 1, 2 a 3), SOLOHILL Laboratories (Glass and Collagen coated), Mat Tek (Plastek) a

- 11 Mitsubishi Kasei (Diacarrier) bylo zjištěno, že stabilní kulturu v průběhu stacionární fáze poskytují pouze kuličky SOLOHILL Glass Coated Polystyrene. V tomto systému buňky MRC-5 rostou ve shlucích mikronosičú, jejichž velikost při postupující kultivaci narůstá. Při vybírání vhodných systémů mikronosičú pro komerční použití je obvyklé vybrat takové typy, které vykazují pro použitou buněčnou linii výraznou agregaci. Obvyklé způsoby pro snížení nebo odstranění agregace jsou zvýšení míchání, snížení koncentrace vápníku a omezené koncentrace séra. U systému MRC-5 bylo zjištěno, že správnou technikou kultivace tvoří sklem pokrytý mikronosič s buňkami MRC-5 systém agregátů, který je ideálním systémem pro pomnožení virů pro výrobu vakcín. Agregát je tvořen buněčnými můstky cestou kontaktu buňky s buňkou. Jak narůstá počet agregátů, buňky rostou v mrtvých objemech a poskytují tak růstovou morfologii, is podobnou tkáni. Je známo, že mrtvý objem je 50 nebo 60 % objemu agregátu, jak ukazuje obrázek 19, zatímco buněčná hmota zaujímá pouze 1 - 2 % tohoto prostoru. Proto jsou, na rozdíl od systémů bioreaktorů nebo immobilizačních způsobů, které vedou k omezením difúze buněčnou hmotou, buňky rozděleny ve agregátu s dostatečným mrtvým objemem pro transport živin a produktů prouděním skrze kuličky. Agregáty jsou rezistentní vůči větším změnám pH, než jsou u kultivací buněk obvyklé a koncentracím EDTA až do 1 mM, což znamená, že vazby receptorů, které se patrně účastní prvních fází tvorby agregátu, nejsou nutné pro udržení struktury agregátu. Protože úplný rozpad agregátů může být navozen trypsinací, struktura agregátů je pravděpodobně udržována proteiny extracelulární matrix, vylučovanými buňkami. Jiné systémy buňka MRC-5/mikronosič tvoří agregáty, které nejsou tak stabilní, jako zde popisované systémy, tvořené sklem pokrytým mikronosičem. Proto volba sklem pokrytých mikronosičú pro kultivaci buněk vede podle našich výsledků k vytvoření stabilní struktury agregátů pro pomnožení virů pro výrobu vakcín.

- 12 Jestliže byl zvolen pro růst bunék 3klem pokrytý mikronosič pro svou stabilitu během infekční fáze, musí být použito pro vytvoření stejných agregátu náležitých kultivačních podmínek. Obrázky 16-18 ilustrují tvorbu agregátů způsobem, popisovaným v tomto vynálezu.

Stejná a předvídatelná struktura agregátů je důležitá pro uvažované použití takového systému pro komerční výrobu virové vakcíny. Za prvé musí být mikronosiče pokryty stejnoměrné buňkami, neboť tvorba agregátů nastává interakcemi buňka s buňkou a ne buňka s mikronosičem. To bylo zjištěno ze skutečnosti, že kuličky bez io připojených buněk zůstávají v průběhu kultivace beze změny, zatímco k agregaci dochází u mikronosičů s přichycenými buňkami. Za vhodných podmínek pro přichytávání mají všechny mikronosiče přichycené buňky a tak se všechny spojují za tvorby agregátů v kultuře, jak ukazuje obrázek 20. Toho se dosáhne inokulací více než 5 buněk na částici, což je při práci s mikronosiči ověřenou praxí. Při stejnoměrném přichytávání hraje rovněž roli způsob trypsinace, míchání, pH, teplota a koncentrace séra. Růst velikosti agregátu jako funkce růstu buněk v agregátu je rovněž ukázána v obrázku 20. Pro růst agregátů v kultuře je důležité hydrodynamické prostředí, vytvářené použitým mícháním. Otáčky míchadla by se měly udržovat těsně nad kritickými otáčkami pro resuspendování ode dna, které odpovídají rychlosti otáčení, při které žádný mikronosič nezůstane bez pohybu na dně déle než 1 s. Míchadla by měla mít průměr přibližně jako polovina průměru tanku nebo větší, aby se minimalizovala rychlost otáčení a maximalizovalo míchání celého objemu. Menší míchadla vytvářejí ve své blízkosti vysoké střižné síly, které mohou přerušit buněčné můstky, a tím snížit agregaci a životaschopnost buněk. U nezdravých kultur vzrůstá velikost agregátů. To je pravděpodobně způsobeno DNA, uvolněnou během buněčné lyže,

3o která působí jako prostředník pro zvýšenou agregaci. Použitím strategie dodávání živin (doplňování media), která zachovává

- 13 životaschopnost buněk, se minimalizuje další agregace v průběhu stacionární fáze.

Kritická rychlost pro resuspendování agregátů je nižší než u jednotlivých mikronosičú, což by se neočekávalo s ohledem na větší velikost agregátu. Důvodem je snížená hustota agregátu, protože mrtvý objem (naplněný mediem) tvoří 50 - 60 % objemu agregátu, a hydrodynamika suspendování agregátů disipací energie na heterogenním povrchu. Agregáty se však usazují mnohem rychleji než jednotlivé mikronosiče. Tyto vlastnosti jsou výhodné pro zpracování v io průmyslovém měřítku. Bylo tedy zjištěno, že buněčné agregáty poskytují stabilní prostředí pro stacionární fázi buněk a pro infekci a růst viru na rozdíl od dřívějších domněnek, že jsou agregáty nežádoucí.

Skleněné mikronosiče SOLOHILL se skládají z polystyrénové kuličky o stanovené hustotě a velikosti, pokryté tenkou vrstvou skla podle patentovaného výrobního postupu, na který má licenci firma SOLOHILL Labs, lne. (US patenty 4,029,045, 4,448,884 a

44,564,532). Protože hustota skla je 2400 kg/m³, je nutné pokrývat mikronosič s nízkou hustotou a získat tak skleněný povrch s nízkou hustotou (hustota 1020 až 1040 kg/m³). Hustota mikronosičú těsně nad hustotou kapalného media je kritická pro minimalizaci poškození buněk střižnými silami při suspendování mikronosičú v míchaném tanku. Jakékoliv sklem pokryté mikronosiče s popsanými vlastnostmi jsou tedy použitelné v uvedeném způsobu a skleněné mikronosiče

SOLOHILL jsou pouze jedním z komerčně dostupných příkladů. Skleněné mikronosiče SOLOHILL byly použity pro růst většího počtu buněčných linií, závislých na ukotvení, včetně buněčné linie Věro (opičí ledvina), CEF (kuřecí embryonální fibroblasty), BHK (křeččí ledvina), MRC-5 (lidský embryonální plicní diploidní fibroblast), HFF

3o (lidský fibroblast předkožky) a MDBK (buňky Mardin-Darby hovězí ledviny). Adhezí podle zde popsané metody mohou být nyní použity

- 14 všechny tyto typy buněk pro prodlouženou kulturu ve shlucích pro produkci viru, který muže tyto buňky infikovat a růst v nich. Bylo publikováno, že skleněný substrát má za následek jinou morfologii přichycování než nastává u mikronosičů CTTODEX firmy Pharmacia LKB Biotechnology (Varani, J. a další, Substrate-dependent differences in growth and biological properties of fibroblasts and epithelial celíš grown in microcarrier culture, J. Biol. Stand., díl 13, str. 67-76, 1985). Tyto rozdíly v kombinaci s náležitými podmínkami kultivace, které se zde popisují, byly použity pro indukci stabilní tvorby agregátů pro produkci virové vakcíny

V jednom z provedení tohoto vynálezu byla užita varianta viru hepatitidy A (HAV), pasáž 23 (P23) kmene CR326F' pro infekci buněk MRC-5, rostoucích na mikronosičích, pouze pro ilustrační účely, a produkční materiál byl kultivován v pasáži 29 (P29). P28CR326F’ je oslabený kmen HAV. Vynález zahrnuje také jiné kmeny a/nebo sérotypy viru HAV, včetně kmenů HAV, které mohou být oslabeny některou běžnou v oboru známou technikou. Jiné buněčné linie, vhodné pro pomnožení HAV, zahrnují linie Věro, FL, WI-38 a FRhK6. Tyto a jiné systémy pro pomnožování HAV v buněčných kulturách se popisují v: Gerety, R.J. „Active Immunization Against Hepatitis A“, v Gerety, R.J. (vyd.) Hepatitis A Academie Press 1984, str. 263-276; a Ticehurst, J.R., Seminars in Liver Disease 6, 46-55 (1986). Jako hostitel pro HAV může v podstatě sloužit jakákoliv buněčná linie jako jakákoliv buněčná linie lidských dipfoidních fibroblastů, za předpokladu, že je vnímavá pro infekci HAV. Výhodnou buněčnou linií je MRC-5. Odborníkům v oboru je jasné, že předmět předkládaného vynálezu zahrnuje, navíc k pasáži 18. P18 nebo P28 kmene CR326F’ HAV, jakoukoliv jinou variantu nebo kmen HAV, jak oslabený nebo virulentní, stejně jako jiné viry, které je možno pěstovat na na ukotvení závislých buňkách. Oslabené varianty kmenů je možno izolovat mnohonásobným pasážováním v buňkách , zvířatech, nebo jinými

- 15 postupy. Podrobnost o oslabeni viz například Provost, P.J. a další, Proč. Soc. Exp. Biol. Med.170, 8 (1932); Provost, P.J. a další, J. Med. Virol. 20, 165 (1986); US patent 4,164.566 a 5,021,348. Způsob kultivace podle předkládaného vynálezu je možno snadno a rychle přizpůsobit oslabeným nebo virulentním kmenům virů.

Ve výhodném provedení vynálezu se buňky infikují četností infekce (MOI) HAV, dostačující k účinné infekci buněčné kultury. Četnost infekce přibližně 0,05 až 1 je dostatečná. Zásobní inokulum pro očkování virem je možno pohodlné získat použitím HAV z části io supernatantu stacionární kultury, infikované HAV a inkubované přibližně 28 dní. HAV je ponechán replikovat ve stacionární kultuře až k dosažení maxima produkce viru. Pro vytvoření inokula mohou být použity i jiné způsoby, jako kultura na mikronosičích nebo v systému COSTAR CUBE. Mediem pro kultivaci buněk může být jakékoliv medium, které podporuje aktivní růst buněk MRC-5 a replikaci HAV.

Způsobu podle vynálezu je možno snáze porozumět podle následujících kroků nebo fází:

Krok 1:_Příprava mikronosičú

Do vhodného bioreaktoru pro míchanou suspenzní kultivaci savčích buněk se přidají suché kuličky sklem pokrytého mikronosiče. Kuličky se resuspendují ve vodě kvality pro injekce a sterilizují in sítu. Po skončení sterilizace se voda vypustí a do bioreaktoru se přidá vhodné sterilní medium pro kultivaci zvolených buněk pro růst příslušného viru. Pro zajištěni úplné náhrady vody a ekvilibrace kuliček se s výhodou medium vymění až třikrát. Pro kulturu HAV bylo zjištěno, že v tomto stupni je přijatelné použití Williamsova media E (bezsérového). Požaduje se konečné množství přibližně 20 g/l až 75 g/l mikronosiče v mediu, s výhodou 40 g/l až 60 g/l.

- 16 Krok 2:_Inokulace buňkami

Po ekvilibraci mikronosičů a dosažení požadované teploty (30 37 °C) jsou do kultivační nádoby vysety buňky, s výhodou v pozdní logaritmické fázi. Pro účely práce v malém měřítku jsou vhodné malé multilamelární kultivační jednotky NUNC CELL FACTORIES (NCF), ve kterých je možno pěstovat buňky v monovrstvě podle doporučení výrobce. Koncentrace buněk při inokulaci je 5 - 10 buněk na kuličku mikronosiče, což odpovídá pro použité koncentrace mikronosičů io přibližně 100000 (1x10^s) buněk/ml. Pro malou kulturu mikronosičů o přibližně 600 mi je potřeba přibližně 6x10' buněk. Z konfiuentní desetivrstvé jednotky NCF může být s použitím trypsinu získáno přibližně 5x10³ buněk. Tyto poměry mohou být snadno upraveny pro zvětšení měřítka pro větší kulturu mikronosičů použitím dalších jednotek NCF, nebo v případě nutnosti očkovací kultury mikronosičů. Po sklizení buněk trypsinem a neutralizaci mediem s obsahem séra jsou odděleny nízkorychlostní centrifugací a resuspendovány v mediu s obsahem 10 % železem doplněného telecího séra, nebo jsou jednoduše naředěny mediem s obsahem 10 % železem doplněného telecího séra. Použitím jednoho dílu buněčného inokula na 9 dílů bezsérového kultivačního media s mikronosiči je dosaženo konečné koncentrace železem doplněného telecího séra 1 %. Tento poměr lze samozřejmě modifikovat změnou koncentrace séra, přidaného do inokulační suspenze buněk, nebo modifikací poměru objemu inokula a objemu bioreaktoru. Bylo zjištěno, že koncentrace séra 1% při pH 7,6 7,9 poskytuje stejnoměrné přichytávání buněk.

Po inokulaci jsou buňky ponechány přichytit se na mikronosiče po dobu přibližně tří hodin (ačkoliv přesný čas, potřebný pro přichycení není kritický a jsou přijatelné delší i kratší doby) za použití minimální rychlosti míchání, dostatečné pro dosažení kritické rychlosti pro resuspendování, což je rychlost míchání (v otáčkách míchadla za

- 17 minutu), potřebné k dosažení stavu, při kterém žádný mikronosič nestráví na dně míchaného bioreaktoru delší čas než přibližně 1 s. Toho je dosaženo sledováním a vhodnou úpravou rychlosti otáčení míchadla, což je jednoduchý, odborníkům v oboru známý potup.

Krok 3:_Promývaná kultura buněk do pozdní logaritmické fáze

Po dostatečném čase pro přichycení buněk k mikronosičům je medium doplňováno dalším sérem pro růst buněk. Pro buňky MRC-5 pro produkci HAV je výhodný přídavek dostatečně železem io doplněného telecího séra až k dosažení koncentrace séra 10 %. Jak jsou si vědomi odborníci v oboru, koncentrace séra se může pro jiná složení media měnit.

Po přibližně 24 hodinách od přichycení buněk a ekvilibrace s jakoukoliv nastavenou koncentrací séra je uveden do činnosti systém promývání, přičemž medium je odstraňováno a doplňováno rychlostí přibližně 0,7 až 2, s výhodou přibližně 1,3 objemu media v reaktoru za den. Monitorování glukózy, laktátu a amoniaku poskytne způsob pro zajištění, aby nedošlo k vyčerpání živin a změnám pH. Odborníci v oboru jsou dobře obeznámeni s metodami monitorování těchto

2o parametrů a způsoby pro dosažení jejich stability. Jestliže je zjištěno příliš kyselé pH, způsobené tvorbou a akumulací laktátu, tento nežádaný stav je možno řídit přídavkem mírné alkálie nebo zvýšením rychlosti promývání. Do vrchní části bioreaktoru se přivádí sterilní filtrovaný vzduch a v některých případech můře být výhodné použití povrchového míchadla pro zvýšení přechodu plynů rozbitím povrchového napětí na přechodu vzduch / kapalina.

Po zajištění funkce promývání se buňky ponechají růst do pozdní exponenciální (log) nebo časné stacionární fáze. Typicky, pro buňky MRC-5 ve Williamsově mediu E, doplněným 10 % železem

- 13 obohaceným telecím sérem, to vyžaduje dobu přibližné 6 dnů. I když doba pro růst buněk není kritická, je žádoucí poskytnout dostatek času na to, aby bylo dosaženo dobrého růstu buněk a agregace.

Krok 4:_Infekce

Obvykle je zásobní inokulum infekčního viru skladováno ve zmrazeném stavu. Inokulum infekčního viru se používá pro infekci buněk při infekční četnosti (MOI) přibližně 0,05 až 1 a s výhodou přibližně 0,1. Promývání je během této infekční periody zastaveno , io aby se umožnilo přichycení viru na buňky, po dobu přibližně 2 hodiny. Po uplynutí dostatečného času pro účinné přichycení je promývání obnoveno. Je možno každý týden odebírat vzorky a po dostatečné době, v závislosti na viru, se bioreaktor sklidí. Pro popisovaný systém HAV, rostoucího na buňkách MRC-5, je maximální produkce viru dosaženo přibližně 14 až 23 dnů po infekci.

Krok 5: Sklizení (harvest) viru

Jako první krok sklízení viru se zastaví míchání a buňky infikované virem, přichycené k mikronosičům, se ponechají gravitační

2o silou usadit. Ve výrobním měřítku jsou výhodné způsoby promývání agregátů, jako například použiti filtračního zařízeni. Supernatant po kultivaci se odstraní. V případě HAV se nachází hlavní část viru uvnitř buněk a musí se uvolnit lyží. Toho je dosaženo rozbitím buněčných agregátů roztokem pro sklízení (harvest solution). Takový roztok obsahuje složku, která působí permeabilizaci buněk pro HAV. Tyto látky jsou v oboru známy; s výhodou se používá detergent, jako Triton X-100, NP-40, nebo ekvivalent, v co nejnižší účinné koncentraci, aby bylo umožněno jeho pozdější odstranění. Jedním z detergentu, které byly pro tento účel shledány přijatelnými, je Triton X-100, který může

- 19 být použit v koncentraci přibližné 0,1 % ve vhodném pufru, jako je 10 mM Tris-HCI, 0,1 mM MgCI₂.

Účinná metoda pro rozbíjeni agregátu v našem systému spočívá v protlačování mikronosičů uzavřenou smyčkou, do které je vložena řada otvorů (trysek) s klesajícím průměrem. Používají se průměry 1/16“ (1,59 mm), 3/64“ (1,19 mm) a 1/32“ (0,79 mm), a obsah bioreaktoru o*bíhá rychlostí přibližně 500 - 1000 ml/min, dokud se nerozpadnou všechny agregáty (sledováno ve vzorcích mikroskopicky). Po zvětšení měřítka tohoto kroku se dosáhne io střižných sil, nutných pro rozbití agregátů, správnou volbou průměrů otvorů tak, aby bylo dosaženo pro zvýšený průtok stejné lineární rychlosti. Protože lineární rychlost se vypočte jako průtok/plocha otvoru, podmínky pro dosažení rozbití agregátů mohou být dosaženy lineární rychlostí v rozmezí 0.163 m/s až 0,337 m/s, bez ohledu na is měřítko. Nejmenší průměr (1/32“, 0,79 mm) je přibližně pětkrát větší než průměr jednotlivého mikronosiče (přibližně 150 pm). Při větším měřítku se pro zabránění ucpání používá větších otvorů, ale pro vyrovnání se zvýší průtok tak, aby se dosáhlo lineárních rychlostí ve výše uvedeném rozsahu. To je dostatečně malý průměr pro dosažení x) účinného rozbíjení agregátů, ale dostatečně velký, aby se minimalizovalo ucpávání, zvláště po průchodu většími otvory. Může být také použito jiných postupů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na sonikaci. Výsledná řídká suspenze mikronosičů se ponechá usadit a buněčný debris (úlomky buněk) se dekantují a uloží. Do bioreaktoru se přidá další pufr s detergentem a obsah bioreaktoru se opět recykluje vnější smyčkou s otvory pro získání zachyceného viru. Suspenze je znovu ponechána usadit a supernatant se spojí s uloženým supernatantem. V této fázi poskytne dobrý odhad počtu sklizených buněk hemocytometrické spočítání jader. Supernatant je přefiltrován

3o pro odstranění jader, s výhodou přes 5 pm filtr, a filtrát se dále

- 20 zpracuje podle potřeby. Postup, který lze použít pro čištění HAV, se uvádí dále.

Krok 6:_Čištění HAV

Virus HAV, získaný kultivací podle vynálezu, je možno dále čistit podle v oboru známých metod nebo může být, v případě, že je virus oslaben, přímo použit jako vakcína. Může být také v oboru známými způsoby inaktivován, mezi nimi na prvním místě formalinem. Podrobnosti těchto v oboru známých kroků popisují například patenty io US 4,164,566; 5,021,348; EP 0 302 692; a USSN 07/926,873, podaný

10. 8. 1992.

Krok 7:_Vytvoření a inaktivace vakcíny

Pro přípravu čištěných kapsid viru HAV je nebo může být is zapotřebí dalších kroků zpracování, které jsou běžné a dobře známé. Základními kroky, typickými pro přípravu formalinem inaktivované vakcíny, jsou například působení formalinem, sterilní filtrace a adsorpce na nosiče nebo pomocné látky (viz například Provost, P.J. a další, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 213 (1979); Provost, P.J. a další, J. Med. Virol. 19, 23 (1986)). Virus HAV může být inaktivován teplem, změnami pH, působením organických rozpouštědel, jako je formalin nebo paraformaldehyd. Typicky se provádí inaktivace HAV formalinem v poměru 1/4000. Inaktivovaný HAV je pak adsorbován nebo koprecipitován s hydroxidem hlinitým jako pomocnou a nosnou látkou. Účinnost inaktivované vakcíny HAV byla ukázána v: New England J. of Med. 372: 453-457, (1992).

Pro účely porovnání popsaného způsobu se způsobem produkce viru v jednovrstevné kultuře byly buňky MRC-5 naočkovány do dvou velkoobjemových reaktorů COSTAR CUBE a 3 kultur mikronosičú.

- 21 Rychlost promývání mikronosičových kultur byla v rozmezí 0,7 a 1,5 objemu bioreaktoru za den, které zahrnuje 1,3 násobku objemu bioreaktoru za den v případě COSTAR CUBE. Náplň mikronosičů byla zvolena tak, aby byla získána podobná hustota buněk jako při produkci v reaktoru COSTAR CUBE, aby bylo možno tyto dva reaktory přímo srovnávat. Kultury na mikronosičích byly během infekční periody stabilní a měly s ohledem na glukózu a laktát podobné metabolické rychlosti jako reaktor COSTAR CUBE. Lyzát mikronosičů a jeden litr lyzátu z COSTAR CUBE, čištěné s podobnou účinností a io zacházením, usnadňují použití dalšího postupu, upraveného pro čištění HAV. Vztaženo na buňku byla produktivita viru hepatitidy A na mikronosičích přibližně poloviční vzhledem kultuře v COSTAR CUBE, což naznačuje potřebu další optimalizace infekčního procesu na mikronosičích. Produktivita, vztažená na objem, byla oproti kultuře v

COSTAR CUBE rovněž přibližně poloviční; avšak metodou mikronosičů je možnost více než zdvojnásobit hustotu buněk, a tím i produktivitu, vztaženou na objem, zvýšením náplně mikronosičů. Populace buněk MRC-5 se udržovala ve stabilních agregátech mikronosičů bez jakékoliv ztráty buněk v průběhu 21 denního postupu

2o infekce. Všechny ostatní testované typy mikronosičů způsobovaly ztráty buněk MRC-5 z mikronosičů po skončení růstové fáze a byly tak pro produkci viru nevhodné. V mikronosičových kulturách bylo dosaženo konečné hustoty buněk 2,2 až 2,4x10⁶ buněk/ml, která je podobná odhadované hustotě 2,6x10^s buněk/ml v kultuře COSTAR

CUBE.

Rychlost spotřeby glukózy a rychlost produkce laktátu byly v promývané kultuře mikronosičů zcela podobné těm, které se vyskytly v promývaném reaktoru COSTAR CUBES. U obou systémů byla pozorována stechiometrická přeměna glukózy na laktát. Produkce

3o amoniaku, vedlejšího produktu hlavně glutaminového metabolismu, byla v mikronosičovém systému, kde bylo v živném mediu přítomno 2

- 22 mM glutaminu, přibližně poloviční proti systémům COSTAR CUBE, ve kterých byla koncentrace glutaminu v živném mediu 4 mM. 21 dní po infekci vyprodukovala mikronosičová kultura v průměru 112 jednotek na milión buněk a 253 jednotek na litr objemu bioreaktoru. Tyto výtěžky jsou 40-50 %, popř. 33 % výtěžků, dosažených v reaktoru

COSTAR CUBE. Růstová křivka viru ukazuje, že přes 50 % viru bylo vyprodukováno již do 14 dnů a podstatný pokles růstové rychlosti viru mezi 14. a 21. dnem. Není jasné, zda snížený buněčný výtěžek je způsoben tím, že ne všechny buňky jsou infikovány, menší io produktivitou na infikovanou buňku nebo vypadáváním viru do media před sklizní. Agregáty byly stabilní po dvou promytích fyziologickým roztokem a dokonce po přidání 0,1 % Tritonu. Agregáty byly rozbíjeny kontrolovaným střihem kapalinou v řadě otvorů, které byly instalovány ve smyčce u bioreaktoru. Jádra byla uvolněna (a tím snadno kvantifikována) a odstraněna filtraci 5 pm filtrem Durapore, což umožnilo zpracování lyzátu obvyklým purifikačním postupem. SDS PAGE materiálu, extrahovaného rozpouštědlem, ukázala 3 charakteristické pruhy pro hepatitis A a čtvrtý pruh s molekulovou hmotností 66 000, který odpovídá pravděpodobně BSA ze séra, který

2o nebyl úplně odstraněn promýváním fyziologickým roztokem.

Jedním z nejvýznamnějších rysů tohoto vynálezu je to, že bylo ukázáno, že buňky MRC-5 mohou být ve stabilním stavu udržovány na mikronosičích v průběhu třítýdenní infekce hepatitidou A a tak je umožněna produkce a kvantitativní čistění viru hepatitidy A. Stabilita systému se připisuje jedinečným vlastnostem agregátů, vytvořených během růstu buněk MRC-5 na sklem pokrytých polystyrénových nosičích.

Zde uvedená data podávají srovnání promývaného mikronosičového postupu a výrobního postupu v monovrstvě buněk při podobných hustotách buněk a rychlostech promývání. Metabolické indikátory, jako jsou spotřeba glukózy, akumulace laktátu a molární

- 23 poměr těchto rychlostí ukazují podobnost metabolismu buněk MRC-5 mezi těmito dvěma postupy. Purifikace viru hepatitidy A byla v obou postupech přibližně podobná, což ukazuje, že nebude třeba větších změn při dalším zpracování, když se bude virus produkovat v mikronosičové kultuře.

Specifická produkce viru na buňku v mikronosičových kulturách s nízkou rychlostí promývání (0,7 objemu/den) byla pouze o 7 % nižší než v kulturách s vyšší rychlostí promývání (1,5 objemu/den), což ukazuje, že použité rychlosti promývání nebyly pro produkci viru io limitující. Specifická produkce viru na buňku v mikronosičových kulturách byla přibližně polovina rychlosti produkce v kulturách viru pěstovaného v monovrstvě při nejlepších možných odhadech hustoty buněk. Protože data z experimentů s různou rychlostí promývání neukazují na limitaci živinami, je možno udělat závěr, že buď se infekce neúčastní všechny buňky, nebo přešel vyprodukovaný virus do media. V prvním případě se předpokládá vysoká životaschopnost 92 % v průběhu infekční periody 21 dní po infekci, zjištěná na základě měření s trypanovou modří, a to dokonce s výměnou media po dávkách (nejhorší případ) . Je-li dána obvyklá specifická produktivita

2o viru na buňku pro kulturu mikronosičú, je možno zvýšit celkovou produktivitu zvýšením hustoty buněk v bioreaktorů vyšší náplní kuliček. Z toho vyplývá, že systém mikronosičú v agregátech má velkou možnost zvětšování měřítka postupu pro výrobu viru hepatitidy A a jiných virových vakcín.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Hustota buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných míkronosičích SOLOHILL.

- 24 Obr. 2 Profil pH promývané kultur/ mikronosičú pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikrono3ičích SOLOHILL.

Obr. 3 Kumulativní spotřeba glukózy pro promývané kultury na s mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích

SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.

Obr. 4 Kumulativní produkce laktátu pro promývané kultury na io mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích

SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.

Obr. 5 Kumulativní produkce amoniaku pro promývané kultury na 15 mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích

SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.

Obr. 6 Profil spotřeby glukózy pro promývané kultury na 20 mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích

SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.

Obr. 7 Profil spotřeby laktátu pro promývané kultury na 25 mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou buněk pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích

SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.

Obr. 8	Poměr mezi spotřebou glukózy a produkcí laktátu pro promývané kultury na mikronosičích ve srovnání s jednovrstevnou kulturou bunék pro růstovou fázi a sklizeň viru hepatitidy A, rostoucího na buňkách MRC-5 a
5	skleněných mikronosičích SOLOHILL, popř. v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 9	Růstová křivka viru hepatitidy A pro promývanou kulturu mikronosičů na skleněných mikronosičích SOLOHILL.
Obr. 10	SOS PAGE viru hepatitidy A, extrahovaného
10	rozpouštědlem, z promývané mikronosičové kultury
Obr. 11	Profily HPSEC pro filtrované lyzáty při 260 nm pro promývanou mikronosičovou kulturu ve srovnání s buněčnou kulturou v monovrstvě pro virus hepatitidy A, rostoucí na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích
15	SOLOHILL, případně v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 12	Profily HPSEC pro nukleázou štěpené lyzáty při 260 nm pro promývanou mikronosičovou kulturu ve srovnání s buněčnou kulturou v monovrstvě pro virus hepatitidy A, rostoucí na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích
20	SOLOHILL, případně v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 13	Profily HPSEC pro zachycené produkty při 260 nm pro promývanou mikronosičovou kulturu ve srovnání s buněčnou kulturou v monovrstvě pro virus hepatitidy A, rostoucí na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích
25	SOLOHILL, případně v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 14	Profily HPSEC pro produkty vysrážené PEG při 260 nm pro promývanou mikronosičovou kulturu ve srovnání s buněčnou kulturou v monovrstvě pro virus hepatitidy A,

	rostoucí na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích SOLOHILL, případné v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 15	Profily HPSEC pro produkty výměny aniontů při 260 nm
5	pro promývanou mikronosičovou kulturu ve srovnání s buněčnou kulturou v monovrstvé pro virus hepatitidy A, rostoucí na buňkách MRC-5 a skleněných mikronosičích SOLOHILL, případné v reaktoru COSTAR CUBES.
Obr. 16	Agregáty mikronosičú, produkované metodou podle
10	vynálezu, po 5 dnech kultivace za použití buněk MRC-5 a sklem pokrytých mikronosičú SOLOHILL. Agregáty mají podobnou velikost a nejsou přítomny žádné jednotlivé mikronosiče bez buněk.
Obr. 17	Agregáty skleněných mikronosičú MRC-5/SOLOHILL, obarvené fluorescein diacetátem. Zelená fluorescence
15	označuje živé buňky.
Obr. 18	Počáteční shlukování systému skleněných mikronosičú MRC-5/SOLOHILL po 1 dni kultivace. Byl použit fluorescein diacetát, živé buňky fluoreskují zeleně.
Obr. 19	Procenta mrtvého objemu v systému MRC-5/kuličky sklem
20	pokrytého mikronosiče tvoří přibližně 50 % nezávisle na průměru agregátu.
Obr. 20	Tvorba agregátu v průběhu růstu buněk. Velikost agregátu vzrůstá úměrně ke zvyšování počtu buněk na agregát.

Následující příklady jsou uvedeny jako příklady zvláštních provedení vynálezu a neměly by být vykládány jako jediný způsob provedení vynálezu.

- 27 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba inokula viru hepatitidy A

Způsob výroby inokula pro buňky a virus ve velkém měřítku zahrnuje pěstování buněk MRC-5 v monovrstvě v reaktoru NUNC CELL FACTORY (NCF) o ploše 6000 cm². Buňky MRC-5 se ponechají růst v NCF do konfluence. Buňky je možno sklidit a použít k pěstování na mikronosičích. Je také možno infikovat konfluentní buňky v NCF při io četnosti infekce MOI přibližné 0,1. Po infekci jsou buňky inkubovány po dobu 28 dnů, přičemž se každý týden vyměňuje medium s obsahem 10 % obj. fetálního telecího séra. Bylo zjištěno, že vysoké séra 2-10 % obj. dovolují vyšší produkci viru, než nízké koncentrace 0,5 - 2 % obj.. Na konci tohoto cyklu obsahuje supernatant velké množství viru, v tomto příkladu 10^7,3 TCID₅₀ na ml, který se z reaktoru NCF bez lyže buněk přímo sklidí a použije se jako virové inokulum. Tímto způsobem se získá velké množství infekčního viru, nutného pro výrobu, způsobem, který je reprodukovatelnější a pohodlnější než kultivace v otáčivých lahvích nebo kultivačních lahvích, nebo s mechanickou sklizní buněk.

Příklad 2

Produkce viru hepatitidy A v systému agregátů mikronosičů

Tento a následující příklady ukazují kvantitativní produkci viru hepatitidy A v nízkoobjemové kultuře mikronosičů a čistění lyzátu obvyklým způsobem pro HAV. Po příslušných úpravách je možno produkovat jiné viry a typy buněk.

- 23 Kultivace mikronosičů v tanku (krok 1)

Kultivační tank byl navržen tak, aby pracoval jako samostatná jednotka, umístěná na vozíku, kde vzorkování, výměna media a infekce byla prováděna v uzavřeném systému za použití svářečky sterilního potrubí SCO II. Nádoby tanků byly vyrobeny na zakázku firmou Bellco s pracovním objemem 565 ml a pláštěm pro řízení teploty. Míchací systém se skládal z lopatek Bellco, upravených na průměr 6,6 cm. Průměr byl zvolen na základě studia míchání, které zahrnovalo měření kritických rychlostí míchání pro resuspendování io ode dna (COBSR) a výpočet hydrodynamických podmínek, vztažených na tuto rychlost. Na povrchu kultury bylo umístěno 4 cm dlouhé povrchové míchadlo, aby umožnilo zvýšení přenosu kyslíku při vyšší hustotě buněk, a pomáhalo rovněž při odstraňování CO₂. Efluent bez mikronosičů byl odstraňován kovovou trubkou o průměru 1/2“ (12,7 mm), pokrytou sítem 10 pm, umístěnou ve výšce požadovaného objemu bioreaktoru s rychlostí průtoku o 50 % vyšší než činil přítok čerstvého media.

Příprava mikronosičů

Pro tuto studii byly použity sklem pokryté polystyrénové mikronosiče od firmy SOLOHILL Laboratories, lne. Pro minimalizaci spotřeby energie pro suspendování mikronosičů byl použit mikronosič o nejnižší hustotě 1020 kg/m³, dostupný u firmy SOLOHILL. Rozmezí velikostí bylo 150 - 210 pm. Analýza velikosti částic, prováděná firmou SOLOHILL, stanovila plochu povrchu na 514 cm²/g a počet kuliček na

6,6x10^s kuliček na gram. Koncentrace mikronosičů pro experiment činila 35,4 g/l.

Mikronosiče byly umístěny v silikonizovaných tancích s dvojitým pláštěm o objemu 500 ml, suspendovány v injekční vodě a autoklávovány 30 min. při 122 °C. Mikronosiče byly poté třikrát

- 29 promyty modifikovaným Williamsovým mediem E 3e 2 mM glutaminu bez séra.

Příklad 3

Rozrůstání buněk / inokulace tanků (krok 2)

Do 14 reaktorů NCF byly vysety buňky MRC-5. 12 z nich bylo sklizeno a použito pro inokulaci dvou reaktorů COSTAR CUBES. Zbylé dva reaktory NCF byly sklizeny a použity jako inokulum pro tanky s mikronosiči. Buňky byly 10 minut centrifugovány při 300 x g a io resuspendovány v modifikovaném Williamsové mediu E s 2 mM glutaminu (90 %) s telecím sérem doplněným železem (FeCS) (10 %). Při experimentu nebylo použito žádných antibiotik. Buňky se přichytávají v množství přibližně 3 buněk na kuličku v 1 % FeCS, pH 7,7, teplota 37 °C. V průběhu tří hodin se všechny buňky přichytí a koncentrace FeCS je upravena na 10 %, aby mohla začít fáze růstu.

Podle Poissonova rozdělení je nutných pouze 5 buněk na kuličku, bylo zajištěno přichycení alespoň jedné buňky na kuličku při náhodných setkáních mezi buňkami a kuličkami. Zjistilo se, že pokud se použije menšího počtu buněk než při výše uvedené podmínce pro

2o přichycení (5 buněk na kuličku), vyskytují se často některé mikronosiče bez buněk. Tyto mikronosiče zůstanou během kultivace samotné, což je další důkaz toho, že jev agregace nastává kontaktem buňky s buňkou, a ne buňky s mikronosičem. V tomto příkladu bylo použito 8,2 buněk na mikronosič a po třech hodinách bylo pozorováno, že na každém mikronosiči je přichycena alespoň jedna buňka (buňky jsou ještě zakulaceny a proto jsou na opakních mikronosičích viditelné). Rozdíly v minimálním poměru buňky/kuličku mohou být způsobeny tím, že některé buňky jsou při inokulaci ve shlucích, což má za následek pokles v předpovězeném poměru buňky/kuličku.

- 30 Optimalizaci podmínek pro přichycení v tomto systému však dovolí běžné experimenty.

V tomto pokusu byla při inokulaci hustota buněk 1,56x10⁵, což odpovídá 8 600 buňkám na 1 cm² povrchu mikronosiče. Od druhého dne se tvořily malé agregáty po 2 - 5 mikronosičích, které se do 5. dne zvětšily na 10 - 30 mikronosičú. Postupné se některé agregáty 10 - 30 mikronosičú spojily za vytvoření agregátů po přibližně 50 mikronosičích. Je zcela jasné, že v průběhu agregačního procesu dochází k růstu buněk. V kultuře nebyly přítomny žádné volné mikronosiče a byl patrný růst buněk v mrtvém objemu mezi mikronosiči. Růstová křivka na obr. 1 ukazuje, že kultury dosáhly hustoty buněk 2 - 3x10^s / ml pátý den. Počet jader šestý den byl nižší, protože větší agregáty se zachytávaly v zúžení vzorkovací trubice. Protože koncentrace částic klesá v důsledku agregace přibližně 50x, kultura se změní ze spíše opakní s jednotlivými mikronosiči na zcela průsvitnou. Je tedy možné monitorování postupu kultivace on-line turbidimetrickou sondou. V průběhu 28 denní kultivace nebyly pozorovány ve vzorcích efluentu žádné volné buňky, uvolněné z mikronosičú. Počty jader, získané při sklizni na konci kultivace rovněž ukazují, že kultura zůstala v průběhu infekční periody stabilní. Bylo zjištěno, že jakmile se agregáty již jednou vytvoří, jsou velmi stabilní, dokonce při extrémních pH, v přítomnost EDTA nebo při vyšších rychlostech míchání. Protože agregáty se snadno rozpadají v přítomnosti trypsinu, jsou nejpravděpodobněji stabilizovány vytvořením extracelulární matrix, složené z kolagenů, které buňky sekretují.

- 31 Příklad 4

Promývání (krok 3)

Kultury na počátku rostly dva dny vsádkovým způsobem, za použití media v lahvích a séra, ozářeného UV zářením. Druhý den bylo zahájeno promývání mediem ve vacích, získaným od firmy JRH, a to modifikovaným Williamsovým mediem E, kombinovaným s FeCS. Medium bylo obsaženo v 10 a 20 litrových vacích Stedim; jak modifikované Williamsovo medium E, tak i šarže neozářeného FeCS byly používány firmou Merck ve výrobě. Před i po kultivaci byl io porovnáván růst buněk MRC-5 v T-lahvích s použitím sérem doplněného media ve vacích s mediem v lahvích, doplněným ozářeným sérem, jako kontrolou. Koncentrace glukózy, laktátu a amoniaku byly stejné, což ukazuje, že směs FeCS se základním mediem je stabilní po dobu 6 měsíců od jejich smíchání. V průběhu experimentu bylo medium doplněno bikarbonátem na konečnou koncentraci 3,7 g/l pro udržení pH nad hodnotou 7,3.

Konečné rychlosti promývání byly 0,7 objemu za den (tank 1) a

1,5 objemu za den (tanky 2 a 3), vztaženo na objem reaktoru 565 ml. Mikrokazetová čerpadla Watson Marlow Pump. použitá pro dávkování, však neměla přesný průtok, zvláště, když se posunula hadička. Proto byly průtoky periodicky měřeny a pro výpočty byly použity níže uvedené změřené hodnoty. Průměrné rychlosti promývání v průběhu infekce byly pro uvedené tanky 0,76, 1,51 a 1,51. Pro lepší funkci systému byly použity rotametry a širší trubice (nižší otáčky). Byla provedena korekce průtoků, když bylo promývání přerušeno kvůli pozdní výměně vaku ) viz tabulka I:

- 32 Tabulka I

Změřené rychlosti promývání: objem bioreaktoru / den
Stáří kultury dny	Tank 1 objem/den	Tank 2 objem/den	Tank 3 objem/den
2	0,5	1,2	1,2
3	0,5	0,6	0,6
4	0,5	1,2	1,2
5	0,5	1,2	1,2
6	0,5	1,2	1,2
7	0,64	1,34	1,84
8	0,7	2,1	2,1
9	0,7	2,1	2,1
10	0,7	1,67	1,67
11	0,7	1,6	1,6
12	0,7	1,27	1,27
13	0,7	1,3	1,3
14	0,7	1,3	1,3
15	0,8	1,4	1,4
16	0,8	1,4	1,4
17	0,8	1,4	1,4
18	0,8	1,4	1,4
19	0,8	1,4	1,4
20	0,8	1,4	1,4
21	0,8	1,4	1,4
22	0,8	1,4	1,4
23	0,8	1,4	1,4
24	0,8	1,4	1,4
25	0,9	1,86	1,86
26	0,8	1,4	1,4
27	0,8	1,4	1,4
28	0,8	1,4	1,4
Rychlost promývání: 1,5 objemu/den = 565 ml/24 h = 23,5 ml/h

- 33 Optimální pH pro buňky MRC-5, známé z literatury, je 7,7 a při pH 7,2 bylo pozorováno úplné zastavení růstu (Forester, S. a další, Biotechnol. Bioeng. 39:305-313, 1992). U reaktorů COSTAR CUBES se udržuje v průběhu kultivace pH na hodnotě 7,3. Protože v tancích není pH řízeno, bylo udržování pH na promývání, které odstraňovalo kyselinu mléčnou, a povrchovém míchadle, které zvyšovalo uvolňování CO₂ z kapalné fáze. Profil pH, který ukazuje obrázek 2, ilustruje pokles pH v průběhu prvních 150 hodin. V tomto čase byl do io dalšího media přidán pro zvýšení pufrační kapacity bikarbonát sodný, aby se zvýšila koncentrace z 2,2 g/l na 3,7 g/l. ,

Jedním z cílů tohoto experimentu bylo vytvořit kulturu mikronosičú s podobnou hustotou, jaká se odhaduje pro růst v systému buněk v monovrstvě pro průmyslové měřítko. Jeden z těchto systémů používá bioreaktory COSTAR CUBE. V následujícím srovnáváme metabolické profily glukózy, laktátu a amoniaku pro reaktor COSTAR CUBE ve srovnání s postupem na mikronosičích podle vynálezu. Hustota buněk v neinfikovaném reaktoru COSTAR CUBE byla 1,6x10^s buněk/ml v den infekce a 3,0x10° po 28 dnech.

Protože spotřeba glukózy stále po infekci vzrůstá, je pravděpodobné, že velká část přírůstku hustoty buněk (1 zdvojení) se vyskytuje právě v této fázi a potom je hustota buněk v reaktoru COSTAR CUBE po zbytek infekční části kultivace zachována. Hustota buněk v infikovaném reaktoru COSTAR CUBE se očekává mezi těmito dvěma hodnotami a nejpravděpodobněji je vyšší než 2x10° buněk/ml. Z těchto odhadů vyplývá závěr, že kultury na mikronosičích a v bioreaktoru COSTAR CUBE se pohybují ve stejném rozsahu hustot. Rychlosti promývání pro kultury mikronosičú se pohybují od 0,7 do 1,5 objemu bioreaktoru za den, což zahrnuje rychlost 1,3 objemu za den, která se používá v postupu, založeném na reaktoru COSTAR CUBE. Při podobných hustotách buněk a rychlostech promývání je možno

- 34 očekávat, že metabolické profily budou mezi těmito dvěma postupy podobné, jestliže bude rovněž podobný buněčný metabolismus.

Na obrázcích 3, 4 a 5 je pro oba systémy ukázána kumulativní spotřeba glukózy, vyprodukovaného laktátu a vyprodukovaného amoniaku v průběhu infekce. Kumulativní množství bylo vypočteno hmotnostní bilancí při zadané rychlosti promývání a profilu koncentrace v čase. V obrázku 3 je udána kumulativní spotřeba glukózy pro 3 kultury mikronosičú, jeden vybraný reaktor COSTAR CUBE a průměrná kumulativní spotřeba glukózy pro 18 produkčních io šarží COSTAR CUBE. Graf ukazuje, že hodnoty produkce v reaktoru COSTAR CUBE jsou podle očekávání z důvodů podobného metabolismu mezi hodnotami pro mikronosiče při nižších a vyšších rychlostech promývání. Obrázek ukazuje rovněž podobnost mezi jedním z reaktorů COSTAR CUBE a průměrnými hodnotami z reaktoru

COSTAR CUBE s výjimkou posunu ve 450. hodině, způsobeného pravděpodobně přerušením činnosti promývání. Kumulativní profil laktátu opět ukazuje podobný trend, kdy akumulace laktátu v reaktoru COSTAR CUBE leží mezi křivkami akumulace pro postup na míkronosičích při vyšší a nižší rychlosti promývání. Specifická rychlost spotřeby glukózy (mmol spotřebované glukózy na litr a hodinu), odpovídající směrnici křivky závislosti kumulativní spotřeby glukózy na čase stoupá v průběhu prvních 400 hodin se stoupající rychlostí promývání. To může naznačovat, že koncentrace glukózy ovlivňuje rychlost, jakou je metabolizována. Z obrázků 6 a 7 je zřejmý rozdíl mezi koncentracemi glukózy a laktátu v bioreaktorů s mikronosiči při rychlostech promývání 0,7 objemu za den a 1,5 objemu za den. Dalším důvodem může být malý rozdíl v hustotách buněk v bioreaktorech. Poměr rychlostí spotřeby glukózy a laktátu, který znázorňuje obr. 8, ukazuje, že pro oba postupy probíhá přeměna

3o glukózy na laktát cestou glykolýzy.

- 35 Kumulativní produkce amoniaku na obr. 5 ukazuje významný rozdíl v metabolismu glutaminu při použití nižší koncentrace glutaminu. V jednom experimentu v reaktoru CQSTAR CUBE byla omylem přidána do media dvojnásobná koncentrace glutaminu. Z těchto dat vyplývá, že v koncentraci 2 mmol/l je pro kultury limitující živinou. Glutamin typicky vstupuje do cyklu trikarboxlyových kyselin (TCA) přes α-ketoglutarát se ztrátou jedné aminoskupiny (a transaminací druhé aminoskupiny). Za předpokladu, že všechen glutamin, dodaný do bioreaktoru, se přeměňuje na amoniak v poměru io 1:1, rychlost akumulace amoniaku by byla 0,071 mmol/l/h pro 1,5 objemu/den a 0,033 mmol/l/h pro 0,7 objemu za den. Hodnoty se těsně blíží hodnotám, které byly naměřeny u těchto kultur. Je rovněž zřetelně vidět, že při stejné koncentraci živiny, ale větší rychlosti promývání, vzrůstá rychlost spotřeby, založená na produkci amoniaku.

Tento jev byl rovněž pozorován v případě metabolismu glukózy a ukazuje rychlost spotřeby závislou na koncentraci, což bylo publikováno pro všechny buněčné linie.

Příklad 5

2o Infekce (krok 4)

V sedmém dni byly kultury infikovány zásobním inokulem HAV, připraveným například, jak je popsáno v příkladu 1, na konečnou MOI 0,1 (tj. 1 virion na 10 buněk v bioreaktoru, kvantifikovaných počtem jader). Později bylo zjištěno, že titr zásobního inokula byl 10^7,19 místo

10'Λ takže aktuální MOI byla 0,062. Přibližně 5 hodin před infekcí byla snížena teplota na 32 °C. Promývání bylo obnoveno po 2 hodinách od infekce.

pH kultury bylo měřeno analyzátorem krevních plynů ComingCiba. Bylo dbáno na to, aby se pH nezměnilo uvolněním CO₂ v

- 36 průběhu vzorkování. Glukóza, kyselina mléčná a amoniak byly analyzovány přístrojem Biolyzer firmy Kodak. Vzorky byly v případě potřeby ředěny vodou pro injekce; v případě amoniaku byla koncentrace opravena o koncentraci ve vodě. Hustota buněk byla stanovena metodou podle: Sanford a další, (J. Nat. Cancer lnst.,11: 773-795, 1951), kdy se jádra uvolňují a barví krystalovou violetí (0,1 % hmot./obj.) a 0,1 M kyselinou citrónovou. Vzorkování kultury pro počítání buněk bylo ukončeno po 6 dnech, protože agregáty se zachytávaly v zúžení vzorkovacího potrubí. Vzorkování efluentu media io bylo prováděno denně.

Růstová křivka pro dny 9 až 21 po infekci je zobrazena na obrázku 9. Jednotky Havag (antigen HAV stanovením ELISA) na ml bioreaktoru byly získány korekcí titru na zředění vzorku během postupu sklízení. Růstová rychlost viru ve třetím týdnu infekce se zdá být podstatně nižší. Další možností je, že maximum nastalo dříve než

21. den a poté se začal virus uvolňovat do media. Z pokusů ze systému NCF je známo, že virus lze z buněk sklízet 21 dnů po infekci a z media 28 dnů po infekci. Druhého způsobu se užívá pro vytvoření zásobního inokula v reaktorech NCF (viz příklad 1).

Srovnáni produkce viru mezi postupem COSTAR CUBE a systémem mikronosičů je uvedeno v tabulce Ila a lib:

- 37 Tabulka Ha

Výtěžek jednotky Havag na litr bioreaktoru 21 dnů po infekci
	Promývaný produkční bioreaktor CUBE	Promývané kultury mikronosičů
	1,3 obj./den	Tankl: 0,7 obj. /den	Tank2: 1,5 obj. /den	Tank3: 1,5 obj. /den
Jednotky Havag celkem	1,97x107	1,34x105	1,51 x105	1,52x105
Objem bioreaktoru	28 I	565 ml	565 ml	565 ml
Jednotky Havag / ml bioreaktoru	695	237	268	269

- 33 Tabulka lib

Výtěžek jednotky Havag na buňku 21 dnů po infekci

	Promývaný produkční bioreaktor CUBE	Promývané kultury mikronosičú
	1,3 obj./den	Tankl: 0,7 obj. /den	Tank2: 1,5 obj. /den	Tank3: 1,5 obj. /den
Jednotky Havag / ml bioreaktoru	695	237	268	269
Buňky / ml bioreaktoru	Odhad* 2,4-3,0x106	2,21x106	2,34x10s	2,36x10s
Jednotky Havag / 106 buněk	229 - 286	107	115	114

* Odhad počtu buněk, založený na měření hustoty neinfikovaných buněk 2,5x10⁵ buněk/cm² po 21 dnech v reaktoru COSTAR CUBE, odpovídající 3x10⁶ buněk/ml; nižší odhad je 2,0x10⁵ buněk/ml.

Jsou provedena dvě srovnání: objemový výtěžek (jednotky Havag na litr bioreaktoru), a specifický výtěžek na buňku (jednotky Havag na buňku). Objemový výtěžek na litr bioreaktoru poskytuje přímý výpočet výtěžku z reaktoru. Protože hustoty buněk mezi různými io reaktory s mikronosiči jsou podobné a podobají se odhadované hustotě buněk v bioreaktoru COSTAR CUBE, pomocí tohoto výtěžku je možno provést přímé srovnání produktivity. Výtěžek reaktoru COSTAR CUBE je průměrný celkový počet Havag jednotek ze sklizní z několika kultivací, dělený 28 litry objemu bioreaktoru. Produktivity tří tanků s mikronosiči byly podobné i u kultury s nižší rychlostí promývání (tank

1), který vykazoval pouze 12 % pokles výtěžku. Výtěžek z reaktorů s

- 39 mikronosiči byl 38 % výtěžku reaktoru COSTAR CUBE. Podobných produktivit je možno dosáhnout zvýšením náplně kuliček a tím dosáhnout zvýšení hustoty buněk v kultuře až na dvojnásobek používané hustoty buněk.

Údaje o jednotkách Havag na buňku v reaktoru COSTAR CUBE byly založeny na odhadu hustoty buněk v reaktoru COSTAR CUBE, jak bylo diskutováno dříve. Hustoty buněk pro tanky jsou získány přímým počítáním jader, uvolněných během sklizně v každém bioreaktoru ve 21. dnu. Protože v reaktoru s nižším průtokem bylo io zjištěno o něco méně buněk, výtěžek na buňku je jen o 7 % nižší než v ostatních tancích (ve srovnání s 12 % vztaženo na objem). To ukazuje, že nižší rychlost promývání pouze málo omezuje produkci viru. Výtěžek v mikronosičové kultuře na buňku je 40 - 50 % výtěžku na buňku v reaktoru COSTAR CUBE, což je ve hrubé shodě s objemovými výtěžky, protože hustoty buněk jsou u bioreaktorů přibližně podobné.

Příklad 6

Sklizeň (krok 5)

V následujících analýzách bylo používáno dvou způsobů: malá sklizeň 5 ml v 9. a 14. dnu po infekci a sklizeň celého bioreaktoru 21 dnů po infekci.

Pro vzorky v malém měřítku byl dvakrát promyt alikvot agregovaných mikronosičů v PBS a resuspendován v lyzačním roztoku s 0,1 % Tritonu. Agregáty byly rozbity střihem v kapalině pipetmanem a byl odebrán vzorek pro počítání jader. Jádra byla obarvena zředěním 200 μΙ vzorku v poměru 1:1 roztokem 0,1 % krystalová violeť / 0,1 M kyselina citrónová. Lyzát byl potom centrifugován při 300 x g, aby byla odstraněna jádra a rozplněn do alikvotú pro stanovení EIA.

- 40 Při sklizni bioreaktoru bylo medium odstraněno odsátím a agregáty byly dvakrát promyty 3tejným objemem jako bioreaktor PBS. Potom byl k agregátům přidán jeden objem bioreaktoru lyzačního pufru s 0,1 % Tritonu a suspenze byla recyklována řadou otvorů o průměrech 1/16“ (1,59 mm), 1/32“ (0,79 mm), a 1/64“ (0,40 mm) při průtoku přibližně 700 ml/min. Po 15 - 30 minutách recirkulace byly mikronosiče (a malé agregáty s 1 - 3 mikronosiči) ponechány usadit a lyzát bez mikronosičú byl odstraněn. K mikronosičům byl přidán další objem bioreaktoru 0,1 % Tritonu, recyklován 15 - 30 minut a spojen s io prvním lyzátem. Ze spojených lyzátů byly odebrány vzorky pro počítání jader (viz výše uvedený postup), EIA a HPSEC. Mikronosiče byly pod mikroskopem testovány na nepřítomnost buněčné hmoty.

Agregáty byly v průběhu dvou promývání PBS při míchání trojnásobnou rychlostí, než při kultivaci (75 proti 25 ot/min), zcela i5 stabilní. Ze sklizní vzorků se zjistilo, že agregáty bude dokonce nesnadné rozbít v přítomnosti lyzačního pufru s Tritonem. Proto bylo použito řady otvorů, které měly simulovat střižné účinky v kapalině, vytvářené v malém měřítku pipetmanem. Doba recirkulace 15 minut na promytí při průtoku přibližné 700 ml/min se zdála pro rozbití

2o dostatečná; mikroskopické pozorování lyzátu ukázalo jednotlivé mikronosiče a jádra. Zde uvedená doba recirkulace pravděpodobně není optimální, ale její optimalizace je možno snadno dosáhnout rutinními experimenty, založenými na předmětném vynálezu. Výhodu postupu je to, že slouží k uvolnění jader pro kvantifikaci hustoty buněk v době sklizně. Hlavním rozdílem mezi lyzáty z monovrstvy a lyzáty mikronosičú je to, že u lyzátů mikronosičú je potřeba před filtrací úlomků buněk přes 0,2 pm filtry odfiltrovat mikronosiče a jádra.

- 41 Příklad 7

Čištění (krok 6)

Pro přípravu purifikovaného viru HAV je možno použít jakoukoliv z velkého počtu známých postupů pro čištění (purifikaci) HAV. Dále se popisuje postup, který reprodukovatelně poskytuje virus HAV nejvyšší kvality.

1. Filtrace lyzátu / BENSONÁZA

800 ml lyzátu bylo nejprve zfiltrováno přes 5 pm filtr Durapore, io aby byly odstraněny mikronosiče a jádra. Potom byl pro odstranění úlomků buněk použit filtr 0,2 pm. Lyzát z reaktoru COSTAR CUBE byl filtrován pouze přes filtr 0,2 pm, jinak bylo další zpracování shodné s lyzáty kultury mikronosičů. Pufr s 0,1 % Tritonu byl doplněn 2M MgCI₂ na konečnou koncentraci 2 mM. Do každého lyzátu bylo přidáno 58 pl/l BENSONÁZY komerčně dostupné nukleázy, vyráběné rekombinantní technikou firmou Nycomed Pharma A/S (Dánsko), a inkubováno při pokojové teplotě a míchání přes noc.

2. Zachycení na koloně

Přibližně 800 ml lyzátu po působení BENSONÁZY bylo přefiltrováno přes 0,2 pm filtr a gravitačně naneseno (výškový rozdíl 2 m) na záchytnou kolonu o průměru 2,6 cm, obsahující 54 ml pryskyřice Toyopearl 650 M. Kolona byla promyta 0,03 M NaCI 20 násobným objemem kolony a produkt byl gravitačně eluován při průtoku přibližně

6 ml/min skokovou změnou koncentrace NaCI na 0,35 M.

- 42 3. Srážení PEG a extrakce rozpouštědlem

Po skladování přes noc při 4 ’C byl eluát (přibližně 30 ml) inkubován s 4,5 % PEG a 0,42 M roztokem soli při 4 - 8 °C pro vysrážení viru hepatitidy A a centrifugován při 1000 x g. Sediment byl resuspendován ve fosfátovém solném pufru s EDTA (PNE) v kombinaci se 2 díly směsi chloroform/isoamylalkohol 24 : 1, ručně protřepáván 3 minuty a centrifugován při 3000 x g. Vodná fáze (přibližně 7 ml) byla odstraněna a solvent reextrahován 3,45 ml pufru PNE. Jednotlivé části byly spojeny jako produkt po extrakci solventem.

4, Analýza EIA, HPSEC a SDS PAGE

Analýzy EIA a HPSEC (HPLC systém Rainin, kolona TSK-GEL G4000 pw size exclusion column) byly prováděny na vzorcích z každého kroku purifikačního postupu. Filtrovaný lyzát a nukleázou štěpený lyzát byly analyzovány při 260 nm, ostatní při 214 nm. Analýza SDS PAGE byla prováděna na 12 % gelu.

- 43 Tabulka 3

EIA stanovení výtěžků purifikace v jednotlivých krocích
Krok	Postup pro sklizeň celého reaktoru	Lyzát CUBE #3	Lyzáty mikronosičů
tank 1	tank 2	tank 3
Filtrovaný lyzát	88	99	34	73	80
Štěpení nukleázou	100	39	100	33	91
Záchyt na koloně	62	60	55	73	72
PEG	108	82	88	34	88
Extrakce rozpoušť.	54	46*	64	72	77
Celkem při extrakci	32	20	26	30	35

* Data pro tento výtěžek byly získána ze vzorků po 1 měsíci.

- 44 Tabulka 4

Relativní obsah (% plochy) viru hepatitidy A při chromatografii HPSEC

Vzorek pro analýzu	Precipitát PEG 214 nm % plochy	Produkt AOX 214 nm % plochy	Produkt AQX, korig. na BSA 214nm, %plochy
Lyzát CUBE #8	35	90	98
Mikronosiče 1	33	55	93
Mikronosiče 2	41	71	98
Mikronosiče 3	44	73	97
Průměrná produkce, šarže 18-26	27,9 % SD 3,5 %	63,3 % SD 6,9 %	-

Cílem sledování čištění bylo určení rozdílu při následné purifikaci mezi lyzátem z mikronosičů a lyzátem z monovrstvy. Litr lyzátu z reaktoru COSTAR CUBE a přibližně 800 ml lyzátu z mikronosičů bylo čištěno za účelem porovnání stejným způsobem. Purifikace byla provedena extrakcí solventem, protože podstatná část čištění se dosáhne v tomto kroku a mělo by tedy být možno dobře porovnat účinnost čištění. V tomto měřítku bylo rovněž omezené io množství materiálu pro další zpracování. Jak ukazuje tabulka 3, výtěžky EIA z postupu v malém měřítku byly v rozumné shodě s postupem při celkové sklizni. Navíc byly výtěžky lyzátu z mikronosičů ve výborné shodě kontrolním lyzátem při produkci. Analýze na SDS PAGE s barvením stříbrem produktu, extrahovaného solventem, která je na obrázku 10, jasně ukazuje 3 pruhy viru hepatitidy A pro lyzát z COSTAR CUBE v malém měřítku a pro tři kultury mikronosičů. Další pruh se objevuje v drahách pro mikronosiče při molekulové hmotnosti

- 45 přibližně 66 000. To odpovídá BSA (bovinní sérový albumin, molekulová hmotnost 66 200) a pochází pravděpodobně z nedostatečného promytí PBS při sklizni, které má zajistit odstraněné sérových proteinů před přídavkem lyzačního pufru s Tritonem. Lyzát z s COSTAR CUBE má metodou EIA přibližně dvojnásobek normálního množství viru hepatitidy A, než se normálně vyskytuje při produkci, nejpravděpodobněji nedostatečným mícháním před vzorkováním.

Vyšší obsah HAV v lyzátu COSTAR CUBE byl postupem potlačen, takže rozdíl v hustotě pruhu je částečně způsoben tímto vyšším io obsahem a částečně přibližně 50 % výtěžkem z kultur mikronosičů .

Profily chromatografie HPSEC pro filtrovaný lyzát, nukleázou štěpený lyzát, zachycený produkt, sraženinu PEG a extrakci rozpouštědlem ukazují obrázky 11 - 15. Je jasně vidět, že profily jsou mezi kulturami mikronosičů a COSTAR CUBE velmi podobné, což dokazuje pro všechny případy podobnou účinnost čištění. V profilu extraktu solventem je peak navíc mezi peaky solventu a HAV patrně pruh BSA, odpovídající pruhu na SDS PAGE. Relativní % plochy HAV pro precipitát PEG a rozpouštědlem extrahovaný produkt (AQX) jsou ukázána v tabulce 4. Procento je vypočteno stejně jako při produkci,

2o tedy bere v úvahu všechny peaky před peakem solventu. Srovnání lyzátu COSTAR CUBE #8 s lyzáty mikronosičů ukazuje relativní shodu pro produkt PAG a nižší plochu v % pro solventem extrahovaný produkt. Peak navíc v kulturách mikronosičů je patrně BSA. Proto byly plochy viru hepatitidy A pro srovnávací účely korigovány odečtením ploch BSA. Relativní plochy pro lyzáty mikronosičů a COSTAR CUBE #8 jsou ve výborné shodě, a v tomto stupni ukazují překvapivě čistý produkt. Porovnání relativních ploch pro lyzát COSTAR CUBE #8 průměru z produkčního stupně COSTAR CUBE ukazuje pro krok PEG mírně nižší výtěžek v případě produkčního stupně a mnohem větší pokles v kroku extrakce solventem. To naznačuje rozdíl mezi zpracováním v plném měřítku (produkční stupeň) a v malém měřítku.

- 46 Příklad 8

Pomnožení viru planých neštovic v systému agregovaných mikronosičů

Následující text popisuje infekci bunék MRC-5, rostoucích v kultuře agregátů, kmenem Oka viru planých neštovic. Sklem pokryté mikronosiče Solohill byly připraveny v koncentracích 40 g/l, 60 g/l a 90 g/l v tancích, jek se popisuje v příkladu 2, a zaočkovány buňkami MRC-5, namožených v reaktorech NCF podobným způsobem, jak je io popsáno v příkladu 3. Buňky byly promývány s konečnou rychlostí 1,

1,5 a 2 objemu reaktoru za den, vyšší průtoky odpovídající vyšší náplni kuliček. Promývání bylo podobné příkladu 4. Buňky rostly po dobu 4 až 5 dnů, a potom byly infikovány pracovním inokulem při infekčním poměru přibližně 1 buňka pracovního inokula na 15 cílových buněk v kultuře mikronosičů. Hustota buněk v době infekce byla 2 4x10⁶ buněk/ml. Pracovní inokulum bylo připraveno infekcí deseti vrstev reaktoru NUNC CELL FACTORY zásobním inokulem při MOI 1:125 a sklizeno trypsinem po 48 hodinách infekce. Vzorky infikované kultury mikronosičů byly sklízeny po 6 hodinách počínaje 30. hodinou

2o dekantací media, čtyřnásobným promytím roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem a resuspendováním ve stabilizačním roztoku. Agregáty byly rozbity střihem v kapalině s použitím jehly stříkačky. Přibližně 48 hodin po infekci byl sklizen celý objem každého ze tří reaktorů za použití metody střihu v kapalině, jak popisuje příklad 6.

Agregáty byly odolnější proti rozbití bez přítomnosti detergentu, jak popisuje příklad 6. Proto je potřeba dosáhnout vyšších střižných sil zvýšením lineárních rychlostí v otvorech.

- 47 Příklad 9

Pomnožení viru příušnic v kultuře agregátů mikronosičú

Buď primární buňky, nebo zamrazené buňky kuřecích embryonálních fibroblastů, několikrát pasážovaných v kulturách monovrstev, byly přidány v poměru 5-10 buněk na kuličku k mikronosičům z různých materiálů - v tomto příkladu sklem pokrytý plast - (průměr 150 - 212 pm, hustota 1020 kg/m³) v množství 40 g/l do 250 ml skleněného tanku. Pro růst buněk bylo použito modifikovaného media 199 nebo DMEM s 10 % FBS, na konečnou io hustotu 4x10⁶ buněk/ml s denním doplňováním media. Růst v tomto systému charakterizovala agregace mikronosičú s prudce stoupající velikostí (2 - 50) při vzrůstání hustoty buněk. Infekce a replikace viru příušnic pro výrobu vakcíny byla v tomto systému ukázána přídavkem inokula viru příušnic (kmen Jeryl Lynn) ke kultuře mikronosičú.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby velkého množství viru v kultuře

   5 agregovaných mikronosičú s buňkami, vyznačující se tím, že zahrnuje zadržování populace buněk v agregovaném a přichyceném stavu, aniž by se buňky z mikronosičú i v prodloužené infekční fázi uvolňovaly, pro výrobu komerčních množství antigenu pro virovou vakcínu, io skládající se z kroků:

   a) příprava sklem pokrytých mikronosičú hydratací, sterilizací a ekvilibrací uvedených sklem pokrytých mikronosičú v kultivačním mediu v bioreaktoru, vhodném pro kultivaci buněk, vnímavých k infekci viru, který má

   15 být použit jako antigen pro vakcínu;

   b) vysetí buněk do vhodného kultivačního media v koncentraci dostatečné pro dosažení stejnoměrného přichycení buněk k mikronosičům, kde každý mikronosič má na sobě nezbytně přichycenu alespoň jednu buňku,
2. 2o při použití rychlosti míchání, rovné kritické rychlosti pro resuspendování ode dna (COBSR) a teplotě a pH, které dovolí vytvoření strukturovaného agregátu;

   c) růst vysetých a přichycených buněk do pozdní logaritmické nebo časné stacionární fáze s řízením pH a os dostatečnou výměnou media pro dosažení náležité výživy buněk a řízením velikosti agregátů a udržováním rychlosti míchání na tak malé hodnotě, aby byla umožněna účinná tvorba agregátů mikronosičú s buňkami a zároveň dostatečně vysoké k udržení všech

   - 49 mikronosičů v suspenzi, tedy rovné kritické rychlosti pro resuspendování ode dna;

   d) infikování agregátů mikronosičů 3 buňkami v pozdní logaritmické nebo časné stacionární fázi virem a růst viru

   5 dostatečně dlouhou dobu pro dosažení maximálního výtěžku viru po sklizni;

   e) sklizeň a získání viru z kultury buněk na agregovaných mikronosičích.

   Způsob podle nároku 1, krok b), tím, že buňky jsou vysety v buněk na mikronosič.

   vyznačující se poměru přibližně 5 až 10
3. 3. Způsob podle nároku 1, krok a), vyznačující se 15 tím, že mikronosiči jsou skleněné mikronosiče

   SOLOHILL.
4. 4. Způsob podle nároku 1, krok b), vyznačující se tím, že buňkami jsou lidské plicní diploidní fibroblasty,

   20 buňky Věro nebo kuřecí embryonální fibroblasty.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, ž e buňkami jsou buňky MRC-5 nebo WI38.

   - 50
6. 6. Způsob podle nároku 1, krok d), vyznačující se tím, že virem je virus hepatitidy A, planých neštovic, spalniček, příušnic, zarděnek, dětské obrny, herpetického viru nebo rotaviru.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e virem je virus hepatitidy A.
8. 8. Způsob podle nároku 6. vyznačující se tím, io že buňkami jsou buňky MRC-5 a virem je virus hepatitidy

   A.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e sklizeň podle kroku e) zahrnuje protlačování buněčné

   15 kultury agregátů mikronosičů řadou otvorů s klesajícím průměrem, takže nejmenší průměr je přibližně dvakrát větší než průměr jednotlivého mikronosiče.
10. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,

    20 že sklizeň podle kroku e) zahrnuje protlačování buněčné kultury agregátů mikronosičů řadou otvorů s klesajícím průměrem, takže se dosáhne lineární rychlosti přibližně 0.168 m/s až 0,337 m/s.

    25
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e promývání agregovaných infikovaných buněk,

    - 51 přichycených k mikronosičům, roztokem soli s fosfátovým pufrem, nemá za následek oddělování nebo rozpad mikronosičových agregátu.

    s
12. 12. Způsob výroby velkého množství viru v kultuře buněk na agregovaných mikronosičích, vyznačující se tím, že zahrnuje zadržování populace buněk v agregovaném a přichyceném stavu, aniž by se buňky z mikronosičů i v prodloužené infekční fázi uvolňovaly, pro

    10 výrobu komerčních množství antigenu pro virovou vakcínu, skládající se z kroků:

    a) příprava sklem pokrytých mikronosičů SOLOHILL hydratací, sterilizací a ekvilibraci uvedených sklem pokrytých mikronosičů v kultivačním mediu v bioreaktoru,

    15 vhodném pro kultivaci buněk, vnímavých k infekci viru hepatitidy A, který má být použit jako antigen pro vakcínu;

    b) vysetí buněk MRC-5 do vhodného kultivačního media v koncentraci přibližně 5 až 10 buněk na mikronosič pro

    20 dosažení stejnoměrného přichycení buněk k mikronosičům, kde každý mikronosič má na sobě nezbytně přichycenu alespoň jednu buňku, při použití rychlosti míchání, rovné kritické rychlosti pro resuspendování ode dna (COBSR) a teplotě a pH, které

    25 dovolí vytvoření strukturovaného agregátu;

    c) růst vysetých a přichycených buněk do pozdní logaritmické nebo časné stacionární fáze s řízením pH a výměnou media rychlostí přibližně 0,7 až 2 objemy kultury za den pro dosažení náležité výživy buněk a

    30 řízením velikosti agregátů a rychlosti míchání na tak

    - 52 malé hodnotě, aby byla umožněna účinná tvorba agregátů mikronosičú s buňkami a zároveň dostatečně vysoké k udržení všech mikronosičú v suspenzi, tedy rovné kritické rychlosti pro resuspendování ode dna s (COBSR);

    d) infikování agregátů mikronosičú s buňkami v pozdní logaritmické nebo časné stacionární fázi virem hepatitidy A a růst viru dostatečně dlouhou dobu pro dosažení maximálního výtěžku viru po sklizni;

    10 e) sklizeň viru z kultury buněk na agregovaných mikronosičích odstraněním kultivačního media a jeho náhradou pufrem pro sklízení buněk s obsahem 0,1 % TRITON X-100, protlačování agregovaných mikronosičú řadou otvorů s klesajícím průměrem, takže nejmenší

    15 průměr je přibližné pětkrát větší než průměr jednotlivého mikronosiče nebo zajišťující dosažení lineární rychlosti přibližně v rozmezí 0.163 m/s až 0,337 m/s, a získání uvolněného viru hepatitidy A.

    20
13. 13. Použití skleněných mikronosičú SOLOHILL při kultivaci virů hepatitidy A, planých neštovic, spalniček, příušnic, zarděnek, dětské obrny, herpetického viru nebo rotaviru.
14. 14. Použití skleněných mikronosičú SOLOHILL při kultivaci viru hepatitidy A

    - 53 15. Použití kultury buněk na agregovaných mikronosičích, vyznačující se tím, že agregáty obsahují přibližně 50 - 60 % mrtvého objemu.