CN112831458A - 一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 - Google Patents
一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112831458A CN112831458A CN201911152960.9A CN201911152960A CN112831458A CN 112831458 A CN112831458 A CN 112831458A CN 201911152960 A CN201911152960 A CN 201911152960A CN 112831458 A CN112831458 A CN 112831458A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mdck
- full
- free
- cells
- passage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract description 8
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 abstract description 8
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 abstract description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 5
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，本发明将MDCK‑sus细胞扩繁传代，然后于MDCK细胞无血清培养基中进行全悬浮无血清培养并扩繁传代，最后分瓶培养，通过优化MDCK‑sus细胞的接种密度和细胞传代时间点，优化全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的方法，为后续生产高质量、高滴度的H9N2亚型禽流感病毒奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法。
背景技术
目前，家禽年出栏量和产值在逐年上升，但禽流感的持续爆发严重危害了养禽业，不仅造成了巨大的经济损失，还引起了多起公共卫生事件，接种禽流感疫苗是最有效的防控手段，因此必须提高禽流感疫苗技术水平。
传统禽流感疫苗通过鸡胚培养生产，效率低、成本高、品质不稳定。国内多家单位也开展了禽流感细胞苗的研究，但由于微载体工艺扩大困难、细胞密度和病毒滴度较低等的因素制约了其产业化进程。而细胞悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是生物制药行业发展的必然趋势，该技术完全克服了以往技术的弊端。
目前全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒工艺尚未成熟，而把握全悬浮无血清MDCK细胞增值禽流感病毒的首要任务是控制全悬浮无血清MDCK的扩繁传代培养，工艺关键是要掌握活细胞的起始密度，为下一步工艺的探究作铺垫。
发明内容
本发明的目的是提供一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代优化方法，将 MDCK-sus细胞扩繁传代，然后于MDCK细胞无血清培养基中进行全悬浮无血清培养并扩繁传代，最后分瓶培养，通过优化MDCK-sus细胞的接种密度和细胞传代时间点，优化全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的方法，为后续生产高质量、高滴度的H9N2亚型禽流感病毒奠定基础。
本发明的技术方案为：
一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，包括以下步骤：
(1)取MDCK-sus细胞扩繁传代；
(2)取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，接种于MDCK细胞无血清培养基中，进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，分瓶培养。
进一步地，步骤(2)中接种的起始活细胞密度为0.5×106～2.0×106cells/mL。
更进一步地，步骤(2)中接种的起始活细胞密度为1.5×106cells/mL。
进一步地，步骤(2)中全悬浮无血清培养60小时，MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度并分瓶培养。
进一步地，步骤(2)中所述培养具体是指在125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下培养。
进一步地，步骤(3)中所述培养具体是指在125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下培养。
本发明的有益效果如下：
本发明全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代优化方法通过优化MDCK-sus细胞的接种密度和细胞传代时间点，有效增加了细胞传代扩增效率，为后续生产高质量、高滴度的H9N2亚型禽流感病毒奠定基础。
附图说明
附图1为测试例1中不同接种密度培养MDCK-sus细胞活细胞密度变化曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中的试剂和细胞：
Driving-M MDCK细胞无血清培养基购自上海倍谙基生物科技有限公司；
全悬浮MDCK-sus细胞均由肇庆大华农农业部动物疫控生物技术与制品创制重点实验室保存供应。
实施例
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，包括以下步骤：
(1)取F1代MDCK-sus细胞，连续2代扩繁；
(2)取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，按照1.5×106cells/mL的起始活细胞密度加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在125mL摇瓶30 mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，取30 mLMDCK-sus细胞悬液，按照1.5×106cells/mL的起始活细胞密度，传至125mL 摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2 的条件下继续培养。
本实施例步骤(2)中培养第4天(96小时)，MDCK-sus细胞密度达到约 20×106cells/mL，且培养60小时即进入对数生长中期。
对比例
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，包括以下步骤：
(1)取F1代MDCK-sus细胞，连续2代扩繁；
(2)取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，按照1×106cells/mL的起始活细胞密度加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在125mL摇瓶30 mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，取30 mLMDCK-sus细胞悬液，按照1.5×106cells/mL的起始活细胞密度，传至125mL 摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2 的条件下继续培养。
本对比例步骤(2)中培养第5天(120小时)接近峰值，达到约19×106 cells/mL。
通过实施例与对比例的对比，可初步判断步骤(2)中以1.5×106cells/mL 的活细胞接种密度培养具有最优的扩繁传代效率，并且全悬浮无血清培养60小时，MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度并分瓶培养最优。
测试例1
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，具体步骤按照对比例进行操作，不同点在于：在步骤(2)中分别设置4个不同的起始活细胞密度，即0.5×106cells/mL、1.0×106cells/mL、1.5×106cells/mL、 2.0×106cells/mL分别加新鲜Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在 125mL摇瓶培养，每24小时取样计算活细胞密度，连续观察至第120小时，每个细胞密度做3个摇瓶重复。
绘制的不同接种密度培养MDCK-sus细胞活细胞密度变化曲线如附图1所示，随着时间的变化，活细胞密度逐渐上升。其中，0.5×106cells/mL组的细胞密度增加比较缓慢，培养第5天(120小时)约为19×106cells/mL，尚未达到最高密度，但增长幅度开始变慢；1×106cells/mL组、1.5×106cells/mL组峰值则随着起始活细胞的密度提高而明显提高，到达峰值的时间也相应提前，1.5× 106cells/mL组峰值位于培养第4天(96小时)，达到约20×106cells/mL，且培养60小时即进入对数生长中期，而1×106cells/mL组培养第5天(120小时) 才接近峰值，达到约19×106cells/mL；2×106cells/mL组培养第3天(72小时) 左右达到峰值，但仅比1.5×106cells/mL略高，此后细胞密度开始降低，可能是因为其细胞起始数量过多，导致生长液营养消耗加快，代谢产物增加导致培养基环境不利于细胞生长。
由此可见，起始细胞密度过高虽然可以缩短细胞到达峰值平台期的时间，但是细胞对培养基营养消耗得也快，细胞提前进入衰老期，最高倍增幅度也难以相应提高，消耗细胞种子较多，降低了细胞传代扩增效率。而过低的起始细胞密度则要形成一定规模的细胞数量需要更长的时间。综合考虑，以1.5×106 cells/mL的活细胞接种密度培养具有最优的效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取MDCK-sus细胞扩繁传代；
(2)取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，接种于MDCK细胞无血清培养基中，进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，分瓶培养。
2.根据权利要求1所述的一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，步骤(2)中接种的起始活细胞密度为0.5×106～2.0×106cells/mL。
3.根据权利要求2所述的一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，步骤(2)中接种的起始活细胞密度为1.5×106cells/mL。
4.根据权利要求1所述的一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，步骤(2)中全悬浮无血清培养60小时，MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度并分瓶培养。
5.根据权利要求1所述的一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养具体是指在125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下培养。
6.根据权利要求1所述的一种全悬浮无血清MDCK细胞扩繁传代的优化方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养具体是指在125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911152960.9A CN112831458A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911152960.9A CN112831458A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112831458A true CN112831458A (zh) | 2021-05-25 |
Family
ID=75921679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911152960.9A Pending CN112831458A (zh) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | 一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112831458A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106011083A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-10-12 | 广东温氏大华农生物科技有限公司 | 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒 |
-
2019
- 2019-11-22 CN CN201911152960.9A patent/CN112831458A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106011083A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-10-12 | 广东温氏大华农生物科技有限公司 | 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 胡可可等: "基于Box-Behnken实验设计与响应面法优化禽流感疫苗生产工艺?", 《高校化学工程学报》 * |
| 陈宏等: "悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养", 《中国农业科学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108300704B (zh) | 一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法 | |
| US11629338B2 (en) | Method for acclimating and suspending Vero and second order production process for virus | |
| CN106987554B (zh) | 悬浮细胞株及其驯化方法 | |
| CN107904215B (zh) | 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法 | |
| CN110301353B (zh) | 马尾松胚性愈伤增殖与维持培养的方法 | |
| CN114107170A (zh) | 猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN102240400A (zh) | 一种应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法 | |
| Sun et al. | Production of influenza H1N1 vaccine from MDCK cells using a novel disposable packed-bed bioreactor | |
| CN104178459A (zh) | 一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法 | |
| CN112680422A (zh) | 一种全悬浮无血清mdck细胞增殖h9n2亚型禽流感病毒的方法 | |
| CN112831458A (zh) | 一种全悬浮无血清mdck细胞扩繁传代的优化方法 | |
| CN102406927A (zh) | 一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法 | |
| CN111662882A (zh) | 一种采用mdck细胞系增殖禽流感病毒的方法 | |
| CN105288608A (zh) | 猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法 | |
| CN109627063A (zh) | 一种畜牧业垃圾生产有机肥的方法 | |
| CN1185339C (zh) | 用于生产生物制品的细胞的制备 | |
| CN104312981A (zh) | 脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法 | |
| CN105296407A (zh) | 一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法 | |
| Kurz et al. | Continuous culture of plant cells | |
| CN109609436A (zh) | 一种无co2环境的mdck细胞全悬浮无血清细胞系的制备方法 | |
| CN104694458A (zh) | Mdck克隆细胞株及其应用 | |
| CN113699119A (zh) | 一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法 | |
| CN111321119B (zh) | 一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN109355263A (zh) | 利用生物反应器生产轮状病毒的方法 | |
| CN109679925A (zh) | 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210525 |